CN103382579B - 一种体外筛选多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学生物学技术领域,公开了一种体外筛选多肽的方法。针对现有多肽胞内筛选技术的局限性,通过构建一个随机的dsDNA文库并转录成mRNA,在以mRNA为模板进行体外表达前先使其与末端带有嘌呤霉素的寡核苷酸链退火互补。在翻译即将结束时,嘌呤霉素进入核糖体并捕获新生成的多肽链形成共价结构,经反转录,形成一个表达多肽与其编码信息cDNA对应结合的随机文库。筛选结束后,设计引物对获得的cDNA进行PCR扩增,并进入下轮筛选,经过多轮循环,最终获得目标多肽及其编码信息。本发明采用完全体外筛选技术,文库容量可以达到1013~1015;体系稳定、操作简便、筛选效率高。
Description
技术领域
本发明属于化学生物学技术领域,涉及多肽的体外筛选,具体涉及构建一个cDNA-多肽文库并用建立的方法对特定目标多肽进行体外筛选。
背景技术
根据达尔文的进化理论,自然界中生物大分子的选择和进化遵循的都是“适者生存,物竞天择”的原则,但是这个过程往往需要经历上万年,甚至更长的时间。如何在实验室里模拟生物大分子的进化过程,快速产生特定活性的分子,一直是科学家们的一个梦想。
上世纪80年代,密苏里大学哥伦比亚分校的G.P.Smith首次建立了能在试管中进行多肽分子选择与进化研究的展示技术,即噬菌体展示(Phage display),其原理是将外源多肽与噬菌体的一种衣壳多肽融合表达后融合多肽展示在噬菌体的表面,而编码这个融合体的DNA则位于噬菌体的基因组中。噬菌体展示技术的最大特点和优点就是将基因型与表现型有机结合在一起,即噬菌体表面的特定表型(多肽质)与噬菌体中的编码信息(DNA)相对应。如果要得到某个特定的多肽,只须在噬菌体基因组中***随机序列文库,进行特异性筛选,然后对筛选出的多肽上的DNA进行测序,即可知道表达这个多肽的基因序列,将这段序列转化到工程菌中即可实现大规模生产应用。但由于噬菌体展示在构建文库和筛选时都涉及到细胞转染,文库容量受转染效率的影响被限制在109~1010,降低了文库筛选效率,另外,噬菌体展示文库一旦建成,很难再进行有效的体外突变和重组,进而限制了文库中分子遗传的多样性。在噬菌体展示技术之后,世界各国的科学家又先后建立了质粒展示、细菌和酵母表面展示等。然而,它们都依赖于体内基因表达,所建文库的容量和分子多样性最终要受到转化效率、胞内环境等多种因素的限制。所以,寻找不受细胞转染和表达等因素影响的完全体外展示***成为必然。在这种背景下,美国Afflymax研究所的L.C.Mattheakis以及哈佛医学院的J.W.Szostak先后提出了核糖体展示和mRNA展示两种基于体外无细胞表达体系的筛选方法,但这两种方法均是以RNA为模板,所形成的RNA-多肽融合体很难经受住严苛的筛选要求,特别是容易受到RNA酶的降解,从而影响整个筛选过程。
我们提出的DNA展示技术是一种能够在体外进行的新型筛选方法,除不受细胞转染效率影响之外,其所形成的DNA-多肽融合体也更为稳定。因此,DNA展示作为一种新兴的多肽筛选技术,将在新药开发,蛋白质相互作用和蛋白质组学等方面显示出更为广泛的应用空间。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的局限性,建立一种可以从大容量cDNA-多肽文库中筛选特定目标多肽的方法。
本发明的技术方案如下:
将5'位改性嘌呤霉素,见下图:
按固相亚磷酰胺三酯法与一段固定序列的DNA进行连接获得5'-末端带有嘌呤霉素的DNA;化学合成编码多肽库的DNA文库,靠近5'端区域包含有T7启动子、增强子和起始密码子等序列,3'端附近则添加了亲和纯化标签;在体外利用T7RNA聚合酶将DNA转录成mRNA,并且在mRNA的3'端包含有一段能与5'端带有嘌呤霉素的引物形成互补结构的固定序列;进行体外表达时,带有嘌呤霉素的引物和mRNA文库在无细胞翻译体系中共翻译,翻译的末期嘌呤霉素会进入核糖体并捕获新生成的多肽链形成共价结构,经反转录,获得一个表达多肽与其编码信息cDNA对应结合的随机文库,即cDNA-多肽文库,实现基因型和表现型的结合;进行体外筛选时,先将靶标固定于磁珠等固相载体上,再用其来对含有目标多肽的cDNA-多肽文库进行特异性选择;筛选结束后,设计一对引物对获得的cDNA进行PCR扩增,并进入下轮筛选,经过多轮循环,最终获得目标多肽及其编码信息。
本发明所涉及的编码多肽库的DNA文库的构建,是先通过化学方法合成一个带有随机序列的单链DNA文库,再设计一条与单链DNA文库3'端固定序列互补的下游引物,经过两个循环的PCR扩增,得到能够编码多肽库的双链DNA文库。
本发明所涉及的T7启动子是基因的组成部分,为RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列,控制从基因转录成mRNA的起始。
本发明所涉及的增强子是DNA上一小段可与多肽结合,加强基因转录作用的区域。
本发明所涉及的起始密码子是指mRNA上开始翻译成多肽的起点,由3个碱基构成,一般为AUG。其中原核生物的起始密码子AUG翻译对应的是甲酰甲硫氨酸,真核生物的起始密码子AUG翻译对应的是甲硫氨酸。
本发明所涉及的带有嘌呤霉素的引物是一段在5'端带有嘌呤霉素的寡核苷酸序列,碱基数控制在30-60之间,嘌呤霉素则是通过化学方法进行修饰之后偶联到寡核苷酸的末端,由于嘌呤霉素的结构与氨酰tRNA分子中腺苷相连结的氨基酸末端基因相似,在表达时能进入核糖体的A位点与正在延伸的多肽链形成共价结构。
本发明所涉及的无细胞翻译体系是指没有完整细胞的体外多肽翻译合成***,通常利用无细胞提取物提供所需要的核糖体、转移核糖核酸、酶类、氨基酸、能量供应***及无机离子等,在试管中以外加的mRNA指导多肽的合成;常用的无细胞提取物有兔网织红细胞裂解物和麦胚抽提物等;本发明使用的是兔网织红细胞裂解物,反应时先把转录模板和带有嘌呤霉素的引物进行退火,形成互补结构之后加入到兔网织红细胞裂解物中,30℃反应20min即可完成多肽的表达;为了形成更多的DNA与多肽融合物,在表达结束后可以将反应管置于冰上40min,之后加入氯化钾、氯化镁使K+、Mg2+离子浓度分别达到500mM和50mM并于室温放置50min。
本发明所涉及的基因型和表现型的结合是指遗传信息与其编码的多肽对应结合在一起,本发明中基因型和表现型的结合是通过嘌呤霉素在表达的末期进入核糖体并捕获新生成的多肽链形成共价结构的作用实现的。
本发明中所涉及的靶标固定是指根据不同的筛选目的将靶标通过化学方法固定在磁珠等固相载体上对预计包含有能够与靶标发生亲和作用的物质进行选择,此处是指将靶标固定在磁珠上用来对含有目标多肽的cDNA-多肽文库进行特异性选择;带有目标多肽的cDNA-多肽融合体通过与固相载体上的靶标特异性结合而得到分离,然后用洗脱液将cDNA-多肽融合体从固相载体上洗脱下来并进行PCR扩增,从而实现对目标多肽编码基因的富集。
如本文所用,下列词语/术语具有下列含义,除非另外说明。
“DNA”:脱氧核糖核酸。是一类带有遗传信息的生物大分子,由4种主要的脱氧核苷酸(dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)通过3',5'-磷酸二酯键连接而成,是遗传信息的载体。
“cDNA”:互补脱氧核糖核酸。是以mRNA为模板,在适当引物的存在下,经反转录酶催化获得的与mRNA互补的单链脱氧核糖核酸。
“随机的dsDNA文库”:是指包含有在每个碱基位置上具有不同碱基所构成的双链脱氧核糖核酸组合。
“RNA”:核糖核酸。是由核糖核苷酸通过3',5'-磷酸二酯键连接而成的多聚体。
“mRNA”:信使核糖核酸。是携带遗传信息的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。
“PCR”:聚合酶链式反应。是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
“嘌呤霉素”:一种抗生素,广泛用作蛋白质合成的抑制剂。其结构与氨酰tRNA 3′端上的AMP结构相似,肽酰转移酶能促使氨基酸与嘌呤霉素结合形成肽酰嘌呤霉素,从核糖体上脱落,从而使蛋白质合成反应中断。
“体外表达”:生物学上的表达是根据遗传密码的中心法则,将成熟的信使RNA分子中碱基的排列顺序解码,并生成对应的特定氨基酸序列的过程。体外表达则是指在无细胞体系中进行的蛋白质表达过程。
“引物”:一段短的单链RNA或DNA片段,可结合在核酸链上与之互补的区域,其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点,核酸聚合酶可由其3'端开始合成新的核酸链。
“体外筛选”:是指在细胞外通过反复的筛选从核酸或多肽的随机文库中得到具有特殊活性的分子。
本发明所公开的方法关键在于:整个筛选过程均是在体外进行,文库容量极大,大大增加了潜在的目标多肽供选择;另一方面,由于嘌呤霉素的作用,形成的cDNA-多肽文库经筛选之后可以通过PCR扩增使有效多肽得到富集并进入下轮筛选,通过多轮筛选最终获得目标多肽。该方法简便、稳定、高效,可应用于发现RNA、小分子、蛋白质等新的多肽配体和阐明多肽与药物在细胞中的相互作用机制。本发明具有明显优于现有技术的优点,其主要优点包括:
1.文库容量大。现有的噬菌体展示技术,由于在构建文库和筛选时都涉及到细胞转染,文库容量受转染效率的影响被限制在109~1010,降低了文库筛选效率,另外,噬菌体展示文库一旦建成,很难再进行有效的体外突变和重组,进而限制了文库中分子遗传的多样性。而本发明涉及的所有步骤均是在无细胞体系中进行,文库的大小不受转染效率的影响,可达到1013~1015。
2.稳定性高。现有的噬菌体展示技术是将多肽展示在噬菌体的表面,筛选过程中容易出现未折叠的多肽在细菌中被降解的情况,而本发明所表达的多肽是以cDNA为载体,稳定性高,能满足苛刻的筛选条件。
3.操作简便。现有的噬菌体展示技术必须经过细菌转化、噬菌体包装,有的展示***还要经过跨膜分泌过程,操作繁琐,而本发明均不涉及这些操作。
4.筛选效率高。由于本发明具有文库容量大、原理简单、操作简便等优点,数周内便可完成整个多肽筛选过程,筛选效率大大提高。
附图说明
图1是具体实施例1体外筛选多肽的流程示意图。
图2是具体实施例1嘌呤霉素修饰的流程示意图。
图3是具体实施例1嘌呤霉素与寡核苷酸偶联反应的流程示意图。
图4是具体实施例1的表达结果图。
图5是具体实施例1的反转录结果图。
具体实施方式
下面结合附图,通过实例进一步说明本发明。本领域的技术人员应理解,这些实例仅用于说明本发明,而不用于限制本发明的范围。
实施例1、体外筛选多肽
体外筛选多肽的流程见图1。
(1)构建包含随机序列的双链DNA文库。通过化学方法合成带有随机序列的单链DNA文库,加等浓度的下游引物进行两个循环的PCR扩增,最终获得包含T7启动子、增强子、起始密码子、随机序列、亲和纯化标签编码序列的双链DNA随机文库。
单链DNA随机序列(SEQ ID NO 1):
TAATACGACTCACTATAGGAGGACGAAATG(NNN)9CACCACCACCATCATCATCAGCTGCGTAACTC
下游引物(SEQ ID NO 2):GAG TTA CGC AGC TGA TGA
反应体系及PCR条件:
加ddH2O将体系补足到100μl。
PCR条件是:95℃预热1min;95℃变性30s,45℃复性45s,72℃延伸45s,2个循环。
(2)体外转录。以双链DNA为模板,在聚合酶作用下转录获得mRNA,反应体系如下:
超纯水将体系补足到160μl。
(3)多肽的体外表达。以mRNA为模板进行多肽翻译前先使其与末端带有嘌呤霉素的寡核苷酸链退火互补,加入兔网织红细胞裂解物进行表达,反应结束后加入氯化钾、氯化镁使K+、Mg2+离子浓度分别达到500mM和50mM并于室温放置50min。以少量表达体系为例,整个反应步骤和体系如下:
带嘌呤霉素的引物(10uM) 1.7ul
mRNA(约10uM) 1.7ul
ddH2O 7.6ul
(67℃加热10min,室温放置5min)
氨基酸混合物1(不含甲硫氨酸) 0.5ul
氨基酸混合物2(不含亮氨酸) 0.5ul
兔网织红细胞裂解物 8.5ul
(30℃反应20min,冰上放置40min)
KCl(3M) 6.3ul(终浓度500mM)
MgCl2(0.5M) 3.8ul(终浓度50mM)
(室温放置50min)
进行大量表达时,反应体系根据需要按比例放大即可。
(4)反转录。表达结束后,直接往表达体系中加入反转录酶,以mRNA为模板合成cDNA,反应体系如下:
(42℃反应30min,75℃灭活10min)
(5)体外筛选及PCR富集。将靶标固定在磁珠上用来对含有目标多肽的cDNA-多肽文库进行特异性选择,带有目标多肽的cDNA-多肽融合体通过与固相载体上的靶标特异性结合而得到分离,然后用洗脱液将cDNA-多肽融合体从固相载体上洗脱下来并进行PCR扩增,从而实现对目标多肽编码基因的富集,PCR体系如下:
加ddH2O将体系补足到100μl。
上游引物序列(SEQ ID NO 3):TAATACGACTCACTATAGGAGGACGAAATG
下游引物序列(SEQ ID NO 4):GAG TTA CGC AGC TGA TGA
PCR条件是:95℃预热1min;95℃变性30s,45℃复性45s,72℃延伸45s,25个循环。
实施例2、嘌呤霉素的化学修饰
嘌呤霉素经化学修饰获得的最终产物见图2。具体操作步骤如下:a.将100mg嘌呤霉素溶于CH3CN(2ml),0℃搅拌,加入Et3N(60ul),溶液澄清,将Fmoc-oSu(72mg)溶于CH3CN(1ml),0℃滴加至反应液中,继续搅拌,30min后变为白色浑浊液,反应时间约为0℃2h,RT 1h,反应结束后用漏斗过滤回收白色固体产物P1。b.将150mg P1溶于2ml吡啶,充分搅匀,加入200ul三乙胺,0℃搅拌;将400mg DMTrCl溶解于2ml吡啶,再用针将其注入到反应液中,0℃搅拌至室温,过柱回收产物P2。c.将420mg P2溶于6ml吡啶,加入10mgDMAP,冰水浴冷却至0℃,用针慢慢加入0.6ml(Ac)2O,0℃搅拌3h,过柱回收产物P3。d.将380mgP3溶于经干燥处理的5ml CH2Cl2,冰水浴冷却至0℃,加入0.2ml二氯乙酸,0℃搅拌至室温,反应2h,过柱回收产物P4。e.称30mg P4,N2严格保护,加250ul吡啶,35℃搅拌15min使P4完全溶解,溶解后为淡黄色溶液,0℃搅拌,加入35ul DIPEA,搅拌,最后加入20ul亚磷酰氯,0℃反应1h,10℃-15℃反应4h,展开剂按二氯甲烷:乙酸乙酯=1:3经碱性柱过柱回收产物P5;获得的P5将与特定序列的DNA进行连接。
实施例3、改性后的嘌呤霉素与一段固定序列的DNA进行连接,反应步骤与现在广泛使用的固相亚磷酰胺三酯法基本相同,偶联产物通过高效液相分离纯化获得。如图3所示,靠近DNA 5'末端的Spacer18代表含12个碳的聚乙二醇,rC代表在寡核苷酸链上5'-3'方向发生掉转的碱基。
实施例4、图4是以不同mRNA为模板进行多肽表达后的结果。用同位素32P标记一段带有与mRNA模板互补序列的DNA,并在夹板的存在下与实施例3中的偶联产物进行连接,得到可用于捕捉多肽的带嘌呤霉素引物,然后使其与不同长度的mRNA模板退火互补后进行多肽的表达,得到不同长度的DNA-多肽融合体。除mRNA长度与前述反应体系中的不同以外,反应步骤和条件均相同。验证结果分析如下:泳道1是在没有mRNA模板的条件下进行的表达,泳道中没有出现DNA-多肽融合体;泳道2则是以包含有7个氨基酸残基编码信息的mRNA模板表达结果,泳道中上方条带即为DNA-多肽融合体;泳道3是以含16个氨基酸编码信息的mRNA模板表达结果。实验结果证明了本发明的合理性和可靠性。
实施例5、图5是用相同的mRNA模板,不同的引物进行反转录的结果。三条引物均用同位素32P标记,如图所示:泳道1的条带是用一条短的引物反转录获得;泳道2上方的条带是由带嘌呤霉素的引物在反转录酶作用下产生的条带;泳道3中上方的条带则是将DNA-多肽融合体回收后作为引物反转录得到的;泳道4除无模板外,其余与泳道3相同。实验结果进一步证明了本发明的可行性。
Claims (8)
1.一种体外筛选多肽的方法,其特征是:将5'位改性嘌呤霉素,见下图:
按固相亚磷酰胺三酯法与一段固定序列的DNA进行连接获得5'-末端带有嘌呤霉素的DNA;通过构建一个随机的dsDNA文库并转录成mRNA,在以mRNA为模板进行体外翻译前先使其与5’-末端带有嘌呤霉素的DNA退火互补;在翻译即将结束时,嘌呤霉素进入核糖体并捕获新生成的多肽链形成共价结构,经反转录,形成一个表达多肽与其编码信息cDNA对应结合的随机文库;筛选结束后,对获得的cDNA进行PCR扩增,并进入下轮筛选,经过多轮循环,最终获得目标多肽及其编码信息。
2.根据权利要求1所述的体外筛选多肽的方法,其特征是:所述随机的dsDNA文库是两端包含T7启动子、核糖体结合位点、亲和纯化标签的编码基因的固定序列,中间开放阅读框包含有若干随机序列的双链DNA文库。
3.根据权利要求1所述的体外筛选多肽的方法,其特征是:所述mRNA是由dsDNA在T7RNA聚合酶的作用下转录获得,转录在体外进行。
4.根据权利要求1所述的体外筛选多肽的方法,其特征是:所述嘌呤霉素是一种多肽合成抑制剂,结构与氨酰tRNA分子中腺苷相连结的氨基酸末端基因相似,在表达时能进入核糖体的A位点与正在延伸的多肽链形成共价结构。
5.根据权利要求1中所述的体外筛选多肽的方法,其特征是:所述5’-末端带有嘌呤霉素的DNA靠近3'端的部分含有一段15个碱基以上的序列能与连接在mRNA 3'末端的DNA序列互补。
6.根据权利要求1中所述的体外筛选多肽的方法,其特征是:所述体外翻译是指mRNA模板与末端带有嘌呤霉素的寡核苷酸链退火后在兔网织红细胞裂解物中进行共翻译,获得包含目标多肽的DNA-多肽融合体。
7.根据权利要求1中所述的体外筛选多肽的方法,其特征是:所述反转录是指在嘌呤霉素捕获多肽形成DNA-多肽融合体后在反转录酶的作用下以mRNA为模板,带嘌呤霉素的寡核苷酸为引物合成cDNA。
8.根据权利要求1中所述的体外筛选多肽的方法,其特征是:所述筛选是指用固定于磁珠固相载体上的靶标对含有目标多肽的cDNA-多肽文库进行特异性选择。
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