JP6057185B2 - 核酸リンカー - Google Patents

Description

本発明は、核酸リンカーに関する。
本願は、２０１１年１１月４日に、日本に出願された特願２０１１−２４２７９０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

新規機能性タンパク質は、医薬品、洗剤、食品加工、研究開発用試薬、臨床分析、さらにはバイオエネルギー、バイオセンサーなど様々なバイオ応用分野への貢献が期待されている。

新規機能性タンパク質の取得に際しては、タンパク質の構造情報から人知によりデザインするタンパク質工学的手法が主流であったが、より有用なタンパク質を取得するためには従来手法よりも効率的にスクリーニングする必要があり、タンパク質のランダムな分子構造改変と淘汰を繰り返す進化分子工学的手法が期待されている。

進化分子工学的手法の一つであるｃＤＮＡディスプレイ法は、遺伝子型−表現型の対応付けの方法であり、核酸リンカーが、タンパク質（表現型）と、これをコードするｍＲＮＡと、逆転写したｃＤＮＡ（遺伝子型）と、を結ぶものである。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体構造は、非常に安定であるため、該核酸リンカーを用いることにより、様々な環境下でスクリーニングを実施することが可能となった。

ｃＤＮＡディスプレイ法は、タンパク質とこれをコードするポリヌクレオチドとを連結する核酸リンカー中に有するピューロマイシンに特徴を有している（特許文献１参照）。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤であり、所定の条件下ではリボソーム上で伸長中のタンパク質のＣ末端に特異的に共有結合する。
ｃＤＮＡディスプレイ法を用いた有用タンパク質のスクリーニング方法は、以下の一連の工程を有する。
先ず、ピューロマイシンを有する核酸リンカーとｍＲＮＡとを結合させ、無細胞翻訳系を用いてｍＲＮＡからタンパク質を合成し、合成されたタンパク質とこれをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）が生じる（非特許文献１参照）。
次に、このｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを作製し、作製したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写酵素により逆転写し、ｃＤＮＡを合成することにより、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを作製し、所望の機能をもつタンパク質を選択する。選択したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体中のｃＤＮＡの塩基配列を解析することによりタンパク質を同定する。逆転写のタイミングは、タンパク質を選択する前でもよい。（非特許文献２参照）。

上記ｍＲＮＡ（又は、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ）−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを基板上に固定したタンパク質アレイは、網羅的解析により、短期間で機能性タンパク質を取得するためのツールとして重要である。このような網羅的解析に用いられる核酸リンカーとして、図１３に示されるものが知られている（特許文献２参照）。図１３Ａに示される核酸リンカー１００は、一本鎖ＤＮＡ配列の５’末端側が、ループ領域を介して相補的な二本鎖配列を形成しており、該ループ領域に基板と結合するための固相結合部位を有している。また、図１３Ｂに示される核酸リンカー１０１は、５’末端側に相互に相補的な配列を有する２本の一本鎖ＤＮＡ配列が、該相補的な配列を介して二本鎖配列を形成しており、該２本の一本鎖ＤＮＡ配列のうち、一方の一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端に固相結合部位を有している。

特許第４３１８７２１号公報 特開２００４−９７２１３号公報

Ｎｅｍｏｔｏら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、第４１４巻、第４０５〜４０８頁、１９９７年 Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第３７巻、ｅ１０８頁、２００９年

核酸リンカーは無細胞翻訳系を用いてｍＲＮＡとタンパク質を連結するための「連結部」に相当する。上記の様な従来の核酸リンカーは、試験管内進化のためにデザインされたものであるため、固相結合部位を有しているものの、あくまでｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質複合体の合成を効率化するためのワンステップとして存在していた。そのため、タンパクアレイ等のｍＲＮＡ−タンパク質複合体を固相化したスクリーニングシステムを用いる場合には、分子操作技術の観点から問題点が複数存在する。
具体的には、１)ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質分子の固相からの効率の良い着脱機構の欠落、２)非特異的吸着や固相基板の光学特性の影響を回避するための固相との間隔を保つスペーサーの欠如等である。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、固相上の固定化に最適で、かつ、高機能な分子操作を可能にする核酸リンカーを提供することを目的とする。

本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、核酸リンカーの５’側に分岐鎖を導入することにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（１３）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質との複合体を製造するための核酸リンカーであって、
１つの３’末端領域と、
枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、
前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部と、
前記１本鎖ポリヌクレオチド部から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部と、を含み、
前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位、又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、
前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、切断部位を含み、且つ５’末端に固相結合部位を有することを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記３’末端領域、及び前記５’末端領域の一方の領域は、切断部位を含むことが好ましい。
（３）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記タンパク質の連結部は、前記アーム部の末端にピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドが結合されてなることが好ましい。
（４）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域と前記３’末端領域とはループ領域を形成していることが好ましい。
（５）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域と前記３’末端領域とは、各々切断部位を含むことが好ましい。
（６）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質との複合体を製造するための核酸リンカーであって、
前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部を含む３’末端領域と、
枝分かれした２つの５’末端領域と、
前記３'末端領域の１本鎖ポリヌクレオチド部から枝分かれした、末端側に前記タンパク質の連結部を有するアーム部と、を備え、
前記２つの５’末端領域の少なくとも１つの領域は、切断部位と、５’末端に固相結合部位を含むスペーサー領域とを有することを特徴とする。
（７）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記タンパク質は、酵素、抗体、抗原、アプタマー及びペプチドのいずれか１つを構成することが好ましい。
（８）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記アーム部は標識物質を有することが好ましい。
（９）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体は、前記核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、を連結してなることを特徴とする。
（１０）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体は、前記核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡ及び前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体、並びに前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が連結されていることを特徴とする。
（１１）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法は、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
を有することを特徴とする。
（１２）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法は、前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から逆転写によりｃＤＮＡを合成する工程と、
を有することを特徴とする。
（１３）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイは、前記タンパク質複合体が基板上に固定化されてなることを特徴とする。

本発明の核酸リンカーは、固相上の固定化に最適で、かつ、高機能な分子操作を可能にするため、網羅的解析に好適に用いられる。

本実施形態に用いられる核酸リンカーの一態様を示した図である。 本実施形態に用いられる核酸リンカーの一態様を示した図である。 本実施形態に用いられる核酸リンカーの一態様を示した図である。 実施例における電気泳動の結果である。 実施例における電気泳動の結果である。 実施例における電気泳動の結果である。 実施例における電気泳動の結果である。 実施例における電気泳動の結果である。 実施例における電気泳動の結果である。 実施例における電気泳動の結果である。 実施例において、ＢＤＡ（Ｂ−ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＰｒｏｔｅｉｎＡ）のｍＲＮＡと、核酸リンカーを共有結合させたものの概略図である。 実施例における電気泳動の結果である。 従来の核酸リンカーの一態様を示した図である。

≪核酸リンカー≫
［第１実施形態］
本実施形態の核酸リンカー２は、ｍＲＮＡ２３と、これらがコードするタンパク質３３とを連結するためのリンカーである。本実施形態の核酸リンカーの構造について、図１を用いて説明する。
図１中、Ｐはピューロマイシン、Ｆはｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（フルオロセイン）を示している。

核酸リンカー２は、１つの３’末端領域５１と、枝分かれした２つの５’末端領域（一方の領域５２，他方の領域５３）と、からなる。

３’末端領域５１は、スクリーニングすべきｍＲＮＡ２３の３’末端側の配列とハイブリダイズし得る１本鎖ポリヌクレオチド部５１aと、１本鎖ポリヌクレオチド部５１aから枝分かれし、末端にタンパク質３３の連結部２ａを有するアーム部５１ｂと、を含む。

１本鎖ポリヌクレオチド部５１aは、ＤＮＡであってもＰＮＡ（ポリヌクレオペプチド）などの核酸誘導体であってもよく、ヌクレアーゼ耐性が付与された修飾ＤＮＡが好ましい。修飾ＤＮＡとしては、ホスホロチオエートなどのヌクレオシド間結合を有するＤＮＡ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルなどの糖修飾を有するＤＮＡなど、当該技術分野において知られる修飾ＤＮＡのいずれを用いてもよい。

アーム部５１ｂは、ｍＲＮＡ２３とタンパク質連結部２ａとを所望の距離に保持するスペーサーとして機能する。アーム部５１ｂの５’末端は、１本鎖ポリヌクレオチド部５１aの３’末端側の箇所で１本鎖ポリヌクレオチド部５１aと結合し、アーム部５１ｂの３’末端はタンパク質連結部２ａを有する。

１本鎖ポリヌクレオチド部５１aとアーム部５１ｂとの連結は、１本鎖ポリヌクレオチド部５１a上の連結箇所に存在する修飾ヌクレオチド（例えばアミノ基がスペーサーを介して塩基部分に導入されたヌクレオチド）と、アーム部５１ｂの末端に存在する修飾ヌクレオチド（例えばチオールを５’末端にもつヌクレオチド）とを二官能性試薬を用いて架橋することにより行うことができる。
後述するようにスクリーニングすべきタンパク質をコードするｍＲＮＡを逆転写させる必要がある場合には、アーム部５１ｂの５’末端は、１本鎖ポリヌクレオチド部５１aの３’末端から数塩基５’側の位置で１本鎖ポリヌクレオチド部５１aと結合し、Ｔ字型の構造を形成していることが好ましい。逆転写の際に１本鎖ポリヌクレオチド部５１aの３’末端がプライマーとして機能するからである。

１本鎖ポリヌクレオチド部５１a、又は、３’末端を除くアーム部５１ｂは、標識物質を用いて標識されてもよい。標識物質は、蛍光色素や放射性物質等から適宜選択される。
本実施形態においては、図１に示されるように、３’末端を除くアーム部５１ｂがフルオロセイン２ｄで修飾されている。かかる修飾により核酸リンカー２が蛍光標識され、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２複合体、又は、ｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質３３複合体を容易に検出することができる。

アーム部５１ｂの３’末端にはタンパク質３３の連結部２ａが存在する。タンパク質連結部２ａとは、所定の条件下でリボソーム上の伸張中のタンパク質３３のＣ末端に特異的に結合する性質を有する構造を意味し、ピューロマイシンが代表的である。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤である。タンパク質３３の連結部２ａとしては、伸張中のタンパク質３３のＣ末端に特異的に結合する機能を有する限り、任意の物質を用いることができ、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮＳ−アミノ酸）、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（ＡＡＮＳ−アミノ酸）などのピューロマイシン誘導体を用いることができる。
ＰＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。
ＡＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。
ピューロマイシン以外に好適に使用できるアミノアシルｔＲＮＡ３’末端アナログとしては、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシシチジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ）、デオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ）などを挙げることができる。

アーム部５１ｂは、スペーサーとして機能するものであれば、核酸や核酸誘導体から構成されていてもよく、ポリエチレングリコールなどの高分子から構成されていてもよい。
アーム部５１ｂにはさらに、ピューロマイシンの安定性を高めるための修飾や、複合体の検出のための標識が付加されていてもよい。

５’末端領域は、２つに枝分かれしており、一方の領域５２と、他方の領域５３と、からなる。一方の領域５２は、３’末端領域５１の一本鎖ポリヌクレオチド部５１ａと他方の領域５３の境界から分岐し、Ｔ字型の構造を形成していることが好ましい。このような分岐部分である一方の領域５２を合成するには、塩基部分からスペーサーを介して分岐鎖合成が可能な修飾ヌクレオチドアミダイトや、分岐用リン酸基アミダイトが使用される。
ｍＲＮＡ２３とハイブリダイズし得る１本鎖ポリヌクレオチド部５１aとの結合を強固なものとするため、一方の領域５２の５’末端は、ｍＲＮＡ２３の３’末端とライゲーションされることが好ましい。

本実施形態の核酸リンカー２の他方の領域５３は、切断部位２ｃを含むことが好ましい。切断部位２ｃとしては、光切断性部位または１本鎖核酸切断酵素切断部位が挙げられる。
切断部位２ｃにより、タンパク質３３と対応づけられるｍＲＮＡ２３（またはｍＲＮＡ２３を逆転写して得られるｃＤＮＡ）を回収することができる。
光切断性部位とは，紫外線などの光を照射すると切断される性質を有する基をいい、例えば、ＰＣ Ｌｉｎｋｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物（核酸の光切断用組成物：特開２００５−２４５２２３）、光分解(ＳＢＩＰ)手法による鎖切断などが挙げられる。
光切断性部位としては、当該技術分野において市販されているか、または知られているいずれの基を用いてもよく、例えばニトロベンジル基が挙げられる。
また、１本鎖核酸切断酵素切断部位とは、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼなどの１本鎖核酸切断酵素により切断されることができる核酸基をいい、ヌクレオチドおよびその誘導体が含まれ、例えば、エンドヌクレアーゼＶに認識されるデオキシイノシンが挙げられる。

本実施形態の核酸リンカー２の他方の領域５３は、５’末端に固相結合部位２ｂを有することが好ましい。
核酸リンカー２の固定化には、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、核酸リンカー２をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法や、金-チオール結合を利用する方法などを用いることができ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。

本実施形態の核酸リンカー２は、分岐鎖として一方の領域５２を有するため、図１３Ｂに示される核酸リンカー１０１のように、二本の一本鎖ＤＮＡ配列を準備する必要が無い。

本実施形態の核酸リンカー２は、他方の領域５３を有するため、他方の領域５３を構成する５’末端の塩基配列を延長することにより、固相と切断部位２ｃとの間の距離をとることができる。
これにより、基板上で該基板に固定した核酸リンカー２とｍＲＮＡ２３をライゲーションさせる場合、基板と核酸リンカー２との距離が近いことでライゲーション効率に影響を及ぼすおそれがない。
また、例えば、核酸リンカー２が切断部位２ｃとしてニトロベンジル基を有し、固相として金基板を用いる場合、金基板とニトロベンジル基との距離が短いと、ニトロベンジル基の切断に要する光エネルギーを金基板が吸収してしまうおそれがある。本実施形態においては、かかるおそれがなく、光照射により効率よく核酸リンカー２を切断し、タンパク質３３と対応づけられるｍＲＮＡ２３（またはｍＲＮＡ２３を逆転写して得られるｃＤＮＡ）を回収することができる。
また、本実施形態の核酸リンカー２においては、他方の領域５３を自由に修飾することができる。即ち、核酸リンカーと固相との間を自由に修飾することができる。
このように、本実施形態の核酸リンカー２は、高機能な分子操作を可能にする。

また、前記２つの５’末端領域の少なくとも１つの領域は、５’末端に固相結合部位を含むスペーサー領域を有することが好ましい。本実施形態の核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質との複合体を製造するためのものである。上記のスペーサー領域を有することにより、核酸リンカーに連結されるタンパク質の立体構造の自由度が確保されたり、核酸リンカーに結合したｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳効率が上昇するものと考えられる。
特に翻訳効率を考慮した場合、翻訳に用いられるリボソームの大きさに鑑みると、上記のスペーサー領域の長さは１０ｎｍ以上が好ましく、１５ｎｍ以上がより好ましく、２０ｎｍ以上がさらに好ましい。
また前記タンパク質は、酵素、抗体、抗原、アプタマー及びペプチドのいずれか１つを構成することが好ましい。

［第２実施形態］
本実施形態の核酸リンカー１２の構造について、図２を用いて説明する。
図２において、図１の核酸リンカー２の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。
核酸リンカー１２は、１つの３’末端領域６１と、枝分かれした２つの５’末端領域（一方の領域６２，他方の領域６３）と、からなる。

一方の領域６２と３’末端領域６１は、ループ領域６４を形成している。
５’末端領域は、２つに枝分かれしており、一方の領域６２と、他方の領域６３と、からなる。他方の領域６３は、ループ領域６４から分岐し、Ｔ字型の構造を形成していることが好ましい。このような分岐部分である他方の領域６３を合成するには、塩基部分からスペーサーを介して分岐鎖合成が可能な修飾ヌクレオチドアミダイトや、分岐用リン酸基アミダイトが使用される。
ｍＲＮＡ２３とハイブリダイズし得る１本鎖ポリヌクレオチド部５１aとの結合を強固なものとするため、一方の領域６２の５’末端は、ｍＲＮＡ２３の３’末端とライゲーションされていることが好ましい。

［第３実施形態］
本実施形態の核酸リンカー２２の構造について、図３を用いて説明する。
図３において、図１の核酸リンカー２及び図２の核酸リンカー１２の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。

本実施形態の核酸リンカー２２において、３’末端領域６１、及び５’末端領域の一方の領域６２は、各々切断部位２ｃ１、２ｃ２を含む。切断部位２ｃ１、２ｃ２としては、第１実施形態と同様に光切断性部位または１本鎖核酸切断酵素切断部位が挙げられる。

≪ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体≫
本実施形態の核酸リンカーを用いて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が製造される。
前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法は、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
を有する。
以下、各工程について説明する。

工程（ａ）において、ｍＲＮＡと核酸リンカーとをアニールさせる。まず、工程（ａ）に用いられるｍＲＮＡの調製について説明する。
ｍＲＮＡは、スクリーニングすべきタンパク質をコードするＤＮＡを調製し、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させることにより得られる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
前記ＤＮＡとしては、標的分子との結合に関して調べたい任意のタンパク質をコードしているＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを利用することができる。例えば、サンプル組織から得たｃＤＮＡライブラリー、配列をランダムに合成したＤＮＡライブラリー、配列の一部を変異させたＤＮＡライブラリーなどを用いることができる。
転写前のＤＮＡの３’末端に共通のタグ配列を挿入し、転写後のｍＲＮＡの３’側が、本実施形態の核酸リンカーの１本鎖ポリヌクレオチド部とハイブリダイズするように設計しておく。

次にｍＲＮＡの３’末端領域と本実施形態の核酸リンカーの１本鎖ポリヌクレオチド部とをアニールさせる。例えば、９０℃まで加熱し、ｍＲＮＡを変性させた後、１５分かけて２５℃まで冷却することによりｍＲＮＡが核酸リンカーに確実にハイブリダイズされる。

次に工程（ｂ）において、前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端領域の一方の領域とをライゲーションさせる。ライゲーションに際し、前記５’末端領域の一方の領域の５’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素を用いて、リン酸化させておく必要がある。ライゲーションに用いる酵素としては、ＲＮＡリガーゼが好ましく、例えばＴ４ＲＮＡリガーゼが挙げられる。

次に工程（ｃ）において、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーのタンパク質連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する。

無細胞翻訳系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系であり、この系にはリボソーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。再構成型無細胞タンパク質合成系は、従来の細胞抽出液を使用する場合よりもヌクレアーゼやプロテアーゼの混入を容易に防ぐことができるため、翻訳効率を高めることができる。
このような系を用いることにより、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が製造される。

≪ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体≫
ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法は、上述したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法に加えて工程（ｄ）を有する。
工程（ｄ）は、上述したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から逆転写によりｃＤＮＡを合成する工程である。逆転写に用いられる逆転写酵素としては、従来公知のものが用いられ、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素等が挙げられる。
逆転写されたｃＤＮＡはｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のｍＲＮＡとハイブリッドを形成する。ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体中のｍＲＮＡは、ｃＤＮＡと比べて昜分解性である他、アプタマーとして非特異的相互作用する可能性が高いため、タンパク質間相互作用解析を行う場合には、このようなｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製しておくことが好ましい。
また、スクリーニングにより有用性を見出されたタンパク質をコードするｃＤＮＡを解析するためには、この複合体の作製が必須である。

≪タンパク質アレイ≫
上述したタンパク質複合体をマイクロアレイ基板上に固定化することによりタンパク質アレイが製造される。用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。タンパク質複合体には、固相結合部位が設けられており、その固相結合部位と、基板に結合させた固相結合部位認識部位との結合を利用して、タンパク質複合体をマイクロアレイ基板上に固定化する。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、核酸リンカーの固定化には、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、核酸リンカーをアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法や、金-チオール結合を利用する方法などを用いることができ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［核酸リンカーの合成１］
１−１ 材料
下記２種のＤＮＡオリゴマーの合成を日本バイオサービスに委託し、自動核酸合成装置を使用して、ホスホロアミダイト法に従って合成した。
（１）ｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−Ｓｅｇｍｅｎｔ
［配列：５’−（Ｂ）−（ｓｐｃ１８）−ＡＡＡＡＡ−（ｄＩ）−ＡＡＡＡＡ−(Ｃ−ＣＣＣ−５’)−Ｘ１−(Ｔ−ＮＨ_２)−ＣＣＴ−３’］
Ｘ１は以下の配列を表す。
ＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧ（配列番号１：１５ｍｅｒ）。

（２）Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−ｓｅｇｍｅｎｔ
［配列：５’− （ＨＯ−Ｃ_６Ｈ_１２−ＳＳ−Ｃ_６Ｈ_１２）−ＴＣ(Ｆ)−（ｓｐｃ１８）−（ｓｐｃ１８）−（ｓｐｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）−３’］

ここで、（Ｂ）は、［１−Ｎ−（４，４'−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）−ｂｉｏｔｉｎｙｌ−６−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ]−２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：５’−Ｂｉｏｔｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）。
(Ｆ)は、５'−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ−５−［Ｎ−（(３',６'−ｄｉｐｉｖａｌｏｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌ）−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ］−３−ａｃｒｙｉｍｉｄｏ］−２'−ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ−３'−ｓｕｃｃｉｎｏｙｌ−ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ａｌｋｙｌａｍｉｎｏを用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄＴ）。
（ｓｐｃ１８）は、１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−[(２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ)−(Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ)]−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：Ｓｐａｃｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ １８）。
（ｄＩ）は、デオキシイノシンを示し、５'−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−２'−ｄｅｏｘｙＩｎｏｓｉｎｅ，３'−[(２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ)−(Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ)]−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：ｄＩ−ＣＥ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）。
（Ｃ−ＣＣＣ−５’）は、５'−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−Ｎ４−（Ｏ−ｌｅｖｕｌｉｎｙｌ−６−ｏｘｙｈｅｘｙｌ）−５−Ｍｅｔｈｙｌ−２'−ｄｅｏｘｙＣｙｔｉｄｉｎｅ，３’−[(２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ)−(Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ)]−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用いて、塩基側分岐鎖にデオキシシトシンを３’→５’方向に３塩基縮合したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：５−Ｍｅ−ｄＣ Ｂｒａｎｃｈｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）。
（Ｔ−ＮＨ_２）は、５'−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−５−[Ｎ−(ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ)−３−ａｃｒｙｌｉｍｉｄｏ]−２'−ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ,３'−[(２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ)−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ)）−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ）。
（ＨＯ−Ｃ_６Ｈ_１２−ＳＳ−Ｃ_６Ｈ_１２）は、（１−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−ｈｅｘｙｌ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，１’−[（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ)−(Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）]−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ)を用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ Ｓ−Ｓ）。
（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）は、５'-Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−Ｎ-ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，２'-ｓｕｃｃｉｎｏｙｌ−ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ａｌｋｙｌａｍｉｎｏ−ＣＰＧを用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−ＣＰＧ）。

１−２ 合成、精製方法
（ｍＲＮＡの合成）
５’上流にＴ７プロモーター配列と翻訳促進配列、３’側下流にスペーサー領域及びｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔとの相補鎖領域を有する配列を付加したＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎ（以下、ＢＤＡという。配列番号２：３６７ｂｐ）をＰＣＲにより増幅した。

ＰＣＲにより得られたＤＮＡからＴ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って５〜３０ｐｍｏｌ／μｌのｍＲＮＡを合成した（３３７ｂ）。

（ｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＳｅｇｍｅｎｔとｍＲＮＡのライゲーション及び逆転写）
前記ｍＲＮＡ２０ｐｍｏｌと、前記ｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔ ４０ｐｍｏｌをＴ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ (タカラバイオ社製)１９μｌ中で混合し、９０℃に加熱した後、１５分間かけて２５℃まで冷却した。この溶液に、０．５μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μｌ、東洋紡績社製)と、０．５μｌのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（４０Ｕ／μｌ、タカラバイオ社製)を加えて混合し、２５℃で１５分間反応させた。
反応産物を８Ｍ尿素５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し（２００Ｖ、６０℃、６０分)、ＳｙｂｒＧｏｌｄ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)にて染色した。結果を図４に示す。
レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ (プロメガ社製)、レーン２はｍＲＮＡ（ＢＤＡ）、レーン３はｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＳｅｇｍｅｎｔとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物、レーン４は前記ライゲーション産物の逆転写産物である。
ｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＳｅｇｍｅｎｔとｍＲＮＡが連結し、高分子量側にバンドがシフトしていることが観察でき、合成した核酸リンカーがｍＲＮＡと連結する能力を有していることが確認できた。
更に、前記ライゲーション産物をＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ (キアゲン社製)を用いて精製した。このライゲーション産物２ｐｍｏｌと２．５ ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘ (タカラバイオ社製) ４μｌと、５ｘＲＴｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製) ２μｌと、ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（１００Ｕ／μｌ、東洋紡社製) ０．５μｌと、ＲＮａｓｅフリー水と、を混合し、１０μｌの混合液とした。この混合液を４２℃で３０分間反応させ、逆転写反応物を得た。この逆転写反応物を８Ｍ尿素５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し（２００Ｖ、６０℃、６０分)、Ｓｙｂｒｇｏｌｄ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)にて染色した。結果を図４に示す。
レーン４においては、レーン３に示すライゲーション産物よりも高分子量側にバンドがシフトしており、逆転写反応が行われたことが確認された。

（ｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｉｎｋｅｒの固相結合能および被切断能の確認）
７．６５μＭのｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔ２μｌと０．１Ｍ ＰＢＳに溶解した２μＭのストレプトアビジン (シグマ社製) ２μｌを混合し、室温で１０分間静置した。
この混合液２μｌに１０ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製)と、ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶ (１Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製)と、ＲＮａｓｅフリー水を加えて混合し、５μｌの混合液とした。この混合液を３７℃で１０分間反応させた。この反応物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し(２００Ｖ、３０℃、３０分)、ＳｙｂｒＧｏｌｄ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)で染色した。結果を図５に示す。
レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ (プロメガ社製)、レーン２はｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔ、レーン３はｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔとストレプトアビジンの混合液、レーン４はＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶ処理液である。
レーン３より、ストレプトアビジンと結合したｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔが高分子量側にシフトしていることがわかる。よって、ｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＳｅｇｍｅｎｔはＢｉｏｔｉｎを介して固相に結合する能力があることが確認された。
レーン４より、ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶによってデオキシイノシンの近傍でＤＮＡ鎖の切断が為され、ストレプトアビジンからｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの切断断片が脱離して低分子量側にシフトしていることが分かる。よって、ｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＳｅｇｍｅｎｔはＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖによって切断され、固相から脱離される能力があることが確認された。

（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの還元）
３ｍＭのＰｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔ０．８μｌを１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ ９．０）１１．３μｌと混合し、１Ｍ ＤＴＴを１．２５μｌ加え、室温で１時間反応させ、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの５’側にあるジスルフィド基をチオール基に還元した。その後、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ ７．２)で平衡化したＮＡＰ−５ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いて、過剰なＤＴＴを除去した。

（ｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−ＳｅｇｍｅｎｔのＥＭＣＳ修飾）
０．７７ｍＭのｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔ１．６μｌを０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ ７．２)２５μｌと混合し、０．１Ｍの二価性架橋剤ＥＭＣＳ （６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）（同仁化学研究所社製）５μｌを加えてよく撹拌し、３７℃で３０分間反応させた。その後、エタノール沈澱を行って、反応物を沈澱させ、未反応のＥＭＣＳを除去した。沈澱物を２００μｌの７０％エタノールにて洗浄した。

（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−ＳｅｇｍｅｎｔとｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの架橋）
前記ｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＳｅｇｍｅｎｔのＥＭＣＳ架橋物の沈澱物を、還元後の前記Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの溶解液に溶解し、４℃で一晩放置した。次いで、１Ｍ ＤＴＴを１０μｌ加えて混合し、室温で３０分間撹拌することで架橋反応を停止した。
その後、エタノール沈澱を行って、反応物を沈澱させ、未反応のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔと過剰なＤＴＴを除去し、沈澱物を２００μｌの７０％エタノールにて洗浄した後、１５μｌの滅菌水に溶解し４５μＭに調整した。得られた架橋物を８Ｍ尿素１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し(２００Ｖ、６０℃、３０分)、ＳｙｂｒＧｏｌｄ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)で染色した。
結果を図６に示す。レーン１は１０ｂｐ ＤＮＡ ｓｔｅｐ ｌａｄｄｅｒ (プロメガ社製)、レーン２はｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔ、レーン３はＰｕｒｏｍｙｃｉｎ−ＳｅｇｍｅｎｔとｄＩ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの架橋物、レーン４は架橋物のエタノール沈澱精製物、レーン５は架橋物のエタノール沈澱後の上清である。レーン４より、目的の架橋物(Ｐｕｒｏ−ｄＩ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｉｎｋｅｒ)が得られていることが確認された。

（Ｐｕｒｏ−ｄＩ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡのライゲーション）
（ｍＲＮＡの合成）で上述した方法により合成したＢＤＡのｍＲＮＡ２０ｐｍｏｌと、前記Ｐｕｒｏ−ｄＩ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｉｎｋｅr ４０ｐｍｏｌをＴ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ (タカラバイオ社製)１８μｌ中で混合し、９０℃に加熱した後、１５分間かけて２５℃まで冷却した。この溶液に、１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(１０Ｕ／μｌ、東洋紡績社製)と、１μｌのＴ４ＲＮＡリガーゼ(４０Ｕ／μｌ、タカラバイオ社製)を加えて混合し、２５℃で１５分間反応させた。反応産物を８Ｍ尿素８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し(２００Ｖ、６０℃、４０分)、ＳｙｂｒＧｏｌｄ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)にて染色した。結果を図７に示す。
レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ (プロメガ社製)、レーン２はｍＲＮＡ（ＢＤＡ）、レーン３はＰｕｒｏ−ｄＩ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅrとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物である。
Ｐｕｒｏ−ｄｉ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡがライゲーションし、高分子量側にバンドがシフトしていることが観察された。即ち、本実施形態の核酸リンカーがｍＲＮＡとライゲーションする能力を有していることが確認された。

（Ｐｕｒｏ−ｄＩ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｉｎｋｅｒを用いたタンパク質ディスプレイ）
上記のように合成した、核酸リンカー（Ｐｕｒｏ−ｄｉ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｉｎｋｅｒ）とｍＲＮＡのライゲーション産物を用いて翻訳反応を行った。１ｐｍｏｌのｍＲＮＡ−核酸リンカーライゲーション産物（ｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒライゲーション産物）と０．７２μｌの２０ｘ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ａｍｂｉｏｎ社製）と、１０．２μｌのウサギ網状赤血球の細胞溶解液であるＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ（Ａｍｂｉｏｎ社製）に、ＲＮａｓｅフリー水を加えて混合し、１５μｌの混合液とした。
この混合液を３０℃にて２０分間反応させた後、６μｌの３Ｍ 塩化カルシウム溶液と１．８ μlの１ Ｍ 塩化マグネシウム溶液を加え、混合した。この混合液を更に３７℃で３０分間反応させ、ＢＤＡ遺伝子のポリペプチド鎖を合成し、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を形成させた。反応産物を８Ｍ尿素含有ＳＤＳ−６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、核酸リンカーに修飾されているＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光シグナルを検出した。
結果を図８に示す。
レーン１はｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒライゲーション産物、レーン２は翻訳産物である。
この泳動結果より、レーン２においてｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒライゲーション産物の高分子量側にシフトしたバンドが検出されたことから、本実施形態の核酸リンカーがタンパク質をディスプレイする能力を有していることが確認された。

［核酸リンカーの合成２］
２−１ 材料
下記３種のＤＮＡオリゴマーの合成を日本バイオサービスに委託し、自動核酸合成装置を使用して、ホスホロアミダイト法に従って合成した。
（１）ＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−Ｓｅｇｍｅｎｔ
［配列：５’−（ＨＯ−Ｃ_６Ｈ_１２−ＳＳ−Ｃ_６Ｈ_１２）−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−(ＰＣ)−ＴＴＴ（Ｃ−ＣＣＣ−５’）−Ｘ１−(Ｔ−ＮＨ_２)−ＣＣＴ−３’］
Ｘ１は上記のとおりである。

（２）ＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔ
［配列：５’−（Ｂ）−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−(ＰＣ)−ＴＴＴ(Ｃ−ＣＣＣ−５’)−Ｘ１−(Ｔ−ＮＨ_２)−ＣＣＴ−３’］
Ｘ１は上記のとおりである。

（３）Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−ｓｅｇｍｅｎｔ
［配列：５’− （ＨＯ−Ｃ_６Ｈ_１２−ＳＳ−Ｃ_６Ｈ_１２）−ＴＣＴ−（ｓｐｃ１８）−（ｓｐｃ１８）−（ｓｐｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）−３’］

ここで、（ＨＯ−Ｃ_６Ｈ_１２−ＳＳ−Ｃ_６Ｈ_１２）、（Ｃ−ＣＣＣ−５’）、（Ｔ−ＮＨ_２）、（Ｂ）、（ｓｐｃ１８）、（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）は、上記のとおりである。
(ＰＣ)は、［４−（４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｂｕｔｙｒａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−１−(２−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ)−ｅｔｈｙｌ]−２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ)−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：ＰＣ Ｓｐａｃｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）。

２−２ 合成、精製方法
（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの還元）
２．５ｍＭのＰｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔ １８μｌを１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ ９．０）９０μｌと混合し、１Ｍ ＤＴＴを１０μｌ加え、室温で１時間反応させ、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの５’側にあるジスルフィド基をチオール基に還元した。その後、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ ７．２)で平衡化したＮＡＰ−５ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いて、過剰なＤＴＴを除去した。

（ＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−ＳｅｇｍｅｎｔのＥＭＣＳ修飾）
１ｍＭのＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−Ｓｅｇｍｅｎｔ１０μｌを０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ ７．２)１００μｌと混合し、０．１Ｍの二価性架橋剤ＥＭＣＳ （６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）（同仁化学研究所社製）を２０μｌ加えてよく撹拌し、３７℃で３０分間反応させた。その後、エタノール沈澱を行って、反応物を沈澱させ、未反応のＥＭＣＳを除去した。沈澱物を２００μｌの７０％エタノールにて洗浄した。

（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔと、ＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−Ｓｅｇｍｅｎｔ又はＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔとの架橋）
前記ＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−ＳｅｇｍｅｎｔのＥＭＣＳ架橋物の沈澱物、又は前記ＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＳｅｇｍｅｎｔのＥＭＣＳ架橋物の沈澱物を、還元後の前記Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの溶解液（約２０ｎｍｏｌ)に溶解し、４℃で一晩放置した。
その後、エタノール沈澱を行って、反応物を沈澱させた。沈澱物を２００μｌの７０％エタノールにて洗浄した後、３０μｌの滅菌水に溶解した。得られた架橋物を８Ｍ尿素１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＳｙｂｒＧｏｌｄ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)で染色した。
結果を図９に示す。レーン１は１０ｂｐ ＤＮＡ ｓｔｅｐ ｌａｄｄｅｒ (プロメガ社製)、レーン２はＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−Ｓｅｇｍｅｎｔ、レーン３はＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｔｈｉｏｌ−ＳｅｇｍｅｎｔとＰｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの架橋物、レーン４はＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔ、レーン５はＰＣ−Ｂｒａｎｃｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＳｅｇｍｅｎｔとＰｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｓｅｇｍｅｎｔの架橋物である。レーン３，５より目的の架橋物(Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−Ｌｉｎｋｅｒ、及びＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｉｎｋｅｒ)が得られていることが確認された。

（Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−Ｌｉｎｋｅｒ、及びＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒのＨＰＬＣ精製）
上記の様に合成したＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−Ｌｉｎｋｅｒ及びＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒをＨＰＬＣにより精製した。

（ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体の合成）
上述した方法により合成したＢＤＡｍＲＮＡ５ｐｍｏｌと、前記Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−Ｌｉｎｋｅｒ １０ｐｍｏｌ又はＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌｉｎｋｅｒ １０ｐｍｏｌをＴ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ (タカラバイオ社製)中で混合し、９０℃に加熱した後、１５分間かけて２５℃まで冷却した。この溶液に、０．５μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μｌ、東洋紡績社製)と、０．５μｌのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（４０Ｕ／μｌ、タカラバイオ社製)を加えて混合し、２５℃で１５分間反応させた。
反応産物を８Ｍ尿素８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＳｙｂｒＧｏｌｄ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)にて染色した。結果を図１０に示す。
レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ (プロメガ社製)、レーン２はｍＲＮＡ（ＢＤＡ）、レーン３はＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物、レーン４はＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物である。
Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−Ｌｉｎｋｅｒ、Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒともにｍＲＮＡと連結し、高分子量側にバンドがシフトしていることが観察でき、合成した核酸リンカーがｍＲＮＡと連結する能力を有していることが確認できた。

図１１に、ｍＲＮＡ(ＢＤＡ)と、核酸リンカーをハイブリダイズさせたものの概略図を示す。図１１中、Ｐはピューロマイシン、ＰＣは光切断性部位（ニトロベンジル基）を示す。大文字で示した部分はＤＮＡ部分、小文字で示した部分はｍＲＮＡを示す。Ｘは、５’−（Ｂ）−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’を示す。

（無細胞翻訳系による翻訳）
上記のように合成した、核酸リンカーとｍＲＮＡのライゲーション産物を用いて翻訳反応を行った。１ｐｍｏｌのｍＲＮＡ−核酸リンカーライゲーション産物（ｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒライゲーション産物）と０．７２μｌの２０ｘ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ａｍｂｉｏｎ社製）と、１０．２μｌのウサギ網状赤血球の細胞溶解液であるＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ（Ａｍｂｉｏｎ社製）と０．３ μｌのＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔ(ｐｒｏｍｅｇａ社製)に、ＲＮａｓｅフリー水を加えて混合し、１５μｌの混合液とした。
この混合液を３０℃にて２０分間反応させた後、６μｌの３Ｍ 塩化カルシウム溶液と１．８ μlの１ Ｍ 塩化マグネシウム溶液を加え、混合した。この混合液を更に３７℃で３０分間反応させ、ＢＤＡ遺伝子のポリペプチド鎖を合成し、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を形成させた。反応産物を８Ｍ尿素含有ＳＤＳ−６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、タンパク質中に取り込まれたＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔの蛍光シグナルを検出した。
更に、反応産物をＳｙｂｒＧｏｌｄ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)にて染色し、ｍＲＮＡを検出した。結果を図１２に示す。
レーン１はＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物、レーン２はＰｕｒｏ−ＰＣ−Ｔｈｉｏｌ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物の翻訳産物、レーン３は、Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物、レーン４は、Ｐｕｒｏ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物の翻訳産物である。
この泳動結果より、ｍＲＮＡより高分子量側に蛍光シグナルを示すｍＲＮＡ−タンパク質複合体のバンドを確認でき、合成された本実施形態の核酸リンカーがタンパク質ディスプレイ能を有していることが確認された。

以上の結果から、本実施形態の核酸リンカーは、固相上の固定化に最適で、高機能な分子操作を可能にすることが明らかである。

本発明の核酸リンカーは、固相上の固定化に最適で、かつ、高機能な分子操作を可能にするため、網羅的解析に好適に用いられる。そのため、本発明は産業上極めて有用である。

２，１２，２２，１００，１０１…核酸リンカー、２ａ…連結部、２ｂ…固相結合部位、２ｃ，２ｃ１，２ｃ２…切断部位、２ｄ…フルオロセイン、２３…ｍＲＮＡ、３３…タンパク質、５１，６１…３’末端領域、５１ａ…一本鎖ポリヌクレオチド部、５１ｂ…アーム部、５２，６２…一方の領域、５３，６３…他方の領域、６４…ループ領域

Claims (13)

1. ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質との複合体を製造するための核酸リンカーであって、
   １つの３’末端領域と、
   枝分かれした２つの５’末端領域と、からなり、
   前記３’末端領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部と、
   前記１本鎖ポリヌクレオチド部から枝分かれし、末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部と、を含み、
   前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域は、前記ｍＲＮＡの３’末端との結合部位、又は前記ｍＲＮＡの３’末端とハイブリダイズする部位を有し、
   前記２つの５’末端領域のうちの他方の領域は、切断部位を含み、且つ５’末端に固相結合部位を有することを特徴とする核酸リンカー。
2. 前記３’末端領域、及び前記５’末端領域の一方の領域は、切断部位を含む請求項１に記載の核酸リンカー。
3. 前記タンパク質の連結部は、前記アーム部の末端にピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドが結合されてなる請求項１又は２に記載の核酸リンカー。
4. 前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域と前記３’末端領域とはループ領域を形成している請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
5. 前記２つの５’末端領域のうちの一方の領域と前記３’末端領域とは、各々切断部位を含む請求項４に記載の核酸リンカー。
6. ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質との複合体を製造するための核酸リンカーであって、
   前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部を含む３’末端領域と、
   枝分かれした２つの５’末端領域と、
   前記３'末端領域の１本鎖ポリヌクレオチド部から枝分かれした、末端側に前記タンパク質の連結部を有するアーム部と、を備え、
   前記２つの５’末端領域の少なくとも１つの領域は、切断部位と、５’末端に固相結合部位を含むスペーサー領域とを有することを特徴とする核酸リンカー。
7. 前記タンパク質は、酵素、抗体、抗原、アプタマー及びペプチドのいずれか１つを構成する請求項６に記載の核酸リンカー。
8. 前記アーム部は標識物質を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、を連結してなることを特徴とするｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体。
10. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡ及び前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体、並びに前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が連結されていることを特徴とするｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体。
11. 請求項９に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法であって、
    （ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
    （ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
    （ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
    を有することを特徴とするｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法。
12. 請求項１０に記載のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法であって、
    （ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
    （ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
    （ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
    （ｄ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から逆転写によりｃＤＮＡを合成する工程と、
    を有することを特徴とするｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法。
13. 請求項９又は１０に記載のタンパク質複合体が基板上に固定化されてなることを特徴とするタンパク質アレイ。