KR20010102019A

KR20010102019A - Ｎ-아세틸글루코사민 ２-에피머라아제 및 이 효소를코딩하는 ｄｎａ

Info

Publication number: KR20010102019A
Application number: KR1020017010089A
Authority: KR
Inventors: 고이즈미사또시; 다바따가즈히꼬; 엔도데쯔오; 오자끼아끼오
Original assignee: 히라타 다다시; 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤
Priority date: 1999-02-09
Filing date: 2000-02-09
Publication date: 2001-11-15
Also published as: AU2459300A; EP1154018A4; US20030157659A1; EP1154018A1; JP3939096B2; CN1226417C; CN1340100A; US6946281B2; WO2000047730A1

Abstract

본 발명은 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 신규한 단백질; 이 단백질을 코딩하는 DNA; 이 DNA 를 함유하는 재조합 벡터; 이 재조합 벡터를 숙주 세포 내로 도입하여 얻어지는 형질전환체; 및 이 형질전환체를 사용한 상기 단백질 또는 N-아세틸만노사민의 제조 방법을 제공한다.

Description

Ｎ-아세틸글루코사민 ２-에피머라아제 및 이 효소를 코딩하는 ＤＮＡ{N-ACETYLGLUCOSAMINE 2-EPIMERASE AND DNA ENCODING THE ENZYME}

N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제에 관해서는 돼지나 래트에 그 존재가 알려져 있고, 돼지 유래의 효소에 대해서는 그 성질이 조사되어 있다 [Biochemistry, 17, 3363 (1970)]. 또한 그 유전자에 관해서는 돼지 유래의 유전자 [J. Biol. Chem., 271, 16294 (1996)] 가 취득되어 있다. 그러나 지금까지 미생물에 있어서의 그 활성에 대해서는 알려져 있지 않다.

남조의 1 종인 시네코시스티스 (Synechocystis) sp. (PCC6803) 에 있어서는 그 게놈의 전체서열은 결정되어 있지만 [DNA Research, 3, 109 (1996), Nucleic Acids Research, 26, 63 (1998)], N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 유전자는 특정되어 있지 않다.

발명의 개시

본 발명의 목적은 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 단백질, 이 단백질을 코딩하는 DNA, 이 DNA 를 사용한 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 단백질의 제조법, 및 이 단백질을 사용한 N-아세틸만노사민의 제조법을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 수행하여 게놈 DNA 의 전체서열이 결정되어 있는 시네코시스티스 sp. (PCC6803) 의 서열정보로부터 돼지 유래의 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제의 아미노산 서열과 상동성이 있는 서열을 검색한 결과, 지금까지 특정되어 있지 않은 신규 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제를 코딩하는 DNA 를 미생물로부터 처음으로 발견하여 이 DNA 를 취득함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명은 다음의 (1) 내지 (10) 에 관한 것이다.

(1) 다음의 (a) 또는 (b) 의 단백질 :

(a) 서열번호 1 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.

(b) (a) 의 단백질이 갖는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 단백질.

상기 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 단백질은 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989) (이하, 몰레큘러·클로닝 제 2 판이라고 약칭함), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (이하, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지라고 함), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 488 (1985) 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여 예컨대 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 에 부위 특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있다.

결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만 상기 부위 특이적 변이법 등의 주지의 방법에 의해 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 수이고, 일반적으로 1 개 내지 수십개, 바람직하게는 1 내지 20 개, 보다 바람직하게는 1 내지 10 개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 개이다.

(2) 상기 (1) 기재의 단백질을 코딩하는 DNA.

(3) 다음의 (a) 또는 (b) 의 DNA 로 이루어지는 DNA :

(a) 서열번호 2 기재의 염기서열을 갖는 DNA.

(b) (a) 의 DNA 와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, 또한 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 로 이루어지는 DNA.

상기「엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA」란 서열번호 2 로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 를 프로브로 하여 콜로니·혼성화법, 플라크·혼성화법 또는 서던 혼성화법 등을 이용함으로써 얻어지는 DNA 를 의미하고, 구체적으로는 콜로니 또는플라크 유래의 DNA 를 고정화한 필터를 사용하여 0.7 내지 1.0 ㏖/ℓ의 염화나트륨 존재하, 65 ℃ 에서 혼성화를 실시한 후, 0.1 내지 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도의 SSC 용액의 조성은 150 m㏖/ℓ염화나트륨, 15 m㏖/ℓ시트르산나트륨으로 이루어짐) 을 사용하여 65 ℃ 조건하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA 를 들 수 있다.

혼성화는 몰레큘러·클로닝 제 2 판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, DNA Cloning 1 : Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995) 등의 실험서에 기재되어 있는 방법에 따라 실시할 수 있다. 혼성화 가능한 DNA 로서 구체적으로는 BLAST [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] 또는 FASTA [Methods in Enzymology, 183, 63-98 (1990)] 등을 사용하여 계산하였을 때에, 서열번호 2 로 표시되는 염기서열과 적어도 80 % 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 95 % 이상의 상동성을 갖는 DNA 를 들 수 있다.

(4) DNA 가 남조 (Cyanobacteria) 에 속하는 미생물 유래의 DNA 인 상기 (2) 또는 (3) 기재의 DNA.

(5) 남조에 속하는 미생물 유래의 DNA 가 시네코시스티스 (Synechocystis) 속에 속하는 미생물 유래의 DNA 인 상기 (2) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 DNA.

(6) 상기 (2) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 DNA 에서 선택되는 DNA 를 벡터에 삽입하여 얻어지는 재조합 DNA.

(7) 상기 (6) 기재의 재조합 DNA 를 숙주세포에 도입하여 얻어지는 형질전환체.

(8) 형질전환체가 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)인 상기 (7) 기재의 형질전환체.

(9) 상기 (7) 또는 (8) 기재의 형질전환체를 배지에서 배양하여 배양물 중에 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 단백질을 생성축적시키고, 상기 배양물로부터 상기 단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 단백질의 제조방법.

(10) 상기 (7) 또는 (8) 기재의 형질전환체의 배양액 또는 이 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하고, 이 효소원 및 N-아세틸글루코사민을 수성매체 중에 존재시켜 이 수성매체 중에서 N-아세틸만노사민을 생성축적시키고, 이 수성매체 중에서 N-아세틸만노사민을 채취하는 것을 특징으로 하는 N-아세틸만노사민의 제조법.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

[1] 본 발명의 DNA 의 제조

(1) 데이터베이스상에서의 유전자의 특정

시네코시스티스 sp. (PCC6803) 의 게놈은 모두 결정되어 있고 [DNA Research, 3, 109 (1996), Nucleic Acids Research, 26, 63 (1998)], CyanoBase (http://www.kazusa.or.jp/cyano/) 등의 데이터베이스에 의해 상동성 검색이 가능하다.

상동성 검색에 사용하는 Query 로는 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 유전자의 서열이라면 어떠한 것도 사용할 수 있지만, 구체적으로는 돼지 유래의 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제의 아미노산 서열 [J. Biol. Chem., 271, 16294 (1996)] 등을 들 수 있다.

검색방법은 이용할 수 있는 것은 어떠한 방법이라도 무관하지만, Genbank 또는 CyanoBase 에서의 호몰로지 검색 등을 예시할 수 있다.

(2) 본 발명의 DNA 의 제조

본 발명의 DNA 는 남조에 속하는 미생물로부터 제조할 수 있다. 남조에 속하는 미생물로는 예컨대 시네코시스티스를 들 수 있고, 구체적으로는 시네코시스티스 sp. PCC6803 주 등을 들 수 있다.

남조에 속하는 미생물을 공지의 방법 [예컨대 J. Gen. Microbiol., 111, 1 (1979)] 에 따라 배양한다.

배양후, 공지의 방법 [예컨대 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)] 에 따라 이 미생물의 염색체 DNA 를 단리정제한다.

본 발명의 DNA 를 함유하는 단편의 취득은 상기 (1) 에서 특정된 게놈의 염기서열에 의거한 프라이머를 제조하고, 게놈 DNA 를 주형으로 하여 PCR 법 (PCR Protocols, Academic Press (1990)] 에 따라 행할 수 있다.

또한 게놈의 염기서열에 의거하여 설계된 합성 DNA 를 프로브로 한 혼성화법 등에 의해 목적으로 하는 DNA 를 취득할 수도 있다.

취득한 DNA 를 그대로, 또는 적당한 제한효소 등으로 절단후, 통상적인 방법에 따라 벡터에 삽입하여 통상 사용되는 염기서열해석방법, 예컨대 디데옥시법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)] 또는 373A·DNA 시퀀서 (퍼킨·엘머사 제조) 등의 염기서열분석장치를 사용하여 분석함으로써 그 DNA 의 염기서열을 결정할 수 있다.

그 DNA 를 삽입하는 벡터로는 pBluescript KS (＋) (스트라타진사 제조, pDIRECT[Nucleic Acids Research, 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK (＋) (스트라타진사 제조), pT7Blue (노바젠사 제조), pCR II (인비트로젠사 제조), pCR-TRAP (진헌터사 제조) 및 pNoTAT7 (5 프라임 →3 프라임사 제조) 등을 들 수 있다.

상기와 같은 방법으로 취득된 신규한 염기서열을 갖는 DNA 로서 예컨대 서열번호 2 로 표시되는 서열을 갖는 DNA 등을 들 수 있다.

서열번호 2 로 표시되는 서열을 갖는 DNA 를 보유하는 플라스미드를 보유하는 대장균으로서 예컨대 에스케리키아 콜라이 NM522/pYP16 을 들 수 있다.

또한 결정된 DNA 의 염기서열에 의거하여 퍼셉티브·바이오시스템즈사 제조 8905 형 DNA 합성장치 등을 사용하여 화학합성함으로써 목적으로 하는 DNA 를 제조할 수도 있다.

대장균으로는 예컨대 에스케리키아 콜라이 XL1-Blue, 에스케리키아 콜라이 XL2-Blue, 에스케리키아 콜라이 DH1, 에스케리키아 콜라이 MC1000, 에스케리키아 콜라이 KY3276, 에스케리키아 콜라이 W1485, 에스케리키아 콜라이 JM109, 에스케리키아 콜라이 HB101, 에스케리키아 콜라이 No.49, 에스케리키아 콜라이 W3110, 에스케리키아 콜라이 NY49, 에스케리키아 콜라이 MP347, 에스케리키아 콜라이 NM522 등을 들 수 있다.

재조합 DNA 의 도입방법으로는 상기 숙주세포에 DNA 를 도입하는 방법이라면 어떠한 방법도 이용할 수 있고, 예컨대 칼슘이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], 프로토플라스트법 (일본 공개특허공보 소63-2483942 호), 전기천공법 [Nucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)] 등을 들 수 있다.

[2] 본 발명의 단백질의 제조

본 발명의 단백질은 몰레큘러·클로닝 제 2 판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 방법 등을 이용하여 예컨대 다음과 같은 방법으로, 상기 [1] 에 기재된 방법에 따라 취득한 본 발명의 DNA 를 숙주세포 중에서 발현시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 DNA 를 기초로 하여 필요에 따라 이 단백질을 코딩하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 제조한다. 또한 이 단백질을 코딩하는 부분의 염기서열을 숙주의 발현에 최적인 코돈이 되도록 염기를 치환함으로써 이 단백질의 생산율을 향상시킬 수 있다.

이 DNA 단편을 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 제작한다.

이 재조합 벡터를 이 발현 벡터에 적합한 숙주세포에 도입함으로써 본 발명의 단백질을 생산하는 형질전환체를 얻을 수 있다.

숙주세포로는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포 등, 식물세포 등, 목적으로하는 유전자를 발현할 수 있는 것이라면 어떠한 것도 사용할 수 있다.

발현 벡터로는 상기 숙주세포에 있어서 자립복제가능 내지는 염색체 안으로의 삽입이 가능하며, 본 발명의 DNA 를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.

세균 등의 원핵생물을 숙주세포로서 사용하는 경우에는 본 발명의 단백질 유전자 발현 벡터는 원핵생물중에서 자립복제가능함과 동시에 프로모터, 리보솜 결합서열, 본 발명의 DNA, 전사종결서열로 구성된 재조합 DNA 인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 포함될 수도 있다.

발현 벡터로는 pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (모두 베링거만하임사 제조), pKK233-2 (팔마시아사 제조), pGEX (팔마시아사 제조), pSE280 (인비트로젠사 제조), pGEMEX-1 (프로메가사 제조), pQE-8 (키아겐사 제조), pET-3 (노바젠사 제조), pKYP10 (일본 공개특허공보 소58-110600 호), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)], pBluescriptII SK＋(스트라타진사 제조), pBluescript II SK(－) (스트라타진사 제조), pTrS30 [대장균 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407) 으로부터 제조], pTrS32 [대장균 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408) 으로부터 제조], pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (타카라슈조사 제조), pUC118 (타카라슈조사 제조), pPA1 (일본 공개특허공보 소63-233798 호), pPAC31 (WO98/12343) 등을 예시할 수 있다.

프로모터로는 대장균 등의 숙주세포 중에서 발현할 수 있는 것이라면 어떠한것이라도 좋다. 예컨대 trp 프로모터 (P trp), lac 프로모터 (P lac), P_L프로모터, P_R프로모터, P_SE프로모터 등의 대장균이나 파지 등에서 유래하는 프로모터, SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다. 또한 Ptrp 를 2 개 직렬시킨 프로모터 (Ptrp x2), tac 프로모터, lacT7 프로모터, letI 프로모터와 같이 인위적으로 설계개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.

리보솜 결합서열인 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈의 사이를 적당한 거리 (예컨대 6 내지 18 염기) 로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 재조합 DNA 에 있어서는 본 발명의 DNA 의 발현에는 전사종결서열이 반드시 필요한 것은 아니지만, 구조유전자의 바로 아래에 전사종결서열을 배치하는 것이 바람직하다.

원핵생물로는 에스케리키아속, 세라티아속 (Serratia), 바실루스속 (Bacillus), 브레비박테륨속 (Brevibacterium), 코리네박테륨속 (Corynebacterium), 미크로박테륨속 (Microbacterium), 슈도모나스속 (Pseudomonas) 등에 속하는 미생물, 예컨대 에스케리키아 콜라이 XL1-Blue, 에스케리키아 콜라이 XL2-Blue, 에스케리키아 콜라이 DH1, 에스케리키아 콜라이 MC1000, 에스케리키아 콜라이 KY3276, 에스케리키아 콜라이 W1485, 에스케리키아 콜라이 JM109, 에스케리키아 콜라이 HB101, 에스케리키아 콜라이 No.49, 에스케리키아 콜라이 W3110, 에스케리키아 콜라이 NY49, 세라티아 피카리아 (Serratia ficaria),세라티아 폰티콜라 (Serratia fonticola), 세라티아 리쿠에파시엔스 (Serratia liquefaciens), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스 아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 브레비박테륨 임마리오필륨 (Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테륨 사카로리티쿰 (Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 코리네박테륨 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테륨 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테륨 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC14067, 코리네박테륨 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13869, 코리네박테륨 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 미크로박테륨 암모니아필룸 (Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354, 슈도모나스 (Pseudomonas) sp. D-0110 등을 들 수 있다.

재조합 DNA 의 도입방법으로는 상기 숙주세포에 DNA 를 도입하는 방법이라면 어떠한 방법도 사용할 수 있고, 예컨대 칼슘이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], 프로토플라스트법 (일본 공개특허공보 소63-248394 호), 전기천공법 [Nucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)] 등을 들 수 있다.

효모균주를 숙주세포로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서 예컨대 YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 등을 사용할 수 있다.

프로모터로는 효모균주 중에서 발현할 수 있는 것이라면 어떠한 것을 사용해도 되고, 예컨대 PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트쇼크폴리펩티드프로모터, MFα1 프로모터, CUP1 프로모터 등의 프로모터를 들 수 있다.

숙주세포로는 사카로마이세스속, 시조사카로마이세스속, 클루이베로미세스속, 트리코스포론속, 시와니오미세스속, 피치아속, 캔디다속 등에 속하는 효모균주를 들 수 있고, 구체적으로는 Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, Pichia pastoris, Candida utilis 등을 들 수 있다.

재조합 DNA 의 도입방법으로는 효모에 DNA 를 도입하는 방법이라면 어떠한 방법도 사용할 수 있고, 예컨대 전기천공법 [Methods in Enzymol., 194, 182 (1990)], 스페로프라스트법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)], 아세트산 리튬법 [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)] 등을 들 수 있다.

동물세포를 숙주로 사용하는 경우에는 발현 벡터로서 예컨대 pcDNAI, pcDM8 (후나코시사에서 시판), pAGE107 (일본 공개특허공보 평3-22979 호), pAS3-3 (일본 공개특허공보 평2-227075 호), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI/Amp (인비트로젠사 제조), pREP4 (인비트로젠사 제조), pAGE103 [J. Biochem, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pAMo, pAMoA 등을 사용할 수 있다.

프로모터로는 동물세포 중에서 발현할 수 있는 것이라면 어떠한 것도 사용할 수 있고, 예컨대 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 의 IE (immediate early) 유전자의프로모터, SV40 의 초기 프로모터 또는 메탈로티오네인의 프로모터, 레트로 바이러스의 프로모터, 히트쇼크 프로모터, SRα프로모터 등을 들 수 있다. 또한 인간 CMV 의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.

숙주세포로는 마우스·골수종 세포, 래트·골수종 세포, 마우스·하이브리도마 세포, 인간의 세포인 나말바 (Namalwa) 세포 또는 Namalwa KJM-1 세포, 인간 태아 신장 세포, 인간 백혈병 세포, 아프리카 녹색원숭이 신장 세포, 차이니즈·햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637 (일본 공개특허공보 소63-299 호) 등을 들 수 있다.

마우스·골수종 세포로는 SP2/0, NSO 등, 래트·골수종 세포로는 YB2/O 등, 인간 태아 신장 세포로는 HEK293 (ATCC : CRL-1573), 293 등, 인간 백혈병 세포로는 BALL-1 등, 아프리카 녹색원숭이 신장 세포로는 COS-1, COS-7 등을 들 수 있다.

재조합 DNA 의 도입방법으로는 동물세포에 DNA 를 도입하는 방법이라면 어떠한 방법도 사용할 수 있고, 예컨대 전기천공법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], 인산칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075 호), 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)], Virology, 52, 456 (1973) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

곤충세포를 숙주로서 사용하는 경우에는 예컨대 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992), 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, Molecular Biology, A Laboratory Manual, Bio/Technology, 6, 47 (1988) 등에 기재된 방법에 따라 단백질을 발현시킬 수 있다.

즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큘로 바이러스를 곤충세포에 공동도입하여 곤충세포배양 상청 중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 다시 재조합 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 단백질을 발현시킬 수 있다.

이 방법에서 사용되는 유전자 도입 벡터로는 예컨대 pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (모두 인비트로젠사 제조) 등을 들 수 있다.

바큘로 바이러스로는 예컨대 밤나방과 곤충을 감염시키는 바이러스인 오토그라파·캘리포니카·누클리어·폴리헤드로시스·바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 사용할 수 있다.

곤충세포로는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 의 난소세포, 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni) 의 난소세포, 누에 난소 유래의 배양세포 등을 사용할 수 있다.

스포도프테라 프루기페르다 의 난소세포로는 Sf9, Sf21 (바큘로 바이러스·익스프렉션·벡터즈 어·래버러토리·매뉴얼) 등, 트리코플루시아 니 의 난소세포로는 High 5, BTI-TN-5B1-4 (인비트로젠사 제조) 등, 누에 난소 유래의 배양세포로는 봄빅스 모리 (Bombyx mori) N4 등을 들 수 있다.

재조합 바이러스를 제조하기 위한 곤충세포로의 상기 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 바큘로 바이러스의 공도입방법으로는 예컨대 인산칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075 호), 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)] 등을 들 수 있다.

식물세포를 숙주세포로 사용하는 경우에는 발현벡터로서 예컨대 Ti 플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.

프로모터로는 식물세포 중에서 발현할 수 있는 것이라면 어떠한 것을 사용해도 되고, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 의 35S 프로모터, 벼 액틴 1 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주세포로는 담배, 감자, 토마토, 당근, 대두, 유채, 알팔파, 벼, 밀, 보리 등의 식물세포 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입방법으로는 식물세포에 DNA 를 도입하는 방법이라면 어떠한 방법도 사용할 수 있고, 예컨대 아그로박테륨 (Agrobacterium) (일본 공개특허공보 소59-140885 호, 일본 공개특허공보 소60-70080 호, WO94/00977 호), 전기천공법 (일본 공개특허공보 소60-251887 호), 파티클 건 (유전자 총) 을 사용하는 방법 (일본 특허 제 2606856 호, 일본 특허 제 2517813 호) 등을 들 수 있다.

유전자의 발현방법으로는 직접 발현 이외에 몰레큘러·클로닝 제 2 판에 기재되어 있는 방법 등에 따라 분비생산, 융합단백질 발현 등을 수행할 수 있다.

효모, 동물세포 또는 곤충세포에 의해 발현시킨 경우에는 당 또는 당쇄가 부가된 단백질을 얻을 수 있다.

이상과 같은 방법으로 얻어지는 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 본 발명의 단백질을 생성축적시키고, 이 배양물로부터 채취함으로써 본 발명의 단백질을 제조할 수 있다.

본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다.

대장균 등의 원핵생물 또는 효모 등의 진핵생물을 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로는 이 생물이 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질전환체의 배양을 효율적으로 수행할 수 있는 배지라면 천연배지, 합성배지의 어느 것을 사용해도 된다.

탄소원으로는 이 생물이 자화할 수 있는 것이라면 되고, 글루코오스, 프룩토오스, 슈크로오스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 등을 사용할 수 있다.

질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 기타 질소함유 화합물, 및 펩톤, 육 엑기스, 효모 엑기스, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 각종 발효균체, 및 그의 소화물 등을 사용할 수 있다.

무기염으로는 인산 제 1 칼륨, 인산 제 2 칼륨, 인산 마그네슘, 황산 마그네슘, 염화나트륨, 황산 제 1 철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상 진탕배양 또는 심부통기교반배양 등의 호기적 조건하에서 실시한다. 배양온도는 15 내지 40 ℃ 가 좋고, 배양시간은 통상 5 시간 내지 7 일간이다. 배양중 pH 는 3.0 내지 9.0 으로 유지한다. pH 의 조정은 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 실시한다.

또한 배양중 필요하다면 암피실린 또는 테트라사이클린 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예컨대 lac 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.

동물세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로는 일반적으로 사용되고 있는 RPMI 1640 배지 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle 의 MEM 배지 [Science, 122, 501 (1952)], DMEM 배지 [Virology, 8, 396 (1959)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상 pH 6 내지 8, 25 내지 40 ℃, 5 % CO₂존재하 등의 조건하에서 1 내지 7 일간 실시한다.

또한 배양 중 필요하다면 카나마이신, 페니실린, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

곤충세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로는 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지 [파민젠사 제조], Sf-900 II SFM 배지 (라이프·테크놀러지즈사 제조), ExCell400, ExCell405 [모두 JRH 바이오사이언시즈사 제조], Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상 pH 6 내지 7, 25 내지 30 ℃ 등의 조건하에서 1 내지 5 일간 실시한다.

또한 배양중 필요하다면 겐타마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

식물세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체는 세포로서, 또는 식물의 세포나 기관에 분화시켜 배양할 수 있다. 이 형질전환체를 배양하는 배지로는 일반적으로 사용되고 있는 무라시게·앤드·스쿠그 (MS) 배지, 화이트 (White) 배지, 또는 이들 배지에 옥신, 사이토카이닌 등, 식물호르몬을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상 pH 5 내지 9, 20 내지 40 ℃ 의 조건하에서 3 내지 60 일간 실시한다.

또한 배양중 필요하다면 카나마이신, 하이그로마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

상기한 바와 같이 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 를 삽입한 재조합체 벡터를 보유하는 미생물, 동물세포, 또는 식물세포 유래의 형질전환체를 통상의 배양방법에 따라 배양하고, 이 단백질을 생성축적시키고, 이 배양물로부터 이 단백질을 채취함으로써 이 단백질을 제조할 수 있다.

본 발명의 단백질의 생산방법으로는 숙주세포내에 생산시키는 방법, 숙주세포 밖으로 분비시키는 방법, 또는 숙주세포외막상에 생산시키는 방법이 있고, 사용하는 숙주세포나, 생산시키는 단백질의 구조를 변경함으로써 이 방법을 선택할 수 있다.

본 발명의 단백질이 숙주세포내 또는 숙주세포외막상에 생산되는 경우, 폴슨 등의 방법 [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], 로우 등의 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], 또는 일본 공개특허공보 평05-336963 호, WO94/23021 호 등에 기재된 방법을 준용함으로써, 이 단백질을 숙주세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.

즉, 유전자 재조합 수법을 이용하여 본 발명의 단백질의 활성 부위를 포함하는 단백질의 바로 앞에 시그널 펩티드를 부가한 형태로 발현시킴으로써 본 발명의 단백질을 숙주세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.

또한 일본 공개특허공보 평2-227075 호에 기재되어 있는 방법에 따라 디히드로 엽산 환원 효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수도 있다.

또한 유전자 도입 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써 유전자가 도입된 동물개체 (트랜스제닉 비인간 동물) 또는 식물개체 (트랜스제닉 식물) 를 조성(造成)하고, 이들 개체를 이용하여 본 발명의 단백질을 제조할 수도 있다.

형질전환체가 동물개체 또는 식물개체인 경우에는 통상의 방법에 따라 사육 또는 재배하여 이 단백질을 생성축적시키고, 이 동물개체 또는 식물개체로부터 이 단백질을 채취함으로써 이 단백질을 제조할 수 있다.

동물개체를 사용하여 본 발명의 단백질을 제조하는 방법으로는 예컨대 공지된 방법 [American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996), American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996), Bio/Technology, 9, 830 (1991)] 에 따라 유전자를 도입하여 조성한 동물 중에 본 발명의 단백질을 생산하는 방법을 들 수 있다.

동물개체의 경우에는 예컨대 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 비인간동물을 사육하여 이 단백질을 이 동물 중에 생성·축적시키고, 이 동물중에서 이 단백질을 채취함으로써 이 단백질을 제조할 수 있다. 이 동물 중의 생성·축적장소로는 예컨대 이 동물의 밀크 (일본 공개특허공보 소63-309192 호), 난(卵) 등을 들 수 있다. 이 때에 사용되는 프로모터로는 동물에서 발현할 수 있는 것이라면 어떤 것도 사용할 수 있지만, 예컨대 유선세포 특이적인 프로모터인 α카세인 프로모터, β카세인 프로모터, β락토 글로불린 프로모터, 훼이 산성 프로테인 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

식물개체를 사용하여 본 발명의 단백질을 제조하는 방법으로는 예컨대 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지의 방법 [조직배양, 20 (1994), 조직배양, 21 (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)] 에 따라 재배하여 이 단백질을 이 식물 중에 생성·축적시키고, 이 식물 중에서 이 단백질을 채취함으로써 이 단백질을 생산하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 형질전환체에 의해 제조된 단백질을 단리·정제하는 방법으로는 통상의 효소의 단리, 정제법을 사용할 수 있다.

예컨대 본 발명의 단백질이 세포내에 용해상태로 발현된 경우에는 배양종료후, 세포를 원심분리를 통해 회수하고, 수계 완충액에 현탁후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤가우린호모게나이저, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 얻는다.

이 무세포 추출액을 원심분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 효소의 단리정제법, 즉, 용매추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석출법, 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸 (DEAE)-세파로오스, DIAION HPA-75 (미쯔비시가세이사 제조) 등 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-세파로오스 FF (Pharmacia 사 제조) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자 체를 사용한 겔 여과법, 친화 크로마토그래피법, 크로마토 포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 단독 또는 조합하여 사용하여 정제생성물을 얻을 수 있다.

또한 이 단백질이 세포내에 불용체를 형성하여 발현된 경우에는 동일하게 세포를 회수한 후 파쇄하고, 원심분리를 실시함으로써 얻어진 침전 분획으로부터, 통상의 방법으로 이 단백질을 회수한 후, 이 단백질의 불용체를 단백질 변성제로 가용화시킨다.

이 가용화액을, 단백질 변성제를 포함하지 않거나, 단백질 변성제의 농도가 단백질을 변성시키지 않는 정도로 희박한 용액에 희석, 또는 투석시키고, 이 단백질을 정상인 입체구조로 구성시킨 후, 상기와 동일한 단리정제법으로 정제 생성물을 얻을 수 있다.

본 발명의 단백질 또는 그의 당수식체 등의 유도체가 세포 밖으로 분비되는 경우에는 배양상청에서 이 단백질 또는 그의 당쇄부가체 등의 유도체를 회수할 수 있다.

즉, 이 배양물을 상기와 동일한 원심분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 가용성 분획을 취득하고, 이 가용성 분획으로부터, 상기와 동일한 단리정제법을 사용함으로써 정제생성물을 얻을 수 있다.

이같은 방법으로 취득되는 단백질로서 예컨대 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다.

또한 본 발명의 폴리펩티드를 다른 단백질과의 융합 단백질로서 생산하고, 융합한 단백질에 친화성을 갖는 물질을 사용한 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수도 있다. 예컨대 로우 등의 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], 일본 공개특허공보 평05-336963 호, WO94/23021 호에 기재된 방법에 따라 본 발명의 폴리펩티드를 단백질 A 와의 융합 단백질로서 생산하고, 면역 글로불린 G 를 사용하는 친화 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 폴리펩티드를 Flag 펩티드와의 융합 단백질로서 생산하고, 항 Flag 항체를 사용하는 친화 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)]. 또한 이 폴리펩티드 자신에 대한 항체를 사용한 친화 크로마토그래피에 의해 정제할 수도 있다.

상기에서 취득된 단백질의 아미노산 정보를 기초로, Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학합성법에 의해 본 발명의 단백질을 제조할 수 있다. 또한 Advanced ChemTech 사, 퍼킨·엘머사, Pharmacia 사, Protein Technology Instrument 사, Synthecell-Vega 사, PerSeptive 사, 시마즈세이사꾸쇼 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학합성할 수도 있다.

[3] N-아세틸만노사민의 제조

상기 [2] 기재의 배양에 의해 얻어진 형질전환체의 배양액 및 이 배양액의 처리물을 효소원으로 사용하여 수성매체 중에서 N-아세틸만노사민을 제조할 수 있다.

배양액의 처리물로는 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분리하여 얻어지는 균체, 이 균체의 건조물, 이 균체의 동결건조물, 이 균체의 계면활성제 처리물, 이 균체의 초음파처리물, 이 균체의 기계적 마쇄처리물, 이 균체의 용매처리물, 이 균체의 효소처리물, 이 균체의 단백질 분획물, 이 균체의 고정화물 또는 이 균체에서 추출하여 얻어지는 효소생성물 등을 들 수 있다.

N-아세틸만노사민의 생성에 있어서 사용되는 효소원은 37 ℃ 에서 1 분 동안에 1 m㏖의 N-아세틸만노사민을 생성할 수 있는 활성을 1 단위 (U) 로 하여 1 mU/ℓ내지 1,000 U/ℓ이고, 바람직하게는 10 mU/ℓ내지 100 U/ℓ의 농도로 사용한다.

N-아세틸만노사민의 생성에 있어서 사용되는 수성매체로는 물, 인산염, 탄산염, 아세트산염, 붕산염, 시트르산염, 트리스 등의 완충액, 메탄올, 에탄올 등의알코올류, 아세트산에틸 등의 에스테르류, 아세톤 등의 케톤류, 아세트아미드 등의 아미드류 등을 들 수 있다. 또한 효소원으로 사용한 미생물의 배양액을 수성매체로 사용할 수 있다.

N-아세틸만노사민의 생성에 있어서, 필요하다면 계면활성제 또는 유기용매를 첨가해도 된다. 계면활성제로는 폴리옥시에틸렌·옥타데실아민 (예컨대 나이민 S-215, 닛뽕유시사 제조) 등의 비이온 계면활성제, 세틸트리메틸암모늄·브로마이드 또는 알킬디메틸·벤질암모늄클로라이드 (예컨대 카티온 F2-40E, 닛뽕유시사 제조) 등의 카티온계 계면활성제, 라우로일·사르코시네이트 등의 음이온계 계면활성제, 알킬디메틸아민 (예컨대 3 급 아민 FB, 닛뽕유시사 제조) 등의 3 급 아민류 등, N-아세틸만노사민의 생성을 촉진하는 것이라면 어떤 것이라도 좋으며, 1 종 또는 수종을 혼합하여 사용할 수도 있다. 계면활성제는 통상 0.1 내지 50 g/ℓ의 농도로 사용된다. 유기용제로는 자일렌, 톨루엔, 지방족 알코올, 아세톤, 아세트산 에틸 등을 들 수 있고, 통상 0.1 내지 50 ㎖/ℓ의 농도로 사용된다.

N-아세틸만노사민의 생성반응은 수성매체 중, pH 5 내지 10, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 20 내지 50 ℃ 의 조건에서 1 내지 96 시간 수행한다. 이 생성반응에 있어서, 필요하다면 ATP, MgCl₂등의 무기염 등을 첨가할 수 있다.

수성매체 중에 생성한 N-아세틸만노사민의 정량은 Dionex 사 제조의 당분석장치 등을 이용하여 실시할 수 있다 [Anal. Biochem., 189, 151 (1990)].

반응액 중에 생성한 N-아세틸만노사민의 채취는 활성탄이나 이온교환수지 등을 이용하는 통상의 방법으로 실시할 수 있다.

본 발명은 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 단백질, 이 단백질을 코딩하는 DNA, 이 DNA 를 함유하는 재조합 DNA, 이 재조합 DNA 를 보유하는 형질전환체, 이 형질전환체를 사용한 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제의 제조법, 및 이 형질전환체를 사용한 N-아세틸만노사민의 제조법에 관한 것이다. N-아세틸만노사민은 N-아세틸노이라민산 생합성의 전구체로서 중요한 화합물이다.

도 1 은 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 발현 플라스미드 pYP16 의 조성공정을 나타낸다.

Amp^r: 암피실린 내성유전자

P_L: P_L프로모터

cI857 : cI857 리프레서

slr1975 : N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 유전자

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하, 본 발명의 실시예를 나타내겠지만 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

데이터베이스상에서의 상동성 검색

돼지 유래의 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제의 아미노산 서열 [J. Biol. Chem., 271, 16294 (1996)] 을 Query 로 하여 Genbank 의 Blast Search 및 시네코시스티스 sp. (PCC6803) 의 게놈 서열의 데이터베이스인 CyanoBase (http://www.kazusa.or.jp/cyano/) 에 있어서 상동검색 (Similarity Search) 을 실시한다.

그 결과, 이 아미노산 서열은 서열번호 1 기재의 아미노산 서열 및 서열번호2 기재의 염기서열을 갖는 레닌 결합 단백질 이라는 기재가 있는 시네코시스티스 sp. (PCC6803) 유래의 서열 (slr1975) 과 높은 상동성을 나타냄이 판명되었다.

실시예 2

시네코시스티스 유래의 유전자 발현주의 조성

시네코시스티스 sp. (PCC6803) 를 J. Gen. Microbiol.,1111 (1979) 에 기재된 방법으로 배양한다.

배양후, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지에 기재된 방법에 따라 이 미생물의 염색체 DNA 를 단리정제한다.

퍼셉티브·바이오시스템즈사 제조 8905 형 DNA 합성기를 사용하여 합성한 서열번호 3 및 4 에 기재된 DNA 를 사용하여 실시예 1 에서 선택된 유전자를 포함하는 DNA 단편을 하기 방법으로 증폭한다.

상기 합성 DNA 를 프라이머로 사용하고, 시네코시스티스 sp. (PCC6803) 의 염색체 DNA 를 주형으로 하여 PCR 을 실시한다. PCR 은 염색체 DNA 0.1 ㎍, 프라이머 각 0.5 μ㏖/ℓ, Pfu DNA 폴리머라아제 (STRATAGENE 사 제조) 2.5 유닛, Pfu DNA 폴리머라아제용 ×10 완충액 (STRATAGENE 사 제조) 4 ㎕, 데옥시NTP 각 200 μ㏖/ℓ를 포함하는 반응액 40 ㎕ 를 사용하여 94 ℃ - 1 분, 42 ℃ - 2 분, 72 ℃ - 3 분의 공정을 30 회 반복함으로써 실시한다.

이 반응액의 1/10 의 양을 아가로스겔 전기영동하고, 목적의 단편이 증폭되어 있음을 확인후, 나머지 반응액과 등량의 TE [10 m㏖/ℓTris-HCl (pH 8.0), 1 m㏖/ℓEDTA] 포화 페놀 / 클로로포름 (1 vol / 1 vol) 을 첨가하여 혼합한다.

이 혼합액을 원심분리후, 얻어진 상층에 2 배 용량의 냉에탄올을 첨가하여 혼합하고, －80 ℃ 로 30 분간 방치한다. 이 방치액을 원심분리하여 DNA 의 침전을 얻는다.

이 DNA 의 침전을 20 ㎕ 의 TE 에 용해한다.

이 용해액 5 ㎕ 를 사용하여 DNA 를 제한효소 ClaI 및 BamHI 로 절단하고, 아가로스겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리한 후, 진클린 II 키트에 의해 1.0 kb 의 DNA 단편을 회수한다.

pPAC31 (WO98/12343) DNA 0.2 ㎍ 을 제한효소 ClaI 및 BamHI 로 절단후, 아가로스겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리하여 동일하게 5.5 kb 의 DNA 단편을 회수한다.

이 1.0 kb 및 5.5 kb 의 단편을 라이게이션 키트를 사용하여 16 ℃, 16 시간, 라이게이션 반응을 실시한다.

이 라이게이션 반응액을 사용하여 대장균 NM522 주를 전술한 공지의 방법에 따라 형질전환하고, 이 형질전환체를 암피실린 50 ㎍/㎖ 를 포함하는 LB 한천배지에 도포후, 30 ℃ 에서 하룻밤 배양한다.

생육된 형질전환체의 콜로니에서 전술한 공지의 방법에 따라 플라스미드를 추출하여 발현 플라스미드인 pYP16 을 얻는다. 이 플라스미드의 구조를 제한효소 절단에 의해 확인하였다 (도 1).

실시예 3

N-아세틸글루코사민의 생산

실시예 2 에서 얻은 에스케리키아 콜라이 NM522/pYP16 주를 암피실린 50 ㎍/㎖ 를 포함하는 LB 배지 8 ㎖ 가 들어 있는 대형시험관에 접종하여 28 ℃ 에서 17 시간 배양한다.

이 배양액을 암피실린 50 ㎍/㎖ 를 포함하는 LB 배지 8 ㎖ 가 들어 있는 대형시험관에 1 % 접종하여 30 ℃ 에서 4 시간 배양한 후, 40 ℃ 에서 3 시간 배양한다. 이 배양액을 원심분리하여 습균체를 취득한다. 이 습균체는 필요에 따라 －20 ℃ 에서 보존할 수 있으며, 사용전에 해동하여 사용할 수 있다.

최종농도 60 ㎎/㎖ 의 이 습균체, 100 m㏖/ℓ Tris-HCl (pH 7.4), 10 m㏖/ℓMgCl₂, 40 m㏖/ℓN-아세틸만노사민, 4 m㏖/ℓATP, 0.4 % 나이민 S-215 로 이루어지는 0.1 ㎖ 의 반응액 중, 37 ℃ 에서 2 시간 반응을 실시한다.

반응종료후, 반응생성물을 다이오넥스사 제조 당분석장치 (DX-500) 를 사용하여 분석하여 반응액 중에 13.7 m㏖/ℓ의 N-아세틸글루코사민이 생성축적되어 있음을 확인하였다.

벡터만을 포함하는 E. coli NM522/pPAC31 주에서는 N-아세틸글루코사민의 생성은 확인되지 않았다.

실시예 4

N-아세틸만노사민의 생산

실시예 2 에서 얻은 에스케리키아 콜라이 NM522/pYP16 주를 암피실린 50 ㎍/㎖ 를 포함하는 LB 배지 8 ㎖ 가 들어 있는 대형시험관에 접종하여 28 ℃ 에서 17시간 배양한다.

이 배양액을 암피실린 50 ㎍/㎖ 를 포함하는 LB 배지 8 ㎖ 가 들어 있는 대형시험관에 1 % 접종하여 28 ℃ 에서 4 시간 배양한 후, 40 ℃ 에서 3 시간 배양한다. 이 배양액을 원심분리하여 습균체를 취득한다. 이 습균체는 필요에 따라 －20 ℃ 에서 보존할 수 있으며, 사용전에 해동하여 사용할 수 있다.

최종농도 60 ㎎/㎖ 의 이 습균체, 100 m㏖/ℓ Tris-HCl (pH 7.4), 10 m㏖/ℓMgCl₂, 500 m㏖/ℓN-아세틸글루코사민, 4 m㏖/ℓATP, 0.4 % 나이민 S-215 로 이루어지는 0.1 ㎖ 의 반응액 중, 37 ℃ 에서 2 시간 반응을 실시한다.

반응종료후, 반응생성물을 다이오넥스사 제조 당분석장치 (DX-500) 를 사용하여 분석하여 반응액 중에 70 m㏖/ℓ의 N-아세틸만노사민이 생성축적되어 있음을 확인하였다.

본 발명에 의해 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제를 유전자 재조합 수법으로 대량으로 생산할 수 있게 된다. 또한 이 효소를 사용함으로써 효율적으로 N-아세틸만노사민을 제조할 수 있다.

서열표 프리텍스트

서열번호 3 : 합성 DNA

서열번호 4 : 합성 DNA

Claims

이하의 (a) 또는 (b) 의 단백질 :

(a) 서열번호 1 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 또는

(b) (a) 의 단백질이 갖는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 단백질.
제 1 항에 기재된 단백질을 코딩하는 DNA.
이하의 (a) 또는 (b) 의 DNA:

(a) 서열번호 2 기재의 염기서열을 갖는 DNA, 또는

(b) (a) 의 DNA 와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, 또한 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, DNA 가 남조 (Cyanobacteria) 에 속하는 미생물 유래의 DNA 인 DNA.
제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 남조에 속하는 미생물 유래의 DNA 가 시네코시스티스 (Synechocystis) 속에 속하는 미생물 유래의 DNA 인DNA.
제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 에서 선택되는 DNA 를 벡터에 삽입하여 얻어지는 재조합 DNA.
제 6 항에 기재된 재조합 DNA 를 숙주세포에 도입하여 얻어지는 형질전환체.
제 7 항에 있어서, 숙주세포가 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)인 형질전환체.
제 7 항 또는 제 8 항에 기재된 형질전환체를 배지에서 배양하여 배양물 중에 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 단백질을 생성축적시키고, 상기 배양물로부터 상기 단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 단백질의 제조방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 기재된 형질전환체의 배양액 또는 이 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하여, 이 효소원 및 N-아세틸글루코사민을 수성매체 중에 존재시켜 상기 수성매체 중에서 N-아세틸만노사민을 생성축적시키고, 상기 수성매체 중에서 N-아세틸만노사민을 채취하는 것을 특징으로 하는 N-아세틸만노사민의 제조법.