KR101827015B1 - 아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ) 관련된 질환의 치료 - Google Patents

아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ) 관련된 질환의 치료 Download PDF

Info

Publication number
KR101827015B1
KR101827015B1 KR1020127006017A KR20127006017A KR101827015B1 KR 101827015 B1 KR101827015 B1 KR 101827015B1 KR 1020127006017 A KR1020127006017 A KR 1020127006017A KR 20127006017 A KR20127006017 A KR 20127006017A KR 101827015 B1 KR101827015 B1 KR 101827015B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antisense
adiponectin
adipoq
delete delete
oligonucleotide
Prior art date
Application number
KR1020127006017A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120046767A (ko
Inventor
조셉 콜라드
올가 크로코바 셔만
Original Assignee
큐알엔에이, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 큐알엔에이, 인크. filed Critical 큐알엔에이, 인크.
Publication of KR20120046767A publication Critical patent/KR20120046767A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101827015B1 publication Critical patent/KR101827015B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/313—Phosphorodithioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/316—Phosphonothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

본 발명은 아디포넥틴(ADIPOQ)의 발현 및/또는 기능을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 아디포넥틴(ADIPOQ)의 천연 안티센스 폴리뉴클레오티드에 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관계한다. 본 발명은 또한 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 확인 및 아디포넥틴(ADIPOQ)의 발현과 관련된 질환 및 장애의 치료에 이를 사용하는 용도에 관계한다.

Description

아디포넥틴(ＡＤＩＰＯＱ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 아디포넥틴(ＡＤＩＰＯＱ) 관련된 질환의 치료{TREATMENT OF ADIPONECTIN (ADIPOQ) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO AN ADIPONECTIN (ADIPOQ)}
본 출원은 2009년 8월 11일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 No. 61/232,917 및 2009년 10월 20일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 No.61/253,187의 우선권을 주장하며, 이는 전문이 참고문헌에 통합된다.
본 발명의 구체예들은 아디포넥틴(ADIPOQ)와 연합된 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
DNA-RNA 및 RNA-RNA 혼성화는 DNA 복제, 전사, 및 해독을 포함하는 많은 측면의 핵산 기능에 중요하다. 혼성화는 또한 특정 핵산을 탐지하거나 또는 이의 발현을 변경하는 다양한 기술의 중심이다. 안티센스 뉴클레오티드는 예를 들면, 표적 RNA에 혼성화되어, 그것에 의해 RNA 접합(splicing), 전사, 해독, 및 복제를 간섭함으로써 유전자 발현을 붕괴시킨다. 안티센스 DNA는 DNA-RNA 혼성물이 대부분 유형의 세포에 존재하는 활성인 리보뉴클레아제 H에 의한 절단(digestion)에 기질 역할을 하는 추가 특징을 가진다. 안티센스 분자들은 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODNs)의 경우에서와 같이 세포로 전달될 수 있거나, 또는 RNA 분자들과 같은 내생 유전자로부터 발현될 수 있다. FDA는 최근 안티센스 약물, VITRAVENE™ (사이토메갈로바이러스 레티니티스 (cytomegalovirus retinitis) 치료용)을 승인하였는데, 이는 안티센스가 치료 용도를 가진다는 것을 반영한다.
요약
한 구체예에서, 본 발명은 천연 안티센스 전사체의 임의의 부위를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(들)을 이용하여 천연 안티센스 전사체의 작용을 억제시켜 대응하는 센스 유전자를 상향-조절하는 방법을 제공한다. 또한 여기에서 천연 안티센스 전사체의 억제는 siRNA, 리보자임 그리고 소(small) 분자들에 의해 이루어질 수 있는데, 이또한 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주한다.
한 구체예는 생체내 또는 시험관내에서 환자의 세포 또는 조직내 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 전술한 세포 또는 조직에 길이가 5 내지 30개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 3의 뉴클레오티드 1 내지 416중, 또는 서열 번호: 4의 1 내지 3591중 또는 서열 번호: 5의 1 내지 875중 또는 서열 번호: 6의 1 내지 194중 5 내지 30개 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 역(reverse) 보체에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며, 이러한 접촉에 의해 생체내 또는 시험관내 환자의 세포 또는 조직에서 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절한다.
또다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 천연 안티센스 서열을 표적으로 하는데, 예를 들면, 서열 번호: 3 내지 6에서 제시된 뉴클레오티드, 그리고 이에 대한 임의의 변이체들, 대립유전자, 상동체들, 돌연변이들, 유도체들, 단편들 그리고 보체 서열들을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예는 서열 번호: 7 내지 31에 제시된다.
또다른 구체예는 생체내 또는 시험관내에서 환자의 세포 또는 조직내 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 전술한 세포 또는 조직에 길이가 5 내지 30개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 안티센스의 역 보체에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며, 이러한 접촉에 의해 생체내 또는 시험관내 환자의 세포 또는 조직에서 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절한다.
또다른 구체예는 생체내 또는 시험관내에서 환자의 세포 또는 조직내 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 전술한 세포 또는 조직에 길이가 5 내지 30개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ) 안티센스 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며, 이러한 접촉에 의해 생체내 또는 시험관내 환자의 세포 또는 조직에서 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절한다.
한 구체예에서, 조성물은 센스 및/또는 안티센스 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
또다른 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 또는 치환된 뉴클레오티드를 포함한다.
또다른 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 결합(bonds)을 포함한다.
또다른 구체예에서, 상기 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 펩티드 핵산, 2’-O-메틸, 플루오로- 또는 탄소, 메틸렌 또는 기타 잠김 핵산 (LNA) 분자들을 포함하는 변형된 염기를 포함한다. 바람직하게는, 상기 변형된 뉴클레오티드는 α-L-LNA을 포함하는 잠김 핵산 분자들이다.
또다른 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 환자의 피하로, 근육내로, 정맥내로 또는 복막내로 투여된다.
또다른 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 약제 조성물내에서 투여된다. 치료 섭생은 환자에게 최소한 한 번 안티센스 화합물을 투여하는 것을 포함하나; 그러나, 이러한 치료는 일정 시간에 걸쳐 다중 투약을 포함하도록 변형될 수 있다. 이 치료는 하나 이상의 다른 유형의 치료법과 결합될 수 있다.
또다른 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 리포좀에 포집되거나 또는 운반체 분자 (가령, 콜레스테롤, TAT 펩티드)에 부착될 수 있다.
다른 측면들은 아래에서 설명된다.
도 1은 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포를 치료 후 대조군과 비교하였을 때, ADIPOQ1 mRNA에서 변화 배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 ADIPOQ mRNA 수준은 ADIPOQ 안티센스 AA515150에 대해 기획된 2개 올리고, BC036509에 대해 기획된 1개 올리고로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. CUR-1023 내지 CUR-1029로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 7 내지 13으로 처리된 시료에 대응한다.
도 2는 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포를 치료 후 대조군과 비교하였을 때, ADIPOQ1 mRNA에서 변화 배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 ADIPOQ mRNA 수준은 ADIPOQ 안티센스 AA515150에 대해 기획된 2개 올리고(CUR-1107 및 1108), BC036509에 대해 기획된 1개 올리고(CUR-1110)로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. CUR-1107, CUR-1108, CUR-1106, CUR-1110 및 CUR-1109로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 14 내지 18로 처리된 시료에 대응한다.
도 3은 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 Vero 세포를 치료 후 대조군과 비교하였을 때, ADIPOQ1 mRNA에서 변화 배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 Vero 세포들내에 ADIPOQ mRNA 수준은 ADIPOQ 안티센스 AA515150에 대해 기획된 1개 올리고(CUR-1107), BC036509에 대해 기획된 1개 올리고(CUR-1110)로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. CUR-1107, CUR-1108, CUR-1106, CUR-1110 및 CUR-1109로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 14 내지 18로 처리된 시료에 대응한다.
도 4는 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포를 치료 후 대조군과 비교하였을 때, ADIPOQ1 mRNA에서 변화 배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 ADIPOQ mRNA 수준은 ADIPOQ 안티센스 AA515150에 대해 기획된 2개 올리고로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. CUR-1167 내지 CUR-1171로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 19 내지 23으로 처리된 시료에 대응한다.
도 5는 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포를 치료 후 대조군과 비교하였을 때, ADIPOQ2 mRNA에서 변화 배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 ADIPOQ2 mRNA 수준은 ADIPOQ 안티센스 Skerblarbu.aApr ADIPOR2에 대해 기획된 올리고중 하나로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. CUR-1068 내지 CUR-1071 및 CUR-1078 내지 CUR-1081로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 24 내지 31로 처리된 시료에 대응한다.
도 6은 강조된 AA515150에 대해 기획왼 올리고의 위치와 Rhesus 게놈과 함께 배열된 천연 안티센스 서열 AA515150을 나타낸다.
도 7은 강조된 skerblarbu.a.Apr07에 대해 기획왼 올리고의 위치와 Rhesus 게놈과 함께 배열된 천연 안티센스 서열 skerblarbu.a.Apr07을 나타낸다.
서열 목록 설명
서열 번호: 1: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 아디포넥틴, C1Q 및 (ADIPOQ)을 포함하는 콜라겐 도메인, 전사체 변이체 2, mRNA (NCBI 수탁 번호: NM_004797);
서열 번호: 2: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 아디포넥틴 수용체 2 (ADIPOR2), mRNA(NCBI 수탁 번호: NM_024551);
서열 번호: 3: 천연 안티센스 서열 (AA515150);
서열 번호: 4: 천연 안티센스 서열 (BC036509);
서열 번호: 5: 천연 안티센스 서열 (LOC729097.aApr07);
서열 번호: 6: 천연 ADIPOQ1 안티센스 서열 (skerblarbu.aApr07);
서열 번호: 7 내지 31: 안티센스 올리고뉴클레오티드.
*는 포스포티오에이트 결합을 나타낸다.
본 발명의 몇 가지 측면들은 설명을 위한 실시예를 참고하여 하기에서 설명된다. 본 발명의 충분한 이해를 제공하기 위하여 다수의 특정 상세한 설명, 관계 및 방법들이 제공됨을 인지해야 한다. 그러나, 당업계 숙련자는 하나 이상의 특정 상세한 내용 없이 또는 기타 방법으로 본 발명을 실시할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 발명은 일부 작용이 상이한 순서 및/또는 다른 작용 또는 사건과 동시에 발행될 수 있기 때문에 작용 또는 사건의 순서에 제한되지 않는다. 더욱이, 본 발명에 따른 방법을 실행하기 위하여 모든 설명된 작용 또는 사건이 모두 요구되지는 않는다.
여기에서 공개된 모든 유전자, 유전자 이름, 그리고 유전자 산물들은 여기에서 공개된 조성물 및 방법을 적용할 수 있는 특정 종의 상동체에 대응한다. 따라서, 이들 용어는 인간 및 마우스의 유전자 및 유전자 산물들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 종의 유전자 또는 유전자 산물을 공개할 때, 이러한 공개는 설명을 위함이며, 명시적으로 다른 언급이 없는 한 이를 한정시키는 것으로 해석해서는 안된다. 따라서, 예를 들면, 일부 구체예에서는 포유동물 핵산 및 아미노산 서열에 관련된 여기에서 공개된 유전자는 기타 포유동물, 물고기, 양서류, 파충류 및 조류를 포함하나 이에 한정되지 않는 기타 동물들의 동족(homologous) 및/또는 진화종(orthologous) 유전자 및 유전자 산물들을 포함한다. 구체예들에서, 유전자 또는 핵산 서열은 사람이다.
정의
여기에서 사용된 정의는 오로지 특정 구체예들을 설명하기 위함이며, 본 발명을 이에 한정시키고자 함은 아니다. 여기에서 사용된 것과 같이, 단수형은 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 복수 개념을 포함한다. 더욱이, 상세한 설명 및/또는 청구범위에 이용된 포함하는("including"), 포함하다("includes"), 가지는("having"), 가지다("has"), ~와 함께("with") 또는 이의 변이체들에 대해서, 이러한 용어들은 포함하는("comprising")과 유사한 방법으로 포괄적인 의도이다.
용어 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 당업계 숙련자가 결정하였을 때 특정 값에 대해 용인가능한 오차 범위내에 있다는 것을 의미하며, 측정 시스템의 한계내에서 그 값이 어떻게 측정되거나 또는 결정되는 지에 따라 부위적으로 달라질 것이다. 예를 들면, "약"은 당업계 실시과정마다 1이내 또는 1이상의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더 바람직하게는 최대 5%, 그리고 더욱더 바람직하게는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 대해, 이 용어는 값의 10배 범위, 바람직하게는 5-배이내, 그리고 더 바람직하게는 2-배이내를 의미한다. 특정 값이 명세서 및 청구항에 설명된 경우, 다른 언급이 없는 한, 용어 "약"은 특정 값의 수용가능한 오차 범위내에 있는 것을 의미하는 것으로 간주해야만 한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "mRNA"는 표적 유전자의 현재 공지된 mRNA 전사체(들) 그리고 추가로 밝혀질 임의의 추가 전사체를 의미한다.
"안티센스 올리고뉴클레오티드" 또는 "안티센스 화합물"은 또다른 RNA 또는 DNA (표적 RNA, DNA)에 결합하는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다. 예를 들면, 만일 RNA 올리고뉴클레오티드라면, RNA-RNA 상호작용 수단에 의해 또다른 RNA 표적에 결합하고, 표적 RNA의 활성을 변경시킨다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 폴리뉴클레오티드의 발현 및/또는 기능의 하향 또는 상향조절할 수 있다. 이 정의는 치료, 진단, 또는 기타 견지로부터 유용한 임의의 외부 RNA 또는 DNA 분자를 포함한다는 것을 의미한다. 이러한 분자들은 예를 들면, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자들, 간섭 RNA (RNAi), micro RNA, 유인(decoy) RNA 분자들, siRNA, 효소 RNA, 치료 편집(editing) RNA 그리고 항진 및 길항 RNA, 안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 외부 가이드 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, 선택적 접합자(alternate splicers), 프라이머, 프로브, 및 표적 핵산의 최소한 일부위에 혼성되는 기타 올리고머 화합물을 포함한다. 이와 같이, 이들 화합물들은 단일-가닥, 이중-가닥, 부위적으로 단일-가닥, 또는 원형 올리고머 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
본 발명의 내용에서, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머 또는 이의 모방체를 말한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 이의 치환된 그리고 알파-아노머 형태, 펩티드 핵산 (PNA), 잠김(locked) 핵산 (LNA), 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 그리고 이와 유사한 것을 포함하는, 천연 및/또는 변형된 모노머 또는 링키지의 선형 또는 고리형 올리고머를 또한 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 모노머-대-모노머 상호작용의 정규적 패턴, 가령, Watson-Crick 유형의 염기 쌍, Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 유형의 염기 쌍형성, 또는 이와 유사한 것에 의해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드는 상이한 부위를 포함하는 키메라("chimeric")일 수 있다. 본 발명의 문맥에서, "키메라" 화합물들은 2개 이상 화학 부위, 예를 들면, DNA 부위(들), RNA 부위(들), PNA 부위(들) 등을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 각 화학 부위는 최소한 한 개의 모노머 단위, 가령, 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우 뉴클레오티드로 구성된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 최소한 한 부위를 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 바람직한 성질들을 나타내도록 변형된다. 올리고뉴클레오티드의 바람직한 성질들은 예를 들면, 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 저항성, 증가된 세포의 취입(uptake), 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화력을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 올리고뉴클레오티드의 상이한 부위는 따라서 상이한 성질들을 가질 수 있다. 본 발명의 키메라 올리고뉴클레오티드는 상기에서 설명된 것과 같이 2개 이상 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 유사체들의 혼합된 구조로 형성될 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드는 "리지스터(register)"내에서 연결될 수 있는 부위로 구성될 수 있는데, 즉, 모노머가 고유 DNA에서와 같이 연속적으로 연결되거나 또는 스페이스를 통하여 연결될 수 있다. 스페이스는 부위 사이에 공유 “다리”를 구성하고, 바람직한 경우에 약 100개 탄소 원자를 초과하지 않는 길이를 가진다. 스페이스는 상이한 기능성, 예를 들면, 양전하 또는 음전하를 가지며, 특정 핵산 결합 성질들 (인터카레이터(intercalators), 홈 결합자(groove binders), 독소, 형광단(fluorophors) etc.)을 나를 수 있고, 친지성일 수 있으며, 예를 들면, 알파-나선을 유도하는 알라닌을 포함하는 펩티드와 같이, 특정 2차 구조를 유도할 수 있는 등의 상이한 기능을 전달할 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, "아디포넥틴(ADIPOQ)"은 모든 패밀리 구성요소들, 돌연변이들, 대립유전자, 단편들, 종, 코딩 및 넌코딩 서열들, 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 가닥들, 등을 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 아디포넥틴1, ADIPOQ1, 30 kDa 함지방세포(adipocyte) 보체-관련된 단백질, ACDC, ACRP30, 함지방세포, C1q 및 콜라겐 도메인-함유 단백질, 함지방세포 보체-관련된 30 kDa 단백질, 아디포넥틴(adiponectin), 아디포넥틴(Adiponectin), AdipoQ, 아디포즈(Adipose) 가장 풍부한 유전자 전사체 1 단백질, ADIPQTL1, ADPN, apM1, APM1, apM-1, APM-1, GBP28 및젤라틴-결합 단백질은 문헌에서 동일한 것으로 간주되며, 그리고 본 출원에서 호환 사용된다.
여기에서 사용된 것과 같이, 단어 ACDCR2, 아디포넥틴(Adiponectin) 수용체 단백질 2, FLJ21432, MGC4640, PAQR2, 프로게스틴(Progestin) 및 adipoQ 수용체 족 구성원 II는본 출원에서 호환 사용된다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "~에 특이적인 올리고뉴클레오티드 " 또는 "~을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드" (i) 표적 유전자의 일부분과 안정적인 복합체를 형성할 수 있는, 또는 (ii) 표적 유전자의 mRNA 전사체의 일부분과 안정적인 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 말한다. 복합체와 듀플렉스의 안정성은 이론적 계산 및/또는 시험관 분석에 의해 결정할 수 있다. 혼성화 복합체들 및 듀플렉스의 안정성을 결정하는 예시적인 분석들은 하기 실시예에서 설명한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "표적 핵산"은 DNA, 및 이러한 DNA로부터 전사된 RNA (premRNA 및 mRNA를 포함), 그리고 이러한 RNA, 코딩, 넌코딩 서열들, 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드로부터 유도된 cDNA를 포함한다. 올리고머 화합물과 이의 표적 핵산의 특이적 혼성화는 이 핵산의 정상적 기능을 간섭한다. 화합물들에 의한 표적 핵산의 기능 조절, 특별히 이에 혼성화되어 기능을 조절하는 것을 일반적으로 "안티센스"라고 한다. 간섭될 DNA의 기능은 예를 들면, 복제 및 전사를 포함한다. 간섭될 RNA의 기능은 모든 중요한 기능, 예를 들면, RNA가 단백질 해독 부위로 전위, RNA로부터 단백질의 해독, 하나 이상의 mRNA 종을 만들기 위한 RNA의 접합, 그리고 RNA에 관여하는 또는 RNA에 의해 실행되는 촉매 활성을 포함하는 기능을 포함한다. 표적 핵산 기능의 이러한 간섭의 전반적인 효과는 인코드된 산물 또는 올리고뉴클레오티드의 발현 조정이다.
RNA 간섭 "RNAi"는 이들의 "표적" 핵산 서열들에 서열-특이적 상동성을 가지는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자들에 의해 중재된다. 본 발명의 특정 구체예들에서, 중개물질은 5-25개의 뉴클레오티드 "작은 간섭" RNA 듀플렉스 (siRNAs)다. siRNAs는 Dicer로 공지된 RNase 효소에 의해 dsRNA의 프로세싱으로부터 유도된다 . siRNA 듀플렉스 산물들은 RISC (RNA Induced Silencing Complex)라고 불리는 다중-단백질 siRNA 복합체로 다시 모이게된다. 특정 이론에 결부되는 것을 원하지 않고, 그 다음 RISC는 표적 핵산(적합하게는 mRNA)으로 안내되고, 여기서 siRNA 듀플렉스는 촉매적 방식에서 절단을 중재하기 위하여 서열-특이적 방식으로 상호작용한다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 작은 간섭 RNAs는 숙련자들이 잘 알고 있는 당업계에 공지되어 있는 과정에 따라 합성되고 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 적합하게 이용하기 위한 작은 간섭 RNAs는 약 1 내지 약 50개 뉴클레오티드 (nt)를 포함한다. 비-제한적 구체예들의 실시예에서, siRNAs는 약 5 내지 약 40개 nt, 약 5 내지 약 30 개 nt, 약 10 내지 약 30개 nt, 약 15 내지 약 25개 nt, 또는 약 20-25개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
적당한 올리고뉴클레오티드의 선택은 핵산 서열들을 자동으로 배열하고, 동일 또는 상동 부위를 표시하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 용이하게 한다. 이러한 프로그램을 이용하여 핵산 서열들은 GenBank와 같은 데이터베이스 조사에 의해 또는 PCR 산물의 서열화에 의해 수득된 핵산 서열들을 비교한다. 다양한 종 범위로부터 핵산 서열들을 비교하면 종간에 적당한 수준의 동일성을 나타내는 핵산 서열들을 선별한다. 서열화되지 않은 유전자의 경우, Southern 블랏을 실행하여 표적 종과 기타 종에서 유전자간에 동일성 수준을 결정한다. 당업계에 공지되어 있는 것과 같이, 다양한 수준의 엄격성(stringency)에서 Southern 블랏을 실행함으로써, 동일성의 대략적인 측정이 가능하다. 이러한 과정은 또한 제어해야할 대상에서 표적 핵산 서열에 높은 수준의 상보성을 나타내며, 기타 종에서 대응 핵산 서열에 대해 더 낮은 수준의 상보성을 나타내는 올리고뉴클레오티드의 선택을 허용한다. 당업계 숙련자는 본 발명에 사용하는 적당한 부위 유전자를 선택함에 있어서 상당한 허용범위가 있다는 것을 인지할 것이다.
"효소 RNA"는 효소 활성을 가진 RNA 분자를 의미한다. 효소 핵산 (리보자임)은 표적 RNA에 우선 결합하여 작용한다. 이러한 결합은 표적 RNA를 절단하도록 작용하는 분자의 효소 부분에 근접하게 있는 효소 핵산의 표적 결합 부분을 통하여 일어난다. 따라서, 효소 핵산은 염기 쌍형성을 통하여 표적 RNA를 먼저 인지하고, 그 다음 이에 결합하고, 그리고 정확한 부위에 일단 결합했다면, 효소적으로 작용하여 표적 RNA를 절단한다.
"유인(decoy) RNA" 는 리간드에 대한 천연 결합 도메인을 모방한 RNA 분자를 의미한다. 따라서, 유인 RNA는 특정 리간드의 결합에 대해 천연 결합 표적과 경쟁한다. 예를 들면, HIV 트란스-활성화 반응(TAR) RNA의 과다발현은 "유인"으로 작용하여 HIV tat 단백질에 효과적으로 결합하고, HIV RNA내에 인코드된 TAR 서열에 이의 결합을 방해하는 것으로 나타났다. 이는 특정 실시예를 의미한다. 당업계 숙련자들은 이것은 하나의 예일 뿐이며, 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 기술을 이용하여 기타 구체예들을 바로 만들 수 있다는 것을 인지할 것이다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "모노머"는 전형적으로 소수의 모노머 단위, 약 3-4개부터 약 수백개의 모노머 단위까지 범위의 올리고뉴클레오티드를 만들기 위하여 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 모노머 또는 이의 유사체를 나타낸다. 포스포디에스테르 링키지(linkages)의 유사체들은 하기에서 더 상세하게 설명하는 것과 같이, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포르네이트, 포스포로셀레네이트, 포스포로아미데이트, 그리고 이와 유사한 것을 포함한다.
용어 “뉴클레오티드”는 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 자연적으로 생성되지 않는 뉴클레오티드를 포함한다. 기존에 "자연적으로 생성되지 않는" 것으로 간주된 다양한 뉴클레오티드는 실질적으로 자연에서 볼 수 있다는 것은 당업계 숙련자에게 분명하게 해야만 한다. 따라서, "뉴클레오티드"는 공지의 퓨린 및 피리미딘 이형고리를 포함하는 분자들 뿐만 아니라, 이형고리 유사체 및 이의 호변체(tautomers)를 포함한다. 다른 유형의 뉴클레오티드의 예시적인 예는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우라실, 퓨린, 산틴, 디아미노퓨린, 8-옥소- N6-메틸아데닌, 7-데아자산틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노시토신, N6,N6-에타노-2,6- 디아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-(C3-C6)-알키닐시토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소시토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소시토신, 이소구아닌, 이노신 및 미국 특허 제5,432,272호에서 설명된 "자연적으로 생성되지 않는" 뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드"는 이들 예들 모두와 이의 유사체 및 이의 호변체를 모두 포함한다. 특히 흥미로운 뉴클레오티드는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우라실을 포함하는 것으로, 이들은 인간에서 치료 및 진단 사용과 관련된 천연 발생 뉴클레오티드로 간주된다. 뉴클레오티드는 Kornberg and Baker , DNA Replication , 2 nd Ed . ( Freeman , San Francisco, 1992)에서 설명하는 것과 같은 천연 2'-데옥시 및 2'-하이드록시 슈가 및 이들의 유사체들을 포함한다.
뉴클레오티드와 관련된 "유사체들"은 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 슈가 모이어티를 가지는 합성 뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 유사체들은 결합 성질들 예를 들면, 듀플렉스 또는 트리플렉스 안정성, 특이성, 또는 이와 유사한 것을 강화시키도록 기획된 합성 뉴클레오티드를 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, "혼성화"는 올리고머 화합물들의 실질적인 보체 가닥들이 쌍을 형성하는 것(페어링)을 말한다. 페어링의 한 기전은 올리고머 화합물들의 가닥들의 상보적 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기(뉴클레오티드) 사이에 수소 결합을 포함하며, Watson-Crick, Hoogsteen 또는 역전된 Hoogsteen 수소 결합 결합이 될 수 있다. 예를 들면, 아데닌 및 티민은 수소 결합 형성을 통하여 쌍을 이루는 보체 뉴클레오티드다. 혼성화는 다양한 환경하에서 일어날 수 있다.
안티센스 화합물은 화합물이 표적 핵산에 결합하여, 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭함으로써 기능 및/또는 활성의 조절이 야기될 때, “특이적으로 결합하고”그리고 특이적 결합이 바람직한 조건, 가령, 생체내 분석 또는 치료의 경우 생리학적 조건하에, 그리고 시험관 분석의 경우 분석이 실행되는 조건하에서 비-표적 핵산 서열에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피하도록 충분한 보체 수준을 가진다.
여기에서 사용된 것과 같이, "엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 본 발명의 화합물은 이의 표적 서열에 혼성화되지만, 기타 서열들에는 최소한의 수로 혼성화되는 조건을 말한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 상이한 환경에서 달라질 것이며, 그리고 본 발명의 문맥에서, 올리고머 화합물들이 표적 서열에 혼성화되는 “엄격한 조건”은 올리고머 화합물들의 성질 및 조성물 그리고 조사될 분석에 의해 결정된다. 일반적으로, 엄격한 혼성화 조건은 Na++ 또는 K++와 같은 무기 양이온(가령, 낮은 이온 강도)과 낮은 염 농도(<0.15M), 올리고머 화합물:표적 서열 복합체의 Tm보다 아래의 20°C 내지 25℃보다 더 높은 온도, 그리고 포름아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸 술폭시드, 또는 세제 도데실 설페이트 나트륨(SDS)과 같은 변성제의 존재를 포함한다. 예를 들면, 혼성화 비율은 1% 포름아미드의 경우 1.1%로 감소된다. 높은 엄격성 혼성화 조건의 예는 60℃에서, 30분간 0.1× 염화나트륨-구연산나트륨 완충액(SSC)/0.1% (w/v) SDS이다.
"상보성"은 여기에서 사용된 것과 같이, 하나 또는 두개의 올리고머 가닥들상에서 2개 뉴클레오티드간에 정확한 페어링 능력을 말한다. 예를 들면, 안티센스 화합물의 특정 위치에 핵염기가 표적 핵산의 특정 위치의 핵염기와 수소결합할 수 있다면, 상기 표적 핵산은 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자이고, 그 다음 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 위치는 상호적 위치로 간주한다. 올리고머 화합물 및 추가 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자는 각 분자에서 충분한 수의 상보성 위치가 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때 서로에 대해 상보성이다. 따라서, "특이적으로 혼성화가능한" 그리고 "상보성"은 올리고머 화합물과 표적 핵산 사이에 안정적이고 특이적인 결합이 일어나도록 충분한 수의 뉴클레오티드에 걸쳐 충분한 수준의 정확한 페어링 또는 상보성을 나타낼 때 사용되는 용어들이다.
올리고머 화합물의 서열은 특이적으로 혼성화되는 이의 표적 핵산의 서열에 100% 상보성일 필요가 없다는 것을 인지할 것이다. 더욱이, 올리고뉴클레오티드는 사이에 있는 또는 인접 단편(가령, 루프 구조, 미스매취 또는 헤어핀 구조)은 혼성화 과정에 관여하지 않도록 하나 이상의 단편에 걸쳐 혼성화될 수 있다. 본 발명의 올리고머 화합물들은 이들이 표적으로 하는 표적 핵산 서열내에 표적 부위에 대해 최소한 약 70%, 또는 최소한 약 75%, 또는 최소한 약 80%, 또는 최소한 약 85%, 또는 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95%, 또는 최소한 약 99% 서열 상보성을 포함한다. 예를 들면, 안티센스 화합물의 20개 뉴클레오티드중 18개가 표적 부위에 상보성이어서, 이에 때라 특이적으로 혼성화되는 안티센스 화합물은 90% 상보성을 나타낼 것이다. 이러한 예에서, 나머지 비-상보성 뉴클레오티드는 상보성 뉴클레오티드와 덩어리를 형성하거나 또는 간섭하게 될 수 있고, 그리고 서로 또는 상보성 뉴클레오티드에 인접해있을 필요는 없다. 이와 같이, 표적 핵산과 완전한 상보성을 가진 두 개 부위의 측면에 있는 4개의 비-상보성 뉴클레오티드를 가진 길이가 18개의 뉴클레오티드인 안티센스 화합물은 표적 핵산과 전체적으로 77.8% 상보성을 가질 것이며, 따라서, 본 발명의 범위에 속한다. 표적 핵산 부위와 안티센스 화합물의 상보성 비율은 당업계에 공지되어 있는 BLAST 프로그램 (기본적인 국소 배열 연구 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 일상적으로 결정할 수 있다. 상동성 비율, 서열 동일성 또는 상보성은 Smith 및 Waterman의 알고리즘(Adv . Appl . Math ., (1981) 2, 482-489)을 이용하는 디폴트 세팅을 이용하여 예를 들면, Gap 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package , Version 8 for Unix , Genetics Computer Group , University Research Park, Madison Wis .)에 의해 결정될 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "열 융점(Tm)"은 정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에서 표적 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 혼성화될 때 온도를 말한다. 전형적으로, 엄격성 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 최소한 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도(또는 이들의 염)이며, 이 온도는 짧은 올리고뉴클레오티드 (가령, 10 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우 최소한 약 30℃이다. 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가하며 얻을 수도 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, "조정(modulation)"은 유전자의 발현을 증가(자극) 또는 감소 (억제)를 의미한다.
폴리뉴클레오티드 서열의 내용에서 이용된 용어 “변이체(variant)”는 야생형 유전자에 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이 정의에는 예를 들면, "대립유전자(allelic)", "접합(splice)", "종(species)", 또는 "다형성(polymorphic)" 변이체를 포함한다. 접합 변이체는 기준 분자에 대해 상당한 동일성을 가질 수 있지만, mRNA 프로세싱 동안 엑손의 교대 접합으로 인하여 더 많은 또는 더 적은 수의 폴리뉴클레오티드를 가질 수 있다. 대응하는 폴리펩티드는 추가 기능 도메인을 가지거나 또는 도메인이 없을 수 있다. 종 변이체는 종마다 다양한 폴리뉴클레오티드 서열들이다. 본 발명에 특히 유용한 것은 야생형 유전자 산물의 변이체다. 변이체들은 핵산 서열에서 최소한 하나의 돌연변이로 인하여 발생될 수 있고, 그리고 변경된 mRNA 또는 기능 또는 구조가 변경된 또는 변경되지 않은 폴리펩티드를 만들 수 있다. 임의의 주어진 천연 또는 재조합 유전자는 대립유전자가 없거나 하나 또는 많은 대립유전자를 가질 수 있다. 변이체를 발생시키는 공통의 돌연변이적 변화는 뉴클레오티드의 천연 결손, 추가 또는 치환으로 인한 것이다. 이들 유형의 각 변화는 단독으로 일어나거나, 다른 것과 함께 일어날 수 있고, 주어진 서열에서 1회 이상 발생될 수 있다.
생성된 폴리펩티드는 서로에 대해 상당한 아미노산 동일성을 일반적으로 가질 것이다. 다형성 변이체는 주어진 종의 개체간에 특정 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열에서 변화이다. 다형성 변이체는 또한 "단일 뉴클레오티드 다형성" (SNPs) 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 한 개 염기에 의해 변화되는 단일 염기 돌연변이를 포함할 수 있다. SNPs의 존재는 예를 들면, 민감성 대 저항성의 질병 상태에 대한 성향을 가진 특정 집단을 나타낼 수 있다.
유도체 폴리뉴클레오티드는 화학 변형을 받게 된 핵산, 예를 들면, 알킬, 아실, 또는 아미노 기에 의해 치환된 핵산을 포함한다. 유도체들, 가령, 유도체 올리고뉴클레오티드는 변형된 슈가 모이어티 또는 슈가 간 링키지와 같은 천연에서 발생되지 않은 부분들을 포함할 수 있다. 이들중 예로는 당업계에 공지되어 있는 포스포로티오에이트 및 기타 황을 포함하는 종들이다. 유도체 핵산은 방사능뉴클레오티드, 효소, 형광 물질, 화학적발광 물질, 발색 물질, 기질, 공인자, 억제, 자성 입자, 그리고 이와 유사한 것을 포함하는 표지를 또한 포함할 수 있다.
"유도체" 폴리펩티드 또는 펩티드는 예를 들면, 글리코실화, 페길화, 포스포릴화, 황산화, 환원/알킬화, 아실화, 화학 결합, 또는 약한 포르말린 처리에 의해 변형된 것이다. 유도체는 방사능동위원소, 형광, 및 효소 표지를 포함하나 이에 한정되지 않는 직간접적으로 탐지가능한 표지를 포함하도록 또한 변형될 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "동물" 또는 "환자"는 예를 들면, 인간, 양, 엘크, 사슴, 뮬 사슴, 밍크, 포유동물, 원숭이, 말, 소, 돼지, 염소, 개, 고양이, 쥐, 마우스, 새, 닭, 파충류, 물고기, 곤충 그리고 거미류를 포함한다.
"포유동물"은 전형적으로 건강관리를 받는(가령, 인간 및 길들여진 동물들) 온혈 포유동물을 포함한다. 예로는 고양잇과, 갯과, 말과, 솟과, 그리고 인간, 및 오로지 인간을 포함한다.
"치료하는(Treating)" 또는 "치료(treatment)"는 포유동물에서 질병 상태의 치료를 포함하고, 그리고 (a) 포유동물에서 질병 상태가 일어나는 것을 막고, 특히 포유동물이 이 질병 상태에 걸리기 쉽지만 아직 걸린 것으로 진단받지 않은 경우; (b) 질병 상태를 억제하는, 가령, 질병의 발생을 억제하는; 및/또는 (c) 질병-상태를 완화시키는, 가령, 바람직한 종점에 도달할 때까지 질병 상태의 퇴보시키는 것을 포함한다. 치료는 또한 질병의 증상을 개선(가령, 통증 또는 불편함을 감소)시키는 것을 포함하며, 여기서 이러한 개선은 질병 상태에 직접적으로 영향을 주거나 주지 않을 수 있다(가령, 원인, 감염, 발현 등).
여기에서 사용된 것과 같이, "암"은 백혈병, 림프종, 흑색종, 암종 및 육종을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유류에서 발견되는 모든 유형의 암 또는 신형성 또는 악성 종양을 말한다. 암은 자체가 “종양”이거나 암의 악성 세포들을 포함하는 조직을 말한다. 종양의 예는 육종 및 암종, 예를 들면: 섬유육종, 점액육종, 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골형성(osteogenic) 육종, 척색종(chordoma), 혈관육종, 다중특발성출혈성육종(endotheliosarcoma), 스튜어트 - 트레브 신드롬 (lymphangiosarcoma), 림프혈관내피육종(lymphangioendotheliosarcoma), 활액육종(synovioma), 중피종(mesothelioma), Ewing 종양, 부드러운 근육결합조직육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암, 땀샘 암종, 피지선피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 융모막암종, 고환종, 배 암종, Wilms 종양, 경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소(small) 세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수질아세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종, 청각 신경교종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 그리고 망막아종을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 공개된 조성물에 의해 치료될 수 있는 추가적인 암은 예를 들면, Hodgkin 질환, Non-Hodgkin 림프종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 유방암, 난소암, 폐암, 횡문근육종, 일차성 혈소판증가증, 일차성 마크로블린혈증, 소-세포 폐 종양, 일차성 뇌종양, 위암, 결장암, 악성 췌장 일슐린종, 악성 암양종, 비뇨기 방광암, 사전악성 피부 병소, 고환암, 림프종, 갑상선 암, 신경아세포종, 식도 암, 비뇨생식기관 암, 악성 고칼슘혈증, 경부암, 자궁내막암, 부신 피질암, 그리고 전립선 암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"신경 질환 또는 장애"는 신경계 및/또는 시계의 임의의 질환 또는 장애를 말한다. "신경 질환 또는 장애"는 중추 신경계 (뇌, 뇌간 및 소뇌), 말초 신경계 (뇌신경을 포함), 그리고 자율 신경계 (중추 및 말초 신경계 모두에 위치한 일부)가 관련된 질환 또는 장애를 포함한다. 신경 장애의 예로 두통, 마비 및 혼수, 치매, 발작, 수면 장애, 외상, 감염, 신생물, 신경안과학, 운동 장애, 탈수초화 질환, 척추 장애, 및 말초 신경, 근육 및 신경근 접합점의 장애를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 중독 및 정신병은 양극 장애 및 정신분열증을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이들 또한 신경 장애의 정의에 포함된다. 다음은 본 발명에 따른 조성물 및 방법을 이용하여 치료될 수 있는 몇 가지 신경 장애, 증상, 신호 및 증후군의 목록이다: 후천성 간질 실어; 급성 파종성 뇌척수염; 부신백질이영양증; 노인성 황반 변성; 뇌량의 발육부진; 인지불능; Aicardi 증후군; Alexander 질환; Alpers 질환; 교대성 반신마비; 맥관 치매; 근위축성 척색 경화증; 무뇌증; Angelman 증후군; 혈관종(angiomatosis); 산소결핍; 실어증; 운동불능; 거미집모양의 낭종; 거미집모양의 염증(arachnoiditis); Anronl-Chiari 변형; 동정맥 변형; Asperger 증후군; 기능장애 운동실조; 주의력 결핍 과다행동 장애; 자폐증; 자율 장애; 등 통증; Batten 질환; Behcet 질환; Bell 마비; 양성 필수 안검경련; 양성 초점; 근위축증; 양성 두개내 고혈압; Binswanger 질환; 안검경련; Bloch Sulzberger 증후군; 상완 신경 얼기 부상; 뇌 종기; 뇌 손상; 뇌 종양들(교아종 다형포함); 척추 종양; Brown-Sequard 증후군; Canavan 질환; 손목관절 터널 증후군; 작열통; 중앙 통증 증후군; 중심성교뇌수초용해; 두부 장애; 대뇌 동맥류; 대뇌 동맥경화증; 대뇌 위축; 대뇌 거대증; 대뇌 마비; Charcot-Marie-Tooth 질환; 화학요법-유도된 신경병질 및 신경병증 통증; Chiari 변형; 무도병; 만성 염증성 탈수초화 다발신경병질; 만성통증; 만성 국부 통증 증후군; Coffin Lowry 증후군; 지속적인 발육 상태를 포함하는 혼수; 선천적 안면 양측마비; 피질기저 퇴화; 두개 동맥염; 두개골유합증; Creutzfeldt-Jakob 질환; 누적성 외상 장애; Cushing 증후군; 세포 거대 봉입체 질환; 사이토메갈로바이러스 감염; 춤추는 눈-춤추는 발증후군; DandyWalker 증후군; Dawson 질환; De Morsier 증후군; Dejerine-Klumke 마비; 치매; 피부근염; 당뇨성 신경병질; 미만성 경화증; 자율신경실조증; 난서증; 난독증; 긴장이상; 조기 유아 간질 뇌증; 빈 Sella 증후군; 뇌염; 뇌류(encephaloceles); 뇌삼차 신경성 혈관종증; 간질; Erb 마비; 본태성 진전증; Fabry's 질환; Fahr's 증후군; 기절; 가족성 강직성 마비; 열병 발작; Fisher 증후군; Friedreich 운동실조; 전두측엽 치매 및 기타 "타우병증"; Gaucher 질환; Gerstmann 증후군; 거대 세포 동맥염; 거대 세포 함유 질환; 구상세포 대뇌피질이영양증; Guillain-Barre 증후군; HTLV-1-관련된 골수증; Hallervorden-Spatz 질환; 두부 손상; 두통; 반측안면 경련증; 유전성 강직성 대마비; 유전성 다발성 신경염증 실조; 이성대상포진; 대상포진; Hirayama 증후군; HIV-관련된 치매 및 신경병질 (또는 AIDS의 신경성 현시); 전전뇌증; Huntington 질환 및 기타 폴리글루타민 반복 질환; 수두무뇌증; 물뇌증; 과콜리졸혈증; 혈중산소감소증; 면역-중재된 뇌척수염; 봉입체 근염; 색조 실조증; 영아 피틴산 축적 질환; 영아 레프슘 질환; 영아 경련; 염증성 근질환; 두개내 낭종; 두개내 고혈압; Joubert 증후군; Keams-Sayre 증후군; Kennedy 질환 Kinsboume 증후군; Klippel Feil 증후군; Krabbe 질환; Kugelberg-Welander 질환; 쿠루병; Lafora 질환; Lambert-Eaton 근무력 증후군; Landau-Kleffner 증후군; 측면 수질 (Wallenberg) 증후군; 학습 장애; Leigh 질환; Lennox-Gustaut 증후군; Lesch-Nyhan 증후군; 백질이영양증; Lewy 몸통 치매; Lissencephaly; locked-in 증후군; Lou Gehrig 질환 (가령, 운동 신경 질환 또는 근위축성 척색 경화증); 요추간반 질환; Lyme 질환--신경 후유증; Machado-Joseph 질환; 큰뇌증; 거대뇌증; Melkersson-Rosenthal 증후군; Menieres 질환; 뇌막염; Menkes 질환; 이염백질이영양증; 소두증; 편두통; Miller Fisher 증후군; 미니-뇌졸증; 미토콘드리아 근병증; Mobius 증후군; 일지성 근위축증; 운동 신경 질환; Moyamoya 질환; 뮤코다당증; 다발경색 치매; 다병소성 운동 신경병질; 다발성 경화증 및 기타 탈수초화 장애; 체위성 저혈압과 다계통 위축증; p 근육 영양실조; 중증근육무기력증; 말이집탈락성 광범위 경화증; 유아의 근간대성 뇌병증; 근질환; 본태성 근긴장; 기면발작; 신경섬유종증; 신경이완성 악성 증후군; AIDS의 신경성 현시; 낭창의 신경 후유증; 신경근육긴장증; 신경 세로이드 리포푸신증; 신경이동 장애; Niemann-Pick 질환; O'Sullivan-McLeod 증후군; 후두 신경통; 구속성 척추 증후군; Ohtahara 증후군; 올리브교 소뇌 위축증; 안구간대경련-근간대경련; 시신경염; 기립성 저혈압; 과사용 증후군; 이상 감각; 신경퇴행성 질환 또는 장애 (Parkinson 질환, Huntington 질환, Alzheimer 질환, 근위축성 척색 경화증 (ALS), 치매, 다발성 경화증 그리고 신경 세포 사멸과 관련된 기타 질환 및 장애); 선천 이상근육근긴장; 종양연관 질환; 돌발발작; Parry Romberg 증후군; Pelizaeus-Merzbacher 질환; 주기적 마비; 말초 신경병질; 통증있는 신경병질 및 신경병증 통증; 지속적인 성장 상태; 전반적 발달 장애; 빛 재채기 반사; 피탄산 축적 질환; Pick 질환; 신경 압박; 뇌하수체 종양; 다발성근염; 공뇌증; 소아마비 증후군; 대상포진후 신경통; 감염후뇌척수염; 체위성 저혈압; Prader-Willi 증후군; 원발성 척색 경화증; 프리온 질환; 진행성 반얼굴 위축; 진행성 다초점 백색질뇌증; 진행성 경화 회백질위축증; 진행성 핵상 마비; 가성뇌종양; Ramsay-Hunt 증후군 (유형 I 및 II); Rasmussen 뇌염; 반사성교감신경이영양증 증후군; Refsum 질환; 반복성 운동 장애; 반복성 스트레스 손상; 하지불안 증후군; 레트로바이러스-연관 골수증; Rett 증후군; Reye 증후군; Saint Vitus 댄스; Sandhoff 질환; Schilder 질환; 뇌갈림증; 중격-시신경 형성장애; 흔들린 아이 증후군; 대상포진; Shy-Drager 증후군; Sjogren 증후군; 수면 무호흡; Soto 증후군; 경련성 마비; 척추 파열; 척추 손상; 척추 종양; 척추 근위축; Stiff-Person 증후군; 발작; Sturge-Weber 증후군; 아급성 경화성 범뇌염; 피질하부 동맥경화성 뇌병; Sydenham 무도병; 실신; 척수공동증; 지연성 운동장애; Tay-Sachs 질환; 일시적 동맥염; 계류 척추 증후군; Thomsen 질환; 흉곽 출구 증후군; Tic Douloureux; Todd 마비; Tourette 증후군; 일과성 허혈 발작; 전염성 해면상뇌증; 횡단성 척추염; 외상성 뇌 손상; 진전; 삼차 신경통; 열대 경직 하반신 마비; 결절성 경화증; 맥관 치매 (다발-경색 치매); 일시적 동맥염을 포함하는 맥관염; Von Hippel-Lindau 질환; Wallenberg 증후군; Werdnig-Hoffman 질환; West 증후군; 편달; Williams 증후군; Wildon 질환; 그리고 Zellweger 증후군을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
“대사 질환”은 예를 들면, 인슐린 저항성, 당뇨병, 비만, 손상된 내당성, 혈액 고콜레스테롤, 혈당과다, 이상지질혈증 및 과다지질혈증을 포함하는 엔도크린계의 광범위한 질환 및 장애를 말한다.
"염증"은 전신 염증성 이상 및 단핵세포, 백혈구 및/또는 호중구의 이동 및 견인과 국소적으로 관련된 이상을 말한다. 염증의 예는 병원성 유기체(그람-양성 세균, 그람-음성 세포, 바이러스, 곰팡이 그리고 원생동물문 및 기생충과 같은 기생충을 포함)에 의한 감염, 이식 거부 (신장, 간, 폐, 또는 각막과 같은 고형 장기의 거부와 이식편대 숙주병(GVHD)을 포함한 골수 이식의 거부를 포함), 또는 국소화된 만성 또는 급성 자가면역 또는 알레르기 반응으로 인한 염증을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 자가면역 질환들은 급성 사구체신염; 류마티즘성 또는반응성 관절염; 만성 사구체신염; 염증성 장 질환들 가령, Crohn 질환, 궤양성 결장염 그리고 괴사성 전장염; 과립구 주입 관련 증후군; 염증성 피부질환 가령, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 건선; 전신 홍반성 루프스(SLE), 자가면역 갑상선염, 다발성 경화증, 그리고 일부 형태의 당뇨병 또는 환자의 자기 면역계의 공격에 의해 병인성 조직 파괴를 야기하는 임의의 기타 자가면역상태를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 알레르기 반응은 알레르기 천식, 만성 기관지염, 급성 그리고 지연된 과민성을 포함한다. 전신 염증성 질환 상태는 외상, 화상, 허혈후에 따른 재관류와 관련된 염증 (가령, 폐, 뇌, 내장 또는 말초 맥관에서 심근경색 및 발작을 포함하 혈전증), 폐혈증, ARDS 또는 다발성 장기부전 증후군을 포함한다. 염증성 세포 모집은 또한 죽상경화성 플라크에서도 발생한다. 염증은 Non-Hodgkin 림프종, We유전자r 육아종증, Hashimoto 갑상선염, 간세포 암종, 흉선 위축, 만성 췌장염, 류마티즘성 관절염, 반응성 림프 비후증, 골관절염, 궤양성 결장염, 유두상 암종, Crohn 질환, 궤양성 결장염, 급성 담낭염, 만성 담낭념, 간경변, 만성 타액선염, 복막염, 급성 췌장염, 만성 췌장염, 만성 위염, 자궁선근종, 자궁내막증, 급성 자궁경관염, 만성 자궁경관염, 림프 비후, 다발성 경화증, 특발성 혈소판 감소 자색반병에 후속되는 비대, 일차성 IgA 신증, 전신 홍반성 루프스, 건선, 폐기종, 만성 신우신염, 그리고 만성 방광염을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
‘심혈관 질환 또는 장애’는 허혈을 일으킬 수 있는 또는 심장의 재관류에 의해 질환을 포함한다. 예로는 아테롬성 동맥경화증, 관상 동맥 질환, 육아종성 심근염, 만성 심근염 (비-육아종성), 일차성 비대성 심근증, 말초 동맥 질환 (PAD), 발작, 협심증, 심근 경색, 심장 마비에 의한 심혈관 조직 손상, 심장 바이패스에 의한 심혈관 조직 손상, 심장 쇼크, 그리고 당업계 숙련자에게 공지된 또는 시르투인3(Sirtuin3)과 관련된 조직 손상을 포함하나 이에 한정되지 않는 또는 심장 또는 맥관구조의 부전 또는 조직 손상과 관련된 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다. CVS 질환들은 아테롬성 동맥경화증, 육아종성 심근염, 심근 경색, 판 모양의 심장 질환에 부차적인 심근 섬유증, 경색없이 심근 섬유증, 일차성 비대성 심근증, 그리고 만성 심근염 (비-육아종증)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 조성물 및 분자들
표적:
한 구체예에서, 표적은 아디포넥틴(ADIPOQ)와 연합된 센스 및/또는 안티센스 넌코딩 및/또는 코딩 서열들을 포함하나 이에 한정되지 않는 아디포넥틴(ADIPOQ)의 핵산 서열들을 포함한다.
한 구체예에서, 표적은 ADIPOQ1 유전자와 연합된 센스 및/또는 안티센스 넌코딩 및/또는 코딩 서열들을 포함하나 이에 한정되지 않는 ADIPOQ1의 핵산 서열들을 포함한다.
한 구체예에서, 표적은 ADIPOQ2 유전자와 연합된 센스 및/또는 안티센스 넌코딩 및/또는 코딩 서열들을 포함하나 이에 한정되지 않는 ADIPOQ2의 핵산 서열들을 포함한다.
GBP-28, apMl, AdipoQ 및 Acrp30으로도 불리는 아디포넥틴은 콜라겐 VIII 및 X 그리고 보체 인자 Clq에 구조적 상동성을 가지고, 인간의 혈장에 높은 수준으로 순환하는 신규한 지방 조직-특이적 단백질이다. 이 단백질은 지방 조직에 의해 분리되는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드중 하나로써 이의 다중 기능에 대해서 최근 수년간 파악되기 시작하였다. 아디포넥틴 발현의 감소는 일부 동물 모델에서 인슐린 저항성과 연관된다. 아디포넥틴의 투여는 혈당의 감소와 인슐린 민감성의 증가가 수반된다. 또한, 페록시좀(peroxisome) 증식물질 활성화된 수용체-감마의 자극을 통하여 인슐린 민감성을 강화시키는 약물 티아졸리딘디온은 마우스에서 혈장 아디포넥틴 및 mRNA 수준을 증가시킨다. 다른 한편, 이러한 함지방세포 단백질은 맥관 손상이 된 실험 모델에서 보호 역할을 하는 것으로 보인다. 인간에서, 아디포넥틴 수준은 건강한 개체 및 당뇨병 환자 모두에서 인슐린 민감성과 양성적으로 연합되며, 지방과다 수준과는 역관계에 있다. 혈장 아디포넥틴 수준은 비만 및 진성 당뇨병 유형 2와 같은 일부 인슐린-저항성 상태와, 관상 동맥 질환 환자에서 감소된 것으로 보고되었다. 반대로, 만성 신부전, 당뇨병 유형 1 및 신경성 식욕부진은 혈장 아디포넥틴 수준의 증가와 연관된다. 혈장 아디포넥틴의 농도는 포도당, 인슐린, 트리글리세리드 수준 및 신체 용적 지수(body mass index)과 음성적으로 관련되며, 그리고 고밀도 지단백질-콜레스테롤 수준 및 인슐린-자극된 포도당 처리와는 양성적으로 관련된다. 티아졸리딘디온을 이용한 체중 감량 및 요법은 인간에서 내생성 아디포넥틴 생산을 증가시켰다. 아디포넥틴은 조직 지방 산화를 증가시켜, 순환하는 지방산 수준을 감소시키는 결과에 의해 인슐린 민감성을 증가시키고, 그리고 간 및 근육에서 세포내 트리글리세리드 함량을 감소시켰다. 이 단백질은 또한 맥관 내피 세포에서 어드헤신(adhesion) 분자의 발현을 억제시키고, 대식세포로부터 사이토킨 생산을 억제시켜, 아테롬성동맥경화증의 초기 단계 동안 발생하는 염증 과정을 억제한다.
에너지 보관을 위한 수동적인 저장도로써의 지방 조직의 전통적인 견해는 더 이상 유효하지 않다. 지난 10년간, 지방 조직은 심혈관 생리기능을 조절하는 엔도크린 기능을 가지는 것으로 나타났다. 아디포넥틴 분비는 TNF-알파 및 카테콜아민에 의해 억제되며, PPAR 감마 활성화에 의해 자극된다. 아디포넥틴은 2가지 주요 수용체, AdipoRl 및 AdipoR2를 통하여 활동한다. 간에서, 아디포넥틴은 지방산 이화작용을 자극하고, 당신생(gluconeogenesis)을 조절함으로써, 지질 및 에너지 대사를 조절한다. 골근육에서, 지방산 산화 및 포도당 흡수를 촉진시킨다. 이와 함께, 아디포넥틴의 대사 작용은 인슐린 민감성을 강화시키고, 순환 지질 수준을 감소시킨다. 아디포넥틴은 또한 NO 분비를 상승시키고, 어드헤신 인자의 생산을 억제함으로써, 내피 및 평활근 세포에 작용하여 죽종생성(atherogenesis)에 대항하는 보호 효과를 갖는다. 심장에서, 아디포넥틴은 아직 충분히 이해하지 못한 기전을 통하여 심근세포 비대 및 심근 섬유증을 억제한다. 아디포넥틴 생산은 또한 비만 및 유형 2 당뇨병 환자에서 감소되는 것을 볼 수 있었고, 이의 순환 수준은 다양한 심혈관 질환의 예후적 의미를 가진다.
지방 조직은 트리글리세리드 보관 부위이며 뿐만 아니나 "아디포킨(adipokines)"이라고 불리는 생물학적으로 많은 활성 중개물질을 배출하는 활성을 가진 엔도크린 기관이다. 비만 개체에서 과다 생산되며, 인슐린 민감성, 지단백질 대사 및 심혈관계에 유해한 효과를 발휘하는 많은 아디포킨, 가령, 렙틴, 종양 죄사 인자-알파, 플라스미노겐 활성화 억제제-I, 레시스틴 등과 같은 것과는 대조적으로, 아디포넥틴은 마른 개체보다는 비만 개체에서 더 적은 양으로 생산되고, 주로 유익한 활성, 가령, 인슐린 민감성을 증가시키고, 지방산 산화를 자극하고, 염증 반응을 억제하고, 그리고 내피-의존적 산화질소 매개된 혈관이완(vasorelaxation)을 유도하는 등의 활성을 보유하는 유일한 아디포킨으로 간주된다. 아디포넥틴은 2가지 수용체, AdipoR1 및 AdipoR2에 결합한다. 아디포넥틴 녹아웃 마우스는 인슐린 저항성, 포도당 과민증, 과다지질혈증, 손상된 내피-의존적 혈관이완 및 고혈압과 같은 대사 증후군의 다양한 현시를 나타내며, 뿐만 아니라, 혈관 손상후 신생내막형성(neointima)의 강화를 나타낸다. 임상 연구에서 혈장 아디포넥틴 농도는 본태성 고혈압 및 허혈성 심장 질환자에서 더 낮았다. 대사 및 심혈관 질환자에 있어서 가능한 치료 전략은 내생성 아디포넥틴 수준을 상승 또는 이 호르몬에 대한 민감성의 증가시키는 것일 수도 있다.
아디포넥틴은 항-염증 및 항-죽종 성질과 연합하여 인슐린 민감성을 증가시킨다. 환자에게서 AIPOQ를 증가시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 이 분자의 표적화는 당뇨병, 비만, 아테롬성 동맥경화증 및 이와 유사한 질환 치료에 이용된다. 암의 경우, 아디포넥틴은 종양 억제물질로 기능을 할 수 있으며, 예를 들면, 결장에서 낮은 수준의 아디포넥틴은 결장암으로 이어진다. 유방암의 경우, 아디포넥틴은 암의 음성적 조절물질로 간주되어, 아디포넥틴의 수준는 유방암의 발달을 억제하거나 또는 치료를 제공하는 치료법이 될 수 있다.
환자에게서 아디포넥틴 수준의 조절은 자가면역 질환 또는 장애를 포함하는 염증 질환 또는 장애에 또한 중요할 것이다. 아디포넥틴은 강력한 항-염증성 성질을 가진 아디포킨이다. 알코올성 간 질환의 발달은 간의 대식세포(Kupffer 세포)의 활성에 의해 부분적으로 중재되는 증가된 전-염증성 활성에 관련되는 것으로 보인다. 상습적인 에탄올 섭취는 간의 대식세포를 리포폴리사카라이드(LPS)에 의한 활성화에 민감하게 만들어, 반응성 산소종과 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파)의 생산 증가로 이어진다. 아디포넥틴은 에탄올 섭취후 간의 대식세포에서 Toll-유사 수용체-4 (TLR-4) 매개된 신호생성을 표준화시킬 수 있는데, 알코올성 간 질환의 진행에서 아디포넥틴의 간보호 효과에 기여하는 것으로 보인다.
아테롬성동맥경화증은 동맥 벽에 존재하는 만성적 염증 과정으로 간주되지만, 또한 저등급의 전신 염증 반응으로 특징화된다. 지방 조직은 이러한 만성적 염증 공정과 그후 심혈관 질환 위험의 중재에 중요한 역할을 할 수 있고, 따라서 지방의 보관 주위로만 간주되어서는 안될 것이다. 함지방세포는 활성 엔도크린 기능을 가질 수 있다; 함지방세포는 몇 가지 사이토킨 [그중에서 인터루킨-6 (IL-6) 및 종양 괴사 인자-(TNF-)] 그리고 아디포넥틴, 30 kDa 함지방세포 보체-관련된 단백질을 만든다. 혈청에서 아디포넥틴 수준은 주로 함지방세포의 크기와 양으로 결정된다. 최대 혈청 농도는 체지장이 적은 개체에서 볼 수 있다. 아디포넥틴은 인슐린 민감화 및 항-죽종성 효과를 가지며, 관상 심장 질환을 가진 환자에서 더 낮은 혈청 수준을 가지는 것으로 보고되었다.
구체예들에서, 낮은 아디포넥틴 수준과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 아디포넥틴 발현 및/또는 기능을 증가시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 예는 서열 번호: 7 내지 31을 포함한다.
본 발명의 구체예들에 따르면, 표적 핵산 분자는 아디포넥틴 (ADIPOQ)이며, 아디포넥틴 (ADIPOQ)의 임의의 이소폼, 수용체 및 패밀리 및 이와 유사한 것까지 확장된다. ADIPOQ의 동의어는 다음을 포함한다: 30 kDa 함지방세포 보체관련된 단백질, ACDC, ACRP30, 함지방세포, Clq 및 콜라겐 도메인-함유 단백질, 함지방세포 보체-관련된 30 kDa 단백질, 아디포넥틴(adiponectin), 아디포넥틴(Adiponectin), AdipoQ, 아디포즈 가장 풍부한 유전자 전사체 1 단백질, ADIPQTL1, ADPN, apM1, APM1, apM-1, APM-1, GBP28, 젤라틴-결합 단백질.
한 구체예에서, 본 발명은 여기에서 설명된 분자들과 관련된 모든 측면들을 고려하고, 그리고 ADIPOQ의 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 서열의 모든 펩티드, 폴리펩티드, 유도체, 변이체를 포함한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 ADIPOQ 분자로 생성될 수 있는 항체 및 압타머(aptamer)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ) 패밀리 구성요소와 연관된 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는데 이용한다. 안티센스를 이용하여 수득한 줄기 세포로부터 생성된 세포/조직으로 치료할 수 있는 예시적인 아디포넥틴(ADIPOQ) 매개된 질환 및 장애는 다음을 포함한다: 암, 염증, 아테롬성동맥경화증, 신경성 질환 또는 장애, 심장 질환 또는 장애, 자가면역 질환 또는 장애, 바이러스, 세균, 곰팡이, 원생동물과 같은 물질로 인한 감염성 질환 또는 장애, 면역결핍성 질환 또는 장애; 알레르기, 아테롬성동맥경화증, 대사 질환 또는 장애 (당뇨병, 당뇨성 신경장애, 비만, 고혈당증, 인슐린 저항성, 인슐린 저항성과 관련된 대사 증후군, 대사 증후군, 고혈압, 인슐린 민감성의 손상된 제어 및 비정상적 혈당 수준 등과 관련된 질환 또는 장애, 간 질환, 신장 질환, 단백뇨 및 세포 증식성 질환.
또다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 ADIPOR와 상호작용하는 분자들을 포함하는 ADIPOR 발현 기능 및 활성을 조절한다. 아디포넥틴은 세포내 어드헤신 분자-I, 혈관 세포 어드헤신 분자-I, 및 E-셀렉틴을 포함하는 어드헤신 분자의 발현을 강력하게 억제한다. 아디포넥틴은 또한 IE 포스포릴화의 억제를 통하여 TNF-유도된 핵 인자-B 활성화를 억제한다. 아디포넥틴에 의한 핵 인자-B의 억제는 내피 세포에 대한 단핵 세포 어드헤신의 억제를 위한 주요 분자 기전일지도 모른다. 아디포넥틴은 또한 대식세포의 소거(scavenger) 수용체 분류 A-I의 발현을 억제하여, 대식세포에 의한 산화된 저-밀도 지단백의 흡수가 두드러지게감소되며, 포말 세포 형성이 억제되는 결과를 가진다. 또한, 배양된 평활근 세포에서, 아디포넥틴은 혈소판-유도된 성장 인자, 헤파린-결합 상피 성장 인자 (EGF)-유사 성장 인자, 염기성 섬유사세포 성장 인자, 및 EGF을 포함하는 성장인자에 의해 유도된 DNA 합성과 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자에 의해 유도된 세포 증식 및 이동을 감쇠시킨다.
또다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ)과 관련된 질환 또는 장애를 앓고 있는 또는 이러한 장애 또는 질환의 발달 위험에 처한 환자에서 아디포넥틴(ADIPOQ)의 정상적인 발현 및/또는 정상적인 기능을 조절한다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 넌코딩 구역을 포함하나 이에 한정되지 않은 아디포넥틴(ADIPOQ)의 폴리뉴클레오티드에 특이적이다. 아디포넥틴(ADIPOQ) 표적은 아디포넥틴(ADIPOQ)의 변이체들; SNP를 포함하는 아디포넥틴(ADIPOQ)의 돌연변이체들; 아디포넥틴(ADIPOQ)의 넌코딩 서열들; 대립유전자들, 단편들 그리고 이와 유사한 것을 포함한다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA 분자다.
본 발명의 구체예들에 따르면, 표적 핵산 분자는 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드 단독에 국한되지 않고, 아디포넥틴(ADIPOQ)의 동소체, 수용체, 상동체들, 넌-코딩 구역 및 상동체들, 그리고 이와 유사한 것 중 임의의 것까지 확장된다.
또 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 변이체들, 대립유전자들, 상동체들, 돌연변이체들, 유도체들, 단편들 및 상보성 서열들을 포함하나 이에 한정되지 않는 아디포넥틴(ADIPOQ) 표적의 자연적 안티센스 서열(코딩 및 넌-코딩 구역에 자연적 안티센스)을 표적으로 한다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA 또는 DNA 분자이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 올리고머 화합물들은 이 화합물에 있는 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에서 상이한 염기가 존재하는 변이체들도 포함한다. 예를 들면, 첫번째 뉴클레오티드가 아데닌이라면, 변이체들은 이 위치에 티미딘, 구아노신, 시티딘 또는 이 위치에 있는 기타 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드를 포함하도록 만들어질 수 있다. 안티센스 화합물의 임의의 위치에서 일어날 수 있다.
일부 구체예들에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 50% 내지 약 60%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 60% 내지 약 70%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 70% 내지 약 80%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 80% 내지 약 90%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이다.
안티센스 화합물은 화합물이 표적 핵산에 결합하여 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여 활성을 잃게 만들 때 특이적으로 하이브리드가능하며, 그리고 특이적 결합이 바람직한 조건들하에서 안티센스 화합물이 비-표적 핵산 서열에 비-특이적 결합을 피할 수 있도록 충분한 상보성이 있다. 이와 같은 조건은 생체내 분석 또는 치료요법적 처리의 경우 생리학적 조건, 그리고 분석이 시험관 분석의 경우에 실시되는 조건등을 포함한다.
DNA, RNA, 키메라, 치환된 등의 안티센스 화합물은 표적 DNA 또는 RNA 분자에 화합물이 특이적으로 결합하여 표적 DNA 또는 RNA의 정상적인 기능을 간섭하여, 활성을 잃게 만들 때 특이적으로 하이브리드가능하며, 그리고 특이적 결합이 바람직한 조건들하에서 안티센스 화합물이 비-표적 핵산 서열에 비-특이적 결합을 피할 수 있도록 충분한 상보성이 있고, 이러한 조건은 생체내 분석 또는 치료요법적 처리의 경우 생리학적 조건, 그리고 분석이 시험관 분석의 경우에 실시되는 조건 등이다.
또 다른 구체예에서, 예를 들면, PCR, 하이브리드화 등을 이용하여 확인되고, 확장된, 서열 번호: 3 내지 6에서 제시된 하나 이상의 서열, 그리고 이와 유사한 것인 안티센스 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는 아디포넥틴(ADIPOQ)의 표적화는 아디포넥틴(ADIPOQ)의 기능 또는 발현을 조절한다. 한 구체예에서, 기준과 비교하였을 때, 발현 또는 기능은 상향 조절된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 기준과 비교하였을 때, 발현 또는 기능은 하향 조절된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 PCR, 하이브리드화 등을 이용하여 확인되고, 확장된 안티센스 서열들을 포함하는, 서열 번호: 7 내지 31에서 제시된 핵산 서열들을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더 짧은 또는 더 긴 단편들, 변형된 결합 그리고 이와 유사한 것을 포함할 수 있다. 변형된 결합 또는 뉴클레오티드간 링키지의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 이와 유사한 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 뉴클레오티드는 인(phosphorus) 유도체이다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드내 슈가 또는 슈가 유사 모이어티에 부착될 수 있는 인 유도체 (또는 변형된 인산염 기)는 일인산염, 이인산염, 삼인산염, 알킬인산염, 알칸인산염, 포스포로티오에이트 그리고 이와 유사한 것이 될 수 있다. 상기 명시된 인산염 유사체의 준비 및 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드로의 결합은 당분야에 공지되어 있기 때문에, 여기에서 설명할 필요는 없다.
안티센스의 특이성 및 감응도는 치료 용도로 당업자에 의해 이용된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 동물 및 사람에게서 질병 상태를 치료하는 치료 모이어티로 이용될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간에게 안전하고 효과적으로 투여되었으며, 여러 임상 시도가 현재 진행중이다. 따라서 올리고뉴클레오티드는 세포, 조직, 동물 특히, 인간의 치료를 위한 치료 섭생에 유용하도록 설정될 수 있는 유용한 치료요법적 형태가 될 수 있다.
본 발명의 구체예들에서, 올리고머 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 분자들에 결합하고, 표적 유전자에 의해 인코드된 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 간섭되는 DNA의 기능은 예를 들면, 복제 및 전사를 포함한다. 간섭되는 RNA의 기능은 예를 들면, RNA를 단백질 해독 부위로 전위, RNA로부터 단백질 해독, 하나 이상의 mRNA 종을 만들기 위한 RNA의 접합 및 RNA가 관여하거나 RNA에 의해 실시될 수 있는 촉매 활성과 같은 모든 중요한 기능을 포함한다. 기능은 원하는 기능에 따라 상향-조절되거나 억제될 수 있다.
상기 안티센스 화합물들은 안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 외부 유도 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, 선택적 스플라이스, 프라이머, 프로브, 및 표적 서열의 최소한 일부에 하이브리드되는 다른 올리고머 화합물을 포함한다. 이와 같이, 이들 화합물들은 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 단일-가닥, 또는 원형 올리고머 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
본 발명의 내용에서 특정 핵산 분자에 안티센스 화합물의 표적화는 다단계 프로세스가 될 수 있다. 이 프로세스는 통상적으로 기능이 조절되는 표적 핵산의 확인으로 시작된다. 이 표적 핵산은 예를 들면, 유전자의 발현이 특정 질환 또는 질병 상태와 연관된 세포 유전자(또는 이 유전자로부터 전사된 mRNA) 또는 감염성 물질의 핵산 분자가 될 수 있다. 본 발명에서 표적 핵산은 아디포넥틴(ADIPOQ)을 인코드한다.
표적화 프로세스는 가령, 발현의 조절과 같은 원하는 효과를 얻기 위하여 안티센스 상호작용을 위하여 표적 핵산 내 최소한 하나의 표적 구역, 단편 또는 부위의 결정을 통상적으로 포함한다. 본 발명의 내용에서, 용어 "구역(region)"은 최소한 한 가지 확인가능한 구조, 기능 또는 성질을 가지는 표적 핵산의 일부로 정의된다. 표적 핵산의 구역내에 단편이 있다. 단편(Segments)은 표적 핵산 내에 구역의 더 작은 또는 하위 부분으로 정의된다. 본 발명에서 사용된 부위(Sites)는 표적 핵산내에 위치로 정의된다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ)의 천연 안티센스 서열들에 결합하고, 그리고 아디포넥틴(ADIPOQ)의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 안티센스 서열들의 예로 서열 번호: 7 내지 31을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 단편에 결합하고, 그리고 아디포넥틴(ADIPOQ)의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 상기 단편들은 아디포넥틴(ADIPOQ) 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ)의 천연 안티센스 서열들에 특이적이며, 아디포넥틴(ADIPOQ)의 천연 안티센스 서열들에 올리고뉴클레오티드가 결합하여 아디포넥틴(ADIPOQ)의 발현 및/또는 기능이 조절된다.
또 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 화합물은 서열 번호: 7 내지 31에서 제시된 서열들을 포함하는데, 이의 안티센스 서열들은 예를 들면, PCR, 하이브리드화 등을 이용하여 확인되고 연장된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더 짧은 또는 더 긴 단편들, 변형된 결합 그리고 이와 유사한 것을 포함한다. 변형된 결합 또는 뉴클레오티드간 링키지의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 이와 유사한 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 뉴클레오티드는 인 유도체를 포함한다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드내에 슈가 또는 슈가 유사체 모이어티에 부착될 수 있는 인 유도체 (또는 변형된 인산염 기)는 일인산염, 이인산염, 삼인산염, 알킬인산염, 알칸인산염, 포스포로티오에이트 그리고 이와 유사한 것이 될 수 있다. 상기 명시된 인산염 유사체의 준비 및 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드으로의 결합은 당분야에 공지되어 있기 때문에, 여기에서 설명할 필요는 없다.
당분야에 공지된 것과 같이, 해독 개시 코돈은 일반적으로 5'-AUG (전사된 mRNA 분자들에서; 대응하는 DNA 분자에서는 5'-ATG)이기 때문에, 해독 개시 코돈은 "AUG 코돈" "시작 코돈" 또는 "AUG 시작 코돈"으로 지칭되기도 한다. 소수의 유전자는 RNA 서열 5'-GUG, 5'-UUG 또는 5'-CUG을 가지는 해독 개시 코돈을 가지며; 그리고 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG는 생체에서 기능을 하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 각 경우에 시작 아미노산은 일반적으로 메티오닌(진핵세포의 경우) 또는 포르밀메티오닌(원핵생물의 경우)이지만, 용어 "해독 개시 코돈" 및 "시작 코돈"은 많은 코돈 서열들을 포함할 수 있다. 진핵생물 및 원핵생물 유전자는 두 개 이상의 대체 시작 코돈을 가지는데, 이들중 임의의 것이 특정 세포 유형 또는 조직에서, 또는 특정 조건하에서 해독 개시에 선호적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 내용에서, "시작 코돈" 및 "해독 개시 코돈"은 코돈의 서열과 무관하게, 아디포넥틴(ADIPOQ)을 인코드하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 해독을 생체내에서 개시하는데 이용되는 코돈을 지칭한다. 유전자의 해독 종료 코돈 (또는 "중지 코돈")은 다음 세 개 서열중 하나를 가질 수 있다; 5'-UAA, 5'-UAG 및 5'-UGA (대응하는 DNA 서열들은 차례로 각각 5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA이다).
용어 "시작 코돈 구역" 및 "해독 개시 코돈 구역"은 해독 개시 코돈으로부터 임의의 방향(가령, 5' 또는 3')으로 약 25 내지 약 50 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 또는 유전자의 일부분을 지칭한다. 유사하게, 용어 "중지 코돈 구역" 및 "해독 종료 코돈 구역"은 해독 종료 코돈으로부터 어느 방향이건(5' 또는 3') 약 25개 내지 약 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 또는 유전자의 일부분을 말한다. 결과적으로, "시작 코돈 구역" (또는 "해독 개시 코돈 구역") 및 "중지 코돈 구역" (또는 "해독 종료 코돈 구역")은 본 발명의 안티센스 화합물에 효과적으로 표적화되는 모든 구역이다.
오픈 리딩 프레임(ORF) 또는 해독 개시 코돈과 해독 종료 코돈 사이에 구역을 말하는 것으로 당분야에 공지된 "코딩 구역"은 효과적으로 표적화될 수 있는 구역이다. 본 발명의 내용 범위내에서, 표적화된 구역은 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 해독 개시 또는 종료 코돈을 포함하는 유전자내 구역이다.
또 다른 표적 구역은 해독 개시 코돈으로부터 5' 방향으로 mRNA의 일부분을 지칭할 때 당분야에서 공지된 5' 무해독 구역(5'UTR)을 포함하면, 따라서 5' 캡 부위와 mRNA의 해독 개시 코돈 사이에 뉴클레오티드(또는 이 유전자에서 상응하는 뉴클레오티드)도 포함된다. 또 다른 표적 구역은 해독 종료 코돈으로부터 3' 방향으로 mRNA의 일부분을 지칭하는 것으로 당분야에서 공지된 3' 무해독 구역(3'UTR)을 포함하면, 따라서 해독 종료 코돈과 mRNA의 3' 말단 사이에 뉴클레오티드(또는 이 유전자에서 상응하는 뉴클레오티드)도 포함된다. mRNA의 5' 캡 부위는 5'-5' 삼인산염 링키지를 통하여 mRNA의 5'-최말단 잔기에 결합된 N7-메틸화된 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA의 5' 캡 구역은 5' 캡 구조 자체 뿐만 아니라 캡 부위에 인접한 첫 50개 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 간주된다. 본 발명에 적합한 또 다른 표적 구역은 5' 캡 구역이다.
일부 진핵 mRNA 전사체는 바로 해독되며, 많은 것들은 “인트론”이라고 공지된 하나 이상의 구역을 포함하는데, 이는 해독되기 전에 전사체로부터 잘려나간다. 나머지(그리고 따라서 해독된) 구역들은 “엑손”으로 알려져 있으며, 함께 접목되어, 연속 mRNA를 형성한다. 한 구체예에서, 접목 부위 가령, 인트론-엑손 접합 또는 엑손-인트론 접합 부위를 표적화하는 것은 질병에 이상 접합이 연관되거나 또는 특정 접합 산물의 과다 생산이 질병과 연관되는 상황에서 특히 유용하다. 재배열 또는 결손으로 인한 이상 융합 접합은 표적 부위의 또 다른 구체예다. 상이한 유전자 소스로부터 두 개(또는 그 이상)의 mRNA의 접합 프로세스를 통하여 생산된 mRNA 전사체는 "융합 전사체"로 공지되어 있다. 인트론은 예를 들면, DNA 또는 pre-mRNA를 표적으로 하는 안티센스 화합물을 이용하면 효과적으로 표적화될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 코딩 및/또는 넌-코딩 구역에 결합하여, 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
또 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 천연 안티센스 폴리뉴클레오티드에 결합하여, 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
또 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 센스 폴리뉴클레오티드에 결합하여, 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
대체(alternative) RNA 전사체는 DNA의 동일한 게놈 구역으로부터 만들어질 수 있다. 이와 같은 대체 전사체들은 일반적으로 "변이체들"로 알려져 있다. 좀더 특이적으로, "pre-mRNA 변이체들"은 동일한 게놈 DNA로부터 생산되지만, 동일한 게놈 DNA로부터 만들어진 다른 전사체와 이들의 시작 또는 중지 위치에서 상이하며, 인트론 및 엑손 서열을 모두 포함하고 있는 전사체다.
접합 동안 하나 이상의 엑손 또는 인트론 구역 또는 이의 일부분을 잘라낼 때, pre-mRNA 변이체들은 더 작은 "mRNA 변이체들"을 만든다. 결과적으로, mRNA 변이체들은 pre-mRNA 변이체들로 프로세스되고, 각 독특한 pre-mRNA 변이체들은 접합의 결과로 독특한 mRNA 변이체를 항상 만들어낸다. 이와 같은 mRNA 변이체들은 또한 "대체 접합 변이체들"로 공지되어 있다. pre-mRNA 변이체의 접합이 발생되지 않는다면, pre-mRNA 변이체는 mRNA 변이체와 동일하게 된다.
변이체들은 전사의 시작 또는 중지에 대한 대체 신호를 이용하여 만들어질 수 있다. Pre-mRNAs 및 mRNAs는 하나 이상의 시작 코돈 또는 중지 코돈을 보유할 수 있다. 대체 시작 코돈을 이용하는 pre-mRNA 또는 mRNA으로부터 기인된 변이체들은 pre-mRNA 또는 mRNA의 “대체 시작 변이체들”로 공지되어 있다. 대체 중지 코돈을 이용하는 이들 전사체들은 pre-mRNA 또는 mRNA의 "대체 중지 변이체들"로 공지되어 있다. 대체 중지 변이체중 한 가지 특정 유형은 "polyA 변이체"이며, 만들어진 다중 전사체들은 전사 기전에 의해 “polyA 중지 신호”중 하나의 대체 선택하고, 따라서, 독특한 polyA 부위에서 종료된 전사체를 만듦으로써 생성된 것이다. 본 발명의 내용 범위에서, 여기에서 설명된 변이체들의 유형이 표적 핵산의 구체예이기도 하다.
안티센스 화합물이 하이브리드되는 표적 핵산 상의 위치는 활성 안티센스 화합물이 표적으로 하는 표적 구역의 최소한 5개 길이의 뉴클레오티드 부분으로 정의된다.
특정 예시적인 표적 단편들의 특이적 서열이 여기에서 제시되어 있지만, 당업자는 이들은 본 발명의 범위내에서 특정 구체예를 설명하고, 묘사하기 위함이라는 것을 인지할 것이다. 추가적인 표적 단편들은 본 내용을 근거하여 당업자들이 용이하게 인지할 수 있다.
설명된 바람직한 표적 단편으로부터 선택된 최소한 5개 길이의 연속 뉴클레오티드 스트레치를 포함하는 길이가 5-100개 뉴클레오티드 표적 단편들은 표적화에 적합한 것으로 간주된다.
표적 단편은 설명된 바람직한 표적 단편의 5'-말단으로부터 최소한 5개 연속 뉴클레오티드(나머지 뉴클레오티드는 표적 단편의 5' 말단의 바로 상류에서 시작하고, DNA 또는 RNA가 약 5 내지 약 100개 뉴클레오티드를 포함할 때 까지 연속되는동일한 DNA 또는 RNA의 연속 스트레치다)를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열들을 포함할 수 있다. 유사하게, 바람직한 표적 단편은 바람직한 표적 단편의 3'-말단으로부터 최소한 5개 연속 뉴클레오티드(나머지 뉴클레오티드는 표적 단편의 3' 말단의 바로 하류에서 시작하고, DNA 또는 RNA가 약 5 내지 약 100개 뉴클레오티드를 포함할 때 까지 연속되는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속 스트레치다)를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열들을 포함할 수 있다. 표적 단편을 갖춘 기술 분야에 당업자는 과도한 실험없이 추가적으로 바람직한 표적 단편을 확인할 수 있을 것이다.
하나 이상의 표적 구역, 단편 또는 부위가 확인되었다면, 표적에 충분한 상보성을 가진, 가령, 충분히 잘 하이브리드되고, 원하는 효과를 제공하기 위하여 충분한 특이성을 가진 안티센스 화합물이 선택된다.
본 발명의 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 특정 표적의 안티센스 가닥에 결합한다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 최소한 5개 길이의 뉴클레오티드이며, 그리고 표적 뉴클레오티드의 전체 길이를 수용하도록 합성하기 위하여, 서열들을 중첩되는 각 올리고뉴클레오티드 표적이 되도록 합성될 수 있다. 표적은 또한 코딩 뿐만 아니라 넌-코딩 구역을 포함한다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 특정 핵산을 표적으로 한다. 특정 핵산에 안티센스 화합물의 표적화는 다단계 프로세스다. 프로세스는 기능이 조절되는 핵산 서열의 확인으로 통상적으로 시작된다. 이는 예를 들면, 유전자의 발현이 특정 질환 또는 질환 상태와 연관되는 세포 유전자(또는 이 유전자로부터 전사된 mRNA), 또는 넌코딩 RNA(ncRNA)와 같은 넌코딩 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.
RNAs는 (1) 메신져 RNAs (mRNAs), 이는 단백질로 해독되며, 및 (2) 단백질-넌코딩 RNAs (ncRNAs)로 분류될 수 있다. ncRNAs는 마이크로RNAs, 안티센스 전사체 및 고밀도의 중지 코돈을 포함하며, 임의의 광범위한 “오픈 리딩 프레임”이 부족한 다른 전사 단위 (TU)를 포함한다. 많은 ncRNAs는 단백질-코딩 좌의 3' 무해독 구역 (3'UTRs)에서 개시 부위로부터 시작되는 것으로 보인다. ncRNAs는 아주 드물고, FANTOM 협회에 의해 서열화된 ncRNA의 최소한 절반은 폴리아데닐화되지 않는 것으로 간주된다. 대부분의 조사자들은 분명한 이유로 프로세스되고, 세포질로 배출된 폴리아데닐화된 mRNA에 초점을 맞추고 있다. 최근, 폴리아데닐화안된 핵 RNA 세트는 매우 크고, 이와 같은 전사체중 많은 것들은 소위 인터진(intergenic) 구역에서 생성된다. ncRNAs가 유전자 발현을 조절할 수 있는 기전은 표적 전사체와의 염기쌍에 의한 것이다. 염기쌍에 의해 기능을 하는 RNA는 (1) 동일한 유전적 위치에서, 그러나 이들이 작용하는 RNA에 반대 가닥상에서 인코드되어, 이들 표적에 대해 완벽한 상보성을 나타내는 cis-인코드된 RNAs, 및 (2) 이들이 작용하는 RNA와는 별개의 염색체 위치에서 인코드되며, 표적과 완벽한 염기쌍을 일반적으로 나타내지 않는 trans-인코드된 RNAs로 분류될 수 있다.
이론에 구애되지 않고, 여기에서 설명되는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 안티센스 폴리뉴클레오티드의 혼란은 상응하는 센스 메신져 RNA의 발현을 변경시킬 수 있다. 그러나, 이와 같은 조절은 부조화적(discordant)(안티센스 녹다운은 메신져 RNA 상승을 초래한다) 또는 조화적(concordant)(안티센스 녹다운은 수반되는 메신져 RNA 감소를 초래한다)이다. 이와 같은 경우에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 전사체의 중첩 또는 중첩되지 않는 부위로 표적화되어, 표적의 녹다운 또는 제거를 초래할 수 있다. 코딩 뿐만 아니라 넌-코딩 안티센스는 동일한 방식으로 표적화될 수 있으며, 그리고 어느 쪽이든 조화 또는 비조화 방식으로 상응하는 센스 전사체를 조절할 수 있다. 표적에 대항하여 이용되는 새로운 올리고뉴클레오티드를 확인하는데 사용되는 전략은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 안티센스 RNA 전사체의 녹다운 또는 원하는 표적을 조절하는 임의의 다른 수단에 기초될 수 있다.
전략 1: 부조화적인 조절의 경우, 안티센스 전사체의 녹다운은 통상적(센스) 유전자의 발현을 상승시킨다. 후자 유전자가 공지의 또는 가상 약물 표적에 인코드한다면, 이의 안티센스 반대편의 녹다운은 수용체 항진 또는 효소 자극물질의 작용을 의식적으로 모방할 수 있다.
전략 2: 조화적 조절의 경우, 안티센스 및 센스 전사체 모두 동시에 녹다운 시킬 수 있어, 통상의(센스) 유전자 발현의 상승적 감소를 얻을 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 녹다운을 얻는데 이용된다면, 이 전략은 센스 전사체를 표적으로 하는 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 그리고 상응하는 안티센스 전사를 표적으로 하는 또 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 중첩 센스 및 안티센스를 동시에 표적으로 하는 단일 대칭적 안티센스 올리고뉴클레오티드에 적용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 안티센스 화합물들은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 외부 유도 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, siRNA 화합물, 단일 또는 이중-가닥 RNA 간섭 (RNAi) 화합물, 가령 siRNA 화합물, 그리고 표적 핵산의 최소한 일부분에 하이브리드하여, 이의 기능을 조절하는 기타 올리고머 화합물들을 포함한다. 이와 같이, 안티센스 화합물들은 DNA, RNA, DNA-like, RNA-like, 또는 이의 혼합물이 될 수 있거나, 또는 하나 이상의 상기 것들의 모방체가 될 수 있다. 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물이 될 수 있으며, 그리고, 내부에 또는 말단이 중배(bulges), 미스메치 또는 루프와 같은 구조적 요소를 포함할 수 있다. 안티센스 화합물은 선형으로 준비될 수 있지만, 결합되거나 원형 및/또는 분지형으로 준비될 수 있다. 안티센스 화합물은 두 가닥이 하이브리드되어 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 형성하거나 또는 하이브리드화를 허용하고, 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물의 형성을 위하여 충분히 자가-상보성을 가진 단일 가닥과 같은 구조체를 포함할 수 있다. 상기 두 개 가닥이 서로 자유 3' 또는 5' 말단을 남기고 내부적으로 연결되거나 또는 연속적인 헤어핀 구조 또는 루프를 형성하도록 연결될 수 있다. 헤어핀 구조는 단일 가닥 특징으로 된 연장부를 만드는 5' 또는 3' 말단 상에 오버행(overhang)을 포함할 수 있다. 이러한 이중 가닥의 화합물은 선택적으로 양단에 오버행을 포함할 수 있다. 추가 변형은 말단, 선택된 뉴클레오티드 위치, 슈가 위치중 하나에 부착된, 또는 뉴클레오티드간 링키지 중 하나에 부착된 콘쥬게이트 군을 포함할 수 있다. 대안으로, 두 개 가닥은 비-핵산 모이어티 또는 링커 군을 통하여 링크될 수 있다. 한 개 가닥으로부터만 형성된 경우, dsRNA는 듀플렉스를 형성하기 위하여 자체에 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취할 수 있다. 따라서, dsRNAs는 완전히 또는 부분적으로 이중 가닥이 될 수 있다. 유전자 발현의 특이적 조절은 유전자전이 세포계에서 dsRNA 헤어핀의 안정적 발현에 의해 이루어질 수 있지만, 그러나, 일부 구체예에서, 유전자 발현 또는 기능은 상향 조절된다. 두 개 가닥으로부터 형성될 때, 또는 듀플렉스를 형성하기 위하여 자체에 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취하는 단일 가닥의 경우, 두 개 가닥(또는 단일 가닥의 듀플렉스 형성 구역)은 Watson-Crick 방식으로 염기쌍을 이루는 상보성 RNA 가닥이다.
일단 시스템내로 도입되면, 본 발명의 화합물들은 표적 핵산의 절단 또는 다른 변형을 얻기 위하여 하나 이상의 효소 또는 구조적 단백질의 작용을 유도하거나 또는 점유-기반 기전(occupancy-based mechanisms)을 통하여 작용할 수 있다. 일반적으로, 핵산 (올리고뉴클레오티드를 포함)은 "DNA-like" (가령, 하나 이상의 2'-데옥시 슈가를 가지고, 그리고 U 염기 대신 일반적으로 T를 가짐) 또는 "RNA-like" (가령, 하나 이상의 2'-하이드록시 또는 2'-변형된 슈가를 가지고, 그리고 T 염기 대신 U 염기를 일반적으로 가짐)으로 설명될 수 있다. 핵산 헬릭스는 한 가지 이상의 구조 유형을 채택할 수 있지만, 가장 흔하게는 A- 및 B-형이 된다. 일반적으로, B-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "DNA-like"이며, 그리고 A-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "RNA-like"이다. 일부(키메라) 구체예에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형 구역을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 바람직한 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 화합물은 최소한 하나의 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드, 변형된 링키지를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 간섭 RNA (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA); 마이크로, 간섭 RNA (miRNA); 작은, 일시적, RNA (stRNA); 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA); 작은 RNA-유도된 유전자 활성(RNAa); 작은 활성화 RNAs (saRNAs), 또는 이의 조합을 포함한다.
dsRNA는 또한 “작은 RNA-유도된 유전자 활성화” 또는 RNAa 기전인 유전자 발현을 활성화시킬 수 있다. dsRNAs 표적화 유전자 프로모터는 관련 유전자의 강력한 전사 활성화를 유도한다. RNAa는 “작은 활성화 RNA(saRNA)"로 불리는 합성 dsRNA를 이용하여 인간 세포에서 설명되었다.
작은 이중-가닥 RNA (dsRNA), 가령, 작은 간섭 RNA (siRNA) 및 마이크로RNA (miRNA)는 RNA 간섭(RNAi)로 알려진 진화론적으로 보존된 기전의 촉발자로 밝혀졌다. RNAi는 유전자 침묵을 일관되게 유도한다. 그러나, 실시예 부분에서 상세하게 설명된 경우에서, 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드 및 이의 인코드된 산물들의 발현 및/또는 기능을 증가시키는 것으로 보인다. dsRNAs는 작은 활성화된 RNAs (saRNA)로 작용할 수 있다. 이론에 구애되지 않고, 유전자 프로모터에서 서열들을 표적화함으로써, saRNAs는 dsRNA-유도된 전사 활성화 (RNAa)로 불리는 현상에서 표적 유전자 발현을 유도할 수 있다.
추가 구체예에서, 여기에서 확인된 "표적 단편"은 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 추가 화합물을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. "조절물질(modulators)"은 아디포넥틴(ADIPOQ)을 인코드하는 핵산 분자의 발현을 감소 또는 증가시키는 화합물이며, 표적 단편에 상보성인 최소한 5개-뉴클레오티드 부분을 포함한다. 상기 스크리닝 방법은 아디포넥틴(ADIPOQ)의 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 핵산 분자의 바람직한 표적 단편을 하나 이상의 후보 조절물질과 접촉시키고, 그리고 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드(가령, 서열 번호: 7-31)를 인코드하는 핵산 분자의 발현을 감소 또는 증가시키는 하나 이상의 후보 조절물질을 선택하는 단계로 구성된다. 상기 후보 조절물질 또는 조절물질들이 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 핵산 분자의 발현을 조절(가령, 감소 또는 증가)시킬 수 있는 것으로 일단 확인되면, 그 다음 조절물질은 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 기능의 추가 연구, 또는 본 발명에 따른 연구, 진단 또는 치료 물질로 이용될 수 있다.
천연 안티센스 서열의 표적화는 표적 유전자의 기능을 조절한다. 예를 들면, 아디포넥틴(ADIPOQ) 유전자(수탁 번호 NM_004797 및 NM_024551). 구체예에서, 상기 표적은 아디포넥틴(ADIPOQ) 유전자의 안티센스 폴리뉴클레오티드다. 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ)(가령, 수탁 번호 NM_004797 및 NM_024551)의 센스 및/또는 천연 안티센스 서열들, 변이체들, 대립유전자들, 이소폼, 상동체들, 돌연변이체들, 유도체들, 단편들 및 이들의 상보성 서열들을 표적으로 삼는다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자이며, 그리고 상기 표적은 안티센스 및/또는 센스 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 코딩 및 넌코딩 구역을 포함한다.
본 발명의 바람직한 표적 단편은 본 발명의 각 상보성 안티센스 화합물과 복합되어 안정화된 이중-가닥 (duplexed) 올리고뉴클레오티드를 형성할 수도 있다.
이와 같은 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 모이어티는 당분야에서 표적 발현을 조절하고, 해독을 조절하고 뿐만 아니라 안티센스 기전을 통하여 RNA 프로세싱을 조절하는 것으로 알려져 있다. 더욱이, 이중-가닥 모이어티는 화학적 변형을 받을 수도 있다. 예를 들면, 이와 같은 이중-가닥 모이어티는 표적에 대한 듀플렉스의 안티센스 가닥의 고유한 하이브리드화에 의해 표적을 저해하여, 표적의 효소적 분해를 촉발시키는 것으로 알려져 있다.
구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드 (가령, 수탁 번호 NM_004797 및 NM_024551), 변이체들, 대립유전자들, 이소폼, 상동체들, 돌연변이체들, 유도체들, 단편들 및 이의 상보성 서열들을 표적한다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자다.
본 발명의 구체예에 따르면, 표적 핵산 분자는 아디포넥틴(ADIPOQ)에만 국한되지 않으며, 아디포넥틴(ADIPOQ) 분자들의 이소폼, 수용체, 상동체들 그리고 이와 유사한 것까지 확장된다.
또 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 천연 안티센스 서열, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드(서열 번호: 3-6) 및 이의 임의의 변이체들, 대립유전자들, 상동체들, 돌연변이체들, 유도체들, 단편들 및 상보성 서열들을 표적한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예는 서열 번호: 7-31에서 제시된다.
한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드와 연합된 넌코딩 센스 및/또는 안티센스 서열들을 포함하나 이에 한정되지 않는 아디포넥틴(ADIPOQ) 안티센스의 핵산 서열에 상보성이거나 또는 이에 결합하고, 그리고 아디포넥틴(ADIPOQ) 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
또 다른 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ) 천연 안티센스의 핵산 서열(서열 번호: 3-6에 제시됨)에 상보성이거나 또는 이에 결합하고, 그리고 아디포넥틴(ADIPOQ) 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호:7 내지 31의 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드 서열들을 포함하고, 아디포넥틴(ADIPOQ) 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
상기 폴리뉴클레오티드 표적은 아디포넥틴(ADIPOQ)의 패밀리 멤버, 아디포넥틴(ADIPOQ)의 변이체들; SNP를 포함하는 아디포넥틴(ADIPOQ)의 돌연변이체들; 아디포넥틴(ADIPOQ)의 넌코딩 서열들; 아디포넥틴(ADIPOQ)의 대립유전자들; 종 변이체들, 단편들 그리고 이와 유사한 것을 포함하는 아디포넥틴(ADIPOQ)를 포함한다. 바람직하게는 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자다.
또 다른 구체예에서, 아디포넥틴(ADIPOQ)를 표적화하는 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA, 간섭 RNA (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA); 마이크로 간섭 RNA (miRNA); 작은, 일시적 RNA (stRNA); 또는 짧은, 헤어핀 RNA (shRNA); 작은 RNA-유도된 유전자 활성화 (RNAa); 또는, 작은 활성화 RNA (saRNA)를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드(가령, 서열 번호: 3-6)의 표적화는 이들 표적의 발현 또는 기능을 조절한다. 한 구체예에서, 발현 또는 기능은 기준과 비교하였을 때 상향-조절된다. 또 다른 구체예에서, 발현 또는 기능은 기준과 비교하였을 때 하향-조절된다.
또 다른 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열 번호: 7-31에서 제시된 것과 같은 서열들을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더 짧은 또는 더 긴 단편들, 변형된 결합 그리고 이와 유사한 것을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 서열 번호: 7 내지 31은 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
바람직한 표적 핵산의 조절은 당분야에 공지된 몇 가지 방식으로 실행될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등. 효소적 핵산 분자들(가령, 리보자임)은 뉴클레오티드 염기 서열-특이적 방식으로 다른 별도의 핵산 분자들을 반복적으로 절단하는 능력을 포함하여 하나 이상의 다양한 반응을 촉매할 수 있는 핵산 분자들이다. 이러한 효소적 핵산 분자들은 예를 들면, 임의의 RNA 전사체를 실질적으로 표적화시키는데 이용될 수 있다
이들의 서열-특이성 때문에, trans-절단 효소적 핵산 분자들은 인간 질환에 대한 치료 물질로써 가능성을 보여준다. 효소적 핵산 분자들은 세포성 RNA의 배경내에 특이적 RNA 표적을 절단하도록 고안될 수 있다. 이러한 절단 이벤트는 mRNA 비-기능성을 제공하여, 이 RNA로부터 단백질 발현을 폐기시킨다. 이러한 방식에서, 질환 상태와 연관된 단백질의 합성이 선택적으로 억제될 수 있다.
일반적으로, RNA 절단 활성을 가진 효소적 핵산은 먼저 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 이와 같은 결합은 표적 RNA를 절단하기 위하여 작용하는 분자의 효소적 부분에 근접하게 유지된 효소적 핵산의 표적 결합 부분을 통하여 일어난다. 따라서, 효소적 핵산은 우선 표적 RNA를 인지하고, 그 다음 상보성 염기 쌍을 통하여 표적 RNA에 결합하고, 그리고 정확한 부위에 일단 결합되면, 효소적으로 작용하여 표적 RNA를 절단한다. 이러한 표적 RNA의 전략적 절단으로 인코드된 단백질의 합성을 지시하는 능력을 파괴시킬 것이다. 효소적 핵산은 이의 RNA표적에 결합하여 이를 절단시킨 후, RNA로부터 방출되어 또 다른 표적을 찾고, 새로운 표적에 반복적으로 결합하고, 이를 절단할 수 있다.
이와 같은 시험관 선별(발달)의 몇 가지 전략이 이용되어, 절단, 및 포스포디에스테르 링키지와 아미드 링키지의 결찰과 같은 다양한 반응을 촉매할 수 있는 새로운 핵산 촉매를 개발하였다.
촉매 활성을 조절할 수 있는 리보자임의 개발은 유전자 발현을 조절하기 위한 목적으로 RNA-절단 리보자임을 이용하는 임의의 전략에 상당히 기여할 수 있다. 해머 머리모양의 리보자임은 예를 들면, Mg2 + 공인자의 포화 농도 존재(10mM)하에 약 1min-1의 촉매속도(kcat)로 기능을 한다. 인위적인 "RNA 리가아제" 리보자임은 약 100 min-1의 속도로 상응하는 자가-변형 반응을 촉매하는 것으로 나타났다. 또한, DNA로 구성된 기질 결합 팔(arm)을 가지고 있는 특정 변형된 해머머리 리보자임은 100 min-1에 근접한 다중 턴-오버 속도로 RNA 절단을 촉매한다. 최종적으로, 특정 뉴클레오티드 유사체를 가진 해머머리의 촉매 코어내에 특이적 잔기의 대체는 촉매 속도에서 약 10배 개선 변형된 리보자임을 제공한다. 이와 같은 발견은 리보자임이 대부분의 자가-절단 리보자임에 의해 시험관에서 보여주는 것보다 상당히 큰 촉매 속도로 화학적 변형을 촉진시킬 것이라는 것을 설명한다. 그 다음 특정 자가-절단 리보자임의 구조를 최적화시켜 최대 촉매 활성을 제공하거나, 또는 전체적으로 RNA 포스포디에스테르 절단에 대해 상당히 더 빠른 속도를 보여주는 새로운 RNA 모티프를 만드는 것이 가능하다.
“해머머리” 모델을 적용시킨 RNA 촉매에 의해 RNA 기질의 분자내 절단은 1987년 처음 나타났다. 상기 RNA 촉매가 회수되었고, 다중 RNA 분자들과 반응되었는데, 이는 진정한 촉매임을 설명하는 것이다.
“해머머리” 모티프에 기초하여 고안된 촉매적 RNA를 이용하여 표적 서열들과 필수적인 염기쌍을 유지하도록 하기 위하여 촉매 RNA내에 적절한 염기 변화를 만듦으로써 특이적 표적 서열들을 절단하였다. 이것은 특이적 표적 서열들을 절단하기 위하여 촉매 RNA의 사용을 허락하며, 그리고 "헤머머리" 모델에 따라 고안된 촉매 RNA는 생체에서 특이적 기질 RNA를 절단하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.
RNA 간섭 (RNAi)은 포유류 및 포유류 세포에서 유전자 발현을 조절하는 강력한 도구가 되었다. 이와 같은 방식은 발현 플라스미드 또는 바이러스 및 siRNA로 프로세스되는 작은 헤어핀 RNA에 대한 코딩 서열을 이용하여 RNA 자체로 또는 DNA로 작은 간섭 RNA(siRNA) 운반을 요구한다. 이 시스템은 pre-siRNA를 세포질로 효과적으로 운반할 수 있는데, 세포질에서 이들 RNA는 활성이 있으며, 유전자 발현을 위하여 조절된 그리고 조직 특이적인 프로모터의 사용을 허용한다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 화합물은 리보핵산 (RNA) 및/또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머, 또는 이의 모방체, 키메라, 유사체 또는 동사체를 포함한다. 이 용어는 자연적으로 생성된 뉴클레오티드, 슈가들 및 공유적 뉴클레오티드간 (기본골격) 링키지로 구성된 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라, 유사하게 기능을 하는 비-자연적으로 생성되는 부분들을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이와 같은 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 강화된 세포성 취입, 표적 핵산에 대해 강화된 친화력 그리고 뉴클레아제 존재시 증가된 안정성과 같은 바람직한 성질들 때문에 고유 형태를 능가하는 것이 종종 바람직하다.
본 발명에 따르면, 올리고뉴클레오티드 또는 "안티센스 화합물"은 안티센스 올리고뉴클레오티드 (가령 RNA, DNA, 이의 모방체, 키메라, 유사체 또는 동사체), 리보자임, 외부 유도 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, siRNA 화합물, 단일- 또는 이중-가닥 RNA 간섭 (RNAi) 화합물 가령, siRNA 화합물, saRNA, aRNA, 및 표적 핵산의 최소한 일부분에 하이브리드되어 이의 기능을 조절하는 기타 올리고머 화합물을 포함한다. 이와 같이, 올리고뉴클레오티드 또는 "안티센스 화합물"은 DNA, RNA, DNA-like, RNA-like, 또는 이의 혼합물들일 수 있고, 또는 하나 이상의 이들의 모방체가 될 수도 있다. 이들 화합물들은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물이 될 수 있으며, 그리고 내부 또는 말단 중배(bulges), 미스메치 또는 루프와 같은 구조적 요소들을 포함할 수 있다. 안티센스 화합물들은 일반적으로 선형으로 준비되지만, 원형 및/또는 가지형이 되기 위해 결합하거나 다른 방식으로 준비될 수 있다. 안티센스 화합물은 예를 들면, 두 개 가닥이 하이브리드되어 완전하게 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 형성하거나 또는 하이브리드화 및 완전하게 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물의 형성을 허용하기 위하여 충분한 자가-상보성을 가진 단일 가닥과 같은 구조체를 포함할 수 있다. 두 가닥은 내부적으로 연결되어 자유 3' 또는 5' 말단을 남겨놓거나 또는 연속 헤어핀 구조 또는 루프를 형성하기 위해 연결될 수 있다. 헤어핀 구조는 5' 또는 3' 말단에 단일 가닥의 연장부를 만드는 오버행을 포함할 수 있다. 이중 가닥의 화합물들은 선택적으로 양단에 오버행을 포함할 수 있다. 추가 변형은 말단, 선택된 뉴클레오티드 위치, 슈가 위치중 하나에 부착된, 또는 뉴클레오티드간 링키지 중 하나에 부착된 콘쥬게이트 군을 포함할 수 있다. 대안으로, 두 개 가닥은 비-핵산 모이어티 또는 링커 군을 통하여 링크될 수 있다. 한 개 가닥으로부터만 형성된 경우, dsRNA는 듀플렉스를 형성하기 위하여 자체에 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취할 수 있다. 따라서, dsRNAs는 완전히 또는 부분적으로 이중 가닥이 될 수 있다. 유전자 발현의 특이적 조절은 유전자전이 세포계에서 dsRNA 헤어핀의 안정적 발현에 의해 이루어질 수 있다. 두 개 가닥으로부터 형성될 때, 또는 듀플렉스를 형성하기 위하여 자체에 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취하는 단일 가닥의 경우, 두 개 가닥(또는 단일 가닥의 듀플렉스 형성 구역)은 Watson-Crick 방식으로 염기쌍을 이루는 상보성 RNA 가닥이다.
일단 시스템내로 도입되면, 본 발명의 화합물들은 표적 핵산의 절단 또는 다른 변형을 얻기 위하여 하나 이상의 효소 또는 구조적 단백질의 작용을 유도할 수 도 있고, 또는 점유-기반 기전(occupancy-based mechanisms)을 통하여 작용할 수도 있다. 일반적으로, 핵산 (올리고뉴클레오티드를 포함)은 "DNA-like" (가령, 하나 이상의 2'-데옥시 슈가를 가지고, 그리고 U 염기 대신 일반적으로 T를 가짐) 또는 "RNA-like" (가령, 하나 이상의 2'-하이드록시 또는 2'-변형된 슈가를 가지고, 그리고 T 염기 대신 U 염기를 일반적으로 가짐)으로 설명될 수 있다. 핵산 헬릭스는 한 가지 이상의 구조 유형을 채택할 수 있지만, 가장 흔하게는 A- 및 B-형이 된다. 일반적으로, B-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "DNA-like"이며, 그리고 A-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "RNA-like"이다. 일부(키메라) 구체예에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형 구역을 포함한다.
본 발명에 따른 안티센스 화합물은 길이가 약 5 내지 약 80 뉴클레오티드 (가령, 약 5 내지 약 80개의 링크된 뉴클레오시드)의 안티센스 부분을 포함할 수 있다. 이는 안티센스 가닥 또는 안티센스 화합물의 일부분의 길이를 말한다. 환언하면, 본 발명의 단일-가닥 안티센스 화합물은 약 5 내지 약 80 뉴클레오티드를 포함하며, 그리고 본 발명의 이중-가닥 안티센스 화합물(예를 들면, dsRNA)은 길이가 5개 내지 약 80개 뉴클레오티드로 된 센스 및 안티센스 가닥 또는 일부분을 포함한다. 이것은 길이가 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 또는 80개 뉴클레오티드 또는 이 범위내 임의의 수의 안티센스 부분을 포함한다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 길이가 10개 내지 50개 뉴클레오티드의 안티센스 부분을 가진다. 이것은 길이가 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 또는 50개 뉴클레오티드 또는 이 범위내 임의의 수의 안티센스 부분으로 구체화된다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 일부 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 15개의 뉴클레오티드다.
한 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 길이가 12개 또는 13개 내지 30개 뉴클레오티드의 안티센스 부분을 가진다. 이것은 길이가 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개 뉴클레오티드 또는 이 범위내 임의의 수의 안티센스 부분으로 구체화된다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 올리고머 화합물은 화합물내에 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 상이한 염기가 존재하는 변이체를 포함한다. 예를 들면, 첫번째 뉴클레오티드가 아데노신이라면, 변이체들은 이 위치에 티미딘, 구아노신 또는 시티딘을 포함하도록 만들어질 수 있다. 안티센스 또는 dsRNA 화합물의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 이들 화합물은 표적 핵산의 발현을 억제하는 이들 능력을 측정하기 위하여 여기에서 설명된 방법에 의해 테스트된다.
일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 40% 내지 약 60%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 60% 내지 약 70%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 70% 내지 약 80%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 80% 내지 약 90%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이다.
또 다른 구체예에서, 서열 번호:7 내지 31에 제시된 핵산 분자들과 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환 또는 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA)으로 치환된다.
또 다른 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 아디포넥틴(ADIPOQ) 및 서열 번호: 1 내지 6의 서열과 연관된 코딩 및/또는 넌코딩 서열들의 핵산 분자들 센스 및/또는 안티센스의 하나 이상의 구역을 표적한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 1 내지 6의 중첩 구역을 또한 표적한다.
본 발명의 특정 바람직한 올리고뉴클레오티드는 키메라 올리고뉴클레오티드다. 본 발명의 내용에서 "키메라 올리고뉴클레오티드" 또는 "키메라"는 두개 이상의 화학적으로 별개의 구역을 포함하며, 각 구역은 최소 한 개의 뉴클레오티드로 구성되는, 올리고뉴클레오티드다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 하나 이상의 유익한 성질(예를 들면, 증가된 뉴클레아제 저항성, 세포내로의 증가된 취입, 표적에 대한 증가된 결합 친화력)을 부여하는 변형된 뉴클레오티드의 최소 한 구역과 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 기질이 되는 구역을 포함한다. 예를 들면, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제다. 따라서, RNase H의 활성화는 RNA 표적의 절단을 초래하여, 유전자 발현의 안티센스 조절의 효과를 상당히 강화시킨다. 결과적으로, 동일한 표적 구역에 하이브리드되는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드와 비교하였을 때, 키메라 올리고뉴클레오티드가 사용되면, 더 짧은 올리고뉴클레오티드로 필적할 수 있는 결과를 종종 얻을 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동 및 필요하다면, 당분야에 공지된 핵산 하이브리드 기술과 연합하여 일반적으로 탐지될 수 있다. 바람직한 한 구체예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 표적 결합 친화력을 증가시키도록 변형된 최소한 한 구역과, RNAse H에 대한 기질로 작용하는 한 구역을 포함한다. 올리고뉴클레오티드가 이의 표적에 대한 친화력(이 경우, ras를 인코드하는 핵산)은 올리고뉴클레오티드/표적 쌍의 Tm을 측정함으로써 일반적으로 결정되는데, 이것은 올리고뉴클레오티드와 표적이 분리되는 온도이며; 해리는 분광광도계에 의해 탐지된다. Tm이 높을수록 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화력은 커진다.
본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 상기에서 설명된 것과 같이 두개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체의 혼성 구조로 형성될 수 있다. 이와 같은 화합물을 당분야에서 하이브리드(hybrids) 또는 겜퍼(gapmers)라고 한다. 이와 같은 하이브리드 구조의 제조에 대해 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 미국 특허 제5,013,830호; 제5,149,797호; 제5,220,007호; 제5,256,775호; 제5,366,878호; 제5,403,711호; 제5,491,133호; 제5,565,350호; 제5,623,065호; 제5,652,355호; 제5,652,356호; 및 제5,700,922호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
또 다른 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 구역은 슈가의 2'위치에서 변형된 최소한 뉴클레오티드를 포함하는데, 가장 바람직하게는 2'-O알킬, 2'-O-알킬-O-알킬 또는 2'-플루오르-변형된 뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, RNA 변형은 피리미딘의 리보즈, 염기가 소실된 잔기(abasic residues) 또는 RNA의 3' 말단에서 역전된 염기상에 2'-플루오르, 2'-아미노 및 2' O-메틸 변형을 포함한다. 이와 같은 변형은 올리고뉴클레오티드에 통상적으로 통합되며, 그리고 이들 올리고뉴클레오티드는 주어진 표적에 대해 2'-데옥시올리고뉴클레오티드보다 더 높은 Tm(가령, 더 높은 표적 결합 친화력)을 가지는 것을 보여주었다. 증가된 친화력의 효과는 유전자 발현의 RNAi 올리고뉴클레오티드 억제를 상당히 강화시키는 것이다. RNAse H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이며; 따라서, 이 효소의 활성화로 RNA 표적이 절단되며, 그리고 RNAi 억제의 효과는 상당히 강화될 것이다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동에 의해 통상적으로 설명될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레아제 저항성을 강화시키기 위하여 변형된다. 세포는 핵산을 분해시킬 수 있는 다양한 엑소- 및 엔도-뉴클레아제를 포함한다. 다수의 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 변형은 고유한 올리고데옥시뉴클레오티드 보다 뉴클레아제 절단에 더 저항성을 가지도록 올리고뉴클레오티드가 통합된 것들이다. 뉴클레아제 저항성은 올리고뉴클레오티드를 세포 추출물 또는 분리된 뉴클레아제 용액과 항온처리하고, 통상적으로 겔 전기영동에 의해 시간이 경과한 후에 남아있는 고유 올리고뉴클레오티드의 수준을 측정함으로써 결정된다. 뉴클레아제 저항성을 강화시키도록 변형된 올리고뉴클레오티드는 변형안된 올리고뉴클레오티드보다 더 긴 시간 동안 고유한 상태로 존재한다. 다양한 올리고뉴클레오티드 변형이 뉴클레아제 저항성을 강화시키거나 부여한다는 것이 설명되었다. 최소한 하나의 포스포로티오에이트 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 더 바람직하다. 일부 경우, 표적 결합 친화력이 강화된 올리고뉴클레오티드 변형은 독립적으로 뉴클레아제 저항성을 강화시킨다. 일부 바람직한 변형은 De Mesmaeker et al . (1995) Acc . Chem . Res . 28:366-374에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에서 구상된 일부 올리고뉴클레오티드의 특정 예는 변형된 기본골격을 포함하는 것들, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 짧은 쇄 알킬 또는 사이클로알킬 인터슈가 링키지 또는 짧은 쇄 이형원자 또는 이형사이클 인터슈가 링키지를 포함한다. 대부분 포스포로티오에이트 기본골격을 가진 올리고뉴클레오티드 및 이형원자 기본골격을 가진 올리고뉴클레오티드, 특히, CH2--NH--O--CH2, CH,--N(CH3)--O--CH2 [메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 기본골격으로 공지됨], CH2--O--N(CH3)--CH2, CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2 및 O--N (CH3)--CH2--CH2 기본골격을 가지며, 이때 고유 포스포디에스테르 기본골격은 O--P--O--CH로 나타낸다). De Mesmaeker et al . (1995) Acc . Chem . Res . 28:366-374)에서 설명된 아미드 기본골격 또한 바람직하다. 몰포리노 기본골격 구조를 가진 올리고뉴클레오티드 또한 바람직하다(Summerton and Weller , U.S. 특허 제5,034,506호). 다른 구체예에서, 펩티드 핵산 (PNA) 기본골격와 같은 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 기본골격은 폴리아미드 기본골격과 대체되며, 뉴클레오티드는 폴리아미드 기본골격의 아자 질소 원자에 직간접적으로 결합된다 (Nielsen et al . (1991) Science , 254, 1497). 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 슈가 모이어티를 또한 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH3O(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2 또는 O(CH2)nCH3 이때, n은 1 내지 약 10이다; C1 내지 C10 저가알킬, 알콕시알콕시, 치환된 저가 알킬, 알카릴 또는 아랄킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O--, S--, 또는 N-알킬; O--, S--, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로사이클로알킬; 헤테로사이클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실일; RNA 절단기; 리포터기; 삽입기(intercalator); 올리고뉴클레오티드의 약리역학적 성질을 개선시키는 기; 또는 올리고뉴클레오티드 및 유사한 성질을 가진 다른 치환기의 약리역학적 성질을 개선시키는 기. 변형은 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸)로 공지되기도 함]을 포함한다. 다른 변형은 2'-메톡시 (2'-O--CH3), 2'-프로폭시 (2'-OCH2 CH2CH3) 및 2'-플루오르 (2'-F)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드상의 다른 위치에 유사한 변형이 있을 수 있는데, 특히, 3' 말단 뉴클레오티드과 5' 말단 뉴클레오티드의 5'위치의 슈가의 3' 위치에 있을 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토퓨라노실기 대신 사이클로부틸과 같은 슈가 모방체를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 또한 추가적으로 또는 대안으로, 뉴클레오티드 (당분야에서 흔히 간단히 “염기”라고 부른다) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, "변형안된" 또는 "천연" 뉴클레오티드는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드는 천연 핵산에 드물게 또는 일시적으로 발견되는 뉴클레오티드, 가령, 하이포산틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 특히 5-메틸시토신 (5-메틸-2'데옥시시토신이라고 하기도 하고, 당분야에서 5-Me-C 라고 지칭하기도 함), 5-하이드록시메틸시토신 (HMC), 글리코실 HMC 및 겐토바이오실 HMC, 뿐만 아니라 합성 뉴클레오티드, 가령, 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸일알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 다른 헤테로치환된 알킬아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다. 당분야에 공지된 “범용(universal)” 염기, 가령, 이노신이 포함될 수 있다. 5-Me-C 치환은 0.6-1.2℃로 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 확인되었고,(Sanghvi , Y. S., in Crooke , S. T. and Lebleu , B., eds ., Antisense Research and Applications , CRC Press , Boca Raton , 1993, pp . 276-278) 그리고 현재 염기 치환이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 또 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성 또는 세포성 취입을 강화시키는 올리고뉴클레오티드 하나 이상의 모이어티 또는 콘쥬게이트에 화학적으로 연결된 것을 포함한다. 이러한 모이어티는 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 티오에테르, 가령, 헥실-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄, 가령, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 포스포리피드, 가령, 디-헥사데실--rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 또는 아다만탄 아세트산을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 친지성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 이와 같은 올리고뉴클레오티드를 준비하는 방법들은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호.
주어진 올리고뉴클레오티드의 모든 위치들이 균일하게 변형될 필요는 없으며, 그리고 전술한 변형중 하나 이상이 단일 올리고뉴클레오티드에 통합되거나 또는 올리고뉴클레오티드내 단일 뉴클레오티드에만 통합될 수 있다. 본 발명은 여기에서 정의된 키메라 올리고뉴클레오티드가 되는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 염기가 소실된(abasic) 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 폴리하이드로카본 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 또 다른 모이어티와 콘쥬게이트된다. 이들 분자들은 슈가, 염기 또는 인산염 기의 몇 군데 위치에서 핵산 분자를 포함하는 임의의 하나 이상의 뉴클레오티드에 링크될 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
본 발명에 이용된 올리고뉴클레오티드는 잘 알려진 고형상 합성 기술을 통하여 통상적으로 그리고 일상적으로 만들어질 수 있다. 이와 같은 합성을 위한 장비는 Applied Biosystems을 포함하는 몇 군데 업자들이 판매한다. 이와 같은 합성을 위한 임의의 기타 수단들이 이용될 수 있으며; 올리고뉴클레오티드의 실질적인 합성은 본 발명의 분야에 숙지된 자의 능력 범위내에 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체들과 같은 다른 올리고뉴클레오티드를 준비하기 위한 유사한 기술을 이용하는 것 또한 공지되어 있다. 형광 라벨된, 바이오티닐화된 또는 콜레스테롤-변형된 올리고뉴클레오티드와 같은 기타 변형된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위하여 유사한 기술 및 시판되는 변형된 아미디트(amidites) 및 조절된 포어 글라스(CPG) 산물들, 가령, 바이오틴, 플로오레신, 아크리딘 또는 솔라렌(psoralen)-변형된 아미디트 및/또는 CPG (Glen Research , Sterling VA)으로부터 시판되는 것 이용)을 이용하는 것 또한 공지되어 있다.
본 발명에 따르면, 효과, 특이성 및 작용 기간을 강화시키기 위하여 LNA 모노머와 같은 변형을 이용하면, MOE, ANA, FANA, PS 등과 같은 현재 화학물질로 구성된 올리고뉴클레오티드의 투여 경로를 확장시킨다. 현재 올리고뉴클레오티드에서 일부 모노머를 LNA 모노머로 치환시키면 이루어질 수 있다. LNA 변형된 올리고뉴클레오티드는 부모 화합물과 유사한 크기를 가질 수 있고, 또는 더 큰, 또는 바람직하게는 더 작은 크기를 가질 수 있다. 이와 같은 LNA-변형된 올리고뉴클레오티드는 약 70% 미만의, 더욱 바람직하게는 약 60% 미만의, 가장 바람직하게는 약 50% 미만의 LNA 모노머를 포함하며, 이들 크기는 약 5개 내지 25개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 12개 내지 20 개 뉴클레오티드 사이가 된다.
변형된 올리고뉴클레오티드 기본골격은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 3'알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 링키지를 가진 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 링크된 유사체들, 그리고 역전된 극성을 가진 것들(이때, 뉴클레오시드 단위의 인접된 쌍은 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 링크된)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다양한 염, 혼합된 염 및 자유 산 형태도 포함된다.
상기 인-함유 링키지의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 및 제5,625,050호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 기본골격은 짧은 쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 링키지, 혼합된 이형원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 링키지, 또는 하나 이상의 짧은 쇄 이형원자 또는 이형사이클 뉴클레오시드간 링키지에 의해 형성된 기본 골격을 가진다. 이들은 몰포리노 링키지 (뉴클레오시드의 슈가 부분으로부터 일부 형성된); 실로옥산 기본골격; 설파이드, 술포옥시드 및 술폰 기본골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 기본골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 기본골격; 알켄 함유 기본골격; 술파메이트 기본골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 기본골격; 술포네이트 및 술폰아미드 기본골격; 아미드 기본골격; 그리고 N, O, S 및 CH2 성분 부분이 혼합된 것을 가지는 것들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다; 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
기타 올리고뉴클레오티드 모방체에 있어서, 슈가 및 뉴클레오티드간 링키지는 모두, 가령, 뉴클레오티드 단위의 기본 골격은 신규한 군으로 대체된다. 염기 단위는 적합한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 올리고머 화합물중 하나인, 우수한 하이브리드화 성질을 가진 것으로 확인된 올리고뉴클레오티드 모방체를 펩티드 핵산 (PNA)이라 지칭한다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 슈가-기본 골격은 아미드 함유 기본골격, 특히 아미도에틸글리신 기본골격으로 치환된다. 핵염기는 보유되며, 기본 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다. PNA 화합물의 추가 교시는 Nielsen et al ., (1991) Science , 254, 1497-1500에서 볼 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 포스포로티오에이트 기본골격를 가진 올리고뉴클레오티드, 이형원자 기본골격, 특히, CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-(메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 기본골격으로 공지됨), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3)CH2- 및-O-N(CH3)-CH2-CH2-를 가진 올리고뉴클레오시드가 되며, 이때, 고유 포스포디에스테르 기본골격은 상기 언급된 미국 특허 제5,489,677호의 -O-P-O-CH2-를 나타내고, 그리고 상기 언급된 미국 특허 제5,602,240호의 아미드 기본 골격이다. 또한, 상기 언급된 미국 특허 제5,034,506호의 몰포리노 기본골격 구조를 가진 올리고뉴클레오티드이다.
변형된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 슈가 모이어티를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S-또는 N-알키닐; 또는 O 알킬-O-알킬, 이때, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환된 또는 치환안된 C 내지 CO 알킬 또는 C2 내지 CO 알케닐 및 알키닐이다. 특히 O(CH2)nOmCH3, O(CH2)n, OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2n)ON(CH2)nCH3)2 이며, 이때 n과 m은 1 내지 약 10이 될 수 있다. 다른 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: C 내지 CO, (저가 알킬, 치환된 저가 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실일, RNA 절단기; 리포터기; 삽입기(intercalator); 올리고뉴클레오티드의 약리역학적 성질을 개선시키는 기; 또는 올리고뉴클레오티드 및 유사한 성질을 가진 다른 치환기의 약리역학적 성질을 개선시키는 기. 변형은 알콕시알콕시기인 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 공지되기도 함]을 포함한다. 추가 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 가령, O(CH2)2ON(CH3)2 기, (하기 실시예에서 설명되는 것과 같이 2'-DMAOE로 공지되기도 함) 그리고 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (당분야에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE), 가령, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2을 포함한다.
다른 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-O CH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오르 (2'-F)을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드에서 3' 위치의 슈가 또는 2'-5' 링크된 올리고뉴클레오티드에서, 그리고 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에 유사한 변형이 만들어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토퓨라노실 슈가 대신 사이클로부틸 모이어티와 같은 슈가 모방체를 가질 수 있다. 이와 같은 변형된 슈가 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
올리고뉴클레오티드는 또한 핵염기 (당분야에서 흔히 간단히 “염기”라고 부른다) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, "변형안된" 또는 "천연" 뉴클레오티드는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드는 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 산틴, 하이포산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체들, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체들, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도-우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오르메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸무아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 그리고 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌과 같은 다른 합성 및 천연 뉴클레오티드를 포함한다.
또한, 뉴클레오티드는 미국 특허 No. 3,687,808호, 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering' , pages 858-859, Kroschwitz , J.I., ed . John Wiley & Sons , 1990, those disclosed by Englisch et al ., ' Angewandle Chemie , International Edition' , 1991, 30, page 613, 및 Sanghvi , Y.S., Chapter 15, ' Antisence Research and Applications' , pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu , B. ea ., CRC Press , 1993에 설명된 것들을 포함한다. 이와 같은 뉴클레오티드의 일부는 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화력을 증가시키는데 특히 유용하다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정도를 0.6-1.2℃ 증가시킨 것으로 나타났고(Sanghvi , Y.S., Crooke , S.T. and Lebleu , B., eds , 'Antisence Research and Applications' , CRC Press , Boca Raton , 1993, pp . 276-278) 그리고 2'-O메톡시에틸 슈가 변형과 복합하였을 때 특히 염기 치환이다.
상기 변형된 뉴클레오티드 및 기타 변형된 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 미국 특허 제3,687,808호, 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,750,692호, 및 제5,681,941호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 기타 변형은 올리고뉴클레오티드 하나 이상의 모이어티 또는 콘쥬게이트에 화학적으로 연결되는 것을 포함하는데, 이는 활성, 세포 분포 또는 올리고뉴클레오티드의 세포 취입을 강화시킨다.
이와 같은 모이어티는 콜레스테롤 모이어티, 담즙산, 티오에테르, 가령, 헥실-S-트리릴티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄 가령, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질 가령, 디-헥사데실--rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-t 옥시콜레스테롤 모이어티와 같은 지질 모이어티를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이와 같은 올리고뉴클레오티드 모이어티의 제법을 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호, 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호; 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
약물 발견: 본 발명의 화합물은 약물 발견 및 표적 유효화 분야에 적용시킬 수 있다. 본 발명은 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드와 질병 상태, 표현형 또는 조건 사이에 존재하는 상관 관계를 설명하기 위하여 약물 발견 노력에서 여기에서 확인된 화합물의 이용 및 바람직한 표적 단편의 이용을 포함한다. 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드를 탐지 또는 조절하는 것을 포함하는 이들 방법은 시료, 조직, 세포 또는 유기체를 본 발명의 화합물과 접촉시키고, 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드의 핵산 또는 단백질 수준을 측정하거나 및/또는 처치후 일정 시간에서 관련된 표현형 또는 화학적 엔드포인트를 측정하고, 그리고 선택적으로 처리안된 샘플의 측정된 값과 본 발명의 추가 화합물로 처리된 화합물의 값을 비교하는 것을 포함한다. 이들 방법은 표적 유효화 프로세스를 위하여 미지의 유전자 기능을 결정하기 위하여, 또는 특정 질환, 상태 또는 표현형의 치료 또는 예방을 위한 표적으로 특정 유전자 산물의 유효성을 결정하기 위한 다른 실험과 나란히 또는 복합하여 실행될 수 있다.
유전자 발현의 상향 조절 또는 억제의 평가:
외인성 핵산을 숙주 세포 또는 유기체로의 전달은 세포 또는 유기체내 핵산이 존재하는 것을 직접적으로 탐지함으로써 평가될 수 있다. 이와 같은 탐지는 당분야에 공지된 몇 가지 방법에 의해 실현될 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산의 존재는 서든 블랏 또는 핵산과 연합된 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용한 폴리메라제 쇄 반응(PCR)에 의해 탐지될 수 있다. 외인성 핵산의 발현은 유전자 발현 분석을 포함하는 통상적인 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산으로부터 생성된 mRNA는 노던 블랏 또는 역 전사 PCR (RT-PCR)을 이용하여 탐지되고 정량화될 수 있다.
외인성 핵산으로부터의 RNA 발현 또한 효소적 활성 또는 리포터 또는 리포터 단백질 활성을 측정함으로써 탐지될 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산이 효과물질 RNA를 생산하고 있다는 것을 나타내는 것과 같이 표적 핵산 발현의 증가 또는 감소에 의해 안티센스 조절 활성을 간접적으로 측정할 수 있다. 서열 보존에 근거하여, 프라이머를 고안하고, 이를 표적 유전자의 코딩 구역을 증폭시키는데 이용할 수 있다. 우선, 각 유전자의 가장 많이 발현된 코딩 구역을 이용하여 모델 기준 유전자를 구축할 수 있는데, 이때 임의의 코딩 또는 넌코딩 구역이 이용될 수 있다. 리포터 코딩 구역과 이의 폴리(A) 신호 사이에 각 코딩 구역을 삽입시켜 각 기준 유전자를 어셈블리한다. 이와 같은 플라스미드는 유전자의 상류 부분에 리포터 유전자를 가지고, 그리고 3' 넌-코딩 구역에 잠재적인 RNAi 표적을 가지는 mRNA를 만든다. 리포터 유전자를 조절함으로써 개별 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 분석할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 리포터 유전자는 아세토하이드록시산 합성효소 (AHAS), 알칼리 포스파타제(AP), 베타 갈락토시다제(LacZ), 베타 글루코로니다제(G미국), 클로람페니콜 아세틸전이효소(CAT), 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 청록색 형광 단백질 (CFP), 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 루시페라제(Luc), 노팔린 합성효소 (NOS), 옥토파인 합성효소 (OCS), 그리고 이들의 유도체들을 포함한다. 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 젠타마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리친, 퓨로마이신 및 테트라사이클린에 저항성을 부여하는 다중 선택성 마커가 이용된다. 리포터 유전자의 조절을 결정하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 이들 방법은 형광 측정법(가령, 형광 분광학, 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 형광 현미경), 항생제 저항성 측정을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
ADIPOQ1 및 ADIPOQ2 단백질 및 mRNA 발현은 당업계에 공지되어 있는 방법들 및 본 명세서 곳곳에서 설명된 방법들을 이용하여 분석할 수 있다. 예를 들면, ELISA와 같은 면역분석을 이용하여 단백질 수준을 결정할 수 있다. ELISAs를 위한 아디포넥틴(ADIPOQ) 항체는 R&D Systems (Minneapolis, MN), Abcam, Cambridge, MA으로부터 상업적으로 입수가능하다.
구체예들에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 처리되는 시료(가령 생체내 또는 시험관내 세포 또는 조직들)내의 ADIPOQ1 및 ADIPOQ2 발현(가령, mRNA 또는 단백질)은 대조군 시료에서의 아디포넥틴(ADIPOQ) 발현과 비교하여 평가한다. 예를 들면, 단백질 또는 핵산의 발현은 당업계에 공지되어 있는 방법들을 이용하여 가짜로 처리된 또는 처리안된 시료내에서의 발현과 비교할 수 있다. 대안으로, 원하는 정보에 근거하여 대조군 안티센스 올리고뉴클레오티드 (가령, 변경된 또는 상이한 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드)로 처리된 시료와 비교할 수 있다. 또다른 구체예에서, 처리된 시료 대 처리안된 시료내에서 아디포넥틴(ADIPOQ) 단백질 또는 핵산의 발현의 차이는 처리된 시료 대 처리안된 시료내 상이한 핵산(연구자가 적합하다고 간주하는 임의 표준, 가령, 유지관리(housekeeping) 유전자를 포함)의 발현 차이로 비교할 수 있다.
관찰된 차이는 대조군과의 비교를 위하여 비율 또는 분획형태로 원한다면 표현할 수 있다. 구체예들에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 시료내의 아디포넥틴(ADIPOQ) mRNA 또는 단백질의 수준은 대조군 핵산으로 처리된 또는 처리안된 시료와 비교하여 약 1.25배 내지 약 10배 이상 증가 또는 감소된다. 구체예들에서, 아디포넥틴(ADIPOQ) mRNA 또는 단백질의 수준은 최소한 약 1.25-배, 최소한 약 1.3-배, 최소한 약 1.4-배, 최소한 약 1.5-배, 최소한 약 1.6-배, 최소한 약 1.7-배, 최소한 약 1.8-배, 최소한 약 2-배, 최소한 약 2.5-배, 최소한 약 3-배, 최소한 약 3.5-배, 최소한 약 4-배, 최소한 약 4.5-배, 최소한 약 5-배, 최소한 약 5.5-배, 최소한 약 6-배, 최소한 약 6.5-배, 최소한 약 7-배, 최소한 약 7.5-배, 최소한 약 8-배, 최소한 약 8.5-배, 최소한 약 9-배, 최소한 약 9.5-배, 또는 최소한 약 10-배 또는 그 이상 증가 또는 감소된다.
키트 , 연구 시약, 진단제 및 치료제
본 발명의 화합물을 진단, 치료 및 예방용으로 이용하거나 연구 시약 및 키트 성분으로 이용할 수 있다. 더욱이, 당업자들은 정교한 특이성으로 유전자 발현을 저해시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 특정 유전자의 기능을 밝히거나 또는 생물학적 경로의 다양한 구성부의 기능들을 구별한다.
키트, 진단 그리고 다양한 생물학적 시스템에 사용하기 위하여, 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 화합물 또는 치료제와 복합하여, 세포 및 조직에서 발현되는 유전자의 일부 또는 전체 보체의 발현 패턴을 밝히기 위한 차등적 및/또는 복합적 분석에 도구로 유용하다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "생물학적 시스템" 또는 "시스템"은 아디포넥틴(ADIPOQ) 유전자의 산물들을 발현시키는, 또는 이를 발현시키도록 능력을 갖춘 임의의 유기체, 세포, 세포 배양물 또는 조직으로 정의된다. 시스템에는 인간, 유전자전이 동물, 세포, 세포 배양물, 조직, 이형이식편, 이식물 및 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
비-제한적 실시예로써, 하나 이상의 안티센스 화합물로 처리된 세포 또는 조직에서의 발현 패턴은 안티센스 화합물로 처리안된 기준 세포 또는 조직과 비교되며, 그리고 생성된 패턴은 검사되는 유전자의 질병 연관성, 신호 경로, 세포 국소화, 발현 수준, 크기, 구조 또는 기능에 관련되기 때문에 차등적인 유전자 발현 수준에 대해 분석된다. 자극된 또는 자극되지 않은 세포, 그리고 발현 패턴에 영향을 주는 다른 화합물들의 존부하에 이와 같은 분석들이 실행될 수 있다.
당분야에 공지된 유전자 발현 분석 방법의 예로는 DNA 어래이 또는 마이크로어래이 (Brazma and Vilo, (2000) FEBS Lett ., 2000 480, 17-24; Celis , et al ., (2000) FEBS Lett ., 480, 2-16), SAGE (유전자 발현의 일련의 분석)(Madden , et al ., (2000) Drug Discov . Today , 2000, 5, 415-425), READS (절단된 cDNAs의 제한 효소 증폭) (Prashar and Weissman , (1999) Methods Enzymol ., 303, 258-72), TOGA (총 유전자 발현 분석) (Sutcliffe , et al ., (2000) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A.., 97, 1976-81), 단백질 어래이 및 단백체학(proteomics) (Celis , et al ., (2000) FEBS Lett., 480, 2-16; Jungblut , et al ., Electrophoresis , 1999, 20, 2100-10), 발현된 서열 tag (EST) 서열화(Celis , et al ., (2000) FEBS Lett ., 480, 2-16; Larsson , et al ., (2000) J. Biotechnol., 80, 143-57), 차감성 RNA 핑거프린팅 (SuRF) (Fuchs , et al ., (2000) Anal . Biochem., 286, 91-98; Larson , et al ., (2000) Cytometry , 41, 203-208), 차감성 클로닝, 차등적 디스플레이(DD) (Jurecic and Belmont , (2000) Curr . Opin . mircobiol ., 3, 316-21), 비교성 게놈 하이브리드화 (Carulli , et al ., (1998) J. Cell Biochem . Suppl ., 1998, 31, 286-96), FISH (형광 원위치 하이브리드화) 기술 (Going and Gusterson , (1999) Eur . J. Cancer , 35, 1895-904) 및 대량 분광학 방법(To , Comb . (2000) Chem . High Throughput Screen , 3, 235-41)을 포함한다.
본 발명의 화합물은 이들 화합물이 아디포넥틴(ADIPOQ)을 인코드하는 핵산에 하이브리드하기 때문에 연구 및 진단에 유용하다. 예를 들면, 효과적인 아디포넥틴(ADIPOQ) 조절물질로써 여기에서 설명되는 조건 및 효과를 가지고 하이브리드되는 올리고뉴클레오티드는 유전자 증폭 또는 탐지에 유리한 조건하에 효과적인 프라이머 또는 프로브다. 이들 프라이머 및 프로브는 아디포넥틴(ADIPOQ)을 인코드하는 핵산 분자들의 특이적 탐지를 요구하는 방법 및 아디포넥틴(ADIPOQ) 탐지 또는 추가 연구에 유용한 이들 핵산 분자들의 증폭에 유용하다. 당분야에 공지된 방법에 의해 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히, 본 발명의 프라이머 및 프로브와 아디포넥틴(ADIPOQ)을 인코드하는 핵산의 하이브리드를 탐지할 수 있다. 이와 같은 수단은 올리고뉴클레오티드에 효소의 콘쥬게이션, 올리고뉴클레오티드의 방사능라벨링 또는 임의의 다른 적합한 탐지 수단을 포함할 수 있다. 샘플에서 아디포넥틴(ADIPOQ)의 수준을 탐지하기 위한 탐지 수단을 이용한 키트를 준비할 수 있다.
치료요법적 용도로 당업자는 안티센스의 특이성 및 감응성을 이용한다. 인간을 포함하는 동물의 질병 상태를 치료하는데 치료요법적 모이어티로 안티센스 화합물을 이용하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 약물은 인간에게 안전하고 효과적으로 투여되었으며, 그리고 다수의 임상 시험이 현재 진행중이다. 따라서, 안티센스 화합물은 세포, 조직 및 동물, 특히 인간의 치료 섭생에 유용하도록 설정되는 유용한 치료 양식이 될 수 있다.
치료용으로, 아디포넥틴(ADIPOQ)의 발현을 조절하여 치료될 수 있는 질환 또는 장애에 민감한 동물, 특히 인간을 본 발명에 따른 안티센스 화합물을 투여함으로써 치료한다. 예를 들면, 한 가지 비-제한적인 구체예에서, 이 방법은 치료를 요하는 동물에게 아디포넥틴(ADIPOQ) 조절물질의 치료요법적 효과량을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 아디포넥틴(ADIPOQ) 조절물질은 아디포넥틴(ADIPOQ) 단백질의 활성을 효과적으로 조절하거나 또는 아디포넥틴(ADIPOQ) 단백질의 발현을 효과적으로 조절한다. 한 구체예에서, 동물에서 아디포넥틴(ADIPOQ)의 활성 또는 발현은 기준과 비교하여 약 10% 억제된다. 바람직하게는, 동물에서 아디포넥틴(ADIPOQ)의 활성 또는 발현은 약 30% 억제된다. 더욱 바람직하게는, 동물에서 아디포넥틴(ADIPOQ)의 활성 또는 발현은 약 50% 또는 그 이상으로 억제된다. 따라서, 기준과 비교하였을 때, 이 올리고머 화합물은 아디포넥틴(ADIPOQ) mRNA의 발현을 최소한 10%, 최소한 50%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 조절한다.
한 구체예에서, 동물에서 아디포넥틴(ADIPOQ)의 활성 또는 발현은 기준과 비교하였을 때 약 10% 증가된다. 바람직하게는, 동물에서 아디포넥틴(ADIPOQ)의 활성 또는 발현은 기준과 비교하였을 때 약 30% 증가된다. 더욱 바람직하게는, 동물에서 아디포넥틴(ADIPOQ)의 활성 또는 발현은 기준과 비교하였을 때 약 50% 또는 그 이상 증가된다. 따라서, 올리고머 화합물은 아디포넥틴(ADIPOQ) mRNA의 발현을 기준과 비교하였을 때, 최소한 10%, 최소한 50%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 조절한다.
예를 들면, 아디포넥틴(ADIPOQ)의 발현 감소는 혈청, 혈액, 지방 조직, 간 또는 임의의 기타 체액, 동물의 조직 또는 기관에서 문헌에서 설명되고, 그리고 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 바람직하게는, 분석될 체액, 조직 또는 기관에 포함된 세포는 아디포넥틴(ADIPOQ) 펩티드를 인코드하는 핵산 분자 및/또는 아디포넥틴(ADIPOQ) 단백질 자체를 포함한다.
본 발명의 화합물들은 적절한 약리학적으로 허용가능한 희석제 또는 캐리어에 효과량의 화합물을 첨가하여 약제 조성물로 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물의 용도 및 방법은 예방학적으로 유용하다.
콘쥬게이트 ( Conjugates ): 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 또 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 취입을 강화시키는 하나 이상의 모이어티 또는 콘쥬게이트에 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 연결시키는 것을 포함한다. 이와 같은 모이어티 또는 콘쥬게이트는 1차 또는 2차 하이드록시기와 같은 기능기에 공유적으로 결합된 콘쥬게이트기를 포함한다. 본 발명의 콘쥬게이트기는 삽입자, 리포터 분자들, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약력학 성질을 강화시키는 기, 그리고 올리고머의 약동학 성질을 강화시키는 기를 포함한다. 일반적인 콘쥬게이트기는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 바이오틴, 페나진, 폴레이트, 페탄트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다. 본 발명의 내용에서 올리고머의 약력학 성질을 강화시키는 기는 취입을 개선시키고, 분해에 저항성을 강화시키고, 및/또는 표적 핵산과 서열 특이적 하이브리드를 강화시키는 기들을 포함한다. 본 발명의 내용에서 올리고머의 약동학 성질을 강화시키는 기는 본 발명의 화합물의 취입, 분포, 대사 또는 배출을 개선시키는 기들을 포함한다. 대표적인 콘쥬게이트 기는 국제 특허 출원 PCT/미국92/09196 (1992년 10월 23일 출원) 및 미국 특허 제6,287,860호에서 설명되며, 참고문헌에 통합된다. 콘쥬게이트 모이어티는 콜레스테롤 모이어티, 콜린산, 티오에테르, 가령, 헥실-5-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄, 가령, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질 가령, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티와 같은 지질 모이어티를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 활성 약물 물질, 예를 들면, 아스피린, 와르파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카르프로펜, 단실사르코신, 2,3,5-트리요호드벤조산, 풀루페나민산, 폴린산, 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 술파 약물, 당뇨병치료제, 항균제 또는 항생제에 콘쥬게이트될 수도 있다.
이와 같은 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호; 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
제제( Formulations ): 본 발명의 화합물은 다른 분자들, 화합물의 분자 구조 또는 혼합물, 예를 들면, 리포좀, 수용체-표적화된 분자들, 흡수(uptake), 분포 및/또는 흡수를 지원하는 경구, 직장, 국소 또는 기타 제제와 혼합, 포집, 콘쥬게이트 또는 연합될 수 있다. 취입, 분포 및/또는 흡수-지원 제제를 만드는 방법을 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 미국 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 제5,459,127호; 제5,521,291호; 제5,543,165호; 제5,547,932호; 제5,583,020호; 제5,591,721호; 제4,426,330호; 제4,534,899호; 제5,013,556호; 제5,108,921호; 제5,213,804호; 제5,227,170호; 제5,264,221호; 제5,356,633호; 제5,395,619호; 제5,416,016호; 제5,417,978호; 제5,462,854호; 제5,469,854호; 제5,512,295호; 제5,527,528호; 제5,534,259호; 제5,543,152호; 제5,556,948호; 5,580,575호; 및 5,595,756호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
비록 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 발현 및/또는 기능을 조절하기 위하여 벡터로 투여할 필요는 없지만, 본 발명의 구체예는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 발현을 위한 발현 벡터 구조체에 관계하는데, 이 벡터 구조체는 프로모터, 하이브리드 프로모터 유전자 서열들을 포함하며, 그리고 강력한 구성 프로모터 활성 프로모터 활성 또는 원하는 경우 유도될 수 있는 프로모터 활성을 보유한다.
구체예에서, 본 발명은 적절한 핵산 운반 시스템과 함께 전술한 안티센스 올리고뉴클레오티드중 최소한 하나를 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 이 시스템은 폴리뉴클레오티드에 작용가능하도록 링크된 비-바이러스 벡터를 포함한다. 이와 같은 비-바이러스 벡터의 예는 올리고뉴클레오티드 만을 포함하거나(가령 서열 번호: 7 내지 31 중 임의의 하나 이상) 또는 적합한 단백질, 폴리사카라이드 또는 지질 제제와 복합된 것을 포함한다.
추가로 적합한 핵산 운반 시스템은 바이러스 벡터를 포함하는데, 일반적으로 아데노바이러스, 아데노바이러스-연합된 바이러스(AAV), 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 Japan-리포좀 (HVJ) 복합체의 헤마글루티닌 바이러스중 최소한 하나로부터 서열을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드에 작용가능하도록 링크된 강력한 진핵 프로모터 가령, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 포함한다.
추가적으로 바람직한 벡터는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 콘쥬게이트를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 및 HIV-계 바이러스를 포함한다. 한 가지 바람직한 HIV-계 바이러스 벡터는 최소한 두 개 벡터를 포함하는데, gag 및 pol 유전자는 HIV 게놈의 것이며, env 유전자는 또 다른 바이러스에서 유래된 것이다. DNA 바이러스 벡터가 바람직하다. 이들 벡터들은 오르소폭스(orthopox) 또는 아비폭스(avipox) 벡터와 같은 폭스 벡터, 허피스바이러스 벡터 예를 들면, 허피스 심플렉스 I 바이러스(HSV) 벡터, 아데노바이러스벡터 및 아데노-연합된 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명의 안티센스 화합물은 임의의 약리학적으로 수용가능한 염, 에스테르 또는 이와 같은 에스테르의 염, 또는 인간을 포함하는 동물에게 투여할 때 생물학적 활성 대사물질 또는 이의 잔기를 제공(직간접적으로)할 수 있는 임의의 다른 화합물을 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물의 생리학적 그리고 약제학적으로 허용가능한 염을 지칭하는데, 가령, 부모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하지만, 화합물에 바람직하지 못한 독성 효과를 부여하지 않는 염을 말한다. 올리고뉴클레오티드의 경우, 약제학적으로 허용가능한 염의 바람직한 예시 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에서 추가 설명되고 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다.
본 발명은 본 발명의 안티센스 화합물을 포함하는 약제 조성물 및 제제를 또한 포함한다. 본 발명의 약제 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지 그리고 치료될 부위에 따라 여러 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(눈, 질 및 직장 운반을 포함하는 점막 포함), 네블리라이즈를 포함하여 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 들여마시는 것을 통하여 폐; 기관내(intratracheal), 비강, 상피 또는 경피), 구강 또는 장관외가 될 수 있다. 장관외(Parenteral) 투여는 정맥, 동맥내, 피하, 복막 또는 근육 주사 또는 주입; 또는 두개내(intracranial), 가령, 수막강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다.
중추 신경계내 조직을 치료하기 위하여, 뇌척수액으로 주입 또는 주사를 통하여 투여할 수 있다. 안티센스 RNA의 뇌척수액으로의 투여는 가령, 전문이 참고문헌에 통합되어 있는 미국 특허 출원 공개 No. 2007/0117772, “Methods for slowing familial ALS disease progression,”에서 설명하고 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 중추신경계의 세포로 투여하고자 할 때, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 혈액-뇌 장벽의 통과를 촉진시킬 수 있는 하나 이상의 물질과 함께 투여할 수 있다. 가령, 내후각뇌피질 또는 해마로 주사할 수 있다. 근육 조직내 운동 뉴우런으로 아데노바이러스 벡터를 투여하여 신경영양성 인자들의 운반은 가령, 전문이 참고문헌에 통합되어 있는 미국 특허 제6,632,427호, “Adenoviral - vector - mediated gene transfer into medullary motor neurons,”에서 설명하고 있다. 뇌, 가령, 선조체(striatum), 시상(thalamus), 해마(hippocampus) 또는 흑질(substantia nigra)과 같은 뇌로 직접적으로 벡터의 운반은 당업계에 공지되어 있으며, 그리고 가령, 전문이 참고문헌에 통합되어 있는 미국 특허 제6,756,523호, “Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain”에서 설명하고 있다. 주사를 통하여 신속하게 투여할 수 있거나 또는 시간을 두고 서서히 주입 또는 지연 방출 제제의 투여를 통하여 이루어질 수 있다.
본 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 바람직한 약제 또는 약력학적 성질들을 제공하는 물질에 연결 또는 콘쥬게이트될 수 있다. 예를 들면, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 혈액-뇌 장벽의 침투를 촉진하는 또는 이를 통과하는 것으로 당업계에 공지되어 있는 임의의 물질, 가령, 트란스페린 수용체에 대한 항체에 결합시키고, 정맥 주사를 통하여 투여할 수 있다. 상기 안티센스 화합물은 안티센스 화합물을 더 효과적으로 만들거나 및/또는 혈액-뇌 장벽을 통한 안티센스 화합물의 운반을 증가시키는 바이러스 벡터에 연결시킬 수 있다. 삼투성 혈액-뇌 장벽 파괴는 메소 에리트리톨(meso erythritol), 크실리톨, D(+) 갈락토즈, D(+) 락토즈, D(+) 크실로오즈, 둘시톨, myo-이노시톨, L(-) 푸락토즈, D(-) 만니톨, D(+) 포도당, D(+) 아라비노즈, D(-) 아라비노즈, 셀로비오즈, D(+) 말토오즈, D(+) 라피노즈, L(+) 람노즈, D(+) 멜리비오즈, D(-) 리비오즈, 아도니톨, D(+) 아라비톨, L(-) 아라비톨, D(+) 퓨코스, L(-) 퓨코스, D(-) 릭소스, L(+) 릭소스, 및 L(-) 릭소스을 포함하나 이에 한정되지 않는 슈가의 주입, 또는 글루타민, 리신, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 티로신, 발린, 및 타우린을 포함하나 이에 한정되지 않는 아미노산을 주입하여 실행할 수 있다. 혈액-뇌 장벽 침투를 강화시키는 방법 및 재료들은 가령, 전문이 참고문헌에 통합되어 있는 U. S. 특허 제4,866,042호, “Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier,” 제6,294,520호, “Material for passage through the blood - brain barrier,” 그리고 제6,936,589호, “Parenteral delivery systems,”에서 설명하고 있다.
본 안티센스 화합물들은 기타 분자들, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 혼합, 포집, 콘쥬게이트 또는 연합될 수 있는데, 예를 들면, 취입, 분포 및/또는 흡수를 지원하기 위하여 리포좀, 수용체-표적화된 분자, 경구, 직장, 국소 또는 기타 제형이 될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 취입을 용이하게 하기 위하여 제형내에 양이온 지질을 포함시킬 수 있다. 취입을 용이하게 하는 것으로 나타난 이러한 조성물중 하나가 LIPOFECTIN (GIBCO-BRL, Bethesda, MD)이다.
최소한 하나의 2'-O-메톡시에틸 변형을 가진 올리고뉴클레오티드는 경구 투여용으로 특히 유용한다. 국소 투여를 위한 약제 조성물 및 제제는 경피 패취, 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌약, 스프레이, 액상 및 분말을 포함한다. 통상적인 약리학적으로 캐리어, 수용성, 분말 또는 오일 베이스, 농후제 그리고 이와 유사한 것이 필수적이거나 바람직할 수 있다. 피복된 콘돔, 장갑 그리고 이와 유사한 것이 유용할 수 있다.
본 발명의 약제 제제는 통상적으로 단위 약형으로 제공될 수 있는데, 이는 약학 산업분야에 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 이와 같은 기술은 활성 성분들을 약학적 캐리어 또는 부형제와 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분들을 액상 캐리어 또는 미세하게 분할된 캐리어 또는 이들 모두와 연합되도록 하고, 그 다음 필요에 따라 산물의 모양을 만들어 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌약 및 관장제를 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 가능한 약형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물은 액상, 비-액상 또는 혼합형 매질에 현탁액으로 조제될 수 있다. 수용성 현탁액은 카르복시메틸셀룰로오즈, 솔비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점성을 증가시키는 물질을 더 포함할 수 있다. 현탁액은 안정화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제 조성물은 용액, 에멸젼, 리포좀-함유 제제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 약제 조성물 및 제제는 하나 이상의 침투 강화제, 캐리어, 부형제 또는 기타 활성 또는 비활성 성분을 포함할 수 있다.
에멸젼은 일반적으로 액체에 0.1㎛를 초과하는 방울의 형태로 분산된 또 다른 액체로 구성된 이종(heterogeneous) 시스템이다. 에멸젼은 분산된 상에 추가하여 추가 성분, 그리고 수용성 상, 오일상의 용액으로 존재하는 또는 별도 상 자체로 존재하는 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예로 마이크로에멸젼이 포함된다. 에멸젼 및 이의 용도는 당분야에 공지되어 있으며, 미국 특허 제6,287,860호에서 추가 설명된다.
본 발명의 제제는 리포좀 제제를 포함한다. 본 발명에 이용된 것과 같이, 용어 "리포좀"은 구형 이중층 또는 이중층에 배열된 양쪽성 지질로 구성된 소포를 말한다. 리포좀은 단층라멜라 또는 다층라멜라로 친지성 물질로 형성된 막과 운반될 조성물을 포함하는 수용성 내부를 가진다. 양이온성 리포좀은 안정한 복합체를 형성하기 위하여 음전하를 띈 DNA 분자들과 상호작용하는 것으로 보이는 양전하를 띈 리포좀이다. pH-민감성 또는 음전하를 띈 리포좀은 복합체를 형성하기 보다는 DNA를 포집하는 것으로 본다. 양이온성 및 비-양이온성 리포좀은 세포로 DNA을 운반하는데 이용된다.
리포좀은 또한 “공간적으로 안정화된” 리포좀을 포함하는데, 여기에서 사용된 이 용어는 하나 이상의 특화된 지질을 포함하는 리포좀을 말한다. 리포좀에 통합되었을 때, 이와 같은 특화된 지질은 이와 같은 특화된 지질이 없는 리포좀과 비교하였을 때 순환 반감기가 강화된 리포좀을 만든다. 공간적으로 안정화된 리포좀의 예는 리포좀의 소포-형성된 지질 부분이 하나 이상의 글리코리피드를 포함하거나 또는 하나 이상의 친지성 폴리머, 가령, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티로 유도화된 것들이다. 리포좀 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에서 설명되고 있다.
본 발명의 제약 제제 및 조성물은 계면활성제 또한 포함할 수 있다. 약물, 제제 및 에멸젼에서 계면활성제의 이용은 당분야에 잘 공지되어 있다. 계면활성제 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에서 추가 설명되고 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다.
한 구체예에서, 본 발명은 핵산, 특히 올리고뉴클레오티드의 효과적인 운반을 위하여 다양한 침투 강화제를 이용한다. 세포 막을 가로질러 비-친지성 약물의 융합을 지원하는 것에 추가하여, 침투 강화제는 또한 친지성 약물의 침투성을 강화시킨다. 침투 강화제는 계면활성제, 지방산, 담즙산, 킬레이트제 그리고 비-킬레이트 비-계면활성제로 된 5가지 넓은 범주중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다. 침투 강화제 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에서 추가 설명되고 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다.
당업자는 제제는 투여 경로와 같은 이들의 의도된 용도에 따라 통상적으로 기획된다는 것을 인지할 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드와 국소 운반제가 혼합된 국소 투여용 제제가 포함되는데, 국소 운반제는 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 및 계면활성제등이 된다. 지질 및 리포좀은 중성(가령, 디올레일-포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성(가령, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온(가령, 디올레일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레일-포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다.
국소 또는 기타 투여용으로, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 리포좀내에 포집되거나 양이온 리포좀에 복합체를 형성할 수 있다. 대안으로, 올리고뉴클레오티드는 지질, 특히, 양이온 지질에 복합될 수 있다. 지방산 및 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 그리고 이들의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에서 추가 설명되어 있다.
경구 투여용 조성물 및 제제는 분말 또는 과립, 미립자, 나노입자, 물 또는 비-수용성 매질에서의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사셋, 태블릿 또는 미니테블릿을 포함한다. 농후제, 향료, 희석제, 에멸젼화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 경구 제제는 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 침투 강화제, 계면활성제 및 킬레이터와 함께 투여되는 것들이다. 계면활성제는 지방산 및/또는 이의 에스테르 또는 염, 담즙산 및/또는 이의 염을 포함한다. 담즙산/염 그리고 지방산 및 이의 용도들은 미국 특허 제 6,287,860호에서 추가 설명되고 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다. 침투 강화제, 예를 들면, 지방산/염과 담즙산/염의 복합 또한 바람직하다. 특히 조합은 라우르산, 카프리산 및 UDCA의 나트륨염이다. 추가 침투 강화제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 분무된 건조 과립을 포함하는 과립형으로 경구로 운반될 수 있고, 또는 미립자 또는 나노입자를 형성하기 위하여 복합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 복합제 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 추가 설명되어 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다. 간섭 RNAs의 생체내 투여는 “RNAi modulation of ApoB and uses thereof”의 제목의 미국 특허 제7,528,118호에서 설명되어 있으며, 이특허는 전문이 참고문헌에 통합된다.
장관외, 기관내 또는 심실내 투여를 위한 조성물 및 제제는 완충액, 희석액 및 침투 강화제, 캐리어 화합물 및 기타 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함하나 이에 한정되지 않는 기타 적합한 첨가제를 포함하는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예는 하나 이상의 올리고머 화합물 및 비-안티센스 기전에 의해 기능을 하는 하나 이상의 다른 치료제를 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 이와같은 화학요법제의 예로는 다우노루비신, 다우노마이신, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 에소루비신, 블레오마이신, 마포스파미드, 이포스파미드, 시토신 아라비노시드, 비스클로로에틸-니트로조우레아, 부술판, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 프레드니손, 하이드록시프로게스테론, 테스토스테론, 탐옥시펜, 다카르바진, 프로카르바진, 헥사메틸멜라민, 펜타메틸멜라민, 미토산트론, 암사크린, 클로람부칠, 메틸사이클로헥실니트로조우레아, 질소 무스타드, 멜파란, 사이클로포스파미드, 6-멀캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-아자시티딘, 하이드록시우레아, 데옥시코포르미신, 4-하이드록시퍼옥시사이클로-포스포라미드, 5-플루오르우라실 (5-FU), 5-플루오르데옥시우리딘(5-FUdR), 메토트렉세이트(MTX), 콜치신, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드(VP-16), 트리메트레세이트, 이리노테칸, 포토테칸, 겜시타빈, 테니포시드, 시스플라틴 및 디에틸스틸베스트롤(DES)과 같은 암 화학치료 약물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 화합물과 함께 이용되면, 이와 같은 화학요법제는 개별적으로 (가령, 5-FU 및 올리고뉴클레오티드), 연속적으로(가령, 일정 시간동안 5-FU 및 올리고뉴클레오티드, 그 다음 MTX 및 올리고뉴클레오티드), 또는 하나 이상의 다른 화학요법제(가령, 5-FU, MTX 및 올리고뉴클레오티드, 또는 5-FU, 방사능요법 및 올리고뉴클레오티드)와 병용하여 이용될 수 있다. 비-스테로이드성 소염제를 포함하나 이에 한정되지 않는 소염제 약물 그리고 코르티코스테로이드, 항바이러스 약물(리비비린, 비다라빈, 아시클로비르 및 강시클로비르를 포함하나 이에 한정되지 않는)이 본 발명의 조성물에 복합될 수 있다. 안티센스 화합물 및 다른 비-안티센스 약물의 복합 또한 본 발명의 범위안에 있다. 두 개 이상의 복합 화합물이 함께 또는 연속적으로 이용될 수 있다.
다른 관련된 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 안티센스 화합물, 특히 제1핵산을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드 그리고 제 2 핵산 표적을 표적으로 하는 하나 이상의 추가 안티센스 화합물을 포함한다. 예를 들면, 제1 표적은 아디포넥틴(ADIPOQ)의 특정 안티센스 서열이 되며, 그리고 제 2 표적은 또 다른 뉴클레오티드 서열의 구역이 될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 조성물은 동일한 아디포넥틴(ADIPOQ)핵산 표적의 상이한 구역을 표적으로 하는 두 개이상의 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 다양한 안티센스 화합물의 예들이 여기에서 설명되며, 기타 화합물들은 당분야에 공지된 적합한 화합물들 중에서 선택될 수 있다. 두 개 이상의 복합 화합물이 함께 또는 연속적으로 이용될 수 있다.
약액주입 ( Dosing ) :
치료 조성물의 제제 및 이의 후속적인 투여(약액주입)은 당분야의 기술에 속한다. 약액주입은 수 일 내지 수개월 지속되는 치료 과정, 또는 치료 효과 또는 질병 상태의 감소가 수득되는 날까지의 치료 과정과 함께 치료될 질병 상태의 중증도, 반응성에 따라 달라진다. 최적의 약액주입 일정은 환자의 신체에 약물 축적 측량으로부터 계산될 수 있다. 당업자는 최적의 주입량, 방법 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다. 최적의 약량은 개별 올리고뉴클레오티드의 상대적 효능에 따라 다양해질 수 있으며, 그리고 일반적으로 시험관 및 생체내 동물 모델에서 효과가 발견되는 EC50에 근거하여 예측된다. 일반적으로, 투약량은 체중 kg당 0.01㎍ 내지 100 g이 되며, 매일, 주단위, 월단위 또는 년단위로 한번 또는 2년마다 내지 20년마다 한번씩 제공될 수 있다. 당업자는 측정된 잔류 시간 및 체액 또는 조직에서 약물의 농도에 근거하여 약액주입에 대한 반복률을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 성공적인 처치후, 질병 상태의 재발을 방지하기 위하여 환자가 유지요법을 받도록 하는 것이 바람직하며, 이때 올리고뉴클레오티드는 체중 kg당 0.01 ㎍ 내지 100 g 범위의 유지 약량으로, 하루에 1회 이상 내지 매 20년마다 1회로 투여된다.
구체예들에서, 환자는 최소한 약 1㎎/㎏(체중), 최소한 약 2㎎/㎏, 최소한 약 3㎎/㎏, 최소한 약 4㎎/㎏, 최소한 약 5㎎/㎏, 최소한 약 6㎎/㎏, 최소한 약 7㎎/㎏, 최소한 약 8㎎/㎏, 최소한 약 9㎎/㎏, 최소한 약 10㎎/㎏, 최소한 약 15㎎/㎏, 최소한 약 20㎎/㎏, 최소한 약 25㎎/㎏, 최소한 약 30㎎/㎏, 최소한 약 35㎎/㎏, 최소한 약 40㎎/㎏, 최소한 약 45㎎/㎏, 최소한 약 50㎎/㎏, 최소한 약 60㎎/㎏, 최소한 약 70㎎/㎏, 최소한 약 80㎎/㎏, 최소한 약 90㎎/㎏, 또는 최소한 약 100 ㎎/㎏의 약물 투여량으로 치료된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 특정 주사 투여량은 가령, 전문이 참고문헌에 통합되어 있는 미국 특허 제7,563,884호, “Antisense modulation of PTP1B expression”에서 설명하고 있다.
본 발명의 다양한 구체예들이 상기에서 설명되었는데, 이는 예를 든 것이며, 이에 한정되지 않음을 인지해야 한다. 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고, 본 발명의 내용에 따라 설명된 구체예에 대해 여러 변화가 만들어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 설명된 임의의 구체예에 한정되어서는 안된다.
여기에서 언급된 모든 문헌들은 참고문헌에 통합된다. 본 출원에서 언급된 모든 공고 및 특허 문헌은 각 공개 또는 특허 문헌이 개별적으로 언급된 것과 같은 수준으로 모든 목적을 위하여 참고문헌에 통합된다. 본 서류에 다양한 참고문헌에서, 출원인은 이들을 본 발명의 “선행 기술”로 인정하지 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법의 구체예는 다음의 실시예에서 설명된다.
실시예
다음의 비-제한적 실시예는 본 발명의 선택된 구체예들을 설명하는 것이다. 나타낸 성분들에서 비율의 변화 및 대체 성분은 당업자에 자명하며, 본 발명의 구체예의 범위내에 있다.
실시예 1:
아디포넥틴(ADIPOQ)에 대한 핵산 분자 안티센스 및/또는 아디포넥틴 ( ADIPOQ ) 폴리뉴클레오티드의 센스 가닥에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 기획
상기에서 명시된 것과 같이, 용어 "~특이적인 올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드 표적"은 (i) 표적 유전자의 부분과 안정적인 복합체를 형성할 수 있는, 또는 (ii) 표적 유전자의 mRNA 전사체의 일부분과 안정적인 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 말한다.
적절한 올리고뉴클레오티드의 선택은 핵산 서열들을 자동으로 배열하고, 동일 또는 동사체 구역을 표시하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 실시한다. 이와 같은 프로그램을 이용하여 GenBank와 같은 데이터베이스를 조사하거나 또는 PCR 산물들을 서열화하여 수득된 핵산 서열들을 비교한다. 특정 종 범위로부터 핵산 서열을 비교하면, 종간에 적절한 동일성 수준을 나타내는 핵산을 선택할 수 있다. 유전자가 서열화안된 경우, 서든 블랏을 실시하여 표적 종과 다른 종의 유전자 사이에 동일성 수준을 결정한다. 다양한 엄격성 수준에서 서든 블랏을 실시함으로써, 당분야에 공지된 바와 같이, 적절한 동일성 수준을 얻을 수 있다. 이 과정에 의해 조절되어야 할 개체에서 표적 핵산 서열에 대해서는 높은 수준의 상보성을 나타내고, 그리고 다른 종의 대응하는 핵산 서열들에 대해서는 낮은 수준의 상보성을 나타내는 올리고뉴클레오티드의 선택이 허용된다. 당업자는 본 발명에 사용하기 위한 유전자의 적절한 구역을 선택하는 것에 상당한 허용범위가 있다는 것을 인지할 것이다.
안티센스 화합물은 표적 핵산에 화합물이 결합하여, 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여 기능 및/또는 활성이 조절되어 “특이적으로 하이브리드가능하며”, 그리고 특이적 결합이 바람직한 조건들, 가령, 생체 분석 또는 치료요법적 처치의 경우 생리학적 조건, 또는 분석이 시험관 분석으로 실행되는 경우의 조건하에서 비-표적 핵산 서열에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피할 수 있도록 충분한 수준의 상보성이 있다.
여기에서 설명된 올리고뉴클레오티드의 혼성화 성질은 당분야에 공지된 하나 이상의 시험관 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 여기에서 설명된 올리고뉴클레오티드의 성질은 용융 곡선 분석(Melting curve assay)을 이용하여 표적 천연 안티센스와 잠재적인 약물 분자들 사이에 결합 강도를 측정함으로써 수득될 수 있다.
표적 천연 안티센스와 잠재적인 약물 분자(Molecule) 사이에 결합 강도는 예를 들면, 용융 곡선 분석과 같은 분자간 상호작용의 강도를 측정하는 확립된 방법중 임의의 것을 이용하여 예측될 수 있다.
용융 곡선 분석은 천연 안티센스/분자 복합체에서 이중 가닥으로부터 단일 가닥 형태로 신속하게 전이가 일어나는 온도를 결정한다. 이 온도는 두 개 분자 사이에 상호작용 강도의 신뢰성있는 척도로 광범위하게 인정된다.
용융 곡선 분석은 실제 천연 안티센스 RNA 분자 또는 분자의 결합 부위에 상응하는 합성 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드의 cDNA 복사체를 이용하여 실시된다. 이 분석을 실행하기 위하여 모든 필수 시약을 포함하는 다중 키트를 이용한다(가령 Applied Biosystems Inc . MeltDoctor kit). 이들 키트들은 이중 가닥 DNA (dsDNA) 결합 염료 (가령, ABI HRM 염료, SYBR Green, SYTO, 등) 중 하나를 포함하는 적절한 완충액을 포함한다. dsDNA 염료의 성질은 이들이 자유형에서는 형광을 방출하지 않지만, dsDNA에 결합되면 상당한 형광성이라는 것이다.
이 분석을 실행하기 위하여, cDNA 또는 대응하는 올리고뉴클레오티드를 특정 제조업자의 프로토콜에 명시된 농도에서 분자와 혼합시킨다. 혼합물을 95℃로 가열시켜, 모든 미리-형성된 dsDNA 복합체를 해리시키고, 그 다음 실온으로 서서히 냉각시키거나 또는 키트 제조업자가 정한 다른 낮은 온도로 냉각시켜, DNA 분자들이 어닐(anneal)되도록 한다. 새로 형성된 복합체를 다시 95℃ 가열시키고, 반응에 의해 생성된 형광물질의 양에 대한 데이터를 동시에 수집한다. 형광 강도는 반응에 존재하는 dsDNA의 양에 역비례한다. 키트에 사용가능한 실시간 PCR 장비(가령 ABI’s StepOne Plus 실시간 PCR 시스템 또는 LightTyper instrument, Roche Diagnostics, Lewes, UK)를 이용하여 데이터를 수거할 수 있다.
적합한 소프트웨어(예를 들면, LightTyper (Roche) 또는 SDS Dissociation Curve, ABI)를 이용하여 온도(x-축)에 대해 온도에 따른 형광물질의 네가티브 유도체를 플롯팅하여(y축상에 -d(Fluorescence)/dT) 용융 피크를 만든다. dsDNA 복합체에서 단일 가닥 분자들로의 신속한 전이 온도를 확인하기 위하여 데이터를 분석한다. 이 온도를 Tm 이라고 하며, 두 분자간의 상호작용 강도에 직접적으로 비례한다. 일반적으로, Tm은 40℃를 넘을 것이다.
실시예 2: 아디포넥틴 ( ADIPOQ ) 폴리뉴클레오티드의 조절
HepG2 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리
ATCC (cat# HB-8065)의 HepG2 세포를 37℃, 5% CO2에서 성장 배지(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI)에서 성장시켰다. 실험 하루전, 세포는 1.5× 105/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 당일, 6개 웰 플레이트에 있는 배지는 새로운 성장배지로 대체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 이 용액 2㎕를 400㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4㎕의 리포펙타민 2000 (Invitrogen cat# 11668019)와 실온에서 20분간 항온처리하고, HepG2 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-18시간 동안 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 48시간 후, 배지를 제거하였고, SV Total RNA Isolation System(Promega (cat # Z3105) 또는 RNeasy Total RNA Isolation Kit(Qiagen (cat# 74181)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B) 또는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(cat# 4368813)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs02564413_s1 및 Hs01047563_m1 Appliend Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)를 이용하여 50℃ 2분, 95℃ 10분, [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회. 처리된 샘플과 허위로 처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
결과 :
실시간 PCR 결과에서, ADIPOQ 안티센스 AA515150에 대해 기획된 올리고중 1개, BC036509에 대해 기획된 올리고중 1개로 처리한 후 48시간 시점에서 HepG2 세포에서 ADIPOQ mRNA 수준은 상당히 증가한다는 것을 보여준다(도 1).
실시간 PCR 결과에서, ADIPOQ 안티센스 AA515150에 대해 기획된 올리고중 2개(CUR-1107 및 1108), BC036509(CUR-1110)에 대해 기획된 올리고중 1개로 처리한 후 48시간 시점에서 HepG2 세포에서 ADIPOQ mRNA 수준은 상당히 증가한다는 것을 보여준다(도 2).
실시간 PCR 결과에서, ADIPOQ 안티센스 AA515150에 대해 기획된 2개 올리고로 처리한 후 48시간 시점에서 HepG2 세포에서 ADIPOQ mRNA 수준은 상당히 증가한다는 것을 보여준다(도 4).
실시간 PCR 결과에서, ADIPOR2 안티센스 Skerblarbu.aApr ADIPOR2에 대해 올리고중 1개로 처리한 후 48시간 시점에서 HepG2 세포에서 ADIPOQ mRNA 수준은 상당히 증가한다는 것을 보여준다(도 4). LOC729097 (CUR-1078-CUR-1081)에 대해 올리고는 ADIPOR2 발현을 증가시키지 못하였다(도 5).
Vero76 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리:
ATCC (cat# CRL-1587)의 Vero76 세포를 37℃, 5% CO2에서 성장 배지(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI)에서 성장시켰다. 실험 하루전, 세포는 1.5× 105/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 당일, 6개 웰 플레이트에 있는 배지는 새로운 성장배지로 대체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 이 용액 2㎕를 400㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4㎕의 리포펙타민 2000 (Invitrogen cat# 11668019)와 실온에서 20분간 항온처리하고, Vero76 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-18시간 동안 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 48시간 후, 배지를 제거하였고, SV Total RNA Isolation System(Promega (cat # Z3105) 또는 RNeasy Total RNA Isolation Kit(Qiagen (cat# 74181)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B) 또는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(cat# 4368813)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs02564413_s1 및 Hs01047563_m1 Appliend Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)를 이용하여 50℃ 2분, 95℃ 10분, [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회. 처리된 샘플과 허위로 처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
결과 : 실시간 PCR 결과에서, ADIPOQ 안티센스 AA515150에 대해 기획된 1개 올리고(CUR-1107), BC036509에 대해 기획된 1개 올리고(CUR-1110)로 처리한 후 48시간 시점에서 Vero세포에서 ADIPOQ mRNA 수준은 상당히 증가한다는 것을 보여준다(도 3).
SEQUENCE LISTING <110> CuRNA, Inc. <120> TREATMENT OF ADIPONECTIN (ADIPOQ) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO AN ADIPONECTIN (ADIPOQ) <130> ADIPOQ <150> US61/232,917 <151> 2009-08-11 <150> US61/253,187 <151> 2009-10-20 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4578 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> NM_004797 <309> 2010-08-08 <313> (1)..(4578) <400> 1 aggctgttga ggctgggcca tctcctcctc acttccattc tgactgcagt ctgtggttct 60 gattccatac cagaggggct caggatgctg ttgctgggag ctgttctact gctattagct 120 ctgcccggtc atgaccagga aaccacgact caagggcccg gagtcctgct tcccctgccc 180 aagggggcct gcacaggttg gatggcgggc atcccagggc atccgggcca taatggggcc 240 ccaggccgtg atggcagaga tggcacccct ggtgagaagg gtgagaaagg agatccaggt 300 cttattggtc ctaagggaga catcggtgaa accggagtac ccggggctga aggtccccga 360 ggctttccgg gaatccaagg caggaaagga gaacctggag aaggtgccta tgtataccgc 420 tcagcattca gtgtgggatt ggagacttac gttactatcc ccaacatgcc cattcgcttt 480 accaagatct tctacaatca gcaaaaccac tatgatggct ccactggtaa attccactgc 540 aacattcctg ggctgtacta ctttgcctac cacatcacag tctatatgaa ggatgtgaag 600 gtcagcctct tcaagaagga caaggctatg ctcttcacct atgatcagta ccaggaaaat 660 aatgtggacc aggcctccgg ctctgtgctc ctgcatctgg aggtgggcga ccaagtctgg 720 ctccaggtgt atggggaagg agagcgtaat ggactctatg ctgataatga caatgactcc 780 accttcacag gctttcttct ctaccatgac accaactgat caccactaac tcagagcctc 840 ctccaggcca aacagcccca aagtcaatta aaggctttca gtacggttag gaagttgatt 900 attatttagt tggaggcctt tagatattat tcattcattt actcattcat ttattcattc 960 attcatcgag taactttaaa aaaatcatat gctatgttcc cagtcctggg gagcttcaca 1020 aacatgacca gataactgac tagaaagaag tagttgacag tgctattttg tgcccactgt 1080 ctctcctgat gctcatatca atcctataag gcacagggaa caagcattct cctgttttta 1140 cagattgtat cctgaggctg agagagttaa gtgaatgtct aaggtcacac agtattaagt 1200 gacagtgcta gaaatcaaac ccagagctgt ggactttgtt cactagactg tgccctttta 1260 tagaggtaca tgttctcttt ggagtgttgg taggtgtctg tttcccacct cacctgagag 1320 ccattgaatt tgccttcctc atgaattaaa acctccccca agcagagctt cctcagagaa 1380 agtggttcta tgatgacgtc ctgtcttgga aggactacta ctcaatggcc cctgcactac 1440 tctacttcct cttacctatg tcccttctca tgcctttccc tccaacgggg aaagccaact 1500 ccatctctaa gtgccgaact catccctgtt cctcaaggcc acctggccag gagcttctct 1560 gatgtgatat ccactttttt tttttttgag atggagtctc actctgtcac ccaggctgga 1620 gtacagtgac acgacctcgg ctcactgcag cctccttctc ctgggtccaa gcaattattg 1680 tgcctcagcc tcccgagtag ctgagacttc aggtgcattc caccacacat ggctaatttt 1740 tgtattttta gtagaaatgg ggtttcgtca tgttggccag gctggtctcg aactcctggc 1800 ctaggtgatc cacccgcctc gacctcccaa agtgctggga ttacaggcat gagccaccat 1860 gcccagtcga tatctcactt tttattttgc catggatgag agtcctgggt gtgaggaaca 1920 cctcccacca ggctagaggc aactgcccag gaaggactgt gcttccgtca cctctaaatc 1980 ccttgcagat ccttgataaa tgcctcatga agaccaatct cttgaatccc atatctaccc 2040 agaattaact ccattccagt ctctgcatgt aatcagtttt atccacagaa acattttcat 2100 tttaggaaat ccctggtttt aagtatcaat ccttgttcag ctggacaata tgaatctttt 2160 ccactgaagt tagggatgac tgtgattttc agaacacgtc cagaattttt catcaagaag 2220 gtagcttgag cctgaaatgc aaaacccatg gaggaattct gaagccattg tctccttgag 2280 taccaacagg gtcagggaag actgggcctc ctgaatttat tattgttctt taagaattac 2340 aggttgaggt agttgatggt ggtaaacatt ctctcaggag acaataactc cagtgatgtt 2400 cttcaaagat tttagcaaaa acagagtaaa tagcattctc tatcaatata taaatttaaa 2460 aaactatctt tttgcttaca gttttaaatt ctgaacaatt ctctcttata tgtgtattgc 2520 taatcattaa ggtattattt tttccacata taaagctttg tctttttgtt gttgttgttg 2580 tttttaagat ggagtttccc tctgttgcca ggctagagtg cagtggcatg atctcggctt 2640 actgcaacct ttgcctccca ggttcaagcg attcttctgc ctcagcctcc cgagtagctg 2700 ggaccacagg tgcctaccac catgccaggc taatttttgt atttttagta aagacagggt 2760 ttcaccatat tggccaggct ggtctcgaac tcctgacctt gtgatctgcc cgcctccatt 2820 tttgttgtta ttttttgaga aagatagata tgaggtttag agagggatga agaggtgaga 2880 gtaagccttg tgttagtcag aactctgtgt tgtgaatgtc attcacaaca gaaaacccaa 2940 aatattatgc aaactactgt aagcaagaaa aataaaggaa aaatggaaac atttattcct 3000 ttgcataata gaaattacca gagttgttct gtctttagat aaggtttgaa ccaaagctca 3060 aaacaatcaa gacccttttc tgtatgtcct tctgttctgc cttccgcagt gtaggcttta 3120 ccctcaggtg ctacacagta tagttctagg gtttccctcc cgatatcaaa aagactgtgg 3180 cctgcccagc tctcgtatcc ccaagccaca ccatctggct aaatggacat catgttttct 3240 ggtgatgccc aaagaggaga gaggaagctc tctttcccag atgccccagc aagtgtaacc 3300 ttgcatctca ttgctctggc tgagttgtgt gcctgtttct gaccaatcac tgagtcagga 3360 ggatgaaata ttcatattga cttaattgca gcttaagtta ggggtatgta gaggtatttt 3420 ccctaaagca aaattgggac actgttatca gaaataggag agtggatgat agatgcaaaa 3480 taatacctgt ccacaacaaa ctcttaatgc tgtgtttgag ctttcatgag tttcccagag 3540 agacatagct ggaaaattcc tattgatttt ctctaaaatt tcaacaagta gctaaagtct 3600 ggctatgctc acagtctcac atctggttgg ggtgggctcc ttacagaaca cgctttcaca 3660 gttaccctaa actctctggg gcagggttat tcctttgtgg aaccagaggc acagagagag 3720 tcaactgagg ccaaaagagg cctgagagaa actgaggtca agatttcagg attaatggtc 3780 ctgtgatgct ttgaagtaca attgtggatt tgtccaattc tctttagttc tgtcagcttt 3840 tgcttcatat attttagcgc tctattatta gatatataca tgtttagtat tatgtcttat 3900 tggtgcattt actctcttat cattatgtaa tgtccttctt tatctgtgat aattttctgt 3960 gttctgaagt ctactttgtc taaaaataac atacgcactc aacttccttt tctttcttcc 4020 ttcctttctt tcttccttcc tttctttctc tctctctctc tttccttcct tccttcctcc 4080 ttttctttct ctctctctct ctctctcttt ttttgacaga ctctcgttct gtggccctgg 4140 ctggagttca gtggtgtgat cttggctcac tgctacctct accatgagca attctcctgc 4200 ctcagcctcc caagtagctg gaactacagg ctcatgccac tgcgcccagc taatttttgt 4260 atttttcgta gagacggggt ttcaccacat tcgtcaggtt ggtttcaaac tcctgacttt 4320 gtgatccacc cgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggcatgagc catcacacct 4380 ggtcaacttt cttttgatta gtgtttttgt ggtatatctt tttccatcat gttactttaa 4440 atatatctat attattgtat ttaaaatgtg tttcttacag actgcatgta gttgggtata 4500 atttttatcc agtctaaaaa tatctgtctt ttaattggtg tttagacaat ttatatttaa 4560 taaaattgtt gaatttaa 4578 <210> 2 <211> 3982 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> NM_024551 <309> 2010-08-02 <313> (1)..(3982) <400> 2 cgcggcggcg gcagcggcgg cggctacacc gggcttggcc ccctccctcc tccgttcccc 60 cctcctcccc cctcccctca gcggtggctc ccaagaagtc cgagacacgc ggatcaactc 120 actatcctga aggtccattc tcccaagaag aggggacaga aagacagatc tatttgtaag 180 aaaggcttgg gtatcccatg aacgagccaa cagaaaaccg attggggtgc agcaggactc 240 cagagccaga tataaggctc agaaaagggc accaactgga tggtacacga agaggtgata 300 atgacagcca ccaaggagat ttggagccca ttttagaggc atctgttcta tcttcccatc 360 ataaaaaaag ctctgaggaa catgaataca gtgatgaagc tcctcaggaa gatgagggct 420 ttatgggcat gtcccctctc ttacaagccc atcatgctat ggaaaaaatg gaagaatttg 480 tttgtaaggt atgggaaggt cggtggcgag tgatccctca tgatgtacta ccagactggc 540 tcaaggataa tgacttcctc ttgcatggac accggcctcc tatgccttct ttccgggcct 600 gttttaagag cattttcaga atacacacag aaacaggcaa catttggaca catctcttag 660 gttgtgtatt cttcctgtgc ctggggatct tttatatgtt tcgcccaaat atctcctttg 720 tggcccctct gcaagagaag gtggtctttg gattattttt cttaggagcc attctctgcc 780 tttctttttc atggctcttc cacacagtct actgccactc agagggggtc tctcggctct 840 tctctaaact ggattactct ggtattgctc ttctgattat gggaagtttt gttccttggc 900 tttattattc tttctactgt aatccacaac cttgcttcat ctacttgatt gtcatctgtg 960 tgctgggcat tgcagccatt atagtctccc agtgggacat gtttgccacc cctcagtatc 1020 ggggagtaag agcaggagtg tttttgggcc taggcctgag tggaatcatt cctaccttgc 1080 actatgtcat ctcggagggg ttccttaagg ccgccaccat agggcagata ggctggttga 1140 tgctgatggc cagcctctac atcacaggag ctgccctgta tgctgcccgg atccccgaac 1200 gctttttccc tggcaaatgt gacatctggt ttcactctca tcagctgttt catatctttg 1260 tggttgctgg agcttttgtt cacttccatg gtgtctcaaa cctccaggag tttcgtttca 1320 tgatcggcgg gggctgcagt gaagaggatg cactgtgata cctaccagtc tccagggact 1380 atgaccctaa accagggcct gcggcacttg cgggcctccc tgctggctac tgatgccagt 1440 accagaggag ccccaaaact ttgacagcct cgtgggcttt gtgacggccc aggggctctg 1500 cgtggtacat gactgagaag agaaaaacaa aaataaatca tacctcaaag gatggagtgc 1560 atcaattggg agaaaaggag acatagccca aaccctggct tattcttggg atctactgat 1620 tgcgggctct gcaagaccct tggcaaactg gcttctgatc catatcatat ttatttgtag 1680 aagatggcga aacagtttag ctggtggttc tttcttctcc ctttctctct ctctatgaca 1740 ataatacaaa ccaatttaag tgaacattta tatccgataa ggggtgggag tgtgatttta 1800 aatgctcttt tgggagaaca aagaaattaa tgtaaataag atttctaact gtttaaataa 1860 gactttatat aaatgtttaa aacatagggg taagggaggg agggagaatt tttgtataga 1920 atgaaacatg caagtaccac acactgtttg aattttgcac aaaaagtgac tgtaggatca 1980 ggtgatagcc ccggaatgta cagtgtcttg gtgcaccaag atgccttcta aaggctgaca 2040 taccttggac cctaatgggg cagagagtat agccctagcc cagtggtgac atgaccactc 2100 cctttgggag gcctgaggta gaggggagtg gtatgtgttt tctcagtgga agcagcacat 2160 gagtgggtga caggatgtta gataaaggct ctagttaggg tgtcattgtc atttgagaga 2220 ctgacacact cctagcagct ggtaaagggg tgctggaggc catggaggag ctctagaaac 2280 attagcatgg gctgatctga ttacttcctg gcatcccgct cacttttatg ggaagtctta 2340 ttagagggat gggacagttt tccatatcct tgctgtggag ctctggaaca ctctctaaat 2400 ttccctctat taaaaatcac tgccctaact acacttcctc cttgagggaa tagaaatgga 2460 cctttctctg acatagttct tggcatggga gccagccaca aatgagattc tgacgtgtcc 2520 aggtttctcc tgagctcatc tacatagatt ggtagaccct tcctttggat taggaaagat 2580 gagttttacc tctggtacac tgtcttggta agcctggatg tgacagacac ctcggctctc 2640 cttgaataag aaagccagca gaactcttaa agccagttgt agtacggagt tgtcagcact 2700 cactgaacct cactttacag ggataagagt ggtgtggcat tttaaataca atggtatgtt 2760 attgccaggg agtgaggtac aagacgatgg ctcatgtcac aggcctacct gatacggtgt 2820 cagagaaagt ggtggggaaa ggatctggtt catggaattc tgatcttggc ccataggtga 2880 accaccaaaa tagtgctcga gtcttaggtt actgtcatca aagacttggg atgactccat 2940 tatatcctgg ggttgtgggt attagaacta aatatggagg tcctgagcat ggggactggc 3000 gtcctcagta ggtgtttggg aatatgggaa gggtctccta tttattcaat agagttttct 3060 cagttatttt cctcccttgc ccttgcaatc tccagcaaaa ggtgggatct aggaagaaag 3120 aatccagtgt agaagttgag aagaacttga acgttttggt tctggataag gtcactgtcc 3180 taggtgctag gtggaccgag caaaagactc agtggatgaa ctggtgcagt gcctgacaga 3240 ataaagaaca gtattaatcc ctttgagaaa gcatagtcca gcaggacagt ggccatttgg 3300 acagaagccc acttagtttc ttgggagcaa cagcacgtat cagaagccag acttgctctt 3360 cggtcatgca ctttgggata cagcgtatag gtgcagccct gtcacaacac caacagaagt 3420 agcagcctct gggtgcagtc acccacaccc caaagctgga aggatctggt tcaacatagc 3480 acaaaccctt aggaaaaatg aaattaacat cactgatgtg taatccagta aaatctccct 3540 ttttcgggtg tgtatgtggg catgtgccca tttctatgtg tgtgtctacg tgcagctcac 3600 taccaacagc ctcatgtgca cttgacctga cagtgctcgc tgagaactct caccaggttg 3660 gcgcctgaat gccttactct cagcagtcag aggcttgctt gctctgtgca gatttttaat 3720 tttctttttt ggccctaggc tggttgggac ctctacagct tcattctttc accattaaat 3780 agtggccttt ttcagtattt tccctcttcc cctttataaa ttatgctaaa gccacaaagc 3840 acatttttgg ggatcataga aggttggggt tccagaaagg catctgtgtg atggttccat 3900 tgatgtggga tttccctact tgctgtattc tcagtttcta ataaaaagaa ccaaatgaaa 3960 tatgaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3982 <210> 3 <211> 416 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gacctcagca gtccctgctg aggaagctgc cgggctccct gtgtaccact ggccttcatg 60 aacaaagctg acaccatcat gctccttcgg acatattctg ctagcataaa gggaccccca 120 tctccccaac cgaattaggc agagctggcc ttccttctag cggagttcct aggagtgagt 180 tggtgccacc ccttgtgagg cttgatccaa aaaccagaac ctctccagac cagggatcca 240 tgtcctctaa cacaagaggg gcagacctaa cctctaaaat ccctcccact ctaaccttca 300 gcatccacag ctcaaaacaa ccaggatgcc tcagaaacag cactcactgg ggcgagcagg 360 attaggcttc agaaaaacca ggtagatcca gtttcttctg tcagaaaatg tttttt 416 <210> 4 <211> 3591 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 agcggagtga ttctcctgcc tcagcctcct gagtagctgg gattacaggc gccagccacc 60 atgcccggct agtttttgtg tttttagtag agacgggatt tcaccatgtt gcccaggctg 120 gtctcaaact cctgatctca ggctcaagct accttcttga tgaaaaattc tggacgtgtt 180 ctgaaaatca cagtcatccc taacttcagt ggaaaagatt catattgtcc agctgaacaa 240 ggattgatac ttaaaaccag ggatttccta aaatgaaaat gtttctgtgg ataaaactga 300 ttacatgcag agactggaat ggagttaatt ctgggtagat atgggattca agagattggt 360 cttcatgagg catttatcaa ggatctgcaa gggatttaga ggtgacggaa gcacagtcct 420 tcctgggcag ttgcctctag cctggtggga ggtgttcctc acacccagga ctctcatcca 480 tggcaaaata aaaagtgaga tatcgactgg gcatggtggc tcacgcctgt aatcccagca 540 ctttgggagg tcgaggcggg tggatcacct aggccaggag ttcgagacca gcctggccaa 600 catgacgaaa ccccatttct actaaaaata caaaaattag ccatgtgtgg tggaatgcac 660 ctgaagtctc agctactcgg gaggctgagg cacaataatt gcttggaccc aggagaagga 720 ggctgcagtg agccgaggtc gtgtcactgt actccagcct gggtgacaga gtgagactcc 780 atctcaaaaa aaaaaaaaaa gtggatatca catcagagaa gctcctggcc aggtggcctt 840 gaggaacagg gatgagttca gcacttagag atggagttgg ctttccccgt tggagggaaa 900 ggcatgagaa gggacatagg taagaggaag tagagtagtg caggggccat tgagtagtag 960 tccttccaag acaggacttc atcatagaac cactttctct gaggaagctc tgcttggggg 1020 aggttttaat tcatgaggaa ggcaaattca atggctctca ggtgaggtgg gaaacagaca 1080 cctaccaaca ctccaaagag aacatgtacc tctataaaag ggcacagtct agtgaacaaa 1140 gtccacagct ctgggtttga tttctagcac tgtcacttaa tactgtgtga ccttagacat 1200 tcacttaact ctctcagcct caggatacaa tctgtaaaaa caggagaatg cttgttccct 1260 gtgccttata ggattgatat gagcatcagg agagacagtg ggcacaaaat agcactgtca 1320 actacttctt tctagtcagt tatctggtca tgtttgtgaa gctccccagg actgggaaca 1380 tagcatatga tttttttaaa gttacttgat gaatgaatga ataaatgaat gagtaaatga 1440 atgaataata tctaaaggcc tccaactaaa taataatcaa cttcctaacc gtactgaaag 1500 cctttaattg actttggggc tgtttggcct ggaggaggct ctgagttagt ggtgatcagt 1560 tggtgtcatg gtagagaaga aagcctgtga aggtggagtc attgtcatta tcagcataga 1620 gtccattacg ctctccttcc ccatacacct ggagccagac ttggtcgccc acctccagat 1680 gcaggagcac agagccggag gcctggtcca cattattttc ctggtactga tcataggtga 1740 agagcatagc cttgtccttc ttgaagaggc tgaccttcac atccttcata tagactgtga 1800 tgtggtaggc aaagtagtac agcccaggaa tgttgcagtg gaatttacca gtggagccat 1860 catagtggtt ttgctgattg tagaagatct tggtaaagcg aatgggcatg ttggggatag 1920 taacgtaagt ctccaatccc acactgaatg ctgagcggta tacataggca ccttctccag 1980 gttctccttt cctgccttgg attcccggaa agcctcgggg accttcagcc ccgggtactc 2040 cggtttcacc gatgtctccc ttaggaccaa taagacctaa ggaatgagaa gacctcagtg 2100 actacaaaga acagaactcc tgcctaggat gtctctcctc ctctattctg cctacccatc 2160 attcaaggcc tagctgaagc tctgcctcct ccttgaagcc ttcattcttc atcaggtcca 2220 cggggtgcca tctctgccat cacggcctgg ggccccatta tggcccggat gccctgggat 2280 gcccgccatc caacctgtgc aggccccctt gggcagggga agcaggactc cgggcccttg 2340 agtcgtggtt tcctggtcat gaccgggcag agctaatagc agtagaacag ctcccagcaa 2400 cagcatcctg agccctggaa tccacatgtg cactgtcagc catggagaga cagaccccac 2460 acacacaccc agttgggacc tacaaaggac tccgtccatc tcagcagagt ctacttctag 2520 gagctgcttt ctaagtattc aacttttcca ggaagacttt tctgaatatt gcagcccacc 2580 ttgatctctt tctgccctga aatctgtaat acttagcatt attccctgtg tgtagtctcc 2640 tttcctcacc aagattatga attcagtgat tgcacagatg acactcctct aattttccca 2700 tgtctgagca caggaccaag cacagggaaa gctccaagag tcgacttgcc aagaatccat 2760 ccttgggttt cccaagtacg atgacacaga ttgctccatt caatgctaac cagcttctct 2820 cctctggctc ctttcttctt tttctttccc cccttctctc tcattttctg tgtctattcc 2880 tccttcttac tctctcattc tctttcttcc tctacccctc tcctggggca catgtttgac 2940 tattgggtat attacatttg cacacatgca cacacacaaa cacacacaga gaaaaagaga 3000 gagagaggga gggagagact caccttgtgt taagcagaca acgagagaca catcatccca 3060 tgaacatatc ccctggccct ttgtttgcct gagccatctt tagctgcccc tcctcccctg 3120 tctaatctct attcagcctt caggacccag tttggatgtc atctgtttca agaagtcctc 3180 cttgttctcc atctcactcc ttggctggtt ctttcccctc tgtgtttctc cagtgccctg 3240 gtaatatggt ttgggtctgt gtccccaccc aaatagcacg tcgacatgtg ttggagaagg 3300 ggcctggtag gaggtgactg aatcatggag gcagacttat cccttgctgt tctcatgata 3360 gtaggtgaat tctcacaaga tctggttgaa agtgtgtagc acttccccta tattctctct 3420 ctctctcttt ctctctctct ctcctgctgc tgtgtgatgt gcttgcttcc ccttcgctct 3480 ttcttccacc atgattgtaa gttttctgag gcctccccag ccatgcttcc tgtacagcct 3540 gtggaactgt gagtcaatta aacctctttt ctttataaaa aaaaaaaaaa a 3591 <210> 5 <211> 875 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 attttgcttt ccctgcctaa cgcagccatg gcgcgtggtc ccaagaagca tctgaagtgg 60 gcagcagctc caaagcattg gatgctggat aaattgaccg gtgtgtttgc tcctcgtcca 120 tccactagtc cccacaagtt gagagagtgt ctccccatca tattcctaag gaacagactt 180 aagtaagccc tgacaggaga tgaagtaaag aagattacat gcagaggttc attaagatcg 240 atggcaaggt ccgaactcat ataacctacc ctgctggatt catggatgtc atcagcattg 300 acaagacggg ggagaatttc cgtctcatct atgacaccaa gggtcgcttt gctgtacatc 360 ctattacacc tgaggaggcc aaatacaaag tgagaaaaat ctctgggggc acaaaaggaa 420 tccctcatct ggtgactcat gatgcccggc accatccgct accctgattc cctcatcaag 480 gtgaatgata ccattcagac agatttggag attggcaaga ttaccaattt catcaagttt 540 gacaatggta acctatgcat ggtgactgta ggtgctaacc tgggaagaac tggtgtgata 600 accaacagag agaggcactc tggatctttt gatgtggttc acatgaaaga tgccaatgga 660 aacagctttg ccactcaact ttccaacatt tttgttattg gcaagggcaa caaaccacag 720 acttctcttc cctgaggaaa agggtatctg cctcaccatt gctgaaaaga aagacaaaag 780 actggcgacc aaacagagca gtgggtgaaa tggtccctgg gtgacatgtt agatctttgt 840 acgtaattaa aaataatgta gcatgataaa cagaa 875 <210> 6 <211> 194 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 aaaatcaaca gtgcaagaat atggccaggg acaatggctc ctgcctgtta aatccagcta 60 ttcaagaggc tgagggagga ggatcgctcg aggccaggag ttcaagacca gcctggacaa 120 catggcaaaa ccctgtttct acaaaaaata caaacattag ccaggcatgg tggtgcatgc 180 ctgtaatccc ggct 194 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 7 aggttagagt gggagggatt t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 8 gccagctctg cctaattcgg t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 9 tccctggtct ggagaggttc t 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 10 gtctctccct ccctctctct 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 11 gtcccttctc atgcctttcc c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 12 ccttctcatg cctttccctc c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 13 tgtctgtttc ccacctcacc t 21 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 14 agagtgggag ggatttta 18 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 15 ggccagctct gcctaattc 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 16 cctggtctgg agaggttct 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 17 cctatgtccc ttctcatgc 19 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 18 ttccctccaa cggggaaa 18 <210> 19 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 19 ggccagctct gc 12 <210> 20 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 20 cagctctgcc ta 12 <210> 21 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 21 cctggtctgg ag 12 <210> 22 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 22 tggagaggtt ct 12 <210> 23 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 23 ggtctggaga gg 12 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 24 tcctcctccc tcagcctctt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 25 gctggtcttg aactcctggc 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 26 atcctcctcc ctcagcctct t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 27 gattacaggc atgcaccacc a 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 28 agtgcctctc tctgttggtt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 29 accatttcac ccactgctct 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 30 gctgcccact tcagatgctt c 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 31 gtctgtggtt tgttgccctt 20

Claims (37)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 아디포넥틴(ADIPOQ) 유전자의 천연 안티센스 서열인 서열 번호: 3 내지 6에 상보적인 길이가 10개 내지 30개인 뉴클레오티드인 합성 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 합성 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 7 내지 15, 17, 19, 22 내지 27, 30 및 31에서 제시된 하나의 뉴클레오티드 서열로 구성되며, 아디포넥틴(ADIPOQ) 유전자의 기능 또는 발현 또는 기능 및 발현을 상향조절하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오티드.
  18. 삭제
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 15 내지 30개 뉴클레오티드 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오티드.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 최소한 하나의 변형된 슈가 모이어티, 최소한 하나의 변형된 뉴클레오시드간 링키지, 최소한 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오티드.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 합성 올리고뉴클레오티드는 2'-O-메톡시에틸 변형된 슈가 모이어티, 2'-메톡시 변형된 슈가 모이어티, 2'-O-알킬 변형된 슈가 모이어티, 바이사이클 슈가 모이어티 및 이의 조합으로부터 선택된 최소한 하나의 변형된 슈가 모이어티로부터 선택된 최소한 하나의 변형된 슈가 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오티드.
  22. 청구항 19에 있어서, 상기 합성 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형은 포스포로티오에이트, 2'-O-메톡시에틸(MOE), 2'-플루오르, 알킬포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카르바메이트, 카르보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세타마이데이트, 카르복시메틸 에스테르, 및 이의 조합으로부터 선택된 최소한 하나의 변형된 뉴클레오시드간 링키지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오티드.
  23. 청구항 19에 있어서, 상기 합성 올리고뉴클레오티드는 펩티드 핵산, 잠금 핵산 (LNA), 아라비노-핵산 및 이의 조합으로부터 선택된 최소 한 가지 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오티드.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드와 관련된 질환 치료에 이용되는 청구항 17에 따른 합성 올리고뉴클레오티드를 활성 성분으로 하고, 약학적으로 수용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물에 있어서, 이때 아디포넥틴(ADIPOQ) 폴리뉴클레오티드와 관련된 질환은 암, 염증, 아테롬성동맥경화증, 신경성 질환 또는 장애, 심장 질환 또는 장애, 자가면역 질환 또는 장애, 바이러스, 세균, 곰팡이, 원생동물로 인한 감염성 질환 또는 장애, 대사 질환 또는 장애, 간 질환, 신장 질환, 단백뇨로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
KR1020127006017A 2009-08-11 2010-08-11 아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ) 관련된 질환의 치료 KR101827015B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23291709P 2009-08-11 2009-08-11
US61/232,917 2009-08-11
US25318709P 2009-10-20 2009-10-20
US61/253,187 2009-10-20
PCT/US2010/045168 WO2011019815A2 (en) 2009-08-11 2010-08-11 Treatment of adiponectin (adipoq) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an adiponectin (adipoq)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120046767A KR20120046767A (ko) 2012-05-10
KR101827015B1 true KR101827015B1 (ko) 2018-02-07

Family

ID=43586806

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127006017A KR101827015B1 (ko) 2009-08-11 2010-08-11 아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ) 관련된 질환의 치료

Country Status (8)

Country Link
US (4) US9044493B2 (ko)
EP (1) EP2464731B1 (ko)
JP (1) JP6189594B2 (ko)
KR (1) KR101827015B1 (ko)
CN (2) CN104313027B (ko)
CA (1) CA2770104C (ko)
ES (1) ES2599986T3 (ko)
WO (1) WO2011019815A2 (ko)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2770104C (en) 2009-08-11 2019-03-19 Opko Curna, Llc Treatment of adiponectin (adipoq) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an adiponectin (adipoq)
AU2011325956B2 (en) 2010-11-12 2016-07-14 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
EA201492123A1 (ru) 2012-05-16 2015-10-30 Рана Терапьютикс, Инк. Композиции и способы для модулирования экспрессии семейства генов smn
EA201492116A1 (ru) 2012-05-16 2015-05-29 Рана Терапьютикс, Инк. Композиции и способы для модулирования экспрессии mecp2
EP2850188A4 (en) 2012-05-16 2016-01-20 Rana Therapeutics Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING THE EXPRESSION OF THE MULTIGENIC FAMILY OF HEMOGLOBIN
KR102028784B1 (ko) 2012-05-16 2019-10-04 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 유전자 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
CN104583401A (zh) 2012-05-16 2015-04-29 Rana医疗有限公司 用于调节atp2a2表达的组合物和方法
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
CN104540946A (zh) 2012-05-16 2015-04-22 Rana医疗有限公司 用于调节utrn表达的组合物和方法
CA2966044A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 The General Hospital Corporation Methods for modulating atrx-dependent gene repression
WO2016149455A2 (en) 2015-03-17 2016-09-22 The General Hospital Corporation The rna interactome of polycomb repressive complex 1 (prc1)
WO2017048620A1 (en) * 2015-09-14 2017-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) and methods of use thereof
KR101901669B1 (ko) * 2016-01-27 2018-09-28 경상대학교산학협력단 아디포넥틴 수용체 활성화 신규 펩티드를 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2019226952A1 (en) * 2018-05-24 2019-11-28 Valkyrie Pharmaceutics, Inc. Methods and formulations for the treatment of obesity and obesity-related metabolic diseases

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006030761A1 (ja) 2004-09-14 2006-03-23 Shionogi & Co., Ltd. 新規糖尿病関連因子

Family Cites Families (236)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1109630A (en) 1910-05-26 1914-09-01 Liberty Trust Company Combined washing and clothes-drying machine.
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5288512A (en) 1987-12-15 1994-02-22 The Procter & Gamble Company Reduced calorie fats made from triglycerides containing medium and long chain fatty acids
NL8800756A (nl) 1988-03-25 1989-10-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Genetisch gemanipuleerde plantecellen en planten, alsmede daarvoor bruikbaar recombinant dna.
US6203976B1 (en) 1989-07-18 2001-03-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation
US5457189A (en) 1989-12-04 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US6034233A (en) 1990-05-04 2000-03-07 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-alkylated oligoribonucleotides and phosphorothioate analogs complementary to portions of the HIV genome
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
DE69128037T2 (de) 1990-11-13 1998-05-07 Immunex Corp Bifunktionelle wählbare fusionsgene
DE4223850A1 (de) 1991-07-23 1993-01-28 Mitsubishi Chem Ind Magnetooptisches aufzeichnungsmedium
US6307040B1 (en) 1992-03-05 2001-10-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5576302A (en) 1991-10-15 1996-11-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5661134A (en) 1991-10-15 1997-08-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US5605662A (en) 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
IL101600A (en) 1992-04-15 2000-02-29 Yissum Res Dev Co Synthetic partially phosphorothioated antisense oligodeoxynucleotides and pharmaceutical compositions containing them
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US6710174B2 (en) 2001-09-13 2004-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression
WO1994009148A1 (en) 1992-10-15 1994-04-28 Toray Industries, Inc. Process for producing major histocompatibility antigen class ii protein and material having the same immobilized thereon
JPH08510130A (ja) 1993-05-11 1996-10-29 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 異常スプライシングを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドと同物質の利用法
EP0804590A1 (en) 1993-05-21 1997-11-05 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
AU679566B2 (en) 1993-09-03 1997-07-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5491084A (en) 1993-09-10 1996-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green-fluorescent protein
EP0889122A3 (en) 1993-11-30 1999-03-03 McGILL UNIVERSITY Inhibition of DNA Methyltransferase
US5908779A (en) 1993-12-01 1999-06-01 University Of Connecticut Targeted RNA degradation using nuclear antisense RNA
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
WO1995022618A1 (en) 1994-02-22 1995-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
US5902880A (en) 1994-08-19 1999-05-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US6551618B2 (en) 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US6645943B1 (en) 1994-10-25 2003-11-11 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
GB9501465D0 (en) 1995-01-25 1995-03-15 King S College London Nucleoside phosphorothioate derivatives,synthesis and use thereof
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
IT1276642B1 (it) 1995-03-03 1997-11-03 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso presente in linfociti b ed oligodeossinucleotidi sintetici utili per inibirne l'azione
IT1275862B1 (it) 1995-03-03 1997-10-24 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso associato ad alcuni tipi di cellule tumorali ed oligodeossinucleotidi sintetici utili nella diagnosi e nel trattamento
US5739311A (en) 1995-06-07 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
US5569588A (en) 1995-08-09 1996-10-29 The Regents Of The University Of California Methods for drug screening
BR9707529A (pt) 1996-02-14 2000-01-04 Isis Pharmaceuticals Inc Oligunucleotìdeo especificamente hibridizável com dna ou rna.
PT888385E (pt) 1996-03-14 2004-01-30 Genentech Inc Utilizacoes de gdnf e de receptores de gdnf
AU2733697A (en) 1996-04-17 1997-11-07 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of vascular endothelial growth factor (vegf/vpf) expression
US5786213A (en) 1996-04-18 1998-07-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of endogenous gastrin expression for treatment of colorectal cancer
US5756710A (en) 1996-06-05 1998-05-26 The Trustees Of Columbia University In City Of New York Phosphorothioate oligonucleotides that bind to the V3-loop and uses thereof
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US5739119A (en) 1996-11-15 1998-04-14 Galli; Rachel L. Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA
US7008776B1 (en) 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
US7235653B2 (en) 1996-12-31 2007-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6013786A (en) 1997-08-22 2000-01-11 Hybridon, Inc. MDM2-specific antisense oligonucleotides
NZ503765A (en) 1997-09-12 2002-04-26 Exiqon As Bi-cyclic and tri-cyclic nucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6034883A (en) 1998-01-29 2000-03-07 Tinney; Charles E. Solid state director for beams
US6175409B1 (en) 1999-04-02 2001-01-16 Symyx Technologies, Inc. Flow-injection analysis and variable-flow light-scattering methods and apparatus for characterizing polymers
US20040186071A1 (en) 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US7321828B2 (en) 1998-04-13 2008-01-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. System of components for preparing oligonucleotides
US6221587B1 (en) 1998-05-12 2001-04-24 Isis Pharmceuticals, Inc. Identification of molecular interaction sites in RNA for novel drug discovery
SK17432000A3 (sk) 1998-05-26 2001-07-10 Icn Pharmaceuticals, Inc. Zlúčenina, ktorá zahŕňa nukleozid s 2',4'-mostíkom a oligonukleotid z nej odvodený
US6833361B2 (en) 1998-05-26 2004-12-21 Ribapharm, Inc. Nucleosides having bicyclic sugar moiety
US6100090A (en) 1999-06-25 2000-08-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of PI3K p85 expression
US20030139359A1 (en) 2001-12-04 2003-07-24 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of phospholipid scramblase 3 expression
US6242589B1 (en) 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
CA2243761C (en) 1998-07-21 2009-10-06 Certicom Corp. Timing attack resistant cryptographic system
US6214986B1 (en) 1998-10-07 2001-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of bcl-x expression
AU1607100A (en) 1998-11-06 2000-05-29 Alcon Laboratories, Inc. Upregulation of endogenous prostaglandins to lower intraocular pressure
US5985663A (en) 1998-11-25 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of interleukin-15 expression
AU776512B2 (en) 1999-01-27 2004-09-09 David Laurence Becker Formulations comprising antisense nucleotides to connexins
ID30093A (id) 1999-02-12 2001-11-01 Sankyo Co Analog-analog nukleosida dan oligonukleotida baru
ATE385237T1 (de) 1999-02-26 2008-02-15 Univ British Columbia Antisense-therapie für trpm-2
US20040137423A1 (en) 1999-03-15 2004-07-15 Hayden Michael R. Compositions and methods for modulating HDL cholesterol and triglyceride levels
JP4726302B2 (ja) 1999-03-15 2011-07-20 ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア Ａｂｃ１ポリペプチドおよびコレステロール水準を調節する方法と試薬
EP1161554B1 (en) 1999-03-18 2011-03-09 Exiqon A/S Detection of mutations in genes by specific lna primers
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
IL145496A0 (en) 1999-03-24 2002-06-30 Exiqon As Improved synthesis of [2.2.1] bicyclo nucleosides
US6734291B2 (en) 1999-03-24 2004-05-11 Exiqon A/S Synthesis of [2.2.1]bicyclo nucleosides
EP1171078A4 (en) 1999-03-26 2002-11-06 Aventis Pharma Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INFLUENCING THE BLOOD LEVELS OF HIGH DENSITY LIPOPROTEIN (HDL) CHOLESTEROL AND APOLIPOPROTEIN AI, VERY LOW DENSITY LIPOROTEIN (VLDL) CHOLESTEROL AND LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) CHOLESTER
ES2300261T3 (es) 1999-04-08 2008-06-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Potenciacion de la respuesta inmune para aplicaciones de vacunas y terapia genetica.
WO2000063365A1 (en) 1999-04-21 2000-10-26 Pangene Corporation Locked nucleic acid hybrids and methods of use
JP2002543214A (ja) 1999-05-04 2002-12-17 エクシコン エ／エス Ｌ−リボ−ｌｎａ類縁体
US20030233670A1 (en) 2001-12-04 2003-12-18 Edgerton Michael D. Gene sequences and uses thereof in plants
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
DE19925073C2 (de) 1999-06-01 2001-07-19 Stefan Weiss Nucleinsäuremoleküle mit spezifischer Erkennung von nativem PrP·S··c·, Herstellung und Verwendung
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
AU781437B2 (en) 1999-06-25 2005-05-26 Serono Genetics Institute S.A. A novel BAP28 gene and protein
US20040006031A1 (en) 2002-07-02 2004-01-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of HMG-CoA reductase expression
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
WO2001021631A2 (en) 1999-09-20 2001-03-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Secreted proteins and uses thereof
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US6986988B2 (en) 1999-10-06 2006-01-17 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger RNA
WO2001025488A2 (en) 1999-10-06 2001-04-12 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger rna
AU1085401A (en) * 1999-10-15 2001-04-30 Orchid Biosciences, Inc. Genotyping reagents, kits and methods of use thereof
AU2778801A (en) 2000-01-07 2001-07-24 Baylor University Antisense compositions and methods
WO2001051490A1 (en) 2000-01-14 2001-07-19 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methanocarba cycloalkyl nucleoside analogues
US6303374B1 (en) 2000-01-18 2001-10-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of caspase 3 expression
JP2001247459A (ja) 2000-03-03 2001-09-11 Oakland Uniservices Ltd 癌の組み合わせ療法
US6936467B2 (en) 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
AP2002002638A0 (en) 2000-03-27 2002-09-30 Univ Delaware Targeted chromosomal genomic alternations with modified single stranded oligonucleotides.
US7402434B2 (en) 2000-05-08 2008-07-22 Newman Stuart A Splice choice antagonists as therapeutic agents
US20030176341A1 (en) 2000-06-29 2003-09-18 Jean-Francois Meritet Interferon-alpha induced gene
WO2002009700A1 (en) 2000-07-28 2002-02-07 Cancer Research Technology Limited Cancer treatment by combination therapy
WO2002018388A1 (fr) 2000-08-29 2002-03-07 Takeshi Imanishi Analogues de nucleosides et derives d'oligonucleotides renfermant ces analogues
HUP0301805A3 (en) 2000-09-02 2005-12-28 Gruenenthal Gmbh Antisense oligonucleotides against vanilloid receptor 1
US6444464B1 (en) 2000-09-08 2002-09-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of E2F transcription factor 2 expression
AU2001289085A1 (en) 2000-09-20 2002-04-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of flip-c expression
US20030186920A1 (en) 2000-10-13 2003-10-02 Sirois Martin G. Antisense oligonucleotide directed toward mammalian vegf receptor genes and uses thereof
US20030228618A1 (en) 2000-11-24 2003-12-11 Erez Levanon Methods and systems for identifying naturally occurring antisense transcripts and methods, kits and arrays utilizing same
US20050222029A1 (en) 2001-01-04 2005-10-06 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating diseases
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US20020147165A1 (en) 2001-02-22 2002-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of calreticulin expression
EP1368458A2 (en) 2001-02-26 2003-12-10 Pharma Pacific Pty. Ltd. Interferon-alpha induced gene
AUPR497101A0 (en) 2001-05-14 2001-06-07 Queensland University Of Technology Polynucleotides and polypeptides linked to cancer and/or tumorigenesi
IL143379A (en) 2001-05-24 2013-11-28 Yissum Res Dev Co Oligonucleotide against human ache isoform r and its uses
US7053195B1 (en) 2001-06-12 2006-05-30 Syngenta Participatious Ag Locked nucleic acid containing heteropolymers and related methods
US7153954B2 (en) 2001-07-12 2006-12-26 Santaris Pharma A/S Method for preparation of LNA phosphoramidites
KR20040022449A (ko) 2001-07-12 2004-03-12 유니버시티 오브 매사추세츠 유전자 불활성화를 매개하는 소형 간섭 ｒｎａ의 생체내제조
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7259150B2 (en) 2001-08-07 2007-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of apolipoprotein (a) expression
AU2002334307A1 (en) 2001-09-04 2003-03-18 Exiqon A/S Novel lna compositions and uses thereof
US20040214766A1 (en) 2001-10-01 2004-10-28 Kari Alitalo VEGF-C or VEGF-D materials and methods for treatment of neuropathologies
BR0213180A (pt) 2001-10-10 2004-09-14 Nestle Sa Planta de café com uma atividade de alfa-d-galactosidase reduzida
US7125982B1 (en) 2001-12-05 2006-10-24 Frayne Consultants Microbial production of nuclease resistant DNA, RNA, and oligo mixtures
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
CA2365811A1 (en) 2001-12-21 2003-06-21 Institut De Cardiologie A new gene therapy using antisense strategy to estrogen receptors (er .alpha. and/or er .beta.) to optimize vascular healing and cardioprotection after vascular injury
KR20030056538A (ko) 2001-12-28 2003-07-04 주식회사 웰진 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 형질전이성장 인자-β1의 효과적 저해제 개발
US20030191075A1 (en) 2002-02-22 2003-10-09 Cook Phillip Dan Method of using modified oligonucleotides for hepatic delivery
US20050143357A1 (en) 2002-02-25 2005-06-30 Ake Pousette Vitamin d upregulated protein 1 (vdup-) methods and uses thereof
US7144995B2 (en) 2002-03-08 2006-12-05 Glen Research Corporation Fluorescent nitrogenous base and nucleosides incorporating same
GB2386836B (en) 2002-03-22 2006-07-26 Cancer Res Ventures Ltd Anti-cancer combinations
US7169916B2 (en) 2002-04-01 2007-01-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chloral-free DCA in oligonucleotide synthesis
US20050215504A1 (en) 2002-04-02 2005-09-29 Bennett C F Antisense modulation of sterol regulatory element-binding protein-1 expression
PT2264172T (pt) 2002-04-05 2017-12-06 Roche Innovation Ct Copenhagen As Compostos oligoméricos para a modulação da expressão do hif-1α.
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
US6808906B2 (en) 2002-05-08 2004-10-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Directionally cloned random cDNA expression vector libraries, compositions and methods of use
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US7148342B2 (en) 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
US20040033480A1 (en) 2002-08-15 2004-02-19 Wong Norman C.W. Use of resveratrol to regulate expression of apolipoprotein A1
AU2003298556A1 (en) 2002-08-19 2004-05-04 Regulome Corporation Functional sites
AU2003270537B2 (en) 2002-09-10 2008-03-20 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Methods and compositions for production of flavonoid and isoflavonoid nutraceuticals
EP1549387A1 (en) 2002-09-25 2005-07-06 Pharmacia Corporation Antisense modulation of farnesoid x receptor expression
US7229976B2 (en) 2002-09-26 2007-06-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of forkhead box O1A expression
GB2394658A (en) 2002-11-01 2004-05-05 Cancer Rec Tech Ltd Oral anti-cancer composition
US20040152651A1 (en) 2002-11-01 2004-08-05 Rana Tariq M. Regulation of transcription elongation factors
CA2504926C (en) 2002-11-01 2014-01-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for sirna inhibition of hif-1 alpha
EP1560840B1 (en) 2002-11-05 2015-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
CA2504694C (en) 2002-11-05 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US20060009410A1 (en) 2002-11-13 2006-01-12 Crooke Rosanne M Effects of apolipoprotein B inhibition on gene expression profiles in animals
US7250496B2 (en) 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
AU2003295600A1 (en) * 2002-11-14 2004-06-15 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
DK2752488T3 (da) 2002-11-18 2020-04-20 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense-design
US7250289B2 (en) * 2002-11-20 2007-07-31 Affymetrix, Inc. Methods of genetic analysis of mouse
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US7790867B2 (en) 2002-12-05 2010-09-07 Rosetta Genomics Inc. Vaccinia virus-related nucleic acids and microRNA
US7713738B2 (en) 2003-02-10 2010-05-11 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression
CA2515677A1 (en) * 2003-02-11 2004-08-26 Wyeth Methods for monitoring drug activities in vivo
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
US7339051B2 (en) 2003-04-28 2008-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS)
CA2540692C (en) 2003-06-02 2013-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide synthesis with alternative solvents
CN1984921B (zh) 2003-06-03 2010-06-16 Isis药物公司 存活蛋白表达的调节
US7568709B2 (en) 2003-07-03 2009-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Passive stabilization systems for wheeled objects
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
NZ545134A (en) 2003-09-18 2009-06-26 Lilly Co Eli Modulation of eIF4E expression
US8258105B2 (en) 2003-10-07 2012-09-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides optimized for kidney targeting
WO2005045034A2 (en) 2003-10-23 2005-05-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF PARKINSON DISEASE USING SHORT INTERERING NUCLEIC ACID (siNA)
US8632570B2 (en) * 2003-11-07 2014-01-21 Biedermann Technologies Gmbh & Co. Kg Stabilization device for bones comprising a spring element and manufacturing method for said spring element
AU2004303464B2 (en) 2003-12-23 2009-10-01 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of BCL-2
RU2388817C2 (ru) 2004-01-12 2010-05-10 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Активация экспрессии гена костного морфогенетического белка (вмр) в костных клетках посредством электромагнитных сигналов
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
GB0403041D0 (en) 2004-02-11 2004-03-17 Milner Anne J Induction of apoptosis
EP1566202A1 (en) 2004-02-23 2005-08-24 Sahltech I Göteborg AB Use of resistin antagonists in the treatment of rheumatoid arthritis
US7402574B2 (en) 2004-03-12 2008-07-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense composition and method for treating cancer
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7577587B2 (en) 2004-07-07 2009-08-18 Sap Ag Purchase order and purchase order response interactive forms
US7297786B2 (en) 2004-07-09 2007-11-20 University Of Iowa Research Foundation RNA interference in respiratory epitheial cells
US20060040861A1 (en) 2004-07-29 2006-02-23 Yoshiki Iwamoto Method of treating, preventing, and diagnosing prostate cancer
WO2006023880A2 (en) 2004-08-23 2006-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the characterization of oligonucleotides
NZ555644A (en) 2004-11-09 2009-04-30 Santaris Pharma As Potent LNA oligonucleotides for the inhibition of HIF-1A expression
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
JP5116107B2 (ja) 2005-06-27 2013-01-09 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ＨＩＦ−１のＲＮＡｉ調節及びその治療的利用
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
EP1937312B1 (en) 2005-08-30 2016-06-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds for modulation of splicing
US20070259377A1 (en) * 2005-10-11 2007-11-08 Mickey Urdea Diabetes-associated markers and methods of use thereof
JP5111385B2 (ja) 2005-10-28 2013-01-09 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ハンチンチン遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法
AU2006311725B2 (en) 2005-11-04 2011-11-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of NAV1.8 gene
EP2431467A3 (en) 2005-11-17 2012-05-02 Board Of Regents, The University Of Texas Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal DNA
US20070248590A1 (en) 2005-12-02 2007-10-25 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Modulators of CDC2-like kinases (CLKS) and methods of use thereof
CN101374964B (zh) 2005-12-09 2013-07-17 贝勒研究院 外周血液白细胞转录模式的模块水平分析
CN100356377C (zh) 2005-12-20 2007-12-19 无锡永中科技有限公司 文档显示方法
US20070213274A1 (en) 2005-12-20 2007-09-13 Oy Jurilab Ltd Novel genes and markers associated with high-density lipoprotein-cholesterol (HDL-C)
EP1976567B1 (en) * 2005-12-28 2020-05-13 The Scripps Research Institute Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets
CA2636724A1 (en) * 2006-01-09 2007-08-02 Children's Hospital Medical Center Adiponectin for treatment of various disorders
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
CA2640171C (en) 2006-01-27 2014-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
WO2007115168A2 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 gene
US7901882B2 (en) * 2006-03-31 2011-03-08 Affymetrix, Inc. Analysis of methylation using nucleic acid arrays
ES2471978T3 (es) 2006-05-05 2014-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y procedimientos para modular la expresión de ApoB
EP3249052B1 (en) 2006-05-11 2019-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
WO2007134181A2 (en) 2006-05-11 2007-11-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP1867338A1 (en) 2006-05-30 2007-12-19 Université Libre De Bruxelles Pharmaceutical composition comprising apolipoproteins for the treatment of human diseases
WO2008057556A2 (en) 2006-11-06 2008-05-15 Beth Israel Deaconess Medical Center Identification and use of small molecules to modulate ese-1 transcription factor function and to treat ese-1 transcription factor associated diseases
WO2008066672A2 (en) 2006-11-06 2008-06-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Identification and use of small molecules to modulate transcription factor function and to treat transcription factor associated diseases
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
CA2675946A1 (en) 2007-01-19 2008-07-24 Lionel Navarro Methods and compositions for modulating the sirna and rna-directed-dna methylation pathways
CA2686933A1 (en) 2007-04-06 2008-10-16 The Johns Hopkins University Methods and compositions for the treatment of cancer
US20080293142A1 (en) 2007-04-19 2008-11-27 The Board Of Regents For Oklahoma State University Multiple shRNA Expression Vectors and Methods of Construction
BRPI0913657A2 (pt) 2008-07-01 2020-08-04 Monsanto Technology Llc constructos de dna recombinante e métodos para a modulação da expressão de um gene-alvo
EP2352830B1 (en) 2008-10-03 2019-01-16 CuRNA, Inc. Treatment of apolipoprotein-a1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to apolipoprotein-a1
EP2177615A1 (en) 2008-10-10 2010-04-21 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method for a genome wide identification of expression regulatory sequences and use of genes and molecules derived thereof for the diagnosis and therapy of metabolic and/or tumorous diseases
CN102449151A (zh) * 2008-10-22 2012-05-09 夸克医药公司 治疗眼部疾病的方法
US8606289B2 (en) 2008-11-10 2013-12-10 Qualcomm Incorporated Power headroom-sensitive scheduling
EP2358382A2 (en) 2008-11-22 2011-08-24 The University of Bristol NOVEL USES OF VEGFxxxB
CA2770104C (en) 2009-08-11 2019-03-19 Opko Curna, Llc Treatment of adiponectin (adipoq) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an adiponectin (adipoq)

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006030761A1 (ja) 2004-09-14 2006-03-23 Shionogi & Co., Ltd. 新規糖尿病関連因子

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochim Biophys Acta. 2006 Jul;1761(7):709-716

Also Published As

Publication number Publication date
EP2464731A4 (en) 2013-05-15
EP2464731A2 (en) 2012-06-20
US10316317B2 (en) 2019-06-11
JP2013501524A (ja) 2013-01-17
US20180201931A1 (en) 2018-07-19
CA2770104A1 (en) 2011-02-17
WO2011019815A3 (en) 2011-10-06
US9909126B2 (en) 2018-03-06
CN102625841A (zh) 2012-08-01
JP6189594B2 (ja) 2017-08-30
EP2464731B1 (en) 2016-10-05
US20120129917A1 (en) 2012-05-24
US9044493B2 (en) 2015-06-02
WO2011019815A2 (en) 2011-02-17
US20150225724A1 (en) 2015-08-13
US20160168568A1 (en) 2016-06-16
US9290766B2 (en) 2016-03-22
ES2599986T3 (es) 2017-02-06
CA2770104C (en) 2019-03-19
KR20120046767A (ko) 2012-05-10
CN104313027B (zh) 2018-11-20
CN104313027A (zh) 2015-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101827015B1 (ko) 아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ) 관련된 질환의 치료
KR101807323B1 (ko) Ｔｎｆｒ2에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 종양 괴사 인자 수용체 2(ｔｎｆｒ2) 관련된 질환의 치료
KR101838305B1 (ko) ＮＲＦ1(Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ 1)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 핵 호흡 인자 1 관련된 질환의 치료
KR101805213B1 (ko) Ｃｈｉｐ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 “ｈｓｐ70-상호작용 단백질(ｃｈｉｐ)의 ｃ-말단” 관련된 질환의 치료
KR101703695B1 (ko) 전사 인자 ｅ3(ｔｆｅ3)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 ｔｆｅ3 및 인슐린 수용체 기질 2(ｉｒｓ2)의 치료
KR101854926B1 (ko) 성 호르몬 결합 글로불린 (ｓｈｂｇ)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 성 호르몬 결합 글로불린 (ｓｈｂｇ) 관련된 질환의 치료
KR101722541B1 (ko) Ｔｔｐ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 트리스테트라프롤린 관련된 질환의 치료
KR101807324B1 (ko) 다운 증후군 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 다운 증후군 유전자 관련된 질환의 치료
KR101857090B1 (ko) 무조(無調)의 동소체 1 (atoh1)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 atoh1 관련된 질환의 치료
KR101865433B1 (ko) 알파-l 이두로니다아제 (idua)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 idua 관련된 질환의 치료
KR101742334B1 (ko) Ｄｍｄ 패밀리에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 디스트로핀 패밀리 관련된 질환의 치료
KR101704988B1 (ko) 항바이러스 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 항바이러스 유전자 관련된 질환의 치료
KR101892760B1 (ko) ＩＱＧＡＰ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ＧＴＰａｓｅ 활성화 단백질을 함유하는 ＩＱ 모티프(ＩＱＧＡＰ)와 관련된 질환의 치료
KR101801404B1 (ko) 콜라겐 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 콜라겐 유전자 관련된 질환의 치료
KR102043422B1 (ko) 프라탁신 (fxn)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 프라탁신 (fxn) 관련된 질환의 치료
KR101801407B1 (ko) 시르투인 (ｓｉｒｔ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 시르투인 관련된 질환의 치료
KR101702689B1 (ko) Ｐｏｎ1에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 파라옥소나제 1(ｐｏｎ1) 관련된 질환의 치료
KR101853511B1 (ko) 인슐린 수용체 기질 2 및 전사 인자 ｅ3(ｔｆｅ3)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ｉｒｓ2 관련된 질환의 치료
KR101838308B1 (ko) 피롤린-5-카르복실레이트 환원효소 1(ｐｙｃｒ1)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ｐｙｃｒ1과 관련된 질환의 치료
KR101802536B1 (ko) 인슐린 유전자 (ｉｎｓ)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 인슐린 유전자 (ｉｎｓ) 관련된 질환의 치료
KR101913232B1 (ko) 인터페론-관련된 발달성 조절물질 1 (ifrd1)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 ifrd1 관련된 질환의 치료
KR101749356B1 (ko) 재편성 인자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 재편성 인자 관련된 질환의 치료
KR101886452B1 (ko) 디스크 라지 호모로그(dlg)에 대한 천연 안티센스 전사체의 저해에 의한 dlg 관련된 질환의 치료
KR101853510B1 (ko) Ｒｎａｓｅ ｈ1에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ｒｎａｓｅ ｈ1과 관련된 질환의 치료
KR101886457B1 (ko) 시알리다아제 4 (neu4)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 neu4 관련된 질환의 치료

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant