KR102646698B1 - 비-알코올성 지방간염의 비침습성 진단 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비-알코올성 지방간염(NASH)을 진단하고, 대상체를 NASH에 대한 치료의 잠재적인 수용자로서 분류하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다.

Description

비-알코올성 지방간염의 비침습성 진단
발명의 분야
본 발명은 비-알코올성 지방간염(NASH)의 진단, 및 NASH에 대한 치료의 잠재적인 수용자로서 대상체를 분류하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD)은 단순한 지방증으로부터 비-알코올성 지방간염(NASH))에 이르는 범위의 진행성 간 질환이다.
비-알코올성 지방간염(NASH)은 또한 지방산 축적, 간세포 손상 및 알코올성 간염과 유사한 염증에 의해 조직학적으로 특성화되는 간의 진행성 질환이다. NASH는 간경변, 간 부전 및/또는 HCC(간세포 암종)를 초래할 수 있는 공정의 주요 단계이다. 유의적인 알코올 섭취량의 결핍의 주의깊은 병력은 이러한 진단을 확립하는데 필수적이다. NASH는 간 전문가에게 평가를 위해 언급되는 환자에서의 상승된 아미노트랜스퍼라제의 가장 일반적인 원인들 중 하나이다. 비만 및 제2형 당뇨병도 NASH와 관련되어 있다.
세계적으로 비만율과 함께, NASH의 발병이 최근 여러 해 동안 증가해 왔으며, NASH로 진행되는 환자는 간-관련된 사망률이 증가해 왔기 때문에, NASH의 유병률 또한 증가하는 것으로 예측되므로, 당해 질환은 미국 뿐만 아니라 다른 나라에서도 드러나는 공공 쟁점이 되고 있다. 따라서, 이들 질환과 관련된 커지는 유병률과 증가된 사망율은 i) 질환 진행의 보다 큰 기계적 이해 및 ii) NASH의 비-침습성 진단을 위한 보다 민감하고 신뢰할만한 방법의 개발에 대한 필요성이 강조되어 왔다.
이들 질환은 충분히 조기에 진단되거나, 적어도 이들의 결과가 제한되는 경우 잠재적으로 역전시킬 수 있으므로, 이러한 조기의, 신속하고 정밀한 진단을 허용하는 새로운 도구를 사용하는 의학 분야를 제공할 수 있는 것이 중요할 것으로 여겨진다.
수개의 시도가 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 진단하고 측정하기 위한 비-침습성 방법을 제한하기 위해 이루어져 왔지만, 오늘날까지 간 생검의 조직학적 분석은 조기 단계 지방증으로부터 NASH를 차별화하기 위한 최적의 시도로 남아있다. 지방증, 소엽(lobular) 및 간문맥(portal) 염증, 팽창(ballooning) 및 세포자멸사(apoptosis) 형태의 간세포 손상, 및 섬유증은 생검으로부터 평가된 NASH의 특징이다. 그러나, 간 생검은 다수의 명백한 단점을 갖는다. 첫째로, 간 생검에서 수집된 물질은 진단된 대상체(subject)의 매우 작은 부분 만을 나타냄으로써, 수집된 샘플이 대상체 기관의 전반적인 상태를 대표하는지에 대한 의심이 증가한다. 더욱이, 간 생검은 환자에게 다루기 힘들고, 걱정하게 만들며, 고통스러울 수 있고, 이환율 및 사망률에 대한 걱정을 일으키는 매우 침습성인 과정이다. 최종적으로, 전술한 관점에서, 간 생검은 일반적인 집단, 또는 심지어 NASH의 위험이 있는 환자가 NASH로 고생할지의 여부에 대해 및/또는 상기 환자에서 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 측정하기 위해 정규적인 과정으로서 충분히 제안될 수 없다.
초음파검사 또한 간 지방증을 진단하는데 사용되었다. 그러나, 이러한 방법은 공명 세기(에코발생: echogenicity) 및 공명(텍스쳐: texture)의 특별한 양식을 기반으로 하므로 주관적이다. 그 결과, 이는 특히 진전된 섬유증을 지닌 환자에서 충분히 민감하지 않고 흔히 부정확하다.
NASH의 진단을 위한 현재의 지침은 비-중증 환자에서 AST/ALT 비(Angulo P. N. Engl. J. Med. 2002 Apr 18; 346(16):1221-31; Maher JJ. Semin Gastrointest Dis. 2002;13 :31-9) 및 매드레이 판별 함수(Maddrey discriminant function)가 32초과인 중증 환자에서의 간 생검(Levitsky J, Mailliard ME. Semin Liver Dis. 2004;24:233-47; Mathurin P, et al. Gastroenterology. 1996;110:1847-53; Mathurin P, et al. J Hepatol. 2002; 36:480-7)을 사용하는 것을 추천하였다.
간 생검은 잠재적인 샘플링 오차와 함께, 여전히 침습성이고 비용이 많이 드는 과정이므로, 환자에서 NASH 수준의 양호한 예측 값을 제공할 수 있는 시험을 수행하는 신속하고 용이한 방법을 갖는 것이 유리할 수 있다.
몇가지 연구는 섬유증의 일부 혈청 바이오마커가 트랜스아미나제 또는 ActiTest와 같은 표준 혈청 마커보다 더 우수한 진단 값을 가졌음을 관찰하였으나(Naveau S, et al., Clin Gastroenterol Hepatol. 2005; 3(2); Castera L, et al., J. Hepatol. 2000; 32:412-8; Annoni G, et al. Hepatology. 1989;9:693-7; Nojgaard C, et al. J Hepatol. 2003;39: 179-86; Chossegros P. 1995;22(2 Su[ppl):96-9), 이러한 연구들 중 어느 것도 NASH의 마커의 정밀한 조합을 실제로 확인하지 못하였다.
더욱이, 최근 몇년내에, 간 진단 분야에서 중요성을 획득한 비-침습성 바이오마커의 사용을 개발하기 위한 몇가지 시도가 있어왔다. 예를 들면, 제EP1846862B호는 환자의 혈청 또는 혈장 샘플로부터 알코올성 또는 비-알코올성 지방간염을 진단하기 위한 및 7개의 생화학적 마커의 농도를 측정하는 단계 및 이후에 이들을 로지스틱 함수(logistic function)을 통해 조합하여 최종 값을 수득하는 단계를 포함하는, 비-침습성 시험관내(in vitro) 방법을 기재하고 있다.
제WO 2014/049131호에는 세포자멸사를 반영하는 적어도 하나의 바이오마커, 인체측정학을 반영하는 적어도 하나의 바이오마커, 대사 활성을 반영하는 적어도 하나의 바이오마커 및 임의로 간 상태를 반영하는 적어도 하나의 바이오마커의 측정 및 수학적 함수에서 상기 바이오마커들 사이의 조합을 기반으로 하는 비-알코올성 지방간염의 비-침습성 진단을 위한 혈액 시험이 개시되었다.
비 침습성 바이오마커를 비교하고 조합하여 간 섬유증을 평가하지만, 또한 이들 비 침습성 바이오마커를 포함하는 상이한 알고리즘의 정확도를 비교하기 위한 몇가지 연구가 수행되었다. 그 곤란성은 효과적이고 관련있는 바이오마커를 선택하고, 궁극적으로 이들을 알코리즘을 통해 조합하고, 상이한 결과를 분석하며 임의로 우수한 방법으로 반응성 환자를 규정하는데 있다.
그러나, NASH에 대한 이러한 정밀한 진단 방법은 현재 이용가능하지 않다.
따라서, 대상체에서 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 진단하고 측정하기 위한 정밀하고, 비-침습성인 수단을 제공하는데 있어서 강력한 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 환자의 간 생검으로부터 수득한 조직학적 데이타를 포함하여, 출원인(연구 GFT505-212-7 - NCT01694849)에 의해 수행된 임상 시험 동안에 NASH 환자로부터 수득된 300개 이상의 고 품질 샘플로부터 측정된 거대한 수의 변수의 매우 미세하고 완전한 분석을 기반으로 한다. 이러한 연구는 NASH 및 이의 중증도 또는 단계 또는 활성의 지표인 주요 순환하는 인자(또는 바이오마커)의 발견을 이끌었다.
본 발명은 혈액, 혈청 또는 혈장 순환 hsa-miR-34 또는 이의 공선상의(collinear) 변수 중 하나의 수준, 및 적어도 하나의 다른 혈액, 혈청 또는 혈장 순환 간 손상의 마커의 수준의 측정을 포함하는, 대상체에서 비-알코올성 지방간염(NASH)의 진단 및/또는 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도의 측정, 및/또는 NASH에 대한 치료의 수용자 또는 비 수용자로서 대상체의 분류, 및/또는 의학적 치료의 효능의 평가, 및/또는 NASH 환자에서 병리의 진행 또는 퇴행의 측정, 및/또는 의학적 치료에 대한 잠재적인 반응자 또는 비 반응자로서 환자의 분류, 및/또는 환자에 대한 질환 결과의 예측, 및/또는 임상적으로 관련된 결과의 대리 마커의 확인을 위한 방법을 개시한다.
다른 국면 및 구현예는 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 특히 순환하는 마이크로--RNA(들)(miRNA(들)) 및 순환하는 간 손상의 마커인 생화학적 바이오마커와 같은 다른 순환하는 바이오마커의 정량화 및/또는 조합을 기반으로 한다.
특히, 본 출원인은 NASH/NAFLD(hsa-miR-21, hsa-miR-24, hsa-miR-33a, hsa-miR-34a, hsa-miR-122 및 hsa-miR-155)의 셋팅시 염증의 잠재적인 마커를 갖는 당해 분야에 개시된 miRNA 중에서, hsa-miR-34a가 NASH를 진단하는데 주요 바이오마커임을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 제1 국면은 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 hsa-miR-34a, 및 임의로 적어도 하나의 다른 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 간 손상의 마커의 측정을 포함하여, 대상체에서 NASH의 진단 또는 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 측정하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라서, 특별한 miRNA(들) 및 임의로 다른 특별한 생화학적 마커의 조합은 대상체에서 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 진단하고 측정하기 위한 매우 정밀하고, 비-침습적인 수단을 가져올 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 방법이 매우 강력하고 정밀하게 되는 방식의 마커들의 유형 둘 다의 조합을 개시한다. 본 발명의 방법은 대상체에서 NASH와 관련된 선택성(selectivity) 및 특이성(specificity) 둘 다를 제공한다.
따라서, 본 발명은, 총체적으로 고려하는 경우, NASH 또는 이의 중증도 또는 단계 또는 활성에 대해 시험한 대상체에서 NASH 및/또는 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도의 지표인, 순환하는 마커의 규정된 세트의 확인으로부터 기인한다. 본 발명은 특히 순환하는 마이크로-RNA(들)(miRNA(들)) 및 다른 순환하는 간 손상의 마커의 확인 및 이들의 수준의 정량화를 조합하여, 대상체에서 비-알코올성 지방간염(NASH)의 진단 및/또는 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
최근에, 암, 간염, 간 손상 및 NAFLD(비알코올성 지방간 질환)을 포함하는 다양한 질환에 대한 바이오마커로서 유의적인 양의 집중된 주위의 순환하는 miRNA(들)이 존재하였다(Osman, Clin. Lab. 2012; 58:393-402; Cermelli et al., PloS.One, 2011; 6:e23937; Elfimova et al., Front Physiol. 2012; 3:476).
miRNA(들)은 단백질 합성을 조절하기 위한 진화적으로 보존된 분자 메카니즘으로서 표적화된 mRNA의 부분적인 퇴행(repression) 또는 퇴화(degradation)에 의해 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절하는 비-암호화되고, 작은(19 내지 25개 뉴클레오타이드 길이), 고도로 보존된 조절성 RNA이다.
현재, 사람 게놈의 다양한 유전자간, 인트론 또는 엑손 서열 내에 암호화된 2000개 이상의 공지된 miRNA가 존재하며 miRNA는 모든 사람 유전자의 60% 까지 직접 표적할 수 있는 것으로 추정된다. miRNA(들)는 세포 자멸사, 분화, 발달, 증식, 및 물질대사를 포함하는, 생물학적 공정의 광범위한 배열에 관여한다.
순환하는 miRNA(들)은 리보핵단백질 복합체 또는 소낭내로 혼입될 수 있기 때문에 혈액의 리보뉴클레아제가 풍부한 환경 속에서 현저하게 안정하다.
miRNA(들) 특이적인 발현 프로파일은 일부 암, 간, 심장, 신장 및 자가면역 질환을 포함하는 수개의 질환과 관련되어 있다. 순환하는 miRNA(들)의 발현 프로파일이 특수한 상태와 강력하게 관련되는 경우, 순환하는 miRNA(들) 프로파일은 질환을 진단하고 모니터하기 위한 바이오마커로서 작용할 수 있다. miRNA는 최근에 NAFLD의 관리에 있어서 신규한 바이오마커 및 잠재적인 치료학적 표적인 것으로 드러났다.
이들의 발견 이래로 miRNA는 사람 질환에서 가능한 관련성에 대해 시험되어 왔다. 이들의 발현 양식에 있어서의 변경은 정상 조직 및 혈청과 비교하여 다수의 질환 상태에서 발견되어 왔다. 특히, 심장 질환, 패혈증, 악성 종양 및 자가면역 질환에서 miRNA 발현에 있어서의 변화는 사람 질환을 치료하기 위한 연구 및 표적의 새로운 방안을 시사하여 왔다.
이러한 촉망되는 새로운 분야는 연구를 추진하였으며 혈청 및 혈장에서 검출가능한 안정한 miRNA가 초기 질환 상태에 대한 바이오마커로서 제공될 수 있거나 질환의 중증도를 측정하는 비-침습성 수단일 수 있다는 가능성을 열었다. 그러나, NASH의 충분히 강력하고 유의적인 지표인 miRNA, 및 이를 NASH의 단계를 진단하거나 측정하기 위한 현재의 우수한 표준물로서 여전히 필요하도록 시행하는 방법은 여전히 간 생검이다.
miRNA(들) 중에서, hsa-miR-122는 간 질환의 바이오마커로서 제안되어 왔다(Chang et al. , 2004; Lagos-Quintana et al. , 2002).
발현 프로파일 연구는 사람 및 마우스 NASH에서 hsa-miR-21, hsa-miR-34a, hsa-miR-122, 및 hsa-miR-155를 포함하는 수개의 차등적으로 발현된 miRNA를 확인하였으며, 이들 miRNA의 변경된 발현은 NASH의 발병에 있어서 유의적인 역할을 시사한다. 그러나, NASH의 시험 및 임상 관리에 있어서 일부 최근의 성공에도 불구하고, 주요한 갭(gap)이 존재한다. 이는 생화학적 병인학, 광범위한 이의 제시(presentation), 및 NAFLD로부터 NASH으로의 질환 진행의 기본적인 공정의 제한된 이해를 포함한다.
특히 NASH로 진행하는 특정 환자 또는 조직의 상이한 민감성이 존재하는지의 여부, 및 이러한 민감성이 miRNA의 변경된 발현과 관련될 수 있는지의 여부는 여전히 알려져 있지 않았다.
오늘날 까지, miRNA 단독 또는 조합의 변경된 발현을 기반으로 하여, NASH의 보다 정밀한 진단에 대한 진단 시험은 이용가능하지 않았다.
본 발명은 순환하는 생물학적 마커의 존재 또는 수준과 관련시키고 하기 기술된 바와 같이 NAS 점수매김에 따라, 치료될 환자의 상이한 유형을 규정하기 위한, 임상 시험 동안의 환자의 생검의 매우 미세한 분석에 기인한다. 특히 본 발명은 치료될 NASH 환자의 3가지 부류(classes)를 비-제한적으로 규정한다. 이들 환자들은 NASH 특성의 점수매김과 관련하여 분류된다.
특수한 구현예에서, 환자의 각각의 부류에 대해 본 출원인은 환자의 몇가지 부류에 대한 관련된 바이오마커의 목록을 규정한다. 또한 이들 상이한 관련된 바이오마커를 조합하는 방법이 개시되어 있다.
따라서, 상이한 방법은 치료될 환자와 직접 연결된다. 본 발명에 따른 방법은 환자를 이들의 NASH 점수 특징에 따라서, NASH의 치료의 미래의 수용자 또는 비-수용자로 환자를 분류할 수 있도록 할 수 있다. 치료될 환자는 관리 기관 또는 각 나라의 보건 정책에 의존할 것이다. 본 출원인은 환자의 몇가지 부류를 확인하기 위한 마커의 상이한 조합을 제안하므로, 주치의가 치료할 이들 환자를 확인하기 위한 강력한 도구가 여기에 제공된다. 본 발명의 방법의 시행은 모니터링 하에서 대상체의 정밀한 분류를 야기한다.
본 발명에 따라서, 치료될 환자의 각각의 유형에 대해 NASH 점수가 수득될 수 있다.
본 발명은 대상체를 NASH에 대한 치료의, 수용자 또는 비 수용자로서, 또는 잠재적인 수용자 또는 잠재적인 비 수용자로서 분류하는 방법을 제공한다. 이러한 분류는 또한 대상체가 간 생검에 의해서와 같이 당해 분야에 공지된 방법에 의해 NASH의 추가의 확인을 수행하여야 하는지 여부를 추가로 측정하기 위한 기준이 될 수 있다.
본 발명의 방법은:
- 대상체에서 NASH를 진단하고,
- 대상체에서 NASH의 활성을 측정하며,
- 대상체에서 NASH의 단계를 측정하고,
- 대상체에서 NASH의 중증도를 측정하며,
- NASH의 치료에 대한 수용자 또는 비 수용자로서 대상체를 분류하고,
- 약물의 효능과 같은, NASH의 의학적 치료 효능을 평가하며,
- NASH 환자에서 병리(pathology)의 진행 또는 퇴행을 측정하고,
- 의학적 치료의 투여 후 NASH 환자에서 병리의 진행 또는 퇴행을 측정하며,
- 환자가 수용자일지 또는 아닐지, 즉, NASH에 대한 의학적 치료에 대한 (잠재적으로) 반응자인지 또는 (잠재적으로) 비 반응자인지를 예측하고,
- 예후 평가, 즉, 질환 결과의 예측을 달성하며,
- 임상 관련 결과의 대리 마커를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 환자에서 NASH의 진단, 그러나 또한 이후 발전을 허용한다. 이들 방법은 예를 들면, 언제 의학적 치료를 시작하는지 또는, 보다 심각한(critical)환자에 대해 언제 수술하는지(간 이식에 의한 것과 같음)의 결정을 위해 유리하게 수행될 수 있다.
본 발명은 NASH의 치료를 위한 매우 촉망되는 약물인, 엘라피브라노(Elafibranor)의 효과에 있어서 큰 임상 연구의 결과에 적용된 수학적 알고리즘 덕분에 확인된 상이한 바이오마커의 미세한(fine) 조합을 기반으로 한다. 엘라피브라노는 GENFIT의 선도 파이프라인 생성물(lead pipeline product)이다. 엘라피브라노는 1일 1회 경구 치료, 및 특히 NASH를 치료하기 위해 개발된 이중 퍼옥시좀 증식인자-활성화된 알파/델타 경로를 통해 작용하는 혁신적인 신약이다. 엘라피브라노는 염증, 인슐린 민감성, 지질/물질대사 프로파일, 및 간 마커를 포함하는, NASH의 다수의 측면을 다루는 것으로 여겨진다.
특수한 구현예에서, 이들 각각이 환자의 구체적인 부류에 전념하는 상이한 알고리즘이 시행된다.
환자 상태에 따른 구체적인 알고리즘을 측정함으로써, 이러한 결과의 추가의 개발은 보다 미세하고 예측적으로 된다.
놀랍게도, NASH와 어느 정도 관련된 것으로 공지된 모든 miRNA 중에서, hsa-miR-34(또는 이의 공선상의 변수중 하나)는 본 발명자들에 의해 적어도 하나의 다른 바이오마커와 조합되는 경우, NASH의 가장 강력하고(powerful) 암시하는(indicative) 바이오마커인 것으로 측정되어 왔다.
본 발명에 따라서, "비-알코올성 지방간염" 또는 "NASH"는 간 지방증, 간세포 팽창 및 간 염증의 존재로서 규정된다.
질환의 이러한 기본적인 규정에 대해, NASH는 간 섬유증을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따라서, 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용되며 표유 동물 대상체, 특히 사람 대상체 또는 사람 환자를 지정한다.
본 발명은 이의 비-침습성 특성 덕분에, NASH에 대해 공지되지 않거나 의심되는 소인이 없는 대상체와 같은, 어떠한 대상체에서도 시행될 수 있다.
그러나, 특수한 구현예에서, 대상체는 비만, 당뇨병을 가지거나, 물질대사 증후군을 앓고 있거나, 간 효소의 상승된 순환하는 수준을 가지거나, 비-알코올성 지방간 질환(또는 간 섬유증)을 지닌 것으로 이미 진단된 대상체와 같이, 미래에 NASH를 가지거나 NASH로 발전할 위험이 있는 대상체이다.
대상체는 또한 NHSH로 이미 확인된 대상체일 수 있으며, 따라서 본 발명의 방법은 간경변, 섬유증, 간암종, 간 이식 또는 심혈관 질환으로 질환의 진전 위험을 측정하도록 한다.
대상체가 NASH를 앓고 있는 경우, 본 발명의 방법은 NASH 질환의 치료를 위한 약물의 효능을 측정하고, 또한 환자의 치료에 대해 반응자/비반응자로서의 분류를 허용한다.
본 발명은 NASH의 치료에 대해 반응자 또는 비-반응자일 수 있는 환자를 확인하기 위해 시행될 수 있다. 특히, 본 발명은 환자를 상이한 부류로 분류하도록 한다.
각각의 환자 분류를 위해, NASH의 진단, 또는 대상체에서 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도의 측정, 또는 비-알코올성 지방간염(NASH)에 대한 치료의 수용자 또는 비-수용자로서 대상체의 분류, 또는 약물의 투여에 의해서와 같은 NASH의 의학적 치료의 효능의 평가, 또는 NASH 환자에서 병리의 진행 또는 퇴행의 측정; 또는 의학적 치료의 투여 후 NASH의 진행 또는 퇴행의 측정, 또는 환자가 의학적 치료에 대해 수용성일 것인지 또는 아닐 것인지의 예측, 또는 예후 평가, 즉, 환자에 대한 질환 결과의 예측, 또는 관련 임상 결과의 대리의 마커의 확인을 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 순환하는 hsa-miR-34(예컨대, hsa-miR-34a) 또는 이의 공선상의 변수, 및 적어도 하나의 다른 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 간 손상의 마커의 수준의 측정을 포함한다.
상기 환자 분류는 임상 시험: 간세포 지방증, 팽창, 소엽의 염증 및, 임의로 섬유증 동안 NASH를 앓는 환자의 고 품질 샘플로부터의 간 생검의 조직학적 특징에 따라 정의된다.
앞서의 분석을 기반으로, NAFLD 활성 점수(NAS)를 확립하고 다음과 같이 정의할 수 있다:
NAS는 3개의 특징을 기준으로 하며, 이들 각각은 0 내지 2 또는 3으로 점수를 매긴다(하기 표 참고).
NAS는 지방증(S) 점수, 소엽의 염증(L) 점수 및 간세포 팽창(B) 점수의 합이다.
따라서, NAS는 0 내지 8에서 포함될 수 있다.
이후, 임의로, NASH 환자는 경우에 따라, 섬유증의 단계에 의해 추가로 특징지워질 수 있다. NASH에서 섬유증의 단계는 하기 나타낸 바와 같이, 3개의 가능성으로 4 단계로 정의될 수 있다.
출처: Kleiner et al., Hepatology 2005;41:1313-21.
본 발명자들에 의해 수집된 데이타를 2개의 상이한 생물통계학적 시도에 따라 진행(processing)하여, 질환 및/또는 이의 중증도 또는 단계 또는 활성의 지표인 점수를 측정하게 함으로써 대상체가 NASH를 앓고 있는지를 의사가 용이하게 측정하거나, 질환의 단계 또는 활성 또는 중증도를 측정하도록 하였다.
2개의 생물통계학적 시도인, 중간 모델 및 부트스트랩 모델(bootstrap model)을 사용하여 하기 기술한 바와 같이, NASH 환자와 관련된 마커의 조합을 미세하게 정의하였다.
본 발명에서 측정된 마커의 수준은 대상체의 체액으로부터 측정되며, 이는 특히 혈액, 보다 특히 혈청 또는 혈장 샘플일 수 있다. 샘플은 또한 뇨와 같은 다른 체액에 상응할 수 있다.
특정 구현예에 따라서, 본 발명에서 측정된, 마커, 및 특히 miRNA(들)의 수준은, 바람직하게는 혈소판이 없는 혈장 샘플로부터 측정된다.
본 발명자들에 의해 확인된 마커의 수준은 면역검정(예컨대, ELISA), 또는 분자 및 생화학적 검정(정량적 RT-PCR, 비색 분석), 또는 분석 방법(예컨대, 질량 분광법)과 같이, 당해 분야에 잘 공지된 통상의 방법에 의해 생체표지기 유형(단백질, 마이크로-RNA, 당 수준...)에 따라 측정될 수 있다.
시험된 마커가 마이크로-RNA, 및 보다 구체적으로 hsa-miR-34a인 경우, 이의 측정은 하기 실시예에 나타낸 것과 같이, 당해 분야에 잘 공지된 다수의 방법에 따라 수행할 수 있다.
요약하면, 측정은 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플, 특히 세포-유리된, 시트레이트-기원한 혈소판-유리된 혈장 샘플로부터 추출된 총 RNA로부터 수행된다. 다른 적절한 내부 기준(공지된 서열 및 양의 마이크로-RNA, 예컨대, 씨. 엘레간스(C. elegans) miR-39)을 RNA 추출 전에 샘플에 첨가할 수 있다. Cq 값은 정량적 RT-PCR을 사용하여 측정한다. 시판되는 키트(kit)는 이러한 검정을 수행하는데 이용가능하다. 예를 들면, Taqman miRNA qRT-PCR 검정: Taqman MicroRNA 역 전사 키트, TaqMan 마이크로RNA 검정 20X, 및 TaqMan Universal Master Mix II(Applied Biosystems)를 제조업자의 지시에 따라 사용할 수 있다. 역 전사는 GeneAmp® PCR System 9700 열 순환기(Applied Biosystems)와 같은 용이하게 이용가능한 PCR 시스템을, 16℃에서 30분에 이은 42℃에서 30분 동안 및 85℃에서 5분 동안 및 이후 4℃에서 유지와 같은 적절한 순환 매개변수를 함께 사용하여 수행할 수 있다. 역 전사는 멀티플렉스 양식으로 시행될 수 있다. 이후에 정량적 PCR을 CFX96TM Real-Time System(C1000 TouchTM Thermal Cycler, BioRad)과 같은 정량적 PCR 시스템을 사용하여 수행한다. 순환 조건은 다음과 같을 수 있다: 95℃에서 10분에 이어 95℃에서 15초 동안 및 60℃에서 60초 동안 총 50회 주기에 이어서 30℃에서 30초 동안. Cq 측정 방식은 정량적 PCR 시스템에서 회귀 방식일 수 있다. 특수한 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 측정된 Cq 값은 상기 특수한 매개변수 및 물질을 사용하여 수득가능한 Cq 값이다. 샘플의 Cq 값은 값들이 각각의 miRNA의 표준 곡선의 최대 Cq를 초과하는 경우 분석으로부터 배제될 수 있다. 표준 곡선을 사용하여 반응 효율을 평가할 수 있다.
일련의 희석을 최대 농축된 cDNA 샘플로부터 출발하여 8점에 걸쳐 수행함으로써, 표준 곡선이 연구 동안 직면할 수 있는 모든 잠재적인 주형 농도를 포함하도록 보증한다. 표준 곡선은 수득된 Cq 값에 대해 주형의 출발량의 log를 플롯팅함으로써 수행할 수 있다. 절대적인 정량적 데이타 합성 hsa-miRNA(예컨대, Integrated DNA Technologies로 부터)를 3.125 fmol/mL에서 희석하여 5 μL를 혈청 샘플로부터 추출된 RNA와 동시에 역 전사를 위해 사용할 수 있다. 이후에 생성물을 일련 희석시키고 PCR을 모든 샘플(표준 및 혈청-기원한 RNA)에서 수행할 수 있다. 표준 곡선은 2회 수행하여 Cq 데이타를 카피/μL로 전환하는데 사용할 수 있다. Cq 측정 방식은 회귀법이었다. 알고리즘의 구축에 사용된 데이타는 Log10(카피/μL의 혈청) 양식이었다.
본 발명에 따라서, 대상체는 특히 대조군(또는 참고) 샘플로부터 수득된 참고 값과 비교하는 경우에, hsa-miR-34a의 수준 및 적어도 하나의 다른 마커의 수준이 증가하면, NASH를 가진 것으로 진단되거나, 잠재적으로 NASH를 가진 것으로 진단되거나 NASH를 가진 경향이 있는 것으로 진단된다. 참고 샘플은 NAFLD 또는 NASH를 가지지 않은, 2명 이상과 같은 1명 이상의 대상체로부터 수득된 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 체액 샘플에 상응할 수 있다.
본 발명에서, 상기 기술된 바와 같이 측정된, 바이오마커의 수준, 즉, hsa-miR-34(예컨대, hs-miR-34a), 또는 이의 공선상의 변수 중 하나, 및 적어도 하나의 다른 마커중 하나를 또한 사용하여 달리 "NASH 점수"로 명명된 질환 점수를 측정할 수 있다. 다음 설명에서 당해 점수는 비-침습성 과정을 사용하여, 즉, 간 생검에 의존하지 않고, NASH의 진단, 또는 NASH의 중증도 또는 단계 또는 활성의 측정, 또한 하기 나열된 모든 매개변수의 측정을 허용하므로 이를 필요로 하는 의사 및 대상체 둘 다에 대한 가치있고 강력한 도구이다. NASH 점수는 낮은, 중간 및 높은 NASH 활성, 또는 중간 및 중증 NASH 사이를 구별하는 역치 값(threshold value)과 비교할 수 있다.
더욱이, NASH 점수는 또한 약물 흡수를 기반으로 의학적 치료와 같은 의학적 치료의 효능을 예측할 수 있다.
NASH 점수는 관련 임상 결과의 대리 마커를 제공한다.
본 발명에 따라서, 이러한 정보는 대상체가 NASH에 대한 치료학적 치료를 제공받거나 제공받지 않을 것인지를 결정하는데 유리하게 사용될 수 있다. 특수한 구현예에 따라서, NASH(낮은, 중간 또는 높은 NASH 활성 또는 중증 NASH)를 지닌 환자로서 측정된 대상체는 적절한 NASH 의학적 치료로 치료될 것이다. 추가의 특수한 구현예에서, 중간 내지 높은 NASH 활성 또는 중증의 NASH를 지닌 대상체가 치료될 것이다.
더욱이, NASH 점수의 계산은 또한 환자가 의학적 치료를 수용할 것인지 또는 수용하지 않을 것인지, 즉, 의학적 치료의 반응자인지 또는 비-반응자인지를 예측하도록 한다.
동일한 방식으로, NASH 점수는 NASH 환자에서 병리의 진행 또는 퇴행을 따르도록 한다. 또한, 이는 의학적 치료의 투여 후 NASH의 진행 또는 퇴행을 측정하도록 한다.
NASH 점수는 또한 예후적 평가, 즉, 진행하는 경화증의 위험과 같은, 환자에 대한 질환 결과의 예측을 가능하도록 한다.
효과적으로, 높은 NASH 점수는 환자가 위험에 있고 부정적(negative) 쟁점, 즉, 경화증 또는 심지어 사망으로 진전될 수 있음을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 대상체를 NASH에 대한 치료의, 수용자 또는 비 수용자로서, 또는 잠재적인 수용자 또는 잠재적인 비 수용자로서 분류하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 위에서 정의한 바와 같은 마커의 수준의 측정, 본원에 제공된 바와 같은 NASH 점수의 계산, 및 상기 NASH 점수를 기준으로 치료의(잠재적인) 수용자 또는 (잠재적인) 비 수용자로서 대상체의 분류를 포함한다. 이러한 분류는 또한 대상체가 간 생검을 겪는 것에 의한 것과 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 NASH를 추가로 확인하여야 하는지를 추가로 측정하기 위한 기준이 될 수 있다.
또한, 대상체의 분류를 또한 사용하여 대상체에서 낮은 NASH 활성 또는 중간 NASH 활성을 측정할 수 있으며, 이러한 분류를 기준으로 대상체에게 NASH를 역전시키기 위한 식이 및/또는 생활방식 추천을 제공할 수 있다.
치료될 환자는 낮은, 중간 또는 높은 NASH 활성을 가지거나, 중증의 NASH를 나타낼 수 있다. 그러나, 바람직한 구현에에 따라서, 본 출원인은 치료될 환자가 위험에 처한 환자로 정의되는 전제로부터 출발한다. 따라서, 본 발명에서 고려된 환자는 바람직하게는 중간 내지 중증의 NASH 환자로 분류된다. 특수한 구현예에 따라서, 본 발명에서, 중간 내지 높은 NASH 활성으로 분류된 대상체, 또는 중증 NASH 환자는 NASH에 대한 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로 고려된다.
본 발명의 내용에서, 일반적으로 NASH 환자는 다음의 간 생검-기원한 등급을 나타내는 것으로 정의된다:
- 지방증 점수 ≥ 1
- 간세포 팽창 점수 ≥ 1
- 소엽의 염증 점수 ≥ 1
- NAS(NAFLD 활성 점수) ≥ 3 (NAS는 지방증 점수, 간세포 팽창 점수 및 소엽의 염증 점수의 합으로 정의된다).
본 발명의 방법은 hsa-miR-34(예컨대, hsa-miR-34a) 또는 이의 공선 변수 중 하나 및 적어도 하나의 다른 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 간 손상의 마커의 측정을 포함한다.
특수한 구현예에서, miRNA(들)의 측정은 혈장 샘플, 및 특히 혈소판-유리된 혈장 샘플에서 실현된다.
통계적 분석에 따라서, 바이오마커는 또한 하기 기술된 바와 같이 공선 시험(collinearity test)을 통해 시험되었다.
2개 또는 수개의 변수가 0.7 초과의 상관관계를 나타내는 경우, 환자를 정의하는 반응 변수와 관련하여 이들의 평균에서의 차이의 일변량 시험(univariate test)을 수행하였다. 이는 공선 변수가 또한 이들이 존재하는 경우 포함됨을 의미한다. 일변량 시험에서 가장 우수한 결과를 지닌 변수를 이들 공선 변수 중에서 선택하였다. 이들 선택된 변수 뿐만 아니라 다른 비-공선 변수도 모델링 시도에 포함된다.
본 발명에서, 상기 기술된 바와 같이 측정된 바이오마커의 수준을 또한 사용하여 달리는 "NASH 점수"로 명명된 질환 점수를 측정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 NASH 점수가 간 손상의 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 마커의 측정된 수준으로부터 계산되고 NASH가 진단되고/되거나 NASH 단계 또는 활성 또는 중증도가 측정되고/되거나 NASH에 대한 치료의 수용자 또는 비수용자로서 대상체의 분류가 측정되고/되거나 약물 투여를 기준으로 의학적 치료의 효능을 측정하고/하거나 NASH 환자에서 병리의 진행 또는 퇴행을 측정하고/하거나 의학적 치료의 투여 후 NASH의 진행 또는 퇴행을 측정하고/하거나 의학적 치료에 대해 수용하는 또는 수용하지 않는 환자의 특성을 측정하고/하거나, 예후 평가, 즉, 환자에 대한 질환 결과의 예측을 확립하고/하거나 관련된 임상 결과의 대리 마커를 제공하는 방법을 기술한다.
본 발명에 따라서, 상기 방법은:
- hsa-miR-34 또는 이의 공선 변수 중 하나; 및 적어도 하나의 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 간 손상의 마커의 수준을 측정하는 단계, 및
- 수학적 알고리즘을 통해 상기 결과를 조합하여 NASH 점수를 수득하는 단계를 포함한다.
특수한 구현예에서, 간 손상의 적어도 하나의 다른 순환하는 마커는 알파 2 마크로글로불린, 당화된 헤모글로빈(HbA1c), 절식 글루코즈 수준, 프럭토스아민 수준, 인슐린, C-펩타이드, 항상성 모델 평가(Homeostasis Model Assessment: HOMA), 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, hsa-miR-200, YKL-40, CK18-M30, CK18-M65, ALT, AST, 뇨 비중(Uninary Specific Gravity: Uri Spec Grav), 뇨 크레아티닌, 호염기성 세포, 고 민감성-반응성 단백질(HSCRP), 뇨 β-NAG, 백혈구, 호염기성 세포 및 피브리노겐으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 이들 측정은 하기에 명백한 바와 같이, 대상체의 신장의 측정과 같은 다른 매개변수로 완료될 수 있다. 특수한 구현예에서, 본 발명의 방법은 miR34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p)의 수준의 측정 및 YKL-40의 수준의 측정을 합한다. 추가의 특수한 구현예에서, 본 발명의 방법은 miR34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p)의 수준의 측정 및 YKL-40 및 알파 2 마크로글로불린의 수준의 측정을 합한다. 다른 특수한 구현예에서, 본 발명의 방법은 miR34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p)의 수준의 측정 및 YKL-40, 알파 2 마크로글로불린 및 당화된 헤모글로빈(HbA1c)의 수준의 측정을 조합한다.
본 발명에 따라서, 본원에 기술된 방법에서, 대조군 샘플의 것에 대해 검정된 마커의 수준에 있어서의 변화는 NASH 및/또는 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도 및/또는 NASH에 대한 치료의 수용자인지 또는 비 수용자인지로서의 대상체의 분류 및/또는 약물 투여를 기준으로 의학적 치료의 효능 및/또는 NASH 환자에서 병리의 진행 또는 퇴행 및/또는 의학적 치료의 투여 후 NASH의 진행 또는 퇴행 및/또는 의학적 치료에 대해 수용성인지 또는 아닌지에 대한 환자의 특성, 및/또는 예후 평가, 즉, 환자에 대한 질환의 결과의 예측의 지표이다.
또한 "S"로서 지칭되는 NASH 점수는 특수한 구현예에서 중간 내지 높은 NASH 활성 또는 중증 NASH를 가질 가능성을 지칭할 수 있다.
환자의 제1 소부류(subclass)
본 발명 및 본 발명의 제1 변형의 맥락에서, 환자의 제1의 소부류는 다음의 간 생검-기원한 등급을 나타내는 환자로서, 또는 이와 동일한 것으로 정의된다:
- 지방증 점수 ≥ 1
- 간세포 팽창 점수 ≥ 1
- 소엽의 염증 점수 ≥ 1
- NAS(NAFLD 활성 점수) ≥ 4(NAS는 지방증 점수, 간세포 팽창 점수 및 소엽의 염증 점수의 합으로 정의된다)
- 섬유증 단계 = 2 (2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일한 섬유증 단계와 같음).
다음의 방법을 시행하여 대상체에서 NASH를 진단하거나, 대상체를 상기 간 생검-기원한 등급을 잠재적으로 나타내는 것으로 분류하거나, 환자를 NASH의 치료의 수용자 또는 비-수용자로 특성화할 수 있다.
환자의 제1 소부류를 확인(또는 진단)하기 위한 방법의 제1 변형에서, hsa-miR-34 수준, 특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p의 수준이 측정되며 공선 변수는 hsa-miR-122, 특히 hsa-miR-122-5p, 및 hsa-miR-192, 특히 hsa-miR-192-5p로 이루어진 그룹에서 선택된다.
본 발명의 제1 변형의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은:
- hsa-miR-34, 특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p; 또는 hsa-miR-122, 특히 hsa-miR-122-5p; 또는 hsa-miR-192, 특히 hsa-miR-192-5p의 수준을 측정하는 단계; 및
- 적어도 하나의 다른 마커, 바람직하게는:
- 알파 2 마크로글로불린,
- 당화된 헤모글로빈(HbA1c), 절식 글루코즈 수준 또는 프럭토스아민 수준,
- 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드(PIIINP),
- hsa-miR-200, (특히 hsa-miR-200a 및 보다 특히 hsa-miR-200a-3p),
- YKL-40,으로 이루어진 그룹에서 선택된, 바람직하게는 모든 것의, 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제1 변형의 특수한 구현예에서, 본 발명의 NASH 점수는 상기 제공된 바와 같이 측정된 다음의 마커 수준으로부터 계산된다:
- miR-34a(보다 특히 miR-34a-5p)의 수준; 및
- 알파 2 마크로글로불린의 수준; 및
- HbA1c의 수준; 및
- 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 수준; 및
- hsa-miR-200a(특히 hsa-miR-200a-3p)의 수준; 및
- YKL-40의 수준.
제1 변형의 추가의 특수한 구현예에서, 상기 점수는 로지스틱 함수로서 정의된다:
여기서:
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F+g*G
여기서:
S는 본 발명에 따른 NASH 점수이고;
A는 g/L 단위의 알파 2 마크로글로불린의 수준이며;
B는 퍼센트 단위의 HbA1c의 수준(예컨대, B는 측정된 HbA1c 퍼센트가 10%인 경우 10과 동일하다)이고;
C는 ng/mL 단위의 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 수준이며;
D는 Cq 단위의 hsa-miR-34a (특히 hsa-miR-34a-5p)의 수준이고;
F는 Cq 단위의 hsa-miR-200 (특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p)의 수준이고;
G는 pg/ml 단위의 YKL-40의 수준이며,
k는 로지스틱 함수의 상수이고;
a는 알파 2 마크로글로불린의 수준과 관련된 계수이며;
b는 HbA1c의 수준과 관련된 계수이고;
c는 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 수준과 관련된 계수이며;
d는 hsa-miR-34a (특히 hsa-miR-34a-5p)의 수준과 관련된 계수이고;
f는 hsa-miR-200 (특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p)의 수준과 관련된 계수이며;
g는 YKL-40의 수준과 관련된 계수이고;
따라서 NASH 점수는 중간 내지 높은 NASH 활성 또는 중증 NASH를 가질 가능성이다.
S가 역치 값 이상인 경우, 대상체는 NASH를 가지거나, 가지고 있거나, 잠재적으로 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지는 것으로 분류되고/되거나 NASH에 대해 치료되어야 하거나, NASH에 대해 잠재적으로 치료되어야 하는 것으로 분류된다. 특수한 구현예에 따라서, S가 역치 값보다 더 낮은 경우, 대상체는 치료되어야 하거나 치료되지 않는 것으로, 특히 치료되지 않아야 하는 것으로 분류되고/되거나 대상체는 이의 낮은 NASH 활성 또는 중간 NASH를 관리하기 위한 식이 및/또는 생활방식 충고의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
특수한 구현예에서, 본원의 실험 부분에 기술된 바와 같은 중간 모델로부터 다음이 유도되며:
k는 5.94 내지 50.74 사이에 포함되는 수이고;
a는 0 내지 1.07 사이에 포함되는 수이며;
b는 0 내지 1.20 사이에 포함되는 수이고;
c는 0 내지 0.24 사이에 포함되는 수이며;
d는 -0.97 내지 0 사이에 포함되는 수이고;
f는 -0.87 내지 0 사이에 포함되는 수이며,
g는 0 내지 1.74E-05 사이 사이에 포함되는 수이고;
여기서 역치 값은 0.2017 내지 0.4645 사이에 포함되고 보다 특히 0.2302와 같다.
특수한 구현예에 따라서, 대상체는 NASH 점수 S가 0.2017 내지 0.4645 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
추가의 특수한 구현예에서, 중간 모델로부터 다음이 여전히 유도된다:
k는 25.13과 동일하고;
a는 0.52와 동일하며;
b는 0.57과 동일하고;
c는 0.12와 동일하며;
d는 -0.43과 동일하며;
f는 -0.47과 동일하고;
g는 9,54E-06과 동일하며,
여기서 상기 역치 값은 0.2017 내지 0.4645 사이에 포함되고, 보다 특히 0.2302와 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, 대상체는 NASH 점수 S가 0.2017 내지 0.4645 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 NASH를 가지거나, 또는 잠재적으로 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
특수한 구현예에 따라서, 수용자 작동 특성(Receiver Operating Characteristic: ROC) 곡선 하 영역(AUC)은 적어도 0.80과 동일하고, 바람직하게는 0.82이며, 보다 바람직하게는 0.84이다. AUC는 알고리즘의 품질을 측정하기 위해 많은 출원에서 사용된 잘 공지된 기준이다. 이의 값이 1에 가까울 수록, 알고리즘이 우수하다.
다른 특수한 구현예에서, 본 출원의 실험 부분에 기술된 바와 같이 부트스트랩 모델로부터 다음이 기원한다:
k는 8.24 내지 35.44 사이에 포함되는 수이고;
a는 0.06 내지 0.88 사이에 포함되는 수이며;
b는 0.14 내지 1.04 사이에 포함되는 수이고;
c는 0.03 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
d는 -0.75 내지 -0.05 사이에 포함되는 수이고;
f는 -0.73 내지 -0.07 사이에 포함되는 수이며,
g는 3.59E-06 내지 1.78E-05 사이에 포함되는 수이고,
여기서 상기 역치 값은 0.2718 내지 0.6391 사이에 포함되고, 보다 특히 0.3502와 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, 대상체는 NASH 점수 S가 0.2718 내지 0.6391 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
추가의 특수한 구현예에서, 상기 부트스트랩 모델로부터 다음이 또한 기원한다:
k는 21.84와 동일하고;
a는 0.47과 동일하며;
b는 0.59와 동일하고;
c는 0.13과 동일하며;
d는 -0.40과 동일하고;
f는 -0.40과 동일하며; 및
g는 1.07E-05과 동일하고,
여기서 상기 역치 값은 0.2718 내지 0.6391 사이에 포함되고, 보다 특히 0.3502와 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, NASH 점수 S가 0.2718 내지 0.6391 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다. 이러한 특수한 구현예에 따라서, AUC는 적어도 0.80과 동일하며, 바람직하게는 0.82이고, 보다 바람직하게는 0.84이다.
특수한 구현예에서, 상기 제1 변형에 대해 기술된 상기 방법은 혈장 샘플로부터 시행된다.
부트스트랩 및 중간 모델로부터 기원한 것 둘 다에 대해, AUC는 매우 양호하다. 이는 모델 둘 다가 본 발명에서 상호교환적으로 활용될 수 있음을 의미한다.
본 발명은 또한: (i) hsa-miR-34 (특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 miR-34a-5p), hsa-miR-122 (특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p)로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커; 및
(ii) 알파 2 마크로글로불린;
(iii) HbA1c, 절식 글루코즈 수준, 프럭토즈아민 수준으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커;
(iv) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드;
(v) hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p), 및
(vi) YKL-40로부터 선택된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 다른, 특히 모든 마커의 수준을 측정하기 위한 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 상기 키트는 다음의 수준을 측정하기 위한 수단을 포함한다:
(i) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 miR-34a-5p),
(ii) 알파 2 마크로글로불린,
(iii) HbA1c,
(iv) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, 및
(v) hsa-miR-200a (특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p) 및 YKL-40.
상기 기술된 방법을 시행하는데 유용한 본 발명의 키트는 또한 임의로 상기 방법을 시행하기 위한 지시사항을 포함한다. 상기 키트는 상기 확인된 마커의 수준의 측정을 수행하기에 적절한 시약 및 완충제를 포함할 수 있다. 특히, 상기 키트는 당해 분야에 잘 공지된 것으로서, 정량화될 단백질에 대해 특이적인 항체, 및/또는 마이크로-RNA를 정량화하는데 유용한 프라이머(primer)를 포함할 수 있다.
본 발명의 이러한 제1 변형 중에서,
본 출원인은 추가로 연구하여 혈청을 순환하는 miRNA(들)에 촛점을 맞추기로 결정하였다.
일반적으로, 상이한 순환하는 마커, 및 특히 miRNA(들)은 치료할 위험이 있는 상이한 환자의 혈장으로부터 평가된다.
새로운 시도에서 본 출원인은 혈청에서 상이한 순환하는 마커를 평가하였다. 혈청은 전혈을 응고되도록 한 후 이의 고체 및 액체 성분으로 분리시 수득된 투명한 황색 액체로 정의될 수 있다.
혈청으로부터 평가된 miRNA(들)은 Log10(혈청의 카피/μl)로 표시되며 이러한 값을 측정하기 위한 세부적인 방법은 하기 나타낸다.
다른 모델에서, 혈청 속에서 평가된 miRNA(들)은 Cq로 표시된다.
miRNA가 혈청 속에서 평가되어 본 발명의 제1 변형의 Cq로 표시되는 바람직한 구현예에 따라서, 상기 방법은:
- hsa-miR-34, 특히 hsa-miR-34a 및 보다 특히 hsa-miR-34a-5p, 또는 hsa-miR-122 및 특히 hsa-miR-122-5p, 또는 CK18-M30, CK18-M65, 또는 ALT 또는 AST의 혈청 수준, 및 적어도 하나의 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 간 손상의 마커를 측정하는 단계, 및
- 수학적 알고리즘을 통해 상기 결과를 조합하여 NASH 점수를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 이러한 국면의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은:
- hsa-miR-34, 특히 hsa-miR-34a 및 보다 특히 hsa-miR-34a-5p, 또는 hsa-miR-122 및 특히 hsa-miR-122-5p, 또는 CK18-M30, CK18-M65, 또는 ALT 또는 AST의 혈청 수준을 측정하는 단계,
- 알파 2 마크로글로불린의 수준을 측정하는 단계,
- 당화된 헤모글로빈 (HbA1c), 절식 글루코즈 수준 또는 프럭토스아민의 수준을 측정하는 단계,
- YKL-40의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제1 국면의 특수한 구현예에서, 본 발명의 NASH 점수는 상기 제공된 바와 같이 다음의 마커 수준으로부터 계산된다:
- 혈청 속에서 측정된 miR-34a (보다 특히 miR-34a-5p)의 수준; 및
- 혈청 속의 알파 2 마크로글로불린의 수준; 및
- 혈청 속의 YKL-40의 수준, 및
- HbA1c의 수준.
이러한 특수한 구현예에 따라서, 상기 점수는 Cq 단위로 표시한 has-miR-34a (특히 hsa-miR-34a-5p)의 혈청 수준과의 로지스틱 함수로 정의된다
여기서:
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D
여기서:
S는 NASH 점수이고;
A는 Cq 단위의 hsa-miR-34a(특히 hsa-miR-34a-5p)의 혈청 수준이며;
B는 g/L 단위의 알파 2 마크로글로불린의 혈청 수준이고;
C는 pg/ml 단위의 YKL-40의 혈청 수준이며;
D는 퍼센트 단위의 HbA1c의 수준(예컨대, 측정된 HbA1c 퍼센트가 10%인 경우 D는 10과 동일하다)이고;
k는 로지스틱 함수의 상수이고;
a는 hsa-miR-34a(특히 hsa-miR-34a-5p)의 혈청 수준과 관련된 계수이며;
b는 알파 2 마크로글로불린의 혈청 수준과 관련된 계수이고;
c는 YKL-40의 혈청 수준과 관련된 계수이며;
d는 HbA1c의 수준과 관련된 계수이다.
S가 역치 값 이상인 경우, 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가지는 것으로 분류되고/되거나 NASH에 대해 치료되어야 하거나, NASH에 대해 잠재적으로 치료되어야 하는 것으로 분류된다. 특수한 구현예에 따라서, S가 역치 값보다 더 낮은 경우, 대상체는 치료되어야 하거나 치료되지 않는 것으로, 특히 치료되지 않아야 하는 것으로 분류되고/되거나 대상체는 이의 낮은 NASH 활성 또는 중간 NASH를 관리하기 위한 식이 및/또는 생활방식 충고의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
특수한 구현예에서, 본 출원의 실험 부분에 기술된 바와 같은 부트스트랩 모델로부터 다음이 유도된다:
k는 9.51 내지 34.37 사이에 포함되는 수이고;
a는 -1.17 내지 -0.47 사이에 포함되는 수이며;
b는 0.02 내지 0.84 사이에 포함되는 수이고;
c는 6.10E-06 내지 2.09E-05 사이에 포함되는 수이며;
d는 0.07 내지 0.89 사이에 포함되는 수이고;
여기서 역치 값은 0.2013 내지 0.5965 사이를 포함하고 보다 특히 0.4661과 같다.
특수한 구현예에 따라서, 대상체는 NASH 점수 S가 0.2013 내지 0.5965 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
추가의 특수한 구현예에서, 상기 부트스트랩 모델로부터 다음이 여전히 유도된다:
k는 21.94와 동일하고;
a는 -0.82와 동일하며;
b는 0.43과 동일하고;
c는 1.35E-05와 동일하며;
d는 0.48과 동일하고;
여기서 상기 역치 값은 0.2013 내지 0.5965 사이에 포함되고, 보다 특히 0.4661와 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, NASH 점수 S가 0.2013 내지 0.5965 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다. 특수한 구현예에 따라서, AUC는 적어도 0.80과 동일하고, 바람직하게는 0.82이다.
추가의 특수한 구현예에서, 본 출원의 실험 부분에 기술된 바와 같이 중간 모델로부터 다음이 기원한다:
k는 6.02 내지 56.69 사이에 포함되는 수이고;
a는 -1.26 내지 0.00 사이에 포함되는 수이며;
b는 0.00 내지 0.88 사이에 포함되는 수이고;
c는 0.00 내지 2.00E-05 사이에 포함되는 수이며;
d는 0.00 내지 0.96 사이에 포함되는 수이고;
여기서 상기 역치 값은 0.97738 내지 0.9955 사이를 포함하고, 보다 특히 0.9936와 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, 대상체는 NASH 점수 S가 0.9773 내지 0.9955 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
추가의 특수한 구현예에서, 상기 중간 모델로부터 다음이 또한 기원한다:
k는 28.17과 동일하고;
a는 -0.84과 동일하며;
b는 0.36과 동일하고;
c는 1.23E-05와 동일하며;
d는 0.41과 동일하고;
여기서 상기 역치 값은 0.9773 내지 0.9955 사이에 포함되고, 보다 특히 0.9936과 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, NASH 점수 S가 0.9773 내지 0.9955 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
이러한 특수한 구현예에 따라서, AUC는 적어도 0.80과 동일하며, 바람직하게는 0.80이고, 보다 바람직하게는 0.82이다.
부트스트랩 및 중간 모델로부터 기원한 것 둘 다에 대해, AUC는 매우 양호하다. 이는 모델 둘 다가 본 발명에서 상호교환적으로 활용될 수 있음을 의미한다.
또한 본 발명의 제1 변형의 특수한 구현예에 따라서, miRNA는 혈청 속에서 평가되고 카피/μl(log10)으로 표시되며, 상기 방법은:
- hsa-miR-34, 특히 hsa-miR-34a 및 보다 특히 miR-34a-5p, 또는 hsa-miR-122 및 특히 hsa-miR-122-5p, 또는 CK18-M30 또는 AST, 및 적어도 하나의 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 간 손상의 마커의 혈청 수준을 측정하는 단계; 및
- 상기 결과를 수학적 알고리즘으로 조합하여 NASH 점수를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 이러한 제1 변형의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은:
- hsa-miR-34, 특히 hsa-miR-34a 및 보다 특히 miR-34a-5p, 또는 hsa-miR-122 및 특히 hsa-miR-122-5p, 또는 CK18-M30 또는 AST의 혈청 수준을 측정하는 단계,
- 당화된 헤모글로빈(HbA1c)의 수준, 절식 글루코즈 수준 또는 프럭토스아민 수준을 측정하는 단계,
- YKL-40의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
이러한 특수한 구현예에 따라서, 상기 점수는 카피/μl(log10) 단위로 표시한 has-miR-34a(특히 hsa-miR-34a-5p)의 혈청 수준과의 로지스틱 함수로 정의된다
여기서;
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D
여기서:
S는 NASH 점수이고;
A는 카피/μl(log10) 단위의 hsa-miR-34a(특히 hsa-miR-34a-5p)의 혈청 수준이며;
B는 g/L 단위의 알파 2 마크로글로불린의 혈청 수준이고;
C는 pg/ml 단위의 YKL-40의 혈청 수준이며;
D는 퍼센트 단위의 HbA1c의 수준(예컨대, HbA1c 퍼센트가 10%인 경우 D는 10과 동일하다)이고;
k는 로지스틱 함수의 상수이고;
a는 hsa-miR-34a(특히 hsa-miR-34a-5p)의 혈청 수준과 관련된 계수이며;
b는 알파 2 마크로글로불린의 혈청 수준과 관련된 계수이고;
c는 YKL-40의 혈청 수준과 관련된 계수이며;
d는 HbA1c의 혈청 수준과 관련된 계수이다. 따라서 NASH 점수는 중간 내지 높은 NASH 활성 또는 중증 NASH를 가질 가능성이다.
S가 역치 값 이상인 경우, 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가지는 것으로 분류되고/되거나 NASH에 대해 치료되어야 하거나, NASH에 대해 잠재적으로 치료되어야 하는 것으로 분류된다. 특수한 구현예에 따라서, S가 역치 값보다 더 낮은 경우, 대상체는 치료되어야 하거나 치료되지 않는 것으로, 특히 치료되지 않아야 하는 것으로 분류되고/되거나 대상체는 이의 낮은 NASH 활성 또는 중간 NASH를 관리하기 위한 식이 및/또는 생활방식 충고의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
특수한 구현예에서, 본 출원의 실험 부분에 기술된 바와 같은 부트스트랩 모델로부터 다음이 유도된다:
k는 -14.50 내지 -7.40 사이에 포함되는 수이고;
a는 1.38 내지 3.58 사이에 포함되는 수이며;
b는 0.02 내지 0.84 사이에 포함되는 수이고;
c는 5.98E-06 내지 2.08E-05 사이에 포함되는 수이며;
d는 0.07 내지 0.89 사이에 포함되는 수이고;
여기서 역치 값은 0.1895 내지 0.6089 사이를 포함하고 보다 특히 0.4255와 같다.
특수한 구현예에 따라서, NASH 점수 S가 0.1895 내지 0.6089 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
추가의 특수한 구현예에서, 상기 부트스트랩 모델로부터 다음이 여전히 유도된다:
k는 -10.95와 동일하고;
a는 2.48과 동일하며;
b는 0.43과 동일하고;
c는 1.34E-05와 동일하며;
d는 0.48과 동일하고;
여기서 상기 역치 값은 0.1895 내지 0.6089 사이에 포함되고, 보다 특히 0.4255와 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, 대상체는 NASH 점수 S가 0.1895 내지 0.6089 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다. 특수한 구현예에 따라서, AUC는 적어도 0.80과 동일하고, 바람직하게는 0.82이다.
추가의 특수한 구현예에서, 본 출원의 실험 부분에 기술된 바와 같은 중간 모델로부터 다음이 기원한다:
k는 -27.16 내지 -0.78 사이에 포함되는 수이고;
a는 0 내지 3.97 사이에 포함되는 수이며;
b는 0 내지 0.89 사이에 포함되는 수이고;
c는 0 내지 1.98E-05 사이에 포함되는 수이며;
d는 0 내지 0.97 사이에 포함되는 수이고;
여기서 상기 역치 값은 0.1421 내지 0.4556 사이에 포함되고, 보다 특히 0.3201과 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, NASH 점수 S가 0.1421 내지 0.4556 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
추가의 특수한 구현예에서,
k는 -11.03과 동일하고;
a는 2.59와 동일하며;
b는 0.38과 동일하고;
c는 1.21E-05와 동일하며;
d는 0.40과 동일하고;
여기서 상기 역치 값은 0.1421 내지 0.4556 사이에 포함되고, 보다 특히 0.3201과 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, 대상체는 NASH 점수 S가 0.1421 내지 0.4556 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다. 이러한 특수한 구현예에 따라서, AUC는 적어도 0.80과 동일하며, 바람직하게는 0.82이다.
혈청에서 평가되고 카피/μl(log10) 단위로 표시되는 miRNA에 관한 제1 변형의 마지막 구현예에서, 본 출원인은 또한 다른 바이오마커 중 일부의 측정된 값을 log10 값으로 전환하기로 결심하였다. 이는 상기 정의된 일부 마커의 측정된 값이 log10으로 표시됨을 의미한다. 따라서, 본 발명의 제1 국면의 이러한 마지막 구현예에 따라서, 상기 방법은:
- hsa-miR-34, 특히 hsa-miR-34a 및 보다 특히 miR-34a-5p, 또는 hsa-miR-122 및 특히 hsa-miR-122-5p, 또는 CK18-M30 또는 ALT 또는 AST, 및 적어도 하나의 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 간 손상의 마커의 혈청 수준을 측정하는 단계; 및
- 상기 결과를 수학적 알고리즘으로 조합하여 NASH 점수를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 이러한 제1 변형의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은:
- hsa-miR-34, 특히 hsa-miR-34a 및 보다 특히 miR-34a-5p, 또는 hsa-miR-122 및 특히 hsa-miR-122-5p, 또는 CK18-M30, 또는 ALT 또는 AST의 혈청 수준을 측정하는 단계,
- log10(HOMA)(항상성 모델 평가)의 수준, 절식 글루코즈 수준 또는 절식 글루코즈 혈청, 또는 log10(프럭토스아민), 또는 HBA1C, 또는 인슐린, 또는 C-펩타이드의 수준을 측정하는 단계,
- log10(YKL-40)의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
이러한 특수한 구현예에 따라서, 상기 점수는 카피/μl(log10) 단위로 표시한 has-miR-34a(특히 hsa-miR-34a-5p)의 혈청 수준과의 로지스틱 함수로 정의된다
여기서;
Y=k+a*A+b*B+c*C
여기서:
S는 NASH 점수이고;
A는 카피/μl(log10) 단위의 hsa-miR-34a(특히 hsa-miR-34a-5p)의 수준이며;
B는 log10(HOMA) 단위의 혈청 수준이고;
C는 log10(YKL-40)의 혈청 수준이며;
k는 로지스틱 함수의 상수이고;
a는 hsa-miR-34a(특히 hsa-miR-34a-5p)의 혈청 수준과 관련된 계수이며;
b는 log10(HOMA)의 혈청 수준과 관련된 계수이고;
c는 log(YKL-40)의 수준과 관련된 계수이다.
따라서 NASH 점수는 중간 내지 높은 NASH 활성 또는 중증 NASH를 가질 가능성이다. S가 역치 값 이상인 경우, 대상체는 NASH를 가지거나, 가지고 있거나, 잠재적으로 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지는 것으로 분류되고/되거나 NASH에 대해 치료되어야 하거나, NASH에 대해 잠재적으로 치료되어야 하는 것으로 분류된다. 특수한 구현예에 따라서, S가 역치 값보다 더 낮은 경우, 대상체는 치료되어야 하거나 치료되지 않는 것으로, 특히 치료되지 않아야 하는 것으로 분류되고/되거나 대상체는 이의 낮은 NASH 활성 또는 중간 NASH를 유지하기 위한 식이 및/또는 생활방식 충고의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
특수한 구현예에서, 본 출원의 실험 부분에 기술된 바와 같은 부트스트랩 모델로부터 다음이 유도된다:
k는 -25.68 내지 -13.34 사이에 포함되는 수이고;
a는 1.62 내지 3.78 사이에 포함되는 수이며;
b는 0.40 내지 2.52 사이에 포함되는 수이고;
c는 1.37 내지 3.61 사이에 포함되는 수이다.
특수한 구현예에 따라서, NASH 점수 S가 0.2392 내지 0.5907 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
추가의 특수한 구현예에서, 상기 부트스트랩 모델로부터 다음이 여전히 유도된다:
k는 -19.51과 동일하고;
a는 2.70과 동일하며;
b는 1.46과 동일하고;
c는 2.49와 동일하며;
여기서 상기 역치 값은 0.2392 내지 0.5907 사이에 포함되고, 보다 특히 0.5313와 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, NASH 점수 S가 0.2392 내지 0.5907 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다. 특수한 구현예에 따라서, AUC는 적어도 0.80과 동일하고, 바람직하게는 0.82이다.
환자의 제2 부류
본 발명의 내용에서 및 본 발명의 제2 변형에서, 환자의 제2의 소부류는 다음의 간 생검-기원한 등급을 나타내는 환자로서, 또는 이와 동일한 것으로 정의된다:
- 지방증 점수 ≥ 1
- 간세포 팽창 점수 ≥ 1
- 소엽의 염증 점수 ≥ 1
- NAS(NAFLD 활성 점수) ≥= 4 (NAS는 지방증 점수, 간세포 팽창 점수 및 소엽의 염증 점수의 합으로 정의된다).
본 발명의 방법은 hsa-miR-34 또는 이의 공선 변수 중 하나 및 적어도 하나의 다른 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 간 손상의 마커의 측정을 포함한다. 통계적 분석에 따라서, 바이오마커는 또한 하기 기술된 바와 같이 공선 시험(collinearity test)을 통해 시험되었다. 환자의 제2의 소부류를 확인(또는 진단)하기 위한 방법의 제1 변형에서, hsa-miR-34 수준, 특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p가 측정되며, 공선 변수는 hsa-miR-122, 특히 hsa-miR-122-5p, 및 hsa-miR-192, 특히 hsa-miR-192-5p로 이루어진 그룹에서 선택된다.
본 발명의 제2 변형의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은
- hsa-miR-34, 특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p의 수준을 측정하는 단계로서, 공선변수는 hsa-miR-122, 특히 hsa-miR-122-5p, 및 hsa-miR-192 및 특히 hsa-miR-192-5p로 이루어진 그룹에서 선택되는 단계;
- YKL-40의 수준을 측정하는 단계; 및 임의로
- 뇨 비중(Uri Spec Grav), 또는 뇨 크레아티닌의 수준을 측정하는 단계;
- 호염기성 세포의 수준을 측정하는 단계;
- HSCRP(고-민감성 C-반응성 단백질)의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
중간 모델로부터 기원한 본 발명의 제2 변형의 보다바람직한 구현예에서, 상기 방법은:
- hsa-miR-34, 특히 hsa-miR-34a 및 보다 특히 miR-34a-5p의 수준을 측정하는 단계,
- YKL-40의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제2 변형의 특수한 구현예에서, 본 발명의 NASH 점수는 상기 제공된 바와 같이 측정된 다음의 마커 수준으로부터 계산된다:
- hsa-miR-34a(보다 특히 miR-34a-5p)의 수준; 및
- YKL-40의 수준.
본 발명의 제2 변형의 추가의 특수한 구현예에서, 상기 점수는 로지스틱 함수로서 정의된다:
여기서:
Y=k+a*A+b*B
여기서:
S는 NASH 점수이고;
A는 Cq 단위의 hsa-miR-34a(특히 hsa-miR-34a-5p)의 수준이고;
B는 pg/ml 단위의 YKL-40의 수준이며;
k는 -116.08 내지 40.97 사이에 포함되는 수이고;
a는 -0.82 내지 0 사이에 포함되는 수이고;
b는 0 내지 1.88E-05 사이에 포함되는 수이고;
여기서 역치 값은 0.1387 내지 0.3481 사이에 포함되며, 보다 특히 0.2187과 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, NASH 점수 S가 0.1387 내지 0.3481 사이에 포함되는 역치 값 이상, 보다 특히 0.2187과 동일한 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 1을 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가지는 것으로 분류되고/되거나 NASH에 대해 치료되어야 하거나, NASH에 대해 잠재적으로 치료되어야 하는 것으로 분류된다.
S가 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 1을 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가지는 것으로 분류되고/되거나 NASH에 대해 치료되어야 하거나, NASH에 대해 잠재적으로 치료되어야 하는 것으로 분류된다. 특수한 구현예에 따라서, S가 역치 값보다 더 낮은 경우, 대상체는 치료되어야 하거나 치료되지 않는 것으로, 특히 치료되지 않아야 하는 것으로 분류되고/되거나 대상체는 이의 낮은 NASH 활성 또는 중간 NASH를 관리하기 위한 식이 및/또는 생활방식 충고의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
특수한 구현예에서, 본 출원의 실험 부분에 기술된 바와 같은 중간 모델로부터 다음이 유도되며:
k는 12.87과 동일하고;
a는 -0.42와 동일하며;
b는 8.160E-06과 동일하고,
여기서 역치 값은 0.1387 내지 0.3481 사이에 포함되고 보다 특히 0.2187과 같다.
특수한 구현예에 따라서, 대상체는 NASH 점수 S가 0.1387 내지 0.3481 사이에 포함되는 역치 값 이상, 보다 특히 0.2187과 동일한 경우 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 1을 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다. 이러한 특수한 구현예에 따라서, AUC는 적어도 0.68, 및 바람직하게는 0.70과 동일하다.
부트스트랩 모델로부터 기원한 본 발명의 이러한 제2 변형의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은
- hsa-miR-34, 특히 hsa-miR-34a, 및 보다 특히 hsa-miR-34a-5p의 수준을 측정하는 단계; 및
- YKL-40의 수준을 측정하는 단계,
- 뇨 비중의 수준을 측정하는 단계,
- 호염기성 세포의 수준을 측정하는 단계,
- HSCRP의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제2 변형의 특수한 구현예에서, 본 발명의 NASH 점수는 상기 제공된 바와 같이 측정된 다음의 마커 수준으로부터 계산된다:
- miR-34a(보다 특히 miR-34a-5p)의 수준; 및
- YKL-40의 수준; 및
- 뇨 비중의 수준; 및
- 호염기성 세포의 수준; 및
- HSCRP의 수준.
본 발명의 제2 변형의 추가의 특수한 구현예에서, 상기 점수는 로지스틱 함수로서 정의된다:
여기서:
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
여기서:
S는 NASH 점수이고;
A는 Cq 단위의 hsa-miR-34a (특히 hsa-miR-34a-5p)의 수준이고;
B는 pg/ml 단위의 YKL-40의 수준이며;
C는 뇨 비중(단위 없음)의 수준이고;
D는 10e9/L 단위의 호염기성 세포의 수준이고;
F는 mg/dL 단위의 HSCRP의 수준이며;
k는 -124.81 내지 1.13 사이에 포함되는 수이고;
a는 -0.91 내지 -0.25 사이에 포함되는 수이며;
b는 4.77e-06 내지 2.39e-05 사이에 포함되는 수이고;
c는 17.21 내지 141.51 사이에 포함되는 수이며;
d는 2.80 내지 60.74 사이에 포함되는 수이고;
f는 0.01 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
여기서 역치 값은 0.5791 내지 0.8269 사이를 포함하며, 보다 특히 0.7758과 동일하다.
특수한 구현예에서 따라서, NASH 점수 S가 0.5791 내지 0.8269 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가진 것으로 분류되거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 1을 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가지는 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로 분류된다.
S가 역치 값 이상인 경우 대상체는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 1을 가지거나, 또는 잠재적으로 가지는 것으로 분류되고/되거나 NASH에 대해 치료어야 하거나, NASH에 대해 잠재적으로 치료되어야 하는 것으로 분류된다. S가 역치 값보다 더 낮은 경우, 대상체는 치료되어야 하거나 치료되지 않는 것으로, 특히 치료되지 않아야 하는 것으로 분류되고/되거나 대상체는 이의 낮은 NASH 활성 또는 중간 NASH를 관리하기 위한 식이 및/또는 생활방식 충고의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
특수한 구현예에서, 본 출원의 실험 부분에 기술된 바와 같은 부트스트랩 모델로부터 다음이 유도된다:
k는 -61.84와 동일하고;
a는 -0.58과 동일하며;
b는 1.44E-05와 동일하고;
c는 79.36과 동일하며;
d는 31.77과 동일하고;
f는 0.12와 동일하며, 여기서 상기 역치 값은 0.5791 내지 0.8269 사이에 포함되고, 보다 특히 0.7758과 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, NASH 점수 S가 0.5791 내지 0.8269 사이에 포함되는 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 1을 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다. 특수한 구현예에 따라서, AUC는 적어도 0.75와 동일하고, 바람직하게는 0.77이다.
본 발명은 또한:
(i) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), 또는 hsa-miR-122 및 특히 hsa-miR-122-5p 또는 hsa-miR-192 및 특히 hsa-miR-192-5p로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커, 및
(ii) YKL-40; 및 임의로
(iii) 뇨 비중(Uri Spec Grav) 또는 뇨 크레아티닌; 호염기성세포; 및 HSCRP(고 민감성 C-반응성 단백질)의 수준을 측정하기 위한 수단을 포함하는 키트에 관한 것이고,
본 발명의 특수한 구현예에서, 상기 키트는:
(i) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), 및
(ii) YKL-40의 수준을 측정하기 위한 수단을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특수한 구현예에서, 상기 키트는:
(i) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), 및
(ii) YKL-40, 및
(iii) 뇨 비중, 및
(iv) 호염기성 세포, 및
(v) HSCRP의 수준을 측정하기 위한 수단을 포함한다.
본 발명의 키트는 상기 기술된 방법을 시행하는데 유용하고 또한 임의로 상기 방법을 시행하기 위한 지시사항을 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기 확인된 마커의 수준의 측정을 수행하기에 적절한 시약 및 완충제를 포함할 수 있다. 특히, 상기 키트는 정량화될 단백질에 대해 특이적인 항체, 및/또는 당해 분야에 잘 공지된 바와 같은, 마이크로-RNA 수준을 정량화하는데 유용한 프라이머를 포함할 수 있다.
환자의 제3 부류
본 발명의 내용에서 및 본 발명의 제3 변형에서, 환자의 제3 소부류는 다음의 간 생검-유도된 등급을 나타내는 환자로 정의되거나 이와 동일하다:
- 지방증 점수 ≥ 1
- 간세포 팽창 점수 ≥ 1
- 소엽의 염증 점수 ≥ 1
- NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 (NAS는 지방증 점수, 간세포 팽창 점수 및 소엽의 염증 점수의 합으로 정의된다)
- 섬유증 단계 = 1b, 1c, 2, 3 또는 4.
본 발명의 제3 변형의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은:
- hsa-miR-34, 특히 hsa-miR-34a 및 보다 특히 hsa-miR-34a-5p, 또는 hsa-miR-122 및 특히 hsa-miR-122-5p 또는 hsa-miR-192 및 특히 hsa-miR-192-5p의 수준을 측정하는 단계,
- CK18-M65, 또는 CK18-M30, 또는 AST 또는 ALT의 수준을 측정하는 단계 ??
- 뇨 β-NAG의 수준을 측정하는 단계, 및
- 백혈구, 또는 호중구의 수준을 측정하는 단계, 및
- 알파 2 마크로글로불린의 수준을 측정하는 단계, 및 임의로
- hsa-miR-200, 특히 hsa-miR-200a 및 보다 특히 hsa-miR-200a-3p의 수준을 측정하는 단계, 및
- 피브리노겐의 수준을 측정하는 단계, 및
- 환자의 신장을 측정하는 단계를 포함한다.
중간 방식으로부터 유도된 본 발명의 제3 변형의 보다 바람직한 구현예에서, 상기 방법은:
- hsa-miR-34, 특히 hsa-miR-34a 및 보다 특히 hsa-miR-34a-5p, 또는 hsa-miR-122 및 특히 hsa-miR-122-5p 또는 hsa-miR-192 및 특히 hsa-miR-192-5p의 수준을 측정하는 단계,
- CK18-M65, 또는 CK18-M30, 또는 AST 또는 ALT의 수준을 측정하는 단계 및
- 뇨 β-NAG의 수준을 측정하는 단계, 및
- 백혈구, 또는 호중구의 수준을 측정하는 단계, 및
- 알파 2 마크로글로불린의 수준을 측정하는 단계,
- hsa-miR-200, 특히 hsa-miR-200a 및 보다 특히 hsa-miR-200a-3p의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
중간 모델로부터 유도된 본 발명의 제3 국면의 특수한 구현예에서, 본 발명의 NASH 점수는 상기 제공된 바와 같이 측정된 다음의 마커로부터 계산된다:
- miR-34a(특히 miR-34a-5p)의 수준, 및
- CK18-M65의 수준, 및
- 뇨 β-NAG의 수준, 및
- 백혈구의 수준, 및
- 알파 2 마크로글로불린의 수준,
- hsa-miR-200a (특히 hsa-miR-200a-3p)의 수준.
본 발명의 제3 변형의 추가의 특별한 구현예에서, 상기 점수는 로지스틱 함수로 정의된다:
여기서:
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F+g*G
여기서:
S는 NASH 점수이고;
A는 Cq 단위의 특히 hsa-miR-34a (특히 hsa-miR-34a 및 보다 특히 hsa-miR-34a-5p)의 수준이며;
B는 U/L 단위의 CK18-M65의 수준이고;
C는 U/L 단위의 뇨 β-NAG의 수준이고;
D는 10e9/L 단위의 백혈구의 수준이며;
F는 g/L 단위의 알파 2 마크로글로불린의 수준이고;
G는 Cq 단위의 has-miR-200a (특히 hsa-miR-200a-3p)의 수준이며,
k는 -69.89 내지 57.02 사이에 포함되는 수이고;
a는 -1.09 내지 0 사이에 포함되는 수이며;
b는 0 내지 0.005 사이에 포함되는 수이고;
c는 0 내지 0.28 사이에 포함되는 수이며;
d는 0 내지 0.69 사이에 포함되는 수이고;
f는 0 내지 1.08 사이에 포함되는 수이며;
g는 -0.80 내지 0 사이에 포함되는 수이고;
여기서 역치 값은 0.0197 내지 0.1136 사이에 포함되고, 보다 특히 0.0592와 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, NASH 점수 S가 0.0197 내지 0.1136 사이에 포함되거나, 보다 특히 0.0592와 동일한 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 = 1b, 1c, 2, 3, 또는 4를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
S가 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 = 1b, 1c, 2, 3 또는 4를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가지는 것으로 분류되고/되거나 NASH에 대해 치료되어야 하거나, NASH에 대해 잠재적으로 치료되어야 하는 것으로 분류된다. 특수한 구현예에 따라서, S가 역치 값보다 더 낮은 경우, 대상체는 치료되어야 하거나 치료되지 않는 것으로, 특히 치료되지 않아야 하는 것으로 분류되고/되거나 대상체는 이의 낮은 NASH 활성 또는 중간 NASH를 관리하기 위한 식이 및/또는 생활방식 충고의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
특수한 구현예에서, 본 출원의 실험 부분에 기술된 바와 같은 중간 모델로부터 다음이 여전히 유도되며:
k는 24.98과 동일하고;
a는 -0.54와 동일하며;
b는 0.002와 동일하고,
c는 0.14와 동일하며,
d는 0.32와 동일하고,
f는 0.43과 동일하며,
g는 -0.37과 동일하고 여기서 역치 값은 0.0197 내지 0.1136 사이에 포함되고 보다 특히 0.0592와 같다.
특수한 구현예에 따라서, 대상체는 NASH 점수 S가 0.0197 내지 0.1136 사이에 포함되고, 보다 특히 0.0592와 동일한 역치 값 이상인 경우 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 = 1b, 1c, 2, 3 또는 4를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다. 이러한 특수한 구현예에 따라서, AUC는 적어도 0.80, 및 바람직하게는 0.82, 및 보다 바람직하게는 0.83과 동일하다.
부트스트랩 모델로부터 기원한 본 발명의 이러한 제3 변형의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은
- hsa-miR-34, 특히 hsa-miR-34a, 및 보다 특히 hsa-miR-34a-5p, 또는 hsa-mir-122 및 특히 hsa-miR-122 또는 hsa-miR-192 및 특히 hsa-miR-192-5p의 수준을 측정하는 단계; 및
- CK18-M65, 또는 CK18-M30, 또는 AST 또는 ALT의 수준을 측정하는 단계,
- 뇨 β-NAG의 수준을 측정하는 단계,
- 백혈구, 또는 호중구의 수준을 측정하는 단계,
- 알파 2 마크로글로불린의 수준을 측정하는 단계, 및
-피브리노겐의 수준을 측정하는 단계, 및
- 신장을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 브트스트랩 모델로부터 유도된 본 발명의 제3 변형의 특수한 구현예에서, 본 발명의 NASH 점수는 상기 제공된 바와 같이 측정된 다음의 마커 수준으로부터 계산된다:
- hsa-miR-34a, 특히 hsa-miR-34a-5p의 수준,
- CK18-M65의 수준, 및
- 뇨 β-NAG의 수준, 및
- 백혈구의 수준, 및
- 알파 2 마크로글로불린의 수준,
- 피브리노겐의 수준,
- 환자의 신장의 수준.
본 발명의 제3 변형의 추가의 특수한 구현예에서, 상기 점수는 로지스틱 함수로서 정의된다:
여기서:
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F+g*G+h*H
여기서:
S는 NASH 점수이고;
A는 Cq 단위의 hsa-miR-34a (특히 hsa-miR-34a-5p)의 수준이며;
B는 U/L 단위의 CK18-M65의 수준이고;
C는 U/L 단위의 뇨 β-NAG의 수준이며;
D는 10E9/L 단위의 백혈구의 수준이고;
F는 g/L 단위의 알파 2 마크로글로불린의 수준이며;
G는 g/L 단위의 피브리노겐의 수준이고,
H는 cm 단위의 신장의 수준이며,
k는 8.31 내지 35.79 사이에 포함되는 수이고;
a는 -0.96 내지 -0.26 사이에 포함되는 수이며;
b는 0.0006 내지 0.0034 사이에 포함되는 수이고;
c는 0.04 내지 0.24 사이에 포함되는 수이며;
d는 0.04 내지 0.52 사이에 포함되는 수이고;
f는 0.07 내지 0.89 사이에 포함되는 수이며;
g는 0.14 내지 1.28 사이에 포함되는 수이고;
h는 -0.08 내지 -0.001 사이에 포함되는 수이며; 여기서 상기 역치 값은 0.3373 내지 0.7260 사이에 포함되고, 보다 특히 0.6370과 동일하다.
특수한 구현예에 따라서, NASH 점수 S가 0.3373 내지 0.7260 사이에 포함되거나, 보다 특히 0.6370과 동일한 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 = 1b, 1c, 2, 3 또는 4를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고/되거나 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
S가 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 = 1b, 1c, 2, 3 또는 4를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가지는 것으로 분류되고/되거나 NASH에 대해 치료되어야 하거나, NASH에 대해 잠재적으로 치료되어야 하는 것으로 분류된다. 특수한 구현예에 따라서, S가 역치 값보다 더 낮은 경우, 대상체는 치료되어야 하거나 치료되지 않는 것으로, 특히 치료되지 않아야 하는 것으로 분류되고/되거나 대상체는 이의 낮은 NASH 활성 또는 중간 NASH를 관리하기 위한 식이 및/또는 생활방식 충고의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
특수한 구현예에서, 본 출원의 실험 부분에 기술된 바와 같은 중간 모델로부터 다음이 여전히 유도되며:
k는 22.05와 동일하고;
a는 -0.61과 동일하며;
b는 0.002와 동일하고,
c는 0.14와 동일하며,
d는 0.28과 동일하고,
f는 0.48과 동일하며,
g는 0.71과 동일하고.
h는 -0.04와 동일하며, 여기서 역치 값은 0.3373 내지 0.7260 사이에 포함되고, 보다 특히 0.6370과 같다.
특수한 구현예에 따라서, NASH 점수 S가 0.3373 내지 0.7260 사이를 포함하고, 보다 특히 0.6370와 동일한 역치 값 이상인 경우 대상체는 NASH를 가지거나, 또는 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 = 1b, 1c, 2, 3 또는 4를 가지고 있거나, 또는 잠재적으로 가진 것으로 분류되고 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다. 이러한 특수한 구현예에 따라서, AUC는 적어도 0.80, 및 바람직하게는 0.82, 및 보다 바람직하게는 0.84와 동일하다.
이러한 제3 변형에 따라서, 본 발명은 또한:
(i) hsa-miR-34, (특히 hsa-miR-34a 및 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122 및 특히 hsa-miR-122-5p 및 hsa-miR-192 및 특히 hsa-miR-192-5p의 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커, 및
(ii) CK18-M65, 또는 CK18-M30, 또는 AST 또는 ALT 및
(iii) 뇨 β-NAG, 및
(iv) 백혈구, 또는 호중구 및
(v) 알파 2 마크로글로불린, 및 임의로
(vi) hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a 및 보다 특히 hsa-miR-200a-3p), 피브리노겐 및 신장의 수준을 측정하기 위한 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 상기 키트는:
(i) hsa-miR-34 (특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 miR-34a-5p), 및
(ii) CK18-M65, 및
(iii) 뇨 β-NAG, 및
(iv) 백혈구, 및
(v) 알파 2 마크로글로불린 및
(vi) hsa-miR-200, (특히 hsa-miR-200a 및 보다 특히 hsa-miR-200a-3p)의 수준을 측정하기 위한 수단을 포함한다.
본 발명의 다른 특수한 구현예에서, 상기 키트는:
(i) hsa-miR-34 (특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 miR-34a-5p), 및
(ii) CK18-M65, 및
(iii) 뇨 β-NAG, 및
(iv) 백혈구, 및
(v) 알파 2 마크로글로불린, 및
(vi) 피브리노겐 및
(vii) 신장의 수준을 측정하기 위한 수단을 포함한다.
본 발명의 키트는 위에서 기술한 방법을 시행하는데 유용하고 또한 임의로 상기 방법을 시행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기 확인된 마커의 수준의 측정을 수행하기에 적절한 시약 및 완충제를 포함할 수 있다. 특히, 상기 키트는 당해 분야에 공지된 바와 같이, 정량화할 단백질에 대해 특이적인 항체, 및/또는 마이크로-RNA 수준을 정량하기에 유용한 프라이머를 포함할 수 있다.
다른 국면에 따라서 본 발명은 또한 환자를 분류하는 상이한 방법에 관한 것이다.
치료 방법
본 발명은 또한:
(a) 대상체에서 NASH를 진단하거나 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 측정하고, 대상체를 NASH에 대한 치료의 수용자 또는 비 수용자로서 분류하고, 약물 흡수를 기준으로 하여 의약 치료의 효능을 측정하고 NASH의 진행 또는 퇴행을 측정하며 상기 제공된 방법에 따라 환자의 결과를 측정하는 단계;
(b) 단계 (a)를 기준으로 하여 상기 대상체에게 NASH용 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 NASH를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한:
(a) 상기 정의한 바와 같은 분류 방법에 따라 상기 대상체를 분류하는 단계;
(b) 상기 대상체가 단계 (a)에 따른 치료의 수용자로서 분류되는 경우 상기 대상체에게 NASH용 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 NASH를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한:
(a) 상기 정의한 바와 같은 분류 방법에 따라 상기 대상체를 분류하는 단계;
(b) 상기 대상체가 단계 (a)에 따른 치료의 비 수용자로서 분류되는 경우 상기 대상체에게 식이 및/또는 생활방식 추천을 제공하는 단계를 포함하는, 대상체에서 NASH 활성을 관리하거나, NASH를 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 NASH를 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 같은 하나 이상의 항-NASH 화합물(들)을 투여함을 포함한다:
[화학식 I]
상기 화학식 I에서:
X1은 할로겐, R1, 또는 G1-R1 그룹을 나타내고;
A는 CH=CH 또는 CH2-CH2 그룹을 나타내며;
X2는 G2-R2 그룹을 나타내고;
G1 및 G2는 동일하거나 상이하고 산소 또는 황의 원자를 나타내며;
R1은 수소 원자, 치환되지 않은 알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 하나 이상의 할로겐 원자, 알콕시 또는 알킬티오 그룹, 사이클로알킬 그룹, 사이클로알킬티오 그룹 또는 헤테로사이클릭 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 나타내고;
R2는 적어도 하나의 -COOR3 그룹으로 치환된 알킬 그룹이고, 여기서 R3는 수소 원자이거나, 또는 하나 이상의 할로겐 원자, 사이클로알킬 그룹, 또는 헤테로사이클릭 그룹으로 치환되거나 치환되지 않는 알킬 그룹이며;
R4 및 R5는 동일하거나 상이하고, 하나 이상의 할로겐 원자, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클릭 그룹으로 치환되거나 치환되지 않은 알킬 그룹을 나타낸다.
NASH의 치료를 위한 이러한 방법의 특수한 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시 페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-이소프로필옥시 카보닐디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-3급부틸옥시카보닐디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸페닐]-3-[3,5-디메틸-4-3급부틸옥시카보닐 디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸 옥시페닐]-3-[3,5-디메틸-4-3급부틸옥시카보닐디메틸메틸옥시 페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸옥시페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸 옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 2-[2,6-디메틸-4-[3-[4-(메틸티오)페닐]-3-옥소-프로필]페녹시]-2-메틸프로파노산, 및 2-[2,6-디메틸-4-[3-[4-(메틸티오)페닐]-3-옥소-프로필]페녹시]-2-메틸-프로파노산 이소프로필 에스테르; 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 본 발명의 추가의 특수한 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시 페닐]프로프-2-엔-1-온 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다.
본 발명의 NASH의 치료를 위한 방법에서 사용될 수 있는 다른 화합물은 제한없이 다음의 부류 및 본원에서 이후의 구체적인 화합물로부터 선택된 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 예시적이고, 비-제한적인 항-NASH 제제는 다음을 포함한다:
- 아세틸-CoA 카복실라제 억제제;
- 항-LPS 항체;
- 정점의 나트륨-공의존성 담즙산 수송인자(transporter) 억제제;
- 생물활성 지질;
- 칸나비노이드 CB1 수용체 길항제;
- 카스파제 억제제;
- 카텝신 억제제;
- CCR 길항제;
- 디아실글리세롤-O-아세틸트랜스퍼라제 (DGAT) 억제제
- 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP4) 억제제;
- 이중 NOX (NADPH 옥시다제) 1&4 억제제;
- 세포외 매트릭스 단백질 조절인자;
- 스테아로일 CoA 데세투라제-1 억제제/지방산 담즙산 접합체(FABAC);
- 파르네소이드 X 수용체(FXR) 작용제;
- 섬유아세포 성장 인자 19(FGF-19) 재조합체;
- 섬유아세포 성장 인자 21(FGF-21) 작용제;
- 갈렉틴 3 억제제;
- 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 동족체;
- G-단백질 커플링된 수용체(GPCR) 조절인자;
- 인테그린 억제제;
- 류코트리엔(LT)/포스포디에스테라제(PDE)/리폭시게나제(LO) 억제제;
- 마크롤라이드;
- miRNA 길항제;
- 모노클로날 항체;
- mTOR 조절인자;
- 핵 수용체 리간드;
- P2Y13 단백질 작용제(agonist);
- 프로테아제-활성하된 수용체(PAR)-2 길항제;
- 단백질 키나제 조절인자;
- PPAR 알파 작용제;
- PPAR 감마 작용제;
- PPAR 델타 작용제;
- PPAR알파/감마 작용제;
- PPAR알파/델타 작용제;
- PPAR 감마/델타;
- PPAR 알파/감마/델타 작용제 또는 PPARpan 작용제;
- Rho-관련된 단백질 키나제 2 (ROCK2) 억제제;
- 시그날-조절 키나제 1 (ASK1) 억제제;
- 나트륨-글루코즈 수송인자(SGLT) 2 억제제;
- 스테아릴 CoA 데세투라제-1 억제제/지방산 담즙산 접합체;
- 갑상샘 수용체 β(THRβ) 작용제;
- 톨 유사 수용체(Toll Like Receptor) 4 (TLR-4) 길항제;
- 타이로신 키나제 수용체(RTK) 조절인자;
- 혈관 부착 단백질-1 (VAP-1) 억제제 및
- 비타민 D 수용체 (VDR) 작용제.
다른 항-NASH 제제는 KB-GE-001 및 NGM-386 및 NGM-395 및 NC-10 및 TCM-606F를 포함한다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "아세틸-CoA 카복실라제 억제제"는 GS-0976; ND-654; AC-8632; PF05175157을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "항-LPS 항체"는 IMM-124-E를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "정점의 나트륨-공의존성 담즙산 수송인자 억제제는 A-4250; 볼릭시바트; 마랄릭시바트(이전에는 SHP-625); GSK-2330672; 엘로빅시바트; CJ-14199를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "생활성 리간드"는 5-하이드록시에이코사펜타에노산(15-HEPE, DS-102)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "칸나비노이드 CB1 수용체 길항제"는 나마키주마브; GRC-10801; MRI-1569; MRI-1867; DBPR-211; AM-6527 : AM-6545; NESS-11-SM; CXB-029; GCC-2680; TM-38837; Org-50189; PF-514273; BMS-812204; ZYO-1; AZD-2207; AZD-1175; 오테나반트; 이비피나반트; 수리나반트; 리모나반트; 드리나반트; SLV-326; V-24343; O-2093를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "카스파제 억제제"는 엠리카산; 벨나카산; 니보카산; IDN-7314; F-573; VX-166; YJP-60107; MX-1122; IDN-6734; TLC-144; SB-234470; IDN-1965; VX-799; SDZ-220-976; L-709049를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "카텝신 억제제"는 VBY-376; VBY-825; VBY-036; VBY-129; VBY-285; Org-219517; LY3000328; RG-7236; BF/PC-18을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "CCR 길항제"는 케니크리비록(CCR2/5 antagonist); PG-092; RAP-310; INCB-10820; RAP-103; PF-04634817; CCX-872를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "디아실글리세롤-O-아세틸트랜스퍼라제 억제제"는 IONIS-DGAT2Rx 이전에는 ISIS-DGAT2Rx; LY-3202328; BH-03004; KR-69530; OT-13540; AZD-7687; ABT-046을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "디펩티딜 펩티다제 IV 억제제"는 에보글립틴; 비다글립틴; 포타글립틴; 알로글립틴; 삭사글립틴; 틸로글립틴; 아나글립틴; 시타글립틴; 레타글립틴; 멜로글립틴; 고소글립틴; 트렐라글립틴; 테넬리글립틴; 두토글립틴; 리나글립틴; 게미글립틴; 요글립틴; 베타글립틴; 이미글립틴; 오마리글립틴; 비다글립틴; 데나글립틴을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "이중 NOX(NADPH 옥시다제) 1&4 억제제"는 GKT-831(이전에는 GKT137831); GKT-901을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "세포외 매트릭스 단백질 조절인자"는 CNX-024; CNX-025; SB-030을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "파르네소이드 X 수용체 (FXR) 작용제"는 오베티콜산; GS-9674; LJN-452; EDP-305; AKN-083; INT-767; GNF-5120; LY2562175; INV-33; NTX-023-1; EP-024297; Px-103; SR-45023을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "섬유아세포 성장 인자 19 (FGF-19) 재조합체"는 NGM-282를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "섬유아세포 성장 인자 21(FGF-21) 작용제"는 PEG-FGF21 이전에는 BMS-986036; YH-25348; BMS-986171; YH-25723; LY-3025876; NNC-0194-0499를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "갈렉틴 3 억제제"는 GR-MD-02; TD-139; ANG-4021; Galectin-3C; LJPC-201; TFD-100; GR-MD-03; GR-MD-04; GM-MD-01; GM-CT-01; GM-CT-02; Gal-100; Gal-200을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 유사체"는 세마글루타이드; 리라글루타이드; 엑세나타이드; 알비글루타이드; 둘라글루타이드; 릭시세나타이드; 록세나타이드; 에프페글레나타이드; 타스포글루타이드; MKC-253; DLP-205; ORMD-0901을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 조절인자"는 CNX-023을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "인테그린 억제제"는 Pliant Therapeutic의 인테그린 억제제; Indalo Therapeutics의 인테그린 억제제; 세인트 루이스 대학(St Louis University)의 인테그린 억제제; ProAgio; GSK-3008348을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "류코트리엔/포스포디에스테라제/리폭시게나제 억제제"는 티펠루카스트(이전에는 MN-001); 코메루카스트; 술루카스트; 마실루카스트; 자피를루카스트; 프라늘루카스트; 몬텔루카스트; 게밀루카스트; 베를루카스트; 알클루카스트; 포빌리카스트; 시날루카스트; 이랄루카스트를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "마크롤라이드"는 솔리트로마이신; 아지트로마이신; 에리트로마이신을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "miRNA 길항제"는 RG-125(이전에는 AZD4076); RGLS-5040; RG-101; MGN-5804; MRG-201을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "메탈로프로테아제-9(MMP-9) 자극인자"는 Elastomics Ab의 MMP-9 자극인자를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 베르틸리무마브; NGM-313; IL-20 표적화 mAbs; 프레솔리무마브(항TGFβ)(이전에는 GC1008); 티몰루마브(이전에는 BTT-1023); 나마키주마브; 오말리주마브; 라니비주마브; 베바키주마브; 레브리키주마브; 에프라투주마브; 펠비주마브; 마투주마브; 모날리주마브; 레슬리주마브; 이네빌리주마브를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "mTOR 조절인자"는 MSDC-0602; SVP-시롤리무스와 함께 동시-투여된 AAV 유전자 치료요법을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "핵 수용체 리간드"는 DUR-928(이전에는 DV 928)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "P2Y13 단백질 작용제"는 CER-209를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)-2 길항제"는 PZ-235; NP-003을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "단백질 키나제 조절인자"는 CNX-014; MB-11055; ALF-1; 만기페린; 암렉사녹스; GS-444217; REG-101; 발린을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "PPAR 알파 작용제"는 페노피브레이트, 시프로피브레이트, 페마피브레이트, 겜피브로질, 클로피브레이트, 비니피브레이트, 클리노피브레이트, 클로피브르산, 니코피브레이트, 피리피브레이트, 플라피브라이드, 로니피브레이트, 테오피브레이트, 토코피브레이트, SR10171을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "PPAR 감마 작용제"는 피오글리타존, 중수소화된 피오글리타존, 로시글리타존, 에파투타존, ATx08-001, OMS-405 , CHS-131, THR-0921, SER-150-DN, KDT-501, GED-0507-34-Levo, CLC-3001, ALL-4를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "PPAR 델타 작용제"는 GW501516 (Endurabol 또는 ({4-[({4-메틸-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-1,3-티아졸-5-일}메틸)설파닐]-2-메틸페녹시}아세트산)) 또는 MBX8025(셀라델파르(Seladelpar) 또는 {2-메틸-4-[5-메틸-2-(4-트리플루오로메틸-페닐)-2H-[l,2,3]트리아졸-4-일메틸실파닐]-페녹시}-아세트산) 또는 GW0742 ([4-[[[2-[3-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-4-메틸-5-티아졸릴]메틸]티오]-2-메틸 페녹시]아세트산) 또는 L165041 또는 HPP-593 또는 NCP-1046을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "PPAR 알파/감마 작용제"(또는 글리타자르로 명명됨)는 사로글??자르, 알레글리타자르, 무라글리타자르, 테사글리타자르, DSP-8658을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
엘라피브라노르 외에도, 예시적인 PPAR 알파/델타 작용제는 T91365를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "PPAR 감마/델타 작용제"는접합된 리놀레산(CLA), T3D-959를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "PPAR 알파/감마/델타 작용제" 또는 "PPARpan 작용제"는 IVA337 또는 TTA(테트라데실티오아세트산) 또는 바바키닌 또는 GW4148 또는 GW9135, 또는 베자피브레이트 또는 로베글리타존, 또는 CS038을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "Rho-관련된 단백질 키나제 2 (ROCK2) 억제제"는 KD-025; TRX-101; BA-1049; LYC-53976; INS-117548; RKI-1447을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "시그날-조절 키나제 1 (ASK1) 억제제"는 GS-4997을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "나트륨-글루코즈 수송(SGLT) 2 억제제"는 레모글리플로진; 다파글리플로진; 에파글리플로진; 에르투글리플로진; 소타글리플로진; 이프라글리플로진; 티아나글리플로진; 카나글리플로진; 토포글리플로진; 자나글리플로진; 벡사글리플로진; 루세오글리플로진; 세르글리플로진; HEC-44616; AST-1935; PLD-101을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "스테아릴 CoA 데사투라제-1 억제제/지방산 담즙산 접합체는 아람콜; GRC-9332; 스테암콜; TSN-2998; GSK-1940029; X엔-801을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "갑상샘 수용체 β(THRβ) 작용제"는 VK-2809; MGL-3196; MGL-3745; SKL-14763; sobetirome; BCT-304; ZYT-1; MB-07811; 에프로티롬을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "톨 유사 수용체 4 (TLR-4) 길항제"는 날트렉손; JKB-121; M-62812; 레사토르비드; 덴드로필린; CS-4771; AyuV-1; AyuV-25; NI-0101; EDA-HPVE7; 에리토란을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "타이로신 키나제 수용체 (RTK) 조절인자는 CNX-025; KBP-7018을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "혈관 부착 단백질-1 (VAP-1) 억제제"는 PXS-4728A; CP-664511; PRX-167700; ASP-8232; RTU-1096; RTU-007; BTT-1023을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라서, 본원에 사용된 용어 "비타민 D 수용체 (VDR) 작용제"는 칼시페롤, 알파칼시돌; 1,25-디하이드록시비타민 D3; 비타민 D2; 비타민 D3; 칼시트리올; 비타민 D4; 비타민 D5; 디하이드로치스테롤; 칼시포트리올; 타칼시톨 1,24-디하이드록시비타민 D3; 파리칼시톨을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 바이러스 간염(HBV, HCV,...), 알코올성 지방간염, 담즙 질환(주요 담즙 담관염, 주요 경화성 담관염, 자가면역 간염, 윌슨 질환(Wilson's disease), 알파1 항트립신 결핍증)과 같은 다른 간 질환, 및 보다 특히 섬유성 간 질환에 전념한다.
실시예
물질 및 방법
샘플 수집 및 분석
임상 연구
임상 시험(NASH (GFT505-212-7 - NCT01694849)에 있어서 제2상 GOLD엔-505 시험은 비-알코올성 지방간염(NASH)을 앓고 있는 환자에서 지방간염에 있어 매일 1회 엘라피브라노르 (1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시 페닐]프로프-2-엔-1-온)의 효능 및 안전성을 평가하기 위한 다중심의, 무작위화된, 이중 맹검의, 위약-조절된 연구이다.
간 생검은 다른 원인론의 간 질환의 적절한 배제 후 NASH의 진단을 확인하기 위해 수행되었다. NASH는 무작위화된 6개월 전에 간 생검에 의해 평가된 지방간염으로서 진단하였다. 지방간염 확인은 간 생검의 중심 판독을 기준으로 하였다. NASH 환자는 지방증 점수 ≥ 1 및 간세포 팽창 ≥ 1 및 소엽의 염증 ≥ 1을 포함하는 NAS ≥ 3으로 정의하였다. 연구는 각각의 참여 중심에서 적절한 규제 기관에 의해 승인되었고 모든 환자는 의학적 조사에서 참여에 대한 동의서를 제공하였다.
NASH에서 제2상 GOLD엔-505 시험으로부터의 혈장 샘플을 NASH의 가장 강력하고 유의적인 마커(들)을 확인하기 위해 사용하였다.
간 생검을 수행하여 다른 원인론의 간 질환의 적절한 배제 후 NASH의 진단을 확인하였다.
NASH는 무작위화하기 전 6개월 내에 간 생검에 의해 평가된 지방간염으로 진단하였다. 지방간염 확인은 간 생검의 중심 판독을 기준으로 하였다.
본 연구는 각각의 참여 중심에서 적절한 규제 기관에 의해 승인되었고 모든 환자는 의학적 연구에서 참여에 대한 동의서를 제공하였다.
혈액 샘플링 및 실험실적 시험
혈액 샘플을 중심 실험실 프로토콜 및 Manual- Genfit - GFT505-212-7에 따라 수집하였다.
연구 프로토콜에 따라서, 다음의 분석을 수행하였다.
혈액학은 헤모글로민, 헤마토크릿, RBC 수, 백혈구, 차등적인 백혈구 수(호중구, 림프구, 호산구, 단핵구, 호염기성 세포 -abs. 및 % 값), 혈소판 및 망상적혈구를 포함한다.
생화학 패널 I은 혈장 글루코즈, 트리글리세라이드(TG), 크레아티닌, 크레아티닌 청소, 감마-글루타밀트랜스퍼라제(GGT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 크레아틴 포스포키나제(CPK), 알칼린 포스파타제, 티로이드 자극 호르몬(TSH) 및 HbA1c을 포함한다.
생화학 패널 II는 혈장 글르코즈, 크레아티닌, 크레아티닌 청소, 총 단백질, 알부민, 나트륨, 칼륨, 클로라이드, 칼슘, 요산, 혈액 우레아 질소(BUN)로서 발현된 우레아, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 감마-글루타밀트랜스퍼라제(GGT), 알칼린 포스파타제, 크레아틴 포스포키나제(CPK), 빌리루빈 총, 빌리루빈 접합된, C-반응성 단백질(hsCRP), AST/ALT 비 및 HbA1c를 포함한다.
뇨분석은 다음을 포함한다:
- 딥스틱 분석(Dipstick analysis)(비중, pH, RBC, 백혈구, 글로코즈, 단백질, 케톤, 빌리루빈, 우로빌리노겐 및 니트레이트),
- RBC, WBC, 캐스트(cast), 결정, 세균, 상피 세포 및 효모를 포함하는 현미경 분석.
- 화학 분석(알부민 및 크레아티닌).
혈청학은 HIV ab I/ II, HCV ab, HCV RNA(HCV RNA 방문 샘플의 수용시 및 HCV Ab에 대해 '반응성' 또는 '규정할 수 없는' 결과의 경우에만 시험하였다) 및 HbsAg를 포함한다.
지질 패널(LIPID PANEL)은 트리글리세라이드(TG), 총 콜레스테롤, 비 HDL-C(계산), 고-밀도 지단백질 콜레스테롤(HDL-C), 저 밀도 지단백질(LDL-C) (계산), 계산된 초 저밀도 지단백질 콜레스테롤(VLDL-C)(계산), 아포지단백질 AI(ApoAI) 및 아포지단백질 B(ApoB)을 포함한다.
뇨 화학(URINE CHEMISTRY)은 알파-1-마이크로글로불린, 베타-N-아세틸글루코스아미다제(베타-NAG) 및 호중구-젤라티나제 관련 리포칼린(N-Gal)을 포함한다.
안전성 마커(SAFETY MARKER)는 호모시스테인, NT-ProBNP, 트로포닌 T, 시스타틴 C, 및 베타2-마이크로글로불린을 포함한다.
혈당 및 다른 지질 매개변수(GLYCEMIC 및 OTHER LIPIDIC PARAMETER)는 렙틴, 인슐린, 항상성 모델 평가(HOMA-IR), 혈청 글루코즈(HOMA-IR의 계산을 위해), 프럭토스아민, C-펩타이드 및 유리 지방산(FFA)을 포함한다.
염증성 마커(INFLAMMATORY MARKER)는 헵토글로빈, 피브리노겐, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터루킨 6(IL-6) 및 플라스미노겐 활성화제 억제제 1(PAI-1) Ag (시트레이트)을 포함한다.
간 마커(LIVER MARKER)는 사이토케라틴-18(CK18)(M65 & M30), 아디노펙틴, 페리틴, 알파2 마크로글로불린, FGF19 & FGF21, 하이알루론산(Advia centaur, 벨기에 Siemens에 의해 생산되고 Genfit로 완전히 위탁됨), 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드(PIIINP) (Advia centaur, 벨기에 Siemens에 의해 생산된 시약) 및 매트릭스 메탈로프로테아제-1(TIMP-1)의 조직 억제제(Advia centaur, Siemens에 의해 생산된 시약)을 포함한다.
각각의 생화학적 검정에 대한 방법, 장치 및 제조업자의 목록은 본 표에 기록되어 있다:
샘플 수집 및 저장
본 바이오마커 연구에 사용된 혈액 샘플은 치료 기간 전에 505.212.7 연구의 환자로부터 채혈하였다. 추가의 샘플의 수집, 저장 및 사용에 대한 서면 동의서를 모든 환자로부터 입수하였다.
시트레이트를 함유하는 튜브 2.7mL에 수집된 혈액을 수집 15분내에 1,500xg 에서 15분 동안 원심분리함으로써 혈액 세포로부터 세포-유리된 혈장을 분리하여 가공하였다. 상층액 혈장을 새로운 튜브로 이전시켰다. 튜브를 -70℃에서 유지시켰다. RNA 추출을 진행하기 위해, 이후 혈장 튜브를 13,000xg에서 2분 동안 원심분리하여 펠렛화하고 혈소판을 제거하였다. 상층액 혈소판-유리된 혈장을 새로운 튜브로 이전시키고, 액체 질소 속에서 동결시키고 -80℃에 저장하였다.
총 RNA 추출 및 시트레이트화된 혈장 속에서 miRNA의 정량화
보존된 miRNA를 지닌 총 RNA를 400μl의 혈소판-유리된 혈장으로부터 miRNeasy 추출 키트(miRNeasy Serum/Plasma Kit(제품 번호 217184)) 및 제조업자의 지시에 따라 1:5의 혈장/QIAzol 비를 사용하여 추출하였다. 씨.엘레간스(C. elegans) 속에서 합성 스파이크된 miR-39를 RNA 추출 전에 RNA 추출 공정의 내부 대조군으로서 샘플[3,125 fmoles]에 가하였다. 용출을 18μl의 용출 완충액 속에서 수행하였다. 성숙한 miRNA의 발현을 제조업자의 지시에 따라 Taqman miRNA qRT-PCR 검정: TaqMan MicroRNA Reverse transcription Kit(참고: 4366596, Applied Biosystems, 캘리포니아주 칼스바드 소재), TaqMan MicroRNA Assay 20X(Ref: 4440887, Applied Biosystems) 및 TaqMan Universal Master Mix II(참고: 4440040, Applied Biosystems)을 사용하여 검출하였다.
역 전사는 GeneAmp® PCR System 9700 열 순환기(Ref: 200005, Applied Biosystems)를 16℃에서 30분 동안에 이어서 42 ℃에서 30분 동안 및 85℃에서 5분 동안에 이어 4℃에 유지시키는 순환 조건으로 사용하여 수행하였다. 역 전사는 4개의 miRNA 특이적인-역 프라이머를 사용하여 멀티플렉스화함으로써 RNA 샘플을 보존하였다. 정량적 PCR을 CFX96TM Real-Time System(C1000 TouchTM 열 순환기, BioRad)를 95℃에서 10분 동안에 이어 95℃에서 15초 동안 및 60℃에서 60초 동안 총 50회 주기로 및 30℃에서 30초로 사용하여 수행하였다. 잠재적인 목적의 miRNA에 대한 특이적인 프라이머의 서열은 다음의 표 2에 따라 선택하였다.
표 2: 시험한 miRNA의 서열
알고리즘의 구축에 사용된 데이타는 Cq 양식이었다. Cq 측정 방식은 회귀법(Regression)이었다.
총 RNA 추출 및 혈청 속에서 miRNA의 정량화
보존된 miRNA를 지닌 혈청 총 RNA를 100μl의 혈청으로부터 miRVanaParis 추출 키트(AM1556, Ambion)에 의해 제조업자의 지시에 따라 추출하였다. 씨. 엘레간스에서 합성 스파이크된 miR-39를 RNA 추출 공정의 내부 대조군으로서 RNA 추출 전에 샘플[3,125 fmoles](MSY0000010, Qiagen)에 첨가하였다. 용출을 100μl의 용출 완충액 속에서 수행하였다.
성숙한 miRNA의 발현을 제조업자의 지시에 따라 Taqman miRNA qRT-PCR 검정: TaqMan MicroRNA Reverse transcription Kit (참고: 4366596, Applied Biosystems, 캘리포니아주 칼스바드 소재), TaqMan MicroRNA Assay 20X (참고: 4440887, Applied Biosystems) 및 TaqMan Universal Master Mix II (참고: 4440040, Applied Biosystems)을 사용하여 검출하였다.
역 전사를 GeneAmp® PCR System 9700 열 순환기(참고: 200005, Applied Biosystems)를 16℃에서 30분 동안에 이어 42℃에서 30분 및 85℃에서 5분 후 4℃에서 유지하는 주기 조건을 사용하여 수행하였다. 역 전사를 4개의 miRNA 특이적인-역 프라이머를 사용하여 멀티플렉스하여 귀중한 RNA 샘플을 보존하였다.
정량적 PCR을 CFX96TM Real-Time System(C1000 TouchTM Thermal Cycler, BioRad)를 95℃에서 10분 동안에 이어 95℃에서 15초 및 60℃에서 60초의 총 50회 주기 및 30℃에서 30초의 주기 조건을 사용하여 수행하였다.
목적한 miRNA에 대한 구체적인 프라이머의 서열을 하기 표에 따라 선택하였다:
합성 hsa-miRNA(Integrated DNA Technologies)를 3.125fmol/mL에서 희석시키고 5μL를 혈청 샘플로부터 추출된 RNA와 동시에 역 전사에 사용하였다. 생성물을 일련 희석시키고 PCR을 모든 샘플(표준 및 혈청-기원한 RNA)에서 수행하였다. 표준 곡선을 2회 수행하고 Cq 데이타를 카피/μL의 단위로 전환하는데 사용하였다. Cq 측정 방식은 회귀법이었다. 알고리즘의 구축에 사용된 데이타는 Log10(카피/μL의 혈처) 양식이었다.
통계적 분석
대상 및 정의
이들 분석의 목적은 치료하여야 할 NASH 환자의 확인과 관련될 수 있는 바이오마커를 발견하는 것이었다. 치료될 환자(TBT)는 본 연구의 상이한 부분에 따라 차등적으로 정의된다.
본 발명의 제1 국면에 따라, TBT는 다음과 같이 정의된다:
- 지방증 점수 ≥ 1
- 간세포 팽창 점수 ≥ 1
- 소엽의 염증 점수 ≥ 1
- NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 (NAS는 지방증 점수, 간세포 팽창 점수 및 소엽의 염증 점수의 합으로 정의된다)
- 섬유증 단계 ≥ 2 (예를 들어, 섬유증 단계는 2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일하다).
본 발명의 제2 국면에 따라, TBT는 다음과 같이 정의된다:
- 지방증 점수 ≥ 1
- 간세포 팽창 점수 ≥ 1
- 소엽의 염증 점수 ≥ 1
- NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 (NAS는 지방증 점수, 간세포 팽창 점수 및 소엽의 염증 점수의 합으로 정의된다)
- 섬유증 단계 ≥ 1 (예를 들어, 섬유증 단계는 1, 2, 3 또는 4와 동일하다).
본 발명의 제3 국면에 따라, TBT는 다음과 같이 정의된다:
- 지방증 점수 ≥ 1
- 간세포 팽창 점수 ≥ 1
- 소엽의 염증 점수 ≥ 1
- NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 (NAS는 지방증 점수, 간세포 팽창 점수 및 소엽의 염증 점수의 합으로 정의된다)
- 섬유증 단계 = 1b, 1c, 2, 3 또는 4.
다른 환자는 치료되지 않을 것으로 기술되었다(NTBT). 분석을 위해, TBT 환자는 반응 변수에서 1로 분류하고 NTBT는 0으로 분류하였다. 위에서 나타낸 바와 같이, 설명이 되는 변수는 인구학(연령, 성별, 인종), 지역(연구 센터, 국가, 대륙) 또는 의학상태(당뇨병) 기록과 함께, 혈액(혈액학, 생화학, 응고, 간 마커, 순환하는 miRNA) 또는 뇨(딥스틱, 침강) 샘플 속에서 측정된 광범위한 바이오마커를 포함하였다.
데이타세트 관리
이러한 연구에 사용된 데이타세트는 Golden-505 시험으로부터 왔으며 초기에는 274명의 환자 및 121개의 변수로 구성되었다. 데이타세트 관리는 다음 단계를 포함하였다:
1. miRNA 측정하지 않은 환자의 제거
2. 10개 이상 잃어버린 값이 있는 변수의 제거
3. 극한 값을 지닌 환자 및 나머지 잃어버린 값을 지닌 28명의 환자의 제거. 212명의 환자에서 수행된 혈청, 및 설명적인 변수 사이의 공선성을 시험하는데 사용된 112개의 변수에 관한 방법을 제외하고는, 본 발명의 모든 방법에 대해 216명의 환자로 데이타세트를 생성하였다.
공선성의 시험
피어슨 상관관계(Pearson correlation)를 정량적 변수 사이에서 2개씩 계산하였다. 2개의 변수가 혈장 miRNA를 사용한 분석에 대해 0.7 또는 혈청 miRNA를 사용한 분석에 대해 0.6을 초과한 상관관계를 나타내는 경우, 환자 TBT를 정의하는 반응 변수와 관련하여 이들의 평균에 있어서의 차이의 일변량 시험을 수행하였다. 선택된 변수는 보다 유의적이었다. 공선 및 선택된 변수는 표 3 내지 표 8에 나타낸다. 이들 변수는 환자 정의에 의존적이므로 환자마다 하나의 범주로부터 변하는데 민감하다.
중간 모델
중간 모델링 공정은 TBT/NTBT 환자 중 2/3에 상응하는 훈련 세트 및 TBT/NTBT 환자 중 나머지 1/3에 상응하는 확인 세트의 데이타세트의 샘플링으로 시작한다. 이러한 샘플링은 수백만 회로 무작위로 수행하며 훈련 및 확인 세트들 사이에 상동성을 나타내는 샘플(2개 세트 사이의 모든 설명적인 변수에 있어서 유의적인 차이는 없다)을 분석을 위해 유지시킨다. 설명적인 변수(바이오마커)와 관련하여 반응 변수(TBT/NTBT 환자로 정의함)의 로지스틱 생성된 선형 모델을 각각의 훈련 세트에서 계산한다. 각각의 훈련 세트 모델에서, 역 가변 선택을 수행하고 최적 모델은 최저 아카이케 지수 기준(Akaike Index Criterion: AIC)에 의해 발견된다. 따라서, 모든 설명적인 변수는 각각의 훈련 세트에 대해 모델 계수를 갖는다. 중간 알고리즘은 0 및 이들의 상응하는 계수와 상이한 중간 계수를 나타내는 변수를 사용하여 구축한다. 이러한 알고리즘은 각각의 확인 세트에서 확인(ROC, AUC, 최적의 역치, 총 정밀도, 민감성, 양성의 예측 값 및 음성의 예측 값)하고 중간의 최적 역치를 수득한다. 부트스트랩 모델과의 비교를 위해, 중간 모델을 또한 확인을 위한 전체 데이타세트에 적용한다.
부트스트랩 모델
부트스트랩 모델링 공정에서, 설명적인 변수(바이오마커)와 관련하여 반응 변수(TBT/NTBT 환자를 정의함)의 로지스틱 생성된 선형 모델을 전체 데이타세트로부터 모든 환자에 대해 계산한다. 역 가변 선택을 수행하고 최적의 알고리즘을 AIC를 사용하여 선택한다. 이후에, 이러한 최적 알고리즘으로부터의 가변 계수의 유의성을 1000개의 부트스트랩 샘플을 사용하는 알고리즘을 수행하여 시험한다. 0을 제외한 95% 신뢰 구간을 나타낸 계수는 유의적인 것으로 고려된다. 이후에, 알고리즘은 ROC, AUC, 최적 역치, 총 정밀도, 민감성, 특이성, 양성의 예측 값 및 음성의 예측 값을 계산함으로써 확인한다.
다른 NASH 점수매김 방법과의 비교
NASH 점수를 확립하기 위한 방법은 문헌에 이미 기술되었다:
- NAFLD 섬유증 점수(안굴로 지수: Angulo Index) (Angulo et al, 2007)
- ELF(Guha et al, 2008)(또한 참고: ELF 명세서 시이트http://www.healthcare.siemens.com/clinical-specialities/liver-disease/elf-test-now-avail)
- 피브로시험(Ratziu et al, 2006)
- 피브로미터(Cales et al, 2009)
- FLI(Bedogni et al, 2006)
- 지방증 점수 또는 스테아토시험(SteatoTest)(Poynard et al, 2005)
따라서, 본 발명자들은 이들 앞서의 방법 다수를 사용하여 본 발명의 NASH 점수를 평가하였다.
본 발명의 상이한 모델의 점수 대 다른 점수 사이의 비교 및 본 발명의 상이한 모델의 점수 대 개개 변수 사이의 비교는 표 9 내지 표 13에 나타낸다.
본원에 나타낸 데이타는 NASH 환자, 또는 잠재적인 NASH 환자의 확인, NASH 활성, 단계 또는 중증도의 측정의 놀라운 개선을 나타낸다. 이러한 발견은 가장 중요하며 환자 관리 효율을 개선시키기 위한 가치있는 도구일 것이다.
표 3. 혈장 속에서 측정으로 다음의 간 생검-기원한 등급에 상응하는 치료할 위험에 처해있는 환자에 대한 공선성 시험에 있어서의 선택된 및 탈락된 변수: 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2 (예를 들면, 섬유증 단계는 2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일하다)
표 4. 혈청 속에서의 측정(카피/μL log 10 단위의 miRNA)으로 다음의 간 생검-기원한 등급에 상응하는 치료할 위험에 처해 있는 환자에 대한 공선성 시험에 있어서 선택된 및 탈락된 변수: 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2 (예를 들면, 섬유증 단계는 2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일하다)
표 5. 혈청 속에서의 측정(Cq 단위의 miRNA)으로 다음의 간 생검-기원한 등급에 상응하는 치료할 위험에 처해 있는 환자에 대한 공선성 시험에 있어서 선택된 및 탈락된 변수: 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2 (예를 들면, 섬유증 단계는 2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일하다)
표 6. 혈청 속에서의 측정(카피/μL 및 log 10 변환 단위의 miRNA)으로 다음의 간 생검-기원한 등급에 상응하는 치료할 위험에 처해있는 환자에 대한 공선성 시험에 있어서 유의적인 선택된 및 탈락된 변수: 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2 (예를 들면, 섬유증 단계는 2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일하다)
표 7. 혈장 속에서의 측정으로 다음의 간 생검-기원한 등급에 상응하는 치료할 위험에 처해있는 환자에 대한 공선성 시험에 있어서 선택된 및 탈락된 변수: 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 1 (예를 들면, 섬유증 단계는 2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일하다)
표 8. 혈장 속에서의 측정으로 다음의 간 생검-기원한 등급에 상응하는 치료할 위험에 처해있는 환자에 대한 공선성 시험에 있어서 선택된 및 탈락된 변수: 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 1 (예를 들면, 섬유증 단계는 2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일하다)
표 9. 본 발명의 모델 대 다른 공지된 모델의 점수 사이의 비교
다음의 간 생검-기원한 등급에 상응하는 치료할 위험에 처해있는 환자에 대한 모델(카피/μl log10 단위의 혈청 속에서 측정된 miRNA)에서: 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2 (예를 들면, 섬유증 단계는 2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일하다)
본 발명의 부트스트랩 및 중간 모델로부터 유도된 모델 둘 다는 다른 공지된 모델보다 더 우수한 AUC를 갖는다. 이러한 차이는 본 발명의 목적을 유의적으로 증명한다.
표 10. 본 발명의 부트스트랩 모델의 점수 대 다른 점수 사이의 비교
다음의 간 생검-기원한 등급에 상응하는 치료할 위험에 처해있는 환자에 대한 모델(카피/μl log10 단위의 혈청 속에서 측정된 miRNA)에서: 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2 (예를 들면, 섬유증 단계는 2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일하다)
본 발명에 나타내고 앞서 기술한 바와 같은 위험에 처해있는 환자에 상응하는 모든 부트스트랩 모델의 경우, AUC 점수는 다른 모델로부터 수득한 AUC 점수보다 통계적으로 더 우수하다.
유도된 중간 모델을 사용하여 수득된 점수는 부트스트랩 모델을 사용하여 수득한 것과 유사하며, 이는 모델 둘 다가 관련성이 있음을 의미한다.
본 발명의 이점이 입증된다.
표 11. 본 발명의 유도된 중간 모델의 점수 대 다른 점수 사이의 비교
다음의 간 생검-기원한 등급에 상응하는 치료할 위험에 처해있는 환자에 대한 모델(카피/μl log10 단위의 혈청 속에서 측정된 miRNA)에서: 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2 (예를 들면, 섬유증 단계는 2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일하다).
본 발명에 나타내고 앞서 기술한 바와 같은 위험에 처해있는 환자에 상응하는 모든 중간 모델의 경우, AUC 점수는 다른 모델로부터 수득한 AUC 점수보다 통계적으로 더 우수하다.
부트스트렙 모델을 사용하여 수득된 점수는 유도된 중간 모델을 사용하여 수득한 것과 유사하며, 이는 모델 둘 다가 관련성이 있음을 의미한다.
본 발명의 이점이 입증된다.
표 12. 본 발명의 부트스트랩 모델의 점수 대 개개 변수 사이의 비교
다음의 간 생검-기원한 등급에 상응하는 치료할 위험에 처해 있는 환자에 대한 모델(카피/μl log10 단위의 혈청 속에서 측정된 miRNA)에서: 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2 (예를 들면, 섬유증 단계는 2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일하다)
앞서 기술한 바와 같은 위험에 처해 있는 환자에 상응하고 몇개의 변수를 조합하는 부트스트랩 모델에 대한 AUC 점수는 개개 변수에 대해 수득된 AUC 점수보다 통계적으로 더 우수하다.
따라서 본 발명에 따른 로지스틱 함수를 통한 몇가지 변수의 조합은 변수 단독의 연구보다 더 우수하고 보다 정밀하다.
본 발명의 이점이 입증된다.
표 13. 본 발명의 유도된 중간 모델의 점수 대 개개 변수 사이의 비교
다음의 간 생검-기원한 등급에 상응하는 치료할 위험에 처해있는 환자에 대한 모델(카피/μl log10 단위의 혈청 속에서 측정된 miRNA)에서: 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS (NAFLD 활성 점수) ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2 (예를 들면, 섬유증 단계는 2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일하다).
앞서 기술한 바와 같은 위험에 처해있는 환자에 상응하고 몇개의 변수를 조합하는 유도된 중간 모델에 대한 AUC 점수는 개개 변수에 대해 수득된 AUC 점수보다 통계적으로 더 우수하다.
따라서, 본 발명에 따른 로지스틱 함수를 통한 몇가지 변수의 조합은 변수 단독의 연구보다 더 우수하고 보다 정밀하다.
본 발명의 이점이 입증된다.
참고 문헌
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SEQUENCE LISTING <110> GENFIT <120> NON-INVASIVE DIAGNOSTIC OF NON-ALCOHOLIC STEATOHEPATISIS <130> IP20183513FR <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 1 ucaccgggug uaaaucagcu ug 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 2 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 3 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 4 uaacacuguc ugguaacgau gu 22 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 5 uagcaccauu ugaaaucagu guu 23 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 6 cugaccuaug aauugacagc c 21 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 7 agcuacauug ucugcugggu uuc 23 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 8 agcagcauug uacagggcua uga 23 <210> 9 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 9 uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23 <210> 10 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 10 cccaguguuc agacuaccug uuc 23 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 11 ucaccgggug uaaaucagcu ug 22 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 uaacacuguc ugguaacgau gu 22 <210> 15 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 uagcaccauu ugaaaucagu guu 23 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 cugaccuaug aauugacagc c 21 <210> 17 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 agcuacauug ucugcugggu uuc 23 <210> 18 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 agcagcauug uacagggcua uga 23 <210> 19 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23 <210> 20 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 cccaguguuc agacuaccug uuc 23

Claims (16)

  1. 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 hsa-miR-34, 및 YKL-40의 수준을, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플로부터의 측정하는 것을 포함하는, 대상체에서 비-알코올성 지방간염(NASH)의 진단을 위한 정보를 수집하는, 방법.
  2. 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 hsa-miR-34, 및 YKL-40의 수준을, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플로부터 측정하는 것을 포함하는, 대상체에서 비-알코올성 지방간염(NASH)의 활성, 단계, 또는 중증도의 측정을 위한 정보를 수집하는, 방법.
  3. 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 hsa-miR-34, 및 YKL-40의 수준을 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플로부터의 측정하는 것을 포함하는, 비-알코올성 지방간염(NASH) 환자에서 병리의 진행 또는 퇴행의 측정을 위한 정보를 수집하는, 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    - hsa-miR-34a, 및 YKL-40의 수준을 측정하는 단계, 및
    - 수학적 알고리즘을 통해 결과를 조합하여 NASH 점수를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    NASH 점수가 다음의 로지스틱 함수(logistic function)에 따라 계산되는 방법:

    상기에서:
    Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F+g*G
    상기에서:
    S는 NASH 점수이고;
    A는 g/L 단위의 알파 2 마크로글로불린의 수준(level)이며;
    B는 퍼센트 단위의 HbA1c의 수준이고;
    C는 ng/mL 단위의 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 수준이며;
    D는 Cq 단위의 hsa-miR-34a의 수준이고;
    F는 Cq 단위의 hsa-miR-200a의 수준이고;
    G는 pg/ml 단위의 YKL-40의 수준이며,
    k는 로지스틱 함수의 상수(constant)이고;
    a는 알파 2 마크로글로불린의 수준과 관련된 계수(coefficient)이며;
    b는 HbA1c의 수준과 관련된 계수이고;
    c는 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 수준과 관련된 계수이며;
    d는 hsa-miR-34a의 수준과 관련된 계수이고;
    f는 hsa-miR-200a의 수준과 관련된 계수이며; 및
    g는 YKL-40의 수준과 관련된 계수이고;
    a) 상기 방법은, 중간 모델(median model):
    k는 5.94와 50.74 사이에 포함된 수이고;
    a는 0와 1.07 사이에 포함된 수이며;
    b는 0과 1.20 사이에 포함된 수이고;
    c는 0과 0.24 사이에 포함된 수이며;
    d는 -0.97과 0 사이에 포함된 수이고;
    f는 -0.87과 0 사이에 포함된 수이며,
    g는 0과 1.74E-05 사이에 포함된 수이고;
    여기서, 0.2017과 0.4645 사이에 포함된 역치 값(threshold value), 보다 더 높은 NASH 점수는 중증 NASH, 또는 중간 또는 높은 NASH 활성의 지표이므로; 지방증 점수(steatosis score) ≥ 1, 간세포 팽창 점수(hepatocyte ballooning score) ≥ 1, 소엽의 염증 점수(lobular inflammation score) ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계(fibrosis stage) ≥ 2를 갖는 환자의 지표임,
    으로부터 유도되거나, 또는,
    b) 상기 방법은, 부트스트랩 모델(bootstrap model):
    k는 8.24와 35.44 사이에 포함된 수이고;
    a는 0.06과 0.88 사이에 포함된 수이며;
    b는 0.14와 1.04 사이에 포함된 수이고;
    c는 0.03과 0.23 사이에 포함된 수이며;
    d는 -0.75와 -0.05 사이에 포함된 수이고;
    f는 -0.73과 -0.07 사이에 포함된 수이며, 및
    g는 3.59E-06과 1.78E-05 사이에 포함된 수이고;
    여기서 0.2718과 0.6391 사이에 포함된 역치 값보다 더 큰 NASH 점수는 중증 NASH, 또는 중간 또는 높은 NASH 활성의 지표이므로; 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 가진 환자의 지표임,
    으로부터 유도됨.
  6. 청구항 4에 있어서,
    NASH 점수가 다음의 로지스틱 함수에 따라 계산되는 방법:

    상기에서;
    Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D,
    a) 상기 방법은 부트스트랩 모델(bootstrap model):
    S는 NASH 점수이고;
    A는 Cq 단위의 hsa-miR-34a의 혈청 수준이며;
    B는 g/L 단위의 알파 2 마크로글로불린의 혈청 수준이고;
    C는 pg/ml 단위의 YKL-40의 혈청 수준이며;
    D는 퍼센트 단위의 HbA1c의 수준이고;
    k는 로지스틱 함수의 상수이고;
    a는 hsa-miR-34a의 혈청 수준과 관련된 계수이며;
    b는 알파 2 마크로글로불린의 혈청 수준과 관련된 계수이고;
    c는 YKL-40의 혈청 수준과 관련된 계수이며;
    d는 HbA1c의 수준과 관련된 계수이고;
    여기서:
    k는 9.51과 34.37 사이에 포함된 수이고;
    a는 -1.17과 -0.47 사이에 포함된 수이며;
    b는 0.02와 0.84 사이에 포함된 수이고;
    c는 6.10E-06과 2.09E-05 사이에 포함된 수이며;
    d는 0.07과 0.89 사이에 포함된 수이고;
    여기서 0.2013과 0.5965 사이에 포함된 역치 값보다 더 높은 NASH 점수는 중증 NASH, 또는 중간 또는 높은 NASH 활성의 지표이므로; 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 갖는 환자의 지표임,
    로부터 유도되거나; 또는
    b) 상기 방법은 중간 모델:
    k는 6.02와 56.69 사이에 포함된 수이고;
    a는 -1.26과 0.00 사이에 포함된 수이며;
    b는 0.00과 0.88 사이에 포함된 수이고;
    c는 0.00과 2.00E-05 사이에 포함된 수이며;
    d는 0.00과 0.96 사이에 포함된 수이고;
    여기서 0.9773과 0.9955 사이에 포함된 역치 값보다 더 높은 NASH 점수는 중증 NASH, 또는 중간 또는 높은 NASH 활성의 지표이므로, 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 갖는 환자의 지표임,
    으로부터 유도됨.
  7. 청구항 4에 있어서,
    NASH 점수가 다음의 로지스틱 함수에 따라 계산되는 방법:

    여기서:
    Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D
    여기서:
    S는 NASH 점수이고;
    A는 카피/μL(log10) 단위의 hsa-miR-34a의 수준이며;
    B는 g/L 단위의 알파 2 마크로글로불린의 혈청 수준이고;
    C는 pg/ml 단위의 YKL-40의 혈청 수준이며;
    D는 퍼센트 단위의 HbA1c의 수준이고;
    k는 로지스틱 함수의 상수이고;
    a는 hsa-miR-34a의 혈청 수준과 관련된 계수이며;
    b는 알파 2 마크로글로불린의 혈청 수준과 관련된 계수이고;
    c는 YKL-40의 혈청 수준과 관련된 계수이며;
    d는 HbA1c의 수준과 관련된 계수이고;
    a) 상기 방법은 부트스트랩 모델:
    k는 -14.50과 -7.40 사이에 포함된 수이고;
    a는 1.38과 3.58 사이에 포함된 수이며;
    b는 0.02와 0.84 사이에 포함된 수이고;
    c는 5.98E-06과 2.08E-05 사이에 포함된 수이며;
    d는 0.07과 0.89 사이에 포함된 수이고;
    여기서 0.1895와 0.6089 사이에 포함된 역치 값보다 더 높은 NASH 점수는 중증 NASH, 또는 중간 또는 높은 NASH 활성의 지표이므로; 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 갖는 환자의 지표임,
    으로부터 유도되거나; 또는
    b) 상기 방법은 중간 모델:
    k는 -27.16과 -0.78 사이에 포함된 수이고;
    a는 0과 3.97 사이에 포함된 수이며;
    b는 0과 0.89 사이에 포함된 수이고;
    c는 0과 1.98E-05 사이에 포함된 수이며;
    d는 0과 0.97 사이에 포함되는 수이고;
    여기서 0.1421과 0.4556 사이에 포함되는 역치 값보다 높은 NASH 점수는, 중증 NASH, 또는 중간 또는 높은 NASH 활성의 지표이므로; 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 2를 갖는 환자의 지표임,
    으로부터 유도됨.
  8. 청구항 4에 있어서,
    NASH 점수가 다음의 로지스틱 함수에 따라 계산되는 방법:

    여기서:
    Y=k+a*A+b*B
    여기서:
    S는 NASH 점수이고;
    A는 Cq 단위의 hsa-miR-34a의 수준이고;
    B는 pg/ml 단위의 YKL-40의 수준이며;
    k는 -116.08과 40.97 사이에 포함된 수이고;
    a는 -0.82와 0 사이에 포함된 수이고;
    b는 0과 1.88E-05 사이에 포함된 수이고;
    여기서 0.1387 내지 0.3481 사이에 포함되는 역치 값보다 더 높은 NASH 점수는, 중증 NASH, 또는 중간 또는 높은 NASH 활성의 지표이므로; 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 1을 갖는 환자의 지표임.
  9. 청구항 4에 있어서,
    NASH 점수가 다음의 로지스틱 함수에 따라 계산되는 방법:

    여기서:
    Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
    여기서:
    S는 NASH 점수이고;
    A는 Cq 단위의 hsa-miR-34a 의 수준이고;
    B는 pg/ml 단위의 YKL-40의 수준이며;
    C는 뇨 비중(단위 없음)의 수준이고;
    D는 10e9/L 단위의 호염기성 세포(basophils)의 수준이고;
    F는 mg/dL 단위의 HSCRP의 수준이며;
    k는 -124.81과 1.13 사이에 포함된 수이고;
    a는 -0.91과 -0.25 사이에 포함된 수이며;
    b는 4.77e-06과 2.39e-05 사이에 포함된 수이고;
    c는 17.21과 141.51 사이에 포함된 수이며;
    d는 2.80과 60.74 사이에 포함된 수이고;
    f는 0.01과 0.23 사이에 포함된 수이며;
    여기서 0.5791과 0.8269 사이에 포함되는 역치 값보다 더 높은 NASH 점수는 중증 NASH, 또는 중간 또는 높은 NASH 활성의 지표이므로; 지방증 점수 ≥ 1, 간세포 팽창 점수 ≥ 1, 소엽의 염증 점수 ≥ 1, NAS ≥ 4 및 섬유증 단계 ≥ 1을 갖는 환자의 지표임.
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