JP6092100B2 - 植物ゲノム工学に一般的に使用されるヌクレオチド配列において植物ゲノムを改変するための方法および手段 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、農学の分野に関する。より特定すると、本発明は、トランスジェニック植物のゲノムの正確に位置するヌクレオチド配列において標的改変（挿入、欠失または置換を含む）を導入するための方法および手段を提供し、前記ヌクレオチド配列は、植物遺伝子組換えに頻繁に使用されるエレメントまたはＤＮＡフラグメント内に、例えば一般的に使用される選択マーカー遺伝子に含まれる。改変は、第一工程において、天然に存在するメガヌクレアーゼに由来する、認識部位を認識しそれを開裂するように再設計されたメガヌクレアーゼを使用した、認識ヌクレオチド配列における二本鎖切断の誘導によってトリガーされる。

背景技術
植物ゲノムにおける標的改変（植物における外来ＤＮＡの組込み位置の制御を含む）を導入する必要性は次第に重要となっており、そしてこの必要性を満たすためにいくつかの方法が開発されている（レビューとしては、Kumar and Fladung, 2001, Trends in Plant Science, 6, pp155-159参照）。これらの方法は殆どが標的位置において二本鎖ＤＮＡ切断を最初に導入することに依拠している。

低頻度切断エンドヌクレアーゼ（例えばＩ−ＳｃｅＩ）を介した二本鎖ＤＮＡ切断の誘導を通しての標的遺伝子座および／または修復もしくはドナーＤＮＡの活性化は、数桁の大きさで相同的組換えの頻度を増加させることが示された。（Puchta et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, pp5055-5060; Chilton and Que, Plant Physiol., 2003; D’Halluin et al. 2008 Plant Biotechnol. J. 6, 93-102）。

ＷＯ９６／１４４０８は、酵素Ｉ−ＳｃｅＩをコードする単離ＤＮＡを記載する。このＤＮＡ配列を、クローニングベクターおよび発現ベクター、形質転換された細胞株およびトランスジェニック動物に取り込むことができる。ベクターは、遺伝子マッピングおよび遺伝子の部位特異的挿入に有用である。

ＷＯ００／４６３８６は、Ｉ−ＳｃｅＩにより誘導される二本鎖切断を通して、細胞における遺伝子または他の染色体ＤＮＡを改変、修復、減弱および不活性化する方法を記載する。また、それを必要とする個体における遺伝子病の処置法または予防法も開示されている。さらに、キメラ制限エンドヌクレアーゼも開示されている。

さらに、酵素の基質または配列特異性を変化させるような低頻度開裂エンドヌクレアーゼの設計を可能とする方法が記載されており、これにより、いずれかの天然の低頻度開裂エンドヌクレアーゼに対する認識部位の存在に依存することなく、対象の遺伝子座において二本鎖切断を誘導することが可能となる。簡潔に言うと、特異的なヌクレオチド配列を認識するように設計された亜鉛フィンガードメインと、天然の制限酵素（例えばＦｏｋＩ）からの非特異的ＤＮＡ開裂ドメインとの間のハイブリッドを使用して、キメラ制限酵素を調製することができる。このような方法は、例えば、ＷＯ０３／０８０８０９、ＷＯ９４／１８３１３またはＷＯ９５／０９２３３およびIsalan et al., 2001, Nature Biotechnology 19, 656- 660; Liu et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530に記載されている。変異体のライブラリーからの選択による、カスタムメイドのメガヌクレアーゼを産生する別の方法は、ＷＯ２００４／０６７７３６に記載されている。また、変化した配列特異性およびＤＮＡ結合親和性を有するカスタムメイドのメガヌクレアーゼまたは再設計されたメガヌクレアーゼを、ＷＯ２００７／０４７８５９に記載のような合理的な設計を通して得ることができる。

ＷＯ２００７／０４９０９５は、２つの別々のサブドメインに突然変異を有する「ＬＡＤＧＬＩＤＡＮＧ」ホーミングエンドヌクレアーゼ変異体を記載し、各々のサブドメインが、改変されたＤＮＡ標的ハーフ部位の明確に異なる部分に結合し、よって、エンドヌクレアーゼ変異体は、各サブドメインによって結合されたヌクレオチドを含むキメラＤＮＡ標的配列を開裂することができる。

ＷＯ２００７／０４９１５６およびＷＯ２００７／０９３８３６は、新規な開裂特異性を有するＩ−ＣｒｅＩホーミングエンドヌクレアーゼ変異体およびその使用を記載する。

ＷＯ２００７／０４７８５９は、改変された配列特異性およびＤＮＡ結合親和性を有する合理的に設計されたメガヌクレアーゼを記載する。

ＷＯ２００６／１０５９４６は、植物細胞および植物において、相同的組換えを通して標的ＤＮＡ配列を、対象のＤＮＡ配列へと正確に交換するための方法を記載し、遺伝子置換事象の経時的な選択のための相同的組換え期の間に使用された選択マーカーまたはスクリーニング可能なマーカーは、その後、足跡を残すことなく、そして除去工程中にin vitro培養に頼ることなく、二本鎖切断誘導低頻度開裂エンドヌクレアーゼの小胞子特異的発現による、選択されたＤＮＡの除去のためのそこに記載された方法を使用して、除去され得る。

米国仮特許出願６０／８２８，０４２および欧州特許出願０６０２０３７０．０およびＷＯ２００８／０３７４３６は、ＷＯ２００６／１０５９４６の方法および手段の変形を記載し、二本鎖切断誘導低頻度開裂エンドヌクレアーゼによって誘導される選択されたＤＮＡフラグメントの除去工程は、生殖系列特異的プロモーターの制御下にある。前記方法の他の態様は、修復ＤＮＡの一方の末端における非相同的な末端結合および他端における相同的組換えに依拠した。

Gao et al. 2009, The Plant Journal , pp 1-11は、再設計されたエンドヌクレアーゼを使用した、メイズにおける遺伝性の標的突然変異誘発を記載する。

再設計されたメガヌクレアーゼは天然に存在するエンドヌクレアーゼに由来するので、利用可能な可能性ある認識部位は、完全にランダムではないが、再設計されたメガヌクレアーゼが基づいている天然に存在するエンドヌクレアーゼによって元々認識されるヌクレオチド配列に対してある程度の類似性を有しているようである。Gao et al. 2009（上記）によって記載されているように、Ｉ−ＣｒｅＩのＤＮＡ結合特徴を改変するための構造に基づいたタンパク質設計法は、Ｉ−ＣｒｅＩ−ＤＮＡ共結晶構造の目視による検査に基づき、これにより、その認識部位の特定の位置におけるＩ−ＣｒｅＩ塩基優先度を変化させる多くのアミノ酸置換の予測がなされる。個々のアミノ酸置換を実験的に評価し、そして塩基優先度の所望の変化を付与するものを突然変異のデータベースに加え、これを「混合および適合」させて、非常に多岐にわたるＤＮＡ部位を認識するＩ−ＣｒｅＩの誘導体を生成することができる。理論的には、現在の突然変異データベースを使用して入手可能である組合せ多様性は、ランダムなＤＮＡ配列において約１０００ｂｐ毎に工学操作されたエンドヌクレアーゼを標的化するのに十分である。

従って、導入遺伝子の一般的に使用される部分としてトランスジェニック植物に以前に導入されたＤＮＡエレメントまたは領域における認識部位を認識することができ、そして十分な効率でその領域において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導し、これにより、例えば、二本鎖切断部位において相同的組換えまたは非相同的末端結合による外来ＤＮＡの挿入、欠失または置換などに必要とされる事象をトリガーする、機能的で再設計されたメガヌクレアーゼの必要性が依然として存在する。認識部位と再設計されたメガヌクレアーゼとのこのような対の同定は、例えばＩ−ＳｃｅＩ（植物細胞に天然に存在しない）などの低頻度開裂エンドヌクレアーゼのために歴史的に導入された認識部位の存在に頼る必要なしに、以前に導入された導入遺伝子の位置における誘導された二本鎖ＤＮＡ切断の近傍におけるＤＮＡの挿入、欠失または置換を可能とすることによって、植物ゲノムを標的様に改変するための利用可能なツールを増強する。

これらおよび他の問題は、種々の本発明の詳細な態様、並びに、特許請求の範囲において本明細書で以後に記載したように解決される。

発明の要約
本発明の１つの態様において、トランスジェニック植物細胞のゲノムにおいて予め定められた部位に外来ＤＮＡ分子を導入するための方法が提供され、前記方法は、
ａ．前記の予め定められた部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する工程；
ｂ．前記の植物細胞に前記の外来ＤＮＡ分子を導入する工程；
ｃ．前記の外来ＤＮＡが前記の予め定められた部位に導入されている植物細胞を選択する工程；および
ｄ．場合により植物細胞を植物へと再生する工程
を含み、前記の予め定められた部位は、天然に存在するメガヌクレアーゼのための認識部位とは異なるヌクレオチド配列であり、そして前記の予め定められた部位は、トランスジェニック植物において導入遺伝子の一部として一般的に導入されるヌクレオチド配列であり、そして二本鎖ＤＮＡ切断は、前記の予め定められた部位を認識しそして前記の二本鎖切断を誘導する天然には存在しない一本鎖メガヌクレアーゼの導入か、または前記の予め定められた部位を協調して認識しそして前記の二本鎖切断を誘導する天然には存在しないメガヌクレアーゼの対の導入かによって誘導されることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、植物細胞のゲノムにおいて予め定められた部位に外来ＤＮＡ分子を導入するための方法を提供し、前記方法は、
ａ．前記の予め定められた部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する工程；
ｂ．前記の植物細胞に前記の外来ＤＮＡ分子を導入する工程；
ｃ．前記の外来ＤＮＡが前記の予め定められた部位に導入されている植物細胞を選択する工程；および
ｄ．場合により植物細胞を植物へと再生する工程
を含み、前記の予め定められた部位は、ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（S. hygroscopicus）からのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコード領域内（ｂａｒコード領域）、これは配列番号３のヌクレオチド配列を有し得る、に含まれ、そして前記の二本鎖ＤＮＡ切断は、前記の予め定められた部位を認識しそして前記の二本鎖切断を誘導する一本鎖メガヌクレアーゼまたは前記の予め定められた部位を協調して認識しそして前記の二本鎖切断を誘導するメガヌクレアーゼの対の導入によって誘導されることを特徴とする。予め定められた部位は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含み得る。

さらに別の態様において、植物細胞のゲノムにおいて予め定められた部位に外来ＤＮＡ分子を導入するための方法が提供され、前記方法は、
ａ．前記の予め定められた部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する工程；
ｂ．前記の植物細胞に前記の外来ＤＮＡ分子を導入する工程；
ｃ．前記の外来ＤＮＡが前記の予め定められた部位に導入されている植物細胞を選択する工程；
ｄ．場合により植物細胞を植物へと再生する工程
を含み、前記の予め定められた部位は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含み、そして前記の二本鎖ＤＮＡ切断は、前記の予め定められた部位を認識しそして前記の二本鎖切断を誘導する一本鎖メガヌクレアーゼの導入か、または前記の予め定められた部位を協調して認識しそして前記の二本鎖切断を誘導するメガヌクレアーゼの対の導入かによって誘導され、このようなメガヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼの対はＩ−ＣｒｅＩ（配列番号１６によって示される）に由来し、そして以下のアミノ酸がサブユニットの１つに存在する：３２位におけるＳ；３３位におけるＹ；３８位におけるＥ；４０位におけるＲ；６６位におけるＫ；８０位におけるＱ；４２位におけるＴ；７７位におけるＲ；６８位におけるＲ；７０位におけるＲ；４４位におけるＱ；２４位におけるＩ；２６位におけるＳ；２８位におけるＳおよび３０位におけるＲまたは７０位におけるＲ；４４位におけるＴ；２４位におけるＩ；２６位におけるＳ；２８位におけるＳ；３０位におけるＮ；３２位におけるＳ；３３位におけるＲ；３８位におけるＱ；８０位におけるＱ；４０位におけるＲ；６６位におけるＫ；４２位におけるＴ；７７位におけるＲおよび６８位におけるＲ（位置はＩ−Ｃｒｅ−Ｉアミノ酸配列に対応する）ことを特徴とする。このようなメガヌクレアーゼの例は、それぞれ、配列番号４のヌクレオチド２００４位からヌクレオチド２５２５位までまたは２５２２位までのヌクレオチド配列、または配列番号４のヌクレオチド４８８５位からヌクレオチド５４０５位までまたは５４０３位までのヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、配列番号５および配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質である。本発明による一本鎖メガヌクレアーゼは、配列番号１７のヌクレオチド１２６７位から１６０５位までおよび１７９５位から２５４１位までのヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号１８のアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは、配列番号１７のヌクレオチド１２６７位から１６０５位まで、１７９５位から１９５６位まで、および２０７１位から２５４１位までのヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる、アミノ酸１位から１６７位までおよび２０８位から３６２位までの配列番号１８のアミノ酸配列を含むタンパク質であり得る。

態様のいずれかにおいて、外来ＤＮＡは修復ＤＮＡ内に含まれ得、修復ＤＮＡは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列の上流または下流配列に相同な少なくとも１つのフランキングヌクレオチド配列を含む。外来ＤＮＡは選択マーカー遺伝子および／または植物で発現可能な対象の遺伝子、例えば、除草剤耐性遺伝子、昆虫耐性遺伝子、疾病耐性遺伝子、非生物的ストレス耐性遺伝子、油生合成、炭水化物生合成に関与する酵素、線維の強度または線維の長さに関与する酵素、二次代謝物の生合成に関与する酵素を含み得る。また、外来ＤＮＡはそれ自体で、すなわち、非相同的な末端結合による組込みのために、予め定められた標的部位の周囲の領域に対して相同性を有するフランキング配列を含むことなく（さらに他のＤＮＡを全く用いることなく）組み込まれ得る。

メガヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼの対は、キメラ遺伝子またはキメラ遺伝子の対から発現され得、各々は、メガヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼの対の１つをコードするコード領域に作動可能に連結され、そしてさらに、植物細胞で機能する転写終結およびポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域に作動的に連結された、植物で発現可能なプロモーターを含む。

本発明はさらに、本明細書において提供された方法によって得られた、外来ＤＮＡが予め定められた部位に導入されている、植物細胞および植物および種子または繁殖部分を提供する。

本発明はまた、化学物質を植物に、または植物が成長している基質に適用する工程を含む、本明細書で提供された方法によって得られた、外来ＤＮＡが予め定められた部位に導入されている植物を成長させる方法を提供する。

本発明のさらに別の態様は、本発明の方法によって得られた植物細胞から本質的になる植物を、別の植物またはそれ自体と交雑し、そして場合により種子を収穫する工程を含む、ｂａｒコード領域において組み込まれた外来ＤＮＡを含む植物を産生するためのプロセスに関する。

本発明はまた、本明細書において提供された方法によって得られた、外来ＤＮＡが予め定められた部位に導入されている植物または植物の種子に化合物を適用する工程を含むプロセスに関する。

本発明の別の態様は、外来ＤＮＡを植物細胞のｂａｒコード領域に導入するための、本明細書において記載したようなメガヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼの対の使用に関する。

本発明のさらに別の態様は、対象の外来ＤＮＡを植物細胞の予め定められた部位に導入するためのカスタムメイドのメガヌクレアーゼの使用に関する。

異なるメガヌクレアーゼモノマーユニットＢＡＹ３９およびＢＡＹ４０の認識部位およびアミノ酸との相互作用の図解。 ＢＡＹ３９／４０モノマーユニット２（「４０」）のアミノ酸配列（アミノ酸配列は、ＳＶ４０核局在化シグナル（アミノ酸１〜１０）を含むことを注記する）。 ＢＡＹ３９／４０モノマーユニット１（「３９」）のアミノ酸配列（アミノ酸配列は、ＳＶ４０核局在化シグナル（アミノ酸１〜１０）を含むことを注記する）。 一本鎖ＢＡＹ３９／４０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列（アミノ酸配列は、ＳＶ４０核局在化シグナル（アミノ酸１〜１２）およびリンカー領域（アミノ酸１６８〜２０５）を含むことを注記する）。 植物で発現可能なｂａｒ遺伝子および植物で発現可能なＢＡＹ３９／４０のモノマーユニットに対する遺伝子を含むトランスジェニック植物に由来するホスフィノトリシン感受性株における、ｂａｒコード領域の認識部位の周辺のＰＣＲ増幅産物のヌクレオチド配列のアラインメント。１．コントロールサンプルのヌクレオチド配列；２．ホスフィノトリシン耐性株のヌクレオチド配列；３〜９：ホスフィノトリシン感受性株のヌクレオチド配列。

本発明の種々の態様の記載
本発明は、Streptomyces hygroscopicusからのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｂａｒ遺伝子）(Thompson, C., Movva, R., Tizard, R., Crameri, R., Davies, J., Lauwereys, M. ans Botterman, J. (1987) Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal 6: 2519-2523 (アクセッション X05822)）のコード領域のヌクレオチド配列（このヌクレオチド配列は、植物の遺伝子組換えに一般的に使用される選択マーカー遺伝子に存在する）に見出され得る、ヌクレオチド配列（配列番号１および配列番号２−図１）を特異的に認識および開裂する、機能的で再設計されたメガヌクレアーゼを得ることができるという観察に基づく。

配列番号３は、ｂａｒ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。配列番号１の認識部位の相補体（配列番号２）は、配列番号３のヌクレオチド１３２から１５３までのヌクレオチド配列に対応する。従って、本明細書において記載したメガヌクレアーゼは、Streptomyces hygroscopicusからのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ領域（ｂａｒ）、続いて、植物において機能的である３’転写終結およびポリアデニル化領域に作動可能に連結された植物で発現可能なプロモーターを有する植物で発現可能な遺伝子を含むトランスジェニック植物におけるヌクレオチド配列を認識および開裂することができ、ｂａｒコード領域は、配列番号１のヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列を含み、例えば配列番号３である。

ｂａｒコード領域は、今まで、現在またはこれから市販される多くのトランスジェニック植物に取り込まれており、これには以下のイベントを含む植物が含まれる：
チコリ（Cichorium intybus）：
− 規制ファイル９７−１４８−０１ｐに記載のようなイベントＲＭ３−３、ＲＭ３−４、ＲＭ３−６

アブラナ（Brassica napus）
− 規制ファイルＤＤ９５−０４（ＣＡ）または９８−２７８−０１ｐ（ＵＳ）に記載のようなイベントＭＳ１
− 規制ファイルＤＤ９６−１７（ＣＡ）または９８−２７８−０１ｐ（ＵＳ）またはＷＯ２００１／０４１５５８に記載のようなイベントＭＳ８
− 規制ファイルＤＤ９５−０４（ＣＡ）または９８−２７８−０１ｐ（ＵＳ）に記載のようなイベントＲＦ１
− 規制ファイルＤＤ９５−０４（ＣＡ）または９８−２７８−０１ｐ（ＵＳ）に記載のようなイベントＲＦ２
− 規制ファイルＤＤ９６−１７（ＣＡ）または９８−２７８−０１ｐ（ＵＳ）またはＷＯ２００１／０４１５５８に記載のようなイベントＲＦ３
− 日本規制緩和ファイルに記載のようなイベントＰＨＹ１４、ＰＨＹ３５、ＰＨＹ３６

ワタ（Gossypium hirsutum）
− 規制ファイル０２−０４２−０１ｐ（ＵＳ）またはＷＯ２００３／０１３２２４に記載のようなイベントＬＬｃｏｔｔｏｎ２５
− ＷＯ２００８／１２２４０６に記載のようなイベントＴ３０３−４０
− 規制ファイル０８−３４０−０１ｐ（ＵＳ）またはＷＯ２００８／１５１７８０に記載のようなイベントＧＨＢ１１９

トウモロコシ（Zea mays）
− 規制ファイル０３−１８１−０１ｐ（ＵＳ）に記載のようなイベントＴＣ−６２７５（＝ＤＡＳ−０６２７５−８）
− 規制ファイル９４−３１９−０１ｐ（ＵＳ）に記載のようなイベントＢｔ１７６
− ＵＳ規制緩和関係書類９５−１４５−０１ｐまたはＷＯ９５０６１２８に記載のようなイベントＢ１６（＝ＤＬＬ２５）
− ＵＳ規制緩和関係書類９６−２９１−０１ｐ（ＵＳ）に記載のようなイベントＤＢＴ４１８
− イベントＺＭＡ１０１
− ＵＳ規制緩和関係書類９７−２６５−０１ｐ（ＵＳ）に記載のようなイベントＣＢＨ３５１
− ＵＳ規制緩和ファイル９５−２２８−０１ｐ（ＵＳ）に記載のようなイベントＭＳ３
− ＵＳ規制緩和ファイル９８−３４９−０１ｐ（ＵＳ）に記載のようなイベントＭＳ６

イネ（Oryza sativa）
− ＵＳ規制緩和関係書類９８−３２９−０１ｐまたはＷＯ２００１／０８３８１８に記載のようなイベントＬＬＲｉｃｅ６２
− ＵＳ規制緩和関係書類０６−２３４−０１ｐまたは米国特許出願２００８２８９０６０に記載のようなイベントＬＬＲＩＣＥ６０１

ダイズ（Glycine max）
− 規制ファイル９６−０６８−０１ｐ（ＵＳ）に記載のイベントＷ６２およびＷ９８。

それ故、これらのイベントを含むトランスジェニック植物は、本明細書において記載したメガヌクレアーゼのための認識配列を含み、そして本発明の方法のための適切な主題である。さらに、植物において発現可能であるｂａｒ遺伝子は、選択マーカーとして一般的に使用され、そして数多くのトランスジェニック植物が生成され、これもまた本発明の方法のための適切な主題である。

従って、１つの態様において、本発明は、トランスジェニック植物細胞の（核）ゲノムにおいて予め定められたまたは予め選択された部位に外来ＤＮＡ分子を導入するための方法に関し、前記方法は、
ａ．前記の予め定められた部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する工程；
ｂ．前記の植物細胞に前記の外来ＤＮＡ分子を導入する工程；および
ｃ．前記の外来ＤＮＡが前記の予め定められた部位に導入されている植物細胞を選択する工程
を含み、前記の予め定められた部位は、天然に存在するメガヌクレアーゼのための認識部位とは異なるヌクレオチド配列であり、そしてトランスジェニック植物において導入遺伝子の一部として一般的に導入されるヌクレオチド配列であり、そして二本鎖ＤＮＡ切断は、前記の予め定められた部位を認識しそして前記の二本鎖切断を誘導する天然には存在しない一本鎖メガヌクレアーゼの導入か、または前記の予め定められた部位を一緒に認識しそして前記の二本鎖切断を誘導する天然には存在しないメガヌクレアーゼモノマーユニットの対の導入かによって誘導される。

本明細書において使用する「導入遺伝子の一部として植物に一般的に導入されるヌクレオチド配列」は、植物に導入されるキメラ遺伝子のエレメントとして以前に使用されていたＤＮＡ領域のヌクレオチド配列を指し、これによりトランスジェニック植物を容易に入手可能となり、特にこれによりトランスジェニック植物が今まで、現在またはこれから市販され、そして規制当局の承認が申請され、そして公共的に入手可能となる。規制当局の承認のための申請に関する情報を要約および提供するいくつかのデータベースが利用可能であり、これには、オンライン（http://www.cera-gmc.org/?action=gm_crop_database&）で調べることのできる環境リスクアセスメントセンターのＧＭ作物データベース、または、オンライン（http://www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html）で入手可能であるＡＰＨＩＳによって承諾または保留中の非規制状態の請願の要約リストが含まれる。

植物に導入遺伝子の一部として一般的に導入されるＤＮＡ領域としては、プロモーター領域、例えばＣａＭＶ ３５Ｓ転写物の３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985), Nature 313 : 810-812）；ＦＭＶ ３５Ｓプロモーター（Richins R.D., Scholthof H.B., Shepherd R.J. (1987) Sequence of the figwort mosaic virus (caulimovirus group). Nucleic Acids Research 15: 8451-8466）；Arabidopsis thaliana Rubisco遺伝子の小サブユニットのプロモーター（Krebbers E., Seurinck J., Herdies L., Cashmore A. R., Timko M. P. (1988). Four genes in two diverged subfamilies encode the ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit polypeptides of Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology, 11, 745-759）；カッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（Verdaguer et al (1996) Plant Mol. Biol. 31: 1129またはVerdaguer et al (1998) Plant Mol. Biol. 37: 1055）；Arabidopsis（An Y.Q., McDowell J.M., Huang S., McKinney E.C., Chambliss S., Meagher R.B. (1996) Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. The Plant Journal 10: 107-121）またはイネ（McElroy D., Zhang W., Cao J., Wu R. (1990) Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transfomation. The Plant Cell 2: 163-171）由来のアクチン２プロモーター；ヒストンＨ３プロモーターまたはヒストンＨ４プロモーター（Chaboute M, Chaubet N, Philipps G, Ehling M and Gigot C (1987) Genomic organization and nucleotide sequences of two histone H3 and two histone H4 genes of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 8: 179-191）；メイズ（Zea mays）ユビキチン−１遺伝子のプロモーター（Christensen et al (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675）；５’ＵＴＲリーダー配列、例えばｃａｂ２２Ｌリーダー（Harpster M, Townsend J, Jones J, Bedbrook J and Dunsmuir P.(1988) Relative strengths of the 35S cauliflower mosaic virus, 1', 2' and nopaline synthase promoters in transformed tobacco, sugarbeet and oilseed rape callus tissue. Mol Gen Genet. 212:182-190）；または５’ｔｅｖ（Carrington J and Freed D (1990) Cap-independent enhancement of translation by a plant potyvirus 5' nontranslated region. J Virol 64(4): 1590-1597）；ノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端（Depicker A., Stachel S., Dhaese P., Zambryski P., Goodman H.M. (1982). Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Journal of Molecular and Applied Genetics 1, 561-573）；オクトピンシンターゼ遺伝子の３’末端（De Greve H., Dhaese P., Seurinck J., Lemmers M., Van Montagu M., Schell J. (1982). Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene. Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 499-511）；ＣａＭＶ３５Ｓ転写終結因子（Sanfacon et al (1991) Genes Dev. 5: 141）、オクトピン型Ｔ−ＤＮＡベクターの遺伝子７の転写終結およびポリアデニル化領域(D'Haese et al, 1983, The EMBO Journal, 2, 419-426)およびｂａｒなどの選択マーカー（Thompson, C., Movva, R., Tizard, R., Crameri, R., Davies, J., Lauwereys, M. ans Botterman, J. (1987) Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal 6: 2519-2523 (アクセッション X05822)）；ｐａｔ（Wohlleben,W., Arnold,W., Broer,I., Hillemann,D., Strauch,E. and Puhler,A. Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tu494 and its expression in Nicotiana tabacum. Gene 70 (1), 25-37 (1988)）；２ｍｅｐｓｐｓ（米国特許第６５６６５８７号からの配列４またはＥＭＢＬ番号ＡＲ３３７８３２）；ＣＰ４（Padgette S.R., Re D., Barry G., Eichholtz D., Delannay X., Fuchs R.L., Kishore G.M., Fraley R.T. (1996). New weed control opportunities: development of soybeans with a Roundup Ready gene. In Herbicide-Resistant Crops: Agricultural, Environmental, Econ...., neo Accession V00618; Beck et al (1982) Gene 19(3) p327-336）；またはｈｐｔ（Kaster et al., (1983), NAR 11, 6895-6911）が挙げられる。

本発明の脈絡において好ましいＤＮＡ領域は、前記したようなｂａｒ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列である。

本明細書において記載した再設計されたメガヌクレアーゼは、足場としての使用のための天然に存在するメガヌクレアーゼＩ−ＣｒｅＩに基づく。Ｉ−ＣｒｅＩは、Chlamydomonas rheinhardtiの葉緑体に見られるホーミングエンドヌクレアーゼである（Thompson et al. 1992, Gene 119, 247-251）。このエンドヌクレアーゼは、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子における疑似パリンドローム２２ｂｐＤＮＡ部位を認識し、そしてイントロンの導入のために使用される二本鎖ＤＮＡ切断を作るホモダイマーである。Ｉ−ＣｒｅＩは、１つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するエンドヌクレアーゼ群のメンバーである。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ酵素は１または２コピーの共通モチーフを含む。Ｉ−ＣｒｅＩなどの単一モチーフ酵素はホモダイマーとして機能するが、二重モチーフ酵素は２つの別々のドメインを有するモノマーである。従って、対象の２２ｂｐヌクレオチド配列を認識するＩ−ＣｒｅＩ足場に由来するメガヌクレアーゼを再設計する場合、２つのモノマーユニットが設計され、各々は２２ｂｐ認識部位の一部を認識し、これは協調して２２ｂｐ認識部位において二本鎖切断を誘導するのに必要とされる（ＷＯ２００７／０４７８５９）。協調された作用は、２つのモノマーユニットを１本鎖メガヌクレアーゼに連結することによって達成され得るか、または例えばＷＯ２００７／０４７８５９に記載のようなヘテロダイマーの形成を促進することによっても達成され得る。

天然に存在するＩ−ＣｒｅＩモノマーのアミノ酸配列は配列番号１６として提供される。そのヘテロダイマーが配列番号１および／または２のヌクレオチド配列を認識するようにＩ−ＣｒｅＩモノマーユニットを再設計するために、以下のアミノ酸が記載の位置に存在する：
１．メガヌクレアーゼユニット１において：
ａ．３２位におけるＳ；
ｂ．３３位におけるＹ；
ｃ．３８位におけるＥ；
ｄ．４０位におけるＲ；
ｅ．６６位におけるＫ；
ｆ．８０位におけるＱ；
ｇ．４２位におけるＴ；
ｈ．７７位におけるＲ；
ｉ．６８位におけるＲ；
ｊ．７０位におけるＲ；
ｋ．４４位におけるＱ；
ｌ．２４位におけるＩ；
ｍ．２６位におけるＳ；
ｎ．２８位におけるＳ；
ｏ．３０位におけるＲ；
２．メガヌクレアーゼユニット２において：
ｐ．７０位におけるＲ；
ｑ．４４位におけるＴ；
ｒ．２４位におけるＩ；
ｓ．２６位におけるＳ；
ｔ．２８位におけるＳ；
ｕ．３０位におけるＮ；
ｖ．３２位におけるＳ；
ｗ．３３位におけるＲ；
ｘ．３８位におけるＱ；
ｙ．８０位におけるＱ；
ｚ．４０位におけるＲ；
ａａ．６６位におけるＫ；
ｂｂ．４２位におけるＴ；
ｃｃ．７７位におけるＲ；
ｄｄ．６８位におけるＲ。

その図解を図１に提供する。

再設計された二本鎖切断誘導酵素は、ＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳなどの核移行シグナル（ＮＬＳ）を含んでいてもよいが、含む必要はない［Raikhel, Plant Physiol. 100: 1627-1632 (1992)およびその中の参考文献］［Kalderon et al. Cell 39: 499-509 (1984)］。核移行シグナルは、タンパク質中のどの場所にも位置し得るが、簡便にはタンパク質のＮ末端に位置する。核移行シグナルは、二本鎖切断誘導酵素のアミノ酸の１つ以上を置換し得る。再設計されたメガヌクレアーゼに、タンパク質のＮ末端において、１０または１２アミノ酸のＳＶ４０のＮＬＳなどのＮＬＳが付与された場合、アミノ酸の位置はそれに従ってシフト（増加）することを注記すべきである。同様に、２つのモノマーユニットが連結して一本鎖のメガヌクレアーゼになった事象においても、第二ユニットの位置はシフトするだろう。Ｉ−ＣｒｅＩアミノ酸配列に関する対応するアミノ酸位置はまた、以下に記載したような最適なアラインメントを決定することによって同定され得る。一本鎖の再設計されたメガヌクレアーゼにおいてユニットの順序は関係なく、すなわち、合わせた２つのユニットが標的配列を認識できるためには、上記のユニット１および２が単一アミノ酸鎖においてその順序で実際に存在するか、またはユニット２が単一アミノ酸鎖においてユニット１に先行するかには差異がないことは明らかである。

本発明に適した再設計されたメガヌクレアーゼは、配列番号５および６に示されるようなアミノ酸配列（ヘテロダイマーとして認識部位を開裂することのできるモノマーユニット）を含み得るか、または配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列（アミノ酸１６８から２０５によって示されるリンカー配列によって連結された、それぞれアミノ酸１から１６７までおよび２０８から３６２までによって示される２つのユニットを含む一本鎖メガヌクレアーゼ）を含み得るか、または配列番号１８の１から１６７までおよび２０６から３６２までのアミノ酸配列（それぞれリンカーを含まない一本鎖メガヌクレアーゼのユニット１および２）を含むアミノ酸配列を含み得る。

簡便には、再設計されたメガヌクレアーゼ（群）は、このようなメガヌクレアーゼ（群）をコードする植物で発現可能な組換え遺伝子（群）の発現によって提供され得る。この目的を達成するために、再設計されたメガヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼモノマーユニットをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ領域を、植物で発現可能なプロモーター並びに転写終結およびポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域に作動可能に連結させることができ、そして植物または植物細胞に導入することができる。再設計されたメガヌクレアーゼ（群）をコードする組換え遺伝子（群）は一過性にまたは安定に導入され得る。

本発明の目的のための「植物で作動するプロモーター」および「植物で発現可能なプロモーター」という用語は、植物、植物組織、植物器官、植物部分または植物細胞において転写を駆動することのできるプロモーターを意味する。これは、植物起源の任意のプロモーターを含むが、植物細胞において転写を指令することのできる非植物起源の任意のプロモーターも含む。

この観点から使用され得るプロモーターは、構成プロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写物プロモーター（Hapster et al.,1988, Mol. Gen. Genet. 212: 182-190）、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター（米国特許第５，３５２，６０５；ＷＯ８４／０２９１３；Benfey et al., 1989, EMBO J. 8:2195-2202）、サブタレニアン・クローバー（subterranean clover）ウイルスプロモーターＮｏ４またはＮｏ７（ＷＯ９６／０６９３２）、Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットプロモーター（米国特許第４，９６２，０２８）、ユビキチンプロモーター（Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29:637-649）、Agrobacterium由来のオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）およびノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーターなどのＴ−ＤＮＡ遺伝子プロモーター、および植物における構成的発現が当業者に公知である遺伝子のさらに他のプロモーターである。

この観点から使用され得るさらに他のプロモーターは、組織特異的または器官特異的プロモーター、好ましくは種子特異的プロモーター、例えば２Ｓアルブミンプロモーター（Joseffson et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:12196-12201）、ファゼオリンプロモーター（米国特許第５，５０４，２００；Bustos et al., 1989, Plant Cell 1.(9):839-53）、レグミン（legumine）プロモーター（Shirsat et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 215(2):326-331）、「未知の種子タンパク質（unknown seed protein）」（ＵＳＰ）プロモーター（Baumlein et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 225(3):459-67）、ナピン（napin）プロモーター（米国特許第５，６０８，１５２；Stalberg et al., 1996, Planta 199:515-519）、Arabidopsisオレオシンプロモーター（ＷＯ９８／４５４６１）、Brassica Bce4プロモーター（ＷＯ９１／１３９８０）、および植物における種子特異的発現が当業者に公知である遺伝子のさらに他のプロモーターである。

使用することのできる他のプロモーターは、組織特異的または器官特異的プロモーター、例えば器官原基特異的プロモーター（An et al., 1996, Plant Cell 8: 15-30）、幹特異的プロモーター（Keller et al., 1988, EMBO J. 7(12): 3625-3633）、葉特異的プロモーター（Hudspeth et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 579-589）、葉肉特異的プロモーター（例えば光誘導性Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター）、根特異的プロモーター（Keller et al., 1989, Genes Dev. 3: 1639-1646）、塊茎特異的プロモーター（Keil et al., 1989, EMBO J. 8(5): 1323-1330）、維管束組織特異的プロモーター（Peleman et al., 1989, Gene 84: 359-369）、雄しべ選択的プロモーター（ＷＯ８９／１０３９６，ＷＯ９２／１３９５６）、裂開部特異的プロモーター（ＷＯ９７／１３８６５）などである。

本発明のために適した再設計されたメガヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド２００４位からヌクレオチド２５２５位または２５２２位までのヌクレオチド配列、または配列番号４のヌクレオチド４８８５位からヌクレオチド５４０５位または５４０３位までのヌクレオチド配列を含み得る。クローニングおよび他の組換えＤＮＡ技術を促進するために、植物において機能するイントロンを、メガヌクレアーゼ、特に一本鎖メガヌクレアーゼをコードする領域に含めることが有利であり得る。このようなイントロンは、例えば、配列番号１７のヌクレオチド１６０６位から１７９４位までのヌクレオチド配列を含み得る。

再設計されたメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ領域は、ＧＣ含量、コドン使用頻度、望ましくないヌクレオチド配列の排除によって植物における発現のために最適化され得る。コドン領域は、植物における発現のためにさらに最適化され得、そして合成コード領域は、以下の規準を満たすように設計されたヌクレオチド配列を有し得る：
ａ）ヌクレオチド配列は、本明細書に記載したような機能的な再設計されたホーミングエンドヌクレアーゼをコードする；
ｂ）ヌクレオチド配列は、約５０％から約６０％のＧＣ含量を有する；
ｃ）ヌクレオチド配列は、ＧＡＴＡＡＴ，ＴＡＴＡＡＡ，ＡＡＴＡＴＡ，ＡＡＴＡＴＴ，ＧＡＴＡＡＡ，ＡＡＴＧＡＡ，ＡＡＴＡＡＧ，ＡＡＴＡＡＡ，ＡＡＴＡＡＴ，ＡＡＣＣＡＡ，ＡＴＡＴＡＡ，ＡＡＴＣＡＡ，ＡＴＡＣＴＡ，ＡＴＡＡＡＡ，ＡＴＧＡＡＡ，ＡＡＧＣＡＴ，ＡＴＴＡＡＴ，ＡＴＡＣＡＴ，ＡＡＡＡＴＡ，ＡＴＴＡＡＡ，ＡＡＴＴＡＡ，ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まない；
ｄ）ヌクレオチドは、ＣＣＡＡＴ，ＡＴＴＧＧ，ＧＣＡＡＴおよびＡＴＴＧＣからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含まない；
ｅ）ヌクレオチド配列は、ＡＴＴＴＡ，ＡＡＧＧＴ，ＡＧＧＴＡ，ＧＧＴＡまたはＧＣＡＧＧからなる群より選択される配列を含まない；
ｆ）ヌクレオチド配列は、ＧまたはＣの群から選択される７つの連続的なヌクレオチドからなるＧＣストレッチを含まない；
ｇ）ヌクレオチド配列は、ＡまたはＴの群から選択される５つの連続したヌクレオチドからなるＡＴストレッチを含まない；および
ｈ）ヌクレオチド配列は、２位および３位にＴＡまたはＣＧデュプレットを含むＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａｌａをコードするコドンを含まない（すなわち、ヌクレオチド配列は、コドンＴＴＡ，ＣＴＡ，ＡＴＡ，ＧＴＡ，ＴＣＧ，ＣＣＧ，ＡＣＧおよびＧＣＧを含まない）。

このような最適化された配列の例は、配列番号１７のヌクレオチド１２６７位から１６０５位までおよびヌクレオチド１７９５位から２５４１位までによって示される（２つのメガヌクレアーゼユニットの間に存在するリンカーをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１９５７位から２０７０位によって示される）。

また、「ＤＮＡフラグメントの導入」並びに「細胞からの植物の再生」などの方法を記載するために使用される用語は、このようなＤＮＡフラグメントが必ずしも形質転換技術によって導入される必要があることを意味しないことは明らかである。実際に、対象のＤＮＡ分子を、ある植物から別の植物へと繁殖または交雑することによっても導入され得ることが当業者には直ちに明らかになるであろう。

しかしながら、対象のＤＮＡ分子は、Agrobacteriumによって媒介される形質転換を含む当技術分野において公知の任意の方法によって、しかしまた直接的なＤＮＡ導入法によっても、植物細胞に導入され得ることは明らかである。形質転換するＤＮＡ分子は、直接的なＤＮＡ導入法を含むがそれに限定されない、任意の慣用的な方法を使用して植物細胞に導入され得る。本明細書において使用する「直接的なＤＮＡ導入」は、天然のAgrobacterium属の使用を含まず、そして植物細胞にＤＮＡを導入することのできる、植物細胞にＤＮＡを導入する任意の方法である。これは、プロトプラストへの電気穿孔によるＤＮＡの導入、インタクトな植物細胞または部分的に分解した組織または植物細胞への電気穿孔によるＤＮＡの導入、プロトプラストへのＰＥＧなどの薬剤の作用を通してのＤＮＡの導入、シリコンウィスカー（whiskers）の使用、およびＤＮＡでコーティングされた微粒子を用いての衝撃などの当技術分野において周知の方法を含む。

予め選択された部位に二本鎖切断を誘導できることは、いくつかの可能性ある適用を開拓する。対象の外来ＤＮＡを、予め選択された部位に、相同的組換えによって、または非相同的末端結合のプロセスのいずれかにおいて導入し得る。また、二本鎖切断を使用して、予め選択された部位に小さな欠失または挿入の形成を誘導し得、これにより、予め選択された部位のヌクレオチド配列を含むキメラ遺伝子を不活性化させる可能性がある。予め選択された部位における二本鎖切断はまた、例えば、ＷＯ０６／１０５９４６、ＷＯ０８／０３７４３６またはＷＯ０８／１４８５５９に記載のように、その部位の近傍のＤＮＡ領域を対象のＤＮＡ領域で置換することを容易にする。

予め選択された部位に相同的組換えによって外来ＤＮＡを挿入するために、外来ＤＮＡは修復ＤＮＡ内に含まれ得、外来ＤＮＡは、予め選択された部位の上流または下流のＤＮＡ領域のヌクレオチド配列に類似したヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのフランキングＤＮＡ領域によってフランキングされている。修復ＤＮＡは、外来ＤＮＡの上流または下流にあり、そして予め選択された部位の上流または下流のＤＮＡ領域のヌクレオチド配列に類似した、２つのフランキングＤＮＡ領域によってフランキングされた挿入しようとする外来ＤＮＡを含み得る。あるいは、外来ＤＮＡは、それ自体で、すなわち、非相同的末端結合による組込みのために、予め定められた標的部位の周りの領域に対して相同性を有するフランキング配列を伴うことなく（さらに他のＤＮＡを全く用いることなく）組込まれ得る。

本明細書において使用する「フランキングＤＮＡ領域」は、標的ＤＮＡ配列または予め選択された部位のそれぞれ上流または下流のＤＮＡ領域に対して相同性を有するヌクレオチド配列を有するＤＮＡである。これは、対象の外来ＤＮＡまたはＤＮＡ分子の挿入をより良好に制御することを可能とする。実際に、相同的組換えによる組込みは、植物核ゲノムへの外来ＤＮＡフラグメントの正確な結合をヌクレオチドレベルまで可能とする。

フランキングＤＮＡ領域は長さが異なり得、そして少なくとも約１０ヌクレオチド長とすべきである。しかしながら、フランキング領域は実践的に可能である限り長くあり得る（例えば、完全細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）などの約１００〜１５０ｂｐまで）。好ましくは、フランキング領域は約５０ｂｐから約２０００ｂｐである。さらに、対象の外来ＤＮＡをフランキングする領域は、予め選択された部位にフランキングするＤＮＡ領域と同一である必要はなく、そして予め選択された部位にフランキングするＤＮＡ領域と約８０％〜約１００％の配列同一性、好ましくは約９５％〜約１００％の配列同一性を有し得る。フランキング領域が長ければ長いほど、相同性に対する必要条件はストリンジェントではなくなる。さらに、配列同一性は、外来ＤＮＡの正確な挿入位置の近傍では実践的に可能である限りできるだけ高いことが好ましい。さらに、隣接するＤＮＡ配列のＤＮＡ配列を変化させることなく、標的ＤＮＡ配列の交換を達成するために、フランキングＤＮＡ配列は、好ましくは、予め選択された部位にフランキングするＤＮＡ領域に対して同一であるべきである。

さらに、対象の外来ＤＮＡにフランキングする領域は、予め選択された部位に直接的にフランキングする領域に対して相同性を有する必要はないが、その予め選択された部位からさらに遠く離れた核ゲノムのＤＮＡ領域に対して相同性を有し得る。その後、外来ＤＮＡの挿入により、予め選択された挿入部位と、相同性を有するＤＮＡ領域との間で標的ＤＮＡの除去が起こる。別の言葉で言えば、相同性領域の間に位置していた標的ＤＮＡは、対象の外来ＤＮＡで置換される。従って、本発明の方法に従って外来ＤＮＡ分子を導入することによって、二本鎖ＤＮＡ切断の修復のための外来ＤＮＡの適切な立体配置を選択することによって、挿入に加えて、相同性領域間に位置するゲノム領域の標的化置換または標的化欠失を行なうこともできる。

挿入しようとする外来ＤＮＡは選択マーカーまたはスクリーニング可能なマーカーも含み得、これは挿入後に除去されてもまたは除去されなくてもよい。

本明細書において使用する「選択マーカーまたはスクリーニング可能なマーカー」は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、そしてこれには、植物で発現可能なホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、グリホサートオキシダーゼ、グリホサート耐性ＥＰＳＰ酵素、ニトリラーゼ遺伝子、突然変異アセト乳酸シンターゼまたはアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、Ｒ遺伝子座の遺伝子、緑蛍光タンパク質などが挙げられるがそれらに限定されない。

選択マーカーまたはスクリーニング可能なマーカーおよび外来ＤＮＡ分子の残りが相同的組換えによってフランキングＤＮＡ領域を通して導入されている植物細胞または植物の選択は、例えば、形質転換ＤＮＡに存在するが、しかしフランキングＤＮＡ領域の外側に位置する配列の不在についてスクリーニングすることによって達成され得る。実際に、フランキングＤＮＡ領域外の形質転換ＤＮＡの配列の存在は、形質転換された植物細胞の起源がランダムなＤＮＡ挿入によることを示す。この目的を達成するために、選択マーカーまたはスクリーニング可能なマーカーを、フランキングＤＮＡ領域外の形質転換ＤＮＡ分子に含め得、これをその後使用して、形質転換ＤＮＡの外に位置する選択マーカーまたはスクリーニング可能なマーカーを有さず、そしてフランキングＤＮＡ領域を通した相同的組換えによって生じ得た植物細胞を同定し得る。あるいは、形質転換ＤＮＡ分子は、このような遺伝子（ネガティブ選択マーカー遺伝子）の不在についての選択を可能とする、フランキングＤＮＡ領域外の選択マーカーを含み得る。

本発明による方法は、例えばその後の同定のための特定のヌクレオチド配列サインを有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む、対象の任意のＤＮＡの挿入を可能とすることは明らかである。対象のＤＮＡはまた、除草剤耐性遺伝子、昆虫耐性遺伝子、疾病耐性遺伝子、非生物的ストレス耐性遺伝子、油生合成または炭水化物生合成に関与する酵素、線維の強度および／または長さに関与する酵素、二次代謝物の生合成に関与する酵素を含むがそれらに限定されない１つ以上の植物で発現可能な遺伝子（群）であり得る。

除草剤耐性遺伝子は、酵素５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子を含む。このようなＥＰＳＰＳ遺伝子の例は、細菌Salmonella typhimuriumのＡｒｏＡ遺伝子（突然変異体ＣＴ７）（Comai et al., 1983, Science 221, 370-371）、細菌Agrobacterium属のＣＰ４遺伝子（Barry et al., 1992, Curr. Topics Plant Physiol. 7, 139-145）、ペチュニアＥＰＳＰＳをコードする遺伝子（Shah et al., 1986, Science 233, 478-481）、トマトＥＰＳＰＳ（Gasser et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 4280-4289）、またはエネウシネエレウシネ（Eleusine）ＥＰＳＰＳ（ＷＯ０１／６６７０４）である。それはまた、例えばＥＰ０８３７９４４、ＷＯ００／６６７４６、ＷＯ００／６６７４７またはＷＯ０２／２６９９５に記載のような突然変異ＥＰＳＰＳであり得る。また、グリホサート耐性植物は、米国特許第５，７７６，７６０号および第５，４６３，１７５号に記載のようなグリホサートオキシドレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を発現させることによって得ることができる。グリホサート耐性植物はまた、例えばＷＯ０２／３６７８２、ＷＯ０３／０９２３６０、ＷＯ０５／０１２５１５およびＷＯ０７／０２４７８２に記載のようなグリホサートアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子を発現させることによって得ることができる。グリホサート耐性植物はまた、例えばＷＯ０１／０２４６１５またはＷＯ０３／０１３２２６に記載のように、前記した遺伝子の天然に存在する突然変異を含む植物を選択することによって得ることができる。グリホサート耐性を付与するＥＰＳＰＳ遺伝子は、例えば、米国特許出願第１１／５１７，９９１、１０／７３９，６１０、１２／１３９，４０８、１２／３５２，５３２、１１／３１２，８６６、１１／３１５，６７８、１２／４２１，２９２、１１／４００，５９８、１１／６５１，７５２、１１／６８１，２８５、１１／６０５，８２４、１２／４６８，２０５、１１／７６０，５７０、１１／７６２，５２６、１１／７６９，３２７、１１／７６９，２５５、１１／９４３８０１または１２／３６２，７７４号に記載されている。グリホサート耐性を付与する他の遺伝子、例えばデカルボキシラーゼ遺伝子は、例えば、米国特許出願１１／５８８，８１１、１１／１８５，３４２、１２／３６４，７２４、１１／１８５，５６０または１２／４２３，９２６に記載されている。

他の除草剤耐性遺伝子は、除草剤を解毒する酵素または例えば米国特許出願第１１／７６０，６０２号に記載の阻害に耐性である突然変異体のグルタミンシンターゼ酵素をコードし得る。１つのこのような効率的な解毒酵素は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする酵素である（Streptomyces種由来のｂａｒまたはｐａｔタンパク質など）。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼは、例えば、米国特許第５，５６１，２３６；５，６４８，４７７；５，６４６，０２４；５，２７３，８９４；５，６３７，４８９；５，２７６，２６８；５，７３９，０８２；５，９０８，８１０および７，１１２，６６５号に記載されている。

除草剤耐性遺伝子はまた、酵素ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）を阻害する除草剤に対して耐性を付与し得る。ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼは、パラ−ヒドロキシフェニルピルベート（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸に転換される反応を触媒する酵素である。ＨＰＰＤ阻害剤に対して耐性である植物を、天然に存在する耐性ＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子を用いて、またはＷＯ９６／３８５６７、ＷＯ９９／２４５８５およびＷＯ９９／２４５８６、ＷＯ２００９／１４４０７９、ＷＯ２００２／０４６３８７もしくはＵＳ６，７６８，０４４に記載のような突然変異またはキメラＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子を用いて形質転換することができる。ＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性はまた、ＨＰＰＤ阻害剤による天然ＨＰＰＤ酵素の阻害にも関わらず、ホモゲンチジン酸の形成を可能とする特定の酵素をコードする遺伝子を用いて植物を形質転換することによって得ることができる。このような植物および遺伝子は、ＷＯ９９／３４００８およびＷＯ０２／３６７８７に記載されている。ＨＰＰＤ阻害剤に対する植物の耐性はまた、ＷＯ２００４／０２４９２８に記載のように、ＨＰＰＤ耐性酵素をコードする遺伝子に加えて、プレフェナートデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）活性を有する酵素をコードする遺伝子を用いて植物を形質転換することによって改良され得る。さらに、植物を、そのゲノムに、ＷＯ２００７／１０３５６７およびＷＯ２００８／１５０４７３に示されるＣＹＰ４５０酵素などのＨＰＰＤ阻害剤を代謝または分解することのできる酵素をコードする遺伝子を加えることによって、ＨＰＰＤ阻害剤の除草剤に対してより耐性とさせることができる。

さらに他の除草剤耐性遺伝子は、例えばTranel and Wright (2002, Weed Science 50:700-712)に、しかしまた、米国特許第５，６０５，０１１、５，３７８，８２４、５，１４１，８７０、および５，０１３，６５９号にも記載されているような変異ＡＬＳ酵素（またアセトヒドロキシ酸シンターゼとしても知られる、ＡＨＡＳ）をコードする。スルホニル尿素耐性植物およびイミダゾリノン耐性植物の産生が、米国特許第５，６０５，０１１；５，０１３，６５９；５，１４１，８７０；５，７６７，３６１；５，７３１，１８０；５，３０４，７３２；４，７６１，３７３；５，３３１，１０７；５，９２８，９３７および５，３７８，８２４号および国際公開公報ＷＯ９６／３３２７０に記載されている。他のイミダゾリノン耐性遺伝子はまた、例えば、ＷＯ２００４／０４００１２、ＷＯ２００４／１０６５２９、ＷＯ２００５／０２０６７３、ＷＯ２００５／０９３０９３、ＷＯ２００６／００７３７３、ＷＯ２００６／０１５３７６、ＷＯ２００６／０２４３５１およびＷＯ２００６／０６０６３４にも記載されている。さらなるスルホニル尿素およびイミダゾリノン耐性遺伝子は、例えば、ＷＯ０７／０２４７８２および米国特許出願第６１／２８８９５８号に記載されている。

昆虫耐性遺伝子は、以下をコードするコード配列を含み得る：
１）Bacillus thuringiensis由来の殺昆虫性結晶タンパク質またはその殺昆虫性部分、例えば、オンライン（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/）のBacillus thuringiensis毒素命名法でCrickmore et al. (2005)によってアップデートされているCrickmore et al. (1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62: 807-813)によって列挙された殺昆虫性結晶タンパク質、またはその殺昆虫性部分、例えば、Ｃｒｙタンパク質クラスＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ３ＡａもしくはＣｒｙ３Ｂｂのタンパク質またはその殺昆虫性部分（例えばＥＰ１９９９１４１およびＷＯ２００７／１０７３０２）、または米国特許出願第１２／２４９，０１６号に記載のような合成遺伝子によってコードされるこのようなタンパク質；
２）Bacillus thuringiensis由来の第二の他の結晶タンパク質またはその部分の存在下で殺昆虫性である、Bacillus thuringiensis由来の結晶タンパク質またはその部分、例えば、Ｃｒｙ３４およびＣｒｙ３５結晶タンパク質からなる二元毒素（Moellenbeck et al. 2001, Nat. Biotechnol. 19: 668-72; Schnepf et al. 2006, Applied Environm. Microbiol. 71, 1765-1774）またはＣｒｙ１ＡもしくはＣｒｙ１Ｆタンパク質およびＣｒｙ２ＡａもしくはＣｒｙ２ＡｂもしくはＣｒｙ２Ａｅタンパク質からなる二元毒素（米国特許出願第１２／２１４，０２２号およびＥＰ０８０１０７９１．５）；または
３）Bacillus thuringiensis由来の種々の殺昆虫結晶タンパク質の部分を含むハイブリッド殺昆虫タンパク質、例えば前記の１）のタンパク質のハイブリッドまたは前記の２）のタンパク質のハイブリッド、例えば、コーン（corn）イベントＭＯＮ８９０３４（ＷＯ２００７／０２７７７７）によって産生されるＣｒｙ１Ａ．１０５；または
４）前記の１）から３）のいずれか１つのタンパク質（いくつかの、特に１〜１０のアミノ酸が、標的昆虫種に対するより高い殺昆虫活性を得るために、および／または影響を受ける標的昆虫種の範囲を広げるために、および／またはクローニングまたは形質転換中にコードされるＤＮＡに導入された変化のために、別のアミノ酸によって置換されている）、例えばコーンイベントＭＯＮ８６３またはＭＯＮ８８０１７におけるＣｒｙ３Ｂｂ１タンパク質、またはコーンイベントＭＩＲ６０４におけるＣｒｙ３Ａタンパク質；または
５）Bacillus thuringiensisまたはBacillus cereus由来の殺昆虫性分泌タンパク質、またはその殺昆虫性部分、例えばhttp://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.htmlに列挙された植物性殺昆虫性（ＶＩＰ）タンパク質、例えばＶＩＰ３Ａａタンパク質クラスのタンパク質；または
６）Bacillus thuringiensisまたはBacillus cereus由来の第二の分泌タンパク質の存在下において殺昆虫性であるBacillus thuringiensisまたはBacillus cereus由来の分泌タンパク質、例えばＶＩＰ１ＡおよびＶＩＰ２Ａタンパク質からなる二元毒素（ＷＯ９４／２１７９５）；または
７）Bacillus thuringiensisまたはBacillus cereus由来の種々の分泌タンパク質からの部分を含むハイブリッド殺昆虫性タンパク質、例えば、前記の１）のタンパク質のハイブリッドまたは前記の２）のタンパク質のハイブリッド；または
８）前記の５）から７）のいずれか１つのタンパク質（いくつかの、特に１〜１０のアミノ酸が、標的昆虫種に対するより高い殺昆虫活性を得るために、および／または影響を受ける標的昆虫種の範囲を広げるために、および／またはクローニングまたは形質転換中（依然として殺昆虫性タンパク質をコードしている）にコードＤＮＡに導入された変化のために、別のアミノ酸によって置換されている）、例えばワタイベントＣＯＴ１０２におけるＶＩＰ３Ａａタンパク質；または
９）Bacillus thuringiensis由来の結晶タンパク質の存在下において殺昆虫性であるBacillus thuringiensisまたはBacillus cereus由来の分泌タンパク質、例えば、ＶＩＰ３とＣｒｙ１ＡまたはＣｒｙ１Ｆとからなる二元毒素（米国特許出願第６１／１２６０８３号および第６１／１９５０１９号）またはＶＩＰ３タンパク質とＣｒｙ２ＡａまたはＣｒｙ２ＡｂまたはＣｒｙ２Ａｅタンパク質からなる二元毒素（米国特許出願第１２／２１４，０２２号およびＥＰ０８０１０７９１．５）；
１０）前記の９）のタンパク質（いくつかの、特に１〜１０のアミノ酸が、標的昆虫種に対するより高い殺昆虫活性を得るために、および／または影響を受ける標的昆虫種の範囲を広げるために、および／またはクローニングまたは形質転換中（依然として殺昆虫性タンパク質をコードしている）にコードＤＮＡに導入された変化のために、別のアミノ酸によって置換されている）。

本明細書において使用する「昆虫耐性遺伝子」はさらに、例えば、ＷＯ２００７／０８０１２６、ＷＯ２００６／１２９２０４、ＷＯ２００７／０７４４０５、ＷＯ２００７／０８０１２７およびＷＯ２００７／０３５６５０に記載のように、植物害虫による摂取時にこの害虫の成長を阻害する二本鎖ＲＮＡを発現時に産生する配列を含む導入遺伝子を含む。

非生物的ストレス耐性遺伝子は、以下を含む。
１）ＷＯ００／０４１７３、ＷＯ／２００６／０４５６３３、ＥＰ０４０７７９８４．５またはＥＰ０６００９８３６．５に記載のような植物細胞または植物におけるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）遺伝子の発現および／または活性を減少させることのできる導入遺伝子。
２）例えばＷＯ２００４／０９０１４０に記載のように、植物または植物細胞のＰＡＲＧコード遺伝子の発現および／または活性を減少させることのできる導入遺伝子。
３）例えばＥＰ０４０７７６２４．７、ＷＯ２００６／１３３８２７、ＰＣＴ／ＥＰ０７／００２４３３、ＥＰ１９９９２６３またはＷＯ２００７／１０７３２６に記載のような、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドサルベージ合成経路の植物で機能する酵素（ニコチンアミダーゼ、ニコチネートホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンターゼまたはニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼを含む）をコードする導入遺伝子。

炭水化物生合成に関与する酵素は、例えば、ＥＰ０５７１４２７、ＷＯ９５／０４８２６、ＥＰ０７１９３３８、ＷＯ９６／１５２４８、ＷＯ９６／１９５８１、ＷＯ９６／２７６７４、ＷＯ９７／１１１８８、ＷＯ９７／２６３６２、ＷＯ９７／３２９８５、ＷＯ９７／４２３２８、ＷＯ９７／４４４７２、ＷＯ９７／４５５４５、ＷＯ９８／２７２１２、ＷＯ９８／４０５０３、ＷＯ９９／５８６８８、ＷＯ９９／５８６９０、ＷＯ９９／５８６５４、ＷＯ００／０８１８４、ＷＯ００／０８１８５、ＷＯ００／０８１７５、ＷＯ００／２８０５２、ＷＯ００／７７２２９、ＷＯ０１／１２７８２、ＷＯ０１／１２８２６、ＷＯ０２／１０１０５９、ＷＯ０３／０７１８６０、ＷＯ２００４／０５６９９９、ＷＯ２００５／０３０９４２、ＷＯ２００５／０３０９４１、ＷＯ２００５／０９５６３２、ＷＯ２００５／０９５６１７、ＷＯ２００５／０９５６１９、ＷＯ２００５／０９５６１８、ＷＯ２００５／１２３９２７、ＷＯ２００６／０１８３１９、ＷＯ２００６／１０３１０７、ＷＯ２００６／１０８７０２、ＷＯ２００７／００９８２３、ＷＯ００／２２１４０、ＷＯ２００６／０６３８６２、ＷＯ２００６／０７２６０３、ＷＯ０２／０３４９２３、ＥＰ０６０９０１３４．５、ＥＰ０６０９０２２８．５、ＥＰ０６０９０２２７．７、ＥＰ０７０９０００７．１、ＥＰ０７０９０００９．７、ＷＯ０１／１４５６９、ＷＯ０２／７９４１０、ＷＯ０３／３３５４０、ＷＯ２００４／０７８９８３、ＷＯ０１／１９９７５、ＷＯ９５／２６４０７、ＷＯ９６／３４９６８、ＷＯ９８／２０１４５、ＷＯ９９／１２９５０、ＷＯ９９／６６０５０、ＷＯ９９／５３０７２、ＵＳ６，７３４，３４１、ＷＯ００／１１１９２、ＷＯ９８／２２６０４、ＷＯ９８／３２３２６、ＷＯ０１／９８５０９、ＷＯ０１／９８５０９、ＷＯ２００５／００２３５９、ＵＳ５，８２４，７９０、ＵＳ６，０１３，８６１、ＷＯ９４／０４６９３、ＷＯ９４／０９１４４、ＷＯ９４／１１５２０、ＷＯ９５／３５０２６またはＷＯ９７／２０９３６に記載のもの、またはＥＰ０６６３９５６、ＷＯ９６／０１９０４、ＷＯ９６／２１０２３、ＷＯ９８／３９４６０およびＷＯ９９／２４５９３に開示されているようなポリフルクトース、特にイヌリンおよびレバンタイプの産生に関与する酵素、ＷＯ９５／３１５５３、ＵＳ２００２０３１８２６、ＵＳ６，２８４，４７９、ＵＳ５，７１２，１０７、ＷＯ９７／４７８０６、ＷＯ９７／４７８０７、ＷＯ９７／４７８０８およびＷＯ００／１４２４９に開示されているようなα−１，４−グルカンの産生に関与する酵素、ＷＯ００／７３４２２に開示されているようなα−１，６−分岐α−１，４−グルカンの産生に関与する酵素、例えばＷＯ００／４７７２７、ＷＯ００／７３４２２、ＥＰ０６０７７３０１．７、ＵＳ５，９０８，９７５およびＥＰ０７２８２１３に開示されているようなアルテルナンの産生に関与する酵素、例えばＷＯ２００６／０３２５３８、ＷＯ２００７／０３９３１４、ＷＯ２００７／０３９３１５、ＷＯ２００７／０３９３１６、ＪＰ２００６３０４７７９およびＷＯ２００５／０１２５２９に開示されているようなヒアルロナンの産生に関与する酵素を含む。

本発明はまた、トランスジェニック植物細胞の（核）ゲノムにおいて予め定められたまたは予め選択された部位に欠失を導入するための方法を提供し、前記方法は、
ａ．前記の予め定められた部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する工程；および
ｂ．前記の予め定められた部位に欠失を有する植物細胞を選択する工程
を含み、前記の予め定められた部位は、天然に存在するメガヌクレアーゼのための認識部位とは異なるヌクレオチド配列であり、そしてトランスジェニック植物において導入遺伝子の一部として一般的に導入されるヌクレオチド配列であり、そして二本鎖ＤＮＡ切断は、前記の予め定められた部位を認識しそして前記の二本鎖切断を誘導する天然には存在しない一本鎖メガヌクレアーゼまたは前記の予め定められた部位を一緒に認識しそして前記の二本鎖切断を誘導する天然には存在しないメガヌクレアーゼモノマーユニットの対の導入によって誘導される。

本明細書に記載のような再設計されたメガヌクレアーゼをコードするキメラ遺伝子を提供することも本発明の態様であり、前記キメラ遺伝子は、３２位におけるＳ；３３位におけるＹ；３８位におけるＥ；４０位におけるＲ；６６位におけるＫ；８０位におけるＱ；４２位におけるＴ；７７位におけるＲ；６８位におけるＲ；７０位におけるＲ；４４位におけるＱ；２４位におけるＩ；２６位におけるＳ；２８位におけるＳおよび３０位におけるＲまたは７０位におけるＲ；４４位におけるＴ；２４位におけるＩ；２６位におけるＳ；２８位におけるＳ；３０位におけるＮ；３２位におけるＳ；３３位におけるＲ；３８位におけるＱ；８０位におけるＱ；４０位におけるＲ；６６位におけるＫ；４２位におけるＴ；７７位におけるＲおよび６８位におけるＲ（Ｉ−ＣｒｅＩのアミノ酸配列に対する位置、再設計されたメガヌクレアーゼにおける対応するアミノ酸の位置は、アラインメントによって決定され得る）を含む足場としてのＩ−ＣｒｅＩのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質、例えば配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１８のアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１８の１位から１６７位までのアミノ酸配列および配列番号１８の２０６位から３６２位までのアミノ酸配列を含むタンパク質などをコードするＤＮＡ領域に作動可能に連結された植物で発現可能なプロモーターを含む。

本発明の手段および方法は、コーン（corn）、タバコ、穀類植物、例えばコムギ、カラスムギ、オオムギ、ライムギ、イネ、芝草、ソルガム、アワまたはサトウキビ植物を含む任意の植物に使用され得ると理解される。本発明の方法はまた、ワタ、キャノーラ、アブラナ、ダイズ、野菜、ジャガイモ、Lemna属、Nicotiana属、Arabidopsis、アルファルファ、オオムギ、マメ、コーン（corn）、ワタ、アマ、エンドウマメ、ナタネ、イネ、ライムギ、ベニバナ、ソルガム、ダイズ、ヒマワリ、タバコ、コムギ、アスパラガス、テンサイおよびサトウダイコン、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナスビ、レタス、タマネギ、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、カボチャ（pumpkin）、ダイコン、ホウレンソウ、カボチャ（squash）、トマト、ズッキーニ、アーモンド、リンゴ、アンズ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、カカオ、サクランボ、ココナッツ、クランベリー、ナツメヤシ、ブドウ、グレープフルーツ、グアバ、キーウィ、レモン、ライム、マンゴー、メロン、ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、パッションフルーツ、モモ、ピーナッツ、西洋ナシ、パイナップル、ピスタチオ、プラム、ラズベリー、ストロベリー、タンジェリン、クルミおよびスイカを含むがそれらに限定されない、任意の植物（被子植物および裸子植物）に適用され得る。

本発明の方法に従って生成された植物細胞および植物を提供することも本発明の目的である。伝統的な繁殖法によって産生された、ＤＮＡ挿入事象を含む、植物の配偶子、種子、胚（接合子または体細胞のいずれか）、子孫またはハイブリッドも、本発明の範囲内に含まれる。このような植物は、標的配列においてまたは標的配列の代わりに挿入された異種または外来ＤＮＡ配列を含み得、そして交換後のこの異種ＤＮＡまたはＤＮＡ配列の存在によってのみその子孫植物と異なる。

本明細書において記載の方法によって得られた植物をさらに、伝統的な繁殖技術によって他の植物と交雑し得、これにより本発明に従って得られた標的化ＤＮＡ挿入事象を含む子孫植物を得ることができる。

本発明による植物および種子はさらに、化合物、例えば以下のリストから選択された化合物を用いて処理され得る：
・ 果物／野菜用除草剤：アトラジン、ブロマシル、ジウロン、グリホサート、リニュロン、メトリブジン、シマジン、トリフルラリン、フルアジホップ、グルホシネート、ハロスルフロンゴワン（Halosulfuron Gowan）、パラコート、プロピザミド、セトキシジム、ブタフェナシル、ハロスルフロン、インダジフラム
・ 果物／野菜用殺虫剤：アルジカルブ、Bacillus thuriengiensis、カルバリル、カルボフラン、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、アバメクチン、シフルトリン／β−シフルトリン、エスフェンバレレート、λ−シハロトリン、アセキノシル、ビフェナゼート、メトキシフェノジド、ノバルロン、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、フルアクリピリム、スピロジクロフェン、γ−シハロトリン、スピロメシフェン、スピノサド、リナキシピル、サイアジピル、トリフルムロン、スピロテトラマト、イミダクロプリド、フルベンジアミド、チオジカルブ、メタフルミゾン、スルホキサフロール、シフルメトフェン、シアノピラフェン（Cyanopyrafen）、クロチアニジン、チアメトキサム、スピノトラム（Spinotoram）、チオジカルブ、フロニカミド、メチオカルブ、エマメクチン安息香酸塩、インドキサカルブ、フェナミホス、ピリプロキシフェン、酸化フェンブタスズ
・果物／野菜用殺真菌剤：アメトクトラジン、アゾキシストロビン、ベンチアバリカルブ、ボスカリド、カプタン、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シアゾファミド、シフルフェナミド、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル、ジフェノコナゾール、ジメトモルフ、ジチアノン、フェンアミドン、フェンヘキサミド、フルアジナム、フルジオキソニル、フルオピコリド、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、フォルペット、ホセチル、イプロジオン、イプロバリカルブ、イソピラザム、クレソキシムメチル、マンコゼブ、マンジプロパミド、メタラキシル／メフェノキサム、メチラム、メトラフェノン、ミクロブタニル、ペンコナゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロパモカルブ、プロピコナゾール、プロピネブ、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、ピリメタニル、キノキシフェン、スピロキサミン、硫黄、テブコナゾール、チオファネートメチル、トリフロキシストロビン
・ 穀物用除草剤：２，４−Ｄ、アミドスルフロン、ブロモキシニル、カルフェントラゾン−ｅ、クロロトルロン、クロルスルフロン、クロジナホップ−ｐ、クロピラリド、ジカンバ、ジクロホップ−ｍ、ジフルフェニカン、フェノキサプロップ、フロラスラム、フルカルバゾン−ｎａ、フルフェナセット、フルピルスルフロン−ｍ、フルロキシピル、フルルタモン、グリホサート、ヨードスルフロン、イオキシニル、イソプロツロン、ｍｃｐａ、メソスルフロン、メトスルフロン、ペンジメタリン、ピノキサデン、プロポキシカルバゾン、プロスルホカルブ、ピロキシスラム、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トラルコキシジム、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフルラリン、トリトスルフロン
・ 穀物用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、シフルフェナミド、シプロコナゾール、シプロジニル、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキンコナゾール、フルキサピロキサド、イソピラザム、クレソキシムメチル、メトコナゾール、メトラフェノン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロピコナゾール、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キノキシフェン、スピロキサミン、テブコナゾール、チオファネートメチル、トリフロキシストロビン
・ 穀物用殺虫剤：ジメトエート、λ−シハルトリン、デルタメトリン、α−シペルメトリン、β−シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン（Dinetofuran）、クロルピリホス（Clorphyriphos）、ピリミカルブ、メチオカルブ、スルホキサフロール
・ メイズ(mays)用除草剤：アトラジン、アラクロール、ブロモキシニル、アセトクロル、ジカンバ、クロピラリド、（Ｓ−）ジメテナミド、グルホシネート、グリホサート、イソキサフルトール、（Ｓ−）メトラクロル、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスルフロン、リムスルフロン、スルコトリオン、ホラムスルフロン、トプラメゾン、テンボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン、フルフェナセット、ピロキサスルホン
・ メイズ用殺虫剤：カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、λ−シハロトリン、テフルトリン、テルブホス、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、β−シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、テブピリムホス、エチプロール、サイアジピル、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン（Dinetofuran）、アベルメクチン
・ メイズ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、シプロコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェニトロパン、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、イソピラザム、メトコナゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン
・ イネ用除草剤：ブタクロール、プロパニル、アジムスルフロン、ベンスルフロン、シハロホップ、ダイムロン、フェントラザミド、イマゾスルフロン、メフェナセット、オキサジクロメホン、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラック、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセット、フェントラザミド、ハロスルフロン、オキサジクロメホン、ベンゾビシクロン、ピリフタリド、ペノキススラム、ビスピリバック、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロール、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロップ、ピリミスルファン
・ イネ用殺虫剤：ダイアジノン、フェノブカルブ、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド、クロチアニジン、エチプロール、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、サイアジピル、スピノサド、スピノトラム（Spinotoram）、エマメクチン安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス、エトフェンプロックス、カルボフラン、ベンフラカルブ、スルホキサフロール
・ イネ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、カルベンダジム、カルプロパミド、ジクロシメット、ジフェノコナゾール、エディフェンホス、フェリムゾン、ゲンタマイシン、ヘキサコナゾール、ヒメキサゾール、イプロベンホス（ＩＢＰ）、イソプロチオラン、イソチアニル、カスガマイシン、マンコゼブ、メトミノストロビン、オリサストロビン、ペンシクロン、プロベナゾール、プロピコナゾール、プロピネブ、ピロキロン、テブコナゾール、チオファネートメチル、チアジニル、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、バリダマイシン
・ ワタ用除草剤：ジウロン、フルオメツロン、ＭＳＭＡ、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップブチル、グリホサート、ノルフルラゾン、ペンジメタリン、ピリチオバックナトリウム、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルホシネート、フルミオキサジン、チジアズロン
・ ワタ用殺虫剤：アセフェート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、λ−シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、γ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、β−シフルトリン、スピロテトラマト
・ クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジネトフラン（Dinetofuran）、フルベンジアミド、サイアジピル、スピノサド、スピノトラム（Spinotoram）、γ−シハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロール
・ ワタ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェンアミドン、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、イソチアニル、マンコゼブ、マネブ、メトミノストロビン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キントゼン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファネートメチル、トリフロキシストロビン
・ ダイズ用除草剤：アラクロール、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロンエチル、クロランスラムメチル、フェノキサプロップ、ホメサフェン、フルアジホップ、グリホサート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、（Ｓ−）メトラクロール、メトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、グルホシネート
・ ダイズ用殺虫剤：λ−シハロトリン、メソミル、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン（Dinetofuran）、フルベンジアミド、リナキシピル、サイアジピル、スピノサド、スピノトラム（Spinotoram）、エマメクチン安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルトリン、γおよびλ−シハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、β−シフルトリン
・ ダイズ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルトリアホール、フルキサピロキサド、イソピラザム、イプロジオン、イソチアニル、マンコゼブ、マネブ、メトコナゾール、メトミノストロビン、ミクロブタニル、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファネートメチル、トリフロキシストロビン
・ サトウダイコン用除草剤：クロリダゾン、デスメジファム、エトフメセート、フェンメジファム、トリアラート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ
・ サトウダイコン用殺虫剤：イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン（Dinetofuran）、デルタメトリン、β−シフルトリン、γ／λ−シハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、テフルトリン、リナキシピル、サイアキシピル（Cyaxypyr）、フィプロニル、カルボフラン
・ キャノーラ用除草剤：クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルホシネート、グリホサート、メタザクロール、トリフルラリン、エタメツルフロン、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム
・ キャノーラ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルシラゾール、フルキサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、メピコートクロリド、メトコナゾール、メトミノストロビン、パクロブトラゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、チオファネートメチル、トリフロキシストロビン、ビンクロゾリン
・ キャノーラ用殺虫剤：カルボフラン、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジネトフラン（Dinetofuran）、β−シフルトリン、γおよびλ−シハロトリン、タウ−フルバレリエート（Fluvaleriate）、エチプロール、スピノサド、スピノトラム（Spinotoram）、フルベンジアミド、リナキシピル、サイアジピル、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン。

本明細書において使用する「含む」は、記載した特徴、整数、工程または成分の存在を言及したように特定すると解釈されるが、１つ以上の特徴、整数、工程または成分、またはその群の存在または追加を排除しない。従って、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含む核酸またはタンパク質は、実際に列挙されたものよりも多くのヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得、すなわちより大きな核酸またはタンパク質に包埋され得る。機能的または構造的に定められたＤＮＡ領域を含むキメラ遺伝子は、追加のＤＮＡ領域などを含み得る。本明細書において使用する「植物部分」は、果実、種子、胚、生長点の領域、カルス組織、葉、根、シュート、花、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含むがそれらに限定されない、任意の植物器官または植物組織を含む。

本発明の目的のための、％で表現される２つの関連するヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「配列同一性」は、比較する位置の数により割った、同一残基を有する２つの最適にアラインされた配列における位置の数（×１００）を指す。ギャップ、すなわち、残基が一方の配列に存在するが他方には存在しないアラインメントにおける位置は、非同一な残基を有する位置として捉えられる。２つの配列のアラインメントはNeedleman and Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch 1970)によって実施される。前記のコンピューター支援配列アラインメントは、Wisconsin Package Version 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA)の一部であるＧＡＰなどの標準的なソフトウェアプログラムを使用して、ギャップ生成ペナルティ（gap creation penalty）＝５０およびギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）＝３を有するデフォルトスコアリングマトリックスを使用して簡便に実施され得る。

ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列が、対応するＤＮＡ分子のヌクレオチド配列への参照によって定められる場合はいつでも、ヌクレオチド配列におけるチミン（Ｔ）はウラシルによって置換されるべきであることは明らかである。ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子への言及がなされるかどうかは、出願の内容から明らかである。

以下の非制限的な実施例は、植物ゲノムにすでに存在するｂａｒコード領域の部位において植物を改変するための再設計されたメガヌクレアーゼの使用を記載する。

実施例において特記しない限り、全ての組換えＤＮＡ技術は、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NYおよびAusubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAの１巻および２巻に記載の標準的なプロトコールに従って実施される。植物分子研究のための標準的な材料および方法は、BIOS Scientific Publications Ltd (UK)およびBlackwell Scientific Publications, UKによって共同で刊行された、R.D.D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax (1993)に記載されている。標準的な分子生物学技術のための他の参考文献は、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK)の１巻および２巻を含む。ポリメラーゼ連鎖反応のための標準的な材料および方法は、Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、およびMcPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germanyに見出され得る。

本明細書において記載した全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。

明細書および実施例の全体を通して、以下の配列への言及がなされる：

配列番号１：再設計されたメガヌクレアーゼＢＡＹ３９／ＢＡＹ４０の認識部位のヌクレオチド配列
配列番号２：再設計されたメガヌクレアーゼＢＡＹ３９／ＢＡＹ４０の認識部位の相補体のヌクレオチド配列
配列番号３：ｂａｒ遺伝子コード領域のヌクレオチド配列
配列番号４：ヘテロダイマーメガヌクレアーゼＢＡＹ３９およびＢＡＹ４０の対を発現するベクターｐＣＶ１７７のヌクレオチド配列
配列番号５：メガヌクレアーゼＢＡＹ３９／４０モノマーユニット２（「４０」）のアミノ酸配列
配列番号６：メガヌクレアーゼＢＡＹ３９／４０モノマーユニット１（「３９」）のアミノ酸配列
配列番号７：ＢＡＹ３９／４０認識部位の周辺のｂａｒコード領域のＰＣＲアンプリコンのヌクレオチド配列（コントロール）
配列番号８：ＢＡＹ３９／４０認識部位の周辺のｂａｒコード領域のＰＣＲアンプリコンのヌクレオチド配列（ＰＰＴ耐性系）
配列番号９：ＢＡＹ３９／４０認識部位の周辺のｂａｒコード領域のＰＣＲアンプリコンのヌクレオチド配列（ＰＰＴ感受性系１）
配列番号１０：ＢＡＹ３９／４０認識部位の周辺のｂａｒコード領域のＰＣＲアンプリコンのヌクレオチド配列（ＰＰＴ感受性系２）
配列番号１１：ＢＡＹ３９／４０認識部位の周辺のｂａｒコード領域のＰＣＲアンプリコンのヌクレオチド配列（ＰＰＴ感受性系３）
配列番号１２：ＢＡＹ３９／４０認識部位の周辺のｂａｒコード領域のＰＣＲアンプリコンのヌクレオチド配列（ＰＰＴ感受性系４）
配列番号１３：ＢＡＹ３９／４０認識部位の周辺のｂａｒコード領域のＰＣＲアンプリコンのヌクレオチド配列（ＰＰＴ感受性系５）
配列番号１４：ＢＡＹ３９／４０認識部位の周辺のｂａｒコード領域のＰＣＲアンプリコンのヌクレオチド配列（ＰＰＴ感受性系６）
配列番号１５：ＢＡＹ３９／４０認識部位の周辺のｂａｒコード領域のＰＣＲアンプリコンのヌクレオチド配列（ＰＰＴ感受性系７）
配列番号１６：Ｉ−ＣｒｅＩ天然変異体のアミノ酸配列（モノマー）
配列番号１７：一本鎖ＢＡＹ３９／ＢＡＹ４０メガヌクレアーゼを発現するベクターｐＣＶ１７０のヌクレオチド配列
配列番号１８：一本鎖ＢＡＹ３９／４０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列

実施例
本明細書において記載した全ての再設計されたメガヌクレアーゼは、Precision BioSciences Inc., 104 T.W. Alexander Drive, Research Triangle Park, NC27713によって設計された。

実施例１：本発明による再設計されたメガヌクレアーゼをコードするＴ−ＤＮＡベクターの記載
慣用的な組換えＤＮＡ技術を使用して、ヘテロダイマー（ｈｄ ＢＡＹ３９／４０）として配列番号１または２のヌクレオチド配列を認識する再設計されたメガヌクレアーゼモノマーの対をコードするキメラ遺伝子を構築し、これは、以下の作動可能に連結されたＤＮＡフラグメントを含む：

・ ＣａＭＶ３５ＳプロモーターをコードするＤＮＡ領域（配列番号６のヌクレオチド１５１６位からヌクレオチド１９３３位まで、例えば配列番号４のヌクレオチド１５１６位からヌクレオチド１９９７位まで）
・ Ｎ末端においてＳＶ４０ＮＬＳと作動可能に連結された、ＢＡＹ３９／４０モノマーユニット２をコードする領域を含むＤＮＡ領域（配列番号４のヌクレオチド２００４位から終止コドンを含む２５２５位まで、または終止コドンを除外した２５２２位まで）
・ ノパリンシンターゼ遺伝子に由来する３’末端転写終結およびポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域（配列番号４のヌクレオチド２５３０位から２７８３位まで）
・ ＣａＭＶ３５ＳプロモーターをコードするＤＮＡ領域（配列番号４のヌクレオチド４３９７位からヌクレオチド４８１４位まで、例えば配列番号４のヌクレオチド４３９７位からヌクレオチド４８７８位まで）
・ Ｎ末端においてＳＶ４０ＮＬＳに作動可能に連結された、ＢＡＹ３９／４０モノマーユニット１を含むＤＮＡ領域（配列番号４のヌクレオチド４８８５位から終止コドンを含む５４０５位まで、または終止コドンを除外した５４０３位まで）
・ ノパリンシンターゼ遺伝子に由来する３’末端転写終結およびポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域（配列番号４のヌクレオチド５４１１位から５６６４位まで）

得られたプラスミドのヌクレオチド配列を配列番号４に示す。

慣用的な組換えＤＮＡ技術を使用して、配列番号１または２のヌクレオチド配列を認識する一本鎖の再設計されたメガヌクレアーゼ（ｓｃ ＢＡＹ３９／４０）をコードするキメラ遺伝子を構築し、これは以下の作動可能に連結されたＤＮＡフラグメントを含む：

・ ＣａＭＶ３５ＳプロモーターをコードするＤＮＡ領域（配列番号１７のヌクレオチド６９１位からヌクレオチド１２２３位まで）
・ Arabidopsis thaliana rbcS ATS1A遺伝子からのリーダー配列；配列番号１７のヌクレオチド１２２４位からヌクレオチド１２６６位まで；Krebbers et al. 1988 Plant Molecular Biology 11:745-759
・ タバコにおける発現のために最適化された、Ｎ末端においてＳＶ４０ ＮＬＳに作動可能に連結された、一本鎖ＢＡＹ３９／４０メガヌクレアーゼのＮ末端領域をコードするＤＮＡ領域（配列番号１７のヌクレオチド１２６７位から１６０５位まで）
・ ジャガイモの光誘導性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子の第２イントロンをコードするＤＮＡ領域（配列番号１７のヌクレオチド１６０６位から１７９４位まで；Ｘ０４７５３；Eckes et al. 1986 Mol. Gen. Genet. 205, 14-22）
・ タバコにおける発現のために最適化された、リンカー配列をコードするＤＮＡ領域（配列番号１７のヌクレオチド１７５７位から２０７０位まで）を含む、一本鎖ＢＡＹ３９／４０メガヌクレアーゼのＣ末端領域をコードするＤＮＡ領域（配列番号１７のヌクレオチド１７９５位から終止コドンを含む１７９８位まで、または終止コドンを除外した２５４１位まで）
・ ３５Ｓ遺伝子に由来する３’末端転写終結およびポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域（配列番号１７のヌクレオチド２５４５位から２６７８位まで）

得られたプラスミドのヌクレオチド配列を配列番号１７に示す。

実施例２：標的タバコ系およびアッセイの記載
二本鎖ＤＮＡ切断誘導のためのアッセイを開発するために、植物で発現可能なプロモーターの制御下のｂａｒコード領域を含む、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）耐性タバコトランスジェニック植物系を選択した。

このトランスジェニック系を形質転換における出発材料として使用し、ｈｄ ＢＡＹ３９／４０メガヌクレアーゼをコードするキメラ遺伝子は、ハイグロマイシンに耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼを含む植物で発現可能なキメラ遺伝子と一緒に安定にまたは一過性に導入された。

ＢＡＹ３９／４０ヘテロダイマーをコードする植物で発現可能なキメラ遺伝子の発現を通してｂａｒコード領域の認識部位における二本鎖ＤＮＡ切断誘導後に、切断を、修復ＤＮＡの非存在下における非相同的な末端結合によって修復することができ、その結果として、１つ以上の塩基対の欠失または挿入が起こり、これによりｂａｒコード領域が破壊され、よってホスフィノトリシン感受性が生じる。

ホスフィノトリシン感受性およびハイグロマイシン耐性を示すいくつかの植物系を選択した。これらの植物系から、ｂａｒコード領域における認識部位（配列番号１または２）のいずれかの側に位置するプライマーを使用してＰＣＲによってＤＮＡフラグメントを増幅し、そしてアンプリコンのヌクレオチド配列を決定した。種々のヌクレオチド配列のアラインメントを図５に示す。

ＰＰＴ感受性植物系（３〜９）では、ＢＡＹ３９／４０に対する認識部位が、欠失（３〜８）または挿入（９）によって改変されているが、ＰＰＴ耐性植物系（２）では改変は見られなかったことは明らかである。

これらの実験から、従って、ｈｄＢＡＹ３９／４０は、予め選択された部位における開裂活性を示すと結論づけることができる。

実施例３：非相同的末端結合による標的化挿入
ｈｄ ＢＡＹ３９／４０メガヌクレアーゼをコードするキメラ遺伝子を含むｐＣＶ１７７、またはｓｃ ＢＡＹ３９／４０をコードするキメラ遺伝子を含むｐＣＶ１７０を、２ｍｅｐｓｐコード領域（標的領域に対してさらなる相同性を有さない）を含む植物で発現可能なキメラ遺伝子などの選択マーカーを含む修復ＤＮＡと共に、そのゲノムに組み込まれた植物で発現可能なキメラｂａｒ遺伝子を含む植物細胞に共送達すること、およびグリホサートなどの選択化合物に対して耐性であるホスフィノトリシン感受性植物の選択は、修復ＤＮＡ配列がｂａｒコード領域に組み込まれた植物細胞の同定を可能とする。

実施例４：相同的末端結合による標的化挿入
ｈｄ ＢＡＹ３９／４０メガヌクレアーゼをコードするキメラ遺伝子を含むｐＣＶ１７７、またはｓｃ ＢＡＹ３９／４０をコードするキメラ遺伝子を含むｐＣＶ１７０のいずれかを、配列番号３のヌクレオチド１からヌクレオチド１３２までのｂａｒコード領域に対する配列類似性を有するヌクレオチド配列を含むフランキング配列によって上流がフランキングされ、そして配列番号３のヌクレオチド１５４からヌクレオチド５５２までのｂａｒコード領域に対する配列類似性を有するヌクレオチド配列を含むフランキング配列によって下流がフランキングされた２ｍｅｐｓｐコード領域を含む植物で発現可能なキメラ遺伝子などの選択マーカーを含む修復ＤＮＡと共に、そのゲノムに組み込まれた植物で発現可能なキメラｂａｒ遺伝子を含む植物細胞に共送達すること、およびグリホサートなどの選択化合物に対して耐性であるホスフィノトリシン感受性植物の選択は、修復ＤＮＡがｂａｒコード領域に組み込まれた植物細胞の同定を可能とする。

実施例５：ワタにおけるＢＡＹ３９／４０一本鎖およびヘテロダイマーメガヌクレアーゼを使用した、標的化二本鎖ＤＮＡ切断誘導
ＣＳＶＭＶプロモーターの制御下にあるｂａｒ遺伝子を含むキメラ遺伝子を含むＰＰＴ耐性ワタ植物に由来する胚形成カルスを、２ｇ/Ｌの活性炭を含むＭ１００基質（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、ＭＥＳ ０．５ｇ/Ｌ、ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．９４ｇ/Ｌ、ゲルライト２ｇ/Ｌ、グルコース ３０ｇ/Ｌ、ｐＨ５．８）上で増殖させた。これらのカルスを、Sanford et al., 1992によって実質的に記載されたようなＢｉｏＲＡＤ ＰＰＳ＿１０００／Ｈｅ微粒子銃粒子送達システムを使用して、微粒子による衝撃にかけ、前記粒子は、ヘテロダイマーＢＡＹ３９／４０メガヌクレアーゼをコードするｐＣＶ１７７ベクター、または一本鎖ＢＡＹ３９／４０メガヌクレアーゼをコードするｐＣＶ１７０ベクターのいずれかでコーティングされた。メガヌクレアーゼベクターと、選択マーカー遺伝子としてグリホサート耐性を付与する植物で発現可能なプロモーター制御下にある２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターとの共送達がなされた。衝撃後、カルスを、１mMのグリホサートを含む培地に移し、この結果、約３０００個のグリホサート耐性の胚形成カルスが得られた。これらの中で８５のイベントがＰＰＴ感受性のようであり、その中で７９のイベントをさらに分子的に分析した。これらの７９のイベントを、標的部位にフランキングするプライマーを使用したＰＣＲおよびＰＣＲ産物のその後のシークエンスによって遺伝子型について特徴付けた。ＰＣＲ産物の不在は、標的部位の周囲における大きな欠失を示す（表１）

従って、これらの結果は、一本鎖ならびにヘテロダイマーのＢＡＹ３９／４０メガヌクレアーゼの両方が、所望の位置において標的化二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができ、そして、標的化欠失、置換および挿入イベントを、ワタにおけるこれらのメガヌクレアーゼを使用して得ることができることを実証する。

Claims (12)

1. トランスジェニック植物細胞のゲノムにおいて予め定められた部位に、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する方法であって、
   ａ．前記植物細胞へ、前記の予め定められた部位を認識し、そして前記の二本鎖切断を誘導する、天然には存在しない一本鎖メガヌクレアーゼまたは天然には存在しない一対のメガヌクレアーゼを導入することにより、前記の予め定められた部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する工程；
   ｂ．置換、挿入または欠失をもたらす、前記二本鎖切断が修復されている、植物細胞を選択する工程；
   を含み、
   前記の予め定められた部位が、天然に存在するメガヌクレアーゼのための認識部位とは異なるヌクレオチド配列であり、ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）によってコードされるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ領域（ｂａｒコード領域）のヌクレオチド配列であることを特徴とする、方法。
2. トランスジェニック植物細胞のゲノムにおいて予め定められた部位に、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する方法であって、
   ａ．前記植物細胞へ、前記の予め定められた部位を認識し、そして前記の二本鎖切断を誘導する、天然には存在しない一本鎖メガヌクレアーゼまたは天然には存在しない一対のメガヌクレアーゼを導入することにより、前記の予め定められた部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する工程；
   ｂ．置換、挿入または欠失をもたらす、前記二本鎖切断が修復されている、植物細胞を選択する工程；
   を含み、
   前記の予め定められた部位が、天然に存在するメガヌクレアーゼのための認識部位とは異なるヌクレオチド配列であり、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含み、そして前記の二本鎖ＤＮＡ切断が誘導されることを特徴とする、前記方法。
3. 前記のメガヌクレアーゼまたは前記一対のメガヌクレアーゼがＩ−ＣｒｅＩに由来し、
   そして以下の核移行シグナル配列を除いた場合の位置のアミノ酸の全てがメガヌクレアーゼユニット１に存在し：
   ａ．３２位におけるＳ；
   ｂ．３３位におけるＹ；
   ｃ．３８位におけるＥ；
   ｄ．４０位におけるＲ；
   ｅ．６６位におけるＫ；
   ｆ．８０位におけるＱ；
   ｇ．４２位におけるＴ；
   ｈ．７７位におけるＲ；
   ｉ．６８位におけるＲ；
   ｊ．７０位におけるＲ；
   ｋ．４４位におけるＱ；
   ｌ．２４位におけるＩ；
   ｍ．２６位におけるＳ；
   ｎ．２８位におけるＳ；
   ｏ．３０位におけるＲ、
   そして以下の核移行シグナル配列を除いた場合の位置のアミノ酸の全てが、メガヌクレアーゼユニット２に存在する：
   ｐ．７０位におけるＲ；
   ｑ．４４位におけるＴ；
   ｒ．２４位におけるＩ；
   ｓ．２６位におけるＳ；
   ｔ．２８位におけるＳ；
   ｕ．３０位におけるＮ；
   ｖ．３２位におけるＳ；
   ｗ．３３位におけるＲ；
   ｘ．３８位におけるＱ；
   ｙ．８０位におけるＱ；
   ｚ．４０位におけるＲ；
   ａａ．６６位におけるＫ；
   ｂｂ．４２位におけるＴ；
   ｃｃ．７７位におけるＲ；
   ｄｄ．６８位におけるＲ、
   請求項１または２記載の方法。
4. 前記一対のメガヌクレアーゼはヘテロダイマーを形成するか、または前記一本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーによって共有結合的に接続されたＩ−ＣｒｅＩに由来する２つのドメインを含む一本鎖メガヌクレアーゼである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 前記一対のメガヌクレアーゼがそれぞれ配列番号５および配列番号６のアミノ酸配列を含むか、前記一対のメガヌクレアーゼが配列番号４のヌクレオチド２００４位からヌクレオチド２５２５位までまたは２５２２位までのヌクレオチド配列、および配列番号４のヌクレオチド４８８５位からヌクレオチド５４０６位までまたは５４０３位までのヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされるか、または前記一対のメガヌクレアーゼが、配列番号１８の１位から１６７位までおよび２０６位から３６２位までのアミノ酸配列を含むか、または前記一対のメガヌクレアーゼが、配列番号１７のヌクレオチド１２６７位から１６０５位までおよび１７９６位から１９５６位までおよび２０７１位から２５４１位までのヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるか、あるいは、前記一対のメガヌクレアーゼが、配列番号１７の１２６７位から１６０５位までおよび１７９６位から２５４４位または２５４１位までのヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 前記の二本鎖切断が修復されている植物細胞がさらに植物へと再生される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物の種子、またはトランスジェニック植物の繁殖材料を産生するための請求項１〜６のいずれか１項記載の方法の使用であって、
   二本鎖ＤＮＡ切断が誘導され、修復された結果、前記の予め定められた部位が置換、挿入または欠失される、使用。
8. ｂａｒコード領域において、置換、挿入または欠失がなされた、植物を産生するための方法であって、
   請求項６に記載の方法または請求項７に記載の使用により得られた植物を、別の植物またはそれ自体と交雑させる工程を含んでなる、方法。
9. 種子を収穫する工程をさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
10. ｂａｒコード領域において、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の通りの、天然には存在しないメガヌクレアーゼまたは一対のメガヌクレアーゼの使用。
11. トランスジェニック植物細胞のゲノムにおいて予め定められた部位に、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導するための、天然には存在しないメガヌクレアーゼまたは一対のメガヌクレアーゼの使用であって、
    前記の予め定められた部位が、天然に存在するメガヌクレアーゼのための認識部位とは異なるヌクレオチド配列であり、ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）によってコードされるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ領域のヌクレオチド配列であり、
    前記の予め定められた部位を認識し、そして前記の二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する、天然には存在しない、一本鎖メガヌクレアーゼまたは一対のメガヌクレアーゼを導入することにより、二本鎖ＤＮＡ切断が誘導される、使用。
12. トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物の種子、またはトランスジェニック植物の繁殖材料を産生するための、請求項１１に記載の使用であって、
    前記の二本鎖ＤＮＡ切断が修復され、前記の予め定められた部位が置換、挿入および／または欠失されている、使用。

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