CN1226417C

CN1226417C - 用n－乙酰葡糖胺2－差向异构酶生产n－乙酰甘露糖胺的方法

Info

Publication number: CN1226417C
Application number: CNB008035814A
Authority: CN
Inventors: 小泉聪司; 田畑和彦; 远藤徹夫; 尾﨑明夫
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1999-02-09
Filing date: 2000-02-09
Publication date: 2005-11-09
Anticipated expiration: 2020-02-09
Also published as: EP1154018A1; AU2459300A; US20030157659A1; WO2000047730A1; CN1340100A; KR20010102019A; EP1154018A4; JP3939096B2; US6946281B2

Abstract

本发明提供具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的新型蛋白质、编码该蛋白质的DNA、含有该DNA的重组载体、将该重组载体导入宿主细胞得到转化体、使用该转化体制备上述蛋白质或N-乙酰甘露糖胺的方法。

Description

用N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶生产N-乙酰甘露糖胺的方法

技术领域

本发明涉及具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的蛋白质、编码该蛋白质的DNA、含有该DNA的重组DNA、带有该重组DNA的转化体、使用该转化体的N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的制备方法以及使用该转化体的N-乙酰甘露糖胺的制备方法。N-乙酰甘露糖胺作为N-乙酰神经氨酸生物合成的前体是重要的化合物。

背景技术

关于N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶，已知存在于猪或大鼠中，并对来源于猪的酶考察了其性质〔Biochemistry，17，3363(1970)〕。另外，关于其基因，已获得了来源于猪的基因〔J.Biol，Chem.，271，16294(1996)〕。但是，迄今为止对于其在微生物中的活性尚不了解。

在1种蓝藻——集胞藻属(Synechocystis sp.)(PCC6803)中，其基因组的所有序列已经被确定〔DNA Research，3：109(1996)；NucleicAcids Research，26，63(1998)〕，但是并没有确定哪个是N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶基因。

发明公开

本发明的目的在于提供具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的蛋白质、编码该蛋白质的DNA、使用该DNA制备具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的蛋白质的方法、以及使用该蛋白质制备N-乙酰甘露糖胺的方法。

本发明人为了解决上述课题进行了悉心的研究，从已经确定了基因组DNA所有序列的集胞藻属(Synechocystis sp.)(PCC6803)的序列信息中，检索与来源于猪的N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的氨基酸序列具有同源性的序列，结果首次从微生物发现了迄今为止尚未确定的编码新型N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的DNA，通过获得该DNA，完成了本发明。

也就是说，本发明涉及下述(1)～(10)。

(1)下述(a)或(b)的蛋白质：

(a)序列号1记载的氨基酸序列构成的蛋白质。

(b)由(a)的蛋白质具有的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个以上氨基酸得到的氨基酸序列构成，并且具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的蛋白质。

上述蛋白质含有在蛋白质(a)的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个以上氨基酸得到的氨基酸序列，并且具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的蛋白质可以采用Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor Larboratory Press(1989)(以下简称为Molecular Cloning第2版)、Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons(1987-1997)(以下简称为Current Protocols in Molecular Biology)、Nucleic AcidsResearch，10：6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、Nucleic Acids Research，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，488(1985)等记载的部位特异性变异导入法，例如可以通过将部位特异性变异导入编码具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白质的DNA获得。

缺失、取代或添加的氨基酸数没有特别的限定，是按照上述部位特异性变异法等公知方法可以缺失、取代或添加的程度内的数目，1个至数十个，优选1～20个，更优选1～10个，进一步优选1～5个。

(2)编码上述(1)记载的蛋白质的DNA。

(3)下述(a)或(b)的DNA：

(a)具有序列号2记载的碱基序列的DNA。

(b)在严格性的条件下与(a)的DNA杂交，并且编码具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的蛋白质的DNA。

上述“在严格性条件下杂交的DNA”是指以具有序列号2所示碱基序列的DNA作为探针，采用菌落杂交法、噬斑杂交法或Southern杂交法等得到的DNA，具体地说，可以使用固定有来源于菌落或噬斑的DNA的滤器，在0.7～1.0mol/l的氯化钠存在下，在65℃下进行杂交后，使用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成为150mmol/l氯化钠、15mmol/l枸橼酸钠)，在65℃的条件下洗涤滤器，可以得到能够鉴定的DNA。

杂交可以按照Molecular Cloning第2版、Current Protocols inMolecular Biology、DNA Cloning 1：Core Techniques，A PracticalApproach，Second Edition，Oxford University(1995)等实验书上记载的方法进行。作为可以杂交的DNA，具体例如使用BLAST〔J.Mol.Biol.，215：403(1990)〕或FASTA〔Methods in Enzymology，183：63-98(1990)〕等计算时，与序列号2表示的碱基序列至少具有80％以上的同源性的DNA，优选具有95％以上的同源性的DNA。

(4)根据上述(2)或(3)所述的DNA，DNA是来源于属于蓝藻(Cyanobacteria)的微生物的DNA。

(5)根据上述(2)～(4)中任意一项所述的DNA，来源于属于蓝藻的微生物的DNA是来源于属于集胞藻属(Synechocystis)的微生物的DNA。

(6)将从上述(2)～(5)中任意一项所述的DNA中选择的DNA***载体得到的重组DNA。

(7)将上述(6)所述的重组DNA引入宿主细胞得到的转化体。

(8)根据上述(7)所述的转化体，转化体是大肠埃希氏菌。

(9)具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的蛋白质的制备方法，其特征在于在培养基中培养上述(7)或(8)所述的转化体，在培养物中生成并蓄积具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的蛋白质，从该培养物收集该蛋白质。

(10)N-乙酰甘露糖胺的制备方法，其特征在于使用上述(7)或(8)所述的转化体的培养液或该培养液的处理物作为酶源，使该酶源和N-乙酰葡糖胺存在于水性介质中，在该水性介质中生成并蓄积N-乙酰甘露糖胺，从该水性介质中收集N-乙酰甘露糖胺。

以下详细说明本发明。

1〕本发明的DNA的制备

(1)在数据库上确定基因

集胞藻属(Synechocystis sp.)(PCC6803)的基因组已全部确定〔DNA Research，3：109(1996)；Nucleic Acids Research，26：36(1998)〕，可以根据CyanoBase(http：//www.kazusa.or.jp/cyano/)等数据库进行同源性检索。

作为同源性检索使用的Query，只要是N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶基因的序列，可以使用任何一种，具体地说例如来源于猪的N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的氨基酸序列〔J.Biol.Chem.，271：16294(1996)〕等。

检索方法可以是任何一种能够利用的方法，例如Genbank或Cyanobase上的同源检索等。

(2)制备本发明的DNA

本发明的DNA可以通过属于蓝藻的微生物制备。作为属于蓝藻的微生物，例如集胞藻属，具体例如集胞藻属(Synechocystis sp.)PCC6803株等。

按照公知的方法〔例如J.Gen.Microbiol.，111：1(1979)〕培养属于蓝藻的微生物。

培养后，按照公知的方法〔例如Current Protocols inMolecularBiology，John Wiley & Sons(1987-1997)〕分离精制该微生物的染色体DNA。

获得含有本发明DNA的片断可以基于上述(1)确定的基因组的碱基序列制备引物，以基因组DNA为模板，按照PCR法(PCR Protocols，Academic Press(1990))进行。

另外，按照以基于基因组的碱基序列设计的合成DNA作为探针的杂交法等，也可以获得所需的DNA。

按照常规方法将获得的DNA直接，或用适当的限制酶等切断后***载体，通过通常采用的碱基序列解析方法，例如二脱氧法〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74：5463(1997)〕或使用373A·DNA序列分析仪(Parkin Elmer公司生产)等碱基序列分析装置进行分析，可以确定该DNA的碱基序列。

作为***该DNA的载体，例如pBluescript KS(+)(Stradagene公司生产)、pDIRECT〔Nucleic Acids Research，18，6069(1990)〕、pCR-script Amp SK(+)(Stradagene公司生产)、pT7Blue(Nova gene公司生产)、pCR II(In vitro gene公司生产)、pCR-TRAP(Gene Hunter公司生产)和pNoTAT7(5Prime→3Prime公司生产)等。

如上所述获得的具有新型碱基序列的DNA例如具有序列号2所示序列的DNA等。

具有下述质粒的大肠菌，所述质粒带有具备序列号2所示序列的DNA，例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)NM522/pYP16。

而且，也可以基于已确定的DNA的碱基序列，使用PerceptiveBiosystems公司生产的8905型DNA合成装置等，通过化学合成制备所需的DNA。

大肠菌例如大肠埃希氏菌XL1-Blue、大肠埃希氏菌XL2-Blue、大肠埃希氏菌DH1、大肠埃希氏菌MC1000、大肠埃希氏菌KY3276、大肠埃希氏菌W1485、大肠埃希氏菌JM109、大肠埃希氏菌HB101、大肠埃希氏菌No.49、大肠埃希氏菌W3110、大肠埃希氏菌NY49、大肠埃希氏菌MP347、大肠埃希氏菌NM522等。

重组DNA的导入方法只要是将DNA导入上述宿主细胞的方法，可以采用任何一种，例如使用钙离子的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)〕、原生质法(特开昭63-248394)、电穿孔法〔NucleicAcids Research，16，6127(1988)〕等。

〔2〕本发明的蛋白质的制备

本发明的蛋白质可以采用Molecular Cloning第2版、CurrentProtocols in Molecular Biology等记载的方法等，例如按照下述方法，使按照上述〔1〕记载的方法获得的本发明DNA在宿主细胞中表达来制备。

以本发明的DNA为基础，必要时制备含有编码该蛋白质的部分的适当长度DNA片段。另外，可以通过取代碱基提高该蛋白质的生产率，使编码该蛋白质的部分碱基序列在宿主的表达中成为最适密码子。

通过将该DNA片段***适当表达载体的启动子的下游，制备重组载体。

通过将该重组载体导入适合该表达载体的宿主细胞，可以得到产生本发明蛋白质的转化体。

宿主细胞只要是细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞等、植物细胞等可以表达目的基因的宿主细胞，可以使用任何一种。

作为表达载体，可以使用上述宿主细胞中能够自我复制或能够***染色体中，并在能够复制本发明DNA的位置含有启动子的载体。

使用细菌等原核生物作为宿主细胞时，本发明的蛋白质基因表达载体优选能够在原核生物中自我复制，同时由启动子、微脂粒结合序列、本发明DNA、复制终止序列构成的重组DNA。也可以含有控制启动子的基因。

表达载体例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均由BoehringerMannhein公司生产)、pKK233-2(Pharmacia公司生产)、pGEX(Pharmacia公司生产)、pSE280(Invitrogen公司生产)、pGEMEX-1(Promega公司生产)、pQE-8(QIAGEN公司生产)、pET-3(Nova Gene公司生产)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200〔Agric.Biol.Chem.，48，699(1984)〕、pLSA1〔Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)〕、pGEL1〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，4306(1985)〕、pBluescript II SK+(Stratagene公司生产)、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司生产)、pTrS30〔由大肠菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备〕、pTrS32〔由大肠菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备〕、pUC19〔Gene，33，103，(1985)〕、pSTV28(宝酒造公司生产)、pUC118(宝酒造公司生产)、pPA1(特开昭63-233798)、pPAC31(WO98/12343)等。

启动子只要可以在大肠菌等宿主细胞中起作用，可以是任何一种。例如trp启动子(P trp)、lac启动子(P lac)、P_L启动子、P_R启动子、P_SE启动子等来源于大肠菌或噬菌体的启动子，SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。另外，也可以使用2个Ptrp串连得到的启动子(P trp×2)、tac启动子、lacT7启动子、let I启动子等人为设计改变的启动子等。

优选使用将微脂粒结合序列——Shine-Dalgarno序列与起始密码子之间调节至适当距离(例如6～18个碱基)的质粒。

在本发明的重组DNA中，复制终止序列对于本发明DNA的表达未必是必要的，但优选在结构基因之下设置复制终止序列。

原核生物如属于埃希氏杆菌属、沙雷氏菌属、杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属、假单胞菌属等的微生物，例如大肠埃希氏菌XL1-Blue、大肠埃希氏菌XL2-Blue、大肠埃希氏菌DH1、大肠埃希氏菌MC1000、大肠埃希氏菌KY3276、大肠埃希氏菌W1485、大肠埃希氏菌JM109、大肠埃希氏菌HB101、大肠埃希氏菌No.49、大肠埃希氏菌W3110、大肠埃希氏菌NY49、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC14067、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)D-0110等。

使用酵母菌株作为宿主细胞时，作为表达载体，可以使用例如YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。

启动子只要可以在酵母菌株中起作用，可以使用任何一种，例如PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal 10启动子、热冲击多肽启动子、MFα1启动子、CUP 1启动子等启动子。

宿主细胞例如属于糖酵母属、裂殖糖酵母属、克鲁维氏酵母属、丝孢酵母属、许旺氏酵母属、毕赤氏酵母属、假丝酵母属等，具体例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺氏酵母(Schwanniomyces alluvius)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)、产朊假丝酵母(Candida utilis)等。

重组DNA的导入方法只要是将DNA导入酵母的方法，可以使用任何一种，例如电穿孔法〔Methods in Enzymol.，194，182(1990)〕、原生质球法〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，4889(1984)〕、醋酸锂法〔J.Bacteriol.，153，163(1983)〕等。

使用动物细胞作为宿主时，作为表达载体，可以使用例如pcDNAI、pcDM8(由Funakoshi公司市售)、pAGE107(特开平3-22979)、pAS3-3(特开平2-227075)、pCDM8〔Nature，329，840(1987)〕、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司生产)、pREP4(Invitrogen公司生产)、pAGE103〔J.Biochem，101，1037(1987)〕、pAGE210、pAMo、pAMoA等。

启动子只要可以在动物细胞中起作用，可以使用任何一种，例如巨细胞病毒(CMV)的IE(immediate early)基因的启动子、SV40的初期启动子或金属硫蛋白的启动子、逆转录病毒的启动子、热冲击启动子、SRα启动子等。另外，人CMv的IE基因的增强子也可以与启动子同时使用。

宿主细胞例如小鼠骨髓瘤细胞、大鼠骨髓瘤细胞、小鼠杂交瘤细胞、人的细胞——Namalwa细胞或Namalwa KJM-1细胞、人胎儿肾脏细胞、人白血病细胞、非洲绿猴肾脏细胞、中国仓鼠的细胞——CHO细胞、HBT5637(特开昭63-299)等。

小鼠骨髓瘤细胞如SP2/0、NSO等，大鼠骨髓瘤细胞如YB2/0等，人胎儿肾脏细胞如HEK(ATCC：CRL-1573)、293等，人白血病细胞如BALL-1等，非洲绿猴肾脏细胞如COS-1、COS-7等。

重组DNA的导入方法只要是可以将DNA导入动物细胞的方法，可以采用任何一种，例如电穿孔法〔Cytotechnology，3，133(1990)〕、磷酸钙法(特开平2-227075)、脂转染法〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，7413(1987)〕、Virology，52，456(1973)记载的方法等。

使用昆虫细胞作为宿主时，可以按照例如BaculovirusExpression Vectors，A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York(1992)、Current Protocols in Molecular Biology、Molecular Biology，A Laboratory Manual、Bio/Technology，6，47(1988)等记载的方法表达蛋白质。

也就是说，可以将导入了重组基因的载体以及杆状病毒共同导入昆虫细胞，在昆虫细胞培养上清液中得到重组病毒后，再使昆虫细胞感染重组病毒，表达蛋白质。

该方法中使用的导入了基因的载体例如pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(均由Invitrogen公司生产)等。

杆状病毒可以使用感染夜蛾科昆虫的病毒——苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosisvirus)等。

昆虫细胞可以使用草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的卵巢细胞、来源于蚕卵巢的培养细胞等。

草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞例如Sf9、Sf21(Baculovirus Expression Vectors，A Laboratory Manual)等，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的卵巢细胞例如High 5、BTI-TN-5B1-4(Invitrogen公司生产)等，来源于蚕卵巢的培养细胞例如家蚕(Bombyx mori)N4等。

用于制备重组病毒将上述导入了重组基因的载体以及上述杆状病毒共同导入昆虫细胞的方法例如磷酸钙法(特开平2-227075)、脂转染法〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，7413(1987)〕。

使用植物细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，可以使用例如Ti质粒、烟草花叶病毒载体等。

启动子只要可以在植物细胞中起作用，可以使用任何一种，例如花椰菜花斑病病毒(CaMV)的35S启动子、稻放线菌1启动子等。

宿主细胞例如烟草、马铃薯、番茄、胡萝卜、大豆、油菜、苜蓿、稻、小麦、大麦等植物细胞等。

重组载体的导入方法只要是将DNA导入植物细胞的方法，可以采用任何一种，例如土壤杆菌属(Agrobacterium)(特开昭59-140885、特开昭60-70080、WO94/00977)、电穿孔法(特开昭60-251887)、使用粒子枪(基因枪)的方法(特许第2606856、特许第2517813)等。

作为基因的表达方法，除直接表达之外，也可以按照MolecularCloning第2版记载的方法等，进行分泌生产、融合蛋白质表达等。

通过酵母、动物细胞或昆虫细胞表达时，可以得到附加糖或糖链的蛋白质。

通过在培养基中培养如上所述得到的转化体，在培养物中生成蓄积本发明的蛋白质，并由该培养物收集本发明的蛋白质，可以制备本发明的蛋白质。

在培养基中培养本发明的转化体的方法可以按照宿主的培养中使用的常规方法进行。

培养以大肠菌等原核生物或酵母等真核生物作为宿主得到的转化体时的培养基只要是含有该生物可以资源化的碳源、氮源、无机盐类等，并可以有效培养转化体的培养基，可以使用天然培养基、合成培养基中任何一种。

碳源只要是该生物可以资源化的物质即可，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它们的糖蜜、淀粉或淀粉水解产物等碳水化合物，醋酸、丙酸等有机酸，乙醇、丙醇等醇类等。

氮源可以使用氨，氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐，其它含氮化合物，以及胨、肉汁、酵母浸出物、玉米浆、酪蛋白水解产物、大豆粕和大豆粕水解产物、各种发酵菌体及其消化物等。

无机盐可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。

培养通常在振荡培养或深部通气搅拌培养等有氧条件下进行。培养温度优选在15～40℃，培养时间为5小时～7天。培养中pH保持在3.0～9.0。pH调节使用无机或有机的酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行。

另外，在培养过程中根据需要也可以向培养基中添加氨苄西林和四环素等抗生素。

培养通过使用诱导性启动子作为启动子的表达载体进行胞质转换得到的微生物时，必要时也可以在培养基中添加诱导物。例如，培养通过使用lac启动子的表达载体进行胞质转换得到的微生物时也可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等，培养通过使用trp启动子的表达载体进行胞质转换得到的微生物时也可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。

培养以动物细胞作为宿主得到的转化体的培养基可以使用通常使用的RPMI1640培养基〔The Journal of the American MedicalAssociation，199，519(1967)〕、Eagle的MEM培养基〔Science，122，501(1952)〕、DMEM培养基〔Virology，8，396(1959)〕、199培养基[Proceeding of the Society for the BiologicalMedicine，73，1(1950)〕或在这些培养基中添加牛胎儿血清得到的培养基等。

培养通常在pH6～8、25～40℃、5％CO₂存在等条件下进行1～7天。

另外，在培养过程中根据需要也可以在培养基中添加卡那霉素、青霉素、链霉素等抗生素。

培养以昆虫细胞作为宿主得到的转化体的培养基可以使用通常使用的TNM-FH培养基〔Farmin Gene公司生产〕、Sf-900 II SFM培养基(Life Technologies公司生产)、ExCell400、ExCell405〔均由JRH Biosciences公司生产〕、Grace’s Insect Medium〔Nature，195，788(1962)〕等。

培养通常在pH6～7、25～30℃等条件下进行1～5天。

另外，在培养过程中根据需要也可以在培养基中添加庆大霉素等抗生素。

以植物细胞作为宿主得到的转化体可以培养成细胞，或培养分化成植物的细胞或器官。培养该转化体培养基可以使用通常使用的Muracyge and Scoog(MS)培养基、怀特(White)培养基或者在这些培养基中添加8-羟基喹啉、细胞***素等、植物激素得到的培养基等。

培养通常在pH5～9、20～40℃的条件下进行3～60天。

另外，在培养过程中根据需要也可以在培养基中添加卡那霉素、潮霉素等抗生素。

如上所述，通过按照常规的培养方法培养来源于带有***了编码本发明蛋白质的DNA的重组载体的微生物、动物细胞或植物细胞的转化体，生成蓄积该蛋白质，并由该培养物收集该蛋白质，可以制备该蛋白质。

本发明蛋白质的生产方法有在宿主细胞内生产的方法、分泌到宿主细胞外的方法或在宿主细胞外膜上生产的方法，根据改变使用的宿主细胞或所生产的蛋白质的结构，可以选择这些方法。

本发明的蛋白质在宿主细胞内或宿主细胞外膜上生产时，按照Poruson等的方法〔J.Biol.Chem.，264，17619(1989)〕、Lao等的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86，8227(1989)、Genes Develop.，4，1288(1990)〕或特开平05-336963、WO94/23021等记载的方法，可以使该蛋白质积极地分泌到宿主细胞外。

也就是说，通过使用基因重组技术，使含有本发明蛋白质活性部位的蛋白质一方以附加信号肽的形式表达，可以使本发明的蛋白质积极地分泌到宿主细胞外。

另外，也可以按照特开平2-227075中记载的方法，利用使用二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增***使产量上升。

而且，也可以通过使导入基因的动物或植物细胞再分化，产生导入基因的动物个体(转基因非人体动物)或植物个体(转基因植物)，利用这些个体制备本发明的蛋白质。

转化体为动物个体或植物个体的场合，可以通过按照常规的方法进行饲养或栽培，生成蓄积该蛋白质，并由该动物个体或植物个体收集该蛋白质，制备该蛋白质。

使用动物个体制备本发明蛋白质的方法例如在按照公知方法〔Amercan Journal of Clinical Nutrition，63，639S(1996)、American Journal of Clinical Nutrition，63，627S(1996)、Bio/Technology，9，830(1991)〕导入基因产生的动物中生产本发明蛋白质的方法。

动物个体的场合，例如可以通过饲养导入了编码本发明蛋白质的DNA的转基因非人体动物，使该蛋白质在该动物中生成、蓄积，并从该动物中收集该蛋白质，制备该蛋白质。该动物中的生成、蓄积场所例如该动物的乳(特开昭63-309192)、卵等。这时使用的启动子只要可以在动物中起作用，可以使用任何一种，优选使用例如乳腺细胞特异性启动——α酪蛋白启动子、β酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子等。

使用植物个体制备本发明蛋白质的方法例如按照公知方法〔组织培养，20(1994)、组织培养，21(1995)、Trends inBiotechnology，15，45(1997)〕栽培导入了编码本发明蛋白质的DNA的转基因植物，使该蛋白质在该植物中生成、蓄积，并从该植物中收集该蛋白质，产生该蛋白质的方法。

作为分离、精制通过本发明的转化体制备的蛋白质的方法，可以采用常规的酶分离、精制方法。

例如，本发明的蛋白质在细胞内以溶解状态表达时，培养结束后，通过离心分离回收细胞，悬浊于水系缓冲液后，用超声波粉碎机、弗氏压碎机、Manton-Gaulin匀浆机、Dyno碾磨机等使细胞破碎，得到无细胞提取液。

单独或组合使用常规的酶分离精制方法，即溶剂提取法、使用硫安等的盐析法、脱盐法、使用有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAD)-琼脂糖、DIAION HPA-75(三菱化成公司生产)等树脂的阴离子交换色谱法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性色谱法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和性色谱法、色谱聚焦法、等电点电泳等电泳法等方法，可以从离心分离该无细胞提取液得到的上清液得到精制标准品。

另外，该蛋白质在细胞内形成不溶体进行表达时，同样回收细胞后粉碎，进行离心分离，从得到的沉淀部分按照常规方法回收该蛋白质后，用蛋白质变性剂使该蛋白质的不溶体变得可溶。

将该可溶化液稀释或透析成不含蛋白质变性剂或蛋白质变性剂的浓度达到不会使蛋白质变性的程度的稀薄溶液，使该蛋白质构成正常的立体结构后，采用与上述同样的分离精制方法可以得到精制标准品。

本发明的蛋白质或其糖修饰体等衍生物分泌到细胞外的场合，可以从培养上清液中回收该蛋白质或其糖连附加体等衍生物。

也就是说，可以采用与上述同样的离心分离等方法处理该培养物，分离得到可溶性部分，采用与上述同样的分离精制法从该可溶性部分得到精制标准品。

这样得到的蛋白质例如具有序列号1表示的氨基酸序列的蛋白质。

另外，也可以作为与其它蛋白质的融合蛋白质生产本发明的多肽，利用使用融合后蛋白质中具有亲和性的物质的亲和性色谱法进行精制。例如，可以按照Lao等的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86，8227(1989)、Genes Develop.，4，1288(1990)〕、特开昭05-336963、WO94/23021记载的方法，作为与蛋白质A的融合蛋白质生产本发明的多肽，按照使用免疫球蛋白G的亲和性色谱法进行精制。

另外，可以作为与Flag肽的融合蛋白质生产本发明的多肽，通过使用Flag抗体的亲和性色谱法进行精制〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86，8227(1989)、Genes Develop.，4，1288(1990)〕。而且，也可以通过使用该多肽自身的抗体的亲和性色谱法进行精制。

以上述获得的蛋白质的氨基酸信息为基础，采用Fmoc法(芴基甲氧基羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等化学合成法，可以制备本发明的蛋白质。另外，也可以利用Advanced ChemTech公司、PerkinElma公司、Pharmacia公司、Protein Technology Instrument公司、Synthecell-Vega公司、岛津制作所等的肽合成机进行化学合成。

〔3〕N-乙酰甘露糖胺的制备

使用通过上述〔2〕记载的培养得到的转化体的培养液和该培养液的处理物作为酶源，可以在水性介质中制备N-乙酰甘露糖胺。

培养液的处理物例如培养液的浓缩物、培养液的干燥物、培养液离心分离得到的菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冷冻干燥物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的超声波处理物、该菌体的机械粉碎物、该菌体的溶剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的蛋白部分、该菌体的固化物或由该菌体提取得到的酶标准品等。

以37℃下1分钟可以生成1mmol N-乙酰甘露糖胺的活性为1单位(U)，N-乙酰甘露糖胺的生成过程中使用的酶源为1mU/l～1000U/l，优选以10mU/l～100U/l的浓度使用。

N-乙酰甘露糖胺的生成过程中使用的水性介质例如水、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐、枸橼酸盐、Tris等缓冲液，甲醇、乙醇等醇类，乙酸乙酯等酯类，丙酮等酮类，乙酰胺等酰胺类等。另外，作为酶源使用的微生物的培养液可以用作水性介质。

N-乙酰甘露糖胺的生成过程中，根据需要也可以添加表面活性剂或有机溶剂。表面活性剂只要是聚氧乙烯十八烷胺(例如Nymeen S-215，日本油脂公司生产)等非离子表面活性剂，溴化十六烷基三甲铵或氯化烷基二甲基苯甲铵(例如Cation F2-40E，日本油脂公司生产)等阳离子表面活性剂，月桂酰基肌氨酸盐等阴离子表面活性剂，烷基二甲胺(例如叔胺FB，日本油脂公司生产)等的叔胺类等促进N-乙酰甘露糖胺生成的物质，任何一种均可，可以使用一种或数种混合使用。表面活性剂通常以0.1～50g/l的浓度使用。有机溶剂例如二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯等，通常以0.1～50ml/l的浓度使用。

N-乙酰甘露糖胺的生成反应在水性介质中，pH5～10，优选pH6～8，20～50℃的条件下进行1～96小时。在该生成反应中，根据需要可以添加ATP、MgCl₂等无机盐等。

水性介质中生成的N-乙酰甘露糖胺的定量可以使用Dionex公司生产的糖分析装置等进行〔Anal.Biochem.，189，151(1990)〕。

收集反应液中生成的N-乙酰甘露糖胺可以按照使用活性炭或离子交换树脂等的常规方法进行。

图面的简单说明

图1 表示产生N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶表达质粒pYP16的步骤。

Ampr：氨苄青霉素耐药基因

PL：PL启动子

cI857：cI857诱导物

slr1975：N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶基因

发明的最佳实施方式

以下，说明本发明的实施例，但是本发明并不受这些实施例的限定。

实施例1 数据库上的同源检索

以来源于猪的N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的氨基酸序列〔J.Biol.Chem.，271，16294(1996)〕作为Query，在Cenbank的BlastSerch和集胞藻属(Synechocystis sp.)(PCC6803)的基因组序列的数据库——Cyanobase(http：//www.kazusa.or.jp/cyano/)中进行同源检索(Similarity Search)。

结果，得知该氨基酸序列与具有序列号1记载的氨基酸序列和序列号2记载的碱基序列的renin-binding protein记载的来源于集胞藻属(Synechocystis sp.)(PCC6803)的序列(slr1975)显示高的同源性。

实施例2 来源于集胞藻属的基因表达株的产生

按照J.Gen.Microbiol.，111，1(1979)记载的方法培养集胞藻属(Synechocystis sp.)(PCC6803)。

培养后，按照Current Protocols in Molecular Biology记载的方法分离精制该微生物的染色体DNA。

使用用Perceptype Biosystems公司生产的8905型DNA合成机合成的序列号3和4记载的DNA，按照下述方法使含有实施例1选择出的基因的DNA片段扩增。

使用上述合成DNA作为引物，以集胞藻属(PCC6803)的染色体DNA作为模板进行PCR。PCR通过使用染色体DNA 0.1μg、引物各0.5μmol/l、Pfu DNA聚合酶(STRATAGENE公司生产)2.5μnits、PfuDNA聚合酶用×10缓冲液(STRATAGENE公司生产)4μl、含有deoxyNTP各200μmol/l的反应液40μl，94℃-1分钟、42℃-2分钟、72℃-3分钟的步骤反复30次进行。

对该反应液的1/10量进行琼脂糖胶电泳，确认所需片段扩增后，添加与残留的反应液等量的TE〔10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/lEDTA〕饱和苯酚/氯仿(1vol/1vol)，混合。

将该混合液离心分离后，在得到的上层中加入2倍容量的冷乙醇混合，在-80℃下放置30分钟。将该放置液离心分离，得到DNA的沉淀。

将该DNA的沉淀溶解于20μl的TE。

使用该溶解液5μl，用限制酶Cla I和Bam HI切断DNA，用琼脂糖胶电泳分离DNA片段后，用Gene Clean II试剂盒回收1.0kb的DNA片段。

用限制酶Cla I和Bam HI将pPAC31(WO98/12343)切断后，用琼脂糖胶电泳分离DNA片段，同样回收5.5kb的DNA片段。

使用连接试剂盒使该1.0kb和5.5kb的片段在16℃下进行连接反应16小时。

使用该连接反应液按照上述公知的方法对大肠菌NM522株进行胞质转换，将该转化体涂覆在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上后，在30℃下培养一夜。

按照上述公知的方法从繁殖得到的转化体的纯系细胞中提取质粒，得到表达质粒pYP16。通过限制酶消化确认该质粒的结构(图1)。

实施例3 N-乙酰葡糖胺的生产

将实施例2得到的大肠埃希氏菌NM522/pYP16株接种在装有含氨苄青霉素50μg/ml的LB培养基8ml的粗型试管中，在28℃下培养17小时。将该培养液按1％接种在装有含氨苄青霉素50μg/ml的LB培养基8ml的粗型试管中，在30℃下培养4小时后，在40℃下培养3小时。将该培养液离心分离，取得湿菌体。必要时该湿菌体可以保存在-20℃，于使用前解冻后使用。

在终浓度为60mg/ml的该湿菌体、100mmol/l Tris-HCl(pH7.4)、10mmol/l MgCl₂、40mmol/l N-乙酰甘露糖胺、4mmol/l ATP、0.4％Nymeen S-215构成的0.1ml反应液中，在37℃下反应2小时。

反应结束后，使用Dionex公司生产的糖分析装置(DX-500)对反应产物进行分析，确认反应液中生成蓄积了13.7mmol/l的N-乙酰葡糖胺。

确认仅含有载体的大肠埃希氏菌NM522/pPAC31株没有产生N-乙酰葡糖胺。

实施例4 N-乙酰甘露糖胺的生产

将实施例2得到的大肠埃希氏菌NM522/pYP16株接种在装有含氨苄青霉素50μg/ml的LB培养基8ml的粗型试管中，在28℃下培养17小时。

将该培养液按1％接种在装有含氨苄青霉素50μg/ml的LB培养基8ml的粗型试管中，在28℃下培养4小时后，在40℃下培养3小时。将该培养液离心分离，取得湿菌体。必要时该湿菌体可以保存在-20℃，于使用前解冻后使用。

在终浓度为60mg/ml的该湿菌体、100mmol/l Tris-HCl(pH7.4)、10mmol/l MgCl₂、500mmol/l N-乙酰葡糖胺、4mmol/l ATP、0.4％Nymeen S-215构成的0.1ml反应液中，在37℃下反应2小时。

反应结束后，使用Dionex公司生产的糖分析装置(DX-500)对反应产物进行分析，确认反应液中生成蓄积了70mmol/l的N-乙酰甘露糖胺。

工业实用性

按照本发明，可以采用基因重组技术大量生产N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶。另外，通过使用该酶可以有效制备N-乙酰甘露糖胺。

序列表free text

序列号3：合成DNA

序列号4：合成DNA

序列表

<110>KYOWA HAKKO KOGYO CO.，LTD.

<120>Novel N-acetyl glucosamine 2-epimerase and a DNA coding for said enzyme

<130>11184WO1

<140>

<141>

<150>JP99-031035

<151>1999-02-09

<160>4

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>391

<212>PRT

<213>Synechocystis sp.(PCC6803)

<400>1

Met Ile Ala His Arg Arg Gln Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Ala

1 5 10 15

Leu His Gln Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Lys Tyr Ser Leu Asp Arg

20 25 30

Gln Gly Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Lys Gly Gln Val Phe

35 40 45

Asp Thr Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Gln Phe

50 55 60

Ala Val Phe Tyr Asn Arg Leu Glu Pro Lys Pro Gln Trp Leu Glu Ile

65 70 75 80

Ala Arg His Gly Ala Asp Phe Leu Ala Arg His Gly Arg Asp Gln Asp

85 90 95

Gly Asn Trp Tyr Phe Ala Leu Asp Gln Glu Gly Lys Pro Leu Arg Gln

100 105 110

Pro Tyr Asn Val Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln

115 120 125

Tyr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Gln Glu Ala Lys Ala Ile Ala Leu Gln

130 135 140

Ala Tyr Asn Asn Val Leu Arg Arg Gln His Asn Pro Lys Gly Gln Tyr

145 150 155 160

Glu Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Val Pro

165 170 175

Met Ile Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Pro

180 185 190

Thr Thr Val Glu Glu Val Leu Ala Gln Thr Val Arg Glu Val Met Thr

195 200 205

Asp Phe Leu Asp Pro Glu Ile Gly Leu Met Arg Glu Ala Val Thr Pro

210 215 220

Thr Gly Glu Phe Val Asp Ser Phe Glu Gly Arg Leu Leu Asn Pro Gly

225 230 235 240

His Gly Ile Glu Ala Met Trp Phe Met Met Asp Ile Ala Gln Arg Ser

245 250 255

Gly Asp Arg Gln Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Val Val Leu Asn Thr

260 265 270

Leu Glu Tyr Ala Trp Asp Glu Glu Phe Gly Gly Ile Phe Tyr Phe Leu

275 280 285

Asp Arg Gln Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu

290 295 300

Trp Trp Val His Leu Glu Thr Leu Val Ala Leu Ala Lys Gly His Gln

305 310 315 320

Ala Thr Gly Gln Glu Lys Cys Trp Gln Trp Phe Glu Arg Val His Asp

325 330 335

Tyr Ala Trp Ser His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly

340 345 350

Tyr Leu Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys

355 360 365

Trp Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Leu Trp Leu Cys Ala Glu

370 375 380

Thr Leu Gln Leu Pro Val Ser

385 390

<210>2

<211>1173

<212>DNA

<213>Synechocystis sp.(PCC6803)

<400>2

atg att gcc cat cgc cgt cag gag tta gcc cag caa tat tac cag gct 48

Met Ile Ala His Arg Arg Gln Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Ala

1 5 10 15

tta cac cag gac gta ttg ccc ttt tgg gaa aaa tat tcc ctc gat cgc 96

Leu His Gln Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Lys Tyr Ser Leu Asp Arg

20 25 30

cag ggg ggc ggt tac ttt acc tgc tta gac cgt aaa ggc cag gtt ttt 144

Gln Gly Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Lys Gly Gln Val Phe

35 40 45

gac aca gat aaa ttc att tgg tta caa aac cgt cag gta tgg cag ttt 192

Asp Thr Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Gln Phe

50 55 60

gcc gtt ttc tac aac cgt ttg gaa cca aaa ccc caa tgg tta gaa att 240

Ala Val Phe Tyr Asn Arg Leu Glu Pro Lys Pro Gln Trp Leu Glu Ile

65 70 75 80

gcc cgc cat ggt gct gat ttt tta gct cgc cac ggc cga gat caa gac 288

Ala Arg His Gly Ala Asp Phe Leu Ala Arg His Gly Arg Asp Gln Asp

85 90 95

ggt aat tgg tat ttt gct ttg gat cag gaa ggc aaa ccc ctg cgt caa 336

Gly Asn Trp Tyr Phe Ala Leu Asp Gln Glu Gly Lys Pro Leu Arg Gln

100 105 110

ccc tat aac gtt ttt tcc gat tgc ttc gcc gcc atg gcc ttt agt caa 384

Pro Tyr Asn Val Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln

115 120 125

tat gcc tta gcc agt ggg gcg cag gaa gct aaa gcc att gcc ctg cag 432

Tyr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Gln Glu Ala Lys Ala Ile Ala Leu Gln

130 135 140

gcc tac aat aac gtc cta cgc cgt cag cac aat ccc aaa ggt caa tac 480

Ala Tyr Asn Asn Val Leu Arg Arg Gln His Asn Pro Lys Gly Gln Tyr

145 150 155 160

gag aag tcc tat cca ggt act aga ccc ctc aaa tcc ctg gcg gtg ccg 528

Glu Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Val Pro

165 170 175

atg att tta gcc aac ctc acc ctg gag atg gaa tgg tta tta ccg cct 576

Met Ile Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Pro

180 185 190

act acc gtg gaa gag gtg ttg gcc caa acc gtc aga gaa gtg atg acg 624

Thr Thr Val Glu Glu Val Leu Ala Gln Thr Val Arg Glu Val Met Thr

195 200 205

gat ttc ctc gac cca gaa ata gga tta atg cgg gaa gcg gtg acc ccc 672

Asp Phe Leu Asp Pro Glu Ile Gly Leu Met Arg Glu Ala Val Thr Pro

210 215 220

aca gga gaa ttt gtt gat agt ttt gaa ggg cgg ttg ctc aac cca gga 720

Thr Gly Glu Phe Val Asp Ser Phe Glu Gly Arg Leu Leu Asn Pro Gly

225 230 235 240

cac ggc att gaa gcc atg tgg ttc atg atg gac att gcc caa cgc tcc 768

His Gly Ile Glu Ala Met Trp Phe Met Met Asp Ile Ala Gln Arg Ser

245 250 255

ggc gat cgc cag tta cag gag caa gcc att gca gtg gtg ttg aac acc 816

Gly Asp Arg Gln Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Val Val Leu Asn Thr

260 265 270

ctg gaa tat gcc tgg gat gaa gaa ttt ggt ggc ata ttt tat ttc ctt 864

Leu Glu Tyr Ala Trp Asp Glu Glu Phe Gly Gly Ile Phe Tyr Phe Leu

275 280 285

gat cgc cag ggc cac cct ccc caa caa ctg gaa tgg gac caa aag ctc 912

Asp Arg Gln Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu

290 295 300

tgg tgg gta cat ttg gaa acc ctg gtt gcc cta gcc aag ggc cac caa 960

Trp Trp Val His Leu Glu Thr Leu Val Ala Leu Ala Lys Gly His Gln

305 310 315 320

gcc act ggc caa gaa aaa tgt tgg caa tgg ttt gag cgg gtc cat gat 1008

Ala Thr Gly Gln Glu Lys Cys Trp Gln Trp Phe Glu Arg Val His Asp

325 330 335

tac gcc tgg agt cat ttc gcc gat cct gag tat ggg gaa tgg ttt ggc 1056

Tyr Ala Trp Ser His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly

340 345 350

tac ctg aat cgc cgg gga gag gtg tta ctc aac cta aaa ggg ggg aaa 1104

Tyr Leu Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys

355 360 365

tgg aaa ggg tgc ttc cac gtg ccc cga gct ctg tgg ctc tgt gcg gaa 1152

Trp Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Leu Trp Leu Cys Ala Glu

370 375 380

act ctc caa ctt ccg gtt agt 1173

Thr Leu Gln Leu Pro Val Ser

385 390

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic DNA

<400>3

taaatcgata tttgtatgat tgcccatcgc cgtcag 36

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic DNA

<400>4

aaaggatcct taactaaccg gaagttggag agtttc 36

Claims

1.N-乙酰甘露糖胺的制备方法，该方法包括：选择转化体的培养物或该培养物的经处理的产物作为酶源，其中转化体含有编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质的DNA、具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的DNA或者在严格性条件下与由SEQ ID NO：2的核苷酸序列组成的DNA杂交并且编码源自蓝细菌属微生物的具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的蛋白质的DNA；使该酶源和N-乙酰葡糖胺存在于水性介质中，在该水性介质中生成并蓄积N-乙酰甘露糖胺；以及从该水性介质中收集N-乙酰甘露糖胺。

2.根据权利要求1的方法，其中蓝细菌属微生物是集胞藻属的微生物。

3.具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质在生产N-乙酰甘露糖胺的方法中的用途。