ES2532112T3 - EPSPS mutantes - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de producción de una planta no transgénica, resistente o tolerante a herbicida que comprende: introducir en células vegetales una oligonucleobase recombinagénica con una mutación dirigida en el gen EPSPS para producir células vegetales con un gen de EPSPS mutante que exprese una proteína EPSPS que esté mutada en las posiciones de aminoácidos Thr179 y Pro183 en una proteína EPSPS de Arabidopsis (AF360224) o en un resto de aminoácido análogo en una proteína EPSPS de otra especie en la que Thr179 es cambiado a Ile y Pro183 es cambiado a Ala; seleccionar una célula vegetal que muestre una tolerancia mejorada al glifosato en comparación con una célula vegetal de tipo silvestre correspondiente; y regenerar una planta no transgénica resistente o tolerante a herbicida que tenga un gen de EPSPS mutado de dicha célula vegetal seleccionada.
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La invención puede ponerse en práctica con oligonucleobases recombinagénicas que tienen las conformaciones y químicas descritas en las patentes Kmiec I y Kmiec II. Kmiec I enseña un procedimiento para introducir alteraciones genéticas específicas en un gen diana. Las oligonucleobases recombinagénicas en Kmiec I y/o Kmiec II contienen dos hebras complementarias, una de las cuales contiene al menos un segmento de nucleótidos de tipo ARN (un "segmento de ARN") que está emparejado por bases a nucleótidos de tipo ADN de la otra hebra.
Kmiec II desvela que los no nucleótidos que contienen bases de purina y pirimidina pueden sustituirse por nucleótidos. Las Patentes de los Estados Unidos Nº 5.756.325; 5.871.984; 5.760.012; 5.888.983; 5.795.972; 5.780.296; 5.945.339; 6.004.804; y 6.010.907 y la Patente Internacional Nº PCT/US00/23457; y las Publicaciones Internacionales de Patente Nº WO 98/49350; WO 99/07865, WO 99/58723, WO 99/58702, WO 99/40789, US 6.870.075; y la Solicitud de Patente Publicada de los Estados Unidos 20030084473 desvelan moléculas recombinagénicas adicionales que pueden usarse para la presente invención. La expresión "oligonucleobase recombinagénica" se usa en el presente documento para indicar las moléculas que pueden usarse en los procedimientos de la presente invención e incluyen oligonucleótidos en doble hélice mixtos, moléculas que contienen no nucleótidos enseñadas en Kmiec II, oligodesoxinucleótidos monocatenarios y otras moléculas recombinagénicas enseñadas en las patentes y publicaciones de patentes anteriormente mencionadas.
En una realización, la oligonucleobase recombinagénica es un oligonucleótido de doble hélice mixto en el que los nucleótidos de tipo ARN del oligonucleótido de doble hélice mixto se hacen resistentes a RNasa reemplazando el 2'-hidroxilo con una funcionalidad fluoro, cloro o bromo o poniendo un sustituyente en el 2'-O. Los sustituyentes adecuados incluyen los sustituyentes enseñados por Kmiec II. Los sustituyentes alternativos incluyen los sustituyentes enseñados por la Patente de los Estados Unidos Nº 5.334.711 (Sproat) y los sustituyentes enseñados por las Publicaciones de Patente EP 629 387 y EP 679 657 (de manera colectiva, las Solicitudes Martin). Como se usa en el presente documento, un derivado 2'-fluoro, cloro o bromo de un ribonucleótido o un ribonucleótido que tiene un sustituyente 2'-OH con un sustituyente descrito en las Solicitudes Martin o Sproat se denomina "Ribonucleótido 2'-sustituido". Tal como se usa en el presente documento, la expresión "nucleótido de tipo ARN" significa un nucleótido 2'-hidroxilo o 2'-sustituido que está enlazado a otros nucleótidos de un oligonucleótido de doble hélice mixto por un enlace fosfodiéster no sustituido o cualquiera de los enlaces no naturales enseñados por Kmiec I o Kmiec II. Tal como se usa en el presente documento, la expresión nucleótido de tipo desoxirribo" significa un nucleótido que tiene un 2'-H, que puede enlazarse a otros nucleótidos de un MDON mediante un enlace fosfodiéster no sustituido o cualquiera de los enlaces no naturales enseñados por Kmiec I o Kmiec II.
En una realización de la presente invención, la oligonucleobase recombinagénica es un oligonucleótido de doble hélice mixto que está enlazado únicamente por enlaces fosfodiéster no sustituidos. En realizaciones alternativas, el enlace es mediante fosfodiésteres sustituidos, derivados fosfodiéster y enlaces no basados en fósforo tal como se enseña por Kmiec II. En otra realización más, cada molécula de tipo ARN en el oligonucleótido de doble hélice mixto es un nucleótido 2'-sustituido. Las realizaciones particularmente preferidas de ribonucleótidos 2'-sustituidos son ribonucleótidos sustituidos con 2'-fluoro, 2'-metoxi, 2'-propiloxi, 2'-aliloxi, 2'-hidroxiletiloxi, 2'-metoxietiloxi, 2'-fluoropropiloxi y 2'-trifluoropropiloxi. Las realizaciones más preferidas de ribonucleótidos 2'-sustituidos son nucleótidos sustituidos en 2'-fluoro, 2'-metoxi, 2'-metoxietiloxi, y 2'-aliloxi. En otra realización, el oligonucleótido de doble hélice mezclado se enlaza mediante enlaces fosfodiéster no sustituidos.
Aunque se sintetizan de manera más conveniente los oligonucleótidos de doble hélice mixto que tienen un solo tipo de nucleótido de tipo ARN 2'-sustituido, los procedimientos de la invención pueden ponerse en práctica con oligonucleótidos de doble hélice que tienen dos o más tipos de nucleótidos de tipo ARN. La función de un segmento de ARN puede no verse afectada por una interrupción causada por la introducción de un desoxinucleótido entre dos trinucleótidos de tipo ARN, por consiguiente, la expresión segmento de ARN abarca dicho "segmento de ARN interrumpido". Un segmento de ARN no interrumpido se cita como un segmento de ARN contiguo. En una realización alternativa, un segmento de ARN puede contener nucleótidos resistentes a RNasa y 2'-OH no sustituidos alternos. Los oligonucleótidos de doble hélice mixtos tienen preferentemente menos de 100 nucleótidos y más preferentemente menos de 85 nucleótidos, pero más de 50 nucleótidos. La primera y la segunda hebra están emparejadas por emparejamiento de bases de Watson-Crick. En una realización, las hebras del oligonucleótido de doble hélice mixtos están unidos covalentemente mediante un enlazante, tal como por un hexa, penta o tretranucleótido monocatenario de tal forma que la primera y la segunda hebra son segmentos de una sola cadena de oligonucleótido que tiene un solo extremo 3' y un solo extremo 5'. Los extremos 3' y 5' pueden protegerse mediante la adición de una "tapa en horquilla" en la que los nucleótidos 3' y 5' terminal están emparejados por emparejamiento de Watson-Crick a nucleótidos adyacentes. Una tapa en horquilla secundaria puede, además, situarse en la unión entre la primera y la segunda hebra distantes de los extremos 3' y 5', de tal forma que se estabiliza el emparejamiento de Watson-Crick entre la primera y la segunda hebra.
La primera y la segunda hebra contienen dos regiones que son homólogas a dos fragmentos del gen de EPSPS diana, es decir, tienen la misma secuencia que los genes diana. Una región homóloga contiene los nucleótidos de un segmento de ARN y pueden contener uno o más nucleótidos de tipo ADN de segmento de ADN conector y también pueden contener nucleótidos de tipo ADN que no se encuentran en el segmento de ADN interviniente. Las dos regiones de homología se separan mediante, y cada una es adyacente a, una región que tiene una secuencia que difiere de la secuencia del gen diana, citada como una "región heteróloga". La región heteróloga puede contener uno, dos o tres nucleótidos desemparejados. Los nucleótidos desemparejados pueden ser contiguos o, como alternativa,
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separarse mediante uno o dos nucleótidos que son homólogos con el gen diana. Como alternativa, la región heteróloga también puede contener una inserción de uno, dos, tres o de cinco o menos nucleótidos. Como alternativa, la secuencia del oligonucleótido de doble hélice mixto puede diferir de la secuencia del gen diana solo por la eliminación de uno, dos, tres, o cinco o menos nucleótidos del oligonucleótido de doble hélice mixto. La longitud y posición de la región heteróloga, en este caso, se considera la longitud de la eliminación, aunque ningún nucleótido del oligonucleótido de doble hélice mixto se encuentre dentro de la región heteróloga. La distancia entre los fragmentos del gen diana que son complementarios a las dos regiones homólogas es de manera idéntica la longitud de la región heteróloga cuando se pretende una sustitución o sustituciones. Cuando la región heteróloga contiene una inserción, las regiones se separan de este modo en el oligonucleótido de doble hélice mixto más allá de lo que lo están sus fragmentos homólogos complementarios en el gen, y lo contrario es aplicable cuando la región heteróloga codifica una eliminación.
Los segmentos de ARN de los oligonucleótidos de doble hélice mixtos son cada uno parte de una región homóloga, es decir, una región que es idéntica en secuencia a un fragmento del gen diana, conteniendo dichos segmentos juntos al menos 13 nucleótidos de tipo ARN y preferentemente de 16 a 25 nucleótidos de tipo ARN o aún más preferentemente 18-22 nucleótidos de tipo ARN o lo más preferentemente 20 nucleótidos. En una realización, los segmentos de ARN de las regiones de homología se separan mediante y son adyacentes a, es decir, "conectadas por" un segmento de ADN interviniente. En una realización, cada nucleótido de la región heteróloga es un nucleótido del segmento de ADN interviniente. Un segmento de ADN interviniente que contiene la región heteróloga de un oligonucleótido de doble hélice mixto se denomina un "segmento mutador".
El cambio a introducir en el gen de EPSPS diana se codifican por la región heteróloga. El cambio a introducir en el gen de EPSPS puede ser un cambio en una o en más bases de la secuencia del gen de EPSPS que cambia en el aminoácido nativo en esa posición al aminoácido deseado.
En otra realización de la presente invención, la oligonucleobase recombinagénica es un vector mutacional de oligodesoxinucleótido monocatenario o SSOMV, que se desvela en la Solicitud Internacional de Patente PCT/US00/23457. La secuencia de SSOMV se basa en los mismos principios que los vectores mutacionales descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nº 5.756.325; 5.871.984; 5.760.012; 5.888.983; 5.795.972; 5.780.296; 5.945.339; 6.004.804; y 6.010.907 y en las Publicaciones Internacionales Nº WO 98/49350; WO 99/07865, WO 99/58723, WO 99/58702, WO 99/40789, US 6.870.075; y en la Solicitud de Patente Publicada 20030084473. La secuencia del SSOMV contiene dos regiones que son homólogas con la secuencia diana separadas por una región que contiene la alteración genética deseada citada como región mutadora. La región mutadora puede tener una secuencia que tiene la misma longitud que la secuencia que separa a las regiones homólogas en la secuencia diana, pero que tiene una secuencia diferente. Dicha región mutadora causará una sustitución.
Los nucleótidos del SSOMV son desoxirribonucleótidos que están unidos mediante enlaces fosfodiéster no modificados excepto que el enlace internucleótido 3' terminal y/o 5' terminal o como alternativa, los dos enlaces internucleótido 3' terminal y/o 5' terminal pueden ser un fosforotioato o fosfoamidato. Tal como se usa en el presente documento, un enlace internucleótido es el enlace entre nucleótidos del SSOMV y no incluye el enlace entre el nucleótido 3' final o el nucleótido 5' final y un sustituyente bloqueante, véase más arriba. En una realización específica, la longitud del SSOMV es de entre 21 y 55 desoxinucleótidos y las longitudes de las regiones de homología tienen, por consiguiente, una longitud total de al menos 20 desoxinucleótidos y al menos dos regiones de homología deben tener cada una longitudes de al menos 8 desoxinucleótidos.
El SSOMV puede diseñarse para ser complementario con la hebra codificante o la no codificante del gen diana. Cuando la mutación deseada es una sustitución de una sola base, se prefiere que los dos nucleótidos mutadores sean una pirimidina. Hasta el punto en que sea coherente con lograr el resultado funcional deseado, se prefiere que tanto el nucleótido mutador como el nucleótido diana en la hebra complementaria sean pirimidinas. Se prefieren particularmente SSOMV que codifiquen mutación por transversión, es decir, un nucleótido mutador de C o T se desempareja, respectivamente, con un nucleótido C o T en la hebra complementaria.
Además del oligodesoxinucleótido, el SSOMV puede contener un sustituyente bloqueante en 5' que está unido a los carbonos 5' terminales a través de un enlazante. La química del enlazante no es crítica más allá de su longitud, pero debe ser preferentemente de 6 átomos de longitud y el enlazante debe ser flexible. Puede usarse una variedad de sustituyentes no tóxicos, tales como biotina, colesterol u otros esteroides o un colorante fluorescente catiónico no intercalante. Los reactivos vendidos como Cy3™ y Cy5™ por Glen Research, Sterling VA, se prefieren particularmente como reactivos para preparar el SSOMV, que son fosforamiditas bloqueadas que tras la incorporación en un oligonucleótido producen indomonocarbocianina sustituida con 3,3,3',3'-tetrametilo y N,N'-isopropilo y colorantes de indodicarbocianina, respectivamente. Cy3 es el más preferido. Cuando la indocarbocianina está sustituida por N-oxialquilo, puede unirse convenientemente al 5' terminal del oligodesoxinucleótido mediante un fosfodiéster con un fosfato 5' terminal. La química del enlazante colorante entre el colorante y el oligodesoxinucleótido no es crítica y se selecciona por conveniencia sintética. Cuando la fosforamidita Cy3 disponible comercialmente se usa según se indica, la modificación 5' resultante consiste en un sustituyente bloqueante y enlazante juntos que son un una indomonocarbocianina de N-hidroxipropilo, N'-fosfatidilpropilo y 3,3,3',3'-tetrametilo.
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En una realización preferida, el colorante de indocarbocianina está tetrasustituido en las posiciones 3 y 3' de los anillos de indol. Sin limitación en cuanto a la teoría, estas sustituciones evitan que el colorante sea un colorante intercalante. La identidad de los sustituyentes en estas posiciones no es críticas. El SSOMV puede además tener un sustituyente 3' bloqueante. Nuevamente, la química del sustituyente 3' bloqueante no es crítica.
En otra realización preferida, el oligonucleótido recombinagénico es un oligodesoxinucleótido monocatenario que tiene un nucleótido 3' terminal, un nucleótido 5' terminal, que tiene al menos 25 desoxinucleótidos y no más de 65 desoxinucleótidos, y que tiene una secuencia que comprende al menos dos regiones de al menos 8 desoxinucleótidos cada una que son cada una, respectivamente, idénticas a al menos dos regiones del gen cromosomal diana, teniendo dichas regiones juntas al menos 24 nucleótidos de longitud, y estando dichas regiones separadas por al menos un nucleótido en la secuencia del gen cromosomal diana o en la secuencia del oligodesoxinucleótido o ambas de tal forma que la secuencia del oligodesoxinucleótido no es idéntica a la secuencia del gen cromosomal diana. Véase la Patente de Estados Unidos 6.271.360.
Microtransportadores y microfibras
El uso de microtransportadores metálicos (microesferas) para introducir grandes fragmentos de ADN en células vegetales que tienen paredes celulares de celulosa mediante penetración de proyectiles se conoce bien por los expertos en la técnica relevante (en lo sucesivo administración biolística). Las Patentes de los Estados Unidos Nº 4.945.050; 5.100.792 y 5.204.253 describen técnicas generales para seleccionar microtransportadores y dispositivos para proyectarlos. Las Patentes de los Estados Unidos Nº 5.484.956 y 5.489.520 describen la preparación de maíz transgénico fértil usando bombardeo con microproyectiles en tejido calloso de maíz. Las técnicas biolísticas también se usan para transformar embriones de maíz inmaduros.
Las condiciones específicas para usar microtransportadores en los procedimientos de la presente invención se describen en la Publicación Internacional WO 99/07865. En una técnica ilustrativa, se añaden por orden microtransportadores enfriados en hielo (60 mg/ml), oligonucleótido en doble hélice mixto (60 mg/ml) CaCl2 2,5 M y espermidina 0,1 M, la mezcla se agita suavemente, por ejemplo, por agitación vorticial, durante 10 minutos y se deja reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, tras los cuales los microtransportadores se diluyen en 5 volúmenes de etanol, se centrifugan y se resuspenden en etanol al 100 %. Pueden obtenerse buenos resultados con una concentración en la solución adherente de 8-10 μg/μl de microtransportadores, 14-17 μg/ml de oligonucleótido de doble hélice mixto, CaCl2 1,1-1,4 M y espermidina 18-22 mM. Se observaron resultados óptimos en las condiciones de 8 μg/μl de microtransportadores, 16,5 μg/ml de oligonucleótido de doble hélice mixto, CaCl2 1,3 M y espermidina 21 mM.
Las oligonucleobases recombinagénicas también pueden introducirse en células vegetales para la práctica de la presente invención usando microfibras para penetrar la pared celular y la membrana celular. La Patente de los Estados Unidos Nº 5.302.523 de Coffee y col. describe el uso de carburo de silicio 30 veces 0,5 μm y 10 veces 0,3 μm para facilitar la transformación de cultivos de maíz en suspensión de la variedad Black Mexican Sweet. Puede usarse cualquier técnica mecánica que pueda usarse para introducir ADN para la transformación de una planta usando microfibras para administrar oligonucleobases recombinagénicas para su uso en la preparación de los presentes mutantes de EPSPS. El procedimiento desvelado por Coffee y col en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.302.523 puede emplearse con materiales de células vegetales regenerables para introducir las presentes oligonucleobases recombinagénicas para efectuar la mutación del gen EPSPS mediante el cual puede recuperarse una planta mutada completa que muestre el fenotipo resistente a glifosato.
Una técnica ilustrativa para la administración con microfibras de una oligonucleobase recombinagénica es del modo siguiente: Se suspenden microfibras estériles (2 μg) en 150 μl de medio de cultivo de plantas que contiene aproximadamente 10 mu.g de un oligonucleótido de doble hélice mixto. Se deja reposar un cultivo en suspensión y se agitan vorticialmente volúmenes iguales de células empaquetadas y de la suspensión de fibra estéril/nucleótido durante 10 minutos y se emplacan. Se aplica medio selectivo inmediatamente o con un retraso de hasta 120 horas según sea necesario para el rasgo particular.
Electroporación
En una realización alternativa, las oligonucleobases recombinagénicas pueden administrarse a la célula vegetal mediante electroporación de un protoplasto derivado de una parte de una planta de acuerdo con técnicas que son bien conocidas para un experto habitual en la técnica. Véase, por ejemplo, Gallois y col., 1996, en Methods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, N.J.; Kipp y col., 1999, en Methods in Molecular Biology 133:213-221, Humana Press, Totowa, N.J.
Las oligonucleobases recombinagénicas también pueden introducirse en microesporas mediante electroporación. Tras la liberación de la tétrada, la microespora es unicelular y de paredes estrechas. Comienza a alargarse y desarrolla un poro germinativo antes de que se forme la exina. Una microespora en este estado es potencialmente más susceptible de transformación con ADN exógeno que otras células vegetales. Además, el desarrollo de la microespora puede alterarse in vitro para producir embriones haploides o callos embriogénicos que puedan regenerarse en plantas (Coumans y col., Plant Cell Rep. 7:618-621, 1989; Datta y col., Plant Sci. 67:83-88, 1990; Maheshwari y col., Am. J Bot.
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69:865-879, 1982; Schaeffer, Adv. en Cell Culture 7:161-182, 1989; Swanson y col., Plant Cell Rep. 6:94-97, 1987). Por lo tanto, las microesporas transformadas pueden regenerarse directamente en plantas haploides o en plantas dihaploides fértiles tras la duplicación de cromosomas mediante procedimientos estándar. Véase la solicitud de los mismos autores de los Estados Unidos con número de serie 09/680.858 titulada "Compositions and Methods for Plant Genetic Modification".
La electroporación de microesporas puede ponerse en práctica con cualquier especie de planta para la que sea posible el cultivo de microesporas, incluyendo, pero sin limitación, plantas en las familias Graminae, Leguminoceae, Cruciferaceae, Solanaceac, Cucurbitaceae, Rosaccae, Poaceae, Lilaceae, Rutaceae, Vitaceae, incluyendo especies tales como maíz (Zea mays), trigo (Triticum aestivum), arroz (Oryza sativa), avena, cebada, canola(Brassica napus, Brassica rapa, Brassica oleracea, y Brassica juncea), algodón (Gossypium hirsuitum L.), varias especies leguminosas (por ejemplo, soja [Glycine max], guisante [Pisum sativum], etc.), uvas [Vitis vinifera], y un hospedador de otras plantas de cultivo importantes. La embriogénesis de microesporas, tanto desde anteras y cultivo de microesporas, se ha descrito en más de 170 especies, que pertenecen a 68 géneros y 28 familias de dicotiledóneas y monocotiledóneas (Raghavan, Embryogenesis in Agniosperms: A Developmental and Experimental Study, Cambridge University Press, Cambridge, Inglaterra, 1986; Rhagavan, Cell Differentiation 21:213-226, 1987; Raemakers y col., Euphytica 81:93-107, 1995). Para una discusión detallada del aislamiento de microesporas, su cultivo, y la regeneración de plantas dobles haploides a partir de embriones derivados de microesporas [MDE] en Brassica napus L., véase Nehlin, The Use of Rapeseed (Brassica napus L.) Microspore as a Tool for Biotechnological Applications, Tesis doctoral, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Suecia, 1999; también Nehlin y col., Plant Sci. 111:219-227, 1995, y Nehlin y col., Plant Sci. 111:219-227, 1995). La duplicación de cromosomas a partir de microesporas u otro cultivo es una técnica bien establecida para la producción de líneas de plantas homozigóticas dobles haploides en varios cultivos (Heberle-Bors y col., In vitro pollen cultures: Progress and perspectives. En: Pollen Biotechnology. Gene expression and allergen characterization, vol. 85-109, ed. Mohapatra, S. S., y Knox, R. B., Chapman y Hall, Nueva York, 1996).
Los procedimientos de electroporación de microesporas se describen en Jardinaud y col., Plant Sci. 93:177-184, 1993, y Fennell y Hauptman, Plant Cell Reports 11:567-570, 1992. Los procedimientos para la electroporación de MDON en protoplastos de plantas también pueden adaptarse para su uso en electroporación de microesporas.
Patillas y microinyección
En otra realización alternativa más, la oligonucleobase recombinagénica puede administrarse a la célula vegetal por medio de patillas o microinyección de la célula vegetal. La técnica denominada de patillas se lleva a cabo esencialmente tal como se describe en Frame y col., 1994, Plant J. 6:941-948. La oligonucleobase recombinagénica se añade a las patillas y se usa para transformar las células vegetales. La oligonucleobase recombinagénica puede incubarse conjuntamente con plásmidos que comprenden secuencias que codifican proteínas capaces de formar complejos de recombinasa en células vegetales de tal forma que la recombinación está catalizada entre el oligonucleótido y la secuencia diana en el gen de EPSPS.
Selección de plantas resistentes a glifosato
Puede ensayarse la resistencia o tolerancia de las plantas o células vegetales a un herbicida de fosfonometilglicina usando procedimientos conocidos de manera común en la técnica, por ejemplo, creciendo la planta o célula vegetal en presencia de un herbicida de fosfonometilglicina y midiendo la velocidad de crecimiento en comparación con la velocidad de crecimiento de plantas de control en ausencia de herbicida. En el caso de glifosato se usan concentraciones de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mM en el medio de selección.
Los siguientes ejemplos ilustran la práctica de la presente invención pero no deben entenderse como limitantes de su ámbito.
Ejemplo 1: Mutantes P178A en Brassica napus (colza) (No según la invención)
Se preparó el siguiente genoplasto (oligonucleobase recombinagénica) para hacer un cambio P178A en germoplasma de Brassica napus (colza):
SEC ID 1: VATGCAGGAACAGCCATGCGTTCACTTACGGCTGCAGTTACTH
en el que V es un colorante fluorescente (V=Cy3) y H es un nucleótido reverso o base reversa (H=3’DMTdCCPG). Las nucleobases subrayadas representan una región heteróloga (codon) donde la mutación sucede en el genoma de la colza, es decir, A. El genoplasto se prepara según técnicas bien conocidas y el genoplasto se administra preferentemente en una célula de planta de colza mediante bombardeo de micropartículas, es decir, biolísticamente. Las plantas de colza regeneradas que contienen al mutante P178 A son resistentes al glifosato cuando se aplican velocidades comerciales.
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