BRPI0519985B1

BRPI0519985B1 - Método para redução do nível de nornicotina ou n-nitrosonornicotina em uma planta do gênero nicotiana ou parte desta ou em um produto de tabaco, cassete de expressão e método para a produção de uma planta do gênero nicotiana

Info

Publication number: BRPI0519985B1
Application number: BRPI0519985-9A
Authority: BR
Inventors: Ralph E. Dewey; Balazs Siminszky; Steven W. Bowen; Lily Gavilano
Original assignee: University Of Kentucky Research Foundation
Priority date: 2005-02-23
Filing date: 2005-02-23
Publication date: 2018-01-30
Also published as: EP2338905B1; US20080202541A1; EP2338905A3; EP2338905A2; US11140843B2; US10383299B2; US20160057967A1; US9187759B2; US20180160644A1; US20110174322A1; EP1851317A1; US7884263B2; US20200022326A1; EP1851317B1; BRPI0519985A2; WO2006091194A1; ATE530656T1; US9913451B2

Abstract

métodos para reduzir o nível de nornicotina ou n'-nitrosonornicotina em plantas do gênero nicotiana e produtos de tabaco, método para reduzir o potencial carcinogênico de produtos de tabaco, polinucleotídeo isolado, polipeptídeo isolado, cassete de expressão, planta do gênero nicotiana, produto de tabaco e método para identificar plantas de tabaco não-conversoras. composições e métodos para reduzir o nível de norncotina e n'-nitrosonornicotina (nnn) em plantas de nicotiana e partes destas são fornecidas. as composições compreendem polinucleotideos e polipeptideos de p45os isolados, que estão envolvidos na conversão metabólica de nicotina para nornicotina nestas plantas. também são fornecidos, cassetes de expressão, vetores, plantas e partes destas, compreendendo seqüências inibidoras que direcionam a expressão ou função dos polipeptideos do cítocromo p450 apresentados. também são fornecidos, métodos para o uso destas novas seqüências para inibir a expressão ou função dos polipeptídeos de citocromo p450 envolvidos nesta conversão metabólica. os métodos têm aplicação na produção de produtos de tabaco que apresentam níveis reduzidos de nornicotina e do seu metabólito carcinogênico, nnn, e, assim, reduzido potencial carcinogênico para indivíduos consumidores destes produtos de tabaco ou expostos à aspiração passíva derivada a partir destes produtos.

Description

(54) Título: MÉTODO PARA REDUÇÃO DO NÍVEL DE NORNICOTINA OU NNITROSONORNICOTINA EM UMA PLANTA DO GÊNERO NICOTIANA OU PARTE DESTA OU EM UM PRODUTO DE TABACO, CASSETE DE EXPRESSÃO E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DO GÊNERO NICOTIANA (51) lnt.CI.: C12N 15/82; A01H 5/00; C07K 14/415 (73) Titular(es): UNIVERSITY OF KENTUCKY RESEARCH FOUNDATION. NORTH CAROLINA STATE UNIVERSITY (72) Inventor(es): RALPH E. DEWEY; BALAZS SIMINSZKY; STEVEN W. BOWEN; LILY GAVILANO

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MÉTODO PARA REDUÇÃO DO NÍVEL DE NORNICOTINA OU N'NITROSONORNICOTINA EM UMA PLANTA DO GÊNERO NICOTIANA OU PARTE DESTA OU EM UM PRODUTO DE TABACO, CASSETE DE EXPRESSÃO E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DO GÊNERO NICOTIANA

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A invenção é relacionada a composições e métodos para reduzir o nivel de nornicotina e seu metabólito, N’nitrosonornicotina, em uma planta que é um membro do gênero

Nicotiana, particularmente composições e métodos para inibir a expressão ou função de um polipeptídeo de citocromo

P450 envolvido na conversão metabólica de nicotina para nornicotina.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] O alcalóide predominante encontrado em variedades de tabaco comercial é a nicotina, tipicamente contabilizando

- 95% do total de alcalóide. A fração restante de alcalóide é compreendida primariamente de três alcalóides de piridina adicionais: nornicotina, anabasina, e anatabina. Nornicotina é gerada diretamente de nicotina através da atividade da enzima N-demetilase de nicotina

Petição 870170063273, de 28/08/2017, pág. 10/21

2/136 (Figura 1) . Nornicotina usualmente representa menos do que

5% do total de alcalóide piridina, mas através de um processo chamado conversão, plantas de tabaco que inicialmente produzem quantidades muito baixas de nornicotina produzem uma progênie que converte metabolicamente uma grande porcentagem de nicotina foliar para nornicotina. Em plantas de tabaco que converteram geneticamente (chamadas conversoras), a grande maioria da produção de nornicotina ocorre durante a senescência e cura da folha madura (Wernsman and Matzinger (1968) Tob. Sei.

12:226-228) . Tabacos Burley são particularmente propensos a conversão genética, com taxas tão altas como 20% por geração observado em alguns cultivares.

Durante a cura e processamento da folha de tabaco, uma porção da nornicotina é metabolizada ao composto N’nitrosonornicotina (NNN; Figura 1), uma nitrosamina específica de tabaco (TSNA) mostrada como sendo carcinogênica em animais de laboratório (Hecht and Hoffman (1990) Câncer Surveys 8:273-294; Hoffmann et al. (1994) J.

Toxicol. Environ. Health 41:1-52; Hecht (1998) Chem. Res.

Toxicol. 11:559-603). Em tabacos curados em estufas com controle de umidade, temperatura e circulação de ar, TSNAs foram encontrados sendo predominantemente formados através da reação de alcalóides com as ínfimas quantidades de

3/136 óxidos de nitrogênio presentes em gases de combustão formados pelos sistemas de aquecimento de calor direto encontrados em câmaras de cura tradicionais (Peele and

Gentry (1999) Formation of Tobacco-specific Nitrosamines in Flue-cured Tobacco, CORESTA Meeting, Agro- Phyto Groups, Suzhou, China). A remodelagem dessas câmaras de cura com dissipadores de calor virtualmente eliminou a mistura de gases de combustão com o ar de cura e reduziu dramaticamente a formação de TSNAs em tabacos curados dessa maneira (Boyette and Hamm (2001) Rec. Adv. Tob. Sei. 27:1722.). Em contraste, nos tabacos Burley curados ao ar, a formação de TSNA procede primariamente através de reação de alcalóides de tabaco com nitrito, um processo catalisado por micróbios transmitidos pelas folhas (Bush et ai. (2001)

Rec. Adv. Tob. Sei. 27:23-46). Até então, tentativas de reduzir TNSAs através de modificação de condições de cura enquanto mantendo padrões de qualidade aceitáveis não foram comprovados como bem-sucedidos para tabacos curados ao ar.

Em tabacos Burley, uma correlação positiva foi encontrada entre o conteúdo de nornicotina da folha e a quantidade de NNN que se acumula no produto curado (Bush et al. (2001) Rec. Adv. Tob. Sei. 27:23-46,· Shi et al. (2000)

Tob. Chem. Res. Conf. 54:Abstract 27). Contudo, manter os níveis de nornicotina a um mínimo foi difícil por causa do

4/136 fenômeno de conversão que resulta em uma introdução contínua de plantas produtoras de nornicotina em população de Burley comercialmente cultivadas. Minimizar o número de plantas de Burley que acumulam altos níveis de nornicotina foi, tradicionalmente, responsabilidade de melhoristas de plantas e produtores de sementes. Embora a porcentagem de conversores de plantas que são ultimamente cultivados em campos de fazendas possa ser reduzida através da remoção de doenças de plantas conversoras durante a propagação de estoques de sementes, esse processo é custoso, consome tempo, e é imperfeito.

Estudos prévios mostraram que uma vez que uma planta tenha convertido, o forte traço de nornicotina é herdado em um único gene dominante (Griffith et al. (1955) Science

121:343-344; Burk and Jeffrey (1958) Tob. Sei. 2:139-141;

Mann et al. (1964) Crop Sei. 4:34 9-353). A natureza desse gene, contudo, é atualmente desconhecida. Nos cenários mais simples, o lócus de conversão pode representar um gene de N-demetilase de nicotina gene não funcional que retoma sua função em plantas conversoras, possivelmente através da mobilização de um elemento passível de transposição indutor de mutação. Alternativamente, o lócus conversor pode codificar uma proteína que inicia uma cascata de eventos que permite, por fim, a planta metabolizar nicotina para

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nornicotina, o que significaria que múltiplos genes podem ser envolvidos.

Independente de existirem um ou vários genes associados com o processo de conversão, é claro que o (s) gene(s) codificando polipeptídeos tendo atividade de demetilase de nicotina desempenham um papel pivotal nesse processo. Apesar da inabilidade para purificar N-demetilase de nicotina de extratos crus ter impedido o isolamento e identificação dessa enzima, existe alguma evidência de que um membro da superfamília do citocromo P4 50 de monooxigenases possa estar envolvido (Hao and Yeoman (1996)

Phytochem. 41:477-482; Hao and Yeoman (1996) Phytochein.

42:325-329; Chelvarajan et al. (1993) J. Agric. Food Chem.

41:858-862; Hao and Yeoman (1998) J. Plant Physiol.

152:420-426) . Contudo, esses estudos não são conclusivos, já que os inibidores P450 clássicos monóxido de carbono e tetcylasis falharam em diminuir a atividade em taxas comparáveis a outras reações reportadas mediadas por P450 (Chelvarajan et al. (1993) J. Agric. Food Chem. 41:858862) .

Adicionalmente, os P450s de citocromo são proteínas de transmembrana ubiquitinosas que participam no metabolismo de uma ampla gama de compostos (revisado por Schuler (1996)

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Crit. Rev. Plant Sei. 15:235-284; Schuler and WerckReichhart (2003) Annu. Rev. Plant Biol. 54:629-667).

Exemplos de reações bioquímicas mediadas por P45 0s de citocromo incluem hidroxilações, demetilações, e epoxidaçoes. Em plantas, as famílias de genes de P450 de citocromo são muito grandes. Por exemplo, o exame total de seqüência genômica revelou 272 genes de P450 de citocromo em Arabidopsis e pelo menos 455 genes de P450 de citocromo singulares em arroz (ver, por exemplo, Nelson et al. (2004)

Plant Physiol. 135(2):756-772). Apesar de P450 de citocromo ter sido implicado como tendo um papel na conversão metabólica de nicotina a nornicotina, a identificação de membros chave participando dessa família de proteínas permanece um desafio.

Ao mesmo tempo que servindo como um precursor para

NNN, estudos recentes sugerem que a nornicotina encontrada em produtos de tabaco pode ter consequências adicionais indesejadas para a saúde. Dickerson e Janda demonstraram que a nornicotina causa glicações de proteínas aberrantes na célula (Dickerson and Janda (2002) Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 99:15084-15088). Concentrações de proteínas modificadas por nornicotina foram encontradas sendo muito mais altas no plasma de fumantes comparado com não fumantes. Adicionalmente, esse mesmo estudo mostrou que a

7/136 nornicotina pode modificar covalentemente drogas esteróides comumente prescritas, tal como prednisona. Tais modificações têm o potencial de alterar ambas a eficácia e a toxicidade dessas drogas.

Em vista das dificuldades associadas com a conversão e os efeitos de saúde indesej ados de acumulação de nornicotina, métodos melhorados para reduzir o conteúdo de nornicotina em variedades de tabaco, particularmente tabaco Burley, são, portanto, desejáveis. Tais métodos não somente ajudariam a melhorar as conseqüências a saúde potenciais negativas da nornicotina por si como descrito acima, mas deveríam também reduzir concomitantemente os níveis de NNN.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

São providas composições e métodos para reduzir o conteúdo de nornicotina em plantas que são membros do gênero Nicotiana. Composições incluem isolar polinucleotídeos e polipeptídeos P450 de citocromo que são envolvidos na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em plantes, particularmente espécies de Nicotiana. Os polinucleotídeos isolados compreendem a seqüência de nucleotídeos relatada em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, ou 11, uma seqüência de nucleotídeos codificando um

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polipeptídeo como relatado na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, ou 12, e fragmentos e variantes dessas. Polipeptídeos isolados da invenção compreendem uma seqüência de aminoácidos relatada em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, ou 12, uma seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência de nucleotídeos relatada em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, ou 11, e fragmentos e variantes dessas.

Os polinucleotídeos da invenção são úteis suprimindo a expressão de um citocromo de P450 que é envolvido na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em uma planta, incluindo os citocromos P450 da presente invenção. Dessa maneira, composições incluem, ainda, cassetes de expressão compreendendo uma seqüência inibidora que é capaz de inibir a expressão ou função de um polipeptídeo de citocromo P450 da invenção, onde a seqüência inibidora está operacionalmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula vegetal. Em alguns avanços, a seqüência inibidora compreende a seqüência relatada em SEQ ID NO: 1,

3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 15, ou 16, ou um complemento ou fragmento dessas. Composições também incluem plantas transformadas e partes de plantas que compreendem um cassete de expressão da presente invenção, opcionalmente estavelmente incorporado no genoma da planta. Ainda providos são produtos de tabaco, incluindo tabaco de

9/136 mascar, tabaco de inalação, cigarros, tabaco de cachimbo, e charutos, tendo nível reduzido de nornicotina, e sua nitrosamina, N’-nitrosonornicotina relacionada.

Os métodos da invenção compreendem inibir a expressão ou função de um polípeptídeo de citocromo P4 50 da presente invenção. Em alguns avanços, um cassete de expressão compreendendo uma seqüência inibidora que visa a expressão ou função de um polípeptídeo de citocromo P450 da presente invenção é introduzido na planta ou parte de planta de interesse, caracterizado pelo fato de que a seqüência inibidora produz um polinucleotideo ou polípeptídeo que inibe a expressão ou função de um polípeptídeo de citocromo P450 da invenção. Em tal avanço, a seqüência inibidora compreende uma seqüência relatada em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7,

9, 11, dessas.	13, 14, 15, ou 16, ou	um	complemento ou fragmento
Os	métodos da invenção	são	úteis na produção	de
plantas	de Nicotiana que	têm	níveis diminuídos	de

nornicotina e seu metabóüto, a nitrosamina N'nitrosonornicotina, nos tecidos foliares e caulinares.

Quando colhidos, os tecidos foliares e caulinares dessas plantas podem ser utilizados para produzir produtos de tabaco tendo níveis reduzidos de nornicotina e sua

10/136 nitrosamina específica de tabaco e, assim, potencial carcinogênico reduzido para indivíduos consumindo esses produtos ou expostos a fumaça secundária derivada desses produtos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra as estruturas de nicotina, nornicotina, and A7'-nitrosonornicotina (NNN) .

A Figura 2 mostra uma análise Northern blot de RNAs conversores e não conversores usando 7D_A06 como uma sonda de hibridização. As faixas 1 e 2 mostram RNAs isolados de folhas de genótipos DH 98-325-5 (não conversor) e DH 98325- 6 (conversor) tratadas com bicarbonato de sódio, respectivamente. As faixas 3 e 4 mostram RNAs isolados de folhas de genótipos DH 98-326-3 (não conversor) e DH 98326- 1 (conversor), respectivamente, tratadas com etefon. O tamanho estimado da banda de hibridização é indicado em quilobases (kb).

A Figura 3A-3G mostra um alinhamento de sequências de nucleotídeos de membros da família de genes 3D C12. Os asteriscos denotam as posições onde a identidade de seqüência é convertida dentre todas as sequências

11/136 comparadas. As posições, onde as diferenças são encontradas, são indicadas com traços e os resíduos correspondentes estão sombreados em cinza. As sequências de nucleotídeos presentes no alinhamento incluem 3D_C 12 (SEQ

ID NO: 1), 3D_C 12-10 (SEQ ID NO:3); 3D_C12-7 (SEQ ID NO:

5); 7DA06 (SEQ ID NO: 7); 3D_C12-15 (SEQ ID NO: 9); e 131A A02 (SEQ ID NO: 11) . As entradas 3D_C12-15 e 131A A02 são sequências de DNAc de tamanho parcial. A região de 99 pb de 3D_C12 que foi usada para fazer o construto baseado em RNAi está sublinhada.

A Figura 4 mostra um alinhamento de sequências de aminoácidos previstas para membros de comprimento total da família 3D_C12 de genes P4 50. As sequências de aminoácidos presentes no alinhamento incluem 3D_C12 (SEQ ID NO: 2) , 3D_C12-10 (SEQ ID NO: 4); 3D_C12-7 (SEQ ID NO: 6); e 7D A06 (SEQ ID NO: 8) . Os asteriscos denotam as posições conservadas dentre todas as quatro sequências. Os resíduos que diferem dentre os membros estão sombreadas em cinza.

A Figura 5 mostra uma análise Northern blot de plantas transgênicas possuindo o construto 3D C12/RNAÍ. (A) Hibridização da sonda 3D C12-7 para RNAs isolados de folhas curadas de plantas transgênicas tratadas com etefon 25 apresentando fenótipos de baixa nornicotina (3D_C12/RNAi-l,

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3, e 4) e fenótipos de alta nornicotina (3D C12/RNAÍ-6, 7, e planta controle de vetor apenas 11) . 0 tamanho estimado da banda em hibridização é indicado em quilobases (kb). (B)

Coloração com brometo de etídio da porção do gel usada em (A) que contém o RNA 28S ribossômico para mostrar a equivalência relativa de carregamento de RNA entre as faixas.

A Figura 6 mostra uma análise de Northern blot de 10 plantas transgênicas possuindo construtos em orientação senso de membros da família de genes 3D_C12. (A) Hibridização da sonda 3D_C12-7 para RNAs isolados de folhas de linhas transgênicas independentes não tratadas expressando construtos 3D_C12-7, 3D_C12, e 7D_A06 e um controle de vetor apenas (controle 8) . O tamanho estimado da banda em hibridização é indicado em quilobases (kb). (B)

A Figura 7 mostra uma seqüência genômica de um fragmento do gene 3D_C12-10 possuindo um íntron. Sequências íntron são indicadas em tipo negrito e itálico. Sequências éxon são apresentadas em tipo plano. As sequências

13/136 correspondendo aos prime rs de PCR usados para amplificar o fragmento do DNA genômico de tabaco estão sublinhadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Fundamentos e Definições

Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve ser entendido gue várias modificações e outros avanços da invenção aqui relatados virão à mente de um especialista na arte à qual essa invenção pertence tendo o beneficio dos ensinamentos apresentado nas descrições por vir e os desenhos associados. Portanto, deve ser entendido que a invenção não deve ser limitada aos avanços específicos descritos e que pretende-se que modificações e outros avanços sejam incluídos no escopo das reivindicações em seqüência. Ao invés, esses avanços são providos de forma que esta descrição satisfaça os requerimentos de aplicação legais.

Apesar de termos específicos serem aqui empregados, eles são usados em um senso genérico e descritivo apenas e não para propósitos de limitação. Por conseguinte, como números se referem a elementos similares. Ainda, o artigo um e uma são aqui usados para referir-se a um ou mais

14/136 de um (i.e., a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Por meio de exemplo, um elemento significa um ou mais elementos. Pela especificação, a palavra compreendendo, ou variações, tais como compreende ou compreendendo, serão entendidas por implicar a inclusão de um elemento relatado, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.

A presente invenção é desenhada para composições e métodos para inibir a expressão ou função de polipeptídeos de citocromo P450 que são envolvidos na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em uma planta, particularmente plantas do gênero Nicotiana, incluindo plantas de tabaco de diversas variedades comerciais. Como aqui usado, os termos inibir, inibição”, e inibindo” são definidos como qualquer método conhecido na arte ou aqui descrito que diminua a expressão ou função de um produto gênico de interesse (i.e., o produto gênico alvo). Inibição pode ser no contexto de uma comparação entre duas plantas, por exemplo, uma planta geneticamente alterada versus uma planta do tipo selvagem.

Altemativamente, inibição de expressão ou função de um produto gênico alvo pode estar no contexto de uma

15/136 comparação entre células vegetais, organelas, órgão, tecidos, ou partes de plantas na mesma planta ou entre plantas diferentes, e inclui comparações entre estágios de desenvolvimento ou temporais na mesma planta ou parte de planta ou entre plantas ou partes de plantas. Inibição inclui qualquer decréscimo relativo de função ou produção de um produto gênico de interesse, até e incluindo a completa eliminação da função ou produção daquele produto gênico. 0 termo inibição engloba qualquer método ou composição que regula negativamente a tradução e/ou transcrição do produto gênico alvo ou atividade funcional do produto gênico alvo.

O termo sequência inibidora engloba qualquer polinucleotideo ou sequência polipeptídica capaz de inibir a expressão ou função de um polipeptideo de citocromo P450 evolvido na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em uma planta, tal como polinucleotídeos ou sequências polipeptídicas de comprimento total, polinucleotídeos ou sequências polipeptídicas truncadas, fragmentos de polinucleotídeos ou seqüências polipeptídicas, variantes de polinucleotídeos ou seqüências polipeptídicas, seqüências de nucleotídeos orientadas no sentido senso, seqüências de nucleotídeos orientadas no sentido anti-senso, o complemento de um sequência de

16/136 nucleotídeos orientadas no sentido senso ou anti-senso, regiões invertidas de sequências de nucleotídeos, hairpins de sequências de nucleotídeos, seqüências de nucleotídeos de dupla fita, seqüências de nucleotídeos de fita única, combinações dessas, e similares. O termo sequência de polinucleotídeos inclui seqüências de RNA, DNA, ácidos nucléicos quimicamente modificados, análogos de ácidos nucléicos, combinações desses, e similares.

Seqüências inibidoras são aqui designadas pelo nome do produto gênico alvo. Assim, uma sequência inibidora de citocromo P450 refere-se a uma seqüência inibidora que é capaz de inibir a expressão de um poiipeptídeo de citocromo P4 50 que é envolvido na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em uma planta, por exemplo, no nível de transcrição e/ou tradução, ou que é capaz de inibir a função de tal poiipeptídeo de citocromo P450. Quando a frase capaz de inibir é usada no contexto de uma seqüência de polinucleotídeos inibidora, esta deve significar que a própria seqüência inibidora exerce o efeito inibidor; ou, onde a seqüência inibidora codifica uma molécula nucleotídica inibidora (por exemplo, RNA hairpin,

RNAmi, ou polinucleotídeos de RNA de dupla fita), ou codifica um poiipeptídeo inibidor (i.e., um poiipeptídeo que inibe a expressão ou função do produto gênico alvo),

17/136 seguindo sua transcrição (por exemplo, no caso de uma seqüência inibidora codificando um RNA hairpin, RNAmi, ou polinucleotídeo de RNA de dupla fita) ou sua transcrição e tradução (no caso de uma seqüência inibidora codificando um polipeptídeo inibidor), o produto transcrito ou traduzido, respectivamente, exerce o efeito inibidor no produto gênico alvo (i.e., inibe a expressão ou função do produto gênico alvo).

Por célula hospedeira, quer-se dizer uma célula que compreenda uma seqüência de ácidos nucléicos heteróloga da invenção. Apesar de que as seqüências de ácidos nucléicos e fragmentos da invenção, e variantes dessas, podem ser introduzidas em qualquer célula de interesse, de interesse em particular são células vegetais, mais particularmente células de uma planta de espécie de Nicotiana, por exemplo, a espécie de planta de tabaco e variedades aqui descritas abaixo.

O uso do termo polinucleotídeo não pretende limitar a presente invenção a polinucleotídeos compreendendo DNA. Aqueles de conhecimento ordinário na arte reconhecerão que polinucleotídeos podem compreender ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos.

Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem

18/136 ambas moléculas naturalmente ocorrentes e análogas sintéticas. Os polinucleotídeos da invenção também englobam todas as formas de sequências incluindo, mas não limitado a, formas de fita simples, formas de fita dupla, hairpíns, estruturas stem-and-loop, e similares.

O termo variante, como aqui usado, deve significar uma sequência substancialmente similar, e o termo polinucleotídeo ou polipeptídeo nativo deve significar uma sequência de nucleotídeos ou sequência de aminoácidos naturalmente ocorrente, respectívamente. Por fragmento, pretende-se uma porção de um polinucleotídeo ou uma porção de uma seqüência de aminoácidos e, a partir daí, uma proteína codificada dessa forma.

Como aqui usado, o termo parte de planta inclui células vegetais, protoplastos vegetais, culturas de células de tecidos vegetais das quais uma planta inteira possa ser regenerada, calos vegetais, moitas vegetais, e células vegetais que são intactas em plantas ou partes de plantas, tais como embriões, pólen, anteras, óvulos, sementes, folhas, flores, caules, galhos, frutos, raízes, pontas de raízes, e similares. Progênie, variantes, e mutantes de plantas regeneradas são também incluídas no escopo da invenção, provido de forma que esses compreendam

19/136 as sequências de ácidos nucléicos introduzidas da invenção.

Por mudança fenotípica, pretende-se uma mudança mensurável em uma ou mais funções celulares. Por exemplo, plantas tendo uma modificação genética no lócus genômico codificando um polipeptídeo de citocromo P450 da invenção podem apresentar expressão ou atividade daquele polipeptídeo de citocromo P450 reduzida ou eliminada.

O termo introduzindo deve significar apresentar à planta o polinucleotídeo ou polipeptídeo de tal maneira que a seqüência ganhe acesso ao interior de uma célula de uma planta.

O termo operacionalmente ligado deve significar uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação operacional entre um polinucleotídeo de interesse e uma seqüência reguladora (i.e., um promotor) é uma ligação funcional que permite a expressão do polinucleotídeo de interesse. Elementos operacionalmente ligados podem ser contíguos ou não contíguos. Quando usados para referir-se à junção de duas regiões codif icadoras de proteínas, por operacionalmente ligado pretende-se que as regiões codificadoras estejam no mesmo quadro de leitura.

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O termo heterólogo, de acordo com a presente invenção, quando usado em referência a uma seqüência, deve significar uma seqüência que se origina de uma espécie estrangeira, ou, se da mesma espécie, ser substancialmente modificado de sua forma nativa em composição e/ou iócus genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente da espécie da qual o polinucleotídeo é derivado, ou, se da mesma/análoga espécie, um ou ambos são substancialmente modificados de sua forma e/ou Iócus genômico original, ou o promotor não é o promotor nativo do polinucleotídeo operacionalmente ligado. Adicionalmente, como aqui usado, um gene quimérico compreende uma seqüência codificadora operacionalmente ligada a uma região de iniciação de transcrição que é heteróloga à seqüência codificadora.

O termo expressão, como aqui usado, refere-se à biossíntese de um produto gênico, incluindo a transcrição e/ou tradução de dito produto gênico. Por exemplo, para os propósitos da presente invenção, um cassete de expressão, como aqui descrito em outras partes, capaz de expressar um polinucleotídeo que inibe a expressão de pelo menos um polipeptídeo de citocromo P450 da invenção, é um cassete de

21/136 expressão capaz de produzir uma molécula de RNA que inibe a transcrição e/ou tradução de pelo menos um polipeptídeo de citocromo P450. A expressão” ou produção de uma proteína ou polipeptídeo de uma molécula de DNA refere-se à transcrição e tradução da seqüência codificadora para produzir a proteína ou polipeptídeo, enquanto a expressão ou produção de uma proteína ou polipeptídeo de uma molécula de RNA refere-se à tradução da seqüência codificadora de RNA para produzir a proteína ou polipeptídeo.

Polinucleotídeos e Polipeptídeos de Citocromo 450, e

Variantes e Fragmentos Desses

As composições da presente invenção incluem polinucleotídeos e polipeptídeos de citocromo P450 isolados que são envolvidos na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em plantas, incluindo variedades comerciais de plantas de tabaco. Em particular, as composições da invenção incluem polipeptídeos isolados compreendendo as sequências de aminoácidos como mostrado nas SEQ ID NOS:2, 4, 6, 8, 10, e 12, e polinucleotídeos isolados compreendendo as seqüêncías de aminoácidos como mostrado nas SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, e 11. Os polinucleotídeos da invenção são úteis em inibir a expressão desses

22/136 polipeptídeos de citocromo P450 ou variantes desses que são envolvidos na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em plantas, particularmente plantas de tabaco.

Dessa maneira, a invenção provê, ainda, cassetes de expressão compreendendo toda a porção da seqüência de polinucleotídeos relatadas nas SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, ou 11, um complemento ou fragmento dessas, ou uma seqüência tendo identidade de seqüência substancial a SEQ ID NO:1, 3,

5, 7, 9, ou 11, ou um complemento ou fragmento dessas, operacionalmente ligado a um promotor que é funcional em uma célula vegetal para uso em expressar um transcrito de

RNA inibidor que interfere com a expressão (i.e., transcrição e/ou tradução) de polipeptídeos de citocromo P450 aqui descritos. Em alguns avanços, os cassetes de expressão compreendem a seqüência de nucleotídeos, como mostrado nas SEQ ID NO: 13, 14, 15, ou 16, um complemento ou fragmento dessas, ou uma seqüência tendo identidade de seqüência substancial às SEQ ID NO: 13, 14, 15, ou 16, ou um complemento ou fragmento dessas. A introdução desses cassetes de expressão em uma planta Nicotiana de interesse, particularmente uma planta de tabaco de variedades comumente conhecidas como variedades flue ou brilhante, variedades Burley, variedades escuras, e variedades oriental/Turco, resulta na produção de plantas de tabaco

23/136 *71 tendo quantidades reduzidas de nornicotina e a nitrosamina,

N’-nitrosonornicotina (NNN). Material foliar e caulinar dessas plantas transgênicas pode ser usado para produzir uma variedade de produtos de tabaco tendo níveis reduzidos de nornicotina, e uma redução concomitante nesse metabólito de nitrosamina carcinogênico.

Os polinucleotídeos e polipeptídeos codificados de citocromo P450 da presente invenção representam uma nova famílias de genes de citocromo P450, designada a família de genes 3D C12 de citocromo 450, que é recém identificada como tendo um papel na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em plantas de tabaco. A supressão da expressão de seus produtos gênicos codificados em plantas de tabaco transgênicas resulta em uma redução significativa na acumulação de nornicotina nas folhas dessas plantas transgênicas. Enquanto não sendo ligado por teoria, o papel metabólico desses polipeptídeos pode ser direto, i.e., catalisando diretamente a reação de N-demetilação, ou um papel indireto, i.e., na forma de produção de um produto que leve à regulação positiva da atividade de demetilase de nicotina da folha. Independente do mecanismo, quaisquer meios pela qual a expressão e/ou função dos polipeptídeos codificados por membros dessa familia de genes de citocromo

P450 são visados para inibição em uma planta de Nicotiana

24/136 serão efetivos em reduzir os níveis de nornicotina, e níveis de seu metabólito carcinogênico, NNN, nessas folhas e caules dessas plantas.

Os genes de citocromo P450 da invenção foram isolados das linhas de tabaco de uma variedade Burley. O primeiro desses genes de citocromo P450, designado 3D_C12, codifica um transcrito de RNAm correspondendo aos nucleotídeos (nt)

1-1551 da seqüência de DNAc relatada em SEQ ID NO:1, o qual codifica o polipeptídeo de comprimento total de 517 resíduos relatado em SEQ ID NO:2. O Segundo membro dessa nova família de citocromo P450, designado 3D_C12-10, codifica um transcrito de RNAm correspondendo a nt 1-1551 da seqüência de DNAc relatada em SEQ ID NO: 3, a qual codifica o polipeptídeo de comprimento total de 517 resíduos relatado em SEQ ID NO:4. O terceiro membro desses genes de citocromo P450, designado 3D_C12-7, codifica um transcrito de RNAm correspondendo a nt 1-1551 da seqüência de DNAc relatada em SEQ ID NO: 5, que codifica o polipeptídeo de comprimento total de 517 resíduos relatado em SEQ ID NO:6. O quarto membro dessa nova família de citocromo P450, designado 7D_A06, codifica um transcrito de RNAm correspondendo a nt 1-1554 da seqüência de DNAc relatada em SEQ ID NO:7, o polipeptídeo de comprimento total de 518 resíduos relatado SEQ ID NO:8.

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Duas seqüências de gene P4 50 de comprimento parcial compartilhando alta identidade de seqüência a membros de comprimento total da família 3D_C12 de genes de citocromo P450 também foram isolados dessas linhas de tabaco Burley. O primeiro desses, designado 3D_C12-15, codifica um transcrito de RNAm correspondendo à seqüência de DNAc relatada em SEQ ID NO: 9, a qual codifica o polipeptídeo de comprimento parcial relatado em SEQ ID NO: 10. A segunda seqüência de gene P450 de comprimento parcial, designada 131A A02, codifica um transcrito de RNAm correspondendo à seqüência de DNAc relatada em SEQ ID NO: 11, o qual codifica o polipeptídeo de comprimento parcial relatado em

SEQ ID NO: 12.

Um alinhamento dos membros da família 3D_C 12 de genes de citocromo P450 é apresentado na Figura 3A-3G. As seqüências de aminoácidos previstas para os quarto clones de comprimento total estão alinhadas na Figura 4. Essas seqüências compartilham alta identidade de seqüência uma coma a outra (pelo menos 90% em ambos níveis de nucleotídeo e aminoácidos (ver Tabelas 2 e 3, Exemplo 4 aqui mostrado abaixo).

A invenção engloba composições de polinucleotídeos ou

26/136 polinucleotídeo proteína isoladas ou substancialmente purificadas. Um polinucleotídeo, ou proteína, isolado ou purificado, ou porção biologicamente ativa desse, é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou proteína como encontrado em seu ambiente naturalmente ocorrente.

Assim, um polinucleotídeo, ou proteína, isolado ou purificado é substancialmente livre de outro material celular, ou meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos quando quimicamente sintetizado. Otimamente, um polinucleotídeo isolado está livre de sequências (otimamente sequências codificadoras de proteínas) que naturalmente flanqueiam o polinucleotídeo (i.e., sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do polinucleotídeo) no DNA genômico do organismo do qual o polinucleotídeo é derivado. Por exemplo, em vários avanços, o polinucleotídeo isolado pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de seqüência de nucleotídeos que naturalmente flanqueiam o polinucleotídeo no DNA genômico da célula da qual o é derivado. Uma proteína que substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína tendo menos do que cerca de 30%,

20%, 10%, 5%, ou 1% (por peso seco) de proteína

27/136 contaminante. Quando a proteína da invenção ou porção biologicamente ativa dessa é produzida de forma recombinante, otimamente, meio de cultura representa menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (por peso seco) de precursores químicos ou químicos não de interesse da proteína.

Fragmentos dos polinucleotídeos e polipeptídeos de citocromo P450 codificados descritos são, dessa forma, também englobados pela presente invenção. Fragmentos de um polinucleotideo podem codificar fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica da proteína nativa e, dessa maneira, estar envolvidos na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em uma planta. Alternativamente, fragmentos de um polinucleotideo que são úteis como sondas de hibridização ou primers de PCR usando métodos descritos abaixo geralmente não codificam proteínas fragmento retendo atividade biológica. Adicionalmente, fragmentos das seqüências de nucleotídeos descritas incluem aqueles que podem ser associados com construtos recombinantes para uso no silenciamento de genes com qualquer método conhecido na arte, incluindo, mas não limitando-se a, supressão/cosupressão senso, supressão anti-senso, interferência de RNA de dupla-fita (RNAds), interferência de RNA haírpin e interferência de RNA haírpin contendo íntron, interferência

28/136 mediada por amplicon, riboenzimas, e pequeno RNA interferente ou micro RNA, como aqui descrito abaixo.

Assim, fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos podem variar de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 70 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos, e até polinucleotídeo de comprimento total codificando as proteínas da invenção, dependendo do resultado desejado.

Um fragmento de um polinucleotídeo de citocromo P450 da presente invenção que codifica uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção codificará pelo menos 15, 25, 30, 50, 75, 100,

125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ou 500 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo de comprimento total de citocromo P450 da invenção (e.g., 517 para SEQ ID NOS: 2,

4, e 6; e 518 para SEQ ID NO:8), ou codificará pelo menos

15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo de comprimento parcial de citocromo P450 da invenção (e.g., 173 para SEQ

ID NO:10; e 222 para SEQ ID N0:12). Uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo de citocromo P450 pode ser preparada isolando-se uma porção de um dos

29/136 polinucleotídeos de citocromo P450 da presente invenção, expressando a porção codificada do polipeptídeo de citocromo P450 (e. g., por expressão recombinante in vitro), e avaliando a atividade da porção codificada do polipeptídeo de citocromo P450, i.e., a habilidade de promover a conversão de nicotina para nornicotina, usando testes conhecidos na arte e aqueles aqui providos abaixo.

Polinucleotídeos que são fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos de citocromo P450 da presente invenção compreendem pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250,

300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 950,

1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450,

1500, 1550, 1600, 1650, ou 1700 nucleotídeos contíguos, ou até o número de nucleotídeos presentes em um polinucleotídeo de citocromo P450 como aqui descrito (e.g., 539 para SEQ ID NO:9; 666 para SEQ ID NO:11; 1733 para SEQ

ID NOS:1, 3, e 5; e 1727 para SEQ ID NO:7).

Variantes dos polinucleotídeos e polipeptídeos codificados descritos são, dessa forma, também englobados pela presente invenção. Tais variantes naturalmente ocorrentes incluem aqueles variantes que compartilham identidade de seqüência substancial aos polinucleotídeos e polipeptídeos de citocromo P450 aqui descritos, como aqui

30/136 definidos abaixo. As composições e métodos da invenção podem ser usada para direcionar a expressão ou função de qualquer citocromo P450 naturalmente ocorrente que compartilha substancial identidade de seqüência aos polipeptídeos de citocromo P450 descritos e que possui a atividade de citocromo P450 relevante, i.e., envolvimento na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em plantas. Tais variantes podem resultar de, por exemplo, polimorfismo genético ou de manipulação humana, como ocorre com cruzamento e seleção. Variantes biologicamente ativos de uma proteína de citocromo P450 da invenção, por exemplo, variantes do polípeptídeo relatado em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8,

10, ou 12, terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%,

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,

96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência à seqüência de aminoácidos para a proteína nativa como determinado por programas de alinhamento de sequências e parâmetros aqui descritos em outra parte, e são caracterizados por seu envolvimento funcional na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em plantas. Um variante biologicamente ativo de uma proteína da invenção pode diferir daquela proteína por tão pouco quanto 1-15 resíduos de aminoácidos, tão pouco quanto 10, tão pouco quanto 9, tão pouco quanto 8, tão pouco quanto 7, tão pouco quanto 6, tão pouco quanto 5, tão pouco quanto 4, tão pouco

31/136 quanto 3, tão pouco quanto 2, ou tão pouco quanto 1 resíduo de aminoácido.

Variantes de um polinucleotídeo em particular da presente invenção incluem aqueles polinucleotídeos naturalmente ocorrentes que codificam um polipeptídeo de citocromo P4 50 que é envolvido na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em plantas. Tais variantes de polinucleotídeos podem compreender uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativo aqui descrito e/ou a substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativo. Por causa da degeneração do código genético, variantes conservativos para polinucleotídeos incluem aquelas sequências que codificam a seqüência de aminoácidos de um dos polipeptídeos de citocromo P450 da invenção. Variantes naturalmente ocorrentes, tais como esses, podem ser identificados com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, como, por exemplo, com reação de cadeia de polimerase (PCR) e técnicas de hibridização como destacado abaixo. Polinucleotídeos variantes também incluem polinucleotídeos derivados sinteticamente, tais como aqueles gerados, por exemplo, usando mutagênese sítio direcionada mas que compartilham substancial identidade de seqüência às seqüências

32/136 naturalmente ocorrentes aqui descritas e, assim, podem ser usadas nos métodos da invenção para inibir a expressão ou função de um citocromo P450 que é envolvido na conversão metabólica de nicotina para nornicotina, incluindo os polipeptideos de citocromo P450 relatados em SEQ ID NOS:2,

4, 6, e 8, e polipeptideos compreendendo a seqüência relatada em SEQ ID NO:10 ou 12. Geralmente, variantes de um polinucleotideo da invenção em particular, por exemplo, a seqüência relatada em SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, ou 11, terá pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,

80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência àquele polinucleotideo em particular como determinado por programas de alinhamento de seqüências e parâmetros aqui descritos em outra parte.

Variantes de um polinucleotideo da presente invenção em particular (também referidos como o polinucleotideo referência) também podem ser avaliados por comparação da identidade de seqüência percentual entre o polipeptídeo codificado pelo polinucleotideo referencie e o polipeptídeo codificado por um polinucleotideo variante. Por exemplo, polinucleotídeos isolados codificando um polipeptídeo com uma particular identidade de seqüência percentual ao polipeptídeo de comprimento total de SEQ ID NO:2, 4, 6, ou 8, ou o polipeptídeo de comprimento parcial codificado pela

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SEQ ID NO: 9 ou 11 aqui descrito. Tais polinucleotídeos podem ser usados nos métodos da presente invenção para direcionar a expressão de polipeptídeos de citocromo P4 50 envolvidos na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em plantas, particularmente plantas de tabaco, inibindo, portanto, a acumulação de nornicotina e seu metabólito N’-nitrosonornicotina nos caules e folhas da planta geneticamente modificada. A identidade de seqüência percentual entre quaisquer dois polipeptídeos pode ser calculada usando programas de alinhamento de seqüências e parâmetros aqui descritos em outra parte. Onde qualquer par de polinucleotídeos da invenção é avaliado por comparação da identidade de seqüência percentual compartilhada pelos dois polipeptídeos que codificam, a identidade de seqüência percentual entre os dois polipeptídeos codificados é de pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência.

Adicionalmente, os polinucleotídeos da invenção podem ser usados para isolar seqüências de citocromo P450 correspondentes de outros organismos, particularmente outras plantas, mais particularmente outros membros do gênero Nicotiana. PCR, hibridização, e outros métodos similares podem ser usados para identificar tais seqüências

34/136 /boz.

baseado em sua homologia de seqüência às sequências aqui relatadas. Seqüências isoladas baseadas em sua identidade de seqüência às seqüências de nucleotídeos aqui relatadas, ou a variantes e fragmentos dessas, são englobadas pela presente invenção. Tais seqüências incluem seqüências que são ortólogas das seqüências descritas.

De acordo com a presente invenção, ortólogos são genes derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em diferentes espécies como um resultado de

especiação.	Genes	encontrados em	diferentes espécies	são
considerados	ortólogos quando	suas seqüências	de
nucleotídeos	e./ou	suas seqüências	de proteínas codificadas
compartilham	pelo	menos 60%, 70%,	75%, 80%, 85%, 90%,	91%,
92%, 93%, !	94%,	95%, 96%, 97%,	98%, 99%, ou mais	de

identidade de seqüência. As funções de ortólogos são, freqüentemente, altamente conservadas entre espécies. Assim, polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptídeo de citocromo P450 que é envolvido na conversão metabólica de nicotina para nornicotina e que hibridizam sob condições rigorosas às seqüências de citocromo P450 aqui descritas, ou a variantes ou fragmentos dessas, são englobados pela presente invenção. Tais seqüências podem ser usadas nos métodos da presente invenção para inibir a expressão de polipeptídeos de citocromo P4 50 que são

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envolvidos	na conversão metabólica	de	nicotina para
nornicotina	em plantas.
Usando	PCR, oligonucleotídeos	primers podem ser
projetados	para uso em reações de	PCR	para amplificar
seqüências	de DNA correspondentes de	DNAc	ou DNA genômico

extraído de qualquer planta de interesse. Métodos para designar primers de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na arte e estão descritos em Sambrook et al.

(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and

Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e

Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic

Press, New York). Métodos conhecidos de PCR incluem, mas não se limitam a, métodos usando primers pareados, primers de refúgio, primers únicos específicos, primers degenerados, primers gene-específicos, primers vetorespecíficos, primers parcialmente sem correspondência, e similares.

Técnicas de hibridização envolvem o uso de todo ou parte de um polinucleotídeo conhecido com uma sonda que hibridiza, seletivamente, a outros polinucleotídeos

36/136 correspondentes presentes em uma população de fragmentos DNA genômico ou fragmentos de DNAc clonados (i.e., bibliotecas de DNA genômico ou DNAc) de um organismo escolhido.

A hibridização pode ser conduzida sob condições rigorosas. Por condições rigorosas ou condições de hibridização rigorosas pretende-se condições sob as quais uma sonda hibridizará a sua seqüência alvo a um grau detectavelmente maior do que a outras seqüências (e.g., pelo menos duas dobras de a base) . Condições rigorosas são dependentes de seqüência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Controlando-se o rigor da hibridização e/ou condições de lavagem, seqüências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, condições de rigor podem ser ajustadas para permitir alguma falta de correspondência em seqüências de forma que permita que graus menores de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga).

Geralmente, uma sonda é menor que cerca de 1000 nucleotídeos em comprimento, otimamente menor que 500 nucleotídeos em comprimento.

Tipicamente, condições rigorosas serão aquelas nas quais a concentração de sais é menor do que cerca de 1,5 M

37/136 de íons de Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íons de Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos 30 °C para sondas curtas (e.g., 10 a 50 nucleotídeos) e de pelo menos 60 °C para sondas longas (e.g., maiores que 50 nucleotídeos). Condições rigorosas podem ser alcançadas, também, com a adição de agentes desestabilizantes, tal como formamida. Condições exemplares de baixo rigor incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M NaCI, 1% SDS (sódio dodecil sulfato) a 37 °C, e uma lavagem em IX a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M trissódio citrato) a 50 a 55 °C. Condições exemplares de rigor moderado incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0 M NaCI, 1% SDS a 37 °C, e uma lavagem em 0,5X a IX SSC a 55 a 60 °C.

Condições exemplares de rigor elevado incluem hibridização em 50% de formamida, 1 M NaCI, 1% SDS a 37 °C, e uma lavagem em 0,lX SSC a 60 a 65 °C. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% SDS. A duração de hibridização é geralmente menos do que cerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem será de pelo menos um tempo de comprimento suficiente para alcançar o equilíbrio.

Em um avanço específico, condições de rigor incluem hibridização em uma solução contendo 5X SSC, 0,5% SDS, 5X

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Denhardfs, 0,45 pg/μΐ de RNA Poli A, 0,45 pg/μΐ de DNA de timo de bezerro e 50% de formamida a 42°C, e pelo menos uma lavagem pós-hibridização em uma solução compreendendo de cerca de 0,01X SSC a cerca de IX SSC. A duração da hibridização é de cerca de 14 a cerca de 16 horas.

A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, o ponto térmico de derretimento (T_m) pode ser aproximado a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: T_m = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do hibrido em pares de bases. T_m é a temperatura (sob definidas força iônica e pH) na qual 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza a uma sonda perfeitamente correspondente. A T_m é reduzida a cerca de 1 °C para cada 1% de falta de correspondência; assim, condições de T_m, hibridização, e/ou lavagem podem ser ajustadas para hibridizar a seqüências da identidade desejada. Por exemplo, se seqüências com >90% de identidade são procuradas, a T_m pode ser diminuída em

39/136 °C. Geralmente, condições rigorosas são selecionadas para ser cerca de 5 °C menos do que a T_m para a seqüência específica e seu complemento, em uma força iônica e pH definidos. Contudo, condições severamente rigorosas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4 °C menos do que a T_m; condições moderadamente rigorosas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou 10 °C menos do que a T_m; condições de baixo rigor podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14,

15, ou 20 °C menos do que a T_m. Usando a equação, composições de hibridização e lavagem, e T_ra desejada, aqueles de habilidade ordinária entenderão que variações no rigor de soluções de hibridização e/ou lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de falta de correspondência resulta em uma T_m de menos do que 45 °C (solução aquosa) ou 32 °C (solução de formamida), é preferível aumentar a concentração SSC de forma que uma maior temperatura possa ser usada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bíology-Hybridization with Nucieic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); and Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Bioiogy, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Ver Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory

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Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,

Plainview, New York).

Sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de DNAc, fragmentos de RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser rotulados com um grupo detectável, tal como ³²P, ou qualquer outro marcador detectável. Por exemplo, sondas para hibridização podem ser, rotulando-se oligonucleotídeos sintéticos, baseadas nos sequências polinucleotídeos de citocromo P450 da presente invenção. Métodos para preparação de sondas para hibridização e para construção de bibliotecas de DNAc e DNA genômico são geralmente conhecidos na arte e são descritos em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory

Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,

Plainview, New York).

Por exemplo, seqüências de polinucleotídeos de citocromo P450 aqui descritas, ou uma ou mais porções dessas, podem ser usadas como sondas capazes de hibridizar especificamente a correspondentes polinucleotídeos e RNAs mensageiros de citocromo P450. Para alcançar hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem seqüências que são únicas dentre seqüências de polinucleotídeos de citocromo P450, incluindo

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regiões 5' acima para a seqüência codificadora e regiões 3’ abaixo para a seqüência codificadora, e são, otimamente, de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos em comprimento, e mais otimamente pelo menos cerca de 20 nucleotídeos em comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar polinucleotídeos de citocromo P450 correspondentes. Essa técnica pode ser usada para isolar sequências codificadoras adicionais de uma planta dese j ada ou como um teste diagnóstico para determinar a presença de sequências codificadoras em uma planta. Técnicas de hibridização incluem rastreamento de hibridização de bibliotecas de DNA em placas (tanto placas como colônias; ver, por exemplo, Sambrook et al. (198 9) Molecular Cloning: A Laboratory

Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,

Plainview, New York).

Como aqui usado, com respeito às relações de seqüência entre dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos, o termo seqüência referência é uma seqüência definida como uma base para comparação de sequências. Uma seqüência referência pode ser um subgrupo ou a totalidade de uma seqüência especificada; por exemplo, com um segmento de um

DNAc ou seqüência gênica de comprimento total, ou o DNAc ou seqüência gênica completos.

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Como aqui usado, o termo janela de comparação faz referência a um segmento contíguo e específico de uma seqüência de polinucleotídeos, caracterizado pelo fato de que a seqüência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (i.e., espaços) comparada à seqüência referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo de dois polinucleotídeos. Geralmente, a janela de comparação é de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos em comprimento, e opcionalmente, pode ser de 30, 40, 50, 100, ou mais longa. Aqueles especialistas na entendem que para evitar uma alta similaridade a uma seqüência referência devido a inclusão de espaços na seqüência de polinucleotídeos uma penalidade por espaço é tipicamente introduzida e é subtraída do número de correspondências.

Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na arte. Assim, a determinação da identidade de seqüência percentual entre quaisquer duas seqüências pode ser conseguida usando um algoritmo matemático. Exemplos não limitantes de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers and Miller (1988)

CABIOS 4:1117; o algoritmo de alinhamento local de Smith et al. (1981) Adv. AppL Math. 2:482; o algoritmo de alinhamento global de Needleman and Wunsch (1970) 1 Mol.

43/136

Bid 48:443-453; o método de alinhamento de busca por local de Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei.

85:2444-2448; o algoritmo de Karlin and Altschul (1990)

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8 722 64, modificado como em

Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA

90:5873-5877.

Os programas BLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol.

Biol. 215:403 são baseados no algoritmo de Karlin and

Altschul (1990) supra. Buscas BLAST por nucleotídeos podem ser efetuadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, tamanho de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeos homólogas a uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína da invenção. Buscas BLAST por proteínas podem ser efetuadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, tamanho de palavra = 3, para obter seqüência s de aminoácidos homólogas a uma proteína ou polípeptídeo da invenção. Para obter alinhamentos

espaçados	para	propósitos	de comparação, Gapped BLAST (in
BLAST 2.0)	pode	ser	utilizado	como	descrito em Altschul et
al. (1997)	Nucleic	acids	Res	. 25:	3389.	Alternativamente,
PSI-BLAST	(em BLAST	2.0)	pode	ser	usado	para efetuar uma
busca iterada	que	detecta	relações	distantes entre
moléculas.	Ver	Altschul	et	al.	(1997	) supra. Quando

utilizando BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, os parâmetros

44/136 padrão dos respectivos programas (e.g., BLASTN para seqüências de nucleotídeos, BLASTX para proteínas) podem ser usados (Ver www.ncbi.nlm.nih.gov). 0 alinhamento pode ser também efetuado manualmente por inspeção.

valores de identidade de seqüência/similaridade aqui providos foram calculados usando os algoritmos de BLASTX (Altschul et al. (1997) supra), Clustal W (Higgins et al.

(1994) Nucleic acids Res. 22: 4673-4680), e GAP (University of Wisconsin Genetic Computing Group software package) usando parâmetros padrão. A presente invenção também engloba o uso de qualquer programa equivalente desses para a análise e comparação de seqüências de ácidos nucléicos e de proteínas. Por programa equivalente pretende-se qualquer programa de comparação de seqüências que, por quaisquer duas seqüências em questão, gere um alinhamento tendo correspondências de resíduos de nucleotídeo ou aminoácidos idênticos e uma identidade de seqüência percentual idêntica quando comparado ao alinhamento correspondente gerado por BLASTX, Clustal W, ou GAP.

Para propósitos da discussão precedente de seqüências de nucleotídeos e polipeptídicas variantes englobadas pela presente invenção, o termo identidade de seqüência ou identidade, no contexto de duas seqüências de

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KVJ substituições resíduos de polinucleotídeos ou polipeptídicas, faz referência aos resíduos nas duas seqüências que são as mesmas quando alinhadas para máxima correspondência sobre uma j anela de comparação especificada. Quando a porcentagem de identidade 5 de seqüência é usada em referência a proteínas, é reconhecido que as posições de resíduos que não são idênticas frequentemente diferem por conservativas de aminoácidos, quando aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (e.g., carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não mudam as propriedades funcionais da molécula. Quando seqüências diferem em substituições conservativas, a identidade de seqüência percentual pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição.

Seqüências que diferem por tais substituições conservativas são ditas por ter similaridade de seqüência ou similaridade. Meios de fazer esse ajuste são bem conhecidos daqueles especialistas na arte. Tipicamente, isso envolve dar uma pontuação a uma substituição conservativa como parcial, ao invés de uma total falta de correspondência, aumentando, dessa forma, a porcentagem de identidade de seqüência. Assim, por exemplo, quando um aminoácido idêntico recebe uma pontuação de 1 e uma substituição não conservativa recebe uma pontuação de zero,

46/136

uma substituição conservativa recebe uma pontuação entre zero e 1. A pontuação de substituições conservativas é calculada, e. g., como implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia).

O termo porcentagem de identidade de seqüência, como aqui usado, significa o valor determinado comparando-se duas seqüências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação, caracterizado pelo fato de que a porção da seqüência de polinucleotídeos na j anela de comparação pode compreender adições ou deleções (i.e., espaços), se comparado à seqüência referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas seqüências. A porcentagem é calculada determinando-se o númetó de posições nas quais a base de ácido nucléico ou resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas seqüências para produzir o número de posições com correspondência, dividindo o número de posições com correspondência pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de seqüência.

Cassetes de expressão para uso nos métodos da invenção

Composições da presente invenção incluem, ainda,

47/136 cassetes de expressão compreendendo sequências inibidoras capazes de inibir a expressão ou função de um polipeptídeo de citocromo P450 envolvido na conversão de nicotina para nornicotina em uma planta Nicotiana ou parte de planta dessa, onde as sequências inibidoras são operacionalmente ligadas a um promotor que é funcional em uma célula vegetal. Dessa maneira, cassetes de expressão compreendendo toda ou parte da seqüência relatada em SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, ou 11, um complemento ou fragmento dessas, ou seqüências compartilhando substancial identidade de seqüência a SEQ ID N0:l, 3, 5, 7, 9, 11, ou um complemento ou fragmento dessas, operacionalmente ligado a um promotor que é funcional em uma célula vegetal, são construídos para uso em métodos de silenciamento de genes da presente invenção aqui descritos abaixo. Tais seqüências são aqui referidas como seqüências inibidoras ou seqüências de polinucleotídeos inibidoras, já que são capazes de ser expressadas como uma molécula de RNA que inibe a expressão (i.e., transcrição e/ou tradução) do polipeptídeo de citocromo P450 alvo, por exemplo, o polipeptídeo relatado em SEQ ID NO:2, 4, 6, ou 8 e variantes dessas, ou um polipeptídeo compreendendo a seqüência relatada em SEQ ID NO: 10 ou 12 e variantes dessas, onde os polipeptídeos variantes têm substancial identidade de seqüência a esses polipeptídeos de citocromo P450 descritos, e são envolvidos

48/136

na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em uma planta.

É reconhecido que cassetes de expressão da presente invenção englobam construtos nos quais uma seqüência de ácidos nucléicos desejada esteja operacionalmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula vegetal, particularmente na célula de uma planta Nicotiana. Por promotor”, pretende-se uma região reguladora de DNA usualmente compreendendo um TATA box capaz de dirigir a RNA polimerase II para iniciar a síntese de RNA no sítio de iniciação de transcrição apropriado para uma seqüência de polinucleotídeos em particular. Um promotor pode adicionalmente compreender outras seqüências de reconhecimento geraimente posicionadas acima ou 5 ’ do TATA box, referidas como elementos promotores acima, os quais influenciam a taxa de iniciação de transcrição. Também é reconhecido que cassetes de expressão da presente invenção englobam domínios adicionais que modulam o nível de expressão, o sincronismo de desenvolvimento da expressão, ou tipo de tecido no qual a expressão ocorre (e.g.,

Australian Patent No. AU-A-77751/94 e U.S. Patent Nos.

5.466.785 e 5.635.618). Por funcional pretende-se o promotor, quando operacionalmente ligado a uma seqüência inibidora codificando uma molécula de nucleotídeo inibidora

49/136 (por exemplo, um RNA haírpin, RNA de dupla-fita, polinucleotideo de RNAmi, e similares), o promotor é capaz de iniciar a transcrição da sequência inibidora operacionalmente ligada, de forma que a molécula de nucleotídeo inibidora seja expressada. Os promotores podem ser selecionados baseados no resultado desejado. Os ácidos nucléicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferenciais de tecido, ou outros promotores para expressão em plantas.

Um cassete de expressão da presente invenção pode conter, também, pelo menos um gene adicional a ser cotransformado na planta. Alternativamente, o(s) gene(s) adicionais podem ser providos em múltiplos cassetes de expressão. Tal cassete de expressão é provido com uma pluralidade de sítios de restrição e/ou sítios de recombinação para inserção da sequência de polinucleotídeos de citocromo P450 inibidora a estar sob regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode, adicionalmente, conter genes marcadores de seleção.

Dessa maneira, um cassete de expressão da presente invenção inclui uma região de iniciação transcricional e de tradução (i.e., um promotor) na direção de transcrição 5’-

50/136 ’ , uma seqüência inibidora, como aqui descrito em outra parte, e uma região de terminação transcricional e de tradução {i.e., região de terminação) funcional em uma célula vegetal. As regiões reguladoras (i.e., promotores, regiões reguladoras de transcrição, e regiões de terminação de tradução) e/ou a seqüência inibidora da invenção podem ser nativas/análogas à célula hospedeira ou uma à outra. Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou a seqüência inibidora da invenção podem ser heterólogas à célula hospedeira ou uma à outra. Enquanto promotores heterólogos podem ser usados para expressar as sequências inibidoras da invenção, sequências promotoras nativas podem também ser usadas.

A região de terminação pode ser nativa em relação à região de iniciação transcricional, pode ser nativa em relação à seqüência inibidora operacionalmente ligada da invenção, pode ser nativa em relação à planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (i.e., estrangeira ou heteróloga em relação ao promotor, à seqüência inibidora de interesse, à planta hospedeira, ou qualquer combinação dessas). Regiões de terminação convenientes são disponibilizadas a partir do plasmídio Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Ver também Guerineau et al.

51/136 (1991) Mal. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell

64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149;

Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et a/. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic acids

Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic acids Res.

15:9627-9639.

Cassetes de expressão da presente invenção podem conter, adicionalmente, seqüências líder 5' que podem atuar para intensificar a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na arte e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder de EMCV (região 5’ não codificadora de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 86:6126-6130); líderes de potivírus, por exemplo, líder de TEV (Vírus Etch de Tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165 (2):233-238), Líder de MDMV (Vírus de

Mosaico de Milho Anão) (Virology 154:9-20), e proteína ligante de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido de RNAm de proteína da capa de vírus de mosaico de alfaia (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature

325:622-625); líder de vírus de mosaico de tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); e líder de vírus de mofo clorótico (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385).

52/136

Ver também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol.

84:965-968. Outros métodos conhecidos por intensificar a tradução podem ser também utilizados.

Na preparação do cassete de expressão, fragmentos de

DNA da invenção podem ser manipulado de forma a provir as seqüências de DNA na correta orientação e, como apropriado, no correto quadro de leitura. Adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unira os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem ser envolvidas para provir sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição, ou similares. Para esse propósito, mutagênese in vitro, reparo de primers, cozimento de restrição, recozimento, re-substituiçòes, e.g., transições e transversões, podem ser envolvidos.

Os cassetes de expressão da presente invenção podem, também, compreender um gene marcador de seleção para a seleção de células transformadas. Genes marcadores de seleção são utilizados para a seleção de células transformadas ou tecidos. Genes marcadores incluem genes codificando resistência a antibióticos, tais como aqueles codificando neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes conferindo resistência a compostos herbicidas, tais como

53/136 /2/ glufosinato amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4diclorofenoxiacetato (2,4-D). Marcadores de seleção adicionais incluem marcadores fenotípicos, tais como 13galactosidase e proteínas fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde (GFP) (Rouwendal et al. (1997) Plant Mo.

Biol. 33:989-999; Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng

85:610-9 e Fetter et al. (2004) Plant Cell 16:215-28), proteína fluorescente ciano (CYP) (Boite et al. (2004) J.

Cell Science 117:943-54 e Kato et al. (2002) Plant Phvsiol 129:913-42), e proteína fluorescente amarela (PhiYFP™ from Evrogen, ver, Boite et al. (2004) J. Cell Science 117:94354) . Para marcadores de seleção adicionais, ver, de forma geral, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA

89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) in

The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell

52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Acl. USA

86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA

86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483;

Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al.

(1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3952-3956; Bairn et al.

54/136 az (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:50725076; Wyborski et al. (1991) Nucleic acids Res. 19:4647-4653; HillenandWissrnan (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimierob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry

27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimierob. Agents

Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of

Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin);

Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Tais descrições são aqui incorporadas por referência. A lista acima de genes marcadores de seleção não deve ser limitante. Qualquer gene marcador de seleção pode ser usado na presente invenção.

Um número de promotores pode ser usado na prática da invenção. De particular interesse, são promotores constitutivos, promotores induzidos, particularmente promotores induzidos quimicamente, e promotores tecidopreferenciais, particularmente promotores preferenciais de folha.

Promotores induzidos quimicamente podem ser usados para inibir a expressão de um citocromo P450 que é envolvido na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em uma

55/136 /23 planta, através da aplicação de um regulador químico exógeno. Promotores induzidos quimicamente são conhecidos na arte e incluem, mas não são limitados ao, promotor PR-la de tabaco, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotores de interesse induzidos quimicamente incluem promotores de resposta a esteróides (ver, por exemplo, o promotor induzido por glucocorticóide em Schena et al. (1991) Proc.

Natl. Acad. Scí. USA 88:10421-10425 e McNellis et al.

(1998) Plant J. 14(2):247-257) e promotores induzidos por tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen.

Genet. 227:229-237, e U.S. Patent Nos. 5.814.618 e

5,789,156), aqui incorporados por referência.

Promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos descritos na U.S. Patent No. 6.072.050; o promotor núcleo CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature

313:810-812); ubiquitina	(Christensen	et	al.	(1989)	Plant
Mol. Biol. 12:619-632 e	Christensen	et	al.	(1992)	Plant
Mol. Biol. 18:675-689);	pEMU (Last	et	al.	(1991)	Theor.
Appl. Genet. 81:581-588);	MAS (Velten	et	al.	(1984)	EMBO 1
3:2723-2730); promotor ALS (U.S. Patent	No.	5.659.026), e

similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5,608.149; 5.608.144; 5.604.121;

5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; e

56/136

6.177.611.

Promotores tecido preferenciais podem ser utilizados para visar a expressão de uma seqüência inibidora de polinucleotídeos da presente invenção em um tecido vegetal em particular. Promotores tecido preferenciais incluem

Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7):792-803,· Hansen et al.

(1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al.

(1997) Transgenic Res. 6 (2):157-168; Rinehart et al. (1996)

Plant Physiol. 112 (3) : 1331-1341; Van Carrtp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2) :513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5) :773-778; Lam (1994) Results Probl.

Cell. Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol

Biol. 23 (6) : 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl.

Acad. Sei. USA 90 (20) : 9586-9590; e Guevara-Garcia et al.

(1993) Plant J. 4(3):495-505.

De interesse em particular são promotores preferenciais de folha para expressão predominantemente em tecidos foliares. Ver, por exemplo, Yamamoto et al. (1997)

Plant J. 12 (2) :255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol.

105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol.

35(5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18;

57/136

. Sei.	USA
.escência são
(1992)	Plant
al. 1	(1994)
(1998)	Plant
(1997)	Plant
Molecular
of	Plant

Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6) :1129-1138;

Baszczynski et al. (1988) Nucl. Acid Res. 16:4732; Mitra et al. (1994) Plant Molecular Biology 26:35-93; Kayaya et al.

(1995) Molecular and General Genetics 248:668-674; e

Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Ac

90(20):9586-9590. Promotores regulados por senescência são também úteis, tais como SAM22 (Crowell et al. (1992) Plant

Mol. Biol. 18:459-466); SAG12 (Lohman et al.

Physiol. Plant. 92:322-328; Wingler et al. (1998) Plant 10 Physiol. 116:329-335); SAG 13 (Gan and Amasino (1997) Plant

Physiol. 113:313-319; SAG15 (Gan (1995)

Characterization and Genetic Manipulation of Plant

Senescence, ’’ Ph.D. Thesis, University of Wisconsin,

Madison); SEN1 (Oh et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:73915 754; promotor de um gene específico de senescência para expressão de TT (Gan and Amasino 91995) Science

270:1986-1988); e similares (ver, por exemplo, Or: et al.

(1999) Plant Cell 11:1073-1080 e McCabe et al. (2001) Plant

Physiol. 127:505-516).

Métodos para Inibir a Expressão ou função de um Citocromo P450 Envolvido na Conversão de Nicotina para

Nornicotina

Métodos de reduzir a concentração, conteúdo, e/ou

58/136 atividade de um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção em uma planta Nicotiana ou parte de planta, particularmente o tecido foliar, são providos. Vários métodos podem ser usados, sozinhos ou em combinação, para reduzir ou eliminar a atividade de um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção. Além disso, combinações de métodos podem ser empregadas para reduzir ou eliminar a atividade de dois ou mais polipeptídeos de citocromo P450 diferentes.

Em concordância com a presente invenção, a expressão de um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção é inibida se o nível de proteína do polipeptídeo de citocromo P450 é estatisticamente menor do que o nível de proteína do mesmo polipeptídeo de citocromo P450 em uma planta que não foi geneticamente modificada ou mutagenizada para inibir a expressão daquele polipeptídeo de citocromo P450, e onde essas plantas foram cultivadas e colhidas usando os mesmo protocolos. Em avanços particulares da invenção, o nível de proteína do polipeptídeo de citocromo P4 50 em uma planta modificada de acordo com a invenção é de menos do que 95%, de menos do que 90%, de menos do que 80%, de menos do que 70%, de menos do que 60%, de menos do que 50%, de menos do que 40%, de menos do que

30%, de menos do que 20%, de menos do que 10%, ou de menos

59/136 do que 5% do nível de proteína do mesmo polipeptídeo de citocromo P450 em uma planta que não é um mutante ou que não tenha sido geneticamente modificada para inibir a expressão daquele polipeptídeo de citocromo P450 e que foi cultivada e colhida usando os mesmos protocolos. O nível de expressão do polipeptídeo de citocromo P450 pode ser medido diretamente, por exemplo, testando-se o nível do transcrito de citocromo P450 ou polipeptídeo de citocromo P450 expressado na planta Nicotiana ou parte de planta, ou indiretamente, por exemplo, medindo-se a conversão de nicotina para nornicotina na planta Nicotiana ou parte de planta. Métodos para monitorar o nível de expressão de uma proteína são conhecidos na arte, e incluem, mas não são limitados a, análise Northern blot, como discutido nos exemplos aqui dados abaixo. Métodos para determinar a atividade do polipeptídeo de citocromo P450 visado para converter nicotina para nornicotina são aqui descritos abaixo em outra parte, e incluem, mas não são limitados a, análise de alcalóide usando cromatografia de gás, por exemplo os procedimentos descritos nos exemplos aqui abaixo.

Em outros avanços da invenção, a atividade de um ou mais polipeptídeos de citocromo P450 é reduzida ou eliminada transformando-se uma planta ou parte de planta

60/136 com um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo que inibe a atividade de um ou mais polipeptídeos de citocromo P450 da presente invenção. A atividade de um polipeptídeo de citocromo P450 em converter nicotina para nornicotina em uma planta Nicotiana, ou parte de planta, é inibida, de acordo com a presente invenção, se essa atividade de conversão for estatisticamente menor do que a atividade de conversão do mesmo polipeptídeo de citocromo P450 em uma planta Nicotiana, ou parte de planta, que não tenha sido geneticamente modificada para inibir a atividade de conversão daquele polipeptídeo de citocromo P450, e que tenha sido cultivado e colhido usando os mesmos protocolos. Em avanços em particular, a atividade de um polipeptídeo de citocromo P450 em converter nicotina para nornicotina em uma planta Nicotiana modificada, ou parte de planta, de acordo com a invenção, é inibida se a atividade é de menos do que 95%, de menos do que 90%, de menos do que 80%, de menos do que 70%, de menos do que 60%, de menos do que 50%, de menos do que 4 0%, de menos do que 30%, de menos do que

20%, de menos do que 10%, ou de menos do que 5% da atividade de conversão do mesmo polipeptídeo de citocromo

P4 50 em uma planta Nicotiana que não foi geneticamente modificada para inibir a expressão daquele polipeptídeo de citocromo P450 e que tenha sido cultivada e colhida usando

61/136

os mesmos protocolos. A atividade de um polipeptídeo de citocromo P45 0 em converter nicotina para nornicotina em uma planta Nicotiana, ou parte de planta, é eliminada de acordo com a invenção quando não é detectável por métodos de teste aqui descritos em outra parte. Métodos de determinar a atividade de um polipeptídeo de citocromo P450 em converter nicotina para nornicotina em uma planta

Nicotiana, ou parte de planta, são aqui descritos em outra parte, e incluem as análises de alcalóides usando cromatografia de gás descritas nos exemplos aqui abaixo.

Em avanços específicos, uma seqüência de polinucleotídeos de citocromo P450 inibidora aqui descrita é introduzida em uma planta Nicotiana, ou parte de planta. Subseqüentemente, uma planta Nicotiana, ou parte de planta, tendo a seqüência de polinucleotídeos inibidora da invenção introduzida é selecionada usando métodos conhecidos daqueles especialistas na arte, tais como, mas não limitando-se a, análise Southern blot, seqüenciamento de DNA, análise de PCR, ou análise fenotípica. Uma planta ou parte de planta alterada ou modificada pelos avanços precedentes é cultivada sob condições de formação de plantas por um tempo suficiente para modular a concentração e/ou atividade de polipeptídeos da presente invenção na planta. Condições de formação de plantas são bem conhecidas

62/136 w

na arte e são aqui discutidas brevemente em outra parte.

Também é reconhecido que o nível e/ou atividade do polipeptídeo pode ser modulado empregando-se um polinucleotídeo que não é capaz de direcionar, em uma planta transformada, a expressão de uma proteína ou um RNA. Por exemplo, os polinucleotídeos da invenção podem ser usados para projetar construtos de polinucleotídeos que podem ser empregados em métodos para alterar ou mutar uma seqüência genômica de nucleotídeos em um organismo. Tais construtos de polinucleotídeos incluem, mas não são limitados a, vetores RNA:DNA, vetores mutacionais RNA:DNA, vetores de reparo RNA:DNA, duplos misturados, oligonucleotídeos RNA:DNA auto-complementares, e oligonucleobases recombinogênicas. Tais construtos de nucleotídeos e métodos de uso são conhecidos na arte. Ver,

U.S. Patent Nos. 5.565.350; 5.731.181; 5.756.325;

5.760.012; 5.795.972; and 5.871.984; todas as quais são aqui incorporadas por referência. Ver também, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821, e Beetham et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei, USA 96:8774-8778; aqui incorporadas por referência.

É reconhecido, portanto, que métodos da presente invenção não dependem da incorporação do polinucleotídeo de

63/136 citocromo P450 inibidor inteiro no genoma, apenas que a planta Nicotiana, ou parte de planta dessa, seja alterada como resultado da introdução desse polinucleotídeo inibidor em uma célula. Em um avanço da invenção, o genoma pode ser alterado seguindo a introdução do polinucleotídeo de citocromo P450 inibidor em uma célula. Por exemplo, o polinucleotídeo inibidor, ou qualquer parte desse, pode se incorporar no genoma da planta. Alterações ao genoma incluem, mas não são limitadas a, adições, deleções, e substituições de nucleotídeos no genoma. Enquanto os métodos da presente invenção não dependem de adições, deleções, e substituições de qualquer número de nucleotídeos em particular, é reconhecido que tais adições, deleções, ou substituições compreendem pelo menos um nucleotídeo.

É ainda reconhecido que reduzir o nível e/ou atividade de uma seqüência de citocromo P450 da presente invenção pode ser realizado para extrair os efeitos da seqüência apenas durante certos estágios de desenvolvimento e para desligar o efeito em outros estágios onde a expressão não é mais desejável. O controle de expressão de citocromo P450 pode ser obtido via o uso de promotores induzidos ou tecido-preferenciais. Alternativamente, o gene poderia ser invertido ou deletado usando recombinases sítio-

64/136 específicas, transposons ou sistemas de recombinação, o que também ligariam ou desligaria a expressão da seqüência de citocromo P450.

De acordo com a presente invenção, mudanças em níveis, taxas, atividade, ou distribuição de polipeptídeos de citocromo P450 da presente invenção, ou mudanças em fenótipo de planta Nicotiana, ou parte de planta, particularmente acumulação reduzida de nornicotina e seu metabólito carcinogênico, NNN, poderia ser medidas comparando-se uma planta objeto, ou parte de planta, a uma planta controle, ou parte de planta controle, onde a planta objeto, ou parte de planta, e planta controle, ou parte de planta controle, tenham sido cultivadas e/ou colhidas usando os mesmo protocolos. Como aqui usado, uma planta objeto ou parte de planta é uma na qual a alteração genética, tal como transformação, tenha sido afetada como para o polipeptídeo de citocromo P450 de interesse, ou é uma planta Nicotiana, ou parte de planta, que descende de uma planta Nicotiana, ou parte de planta, alterada dessa forma e que compreende a alteração. Uma planta controle, ou parte de planta controle, provê um ponto de referência para medir mudanças no fenótipo da planta objeto ou parte de planta objeto.

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De acordo com a presente invenção, a planta controle, ou parte de planta controle, pode compreender uma planta

Nicotiana, ou parte de planta, do tipo selvagem, i.e., do mesmo genótipo que o material iniciai para a alteração genética que resultou na planta obj eto, ou parte de planta objeto. Uma planta controle, ou parte de planta controle, pode compreender, também, uma planta Nicotiana, ou parte de planta, do mesmo genótipo que o material inicial mas foi transformada com um construto nulo (i.e., com um construto que não tenha efeito no traço de interesse, tal como um construto compreendendo um gene marcador de seleção).

Alternativamente, uma planta controle, ou parte de planta controle, pode compreender uma planta Nicotiana, ou parte de planta, que é um segregante não transformado dentre a progênie de uma planta objeto ou parte de planta objeto, ou uma planta Nicotiana, ou parte de planta, geneticamente idêntica à planta objeto, ou parte de planta objeto, mas que não seja exposta a condições ou estímulos que induziríam a supressão do gene de citocromo P450 de interesse. Finalmente, uma planta controle, ou parte de planta controle, pode compreender a própria planta obj eto, ou parte de planta, sob condições nas quais a sequência de citocromo P450 inibidora não é expressada. Em todos tais casos, a planta objeto, ou parte de planta objeto, e a planta controle, ou parte de planta controle, são cultivadas

66/136 e colhidas usando os mesmos protocolos.

Como aqui descrito em outra parte, métodos são providos para reduzir ou eliminar a atividade e/ou concentração de um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção introduzido em uma planta Nicotiana, ou parte de planta, uma seqüência de polinucleotideos de citocromo P450 inibidora que é capaz de inibir a expressão ou função de um polipeptídeo de citocromo P450 que é envolvido na conversão metabólica de nicotina para nornicotina. Em alguns avanços, a seqüência inibidora é introduzida por transformação da planta, ou parte de planta, tal como uma célula vegetal, com um cassete de expressão que expresse um polinucleotídeo que inibe a expressão do polipeptídeo de citocromo P450. O polinucleotídeo pode inibir a expressão de um polipeptídeo de citocromo P450 diretamente, prevenindo a tradução do RNA mensageiro do polipeptídeo de citocromo P450, ou indiretamente, codificando um polipeptídeo que inibe a transcrição ou tradução de um gene de polipeptídeo de citocromo P450 codificando um polipeptídeo de citocromo P450. Métodos para inibir ou eliminar a expressão de um produto gênico em uma planta são bem conhecidos na arte, e qualquer tal método pode ser usado, na presente invenção, para inibir a expressão de polipeptídeos de citocromo P450.

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Em outros avanços, a atividade de um polípeptídeo de citocromo P450 da presente invenção pode ser reduzida ou eliminada rompendo-se o gene codificando o polípeptídeo de citocromo P450. A invenção engloba plantas mutagenizadas que carregam mutações em genes de citocromo P450, onde as mutações reduzem a expressão do gene de citocromo P450 ou inibem a atividade de um polípeptídeo de citocromo P450 da presente invenção.

Em alguns avanços da presente invenção, uma planta Nicotiana_f ou parte de planta, é transformada com um cassete de expressão que é capaz de expressar um polinucleotídeo que inibe a expressão de uma seqüência de citocromo P450. Tais métodos podem incluir o uso de supressão/co-supressão senso, supressão anti-senso, interferência de RNA de dupla-fita (dsRNA), interferência de RNA hairpin e interferência de RNA hairpin contendo íntron, interferência mediada por amplicon, ribozimas, e

RNA pequeno interferente ou micro RNA.

Para co-supressão, um cassete de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA correspondendo a toda ou parte de um RNA mensageiro codificando um polípeptídeo de citocromo P450 de interesse (por exemplo, um

68/136 polipeptídeo de citocromo P450 compreendendo a seqüência relatada em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, ou 12 ou uma seqüência tendo substancial identidade de seqüência a SEQ

ID N0:2, 4, 6, 8, 10, ou 12) na orientação senso. A Sobre expressão da molécula de RNA pode resultar em expressão reduzida do gene nativo. Múltiplas linhas de plantas transformadas com o cassete de expressão de co-supressão são, então, rastreadas para identificar aquelas que apresentam a maior inibição de expressão de polipeptídeo de citocromo P450.

O polinucleotídeo usado para co-supressão pode corresponder a toda ou parte da seqüência codificando um polipeptídeo de citocromo P450 ou a presente invenção, toda ou parte da região 5 ’ e/ou 3 ’ não traduzida de um transcrito de polipeptídeo de citocromo P450, ou toda ou parte de ambas seqüência codificadora e regiões não traduzida de um transcrito codificando um polipeptídeo de citocromo P450. Em alguns avanços onde o polinucleotídeo compreende toda ou parte da região codificadora para um polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção, o cassete de expressão é projetado para eliminar o códon de início do polinucleotídeo de forma que nenhum produto de proteína seja transcrito.

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A co-supressão pode ser usada para inibir a expressão de genes vegetais para produzir plantas tendo níveis indetectáveis de proteína para as proteínas codificadas por esses genes ou pode, também, ser usada para inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta {e.g.,

Broin et al. (2002) Plant Ceil 14:1417-1432; U.S. Patent No.

5.942.657). Métodos para usar co-supressão para inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos em

Flavell et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:34 9010 3496; Jorgensen et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973;

Johansen and Carrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938;

Broin et al. (2002) Plant Ceil 14:1417-1432; Stoutjesdijk et al (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Yu et al. (2003)

Phytochemistry 63:753-763; e U.S. Patent Nos. 5.034.323, 15 5.283.184, e 5.942.657; cada qual aqui incorporada por referência. A eficiência de co-supressão pode ser aumentada incluindo uma região poli-dT no cassete de expressão na posição 3' para a seqüência senso e 5' do sinal de poliadenilação. Ver, U.S. Patent Publication No.

20020048814, aqui incorporada por referência. Tipicamente, tal seqüência de nucleotídeos possui substancial identidade de seqüência à seqüência do transcrito do gene endógeno,

otimamente	maior do que cerca de	65%	de identidade	de
seqüência,	mais otimamente maior do	que	cerca de 85%	de
25 identidade	de seqüência, maior do	que	cerca de 95%	de

70/136 identidade de seqüência (e.g., U.S. Patent Nos. 5.283.184 e 5.034.323; aqui incorporadas por referência).

Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressão do polipeptídeo de citocromo P450 da presente invenção pode ser obtida por supressão anti-senso. Para supressão antisenso, o cassete de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA complementar a todo ou parte de um RNA mensageiro codificando o polipeptídeo de citocromo P450. A sobre-expressão da molécula de RNA anti-senso pode resultar em expressão reduzida do gene nativo. Conseqüentemente, múltiplas linhas de plantas transformadas com o cassete de expressão de supressão anti-senso são rastreadas para identificar aquelas que apresentam a maior inibição de expressão de polipeptídeo de citocromo P450.

O polinucleotideo para uso em supressão anti-senso pode corresponder a todo ou parte do complemento da seqüência codificando o polipeptídeo de citocromo P450, todo ou parte do complemento da região 5' e/ou 3’ não traduzida do transcrito de polipeptídeo de citocromo P450, ou todo ou parte do complemento de ambas seqüência codificadora e regiões não traduzidas de um transcrito codificando o polipeptídeo de citocromo P450. Além disso, o polinucleotideo anti-senso pode ser completamente

71/136 complementar (i.e., 100% idêntico ao complemento da seqüência alvo) ou parcialmente complementar (i.e., menos do que 100% idêntico ao complemento da seqüência alvo) à seqüência alvo. A supressão(anti-senso pode ser usada para inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta (e.g., U.S. Patent No. 5.942.657). Adicionalmente, porções dos nucleotídeos anti-senso podem ser usadas para romper a expressão do gene alvo. Geralmente, seqüências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos,

300, 400, 450, 500, 550, ou maiores podem ser usadas.

Métodos para usar supressão anti-senso para inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos, por exemplo, em Liu et al (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 e

U.S. Patent Nos. 5.759.829 e 5.942.657, cada qual é aqui incorporada por referência. A eficiência de supressão antisenso pode ser aumentada incluindo uma região poli-dT no cassete de expressão na posição 3' à seqüência anti-senso e 5' do sinal de poliadenilação. Ver, U.S. Patent Publication

No. 20020048814, aqui incorporada por referência.

Para interferência de dsRNA, uma molécula de RNA senso, como aquela descrita acima para co-supressão, e uma molécula de RNA anti-senso que é completamente ou parcialmente complementar à molécula de RNA senso são

72/136 expressadas na mesma célula, resultando na inibição da expressão do RNA mensageiro endógeno correspondente.

A expressão das moléculas senso e anti-senso podem ser conseguidas projetando-se o cassete de expressão para compreender ambas seqüência senso e uma seqüência antisenso para a seqüência alvo de citocromo P450.

Alternativamente, cassetes de expressão separados podem ser usados para as seqüências senso e anti-senso. Múltiplas linhas de plantas transformadas com o cassete de expressão ou cassetes de expressão de interferência de dsRNA são, então, rastreadas para identificar linhas de plantas que apresentam a maior inibição de expressão do polipeptídeo de citocromo P450 visado. Métodos para usar interferência de dsRNA para inibir a expressão de genes vegetais endógenos são descritos em Waterhouse et al. (1998) Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 95:13959-13964, Liu et al. (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743, e WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631, e WO 00/49035; cada qual é aqui incorporado por referência.

Cassetes de expressão amplicon compreendem uma seqüência derivada de virus que contenha todo ou parte do gene alvo, mas geralmente não todos os genes do vírus nativo. As seqüências virais presentes no produto de transcrição do cassete de expressão permitem ao produto de

73/136 transcrição dirigir sua própria replicação. Os transcritos produzidos pelo amplicon podem ser tanto senso ou antisenso relativos à seqüência alvo (i.e., o RNA mensageiro para um polipeptídeo de citocromo P450 que é envolvido na conversão metabólica de nicotina para nornicotina). Métodos de usar amplicons para inibir a expressão de genes vegetais endógenos são descritos, por exemplo, em Angell and

Baulcombe (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angell and Baulcombe (1999) Plant J. 20:357-362, e U.S. Patent No. 6.646.805, cada qual aqui incorporada por referência.

Em avanços adicionais da presente invenção, o polinucleotídeo expressado pelo cassete de expressão da invenção é RNA catalítico ou tem atividade de ribozima específica para o RNA mensageiro de um polipeptídeo de citocromo P450 aqui descrito. Assim, o polinucleotídeo causa a degradação do RNA mensageiro endógeno, resultando em expressão reduzida do polipeptídeo de citocromo P450. Esse método é descrito, por exemplo, em U.S. Patent No.

4.987.071, aqui incorporada por referência.

Em avanços adicionais da invenção, a inibição da expressão de um ou mais polipeptídeos de citocromo P450 pode ser obtida por interferência de RNA por expressão de um gene codificando um micro RNA (RNAmi) . RNAs mi são

74/136 agentes reguladores consistindo de cerca de 22 ribonucleotídeos. Os RNAs mi são altamente eficientes em inibir a expressão de genes endógenos. Ver, por exemplo

Javier et al. (2003) Nature 425: 257-263, aqui incorporado por referência.

Para interferência de RNAmi, o cassete de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA que é modelada em um gene de RNAmi endógeno. 0 gene de RNAmi codifica um RNA que forma uma estrutura hairpin contendo uma seqüência de 22 nucleotídeos que é complementar a outro gene endógeno (seqüência alvo). Para supressão de polipeptídeo de citocromo P450 expressão, a seqüência de 22 nucleotídeos é selecionada a partir de uma seqüência de transcrito de polipeptídeo de citocromo P450 e contém 22 nucleotídeos codificando essa seqüência polipeptídica de citocromo P450 na orientação senso e 21 nucleotídeos de uma seqüência anti-senso correspondente que é complementar à seqüência senso. Moléculas de RNAmi são altamente eficientes em inibir a expressão de genes endógenos, e a interferência de RNA que induzem é herdada por subseqüentes gerações de plantas.

Ainda em outros avanços da invenção, a inibição da expressão de um ou mais polipeptídeos de citocromo P450

75/136 pode ser obtida por interferência de RNA hairpin (RNAhp) ou interferência de RNA hairpin contendo íntron (RNAihp) .

Esses métodos são altamente eficientes em inibir a expressão de genes endógenos. Ver, Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38 e as referências aí citadas.

Para interferência de RNAhp, o cassete de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA que hibridiza com si própria para formar uma estrutura hairpin que compreende uma região de loop de fita simples e um ramo de bases pareadas. A região ramo de bases pareadas compreende uma seqüência senso correspondendo a todo ou parte do RNA mensageiro endógeno codificando o produto gênico cuja expressão é para ser inibida, nesse caso, um polipeptídeo de citocromo P450 aqui descrito, e uma seqüência anti-senso que é completamente ou parcialmente complementar à seqüência senso. Alternativamente, a região ramo de bases pareadas pode corresponder a uma porção de uma seqüência promotora controlando a expressão do gene codificando o polipeptídeo de citocromo P450 a ser inibido. Assim, a região ramo de bases pareadas da molécula geralmente determina a especificidade da interferência de RNA.

Moléculas de RNAhp são altamente eficientes em inibir a expressão de genes endógenos, e a interferência de RNA que

76/136

induzem é herdada por subseqüentes gerações de plantas. Ver, por exemplo, Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al. (2002)

Plant Physiol. 129:1723-1731; e Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Métodos para usar interferência de RNAhp para inibir ou silenciar a expressão de genes são descritos, por exemplo, em Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:49854990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731;

Waterhouse	and	Helliwell (2003) Nat.	Rev.	Genet. 4:29-38;
Pandolfini	et	al. BMC Biotechnology	3:7,	e U.S. Patent
Publication	No.	20030175965; cada qual	aqui	incorporado por

referência. Um teste transiente para a eficiência de construtos de RNAhp para silenciar a expressão gênica in vivo foi descrito por Panstruga et al. (2003) MoL Biol. Rep. 30:135-140, aqui incorporado por referência.

Para RNAihp, as moléculas interferentes possuem a mesma estrutura geral como para RNAhp, mas a molécula de RNA compreende, adicionalmente, um íntron que é capaz de ser recortado (spliced) na célula na qual o RNAihp é expressado. 0 uso de um íntron minimiza o tamanho do loop na molécula de RNA hairpin seguindo splicing, e isso aumenta a eficiência de interferência. Ver, por exemplo,

Smith et al. (2000) Nature 407:319-320. Na verdade, Smith

77/136 et al. apresentam 100% de supressão de expressão de gene endógeno usando interferência mediada por RNAihp. Métodos para usar interferência de RNAihp para inibir a expressão de genes vegetais endógenos são descritos, por exemplo, em

Smith et al. (2000) Nature 407:319-320; Wesley et al. (2001)

Plant J. 27:581-590; Wang and Waterhouse (2001) Curr. Opin.

Plant Biol. 5:146-150; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat.

Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell and Waterhouse (2003)

Methods 30:289-295, e U.S. Patent Publication No.

20030180945, cada qual é aqui incorporado por referência.

O cassete de expressão para interferência de RNAhp pode ser também proj etado, de forma que a seqüência senso e a seqüência anti-senso não correspondam a um RNA endógeno.

Nesse avanço, as seqüência senso e anti-senso flanqueiam uma seqüência loop que compreende uma seqüência de nucleotídeos correspondendo a todo ou parte do RNA mensageiro endógeno do gene alvo. Assim, é a região de loop que determina a especificidade da interferência de RNA. Ver, por exemplo, WO 02/00904, aqui incorporada por referência.

O silenciamento de genes de transcrição (TGS) pode ser conseguido através do uso de construtos de RNAhp, caracterizado pelo fato de que a repetição invertida do

78/136 hairpin compartilha identidade de seqüência com a região promotora de um gene a ser silenciado. 0 processamento do RNAhp em RNAs pequenos que podem interagir com a região promotora homóloga podem iniciar a degradação ou metilação para resultar em silenciamento (Aufsatz et al. (2002) Proc.

Natl. Acad. Scl. 99 (Suppl. 4) : 164 99-16506; Mette et al.

(2000) EMBO 19(19):5194-5201).

Em avanços adicionais, um polinucleotídeo pode ser utilizado codificando uma proteína dedo de zinco que se combina a um gene codificando um polipeptídeo de citocromo

P450, resultando em expressão reduzida do gene. Em avanços em particular, a proteína dedo de zinco se liga a uma região reguladora de um gene de polipeptídeo de citocromo

P450. Em outros avanços, a proteína dedo de zinco se liga a um RNA mensageiro codificando um polipeptídeo de citocromo P450 e previne sua tradução. Métodos de selecionar sítios para direcionar proteínas dedo de zinco foram descritos em, por exemplo, U.S. Patent No. 6.453.242, e métodos para usar proteínas dedo de zinco para inibir a expressão de genes em plantas são descritos, por exemplo, em U.S. Patent

Publication No. 20030037355; cada qual é aqui incorporada por referência.

Em outros avanços da invenção, o polinucleotídeo

79/136 codifica um anticorpo que se liga a pelo menos um polipeptideo de citocromo P450, e reduz a atividade de um polipeptideo de citocromo P450 da presente invenção. Em outro avanço, a ligação do anticorpo resulta em conversão aumentada do complexo anticorpo - polipeptideo de citocromo

P450 por mecanismos celulares de controle de qualidade. A expressão de anticorpos em partes de plantas e a inibição de vias moleculares por expressão e ligação de anticorpos a proteínas em partes de plantas são bem conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Conrad and Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21:35-36, aqui incorporado por referência.

Em outros avanços, a atividade de um polipeptideo de citocromo P450 da presente invenção é reduzida ou eliminada

por rompimento	do	gene	codificando o	polipeptideo	de
citocromo	P450.	0	gene	codificando o	polipeptideo	de
citocromo	P450	pode ser	rompido por	qualquer método

conhecido na arte, por exemplo, por marcação com transposon ou mutagenizando plantas usando mutagênese aleatória ou direcionada e selecionando plantas que possuem atividade de citocromo P450 reduzida.

A marcação de transposon pode ser usada para reduzir ou eliminar a atividade de um ou mais polipeptídeos de citocromo P450 da presente invenção. Marcação de transposon

80/136 compreende inserir um transposon em um gene de citocromo P4 50 endógeno para reduzir ou eliminar a expressão do polipeptídeo de citocromo P450.

Nesse avanço, a expressão de um ou mais polipeptídeos de citocromo P450 é reduzida ou eliminada inserindo-se um transposon em uma região reguladora ou região codificadora do gene codificando o polipeptídeo de citocromo P450. Um transposon que está em uma seqüência éxon, íntron, 5' ou

3¹ não traduzida, um promotor, ou qualquer outra seqüência reguladora de um gene de polipeptídeo de citocromo P4 50 pode ser usado para reduzir ou eliminar a expressão e/ou atividade do polipeptídeo de citocromo P450 codificado.

Métodos para a marcação de transposon de genes específicos em plantas são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Maes et al. (1999) Trends Plant Sei. 4:90-96; Dharmapuri and Sonti (1999) EEMS Microbiol. Lett. 179:5359; Meissner et al. (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat et al. (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin.

Plant Biol. 2:103-107; Gai et al. (2000) Nucleic acids Res.

28:94-96; Fitzmaurice et al. (1999) Genetics 153:19191928).

Métodos adicionais para diminuir ou eliminar a

81/136 expressão de genes endógenos em plantas são também conhecidos na arte e podem ser similarmente aplicados à atual invenção. Esses métodos incluem outras formas de mutagênese, tais como mutagênese induzida por etil metanosulfonato, mutagênese por deleção, e mutagênese por deleção de nêutrons rápida usada em um senso genético reverso (com PCR) para identificar linhas de plantas nas quais o gene endógeno foi deletado. Para exemplos desses métodos, ver Ohshima et al. (1998) Virology 243:472-481;

Okubara et al. (1994) Genetics 137:867-874; e Quesada et al. (2000) Genetícs 154 : 421-436; cada qual é aqui incorporado por referência. Além disso, um método rápido e automático para rastrear mutações induzidas quimicamente, TILLING (Targeting Xnduced Local Lesions In Genomes, ou

Lesões Locais em Genomas Induzidas Direcionalmente), usando

HPLC de desnaturação ou digestão seletiva por endonuclease de produtos de PCR selecionados, é também aplicável à atual invenção. Ver McCallum et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:455-457, aqui incorporado por referência.

Mutações que impactam a expressão gênica ou que interferem com a função da proteína codificada de citocromo P450 podem ser determinadas usando métodos que são bem conhecidos na arte. Mutações de inserção em éxons gênicos resultam, usualmente, em mutantes nulos. Mutações em

82/136 resíduos conservados pode ser particularmente efetivas em inibir a função metabólica da proteína codificada.

Resíduos conservados de polipeptideos de citocromo P4 50 vegetais adequados para mutagênese com o objetivo de eliminar a atividade de um polipeptídeo de citocromo P450 na conversão de nicotina para nornicotina em uma planta

Nicotiana, ou parte de planta, foram descritos (Ver, por exemplo, Figuras 3 e 4) . Tais mutantes podem ser isolados de acordo com procedimentos bem conhecidos.

Em outro avanço dessa invenção, mutantes dominantes podem ser usados para dar início ao silenciamento de RNA devido a inversão gênica e recombinação de um lócus gênico duplicado. Ver, por exemplo, Kusaba et al. (2003) Plant

Cell 15:1455-1467.

Enquanto um número de seqüências são reconhecidas na prática da invenção, em particular, SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:5 são particularmente úteis. Enquanto não sendo ligado a quaísque mecanismos de ação em particular, acredita-se que essas seqüências codifiquem uma demetilase de nicotina que catalisa a N-demetilação oxidativa de nicotina para nornicotina. Assim, métodos para inibir especificamente essas seqüências codificadoras e não outras seqüências P450 podem ser benéficos à planta recombínante. Isto é,

83/136 estratégias que levariam à inibição de função gênica desse lócus individual podem provar serem superiores àquelas que inibem toda a família de genes. As enzimas P450 são envolvidas que quaisquer mecanismos na planta, a inibição das quais pode ser deletéria ou em detrimento do crescimento e desenvolvimento da plant ou pode impactar negativamente fatores, tais como capacidades, da planta, de defesa a doenças. Da mesma forma, porque as enzimas P45 da planta Nicotiana tem sido implicadas em metabólitos vegetais, tais como fenilpropanóide, alcalóides, terpenóides, lipídeos, glicosidas cianogênicas, glucosinolatos, e um hospedeiro de outras entidades químicas, rompimento de atividade p450 pode alterar componentes envolvidos no sabor, textura, ou outras propriedades do tabaco que causariam impacto na utilidade comercial da planta. Portanto, o uso dos métodos discutidos acima para inibir a expressão em uma maneira que vise, especificamente, a seqüência codificadora de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO: 5 pode ser preferido, incluindo estratégias mutacionais direcionadas, tais como quimeraplastia. Ver, por exemplo, Stewart et al. (2000) Biotechniques 29(4): 838-843; Graham et al. (2002) Biochim Biophys Acta 1587(1):16, aqui incorporados por referência.

A proteína codificada pelo DNAc designado 3D_C12-10 (SEQ

84/136

ID NO:4) difere-se de 3D_C12-7 (SEQ ID NO:6) em apenas dois resíduos de aminoácidos imediatamente seguindo a metionina de início. Os códons correspondentes a esses aminoácidos foram contidos no primer de PCR usado para gerar o DNAc de 3D_C12-7. Assim, o modelo de RNAm original do qual 3D_C 12-7 foi amplificada pode ser o mesmo que aquele correspondente ao gene de 3D_C12-10, com as sequências primer de PCR mediando as mudanças observadas na segunda e terceira seqüência de aminoácidos. Independentemente, os produtos de proteína codificados funcionariam identicamente. A localidade dos dois aminoácidos que diferem entre as proteínas previstas está na seqüência sinal N-terminal que serve meramente para ancorar a proteína à membrana do retículo endoplasmático e, portanto, não seria esperados para influenciar as propriedades catalíticas da enzima.

Em outro avanço da invenção, as composições da invenção são úteis em métodos de rastreamento para identificar plantas não conversoras para uso em programas de melhoramento. Dessa maneira, as seqüências de nucleotídeos da invenção podem ser usadas para rastrear germoplasinas nativas para plantas não conversoras tendo uma mutação estável em um ou mais genes p450 aqui identificados. Essas plantas não conversoras identificadas pelos métodos da invenção podem ser usadas para desenvolver

85/136 linhas de cruzamento.

Além das seqüêncías de nucleotídeos codificando seqüêncías codificadoras P450, as composições da invenção incluem uma seqüência íntron na seqüência 3D_C12-10 que pode ser usada em métodos de rastreamento. Enquanto não ligado por qualquer mecanismo de ação, o (s) gene(s) 3D_C127/3D_C12-10 podem representar o(s) único(s) membro (s) da família 3D_C12 envolvida na conversão metabólica de nicotina para nornicotina (e, como previamente dito, existe uma boa chance de que os DNAs c de 3D_C12-7 e 3D_C12-10 originados de um único particular lócus genético) . Para certas aplicações, seria útil ter meios de diferenciar, diagnosticamente, esse membro específico da família de genes 3 D C12 do resto das seqüêncías proximamente relacionadas com essa família. Por exemplo, é possível que no germoplasma de tabaco naturalmente existente (ou em populações mutagenizadas), elevações possam existir nas quais esse gene é naturalmente não funcional e pode, portanto, poder ser valioso como uma fonte permanentemente não conversora. Um método para testar especificamente tais genótipos (e.g. mutantes de deleção, rearranjos, e similares) poderia servir como uma ferramenta poderosa.

Para obter tal ferramenta, o alinhamento de seqüência apresentado na Figura 3A-3G foi usado para projetar primers

86/136 de PCR em regiões possuindo polimorfismos dentre os membros. Uma combinação de primer (primer 5’ apresentado em

SEQ ID NO: 25 e primer 3' apresentado em SEQ ID NO: 26) usando seqüências específicas para 3D_C12-1O produz dois resultados particularmente úteis: (1) todos produtos de PCR amplificado do DNA genômico de tabaco deram o mesmo particular produto (como determinado por análise de seqüência de DNA); e (2) a presença de um íntron de 992 pb foi revelada estando localizada entre as seqüências primer (Figura 7; íntron apresentado na SEQ ID NO:24).

Quando qualquer DNAc correspondendo a um membro da família 3D_C 12 é usado como uma sonda de hibridização em um teste de Southern blotting de DNA genômico de tabaco, um padrão complexo é observado. Isso é esperado, dado que existem múltiplos membros proximamente relacionados dessa família de genes. Porque as regiões de íntron de genes são tipicamente menos conservadas que éxons, é previsto que o uso de uma sonda específica de íntron reduziría essa complexidade e permitiría distinguir melhor o (s) gene(s) correspondendo ao gene 3D_C12-7/3D_C12-10 de outros membros da família. De fato, a sonda correspondendo à seqüência apresentada na Figura 7 resultou em um padrão de Southern blotting com complexidade altamente reduzida. O uso de uma sonda 3D_C12-10 específica de íntron, e/ou os primers de

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PCR usados para gerar o fragmento apresentado na Figura 7, provê, portanto, ferramentas poderosas em testes para determinar se quaisquer plantas de tabaco naturalmente ocorrentes, ou mutagenizadas, possuem deleçoes ou rearranjos que pode transmitir o gene inativo. Tal planta pode ser, então, usada em 20 programas de melhoramento para crier linhas de tabaco incapazes de conversão.

Plantas Transformadas, Partes de Planta, e Produtos

Tendo Conteúdo de Nornicotina e NNN Reduzido

Os polinucleotídeos de citocromo P450 da invenção, e variantes e fragmentos desses, podem ser usados nos métodos da presente invenção para inibir a expressão ou função de citocromos P450 que são envolvidos na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em uma planta. Dessa maneira, seqüências inibidoras que direcionam a expressão ou função de um polipeptídeo de citocromo P450 aqui descritas são introduzidas em uma planta ou célula vegetal de interesse. Em alguns avanços, os cassetes de expressão aqui descritos são introduzidos em uma planta de interesse, por exemplo, uma planta Nicotiana, como aqui anotado abaixo, usando quaisquer métodos de transformação adequados conhecidos na arte incluindo aqueles aqui descritos.

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Os métodos da invenção não dependem de um método em particular para introduzir uma seqüência em uma planta ou

parte	de	planta,	apenas que a	seqüência desej ada ganhe
acesso	ao	interior	de pelo menos	uma célula da planta	ou
parte	de	planta.	Métodos para	introduzir seqüências	de

polinucleotídeos em plantas são conhecidos na arte e incluem, mas não são limitados a, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente, e métodos mediados por vírus.

Protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir seqüências de polinucleotídeos heterólogas em plantas variam dependendo do tipo de planta ou célula vegetal visada para transformação. Métodos adequados de introduzir polinucleotídeos em células vegetais da presente invenção incluem micro injeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Shillito et al. (1987) Meth. Enzvmol. 153:313-336; Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606), transformação mediada por Agrobacterium (U.S. Patent Nos. 5.104.310, 5.149.645, 5.177.010, 5.231.019, 5.463.174, 5.464.763,

5.469.976, 4.762.785, 5.004.863, 5.159.135, 5.563.055, e

5.981.840), transferência gênica direta (Paszkowski et al.

(1984) EMBO J. 3:2717-2722), e aceleração balística de partículas (ver, por exemplo, U.S. Patent Nos. 4.945.050,

89/136

5.141.131, 5.886.244, 5.879.918, e 5.932.782; Tomes et al.

(1995) in Plant Cell, Tissue, and. Organ Culture:

Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (SpringerVerlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:9235 926). Ver, também, Weissinger et al. (1988) Ann. Rev.

Genet. 22:421-477; Christou et al. (1988) Plant Physiol.

87:671-674 (soybean); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soybean); Finer and McMullen (1991) Tn Vitro

Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soybean); Singh et al. (1998)

Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soybean); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415418 and Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:56015 566 (transformação mediada por fios de carboneto de silício); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); todos os quais são aqui incorporados por referência.

Qualquer tecido vegetal que possa ser subsequentemente propagado usando métodos donais, seja por organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com um construto recombinante compreendendo uma seqüência inibidora de citocromo P450, por exemplo, um cassete de expressão da presente invenção. Por organogênese pretende-se o

90/136 processo pelo qual brotos e raízes são desenvolvidos seqüencialmente a partir de centros meristemáticos. Por embriogênese pretende-se o processo pelo qual brotos e raízes se desenvolvem juntos em uma maneira harmonizada (não sequencialmente), seja de células somáticas ou gametas. Tecidos exemplares que são adequados para vários protocolos de transformação aqui descritos incluem, mas não são limitados a, tecido de calo, tecido meristemático existente (e.g., meristemas apicais, botões axilares, e meristemas radiculares) e tecido de meristema induzido (e.g., meristema de cotilédone e meristema de hipocótil), hipocótiles, cotilédone, discos foliares, pólen, embriões, e similares.

Como aqui usado, o termo transformação estável deve significar que o construto de nucleotídeo de interesse introduzido em uma planta se integra no genoma da planta e é capaz de ser herdado pela progênie dessas. Transformação transiente deve significar que uma seqüência é introduzida na planta e é expressada apenas temporariamente ou é presente apenas transientemente na planta.

Em avanços específicos, as seqüências inibidoras da invenção podem ser providas para uma planta usando uma variedade de métodos de transformação transiente. As

91/136 sequências inibidoras da invenção podem ser transientemente transformadas na planta usando técnicas conhecidas na arte.

Tais técnicas incluem sistemas vetores virais e a precipitação do polinucleotídeo em uma maneira que impeça a 5 subseqüente liberação do DNA. Assim, a transcrição do DNA

combinado à particular pode ocorrer, mas a freqüência com a
qual é liberada para	se	tornar integrado	no genoma é
altamente reduzida.	Tais	métodos incluem	o uso de
partículas encapadas	com	polietilenoimina	(PEI; Sigma
#P3143).
Em outros avanços	, a	seqüência iníbidora	da invenção
pode ser introduzida	em	plantas levando as	plantas em

contato com um vírus ou ácidos nucléicos virais.

Geraimente, tais métodos envolvem incorporar um cassete de expressão da invenção com uma molécula de DNA ou RNA viral. É reconhecido que promotores para uso nos cassetes de expressão da invenção também englobam promotores utilizados para transcrição por RNA polimerases virais. Métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína aí codificada, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, U.S.

Patent Nos. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367,

5.316.931, e Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology

5:209-221; aqui incorporados por referência.

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Células transformadas podem ser cultivadas em plantas

Nicotiana de acordo com métodos convencionais. Ver, por exemplo, métodos descritos em Vasil and Hildebrandt (1965) Science 150:889; Negaard and Hoffinan (1989) Biotechniques (8):808-812. Essas plantas pode ser, então, cultivadas e tanto polinizadas com a mesma linha transformada ou linhas diferentes, e a progênie resultante tendo expressão da característica fenotípica desejada identificada, i.e., expressão reduzida de um ou mais citocromos P450 que estão envolvidos nas conversão metabólica de nicotina para nornicotina, e, assim, conteúdo reduzido de nornicotina, e um concomitante conteúdo reduzido de seu metabólito de nitrosamina, NNN, na planta, particularmente nos tecidos foliares. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e, então, as sementes são colhidas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada. Dessa maneira, a presente invenção provê sementes transformadas (também referidas como sementes transgênicas) tendo um polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporado em seu genoma.

93/136

As composições e métodos da invenção podem ser usados para reduzir o conteúdo de nornicotina, particularmente nas folhas e caules, de qualquer planta do gênero Nicotiana incluindo, mas não limitando-se a, as seguintes espécies:

acuminata, affinis, alata, attenuate, bigelovii, clevelandii, excelsior, forgetiana, glauca, glutinosa, langsdolffii, longiflora, obtusifolia, pahneri, paniculata, plumbaginifolia, qudrivalvis, repanda, rústica, suaveolens, -sylvestris, tabacum, tomentosa, trigonophylla, e x sanderae. A presente invenção também engloba a transformação de quaisquer variedades de uma planta do gênero Nicotiana, incluindo mas não limitando-se a Nicotiana acuminata multiflora, Nicotiana alata grandiflora, Nicotiana bigelovii quadrivalvis, Nicotiana bigelovii wallacei, Nicotiana obtusifolia obtusifolia, Nicotiana obtusifolia plameri, Nicotiana quadrivalvis bigelovii, Nicotiana quadrivalvis quadrivalvis, Nicotiana quadrivalvis wallacei, e Nicotiana trigonophylla palmeri, assim como variedades comumente conhecidas como variedades flue ou brilhante, variedades

Burley, variedades escuras, e variedades oriental/Turca.

As plantas transgênicas do gênero Nicotiana, como aqui descrito, são adequadas para técnicas de cultivo e colheita convencionais, tais como cultivo em solo rico em adubo ou sem adubo, ensacando as flores ou sem ensacar, ou podando

94/136 ou sem poda. As folhas e caules colhidos podem ser usados em qualquer produto tradicional de tabaco, incluindo, mas não limitando-se a, tabaco de cachimbo, charuto e cigarro, e tabaco de mascar em qualquer forma incluindo tabaco em folha, tabaco em tiras, ou tabaco de corte.

Assim, a presente invenção provê uma planta Nicotiana, particularmente tecidos foliares dessas plantas, compreendendo um cassete de expressão da invenção e uma quantidade reduzida de nornicotina e N’-nitrosonornicotina. Como aqui usado, o termo uma quantidade reduzida ou um nível reduzido deve referir-se a uma quantidade de nornicotina e/ou N'-nitrosonornicotina em uma planta tratada ou planta transgênica do gênero Nicotiana, ou uma parte de planta ou produto de tabaco dessas, que é menor do que seria encontrado em uma planta do gênero Nicotiana ou uma parte de planta ou produto de tabaco da mesma variedade de tabaco, processado (i.e., cultivado e colhido) da mesma maneira, que não foi tratado ou não tornou-se transgênico para nornicotina e/ou N’-nitrosonornicotina reduzida. A quantidade de nornicotina pode ser reduzida por cerca de 10% a mais do que cerca de 90%, incluindo mais do que cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de

60%, cerca de 70%, e cerca de 80%.

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Μ

Ο termo produtos de tabaco, como aqui usado, incluem, mas não são limitados a, materiais de fumo (e.g., tabaco de cigarros, charutos, cachimbos), inalação, tabaco de mascar, goma, e losangos. A presente invenção também engloba uma gama de marcas de produtos de tabaco que podem ser feitas combinando-se tabaco convencional com diferentes quantidades de tabaco de baixa nornicotina e/ou N ’ nitrosonornicotina aqui descrito. Em avanços adicionais, a planta ou parte de planta do gênero Nicotiana, como descrita acima, é curada de tabaco.

Em alguns avanços da presente invenção, o produto de tabaco reduz o potencial carcinogênico de fumaça de tabaco que é inalado diretamente com o consumo de um produto de tabaco, tal como tabaco de charutos, cigarros, ou cachimbos, ou inalado como fumaça secundária (i.e., por um indivíduo que inala a fumaça de tabaco gerada por um indivíduo consumindo um produto de tabaco). 0 tabaco curado aqui descrito pode ser usado para preparar um produto de tabaco, particularmente um que passe por mudanças químicas devido ao calor, compreendendo uma quantidade reduzida de nornicotina e/ou N'-nitrosonornicotina no fluxo de fumaça que é inalado diretamente ou inalado como fumaça secundária. Da mesma maneira, os produtos de tabaco da invenção podem ser úteis na preparação de produtos de

96/136 tabaco com menos fumaça, tais como tabaco de mascar, de inalação, e similares.

Os produtos de tabaco obtidos das plantas de tabaco transgênicas da presente invenção são, assim, úteis em métodos para reduzir o potencial carcinogênico desses produtos de tabaco, e reduzir a exposição de humanos à nitrosamina NNN carcinogênica, particularmente para indivíduos que são usuários desses produtos de tabaco.

Os seguintes exemplos são oferecidos por meio de ilustração e não por meio de limitação.

EXPERIMENTAL

Os seguintes materiais e protocolos foram utilizados nos experimentos aqui descritos abaixo.

Materiais vegetais

Todos	os	materiais vegetais utilizados n	.esses
experimentos	foram providos pelo Dr.	Earl Wernsman,
Department	of	Crop Science,	North	Carolina	State
University.	DH	911307-46(NC) e	Dl-191-	1307-46 (Con)	são
linhas Burley	haplóides duplas	quase	isogênicas	(não

97/136 conversoras e conversoras, respectivamente) recuperadas da mesma planta materna haplóide. Linhas Burley DH 98-326-3 (não conversora) e DH 98-326-1 (conversoras, and DH 98-3255 (não conversora) e DH 98-325-6 (conversora) representam dois pares adicionais de linhas quase isogênicas. SC58 é uma variedade de tabaco curado em estufas com controle de umidade, temperatura e circulação de ar, da qual indivíduos não conversores são designados SC58 (c_Tc_T) . SC58 (C_TC_T) é uma linha conversora estável quase isogênica que se originou pela introdução do lócus conversor único dominante (C_T) encontrado em espécies de tabaco N. tomentosiformis progenitoras em SC58 (Mann et al. (1964) Crop Sei. 4:349353. Após oito cruzamentos reversos adicionais para SC58, a linha quase isogênica SC58(C_TC_T) foi criada e subseqüentemente mantida por auto-fertilização.

Todas as plantas foram mantida em câmaras de crescimento ou estufas usando solo de plantio padrão e fertilizante. Para estudos de micro arranjos, o metabolismo de nicotina para nornicotina foi acelerado excisando-se folhas individuais e inserindo seus petíolos em uma solução de 0,1% etefon ou 1% bicarbonato de sódio. As folhas foram, então, colocadas em uma câmara de crescimento (27°C) por 5 a 7 horas para facilitar a entrada das soluções de etefon ou bicarbonato de sódio pelo canal de transpiração.

98/136

As folhas tratadas foram colocadas em pequenas sacolas plásticas de armazenamento após serem levemente borrifadas com água (para manter alta umidade) e curadas por três dias a 30 °C no escuro. Para intensificar a conversão de nicotina para nornicotina nas plantas transgênicas geradas nesse estudo, folhas destacadas foram imersas em uma solução de 0,2% etefon, secadas, e curadas em sacolas plásticas de armazenamento por sete dias, em temperatura ambiente, no escuro.

Bibliotecas de DNAc e Marcas de Seqüência Expressadas (ESTs)

O RNA celular total foi isolado de tecido foliar em senescência de linhas Burley DH 91-1307-46(NC) e DH 911307-46(Con) usando o reagente TRIzol® de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen). RNA PoliA+ foi isolado do RNA total usando o sistema MessageMaker (Invitrogen), e o DNAc foi subsequentemente sintetizado e clonado no vetor fago lambda ΖΑΡ II usando o kit ZAP-DNAc Synthesis and. Gigapack III Gold Cloning Kit (Stratagene) . Alíquotas das bibliotecas fago foram convertidas para bibliotecas plasmídio baseadas em pBluescript seguindo o protocolo de excisão em massa destacado pela Stratagene.

99/136

Milhares de colônias de ambas bibliotecas conversoras e não conversoras foram cultivadas em meio sólido seletivo e colocadas em placas poço 384 contendo caldo Luria com ampicilina) em 10% glicerol para facilitar o armazenamento de longo prazo dos clones a -80°C. Mais de 11.000 clones de cada biblioteca foram transferidos das placas de 384 poço a blocos de crescimento de placas poço 96 e cultivados em meio seletivo. Plasmídios foram isolados em formato de 96 poços usando o kit R.E.A.L. Preparation Kit (Qiagen) com o auxílio de um estação BioRobot 3000 Workstation (Qiagen). Para gerar as ESTs, os clones de plasmídios foram seqüenciados usando o primer T3 (Qiagen) e sistema terminado BigDye® Terminator (Applied Biosystems) de acordo com o protocolo de seqüenciamento de ciclo BigDye®. Placas poço 96 Performa® DTR (Edge Biosystems) foram usadas para remover a tintura não incorporada das reações antes do carregamento das amostras em um seqüenciador de DNA Perkin

Elmer Prism 3700 96-Capillary Automated DNA Sequencer.

Preparação de Chips de DNA

Para obter DNAs adequados para colocação em slides de vidro, os primers de seqüenciamento Ml3 normal e reverso (Qiagen) foram usado como primers de PCR para amplificar inserções de DNAc dos plasmídios contendo DNAs c

100/136 representados nas bases de dados de ESTs.

Clones de plasmídios foram sujeitos a PCR em formato de 96 poços usando um termociclo modelo Applied Biosystems Gene Amp 9700. Os produtos de PCR resultants foram processados através de sistemas de purificação Millipore Multiscreen™ PCR ou Montage™ PC496. Os produtos resultants foram transferidos em placas poço 384 contendo volumes iguais de DSMO. As concentrações finais de DNA foram estimadas sendo iguais a ou maiores que 0,1 mg/ml. Os DNAs foram subsequentemente colocados em slides cobertos com amino-silano (Corning ' GAPS II) usando uma impressora de ordenação Affymetrix GMS 417. DNAs foram imobilizados à superfície do slide por ligação cruzada ITV (-120mJ/m²) , seguido por cozimento a 75°C por duas horas.

Hibridização e Análise de Micro-ordenação

O método de incorporação de tintura indireto baseado em amino alil dUTP descrito pelo The Institute of Genome Research (http://pga.tigr.org/protocols.html) foi usado para rotular RNAs conversores e não conversores com tinturas fluorescentes Cy3 e Cy3 (Amersham Biosciences).

Resumidamente, 20 pg de RNA total foi transcrito reversamente em um volume de 30 μΐ contendo 400 unidades de

101/136

SuperScript II RT (Invitrogen), 6 ng de primers hexâmeros aleatórios, 0,5 mM de dATP, dCTP, e dGTP cada, 0,3 mM dTTP, e 0,2 mM amino alil dUTP (Sigma) em tampão de síntese de primeira fita (Invitrogen). As reações foram incubadas por

6 a 14 horas a 42°C, seguido por hidrólise do RNA com NaOH.

As moléculas resultantes da primeira fita de DNAc foram purificadas por coluna (Qiagen) e lavadas com tampão de fosfato. Reações de combinação do NHS-éster Cy3 ou tinturas fluorescentes Cy5 ao DNAc ocorreram durante a incubação em 0,05 M de tampão de carbonato de sódio (pH 9,0) e 25% DMSO a temperatura ambiente por 1,5 horas.

Slides de Micro arranjos foram pré-hibridizados em uma solução de 5X SSC, 0,1% SDS, e 1% BSA a 42°C por 45 minutos, suavemente enxaguados com dH2O e isopropanol, e secados por centrifugação de baixa velocidade. Os DNAs c rotulados com Cy3 e Cy5 foram purificados por coluna (Qiagen), combinados, e hibridizados aos slides de DNA slides em uma solução contendo 5X SSC, 0,5% SDS, 5X

Denhardfs, 0,45 μΐ RNA Poli A, 0,45 pg/μΐ de DNA de timo de bezerro, e 50% formamida. Os slides foram incubados com a solução de hibridização por 14 a 16 horas a 42 °C. Lavagens pós-hibridização consistiram de incubações sequenciais de 4 minutos com as seguintes soluções: IX SSC,

0,2% SDS; 0,lX SSC, 0,2% SDS; 0,lX SSC, e uma enxaguada

102/136 final de 10 segundos com 0,01X SSC.

Os micro arranjos foram subsequentemente escaneados usando ScanArray 2.1 (GSI Lumonics) ou ScanArray Express (PerkinElmer). Escaneamento seqüencial para fluorescência de Cy5 e Cy3 foi efetuado a uma resolução máxima de 10 gm/pixel, e ajustados com poder de laser e ganho PMT para provir forças de sinal confiáveis e equivalentes. As imagens de arranjos adquiridas foram quantificadas por intensidade de sinal com o software de análise QuantArray™ (PerkinElmer), usando o método baseado em histograma. As intensidades totais foram usadas como campos de quantificação de resultado, e os grupos de dados adquiridos foram salvos como Unicode, arquivos de texto delimitados por tab. A importação dos arquivos de texto em Microsoft Excel permitira o cálculo subseqüente das razões Cy5/Cy3 e Cy3/Cy5, a estatística que empregamos para a identificação de genes candidatos.

Clonagem de membros de comprimento total e membros adicionais da família de genes 3D C12

Para clonar toda a região codificados de 3D_C12 e 7D_A06 uma estratégia de raça 5' modificada foi empregada usando um primer específico de vetor pBluescript II

103/136 (BlueSK; 5’-CGCTCTAGAACTAGTGATC-3’ ; SEQ ID NO:17) e um grupo de primers reversos gene-específicos. Dois primers reversos específicos de 3D_C12 foram projetados, um dos quais é complementar à porção abaixo da região 3' não traduzida (5’-TTTTTGGGACAATCAGTCAA-3’ SEQ ID NO:18) e o outro complementar a uma sequência na região codificadora (5 ' - GTTAGATTTATCGTACTCGAATT-3; SEQ ID NO: 19). Para o primer anterior, as primeiras cinco Ts são complementares à cauda poliA do transcrito. Um primer reverso específico de

7D__A06 (5’-TTCATTTCAAATTATTTTATGCACCA-3' ; SEQ ID NO: 20) foi também projetado, e é complementar a um segmento na região ’ não traduzida desse gene. Reações de PCR continham 10 ng de biblioteca de DNAc de folha de tabaco conversor (no vetor pBluescript) como modelo, 2 μΜ de concentração de cada primer, 350 μΜ de cada dNTP, e 1,5 mM de MgCl₂ em um volume de reação final de 50 μΕ. A amplificação foi iniciada pela adição de 2,5 unidades de mistura de enzima UniPol usando condições descritas pelo fabricante (Roche). Após uma etapa de desnaturação inicial a 94 °C por 4 minutos, as amostras foram sujeitas a 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 15 segundos, recozimento a 57°C por 30 segundos, e extensão a 72°C por 90 segundos. Uma etapa de extensão final a 72°C por 10 minutos foi incluída no final dos 30 ciclos. Os amplicons foram ligados no vetor pGEM Easy T/A (Promega) , e 10 clones aleatoriamente

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selecionados de cada amplificação foram sujeitos a análise de seqüência de DNA. Ácidos nucléicos e seqüências de proteínas previstas dos vários membros da família de genes 3D C12 foram analisados e comparados usando os algoritmos de BLASTX (Altschul et al. (1997) Nucleic acids Res. 25:3389-3402), ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic acids Res. 22:4673-4680) e GAP (pacote de software

University cf Wisconsin Genetic Computing Group software package) .

A estratégia descrita acima foi eficiente em identificar informação de seqüência de comprimento total para 3D_C12 e 7D A06. Além disso, amplificações de PCR usando o primer de PCR interno â região codificadora de 3D_C12 levantou informações de seqüência parcial para o DNAc 3D_C12-15 particular. Em uma tentativa de obter informações de seqüência de comprimento total para 3D_C1215, um primer gene-específco complementar ao terminal 5' de sua região codificadora (5'-ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3; SEQ ID

NO: 21) foi usado em conjunto com um primer reverso específico de pBluescript (5^r- TCGAGGTCGACGGTATC-3’; SEQ ID NO:22). Apesar de um DNAc de 3D_C12-15 de comprimento total não ter sido recuperado, essa amplificação resultou no isolamento de 3D_C12-7, o que provou ser outro membro particular da família de genes 3D_C12.

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Análise de Planta Transgênica

Os construtos de silenciamento de genes baseados em

RNAi foram reunidos em uma versão do vetor de clonagem pKYL80 (Schardl et al. (1987) Gene 61:1-11) que foi criado para conter um fragmento de 151 pb do íntron de gene FAD3 de soj a entre os sítios de restrição Xhol e Sad do poliligante (pKYLX80l). Para criar um construto no qual o íntron FAD3 foi flanqueado por um fragmento senso e antisenso de 3D_C12, uma região de 99 pb localizada imediatamente acima do códon de parada do DNAc de 3D_C 12 (Figura 3A-3G) foi clonada entre os sítios de restrição Hindill - Xhol e Saci - Xbal de pKYLX80l em sua orientação senso e anti-senso, respectivamente. O fragmento Hindill Xbal resultante contendo o braço senso 3D_C12, íntron FAD3, e braço anti-senso 3D_C12, foi subclonada no vetor de expressão vegetal binário pKYLX71 (Maiti et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6110-6114) entre o promotor

35S CaMV e uma subunidade terminadora pequena da rubisco.

Construtos de sobre-expressão foram criados substituindo o ORF de 3-glucuronidase ORF do vetor de expressão vegetal binário pBI121 (Clontech) com as regiões codificadoras de comprimento total dos DNAs c 3D_C12,

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7D_A06, e 3D_C12-7. Isso colocou os P450s de tabaco sob o controle transcricional do promotor 35S CaMV. Os construtos baseados em pBI121 e pKYLX71 foram transformado na linhagem LBA 4404 de Agrobacterium tumefaciens e introduzidos em cultivares de tabaco Petite Havana e DH98-325-6 (conversores), respectivamente, usando protocolos estabelecidos (Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231).

Análise de Northern Blot

RNA celular total foi isolado de folhas de tabaco usando o método TRIZOL® como descrito pelo fabricante (Invitrogen) . De cinco a dez microgramas de RNA foram fracionados por tamanho em 1,2% de gel de agarose preparado em tampão TBE. Imobilização de RNA, rotulagem de sonda, e detecção de sinal foram conduzidas usando os kits DIG de rotulagem e detecção de ácidos nucléicos de acordo com as instruções do fabricante (Roche). Alternativamente, sondas foram sintetizadas usando ³²P-dCTP de acordo com protocolos acompanhado o kit Random Primed DNA Labeling (Roche).

Análise de Alcalóide

Folhas de tabaco foram colhidas e secadas com ar em um forno a 65 °C por 2 dias. Uma amostra de 100 mg de folha

107/136 esmagada e seca foi adicionada a 0,5 ml de 2 N NaOH em um frasco de cintilação de 20 mL. A amostra foi misturada e deixada incubando por 15 minutos em temperatura ambiente.

Alcalóides foram extraídos pela adição de 5 mL de solução de extração [0,04 % quinolina (peso/vol) dissolvidos em metil-t-butil éter] e suavemente rodados em um agitador linear por 3 horas. Após a fase de separação, uma alíquota da fase orgânica foi transferida a um frasco de amostra. Amostras foram analisadas usando um cromatógrafo de gás

PerkinElmer Autosystem XL equipado com um detector de chama de ionização, um alinhador de vidro split/splitless de 4 mm, e uma coluna ID DB-5 de 30 m x 0,53 mm. As condições cromatográficas foram como se segue: temperatura do detector: 250°C; temperatura do injetor: 250°C; taxa de fluxo de hélioi a 120°C: 20 mL/min; volume de injeção: 2 AL; condições da coluna: 120°C, espera de 1 minuto, 120280°C a taxa de ramping de 30°C /minuto, espera a 280°C por 2 minutos. A composição de alcalóide foi determinada pelo software TotalChrome Navigator usando uma curva de calibragem.

Exemplo 1: Geração de Bases de Dados de EST

RNAs isolados de folhas em senescência do genótipo conversor DH 91-130746(Con) e seu oposto quase isogênico

108/136 não conversor DH 91-1307-46(NC) foram usados para gerar bibliotecas de DNAc. Seqüenciadores de DNA automáticos de alta produção foram inicialmente usados para gerar informações de seqüência de corrida única {ESTs) para

11.136 DNAs c randomicamente escolhidos da biblioteca conversora. A ferramenta BLASTX de busca de alinhamento local (Altschui et al. (1990) Mol. Biol. 215:403-410) foi usada para comparer a prevista seqüência de proteínas de cada DNAc de tabaco com a base de dados de proteínas curadas não redundante pelo National Center for

Biotechnology Information da National Library of Medicine and National Institutes of Health. Subseqüentemente, uma base de dados EST anotada similar foi gerada conduzindo-se corridas de seqüenciamento em 11.904 DNAs c selecionados a partir da biblioteca não conversora.

Exemplo 2: Análises de Micro arranjos de Biblioteca de

DNAC Conversor

Métodos

Com o término das bases de dados de EST geradas a partir da biblioteca de DNAc conversor, as inserções de 4992 clones foram amplificadas por PCR e colocadas em slides de vidro. Dada a possibilidade de que a enzima

109/136 nicotina demetilase possa ser catalisada por uma enzima da classe P450 de enzimas oxidativas, atenção especial foi dada a entradas da biblioteca que foram previstas pela análise BLASTX para codificar P450s.

A partir de inspeção visual dos resultados de BLASTX, foi estimado que 31 genes P450 particulares foram representados na base de dados. Quando selecionando placas poço 96 específicas a ser incluídas no micro arranjo, foi tomado cuidado para assegurar que todos genes P450 particulares seria incluídos dentre os 4992 DNAs c selecionados.

RNAs isolados dos genótipos Burley quase isogênicos DH

98-326-3 (não conversor) e DH 98-326-1 (conversor), e DH

98-325-5 (não conversor) e DH 98-325-6 (conversor) foram usados para gerar DNAs c rotulados com Cy3 e Cy5. Para maximizar a conversão metabólica de nicotina para nornicotina em genótipos conversores, folhas destacadas foram tratadas com bicarbonato de sódio ou etefon antes da dura, tratamento comprovado por acelerar a produção de nornicotina em plantas conversoras enquanto tendo nenhum efeito em indivíduos não conversores (Fannin and Bush (1992) Med. Sei. Res. 20:8 67-8 68; Shi et al. (2003) 1

Agric. Food Chem. 51:7679-7683).

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Para minimizar a variabilidade inerente com experimentos de micro arranjo, experimentos recíprocos foram conduzidos simultaneamente. Dessa maneira, RNA DH 985 325-5 foi rotulado com Cy5 e RNA DH 98-325-6 foi rotulado com Cy3, e, então, em um experimento recíproco RNA DH 98325-5 foi rotulado com Cy3 e RNA DH 98-325-6 foi rotulado com Cy5 (coletivamente referido como Exp. 2.1).

Similarmente, RNAs DH 98-326-3 e DH 98-32 6-1 foram rotulados com Cy3 e Cy5, respectivamente, em um experimento e, então, os mesmos RNAs foram rotulados com Cy5 e Cy3, respectivamente, em um experimento recíproco (coletivamente referido como Exp. 2.2).

Mesmo quando conduzidos reciprocamente, os resultados de qualquer dado experimento de micro arranjo são prováveis de incluir falsos positivos, representando genes que são diferencialmente regulados entre um par genotípico específico e/ou unicamente em resposta a um tratamento específico, ao contrário a diferenças diretamente associadas com o fenômeno de conversão. Para definir o grupo de genes candidatos que são mais prováveis de serem positivamente regulados devido ao processo de conversão,

DNAs c foram identificados se encaixando nos seguintes critérios: pra qualquer grupo de experimentos recíprocos

111/136 (i.e., Exp. 2.1, ou Exp. 2.2), a intensidade de hibridização de um dado DNAc tinha que ser de pelo menos 2dobras maior com a sonda conversora do que a sonda não conversora em pelo menos uma das hibridizações, e não menos do que 1,5-dobras maior no experimento recíproco.

Experimento 2.1 - Folhas das linhas quase isogênicas DH 98-325-5 e DH 98325-6 foram tratadas com etefon e curadas por 3 dias a 30°C. A análise de alcalóide revelou que virtualmente toda a nicotina tinha sido metabolizada para nornicotina na folha de DH 98-325-6 durante esse período enquanto um mínimo de nornicotina foi observado na folha de DH 98-325-5. RNAs da planta não conversora DH 98-325-5 foram rotulados com a tintura fluorescente Cy3, e RNAs extraídos de uma folha de DH 98325-6 (conversora) foram rotulados com Cy5. Os DNAs c rotulados com Cy3 e Cy5 foram incubados juntos no mesmo chip de DNA e deixados para hibridizar de um dia para o outro.

Experimento 2.2 - Uma análise de micro arranjo similar ao Exp. 2.1 foi conduzida usando as linhas quase isogênicas

DH 98-326-3 (não conversora) e DH 98-326-1 (conversora).

Nesses experimentos, folhas de cada genótipo foram tratadas com 1% bicarbonato de sódio e curadas por 3 dias a 30°C. Ao

112/136 final do período de tratamento, nicotina foi o alcalóide predominante na folha de DH 98-326-3, enquanto quase todo alcalóide na folha de DH 98-326-1 foi nornicotina. Como descrito para Exp. 2.1, esses experimentos foram reciprocamente conduzidos.

Resultados

Em ambos Experimento 2.1 e Experimento 2.2, a grande maioria dos 4992 DNAs c apontados nos slides de vidro apresentaram nenhuma diferença substancial em suas intensidades de hibridização às sondas competindo rotuladas com Cy3e Cy5. Dos 4 992 DNAs c apontados nos slides de vidro, apenas cinco apresentaram pelo menos expressão 2dobras maior em uma hibridização e não menos do que 1,5dobra na hibridização recíproca para ambos Exp. 2.1 e Exp. 2.2. Essas foram designadas 3D C12, 7D_A06, 27C_C12,

33A_D06, e 34D_F06. Análise BLASTX da informação parcial de seqüência para 3D_C12 e 7D_A06 encontrou em nossa base de dados EST previstos que os DNAs c codificam duas enzimas proximamente relacionadas P450. 27C_C12 e 33A D06 foram previstas para codificar proteínas de parede ricas em glicina, apresentando acima de 90% de identidade de seqüência a proteínas pequenas de tabaco ricas em glicina encontradas no GenBank (e.g., Accession No. AAK5754 6) .

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Clone 34D_F06 foi encontrado contendo uma inserção de DNAc dupla, uma inserção apresentando homologia a proteína quinase serina/treonina, e a outra apresentando alta identidade de seqüência às mesmas proteínas de parede ricas em glicina como os DNAs c 27C C12 e 33A D06.

Exemplo 3: Análise de Micro Arranjo de Biblioteca de

DNAc Não-Conversor

Com o término da base de dados EST da biblioteca não conversora (gerado a partir de folhas em senescência do genótipo DH 91-1307-46 (NC)), outro grupo de experimentos de micro arranjo foi iniciado. Para essa próxima geração de micro arranjos, a meta foi produzir slides de vidro contendo o grupo de genes não redundantes completo dos genes representados em ambas bibliotecas.

Para obter uma estimativa do número de genes particulares que são representados na base de dados, análise de agrupamento foi conduzida para identificar ESTs previstas por serem representados múltiplas vezes na base de dados (contigs} versus aqueles previstos por serem representados apenas uma vez (singletons} (Huang and Madan (1999) Genome Res. 9: 868877) . Devido à natureza dos algoritmos de agrupamento, seqüências apresentando altas, /«>2

114/136 mas imperfeitas, identidades de seqüência são agrupadas no mesmo contig. O grupo total de genes particulares previstos, ou unigenes, em uma base de dados é calculado como a soma dos contigs e singletons. Análise de agrupamento das bases de dados conversora e não conversora combinadas previram 2246 contigs e 4717 singletons par um total de 6.963 unigenes. Inserções de todos singletons e uma individual de cada contig foram amplificadas por PCR e apontadas em slides de vidro, resultando em um chip de gene contendo o grupo completo de 6.963 unigenes.

Além de criar um novo chip de DNA, os materiais genéticos usados para gerar sondas de hibridização também diferiram daqueles usados no Exemplo 2. SC58 é uma variedade de indivíduos de tabaco curado em estufas com controle de umidade, temperatura e circulação de ar, não conversores, dos quais são designados SC58(cTcT). SC58(C_TC_T) é uma linha conversora estável quase isogênica que se originou através da introdução do lócus conversor dominante único (C_T) encontrado na espécie de tabaco progenitora N.

tomentosiformis em SC58 (Mann et al. (1964) Crop Sei.

4:349353) . Após oito cruzamentos reversos adicionais para

SC58, a linha quase isogênica SC58(C_TC_T) foi criada e subseqüentemente mantida via auto-fertilização. O fenótipo de conversão de plantas SC58(CtC_t) é único com respeito a

115/136 linhas de tabaco conversoras padrão nas quais o metabolismo de nicotina para nornicotina na folha não requer senescência ou cura. Plantas possuindo o lócus conversor CT de N. tomentosiformis contém nornicotina como o alcalóide predominante até em tecido foliar verde (Wernsman and Matzinger (1968) Tob. Sei. 12:226-228).

RNAs isolados de tecido foliar verde de SC58(c_Tc_T) e

SC58(C_TC_T) foram rotulados com Cy3 e Cy5, respectivamente, e simultaneamente hibridizados a um chio de DNA contendo todo o grupo de 6.963 unigenes de DNAs c. As tinturas fluorescentes foram invertidas para produzir as sondas para um experimento recíproco como descrito nos Exps. 2.1 e 2.2 do Exemplo 2.

Resultados

Os resultados foram avaliadas usando os mesmos critérios como no Exemplo 2, i.e., DNAs c individuais foram identificados mostrando pelo menos 2-dobras intensificadas de hibridização ao DNAc SC58 (C_TC_T) rotulado versus SC58 (c_Tc_T) em um experimento e pelo menos 1,5-dobra de intensificação no teste recíproco.

Os resultados foram comparados àqueles dos Exp. 2.1 e

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Exp. 2.2 no Exemplo 2 acima. Hibridização intensifica dos

RNAs conversores para DNAs c codificando membros da mesma família P450 proximamente relacionada foi o único resultado compartilhado por todos os três experimentos de micro arranj o usando os critérios definidos. 131 A_A02 é o nome do DNAc que foi apontado no chip unigene de 6963 membros que é representativo da família de genes P450 que inclui 3D_C12 e 7D__A06 (3D_C12 e 7D_A06 eles próprios não foram apontados no slide unigene). Nenhum outro DNAc no arranjo no Exemplo 3, o qual incluiu representantes dos contigs contendo a proteína rica em glicína codificando DNAs c 27C_C12 e 33A D06 e 34D_F06, foi positivo pelos critérios definidos e também foram positivos no Exp. 2.1 ou Exp. 2.2 do Exemplo 2 acima, independente se os resultados foram comparados individualmente ou coletivamente.

Tabela 1. Resultados de Micro Arranjo de membros da família de genes 3D C12

	Experimento 2.1		Experimento 2.1 (reciproco)
DNAc	Leitura de Cy3	Leitura de Cy5	Taxa Cy5/Cy3	Leitura de Cy3	Leitura de Cy5	Taxa Cy5/Cy3
3D C12	15514,14	25928,95	1, 67	19355,85	9507,87	2,04
7D A06	15238,23	37196,19	2, 44	13651,03	8121,04	1,68

	Experimento 2.2		Experimento 2,2 (reciproco)
	Leitura de Cy3	Leitura de Cy5	Taxa Cy5/Cy3	Leitura de Cy3	Leitura de Cy5	Taxa Cy5/Cy3
3D C12	12756,43	28669,28	2,25	32198,81	16166,13	1,99
7D A06	7571,06	19180,94	2,53	42408,85	18440,17	2,30

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	Exemplo 3		Exemplo 3 (recíproco)
	Leitura de Cy3	Leitura de Cy5	Taxa Cy5/Cy3	Leitura de Cy3	Leitura de Cy5	Taxa Cy5/Cy3
131A A02	11138,96	19638,82	1,76	36963,45	10085,25	3, 67

Resultados combinados

Os resultados combinados dos experimentos de micro 5 arranjo descritos acima definiram membros de uma família de genes P450 proximamente relacionados, daqui em diante referida como a família 3D_C12, a serem os melhores candidatos para desempenhar um papel direto na conversão metabólica de nicotina para nornicotina em plantas de tabaco conversoras. Os resultados de hibridização dos membros dessa família P450 em cada um dos três experimentos de micro arranjo são apresentados na Tabela 1. Os resultados dos micro arranjos foram independentemente confirmados usando testes de Northern blotting. Como 15 mostrado na Figura 2, um sinal de aproximadamente 2-dobras maior foi observado em folhas conversoras curadas em senescência comparado a suas opostas não conversoras quando blots de RNA foram incubados com uma sonda de hibridização

7D A06 radío-rotulada.

Exemplo 4: Análise de Seqüência da Família de Genes 3D

118/136

C12

Uma vez que os experimentos de micro arranjo definiram 3D_C12 e 7D_A06 como sendo potencialmente envolvidas no processo de conversão, obter informações de seqüências de DNA completas para esses genes se tornou a próxima etapa em sua caracterização. Os clones originais 3D_C12 e 7D_A06 que foram seqüenciados quando gerando a base de dados EST aqui descrita em outra parte (e apontados nos micro arranjos) não DNAs c de comprimento total. Para obter uma seqüência de comprimento total, primers foram gerados correspondendo a regiões da região 3’ flanqueando e no interior das regiões codificadoras que foram suficientemente polimórficas para distinguir entre 7D_A06 e 3D__C12. Esses primers gene-específicos foram usados em combinação com primers específicos ao sítio de clonagem de pBluescript II para amplificar DNAs c da biblioteca de DNAc conversor em uma tentativa de obter a seqüência que incluiría as extremidades 5' completas de 3D _ C12 e quadros de leitura

7D A06.

Essa estratégia leva à determinação da seqüência de DNA correspondente às regiões codificadoras completas de 3D_C12 (nt 1-1551 de SEQ ID NO:1; seqüência de aminoácidos prevista mostradas em SEQ ID NO:2) e 7D_A06 (nt 1-1554 de

119/136

SEQ ID NO: 7; seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:8) (Figuras 3A-3G e 4). Análises de GAP dos DNAs 3D_C12 e 7D_A06 e seqüências de proteína previstas mostraram que elas compartilham 93,4% de identidade de seqüência de DNA e

92,3% de identidade no nível de proteína (Tabelas 2 e 3).

Análise BLASTX inicial contra a base de dados não redundantes de GenBank revelou que 3D_C12 e 7D A06 compartilham a maior homologia de seqüência a CYP82E1, um gene P4 50 de tabaco de função desconhecida que é regulado positivamente em resposta a extratores fúngicos (Takemoto et al. (1999). Plant Cell Physiol. 40:1232-1242). A proteína CYP82E1 é 66,9% e 67,5% identical às seqüências de aminoácidos previstas de 3D_C12 (SEQ ID NO:2) e 7D_A06 (SEQ ID NO:8), respectivamente, e a seqüência de DNA CYP82E1 é

72,1% e 73,5% idêntica às respectivas seqüências codificadoras para 3D_C12 (nt 1-1551 de SEQ ID NO:1) e 7D_A06 (nt 1-1554 de SEQ ID NO:7).

Tabela 2. Identidades de seqüência de nucleotídeos entre membros da família de genes 3D_C12.
	3D_C12	7D_A06	3DC12-7	3D_C12-10	3D C12-15*
7D A06	93,4**
3D-C12-7	93,7	94,0
3D-C12-10	93,7	94,4	99,7
3D-C12- 15*	95,5	92,6	93,1	92,8

120/136

131A_A02*	98, 0	94,0	93,4	93,1	93, 1
*seqüências parciais
“números indicam porcentagens

Tabela 3. Identidade de seqüência de aminoácidos previstas entre membros de comprimento total da família de genes 3D__C12.
	3D C12	7D_A06	3D C12-7
7D_A06	92,3*
3D-C12-7	92,8	94,8
3D-C12-10	92,5	94,4	99, 6
**números indicam porcentagens

Além de permitir a aquisição informações de comprimento de seqüência para os DNAs c 3D_C12 e 7D_A06, as amplificações de PCR acima descritas permitiram produtos adicionais que foram proximamente relacionados a, ainda claramente distintos de, as seqüências de DNAc3D_C12 e 7D_A06. Usando um primer direcionado contra uma seqüência interior ao DNAc 3D_C12, em combinação com um primer específico para pBluescript II, uma seqüência única designada 3D_C12-15 (Figura 3A-3G; SEQ ID NO:9; seqüência de aminoácidos prevista mostrada em SEQ ID NO:10) foi amplificada além do produto 3D_C12 esperado. 3D_C12-15 é 95,5% idêntica à seqüência de DNA correspondente de 3D C12 e 92,6% idêntica à mesma região de 7D_A06 (Tabela 2).

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Como o fragmento de 3D_C12-15 representou um membro distinto adicional da família de genes 3D C12, uma tentativa foi feita para obter uma seqüência de DNAc de comprimento total desse gene. Um primer de PCR específico para os primeiros sete códons do quadro de leitura de 3D_C12-15 foi usado em combinação com um primer específico para pBluescript II em uma reação de amplificação usando nossa biblioteca de DNAc conversor como modelo. A análise de seqüência de diversos produtos de amplificação independentes falhou em revelar um gene 3D_C12-15 de comprimento total. Ao invés, um novo membro dessa família foi recuperado, designado 3D_C12-7 (Figura 3A-3G; seqüência codificadora relatada como nt 1-1551 de SEQ ID NO:5).

Através da seqüência de nucleotídeos de comprimento- total mostrada em SEQ ID NO:5, 3D_C12-7 compartilha 93,7% de identidade de seqüência de nucleotídeos com 3D_C12 (através de SEQ ID NO:1), 94,0% de identidade de seqüência de nucleotídeos com 7D_A06 (através de SEQ ID NO:7), e 93,1% de identidade pela região correspondente do fragmento 3D_C12-15 (SEQ ID NO:9) (Tabela 2). A seqüência de aminoácidos prevista de 3D_C12-7 (SEQ ID NO:6) é 92,8% idêntica à proteína 3D_C12 (SEQ ID N0:2), e 94,8% idêntica à proteína 7D_A06 (SEQ ID N0:8) (Tabela 3).

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Á1P

Dois membros adicionais da família 3D_C12 também foram identificados. Um gene designado 3D_C12-1O (Figura 3A-3G; seqüência codificadora relatada como nt 1-1551 de SEQ ID NO:3; seqüência de aminoácidos prevista relatada em SEQ ID NO:4) foi recuperado a partir de uma reação de amplificação usando um primer de PCR complementar a uma seqüência na região 3' flanqueando 3D_C12 junto com um primer específico de Bluescript II (e a biblioteca conversora como modelo). 3D_C 12-10 difere em apenas cinco posições de nucleotídeos da seqüência de nucleotídeos 3D_C12-7 (SEQ ID NO:5) (Figura 3A-3G), e a apenas duas posições de aminoácidos do produto de proteína 3D_C12-7 previsto (SEQ ID NO:6) (Figura 4).

Com o término da base de dados de EST não conversoras, outro membro da família de genes 3D_C12 foi revelado. Uma seqüência de DNA parcial de 131A _A02 (SEQ ID NO: 11; seqüência de aminoácidos prevista relatada em SEQ ID NO: 12), que é encontrada nessa base de dados, é 98,0% idêntica à seqüência correspondente de 3D_C12, e 94,0% idêntica à mesma região de 7D_A06 (Figura 3A-3G e Tabela

2) . Como descrito na seção anterior, 131A A02 é um membro da família de genes 3D_C12 que foi representado no chip de unigene compreensivo usado em testes de micro arranjo, como descrito aqui em outra parte.

123/136

Exemplo 5: Análise de Planta Transgênica de Membros da

Família de Genes 3D C12

Para determinar se membros da família 3D_C12 de genes de citocromo P450 estão envolvidos na conversão metabólica de nicotina para nornicotina, plantas transgênicas foram geradas usando construtos projetados tanto para intensificar como inibir a expressão gênica. Para testar os efeitos da regulação negativa de atividade gênica, uma estratégia de interferência de RNA (RNAi) foi empregada. Uma região de 99 pb de 3D_C12 localizada imediatamente acima do códon de parada (Figura 3A-3G), foi usada para criar um construto que formariam um hairpin de dsRNA na célula vegetal. Tais estruturas de dsRNA são conhecidas por ativar um complexo de silenciamento de RNAi que leva à degradação de ambos RNAs de transgene e RNAs endógenos que são idênticos ou altamente homólogos à seqüência encontrada no dsRNA (Wesley et al. (2001) Plant J. 27: 581-590;

Waterhouse & Helliwell (2002) Nat. Gen. Rev. 4: 29-38).

Dado que cada membro da 3 D C12, caracterizado como aqui descrito, compartilha mais de 90% de identidade de seqüência de, um construto de RNAi sintetizado contra um membro foi esperado por silenciar toda a família de genes. Especificamente, o construto de RNAi gerado contra a

124/136

seqüência 3D_C 12 compartilha identidades de seqüência de 90/99 e 91/99 com os DNAs c de 7D A06 e 3D _C12-7, respectivamente, por essa região (Figura 3A-3G). O construto 3D_C12/RNAi foi cionado abaixo do promotor constitutivo 35S de vírus de mosaico de couve-flor (CaMV) e introduzido na linha de tabaco Burley DH 98-325-6 forte conversora usando transformação mediada por Agrobacterium.

Uma marca de autenticidade de silenciamento mediado por

RNAi é a redução marcada na acumulação de transcrito do gene cuja atividade foi regulada negativamente. Para confirmar que o silenciamento de genes da família de genes 3D_C12 tinha ocorrido nas plantas apresentando fenótipos de baixa nornicotina, uma análise de Northern blot foi conduzida usando RNAs isolados de três das plantas transgênicas possuindo construtos 3D_C12/RNAi e apresentando fenótipos de baixa nornicotina, dois indivíduos transformados com o construto 3D_Cl2/RNAi ainda apresentando altos níveis de nornicotina, e uma das plantas controle de vetor apenas.

Para avaliar os efeitos de sobre-expressão de atividade gênica, os DNAs c do três membros da família de genes 3D _C12 para qual nós obtivemos primeiro informações de seqüência de comprimento total (3D_C12, 7D_A06, e

3D_C12-7) foram clonados em suas orientações senso abaixo

125/136 do promotor 35S CaMV. Esses construtos foram subsequentemente introduzido em um cultivar de N. tabacuia

Petite Havana usando transformação mediada por

Agrobacterium. A linha Petite Havana é comumente usada por pesquisadores por causa de sua baixa estatura e tempo de geração abreviado em relação a cultivares de tabaco comerciais. O status conversor/não conversor do cultivar

Petite Havana é desconhecido, mas os testes de alcalóide da presente aplicação claramente mostraram que as plantas em nossa posse foram conversoras fortes.

Apesar de que as plantas hospedeiras nesses experimentos foram conversoras, a presente estratégia foi conduzir testes de alcalóide em tecido verde não curado, onde um mínimo de nornicotina se acumula em plantas conversoras e não conversoras e similares (e o promotor 35S

CaMV é muito ativo). Na verdade, uma linha não conversora foi propositadamente escolhida porque o cultivo de tecido, como requerido quando conduzindo transformação mediada por Agrobacterium, é conhecido por intensificar a freqüência de conversão genética e, assim, complicaria, potencialmente, a interpretação de resultados (e.g., avaliar de um novo fenótipo foi unicamente atribuível ao transgene, ao contrário de ser o resultado da planta ter passado por conversão genética).

126/136

Resultados

Dado o alto grau de variabilidade tipicamente 5 observada entre plantas transgênicas independentes transformadas com o mesmo construto transgene, 10 indivíduos independentemente transformados foram selecionados para se avaliar os efeitos do construto 3D C12/RNAÍ na conversão metabólica de nicotina para nornicotina. Folhas de cada um dos indivíduos 10 3D __Cl2/RNAi, além de duas plantas controle transformadas com o vetor pBT121 apenas, foram tratadas com etefon e curadas por sete dias. A análise de alcalóide desses materiais é apresentada na Tabela 4.

Tabela 4. Análise de alcalóide de plantas DH 98-325-6 independentemente transformadas com o construto 3D_C12/RNAi (e controle de vetor pBI121), As folhas foram tratadas com etefon e curadas por sete dias.
Amostra	% Nicotina *	% Nornicotin a*	% Anabasina *	% Anatabina *	% Conversão**
3D C12 RNAi (11	3,149	0,100	0,012	0,159	2,8
3D C12 RNAi (2)	2,569	0, 193	0,009	0, 110	7,0
3D C12 RNAi (3)	2,175	0,064	0, 007	0,080	2,9
3D C12 RNAi Í41	3, 517	0, 125	0,012	0, 139	3,4
3D C12 RNAi (5)	1,085	0,868	0, 009	0,119	44,4
3D C12 RNAi (6)	0, 025	2,260	0,011	0, 122	98,9
3D C12 RNAi (71	0,027	1,867	0,011	0, 122	98,6
3D C12 RNAi (8)	2,268	0, 128	0, 009	0,102	5, 3
3D C12 RNAi W	2, 197	0,133	0,008	0, 099	5,7

127/136

3D C12 RNAi (10)	2,434	0,112	0, 009	0,110	4,4

Controle vetor Í3)	1,811	1,1735	0,018	0, 170	48, 9
Controle vetor íll)	0,290	2, 090	0, 013	0,143	87, 8

*porcentagem de peso seco de folha
**[% nornicotina/ {% nicotina + nornicotina)] X 100

Típico da linha DH 98-325-6, o tratamento com etefon e a cura resultaram em substancial produção de nornicotina nas duas plantas controle {48,9% e 87,8% de conversão de 5 nicotina para nornicotina). Em um contraste dramático, sete das dez plantas transgênicas independentes possuindo o construto 3D_C12/RNAi apresentaram mínima conversão de nicotina para nornicotina, com porcentagens de conversão variando de 2,8 a 7,0 por cento. As outras três linhas 10 3D_C12/RNAi apresentaram conteúdos de alcalóide similares às plantas controle de vetor apenas. Concentrações dos alcalóides menores anabasina e anatabina não pareceram ser significantemente influenciadas pela presença ou ausência do transgene 3D_C12/RNAi (Tabela 4).

Apesar de que a inserção de DNAc do gene 3D_C12-7 foi usada como a sonda de hibridização específica, nas condições de hibridização e lavagem usadas nesse experimento, hibridização cruzada a toda família de genes

128/136

3DS12 seria esperado. Como mostrado na Figura 5, um forte sinal de hibridização foi detectado em cada planta apresentando um fenótipo de alta nornicotina, e mínima hibridização foi detectada nas plantas transformadas com o construto 3D C12/RNAÍ que apresentou um fenótipo de baixa nornicotina. Nós, assim, concluímos que o silenciamento efetivo da família de genes 3D C12 inibe a conversão metabólica de nicotina para nornicotina em tabaco.

A análise de alcalóide de plantas transgênicas Petite

Havana é mostrada na Tabela 5. Quatro plantas independentemente transformadas contendo os construtos 35S:3D_C12 e 35S:3D_C127 foram testadas junto com sete indivíduos de 35S:7D_A06 independentes e três plantas independentemente transformadas com o vetor pBI121 controle. Como esperado, as folhas verdes não curadas das três plantas controle de vetor apenas continham mínimas quantidades de nornicotina. Da mesma forma, todas plantas transformadas com os construtos 35S:3D_C12 e 35S:7D A06 apresentara mínima conversão metabólica de nicotina para nornicotina. Um fenótipo muito diferente, contudo, foi observado com plantas transformadas com 35S:3D_C12-7. Todas quarto plantas independentemente transformadas com esses construto continha nornicotina como o alcalóide predominante na folha verde não tratada; porcentagens de

129/136 conversão de nicotina para nornicotina variaram de 94,6 a

98,6.

Tabela 5. Análise de alcalóide de plantas Petite Havana individuais transformadas com construtos 3D_C12, 3D C12-7, 7D A06 ou o controle vetor pB1121. Folhas verdes foram colhidas e analisadas sem tratamento ou cura.
Amostra	% Nicotin a*	% Nornicot ina*	% Anabasina*	% Anatabina *	% Conversão**
Controle vetor (2)	0,673	0,018	0,006	0,018	2,6
Controle vetor (8)	0, 605	0,014	0,005	0,016	2,3
Controle vetor (10)	0, 694	0,017	0,004	0, 018	2,4
35S:3D_C12 (1)	0,706	0, 005	0,006	0,020	0,7
35S:3D_C12 (2)	0,814	0,022	0,007	0, 017	2,6
35S:3D_C12 (3)	0, 630	0,010	0,003	0, 012	1,6
35S:3D_C12 (4)	0,647	0,010	0,004	0,011	1,5
35S:3D C12-7 (D	0,005	0,347	0,002	0, 012	98,6
35S:3D C12-7 (2)	0,006	0,255	0,002	0,009	97,4
35S:3D C12-7 (3)	0,017	0,300	0,002	0, 010	94,6
35S:3D C12-7 (4)	0,010	0,384	0,002	0,015	97,5
35S:7D_A06 (1)	0,761	0, 011	0,005	0, 018	1,4
35S:7D_A06 (2)	0,507	0,009	0,003	0,007	1,7
35S:7D_A06 (4)	0, 653	0,015	0,006	0, 015	2,2
35S:7D_A06 (5)	0,643	0,013	0,004	0,018	2,0
35S:7D_A06 (6)	0,521	0,007	0,004	0, 014	1,3
35S:7D_A06 (7)	0,716	0,015	0, 005	0, 020	2,1
35S:7D_A06 (8)	0,701	0,027	0,004	0, 018	3,7

*porcentagem de peso de folha seca
** [ % nornicotina/ {% nicotina + nornicotina}] X 100

130/136

Wò

Exemplo 6: Co-supressão da Família de Genes 3D C12

Além da conclusão importante de que o gene 3D_C12-7 foi capaz de mediar a conversão de nicotina para nornicotina, uma observação adicional apareceu nas análises de alcalóide das plantas transgênicas Petite Havana. Os resultados de alcalóides reportados na Tabela 5 juntos com os testes de alcalóide adicionais conduzidos independentemente (dados não apresentados) apresentaram, consistentemente, uma das plantas transformadas com o construto 35S:3D C12 (35S:3D C12(l)) como tendo menos nornicotina na folha verde não tratada do que qualquer outra planta nesse estudo. Isso pode ser o resultado de cosupressão da família de genes 3D_C12 nessa planta específica, um fenômeno frequentemente observado em plantas transgênicas, mesmo quando um transgene é expressado em sua orientação senso (Fagard and Vaucheret (2000) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51: 167-194).

Se a planta 35S:3D_C12 (1) estava verdadeiramente apresentando um fenótipo de co-supressão, esse fenótipo seria esperado por ser mantido mesmo no tratamento com etefon e cura das folhas, similar aos fenótipos de baixa nornicotina conferidos pelo construto 3D C12/RNAÍ no genótipo DH 98-325-6 conversor, como descrito acima. Para

131/136 testar essa previsão, perfis de alcalóides foram determinados em folhas curadas tratadas com etefon de

35S:3D_C12 (1) e duas plantas controle de vetor apenas.

Como mostrado na Tabela 6, o tratamento com etefon e a cura resultaram em mais de 97% de conversão de nicotina para nornicotina nas duas plantas controle, enquanto folhas 35S:3D_C12 (1) similarmente tratadas apresentaram conversão insignificante (0,6%). Folhas de outras plantas expressando tanto transgenes 35S:3D_C12 e

35S:7D A06 foram também sujeitas a tratamento com etefon e cura. Em cada caso, um fenótipo de alta nornicotina foi observado, similar às plantas controle de vetor apenas (dados não apresentados) .

Table 6. Análise de alcalóide de plantas controle de vetor 355:3D_C12 (I) e pBI121. As folhas foram tratadas com etefon e curadas por sete dias.
Amostra	% Nicotina *	% Nornicotin a*	% Anabasina *	% Anatabina*	% Conversão**
Controle vetor (8)	0,009	0, 425	n.d.	0,011	97, 9
Controle vetor (10)	0,008	0,560	n.d.	0,025	98, 6
35S:3D_C12 (1)	1,185	0,007	n. d.	0,020	0, 6

*porcentagem de peso de folha seca
**[% nornicotina/ (% nicotina + nornicotina)1 X 100
n.d., não detectada

Por fim, testes de Northern blot foram conduzidos em plantas selecionadas representando cada dos genótipos

132/136 transgênicos Petite Havana (Figura 6) . Usando um DNAc de 3D_Cl2-7 como uma sonda de hibridização, um sinal mínimo foi detectado com RNAs isolados de folhas verdes não tratadas de planta controle de vetor apenas. Em contraste, a hibridização foi facilmente detectada em amostras de

RNA de todas as quatro plantas transgênicas independentes possuindo o construto 35S:3D_Cl2-7. Um forte sinal de hibridização foi similarmente observado usando RNAs de todas outras plantas transgênicas testadas que foram transformadas com os construtos 35S:3D_C12 e 35S:7D_A06, com a exceção da planta 35S:3D_C12 (1) contendo baixa nornicotina.

Os resultados gerais de testes Northern blotting 15 apresentam que o promotor 35S CaMV foi geralmente efetivo em mediar um alto nível de expressão gênica para cada dos três membros da família de genes 3D_C12 testados nesse estudo. A falha para detectar um sinal de hibridização na planta 35S:3D_C12 (1) é consistente com a interpretação de que a família de genes 3D_C12 foi silenciada via cosupressão nesse indivíduo.

Conclusões Gerais

As análises delineadas nos Exemplos 1-6 acima

133/136

resultaram na descoberta de uma família da genes P450 proximamente relacionada, designada família 3D_C12, cujos níveis coletivos de transcrito foram significativamente elevados em plantas de tabaco conversoras que estavam ativamente metabolizando nicotina para nornicotina, em comparação a suas opostas não conversoras. A análise de planta transgênica demonstrou que a supressão de expressão gênica dessa família P450 em linhas de tabaco conversoras inibiram o metabolismo de nicotina para nornicotina a níveis similares aos observados em plantas não conversoras.

Adicionalmente, a expressão senso de diversos indivíduos dessa família de genes proximamente relacionada identificou um membro, designado 3D_C 12-7, desempenhando um papel direto na conversão metabólica de nicotina para nornicotina. A sobre-expressão de 3D C12-7 usando um promotor constitutivo forte causou um aumento dramático na produção de nornicotina e acumulação em folhas verdes não curadas de plantas de tabaco transgênicas, um tecido onde a nicotina é normalmente o alcalóide predominante em plantas conversoras e não conversoras. Dado que o membro da família de citocromo P450 designado 3D_C12-1O difere-se de 3D_C12-7 em apenas dois resíduos de aminoácidos seguindo, imediatamente, a metionina de início e na seqüência sinal

N-terminal, é previsto que esses produtos codificados funcionam identicamente.

134/136 contraste em fenótipos de alcalóide entre a planta 35S:3D_C12 (1) e plantas controle de vetor apenas foi mais dramático em folhas que tinham sido tratadas com etefon e curadas (0,6% de conversão versus >97% de conversão; Tabela

6). Contudo, é passível de nota que o conteúdo de nornicotina da planta 35S:3D_C12 (1) co-suprimida foi reduzido até em folhas verdes não tratadas onde o fenótipo de alta nornicotina é tipicamente não manifesto em linhas de tabaco conversoras ou não conversoras. As folhas verdes não tratadas de linha 35S:3D_C12 (1) apresentaram apenas

0,7% de conversão de nicotina para nornicotina, enquanto toda outra planta nesse experimento apresentou porcentagens de conversão variando de 1,3 a 3,7 (Tabela 5). Esse resultado sugere que a inibição de expressão gênica da família 3D_C12 pode provar ser efetiva em diminuir, adicionalmente, os níveis de nornicotina, mesmo em linhas de tabaco onde a conversão genética não é tipicamente um problema importante (tais como tabacos curados em estufas com controle de umidade, temperatura e circulação de ar) ou nos indivíduos não conversores em linhas que são propensas a conversão genética (tais como tabacos Burley) .

Testes de Southern blotting usando membros da família de genes 3D_C12 como sondas de hibridização resultam em

135/136

padrões de banda muito complexos, sugerindo que mais membros dessa família de genes possam existir, mesmo além daqueles que foram aqui identificados e caracterizados (dados não mostrados). A hipótese de que a família de genes

3D_C12 é compreendida de membros adicionais é ainda suportadas pela recente publicação de 75 DNAs c P450 de comprimento total de tabaco de função desconhecida (U.S. Patent Application Publication 20040162420). Nessa lista de P450s são DNAs c adicionais que seriam, baseado no trabalho aqui descrito, colocados na família 3D_C12, em vista de seu exposição de 90% de identidade de seqüência de aminoácidos às seqüêncías de proteínas mostradas na Figura 4.

Com respeito à função molecular específica do gene

3D_Cl2-7 ou o membro quase idêntico 3D_C12-10 da família, é possível que este codifique a própria enzima nicotina demetilase que catalisa a N-demetilação oxidativa de nicotina para nornicotina (Figura 1) . Alternativamente, a enzima 3D_C12-7 codificada ou enzima codificada quase idêntica 3D_C12-10 pode produzir um produto que leve à regulação positiva da atividade de nicotina demetilase da folha, ao contrário de catalisar diretamente a reação de Ndemetilação.

Todas publicações e aplicações de patentes mencionadas

136/136

na especificação são indicativas do nível daqueles especialistas na arte a qual a invenção pertence. Todas publicações e aplicações de patentes são aqui incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação e aplicação de patentes individual fosse especificamente e individualmente indicadas a serem incorporadas por referência.

Apesar da invenção precedente ser descrita em algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para propósitos de claridade de entendimento, será óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas no escopo das reivindicações no apêndice.

1/7

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.

Método para redução do nível de nornicotina ou N'nitrosonornicotina em uma planta do gênero Nicotiana ou parte desta, caracterizado por compreender a inibição da expressão ou função de um citocromo P450 pela introdução na dita planta ou parte desta de um cassete de expressão compreendendo uma sequência inibidora do citocromo P450 operacionalmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula vegetal, em que dita sequência inibidora é selecionada do grupo consistindo de:

a) uma sequência codificante definida em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 ou 11;

b) uma sequência nucleotídica definida em SEQ ID NO: 13, 14, 15 ou 16.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência inibidora é capaz de ser transcrita como um polinucleotídeo inibidor selecionado do grupo consistindo de um polinucleotídeo de RNA fita simples, um polinucleotídeo de RNA fita dupla, e uma combinação destes.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é selecionado do grupo consistindo de um promotor constitutivo, um promotor induzível, ou um promotor tecido-específico.

Petição 870170063273, de 28/08/2017, pág. 11/21

2/7
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor específico para folha.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido cassete de expressão está incorporado em um vetor.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a referida planta é selecionada do grupo consistindo de Nicotiana acuminata multiflora, Nicotiana alata grandiflora, Nicotiana bigelovii quadrivalvis, Nicotiana bigelovii wallacei, obtusi folia obtusifolia, Nicotiana

Nicotiana quadrivalvis bigelovii, quadrivalvis, Nicotiana quadrivalvis wallacei e Nicotiana trigonophylla palmeri.

Nicotiana palmeri, obtusi folia

Nicotiana quadrivalvis

Ί. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o referido citocromo P450 é um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo de:

uma sequência de aminoácido definida em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8,

10 ou 12.

8. Método para a redução do nível de nornicoina ou N'nitrosonornicotina em um produto de tabaco, caracterizado por compreender as etapas:

Petição 870170063273, de 28/08/2017, pág. 12/21

3/7

a) uma planta de Nicotiana ou parte desta geneticamente modificada para inibir a expressão ou função de um citocromo P450 pela introdução de um cassete de expressão compreendendo uma sequência inibidora do citocromo P450 operacionalmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula vegetal na dita planta de Nicotiana ou parte desta, em que a sequência inibidora é selecionada a partir do grupo consistindo de:

i) uma sequência codificante definida em SEQ ID NO:

1, 3, 5, 7, 9 ou 11;

ii) uma sequência nucleotídica definida em SEQ ID NO:

13, 14, 15 ou 16; e

b) preparação do dito produto de tabaco a partir da planta Nicotiana ou parte dela.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida sequência inibidora é capaz de ser transcrita como um polinucleotídeo inibidor selecionado do grupo consistindo de um polinucleotídeo de RNA fita simples, um polinucleotídeo de RNA fita dupla, e uma combinação destes.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é selecionado do grupo consistindo de um promotor constitutivo, um promotor induzível, ou um promotor tecido-específico.

Petição 870170063273, de 28/08/2017, pág. 13/21

4/Ί

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a

10, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor específico para folha.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a

11, caracterizado pelo fato de que o referido cassete de expressão é incorporado em um vetor.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a

12, caracterizado pelo fato de que o referido produto de tabaco é selecionado a partir do grupo consistindo de tabaco mastigável, rapé, cigarros, tabaco para cachimbo e charutos.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a

13, caracterizado pelo fato de que a referida planta de tabaco é da variedade Burley.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a

14, caracterizado pelo fato de que referido citocromo P450 é um polipeptídeo compreendendo uma sequêcia de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo de:

uma sequência de aminoácido do grupo SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ou 12 .

16. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo heterólogo isolado, operacionalmente ligado a um promotor que é funcional em uma célula vegetal, em que referido polunicleotídeo heterólogo

Petição 870170063273, de 28/08/2017, pág. 14/21

5/7 isolado compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo de:

a) a sequência codificante definida em SEQ ID NO: 1,
7, 9 ou 11;

b) uma sequência de nucleotídeo definida em SEQ ID

NO: 13, 14, 15, 16 ou 24.

17. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido cassete está incorporado em um vetor.

18. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é selecionado a partir do grupo consistindo de um promotor constitutivo, um promotor induzível e um promotor tecidoespecífico.

19. Método para a produção de uma planta do gênero Nicotiana com níveis reduzidos de nornicotina ou Ν'-nitrosonornicotina pela inibição da expressão ou função de um citocromo P450, caracterizado por dito método compreender as etapas:

a) introduzir em uma célula de planta Nicotiana um cassete de expressão compreendendo uma sequência inibidora do citocromo P450 operacionalmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula de planta, em que dita

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Ç>/1 sequência inibidora é selecionada do grupo consistindo de:

i) a sequência codificadora definida em SEQ ID NO: 1,

3, 5, 7, 9,ou 11;

ii) uma sequência de nucleotídeo definida em SEQ ID

NO: 13, 14, 15, ou 16;

b) cultivar a célula da planta Nicotiana sob condições de crescimento; e

c) regenerar a planta Nicotiana com reduzidos níveis de nornicotina ou N '-nitrosonornicotina da dita célula de planta Nicotiana.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a referida célula de planta é selecionada a partir de uma planta do grupo consistindo de Nicotiana acuminata multiflora, Nicotiana alata grandiflora, Nicotiana bigelovii guadrivalvis, Nicotiana

Nicotiana obtusifolia obtusifolia, palmeri, Nicotiana guadrivalvis guadrivalvis guadrivalvis, Nicotiana guadrivalvis wallacei e Nicotiana trigonophylla palmeri.

bigelovii wallacei,

Nicotiana obtusi folia bigelovii,

Nicotiana

21. Método de acordo com a reivindicação 19 ou reivindicação 20, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a preparação de um produto de tabaco, em que dito produto de

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7/7 tabaco mascar, é selecionado a partir do grupo consistindo de tabaco rapé, cigarro, tabaco de cachimbo e charutos.

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