EA044836B1 - Неинвазивная диагностика неалкогольного стеатогепатита - Google Patents
Неинвазивная диагностика неалкогольного стеатогепатита Download PDFInfo
- Publication number
- EA044836B1 EA044836B1 EA201892201 EA044836B1 EA 044836 B1 EA044836 B1 EA 044836B1 EA 201892201 EA201892201 EA 201892201 EA 044836 B1 EA044836 B1 EA 044836B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- nash
- mir
- hsa
- level
- scores
- Prior art date
Links
- 208000008338 non-alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 claims description 319
- 206010053219 non-alcoholic steatohepatitis Diseases 0.000 claims description 283
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 91
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 81
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 claims description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 75
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 61
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 claims description 57
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 56
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 56
- 230000007863 steatosis Effects 0.000 claims description 56
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 55
- 101000883515 Homo sapiens Chitinase-3-like protein 1 Proteins 0.000 claims description 54
- 102100038196 Chitinase-3-like protein 1 Human genes 0.000 claims description 52
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 49
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 49
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 38
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 38
- 108091067619 Homo sapiens miR-34a stem-loop Proteins 0.000 claims description 34
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 32
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 27
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 27
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 25
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 24
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 24
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 claims description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 23
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 claims description 22
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 claims description 20
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 claims description 19
- IXZISFNWUWKBOM-ARQDHWQXSA-N fructosamine Chemical compound NC[C@@]1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O IXZISFNWUWKBOM-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 16
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims description 15
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 claims description 14
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 claims description 12
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 claims description 12
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims description 12
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 claims description 12
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 claims description 12
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 claims description 11
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 10
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 claims description 9
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 claims description 9
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 7
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 claims description 6
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 claims description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 6
- 108091005995 glycated hemoglobin Proteins 0.000 claims description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 claims description 5
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 4
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 claims description 4
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 4
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims description 4
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 claims description 3
- 238000009534 blood test Methods 0.000 claims description 2
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 claims 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 43
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 35
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 33
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 27
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 24
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 16
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 16
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 15
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 15
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 14
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 101710095342 Apolipoprotein B Proteins 0.000 description 13
- 102100040202 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 description 13
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 13
- 108091029119 miR-34a stem-loop Proteins 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 12
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 12
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 12
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 11
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 11
- 108091007780 MiR-122 Proteins 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 10
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 10
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 9
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 9
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 9
- 108091040342 miR-34a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 9
- 108091035608 miR-34a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 9
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 8
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 8
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 8
- 108091069016 Homo sapiens miR-122 stem-loop Proteins 0.000 description 8
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 8
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 7
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 7
- 108091065166 Homo sapiens miR-200a stem-loop Proteins 0.000 description 7
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 7
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 7
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 6
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 6
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 6
- 206010042135 Stomatitis necrotising Diseases 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 6
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 6
- 108010022197 lipoprotein cholesterol Proteins 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 201000008585 noma Diseases 0.000 description 6
- 108010046315 IDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 5
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 5
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000003253 miRNA assay Methods 0.000 description 5
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000012549 training Methods 0.000 description 5
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 4
- 102000003973 Fibroblast growth factor 21 Human genes 0.000 description 4
- 108090000376 Fibroblast growth factor 21 Proteins 0.000 description 4
- 108020004206 Gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108010034596 procollagen Type III-N-terminal peptide Proteins 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 4
- MXBCYQUALCBQIJ-RYVPXURESA-N (8s,9s,10r,13s,14s,17r)-13-ethyl-17-ethynyl-11-methylidene-1,2,3,6,7,8,9,10,12,14,15,16-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-ol;(8r,9s,13s,14s,17r)-17-ethynyl-13-methyl-7,8,9,11,12,14,15,16-octahydro-6h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-diol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1.C1CC[C@@H]2[C@H]3C(=C)C[C@](CC)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MXBCYQUALCBQIJ-RYVPXURESA-N 0.000 description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 3
- 108091065981 Homo sapiens miR-155 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 108010069201 VLDL Cholesterol Proteins 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 3
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 108091074487 miR-34 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091092493 miR-34-1 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091059780 miR-34-2 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091090568 miR-39 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091056739 miR-39-1 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091039160 miR-39-2 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- 108010055851 Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 2
- 102000011690 Adiponectin Human genes 0.000 description 2
- 108010076365 Adiponectin Proteins 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 208000007082 Alcoholic Fatty Liver Diseases 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108091070482 Caenorhabditis elegans miR-39 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 2
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 2
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 2
- 102100031734 Fibroblast growth factor 19 Human genes 0.000 description 2
- 102000014702 Haptoglobin Human genes 0.000 description 2
- 108050005077 Haptoglobin Proteins 0.000 description 2
- 101000846394 Homo sapiens Fibroblast growth factor 19 Proteins 0.000 description 2
- 108091067995 Homo sapiens miR-192 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091070493 Homo sapiens miR-21 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091068837 Homo sapiens miR-29b-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091068845 Homo sapiens miR-29b-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 102100033421 Keratin, type I cytoskeletal 18 Human genes 0.000 description 2
- 108010066327 Keratin-18 Proteins 0.000 description 2
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 2
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 2
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 2
- 108010051335 Lipocalin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000013519 Lipocalin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108091008065 MIR21 Proteins 0.000 description 2
- 108091030146 MiRBase Proteins 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100030122 Protein O-GlcNAcase Human genes 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 101100041929 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SDH3 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 2
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 2
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 2
- 208000026594 alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 229950001279 elafibranor Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- AFLFKFHDSCQHOL-IZZDOVSWSA-N gft505 Chemical compound C1=CC(SC)=CC=C1C(=O)\C=C\C1=CC(C)=C(OC(C)(C)C(O)=O)C(C)=C1 AFLFKFHDSCQHOL-IZZDOVSWSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 2
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- OBHRVMZSZIDDEK-UHFFFAOYSA-N urobilinogen Chemical compound CCC1=C(C)C(=O)NC1CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(CC3C(=C(CC)C(=O)N3)C)N2)CCC(O)=O)N1 OBHRVMZSZIDDEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 description 1
- 102000003966 Alpha-1-microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 101800001761 Alpha-1-microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 208000015163 Biliary Tract disease Diseases 0.000 description 1
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 1
- JHQXCEBEGVCTTB-UHFFFAOYSA-N CSc1ccc(cc1)C(=O)C=Cc1cc(C)c(C(O)=O)c(C)c1OC(C)C Chemical compound CSc1ccc(cc1)C(=O)C=Cc1cc(C)c(C(O)=O)c(C)c1OC(C)C JHQXCEBEGVCTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108010066813 Chitinase-3-Like Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000018704 Chitinase-3-Like Protein 1 Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010008609 Cholangitis sclerosing Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000012192 Cystatin C Human genes 0.000 description 1
- 108010061642 Cystatin C Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010019728 Hepatitis alcoholic Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 208000002972 Hepatolenticular Degeneration Diseases 0.000 description 1
- 101000741967 Homo sapiens Presequence protease, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108091068855 Homo sapiens miR-103a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091068838 Homo sapiens miR-103a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091067692 Homo sapiens miR-199a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091067467 Homo sapiens miR-199a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091067572 Homo sapiens miR-221 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000057248 Lipoprotein(a) Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000015532 Nicotinamide phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010064862 Nicotinamide phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038632 Presequence protease, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 102000007156 Resistin Human genes 0.000 description 1
- 108010047909 Resistin Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 102000004987 Troponin T Human genes 0.000 description 1
- 108090001108 Troponin T Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000018839 Wilson disease Diseases 0.000 description 1
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002353 alcoholic hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Substances [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000011984 electrochemiluminescence immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000036449 fibrotic liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- -1 hsa-miR-34a Proteins 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000007620 mathematical function Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000101 novel biomarker Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 201000000742 primary sclerosing cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 208000010157 sclerosing cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 238000013077 scoring method Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
Description
Область изобретения
Изобретение относится к новому способу диагностики неалкогольного стеатогепатита (NASH) и классификации индивидуума как потенциального реципиента лечения NASH.
Предпосылки изобретения
Неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD) является прогрессирующим заболеванием печени, охватывающим диапазон от простого стеатоза до неалкогольного стеатогепатита (NASH).
Неалкогольный стеатогепатит (NASH) также является прогрессирующим заболеванием печени, гистологически отличающимся накоплением жирных кислот, повреждением гепатоцитов и воспалением, напоминающим алкогольный гепатит. NASH представляет собой критическую стадию процесса, который может приводить к циррозу, печеночной недостаточности и/или НСС (печеночно-клеточной карциноме). Для постановки этого диагноза необходимо тщательное документирование отсутствия значительного потребления алкоголя. NASH является одной из наиболее распространенных причин повышения аминотрансфераз у пациентов, рассматриваемых гепатологами при оценке. Ожирение и диабет 2 типа ассоциированы с NASH.
Вместе с распространением ожирения во всем мире, частота NASH также увеличилась за последние годы, и пациенты с развившимся NASH имеют повышенный показатель смертности, связанной с заболеваниями печени. Т.к. распространенность этих заболевания повышается, ожидают, что распространенность NASH также будет повышаться, и, таким образом, это заболевание становится растущей общественной проблемой в США, а также других странах. Таким образом, растущая распространенность и повышенная смертность, ассоциированные с этими заболеваниями, подчеркивают необходимость
i) большего механистического понимания прогрессирования заболевания; и ii) разработки более чувствительного и надежного способа неинвазивной диагностики NASH.
Т.к. эти заболевания потенциально можно реверсировать при достаточно ранней диагностике или, по меньшей мере, ограничить их последствия, представляется важным иметь возможность обеспечить медицинскую область новым инструментам, делающими возможной такую раннюю, быструю и точную диагностику.
Хотя предпринималось несколько попыток предложить неинвазивные способы диагностики и определения активности, стадии или тяжести NASH, в настоящее время гистологический анализ биоптатов печени остается оптимальным подходом для дифференцирования NASH и ранних стадий стеатоза. Стеатоз, лобулярное и портальное воспаление, повреждение гепатоцитов в формах баллонирования и апоптоза и фиброз являются признаками NASH, оцениваемыми при биопсии. Однако биопсия печени имеет ряд очевидных недостатков. Во-первых, материал, собранный при биопсии печени, представляет собой лишь очень небольшую часть печени индивидуума, подвергаемого диагностике, что, таким образом, увеличивает сомнения, касающиеся того, свидетельствует ли полученный образец об общем состоянии органа индивидуума. Кроме того, биопсия печени является очень инвазивным способом, который может являться трудоемким, причиняющим беспокойство и болезненным для пациента, что увеличивает опасения, касающиеся осложнений и смертности. И наконец, в свете приведенного выше, биопсию печени нельзя с достаточными основаниями предлагать в качестве рутинного способа определения того, страдает ли NASH индивидуум из общей совокупности или даже пациенты с риском NASH, и/или определения активности, стадии или тяжести NASH у указанного индивидуума.
Ультрасонографию также использовали для диагностики жирового гепатоза. Однако этот способ является субъективным, т.к. он основан на интенсивности отраженного сигнала (эхогенности) и конкретных паттернов отраженных сигналов (текстуры). В результате он не является достаточно чувствительным и зачастую неточен, особенно у пациентов с фиброзом на поздних стадиях.
В современных руководствах по диагностике NASH рекомендуют использование соотношения АСТ/АЛТ у нетяжелых пациентов (Angulo P.N., Engl. J. Med., 2002 Apr 18, 346(16):1221-31; Maher J.J., Semin Gastrointest Dis., 2002, 13:31-9) и биопсии печени у тяжелых пациентов с использованием дискриминантной функции Маддрея выше 32 (Levitsky J., Mailliard M.E., Semin Liver Dis., 2004, 24:233-47; Mathurin P. et al., Gastroenterology, 1996, 110:1847-53; Mathurin P. et al., J. Hepatol., 2002, 36:480-7).
Т.к. биопсия печени все еще является инвазивным и затратным способом с потенциальной ошибкой выборочного исследования, предпочтительным может являться наличие быстрого и простого способа для осуществления тестирования, обладающего хорошим прогностическим значением уровня NASH у пациента.
В нескольких исследованиях описано, что некоторые сывороточные биомаркеры фиброза имеют лучшие диагностические значения, чем стандартные сывороточные маркеры, такие трансаминазы или ActiTest (Naveau S. et al., Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2005, 3(2); Castera L. et al., J. Hepatol., 2000, 32:412-8; Annoni G. et al., Hepatology, 1989;9:693-7; Nojgaard C. et al., J. Hepatol., 2003, 39:179-86; Chossegros P., 1995, 22(2 Suppl):96-9), но ни в одном из этих исследований не идентифицирована точная комбинация маркеров NASH.
Кроме того, в последние годы в некоторых исследованиях изучали использование неинвазивных биомаркеров, которые приобрели важное значение в области диагностики печени. Например, в ЕР 1846862 В описывают неинвазивный способ in vitro для диагностики алкогольного или неалкогольного стеатогепа- 1 044836 тита в образце сыворотки или плазмы пациента, включающий стадии измерения концентрации 7 биохимических маркеров, а затем их комбинирования с помощью логистической функции для получения конечного значения.
В WO 2014/049131 описывают анализ крови для неинвазивной диагностики неалкогольного стеатогепатита на основе измерения по меньшей мере одного биомаркера, отражающего апоптоз, по меньшей мере одного биомаркера, отражающего антропометрические данные, по меньшей мере одного биомаркера, отражающего метаболическую активность и необязательно по меньшей мере одного биомаркера, отражающего состояние печени и комбинирования указанных биомаркеров с использованием математической функции.
Осуществлено несколько исследований, в которых сравнивали и комбинировали неинвазивные биомаркеры для оценки печеночного фиброза, а также сравнивали точность различных алгоритмов, включающих эти неинвазивные биомаркеры. Трудность заключается в выборе эффективных и надежных биомаркеров в конечном итоге для их комбинирования посредством алгоритма, анализе различных результатов и необязательно определении хорошо отвечающих пациентов.
Однако в настоящее время такой точный способ диагностики NASH недоступен.
Таким образом, существует потребность в точных, неинвазивных способах диагностики и определения активности, стадии или тяжести NASH у индивидуума.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано на очень точном и полном анализе большого количества переменных, определенных с использованием более 300 образцов высокого качества, полученных от пациентов с NASH при клиническом исследовании, осуществленных заявителем (исследование GFT505-212-7NCT01694849), включающем гистологические данные, полученные с использованием биоптатов печени пациентов. Это исследование привело к открытию ключевых циркулирующих факторов (или биомаркеров), свидетельствующих о NASH и его тяжести, или стадии, или активности.
Настоящее изобретение относится к способу диагностики стадии или тяжести неалкогольного стеатогепатита (NASH) у индивидуума, и/или классификации индивидуума как реципиента или нереципиента лечения NASH, и/или оценки эффективности лечения, и/или определения прогрессирования или регрессирования патологии у пациентов с NASH, и/или классификации пациента как потенциально отвечающего или неотвечающего на лечение, и/или прогнозирования исхода заболевания у пациента, и/или идентификации суррогатных маркеров клинических исходов, включающих этапы измерения уровня в крови, сыворотки или плазме циркулирующего hsa-miR-34 и измерения в крови, сыворотке или плазме уровня циркулирующей YKL-40.
Другие аспекты и варианты осуществления будут очевидны из следующего подробного описания.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основано на количественном анализе и/или комбинировании конкретных циркулирующих микроРНК (мкРНК) и других циркулирующих биомаркеров, таких как биохимические биомаркеры, являющиеся циркулирующими маркерами повреждения печени.
В частности, заявитель определил, что среди мкРНК, описанных в этой области, есть потенциальные маркеры воспаления в условиях NASH/NAFLD (hsa-miR-21, hsa-miR-24, hsa-miR-33а, hsa-miR-34a, hsa-miR-122 и hsa-miR-155), hsa-miR-34a является ключевым биомаркером для диагностики NASH.
Таким образом, первый аспект изобретения относится к способу диагностики стадии или тяжести NASH у индивидуума, включающему измерение уровня циркулирующей hsa-miR-34a в крови, сыворотке или плазме и измерение уровня циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме и необязательно по меньшей мере одного другого циркулирующего маркера повреждения печени в крови, сыворотке или плазме.
По изобретению, комбинации конкретных мкРНК и необязательно других конкретных биохимических маркеров могут приводить к очень точному, неинвазивному способу диагностики и определения стадии или тяжести NASH у индивидуума. Таким образом, настоящее изобретение относится к комбинации обоих типов маркеров таким образом, что способ является очень мощным и точным. Способ по настоящему изобретению обладает селективностью и специфичностью в отношении NASH у индивидуума.
Таким образом, настоящее изобретение обусловлено идентификацией определенного набора циркулирующих маркеров, которые при рассмотрении в совокупности свидетельствуют о NASH и/или активности, стадии или тяжести NASH у индивидуума, тестируемого на NASH или его тяжесть, или стадию, или активность. Изобретение, в частности, относится к способу диагностики неалкогольного стеатогепатита (NASH) и/или определения стадии или тяжести NASH у индивидуума, в котором комбинируют идентификацию циркулирующих микроРНК (мкРНК) и других циркулирующих маркеров повреждения печени и количественный анализ их уровня.
В последнее время наблюдают высокий уровень активности в области, окружающей мкРНК как биомаркеров различных заболеваний, включая злокачественные новообразования, гепатит, повреждение печени и NAFLD (неалкогольную жировую болезнь печени) (Osman, Clin. Lab., 2012, 58:393-402; Cermelli et al., PloS.One, 2011, 6:e23937; Elfimova et al., Front. Physiol., 2012, 3:476).
мкРНК являются некодирующими, небольшими (от 19 до 25 нуклеотидов в длину), высококонсер- 2 044836 вативными регуляторными РНК, регулирующими экспрессию генов на посттранскрипционном уровне посредством частичной репрессии или деградации мРНК-мишени, в качестве эволюционно консервативного молекулярного механизма для модуляции синтеза белка.
В настоящее время существует более 2000 известных мкРНК, кодируемых различными межгенными, интронными или экзонными последовательностями в геноме человека, и считают, что мкРНК могут напрямую направленно воздействовать на до 60% всех генов человека. мкРНК участвуют в широком спектре биологических процессов, включая апоптоз, дифференцировку, развитие, пролиферацию и метаболизм клеток.
Циркулирующие мкРНК являются удивительно стабильными в среде, богатой рибонуклеазами, в крови, т.к. они могут встраиваться в рибонуклеопротеиновые комплексы или везикулы.
Конкретные профили экспрессии мкРНК ассоциированы с некоторыми заболеваниями, включая некоторые злокачественные новообразования, заболевания печени, сердца, почки и аутоиммунное заболевание. Если профили экспрессии циркулирующих мкРНК сильно коррелируют с конкретными условиями, то профиль циркулирующих мкРНК может служить в качестве биомаркера для диагностики и мониторинга заболеваний. мкРНК недавно стали рассматривать в качестве новых биомаркеров и потенциальных терапевтических мишеней при лечении NAFLD.
С момента их открытия, мкРНК исследуют на потенциальную взаимосвязь с заболеваниями человека. При многих заболеваниях наблюдают изменения их профилей экспрессии по сравнению с нормальными тканями и сывороткой. В частности, изменения экспрессии мкРНК при заболеваниях сердца, сепсисе, злокачественных новообразованиях и аутоиммунных заболеваниях позволяют найти новый путь исследования и мишени для лечения заболеваний человека.
Эта перспективная новая область позволила провести исследования и обнаружить возможность того, что стабильные мкРНК, детектируемые в сыворотке и плазме, могут служить в качестве биомаркеров ранних стадий заболевания или являться неинвазивным средством определения тяжести заболевания. Однако мкРНК являются достаточно мощным и значительным показателем NASH, и все еще необходимы способы реализации этого, т.к. современным золотым стандартом диагностики или определения стадии NASH все еще остается биопсия печени.
Среди мкРНК hsa-miR-122 предлагают в качестве биомаркера заболевания печени (Chang et al., 2004; Lagos-Quintana et al., 2002).
В исследованиях по определению профиля экспрессии идентифицировали несколько дифференциально экспрессирующихся мкРНК, включая hsa-miR-21, hsa-miR-34a, hsa-miR-122 и hsa-miR-155 при NASH человека и мыши и определяли, что измененная экспрессия этих мкРНК позволяет предполагать их значительную роль в патогенезе NASH. Однако несмотря на некоторый недавний успех в исследовании и лечении NASH в этой области остаются значительные пробелы. Они включают ограниченное понимание биохимической этиологии, широкий спектр ее проявления и основной процесс прогрессирования заболевания от NAFLD до NASH.
В частности, до сих пор неизвестно, существует ли разная предрасположенность конкретных пациентов или тканей к прогрессированию до NASH и может ли эта предрасположенность быть ассоциированной с измененной экспрессией мкРНК.
В настоящее время не доступен ни один диагностический тест для более точной диагностики NASH с учетом измененной экспрессии мкРНК в отдельности или в комбинации.
Настоящее изобретение основано на очень точном анализе биоптатов пациентов в ходе клинического исследовании для определения корреляции с наличием или уровнем циркулирующих биологических маркеров и определения различных типов пациентов, подлежащих лечению, в соответствие с балльной оценкой NAS, как описано ниже. В частности, по настоящему изобретению, в качестве неограничивающего примера, определяют три класса пациентов с NASH, подлежащих лечению. Этих пациентов классифицируют относительно балльной оценки характеристик NASH.
В конкретном варианте осуществления для каждого класса пациентов заявитель определяет список соответствующих биомаркеров для нескольких классов пациентов. Дополнительно описан способ, посредством которого комбинируют эти разные соответствующие биомаркеры.
Таким образом, различные способы напрямую связаны с пациентом, подлежащим лечению. Способы по изобретению могут позволить классифицировать пациентов как будущих реципиентов или нереципиентов лечения NASH в зависимости от их признаков по оценке NASH. Пациент, подлежащий лечению, может зависеть от регуляторного органа или политики здравоохранения каждой страны. Настоящее изобретение относится к мощному инструменту, предоставляемому лечащему врачу для идентификации этих пациентов, подлежащих лечению, т.к. заявитель предлагает различные комбинации маркеров для идентификации нескольких классов пациентов. Осуществление способов по изобретению приводит к точной классификации индивидуумов, находящихся под мониторингом.
По изобретению, для каждого типа пациентов, подлежащих лечению, можно получать балльную оценку NASH.
Настоящее изобретение относится к способу классификации индивидуума как реципиента или нереципиента, или как потенциального реципиента или потенциального не-реципиента лечения NASH. Эта
- 3 044836 классификация также может служить основой для дальнейшего определения того, необходимо ли далее подвергать индивидуума дополнительному подтверждению NASH известными в этой области способами, такими как биопсия печени.
Способ по настоящему изобретению можно использовать для диагностики NASH у индивидуума;
определения стадии NASH у индивидуума;
определения тяжести NASH у индивидуума;
классификации индивидуума как реципиента или нереципиента лечения NASH;
оценки эффективности лечения NASH, такой как эффективность лекарственного средства;
определения прогрессирования или регрессирования патологии у пациента с NASH;
определения прогрессирования или регрессирования патологии у пациента с NASH после проведения лечения;
прогнозирования того, будет ли пациент восприимчивым или нет, т.е. (потенциально) отвечающим или (потенциально) неотвечающим на лечение NASH;
осуществления прогностической оценки, т.е. прогнозирования исхода заболевания.
Способы по изобретению делают возможной диагностику, а также мониторинг развития NASH у пациента. Эти способы предпочтительно можно осуществлять для определения начала лечения, например, или для оперативного вмешательства в случае пациентов в более критическом состоянии (такого как трансплантация печени).
Настоящее изобретение основано на точной комбинации разных идентифицированных биомаркеров благодаря математическим алгоритмам, примененным к результатам большого клинического исследования эффекта элафибранора, очень перспективного лекарственного средства для лечения NASH.
В конкретном варианте осуществления используют различные алгоритмы, каждый из которых ориентирован на конкретный класс пациентов.
При определении конкретного алгоритма в зависимости от состояния пациента дальнейшее использование результатов становится более точным и прогностическим.
Неожиданно среди всех мкРНК, как известно, каким-либо образом ассоциированных с NASH, авторы настоящего изобретения определяли hsa-miR-34 как наиболее мощный и показательный биомаркер NASH при комбинировании по меньшей мере с одним другим биомаркером.
По настоящему изобретению неалкогольный стеатогепатит или NASH определяют как наличие жирового гепатоза, баллонирования гепатоцитов и воспаления печени.
Помимо этого основного определения заболевания, NASH может дополнительно включать фиброз печени.
По настоящему изобретению термины индивидуум и пациент используют взаимозаменяемо и они означают млекопитающего, в частности человека или пациента-человека.
Настоящее изобретение благодаря своей неинвазивной природе можно осуществлять в отношении любого индивидуума, такого как индивидуум без известной предрасположенности к NASH или с предполагаемой предрасположенностью к NASH.
Однако в конкретном варианте осуществления индивидуум является индивидуумом с риском NASH или развития NASH в будущем, таким как индивидуум, имеющий ожирение, диабет, страдающий метаболическим синдромом или имеющий повышенный уровень циркулирующих ферментов печени (АЛТ и/или ACT), или индивидуумом с диагнозом неалкогольной жировой болезни печени (или жирового гепатоза).
Индивидуум также может являться индивидуумом с уже идентифицированной NASH, таким образом, способ по изобретению делает возможным определение рисков развития заболевания в цирроз печени, фиброз, гепатокарциному, показание к трансплантации печени или сердечно-сосудистое заболевание.
Если индивидуум страдает NASH, способ по изобретению делает возможным определение эффективности лекарственного средства для лечения заболевания NASH, и также классификацию пациента как отвечающего/неотвечающего на лечение.
Настоящее изобретение можно осуществлять для идентификации пациентов, которые могут являться отвечающими или неотвечающими на лечение NASH. В частности, настоящее изобретение делает возможной классификацию пациентов на различные классы.
В случае классификации каждого пациента настоящее изобретение относится к способу диагностики NASH, или определения стадии или тяжести NASH у индивидуума, или классификации индивидуума как реципиента или не-реципиента лечения неалкогольного стеатогепатита (NASH), или оценки эффективности лечения NASH, такого как посредством введения лекарственного средства, или определения прогрессирования или регрессирования патологии у пациентов с NASH, или определения прогрессирования или регрессирования NASH после проведения лечения, или прогнозирования того, будут ли пациенты восприимчивыми или нет к лечению, или прогностической оценки, т.е. прогнозирования исхода заболевания у пациента, и включающему измерение уровня циркулирующей hsa-miR-34 (например, hsamiR-34a) в крови, сыворотке или плазме, и измерение в крови, сыворотке или плазме уровня циркулирующей YKL-40.
- 4 044836
Классификацию пациентов осуществляют в соответствии с гистологическими признаками в биоптатах печени из образцов высокого качества от пациентов с NASH в ходе клинического исследования:
печеночноклеточный стеатоз, баллонирование, лобулярное воспаление и, необязательно, фиброз.
Основываясь на предшествующем анализе, разрабатывали балльную оценку активности NAFLD (NAS), и ее можно определять следующим образом:
NAS основана на 3 признаках, каждый из которых оценивается в от 0 до 2 или 3 (см. таблицу ниже);
NAS представляет собой сумму балльной оценки стеатоза (S), лобулярного воспаления (L) и баллонирования гепатоцитов (В).
Таким образом, NAS может включать баллы от 0 до 8.
Затем необязательно пациентов NASH можно дополнительно охарактеризовывать по стадии фиброза, если он есть. Стадирование фиброза при NASH можно осуществлять в виде 4 стадий с тремя вероятностями для стадии 1, как показано ниже.
| ЫАЭ=общие баллы: S+L+B (диапазон 0-8) | |||||
| Стеатоз | Баллы S | Лобулярное воспаление | Баллы L | Баллонирование гепатоцитов | Баллы В |
| <5% | 0 | Нет | 0 | Нет | 0 |
| 5-33% | 1 | <2 фокусов/200х | 1 | ||
| Немного баллонированных клеток | 1 | ||||
| 34-66% | 2 | 2-4 фокуса/200х | 2 | ||
| Много баллонированных клеток | 2 | ||||
| >66% | 3 | >4 фокуса/200х | 3 | ||
| Стадия фиброза | |||||
| Нет | 0 | ||||
| Слабый, перисинусоидальный фиброз зоны 3 | 1а | ||||
| Умеренный, перисинусоидальный фиброз зоны 3 | 1Ь | ||||
| Только портальный/перипортальный фиброз | 1с | ||||
| Перисинусоидальный фиброз зоны 3 и портальный/перипортальный фиброз | 2 | ||||
| Мостовидный фиброз | 3 | ||||
| Цирроз | 4 |
Источник: Kleiner et al., Hepatology, 2005, 41:1313-21.
Данные, собранные авторами настоящего изобретения, обрабатывали с использованием двух разных биостатистических подходов, что приводило к определению баллов, свидетельствующих о заболевании и/или его тяжести, или стадии, или активности, таким образом, получали мощный, точный и высокопрогностический инструмент для лечащего врача для легкого определения того, страдает ли индивидуум NASH, или для определения стадии, или активности, или тяжести заболевания.
Два биостатистических подхода, медианную модель и бутстреп-модель использовали для точного определения комбинации маркеров, коррелирующей с пациентами с NASH, как описано ниже.
Уровни маркеров, измеряемые в настоящем изобретении, определяли в физиологических жидкостях индивидуума, которые представляют собой кровь, более конкретно, образец сыворотки или плазмы.
В конкретном варианте осуществления уровень маркеров и особенно мкРНК, измеряемых в настоящем изобретении, определяют в образце плазмы и предпочтительно образце плазмы, не содержащем тромбоциты.
Уровень маркеров, идентифицированных авторами настоящего изобретения, можно определять общепринятыми способами, хорошо известными в этой области, такими как иммунологические анализы (например, ELISA), или молекулярные и биохимические анализы (количественная RT-ПЦР, колориметрические анализы), или аналитические способы (такие как масс-спектрометрия), в зависимости от типа биомаркера (такого как уровень белка, микроРНК, глюкоза).
Если тестируемым маркером является микроРНК, более конкретно hsa-miR-34a, его измерение можно осуществлять рядом способов, хорошо известных в этой области, таких как представленные в примерах ниже.
В кратком изложении, измерения осуществляют с использованием тотальной РНК, выделенной из образца крови, плазмы или сыворотки, в частности бесклеточного, цитратного образца плазмы, не содержащего тромбоциты. Перед выделением РНК к образцу можно добавлять подходящий внутренний контроль (такой как микроРНК с известной последовательностью и количеством, например, miR-39
- 5 044836
С. elegans). Значения Cq определяют с использованием количественной RT-ПЦР. Доступны коммерческие наборы для осуществления таких анализов. Например, анализ qRT-ПЦР мкРНК Taqman: набор для обратной транскрипции микроРНК Taqman, 20-кратные реагенты для анализа микроРНК TaqMan и универсальный мастер-микс TaqMan II (Applied Biosystems) можно использовать по инструкциям производителя. Обратную транскрипцию можно осуществлять с использованием доступных систем для ПЦР, таких как термоциклер GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems), с подходящими параметрами циклов, таких как 16°С в течение 30 мин, затем 42°С в течение 30 мин и 85°С в течение 5 мин перед хранением при 4°С. Обратную транскрипцию можно осуществлять в мультиплексном формате. Затем осуществляют количественную ПЦР с использованием системы для количественной ПЦР, такой как CFX96TM Real-Time System (термоциклер С1000 TouchTM, BioRad). Условия циклов могут быть следующими: 95°С в течение 10 мин, затем 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 60 с в течение всего 50 циклов, в затем 30°С в течение 30 с. Режимом определения Cq может являться регрессионный режим в системе для количественной ПЦР. В конкретном варианте осуществления значение Cq, определяемое способом по изобретению, является значением Cq, получаемым с использованием указанных выше конкретных параметров и материалов. Значения Cq образцов можно исключать из анализа, если значения превышают максимум Cq стандартной кривой для каждой мкРНК. Стандартную кривую можно использовать для оценки эффективности реакции.
Серийное разведение можно осуществлять по восьми точкам, начиная с наиболее концентрированного образца кДНК, для обеспечения того, чтобы стандартная кривая охватывала все потенциальные концентрации матрицы, которые могут встречаться в ходе исследования. Стандартную кривую можно получать посредством построения графика log исходного количества матрицы относительно полученных значений Cq. Для получения абсолютных количественных данных синтетическую hsa-мкРНК (например, от Integrated DNA Technologies) можно разводить до 3,125 фмоль/мл и использовать 5 мкл для обратной транскрипции одновременно с РНК, выделенной из образцов сыворотки. Затем продукт можно серийно разводить и можно осуществлять ПЦР с использованием всех образцов (стандартов и РНК, полученной из сыворотки). Построение стандартной кривой можно осуществлять в двух параллелях и использовать для преобразования данных о Cq в копии/мкл. Режим определения Cq представлял собой регрессию. Данные, используемые в построении алгоритма, выражали в формате Log10(копий/мкл сыворотки).
По настоящему изобретению индивидуума определяют как имеющего NASH, или потенциально имеющего NASH, или вероятно имеющего NASH, если уровень hsa-miR-34a и уровни по меньшей мере одного другого маркера повышены, в частности, по сравнению с референсными значениями, полученными с использованием контрольного (или референсного) образца. Референсный образец может соответствовать образцу физиологической жидкости, такому как образец крови, сыворотки или плазмы, полученному из одного или нескольких индивидуумов, например двух или более, не имеющих NAFLD или NASH.
В настоящем изобретении уровни биомаркеров, т.е. уровень hsa-miR-34 (например, hs-miR-34a) и циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме, измеряли как описано выше, также можно использовать для определения балльной оценки заболевания, также названной балльной оценкой NASH. Эта балльная оценка, представленная в настоящем описании, является бесценным и мощным инструментом для практического специалиста и нуждающихся в этом индивидуумов, т.к. она делает возможной диагностику NASH, или определение тяжести, или стадии, или активности NASH, а также всех параметров, указанных ниже, с использованием неинвазивного способа, т.е. без использования биопсии печени. Балльную оценку NASH можно сравнивать с пороговыми значениями, позволяющими отличать низкую, умеренную или высокую активность NASH или умеренный и тяжелый NASH.
Кроме того, с помощью балльной оценки NASH также можно прогнозировать эффективность лечения, такого как лечение на основе усвоения лекарственного средства.
По настоящему изобретению эту информацию предпочтительно можно использовать для определения того, будет ли индивидуум реципиентом терапевтического лечения NASH или нет. В конкретном варианте осуществления индивидуума, определенного как пациента с NASH (с низкой, умеренной или высокой активностью NASH или тяжелым NASH), будут лечить с помощью подходящего лечения NASH. В дополнительном конкретном варианте осуществления будут лечить индивидуумов с активностью NASH от умеренной до высокой или тяжелым NASH.
Кроме того, вычисление баллов NASH также позволяет прогнозировать то, будет ли пациент восприимчивым к лечению или нет, т.е. отвечающим или неотвечающим на лечение.
Аналогично балльная оценка NASH позволяет следить за прогрессированием или регрессированием патологии у пациентов с NASH. Кроме того, она делает возможным определение прогрессирования или регрессирования NASH после проведения лечения.
Балльная оценка NASH также делает возможной прогностическую оценку, т.е. прогнозирование исхода заболевания у пациента, например риск развития цирроза.
Фактически высокие баллы NASH свидетельствуют о том, что пациент имеет риск и у него может развить отрицательное явление, т.е. цирроз или даже смерть.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу классификации индивидуума как ре
- 6 044836 ципиента или не-реципиента или потенциального реципиента или потенциального не-реципиента лечения NASH, включающему определение уровней маркеров, как определено выше, вычисление баллов NASH, как представлено в настоящем описании, и классификацию индивидуума как (потенциального) реципиента или (потенциального) не-реципиента лечения с учетом указанных баллов NASH. Эта классификация также может служить основой для дальнейшего определения того, необходимо ли далее подвергать индивидуума дополнительному подтверждению NASH известными в этой области способами, такими как биопсия печени.
Кроме того, классификацию индивидуума также можно использовать для определения низкой активности NASH или умеренного NASH у индивидуума и предоставления индивидууму рекомендаций по питанию и/или образу жизни для реверсирования NASH с учетом этой классификации.
Пациент, подлежащий лечению, может иметь низкую, умеренную или высокую активность NASH или тяжелый NASH. Однако в предпочтительном варианте осуществления заявитель начал с предположения о том, что пациента, подлежащего лечению, определяют как пациента с риском.
Таким образом, пациента, рассматриваемого в настоящем изобретении, предпочтительно классифицируют как пациента с NASH от умеренного до тяжелого.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения индивидуумов, классифицируемых как имеющих активность NASH от умеренной до высокой или как пациентов с тяжелым NASH, рассматривают в качестве реципиентов или потенциальных реципиентов лечения NASH.
В контексте по настоящему изобретению, как правило, пациента с NASH определяют как имеющего следующие оценки при биопсии печени:
баллы стеатоза >1;
баллы баллонирования гепатоцитов >1;
баллы лобулярного воспаления >1;
NAS (баллы активности NAFLD) >3 (NAS определяют как сумму баллов стеатоза, баллов баллонирования гепатоцитов и баллов лобулярного воспаления).
Способы по изобретению включают измерение hsa-miR-34 (например, hsa-miR-34a) и циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме.
В конкретном варианте осуществления измерения уровней мкРНК осуществляют с использованием образцов плазмы и особенно образцов плазмы, не содержащих тромбоциты.
В соответствии со статистическим анализом биомаркеры также тестировали с использованием проверки на коллинеарность, как описано ниже.
Если у двух или более переменных наблюдают корреляцию выше 0,7, осуществляют одномерный анализ различия среднего относительно переменной ответа, определяющей пациентов. Это означает, что коллинеарные переменные также включены, если они существуют. Среди коллинеарных переменных выбирали переменную с наилучшим результатом в одномерном анализе. Эти выбранные переменные, а также другие неколлинеарные переменные включали в моделирование.
В настоящем изобретении уровни биомаркеров, измеренных, как описано выше, также можно использовать для определения балльной оценки заболевания, также называемой балльной оценкой NASH.
Таким образом, в настоящем описании также описывают способ, где баллы NASH вычисляют из измеренных уровней циркулирующих hsa-miR-34 или YKL-40 в крови, сыворотке или плазме и где диагностируют NASH и/или определяют стадию, или активность, или тяжесть NASH, и/или классифицируют индивидуума как реципиента или не-реципиента лечения NASH, и/или определяют эффективность лечения на основе введения лекарственного средства, и/или измеряют прогрессирование или регрессирование патологии у пациентов с NASH, и/или измеряют прогрессирование или регрессирование NASH после проведения лечения, и/или определяют пациента как восприимчивого к лечению или нет, и/или осуществляют прогностическую оценку, т.е. прогнозирование исхода заболевания у пациента.
Согласно изобретению, способ включает стадии измерения уровня циркулирующей hsa-miR-34 в крови, сыворотке или плазме;
измерение уровня циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме и необязательно по меньшей мере одного циркулирующего маркера повреждения печени в крови, сыворотке или плазме; и комбинирования результатов посредством математического алгоритма для получения балльной оценки NASH.
В конкретном варианте осуществления по меньшей мере один другой циркулирующий маркер повреждения печени выбирают из группы, состоящей из альфа-2-макроглобулина, гликированного гемоглобина (HbA1c), уровня глюкозы натощак, уровня фруктозамина, инсулина, С-пептида, оценки гомеостатической модели (НОМА), N-концевого про-пептида коллагена типа III, hsa-miR-200, CK18-M30, CK18-M65, АЛТ, ACT, удельного веса мочи), креатинина мочи, базофилов, высокочувствительного С-реактивного белка (HSCRP), β-NAG мочи, лейкоцитов, нейтрофилов и фибриногена. Эти измерения можно дополнять другими параметрами, такими как измерение роста индивидуума, как будет описано ниже. В конкретном варианте осуществления в способе по изобретению комбинируют измерение уровня
- 7 044836 miR34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p) и измерение уровня YKL-40. В дополнительном конкретном варианте осуществления в способе по изобретению комбинируют измерение уровня miR34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p) и измерение уровня YKL-40 и альфа-2-макроглобулина. В другом конкретном варианте осуществления в способе по изобретению комбинируют измерение уровня miR34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p) и измерение уровня YKL-40, альфа-2-макроглобулина и гликированного гемоглобина (HbA1c).
По настоящему изобретению в способах, представленных в настоящем описании, изменение уровней маркеров, анализируемых относительно уровней в контрольном образце, является показателем NASH, и/или стадии или тяжести NASH, и/или классификации индивидуума как реципиента или нереципиента лечения NASH, и/или эффективности лечения на основе введения лекарственного средства, и/или прогрессирования или регрессирования патологии у пациентов с NASH, и/или прогрессирования или регрессирования NASH после проведения лечения, и/или определения пациента как восприимчивого или невосприимчивого к лечению, и/или прогностической оценки, т.е. прогнозирования исхода заболевания пациента.
Термин балльная оценка NASH, также обозначаемый как S, в конкретном варианте осуществления может относиться к вероятности того, что пациент имеет активность NASH от умеренной до высокой или тяжелый NASH.
Первый подкласс пациентов.
В контексте по настоящему изобретению и в первом варианте изобретения первый подкласс пациентов определяют как пациента, у которого присутствуют следующие показатели при биопсии печени, или он эквивалентен ему:
баллы стеатоза >1;
баллы баллонирования гепатоцитов >1;
баллы лобулярного воспаления >1;
NAS (баллы активности NAFLD) >4 (NAS определяют как сумму баллов стеатоза, баллов баллонирования гепатоцитов и баллов лобулярного воспаления);
стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3).
Следующие способы можно осуществлять для диагностики NASH у индивидуума или для классификации индивидуума как потенциально имеющего указанные выше показатели при биопсии печени, или для характеризации пациента как реципиента или не-реципиента лечения NASH.
В первом варианте способа идентификации (или диагностики) первого подкласса пациентов, измеряют уровень hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p, и уровень YKL-40.
В предпочтительном варианте осуществления первого варианта изобретения способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p; и измерения уровня YKL-40;
измерения уровня по меньшей мере одного другого маркера, предпочтительно всех, выбранных в группе, состоящей из альфа-2-макроглобулина, гликированного гемоглобина (HbA1c), уровня глюкозы натощак или уровня фруктозамина,
N-концевого про-пептида коллагена типа III (PIIINP), hsa-miR-200, в частности hsa-miR-200a, более конкретно hsa-miR-200a-3p).
В конкретном варианте осуществления первого варианта изобретения баллы NASH по изобретению вычисляют с использованием следующих уровней маркеров, измеренных, как указано выше:
уровня miR-34a (более конкретно miR-34a-5p);
уровня альфа-2-макроглобулина;
уровня HbA1c;
уровня N-концевого про-пептида коллагена типа III;
уровня hsa-miR-200a (в частности, hsa-miR-200a-3p); и уровня YKL-40.
В дополнительном конкретном варианте осуществления первого варианта баллы определяют в виде логистической функции где
Y=k+ax A+b xB+cxC+dxD+fxF+gxG, где S представляет собой баллы NASH по настоящему изобретению;
А представляет собой уровень альфа-2-макроглобулина в г/л;
В представляет собой уровень HbAlc в процентах (например, В равно 10, если процентная доля измеренного HbAlc составляет 10%);
С представляет собой уровень N-концевого про-пептида коллагена типа III в нг/мл;
- 8 044836
D представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в Cq;
F представляет собой уровень hsa-miR-200 (в частности, hsa-miR-200a, более конкретно hsa-miR200a-3p) в Cq;
G представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;
k представляет собой константу логистической функции;
а представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем альфа-2-макроглобулина;
b представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем HbA1c;
с представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем N-концевого про-пептида коллагена типа III;
d представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR34a-5p);
f представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем hsa-miR-200 (в частности, hsa-miR-200a, более конкретно hsa-miR-200a-3p);
g представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем YKL-40;
Таким образом, баллы NASH представляют собой вероятность того, что пациент имеет активность NASH от умеренной до высокой или тяжелый NASH.
Если S выше или равны пороговому значению, индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH или потенциально подлежащего лечению NASH. В конкретном варианте осуществления, если S ниже порогового значения, индивидуума можно классифицировать как подлежащего лечению или неподлежащего лечению, в частности неподлежащего лечению, и/или индивидуума классифицируют как реципиента или потенциального реципиента рекомендаций по питанию и/или образу жизни для лечения низкой активности NASH или умеренного NASH у него.
В конкретном варианте осуществления, полученном с использованием медианной модели, как описано в экспериментальной части заявки, k является числом от 5,94 до 50,74;
а является числом от 0 до 1,07;
b является числом от 0 до 1,20;
с является числом от 0 до 0,24;
d является числом от -0,97 до 0;
f является числом от -0,87 до 0, g является числом от 0 до 1,74Е-05;
и где пороговое значение составляет от 0,2017 до 0,4645 и более конкретно равно 0,2302.
В конкретном варианте осуществления, индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2017 до 0,4645.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, полученном из медианной модели, k равно 25,13;
а равно 0,52;
b равно 0,57;
с равно 0,12;
d равно -0,43;
f равно -0,47; и g равно 9,54Е-06, и где пороговое значение составляет от 0,2017 до 0,4645 и более конкретно равно 0,2302.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2017 до 0,4645.
В конкретном варианте осуществления площадь под кривой (AUC) зависимости чувствительности от частоты ложноположительных результатов (ROC) по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82, более предпочтительно 0,84. AUC является хорошо известным критерием, используемым во многих областях для измерения качества алгоритма. Чем больше ее значение близко 1, тем лучше алгоритм.
В другом конкретном варианте осуществления, полученном из бутстреп-модели, как описано в экспериментальной части заявки, k является числом от 8,24 до 35,44;
а является числом от 0,06 до 0,88;
- 9 044836 b является числом от 0,14 до 1,04;
с является числом от 0,03 до 0,23;
d является числом от -0,75 до -0,05;
f является числом от -0,73 до -0,07, g является числом от 3,59Е-06 до 1,78Е-05, и где пороговое значение составляет от 0,2718 до 0,6391 и более конкретно равно 0,3502.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2718 до 0,6391.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, также полученном из бутстреп-модели, k равно 21,84;
а равно 0,47;
b равно 0,59;
с равно 0,13;
d равно -0,40;
f равно -0,40; и g равно 1,07Е-05, и где пороговое значение составляет от 0,2718 до 0,6391 и более конкретно равно 0,3502.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадии фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2718 до 0,6391.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82, более предпочтительно 0,84.
В конкретном варианте осуществления указанные выше способы, описанные для первого варианта, осуществляют с использованием образца плазмы.
В случае бутстреп-модели и медианной модели AUC являлась очень хорошей.
Это означает, что обе модели в настоящем изобретении можно использовать взаимозаменяемо.
Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему средства для определения уровня (i) hsa-miR-34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно miR-34a-5p) и YKL-40; и по меньшей мере одного другого маркера, в частности всех маркеров, выбранных из группы, состоящей из (ii) альфа-2-макроглобулина;
(iii) по меньшей мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из HbA1c, уровня глюкозы натощак, уровня фруктозамина;
(iv) N-концевого про-пептида коллагена типа III;
(v) hsa-miR-200 (в частности, hsa-miR-200a, более конкретно hsa-miR-200a-3p).
В конкретном варианте осуществления изобретения указанный набор содержит средства для определения уровня (i) hsa-miR-34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно miR-34a-5p);
(ii) альфа-2-макроглобулина;
(iii) HbA1c;
(iv) N-концевого про-пептида коллагена типа III; и (v) hsa-miR-200a (в частности, hsa-miR-200a, более конкретно hsa-miR-200a-3p) и YKL-40.
Набор по изобретению применим для осуществления способов, описанных выше, и может дополнительно необязательно включать инструкции для осуществления указанных способов. Набор может содержать реагенты и буферы, подходящие для осуществления измерений уровней маркеров, указанных выше. Набор содержит антитела, специфические для белка, подлежащего количественному анализу, и/или праймеры, применимые для количественного анализа уровней микроРНК, как хорошо известно в этой области.
В этом первом варианте настоящего изобретения заявитель углубился в исследования и решил сфокусироваться на циркулирующих мкРНК в сыворотке.
Как правило, различные циркулирующие маркеры, особенно мкРНК, оценивают с использованием плазмы различных пациентов с риском, подлежащих лечению.
В новом подходе заявитель оценивал различные циркулирующие маркеры с использованием сывороток. Сыворотку можно определять как прозрачную желтоватую жидкость, полученную после разделения цельной крови на твердые и жидкие компоненты после того, как ей позволили свернуться.
мкРНК, анализируемые с использованием сывороток, выражают в Log10(копий/мкл сыворотки), и подробности способа определения этого значения представлены ниже.
- 10 044836
В другой модели мкРНК, анализируемые с использованием сывороток, выражают в Cq.
В предпочтительном варианте осуществления, в котором мкРНК анализируют с использованием сывороток и выражают в Cq по первому варианту по изобретению, способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34 в сыворотке, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p, и измерения уровня циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме и необязательно по меньшей мере одного циркулирующего маркера повреждения печени в крови, сыворотке или плазме; и комбинирования результатов посредством математического алгоритма для получения баллов NASH.
В другом предпочтительном варианте осуществления этого аспекта изобретения способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34 в сыворотке, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p;
измерения уровня альфа-2-макроглобулина;
измерения уровня гликированного гемоглобина (HbA1c), уровня глюкозы натощак или уровня фруктозамина;
измерения уровня YKL-40.
В конкретном варианте осуществления первого аспекта изобретения баллы NASH по изобретению вычисляют из следующих уровней маркеров, измеренных, как указано выше:
уровня miR-34a (более конкретно miR-34a-5p), измеренного в сыворотке;
уровня альфа-2-макроглобулина в сыворотке;
уровня YKL-40 в сыворотке; и уровня HbA1c.
В конкретном варианте осуществления баллы определяют в виде логистической функции с использованием уровня has-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в сыворотке, выраженного в единицах Cq,
где
Y=k+ax A+b xB+cxC+dxD, где S представляет собой баллы NASH;
А представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в сыворотке в Cq;
В представляет собой сыворотка уровень альфа-2-макроглобулина в г/л;
С представляет собой сыворотка уровень YKL-40 в пг/мл;
D представляет собой уровень HbAlc в процентах (например, D равно 10, если измеренная процентная доля HbAlc составляет 10%);
k представляет собой константу логистической функции;
а представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем hsa-miR-34a (в частности hsa-miR34a-5p) в сыворотке;
b представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем альфа-2-макроглобулина в сыворотке;
с представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем YKL-40 в сыворотке;
d представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем HbA1c.
Если S выше или равны пороговому значению, индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH или потенциально подлежащего лечению NASH. В конкретном варианте осуществления, если S ниже порогового значения, индивидуума можно классифицировать как подлежащего лечению или неподлежащего лечению, в частности неподлежащего лечению, и/или индивидуума классифицируют как реципиента или потенциального реципиента рекомендаций по питанию и образу жизни для лечения низкой активности NASH или умеренного NASH у него.
В конкретном варианте осуществления, полученном из бутстреп-модели, как описано в экспериментальной части заявки, k является числом от 9,51 до 34,37;
а является числом от -1,17 до -0,47;
b является числом от 0,02 до 0,84;
с является числом от 6,10Е-06 до 2,09Е-05;
d является числом от 0,07 до 0,89, и где пороговое значение составляет от 0,2013 до 0,5965 и более конкретно равно 0,4661.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2013 до 0,5965.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, также полученном из бутстреп-модели,
- 11 044836 к равно 21,94;
а равно -0,82;
b равно 0,43;
с равно 1,35Е-05;
d равно 0,48, и где пороговое значение составляет от 0,2013 до 0,5965 и более конкретно равно 0,4661.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2013 до 0,5965.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, полученном из медианной модели, как описано в экспериментальной части заявки, к является числом от 6,02 до 56,69;
а является числом от -1,26 до 0,00;
b является числом от 0,00 до 0,88, с является числом от 0,00 до 2,00Е-05;
d является числом от 0,00 до 0,96, и где пороговое значение составляет от 0,9773 до 0,9955 и более конкретно равно 0,9936.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего стеатоз >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,9773 до 0,9955.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, также полученном из медианной модели, к равно 28,17;
а равно -0,84;
b равно 0,36;
с равно 1,23Е-05;
d равно 0,41, и где пороговое значение составляет от 0,9773 до 0,9955 и более конкретно равно 0,9936.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS >4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,9773 до 0,9955.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82.
В случае бутстреп-модели и медианной модели AUC являлась очень хорошей.
Это означает, что обе модели в настоящем изобретении можно использовать взаимозаменяемо.
В конкретном варианте осуществления первого варианта изобретения, в котором мкРНК анализируют с использованием сывороток и выражают в копиях/мкл (log10), способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p, и измерения уровня циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме и необязательно по меньшей мере одного циркулирующего маркера повреждения печени в крови, сыворотке или плазме; и комбинирования результатов посредством математического алгоритма для получения баллов NASH.
В другом предпочтительном варианте осуществления этого первого варианта изобретения способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности, hsa-miR-34a, и более конкретно - hsa-miR-34a-5p;
измерения уровня альфа-2-макроглобулина;
измерения уровня гликированного гемоглобина (HbA1c), уровня глюкозы натощак или уровня фруктозамина;
измерения уровня YKL-40.
В этом конкретном варианте осуществления баллы определяют в виде логистической функции с использованием уровня has-miR-34a в сыворотке (в частности, hsa-miR-34a-5p), выраженного в копиях/мкл (log10).
где
Y=k+ax A+b xB+cxC+dxD,
- 12 044836 где S представляет собой баллы NASH;
А представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в сыворотке в копиях/мкл (log10);
В представляет собой уровень альфа-2-макроглобулина в сыворотке в г/л;
С представляет собой уровень YKL-40 в сыворотке в пг/мл;
D представляет собой уровень HbA1c в процентах (например, D равно 10, если измеренная процентная доля HbA1c составляет 10%);
k представляет собой константу логистической функции;
а представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем hsa-miR-34a (в частности hsa-miR34a-5p) в сыворотке;
b представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем альфа-2-макроглобулина в сыворотке;
с представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем YKL-40 в сыворотке;
d представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем HbA1c.
Таким образом, баллы NASH представляют собой вероятность того, что пациент имеет активность NASH от умеренной до высокой или тяжелый NASH.
Если S выше или равны пороговому значению, индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH или потенциально подлежащего лечению NASH. В конкретном варианте осуществления, если S ниже порогового значения, индивидуума можно классифицировать как подлежащего лечению или неподлежащего лечению, в частности неподлежащего лечению, и/или индивидуума классифицируют как реципиента или потенциального реципиента, рекомендаций по питанию и/или образу жизни для лечения низкой активности NASH или умеренного NASH у него.
В конкретном варианте осуществления, полученном из бутстреп-модели, как описано в экспериментальной части заявки, k является числом от -14,50 до -7,40;
а является числом от 1,38 до 3,58;
b является числом от 0,02 до 0,84;
с является числом от 5,98Е-06 до 2,08Е-05;
d является числом от 0,07 до 0,89, и где пороговое значение составляет от 0,1895 до 0,6089 и более конкретно равно 0,4255.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,1895 до 0,6089.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, также полученном из бутстреп-модели, k равно -10,95;
а равно 2,48;
b равно 0,43;
с равно 1,34Е-05;
d равно 0,48, и где пороговое значение составляет от 0,1895 до 0,6089 и более конкретно равно 0,4255.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,1895 до 0,6089.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, полученном из медианной модели, как описано в экспериментальной части заявки, k является числом от -27,16 до -0,78;
а является числом от 0 до 3,97;
b является числом от 0 до 0,89, с является числом от 0 до 1,98Е-05;
d является числом от 0 до 0,97, и где пороговое значение составляет от 0,1421 до 0,4556 и более конкретно равно 0,3201.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или
- 13 044836 потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от
0,1421 до 0,4556.
В дополнительном конкретном варианте осуществления k равно -11,03;
а равно 2,59;
b равно 0,38;
с равно 1,21Е-05;
d равно 0,40, и где пороговое значение составляет от 0,1421 до 0,4556 и более конкретно равно 0,3201.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,1421 до 0,4556.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82.
В последнем варианте осуществления этого первого варианта, касающегося мкРНК, анализируемой с использованием сывороток и выражаемой в копиях/мкл (log10), заявитель также решил преобразовать измеренные значения некоторых из других биомаркеров в значения log10. Это означает, что измеренные значения некоторых маркеров, определенных выше, выражают в log10.
Таким образом, в этом последнем варианте осуществления первого аспекта изобретения способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p, или hsamiR-122, в частности hsa-miR-122-5p, и измерения уровня циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме и необязательно по меньшей мере одного циркулирующего маркера повреждения печени в крови, сыворотке или плазме; и комбинирования результатов посредством математического алгоритма для получения баллов NASH.
В другом предпочтительном варианте осуществления этого варианта изобретения способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p, в сыворотке;
измерения уровня log10(HOMA) (оценки гомеостатической модели), или уровня глюкозы натощак в плазме, или уровня глюкозы натощак в сыворотке, или 1од10(фруктозамина), или НВА1С, или инсулина, или С-пептида;
измерения уровня log10(YKL-40).
В этом конкретном варианте осуществления баллы определяют в виде логистической функции с использованием уровня в сыворотке has-miR-34a (в частности hsa-miR-34a-5p), выраженного в копиях/мкл (log10).
где
Y=k+ax A+b х B+c х C, где S представляет собой баллы NASH;
А представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в сыворотке в копиях/мкл (log10);
В представляет собой уровень log10(HOMA) в сыворотке;
С представляет собой уровень log10(YKL-40) в сыворотке, k представляет собой константу логистической функции;
а представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем hsa-miR-34a (в частности hsa-miR34a-5p) в сыворотке;
b представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем log10(HOMA) в сыворотке;
с представляет собой коэффициент, ассоциированный с уровнем log10(YKL-40) в сыворотке.
Таким образом, баллы NASH представляют собой вероятность того, что пациент имеет активность NASH от умеренной до высокой или тяжелый NASH.
Если S выше или равны пороговому значению, индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH или потенциально подлежащего лечению NASH. В конкретном варианте осуществления, если S ниже порогового значения, индивидуума можно классифицировать как подлежащего лечению или неподлежащего лечению, в частности неподлежащего лечению и/или индивидуума классифицируют как реципиента или потенциального реципиента рекомендаций по питанию и/или образу жизни для лечения низкой активности NASH или умеренного NASH у него.
- 14 044836
В конкретном варианте осуществления, полученном из бутстреп-модели, как описано в экспериментальной части заявки, k является числом от -25,68 до -13,34;
а является числом от 1,62 до 3,78;
b является числом от 0,40 до 2,52;
с является числом от 1,37 до 3,61.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2392 до 0,5907.
В дополнительном конкретном варианте осуществления, также полученном из бутстреп-модели, k равно -19,51;
а равно 2,70;
b равно 1,46;
с равно 2,49, и где пороговое значение составляет от 0,2392 до 0,5907 и более конкретно равно 0,5313.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >2 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,2392 до 0,5907.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,80, предпочтительно 0,82.
Второй подкласс пациентов.
В контексте по настоящему изобретению и во втором варианте изобретения второй подкласс пациентов определяют как (или он эквивалентен) пациента, у которого присутствуют следующие показатели при биопсии печени:
баллы стеатоза >1;
баллы баллонирования гепатоцитов >1;
баллы лобулярного воспаления >1;
NAS (баллы активности NAFLD) >4 (NAS определяют как сумму баллов стеатоза, баллов баллонирования гепатоцитов и баллов лобулярного воспаления);
стадия фиброза >1 (такая как стадия фиброза, равная 1, 2, 3 или 4).
Способы по изобретению включают измерение hsa-miR-34 и YKL-40 и необязательно по меньшей мере одного другого циркулирующего маркера повреждения печени в крови, сыворотке или плазме.
В соответствии со статистическим анализом, биомаркеры также тестировали посредством проверки на коллинеарность, как описано ниже.
В первом варианте способа идентификации (или диагностики) второго подкласса пациентов измеряют уровень hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p, и уровень YKL-40.
В предпочтительном варианте осуществления второго варианта изобретения способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p;
измерения уровня YKL-40; и необязательно измерения уровня удельного веса мочи или креатинина мочи;
измерения уровня базофилов; и измерения уровня HSCRP (высокочувствительного С-реактивного белка).
В более предпочтительном варианте осуществления этого второго варианта изобретения, полученного из медианной модели, способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p;
измерение уровня YKL-40.
В конкретном варианте осуществления второго варианта изобретения баллы NASH по изобретению вычисляют из следующих уровней маркеров, измеренных, как указано выше:
уровня miR-34a (более конкретно - miR-34a-5p); и уровня YKL-40.
В дополнительном конкретном варианте осуществления второго варианта изобретения баллы определяют в виде логистической функции где
Y=k+axA+bxB, где S представляет собой баллы NASH;
А представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в Cq;
- 15 044836
В представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;
к является числом от -116,08 до 40,97;
а является числом от -0,82 до 0;
b является числом от 0 до 1,88Е-05, и где пороговое значение составляет от 0,1387 до 0,3481 и более конкретно равно 0,2187.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,1387 до 0,3481, более конкретно равны 0,2187.
Если S выше или равны пороговому значению, индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1 и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH или потенциально подлежащего лечению NASH. В конкретном варианте осуществления, если S ниже порогового значения, индивидуума можно классифицировать как подлежащего лечению или неподлежащего лечению, в частности неподлежащего лечению, и/или индивидуума классифицируют как реципиента или потенциального реципиента, рекомендаций по питанию и/или образу жизни для лечения низкой активности NASH или умеренного NASH у него.
В конкретном варианте осуществления, также полученном из медианной модели, как описано в экспериментальной части заявки, k равно 12,87;
а равно -0,42;
b равно 8,160Е-06, и где пороговое значение составляет от 0,1387 до 0,3481 и более конкретно равно 0,2187.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,1387 до 0,3481, более конкретно равны 0,2187.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,68, предпочтительно 0,70.
В другом предпочтительном варианте осуществления этого второго варианта изобретения, полученного из бутстреп-модели, способ включает стадии измерения уровня hsa-miR-34, в частности hsa-miR-34a, более конкретно hsa-miR-34a-5p;
измерения уровня YKL-40;
измерения уровня удельного веса мочи;
измерения уровня базофилов;
измерения уровня HSCRP.
В конкретном варианте осуществления второго варианта изобретения баллы NASH по изобретению вычисляют из следующих уровней маркеров, как указанно выше:
уровня miR-34a (более конкретно, miR-34a-5p);
уровня YKL-40;
уровня удельного веса мочи;
уровня базофилов; и уровня HSCRP.
В дополнительном конкретном варианте осуществления второго варианта изобретения баллы определяют в виде логистической функции где
Y=k+axA+bxB+cxC+dxD+fxF, где S представляет собой баллы NASH;
А представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в Cq;
В представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;
С представляет собой уровень удельного веса мочи (без единиц);
D представляет собой уровень базофилов в 10е9/л;
F представляет собой уровень HSCRP в мг/дл;
к является числом от -124,81 и 1,13;
а является числом от -0,91 до -0,25;
b является числом от 4,77е-06 до 2,39е-05;
с является числом от 17,21 до 141,51;
d является числом от 2,80 до 60,74;
- 16 044836 f является числом от 0,01 до 0,23, и где пороговое значение составляет от 0,5791 до 0,8269 и более конкретно равно 0,7758.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,5791 до 0,8269.
Если S выше или равны пороговому значению, индивидуума классифицируют как имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1 и/или классифицируют как подлежащего лечению NASH или потенциально подлежащего лечению NASH. В конкретном варианте осуществления, если S ниже порогового значения, индивидуума можно классифицировать как подлежащего лечению или неподлежащего лечению, в частности неподлежащего лечению, и/или индивидуума классифицируют как реципиента или потенциального реципиента, рекомендаций по питанию и/или образу жизни для лечения низкой активности NASH или умеренного NASH у него.
В конкретном варианте осуществления, полученном из бутстреп-модели, как описано в экспериментальной части заявки, k равно -61,84;
а равно -0,58;
b равно 1,44Е-05;
с равно 79,36;
d равно 31,77;
f равно 0,12, и где пороговое значение составляет от 0,5791 до 0,8269 и более конкретно равно 0,7758.
В конкретном варианте осуществления индивидуума классифицируют как имеющего NASH или имеющего или потенциально имеющего баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1 и/или классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения, если баллы NASH S выше или равны пороговому значению от 0,5791 до 0,8269.
В конкретном варианте осуществления AUC по меньшей мере равна 0,75, предпочтительно 0,77.
Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему средства для определения уровня, (i) по меньшей мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из hsa-miR-34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно miR-34a-5p); и (ii) YKL-40; и необязательно (iii) удельного веса мочи или креатинина мочи; базофилов и HSCRP (высокочувствительного С-реактивного белка).
В конкретном варианте осуществления изобретения указанный набор содержит средства для определения уровня (i) hsa-miR-34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно miR-34a-5p); и (ii) YKL-40.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанный набор содержит средства для определения уровня (i) hsa-miR-34 (в частности, hsa-miR-34a, более конкретно miR-34a-5p);
(ii) YKL-40;
(iii) удельного веса мочи;
(iv) базофилов; и (v) HSCRP.
Набор по изобретению применим для осуществления способов, описанных выше, и может дополнительно необязательно включать инструкции по осуществлению указанных способов. Набор может содержать реагенты и буферы, подходящие для осуществления измерений уровней маркеров, указанных выше. Набор содержит антитела, специфические для белка, подлежащего количественному анализу, и/или праймеры, применимые для количественного анализа уровней микроРНК, как хорошо известно в этой области.
По другому аспекту настоящее изобретение также относится к различным способам классификации пациентов.
Настоящее изобретение также относится к другим заболеваниям печени и более конкретно фиброзным заболеваниям печени, таким как вирусный гепатит (HBV, HCV), алкогольный стеатогепатит, заболевания желчных путей (первичный биллиарный холангит, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, болезнь Вильсона, недостаточность альфа-1-антитрипсина).
- 17 044836
Примеры
Материалы и способы.
Сбор и анализы образцов.
Клиническое исследование.
Клиническое исследование (исследование фазы 2 GOLDEN-505 NASH (GFT505-212-7-NCT01694849) является многоцентровым, рандомизированным, двойным слепым, плацебо-контролируемым исследованием для оценки эффективности и безопасности введения элафибранора (1-[4-метилтиофенил]-3-[3,5диметил-4-карбоксидиметилметилоксифенил]проп-2-ен-1-она) раз в сутки в отношении стеатогепатита у пациентов с неалкогольным стеатогепатитом (NASH).
Биопсию печени осуществляли для подтверждения диагноза NASH после соответствующего исключения заболевания печени другой этиологии. NASH диагностировали как стеатогепатит, оцениваемый посредством биопсии печени в пределах 6 месяцев до рандомизации. Подтверждение стеатогепатита было основано на централизованном анализе биоптатов печени. Пациентов NASH определяли как имеющих NAS >3, включая баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1 и баллы лобулярного воспаления >1.
Исследование было одобрено соответствующими регулирующими органами в каждом участвующем центре, и все пациенты давали согласие на участие в медицинском исследовании.
Образцы плазмы из исследования фазы 2 GOLDEN-505 NASH использовали для идентификации наиболее мощных и значимых маркеров NASH.
Биопсию печени осуществляли для подтверждения диагноза NASH после соответствующего исключения заболевания печени другой этиологии.
NASH диагностировали как стеатогепатит, оцениваемый посредством биопсии печени в пределах 6 месяцев до рандомизации. Подтверждение стеатогепатита было основано на централизованном анализе биоптатов печени.
Исследование было одобрено соответствующими регулирующими органами в каждом участвующем центре, и все пациенты давали согласие на участие в медицинском исследовании.
Забор крови и лабораторное тестирование.
Образцы крови получали в соответствии с центральным лабораторным протоколом и руководством Genfit - GFT505-212-7.
В соответствии с протоколом исследования осуществляли следующие анализы.
Гематология включает гемоглобин, гематокрит, количество эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы - абсолютные значения и % значения), тромбоциты и ретикулоциты.
Биохимическая панель I включает глюкозу плазмы, триглицериды (TG), креатинин, клиренс креатинина, гамма-глутамилтрансферазу (GGT), аспартатаминотрансферазу (ACT), аланинаминотрансферазу (АЛТ), креатинфосфокиназу (СРК), щелочную фосфатазу, тиреотропный гормон (TSH) и HbA1c.
Биохимическая панель II включает глюкозу плазмы, креатинин, клиренс креатинина, общий белок, альбумин, натрий, калий, хлорид, кальций, мочевую кислоту, мочевину, выраженную как азот мочевины крови (BUN), аспартатаминотрансферазу (ACT), аланинаминотрансферазу (АЛТ), гамма-глутамилтрансферазу (GGT), щелочную фосфатазу, креатинфосфокиназу (СРК), общий билирубин, конъюгированный билирубин, С-реактивный белок (hsCRP), соотношение АСТ/АЛТ и HbA1c.
Анализ мочи включает анализ с использованием тест-полосок (удельный вес, рН, RBC, лейкоциты, глюкоза, белок, кетоны, билирубин, уробилиноген и нитрит);
микроскопический анализ включает эритроциты, лейкоциты, цилиндры, кристаллы, бактерии, эпителиальные клетки и дрожжи;
химический анализ (альбумин и креатинин).
Серология включает антитела против ВИЧ I/II, антитела против HCV, РНК HCV (тестировали только после получения образцов при посещении для анализа РНК HCV и в случае реактивного или промежуточного результата на антитела против HCV) и HbsAg.
Липидная панель включает триглицериды (TG), общий холестерин, не-HDL-C (вычисление), холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL-C), липопротеины низкой плотности (LDL-C) (вычисление), вычисленный холестерин липопротеинов очень низкой плотности (VLDL-C) (вычисление), аполипопротеин AI (ApoAI) и аполипопротеин В (АроВ).
Химический анализ мочи включает альфа-1-микроглобулин, бета-N-ацетилглюкозаминидазы (бета-NAG) и нейтрофил-желатиназа-ассоциированный липокалин (N-Gal).
Маркеры безопасности включают гомоцистеин, NT-ProBNP, тропонин Т, цистатин С и бета-2микроглобулин.
Гликемические и другие липидные параметры включают лептин, инсулин, оценку гомеостатической модели (HOMA-IR), глюкозу сыворотки (для вычисления HOMA-IR), фруктозамин, С-пептид и свободные жирные кислоты (FFA).
- 18 044836
Воспалительные маркеры включают гаптоглобин, фибриноген, фактор некроза опухоли (ФНО), интерлейкин-6 (ИЛ-6) и ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1) Ag (цитрат).
Маркеры печени включают цитокератин-18 (СК18) (М65 и М30), адипонектин, ферритин, альфа2-макроглобулин, FGF19 и FGF21, гиалуроновую кислоту (Advia centaur, реагент, производимый Siemens Belgium и переданный Genfit), N-концевой про-пептид коллагена типа III (PIIINP) (Advia centaur, реагент, производимый Siemens Belgium) и тканевый ингибитор матричной металлопротеазы-1 (TIMP-1) (Advia centaur, реагент, производимый Siemens).
Список способов, инструментов и производителей для каждого биохимического анализа приведен в этой таблице.________________________________________________________________________________
| Параметр | Способ | Инструмент | Производитель |
| Лептин | ELISA | вручную | R&D systems |
| Инсулин | CLIA | Immulite 2000 | Siemens |
| HOMA-IR | Вычисление с использованием глюкозы и инсулина | ||
| Фруктозамин | Колориметрический способ | Modular Р800 | Roche Diagnostics |
| С-пептид | CLIA | Immulite 2000 | Siemens |
| Гаптоглобин | Иммунотурбидиметрия | Modular P800 | Roche Diagnostics |
| Фибриноген | Способ Клаусса | STAR- evolution | Stago |
| ФНО | Муль тианалитное профилирование с использование флуорокина | Luminex | Millipore |
| ИЛ-6 | Муль тианалитное профилирование с использование флуорокина | Luminex | Millipore |
| ΡΑΙ-l Ад | ELISA | вручную | Stago |
| FFA | ACS-ACOD | Modular P800 | Roche Diagnostics |
| СК18 МЗО | ELISA | вручную | Peviva |
| СК18 М65 | ELISA | вручную | Peviva |
| Адипонектин | ELISA | вручную | Millipore |
| Ферритин | ECLIA | Modular E170 | Roche Diagnostics |
| Альфа-2макроглобулин | Нефелометрия | BN II | Siemens |
| Гиалуроновая кислота | Иммунологический анализ | Advia centaur | Siemens |
| PIIINP | Иммунологический анализ | Advia centaur | Siemens |
| TIMP-1 | Иммунологический анализ | Advia centaur | Siemens |
| FGF-19 | ELISA | вручную | R&D systems |
- 19 044836
| FGF-21 | ELISA | вручную | R&D systems |
| Висфатин | ELISA | вручную | Alpco immunoassays |
| Резистин | ELISA | вручную | R&D systems |
| YKL40, CHi3Ll | Иммунологический анализ хитиназа-3-подобного белка 1 человека Quantikine ® ELISA Кат. № DC3L10 Для количественного определения концентрации хитиназа-3подобного белка 1 человека (CHI3L1) в супернатантах культур клеток, сыворотке, плазме и моче. |
Получение и хранение образцов.
Образцы крови, используемые в этом исследовании биомаркеров, получали от пациентов исследования 505.212.7 до периода лечения. От каждого пациента получали письменное информированное согласие на получение, хранение и использование дополнительных образцов.
Кровь, собранную в пробирки 2,7 мл, содержащие цитрат, обрабатывали посредством отделения бесклеточной плазмы от клеток крови посредством центрифугирования при 1500xg в течение 15 мин. Супернатант плазмы переносили в новую пробирку. Пробирки хранили при -70°С.
Для перехода к выделению РНК пробирки с плазмой центрифугировали при 13000xg в течение 2 мин для осаждения и удаления тромбоцитов. Супернатант плазмы, не содержащий тромбоциты, переносили в новую пробирку, замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.
Выделение тотальной РНК и количественный анализ мкРНК в цитратной плазме.
Тотальную РНК с сохраненной мкРНК выделяли из 400 мкл не содержащей тромбоциты плазмы с помощью набора для выделения miRNeasy (miRNeasy Serum/Plasma Kit (кат. № 217184)) с использованием соотношения плазма/QIAzol 1:5 по инструкциям производителя. В образцы [3,125 фмоль] добавляли синтетическую добавочную miR-39 С. elegans до выделения РНК в качестве внутреннего контроля при выделении РНК. Элюцию осуществляли в 18 мкл элюирующего буфера.
Экспрессию зрелой мкРНК определяли по инструкциям производителя с использованием анализа qRT-ПЦР мкРНК Taqman: набор для обратной транскрипции микроРНК TaqMan (Ref: 4366596, Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 20-кратная смесь для анализа микроРНК TaqMan (Ref: 4440887, Applied Biosystems) и универсальный мастер-микс TaqMan II (Ref: 4440040, Applied Biosystems).
Обратную транскрипцию осуществляли с использованием термоциклера GeneAmp® PCR System 9700 (Ref: 200005, Applied Biosystems) с условиями циклов 16°C в течение 30 мин, затем 42°С в течение 30 мин и 85°С в течение 5 мин перед хранением при 4°С. Обратную транскрипцию осуществляли в мультиплексном формате с использованием 4 мкРНК-специфических обратных праймеров для сохранения образца РНК.
Количественную ПЦР осуществляли с использованием системы CFX96™ Real-Time System (термоциклер С1000 Touch™, BioRad) с условиями циклов 95°С в течение 10 мин, затем 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 60 с всего в течение 50 циклов и 30°С в течение 30 с.
Последовательности специфических праймеров для мкРНК, потенциально представляющих интерес, выбирали в соответствии с представленным в следующей табл. 1.
Таблица 1
Последовательности тестируемой мкРНК
| Зрелая мкРНК | ID анализа (Life Technol ogies) | Последовательность зрелой мкРНК | Номер в mirBase | Поставщик |
| cel-miR-39-3p | 000200 | UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG (SEQ ID NO:1) | ΜΙΜΆΤ0000010 | Life technologies |
| hsa-miR-122- 5p | 002245 | UGGAGUGUGAGAAUGGUGUUUG (SEQ ID NO:2) | ΜΙΜΆΤ0000421 | Life technologies |
-20044836
| hsa-miR-34a- 5р | 000426 | UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU (SEQ ID NO:3) | ΜΙΜΆΤ0000255 | Life technologies |
| hsa-miR-200a- Зр | 000502 | UAACACU GU CU GGUAAC GAU GU (SEQ ID NO:4) | ΜΙΜΆΤ0000318 | Life technologies |
| hsa-miR-2 9b- Зр | 000413 | UAGCAC CAUUU GAAAU CAGU GUU (SEQ ID NO:5) | ΜΙΜΆΤ0000100 | Life technologies |
| hsa-miR-1925р | 000491 | CU GAC CUAU GAAUU GACAGC C (SEQ ID NO:6) | ΜΙΜΆΤ0000222 | Life technologies |
| hsa-miR-221- Зр | 000524 | AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC (SEQ ID NO:7) | ΜΙΜΆΤ0000278 | Life technologies |
| hsa-miR-103aЗр | 000439 | AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA (SEQ ID NO:8) | ΜΙΜΆΤ0000101 | Life technologies |
| hsa-miR-155- 5р | 002623 | UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU (SEQ ID NO:9) | ΜΙΜΆΤ0000646 | Life technologies |
| hsa-miR-199a -5р | 000498 | С C CAGU GUU CAGACUAC CU GUU C (SEQ ID NO:10) | ΜΙΜΆΤ0000231 | Life technologies |
Данные, используемые при конструировании алгоритма, находились в формате Cq. Режим определения Cq представлял собой регрессию.
Выделение тотальной РНК и количественный анализ мкРНК в сыворотке.
Тотальную РНК в сыворотке с сохраненной мкРНК выделяли из 100 мкл сыворотки с помощью набора для выделения miRVanaParis (АМ1556, Ambion) по инструкциям производителя. К образцам [3,125 фмоль] добавляли синтетическую добавочную miR-39 С. elegans (MSY0000010, Qiagen) до выделения РНК в качестве внутреннего контроля при выделении РНК. Элюцию осуществляли в 100 мкл элюирующего буфера.
Экспрессию зрелой мкРНК определяли по инструкциям производителя с использованием анализа qRT-ПЦР мкРНК Taqman: набор для обратной транскрипции микроРНК TaqMan (Ref: 4366596, Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 20-кратная смесь для анализа микроРНК TaqMan (Ref: 4440887, Applied Biosystems) и универсальный мастер-микс TaqMan II (Ref: 4440040, Applied Biosystems).
Обратную транскрипцию осуществляли с использованием термоциклера GeneAmp® PCR System 9700 (Ref: 200005, Applied Biosystems) с условиями циклов 16°С в течение 30 мин, затем 42°С в течение 30 мин и 85°С в течение 5 мин перед хранением при 4°С. Обратную транскрипцию осуществляли в мультиплексном формате с использованием 4 мкРНК-специфических обратных праймеров для сохранения образца РНК.
Количественную ПЦР осуществляли с использованием системы CFX96™ Real-Time System (термоциклер С1000 Touch™, BioRad) с условиями циклов 95°С в течение 10 мин, затем 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 60 с всего в течение 50 циклов и 30°С в течение 30 с.
Последовательности специфических праймеров для интересующих мкРНК выбирали в соответствии с представленным в следующей таблице.
| Зрелая мкРНК | ID анализа | Последовательность зрелой мкРНК | Номер в mirBase | Поставщик |
| cel-miR-3 9- 3p | 000200 | UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG | MIMAT000001 0 | Li f e technologies |
| hsa-miR- 122-5p | 002245 | U GGAGU GU GACAAU G GU GUUU G | ΜΙΜΆΤ000042 1 | Li f e technologies |
| hsa-miR34a-5p | 000426 | UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU | MIMAT000025 5 | Li f e technologies |
| hsa-miR- 2 00a-3p | 000502 | UAACACU GU CU GGUAAC GAU GU | MIMAT000031 8 | Li f e technologies |
| hsa-miR- 29b-3p | 000413 | UAGCAC CAUUU GAAAU CAGU GU U | ΜΙΜΆΤ000010 0 | Li f e technologies |
| hsa-miR- 192-5p | 000491 | CU GAC CUAU GAAUU GACAG С C | ΜΙΜΆΤ000022 2 | Li f e technologies |
- 21 044836
| hsa-miR- 221-Зр | 000524 | AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUU С | MIMAT000027 8 | Life technologies |
| hsa-miR- | 000439 | AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUG | MIMAT000010 | Life |
| 1ОЗа-Зр | А | 1 | technologies | |
| hsa-miR- | 002623 | UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG | MIMAT000064 | Life |
| 155-5р | и | 6 | technologies | |
| hsa-miR- | 000498 | С С CAGU GUU CAGACUAC CU GUU | MIMAT000023 | Life |
| 199а -5р | С | 1 | technologies |
Синтетическую hsa-мкРНК (Integrated DNA Technologies) разводили до 3,125 фмоль/мл и 5 мкл использовали для обратной транскрипции одновременно с РНК, выделенной из образцов сыворотки. Продукт серийно разводили и осуществляли ПЦР с использованием всех образцов (стандарты и РНК из сыворотки). Построение стандартных кривых осуществляли в двух параллелях и использовали для преобразования данных Cq в копии/мкл. Режимом определения Cq являлась регрессия. Данные, используемые для построения алгоритма, находились в формате Ьс^10(копии/мкл сыворотки).
| Ref . ID | Олигорибон уклеотид | Последовательность одноцепочечной РНК | MW | Tm (°C) | Содержа ние GC (%) | Постав щи к |
| 69861876 | cel-miR- 39-3p | 5'Phos- UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG- 3 ' | 7098,2 | 53,2 | 50,0 | IDT |
| 69861877 | hsa-miR122-5p | 5'Phos- UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG- 3 ' | 7196,2 | 50,7 | 45,5 | IDT |
| 69861878 | hsa-miR- 29b-3p | 5'Phos- UAGCAC CAUUU GAAAU CAGU GUU - 3 ' | 7373,4 | 44,9 | 34,8 | IDT |
| 69861879 | hsa-miR- 34a-5p | 5'Phos- UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU- 3 ' | 7109,1 | 53,0 | 50,0 | IDT |
| 69861880 | hsa-miR- 192-5p | 5'Phos- CUGACCUAUGAAUUGACAGCC-3' | 6376,0 | 53,4 | 47,6 | IDT |
| 69861881 | hsa-miR- 221-3p | 5'Phos- AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC- 3 ' | 7358,3 | 51,8 | 47,8 | IDT |
| 69861882 | hsa-miR- 103a-3p | 5'Phos- AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA- 3 ' | 7490,5 | 59,4 | 47,8 | IDT |
| 69861883 | hsa-miR- 155-5p | 5'Phos- UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU- 3 ' | 7469,4 | 50,7 | 39,1 | IDT |
| 69861884 | hsa-miR199a-5p | 5'Phos- C C CAGU GUU CAGACUAC CU GUU C- 3 ' | 7300,3 | 51,9 | 52,2 | IDT |
| 69861885 | hsa-miR- 200a-3p | 5'Phos- UAACACU GU CU GGUAAC GAU GU- 3 ' | 7083,2 | 51,3 | 40,9 | IDT |
Статистический анализ.
Цель и определение.
Целью этих анализов являлось обнаружение биомаркеров, которые могут быть связаны с идентификацией пациентов с NASH, подлежащих лечению. Пациентов, подлежащих лечению (ТВТ), определяют по-разному в зависимости от различных частей исследования.
-22 044836
В первом аспекте изобретения ТВТ определяют как баллы стеатоза >1;
баллы баллонирования гепатоцитов >1;
баллы лобулярного воспаления >1;
NAS (баллы активности NAFLD) >4 (NAS определяют как сумму баллов стеатоза, баллов баллонирования гепатоцитов и баллов лобулярного воспаления);
стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3).
Во втором аспекте изобретения ТВТ определяют как баллы стеатоза >1;
баллы баллонирования гепатоцитов >1;
баллы лобулярного воспаления >1;
NAS (баллы активности NAFLD) >4 (NAS определяют как сумму баллов стеатоза, баллов баллонирования гепатоцитов и баллов лобулярного воспаления);
стадия фиброза >1 (такая как стадия фиброза, равная 1, 2, 3 или 4).
В третьем аспекте изобретения ТВТ определяют как баллы стеатоза >1;
баллы баллонирования гепатоцитов >1;
баллы лобулярного воспаления >1;
NAS (баллы активности NAFLD) >4 (NAS определяют как сумму баллов стеатоза, баллов баллонирования гепатоцитов и баллов лобулярного воспаления);
стадия фиброза=1b, 1с, 2, 3 или 4.
Других пациентов определяли как неподлежащих лечению (NTBT). Для анализа пациентов ТВТ классифицировали как 1 и NTBT как 0 в переменной ответа. Как указано выше, объясняющие переменные включали широкий диапазон биомаркеров, измеренных в образцах крови (гематология, биохимия, свертывание, маркеры печени, циркулирующие мкРНК) или моче (тест-полоски, седиментация) при условии наличия демографических (возраст, пол, раса), географических (исследовательский центр, страна, континент) или медицинских (диабет) данных.
Обработка набора данных.
Набор данных, используемый в настоящем исследовании, получали из исследования Golden-505, и исходно он состоял из 274 пациентов и 121 переменных. Обработка набора данных включала следующие стадии:
1) удаление пациентов без измерения мкРНК;
2) удаление переменных с более чем 10 отсутствующими значениями;
3) удаление пациентов с крайними значениями и 28 с оставшимися отсутствующими значениями.
Это приводило к получению набора данных для 216 пациентов для всех способов по настоящему изобретению за исключением способов, касающихся сыворотки, которые осуществляли на 212 пациентах, и 112 переменных, используемых для проверки на коллинеарность между объясняющими переменными.
Проверка на коллинеарность.
Коэффициент корреляции.
Пирсона вычисляли попарно с использованием количественных переменных. Когда у двух переменных наблюдают коэффициент корреляции выше 0,7 в случае анализа с использованием мкРНК плазмы или 0,6 в случае анализа с использованием мкРНК сыворотки, осуществляли одномерный анализ различия среднего относительно переменной ответа, определяющей пациентов ТВТ. Выбранная переменная была более значимой.
Коллинеарные и выбранные переменные представлены в табл. 2-7.
Эти переменные зависят от определения пациента и, таким образом, склонны варьироваться в зависимости от категории пациентов.
Медианная модель.
Получение медианной модели начинали с наблюдения набора данных в обучающей выборке, соответствующей 2/3 пациентов TBT/NTBT, и валидационной выборке, соответствующей остальной 1/3 пациентов TBT/NTBT. Это наблюдение осуществляют случайным образом миллион раз и для анализа сохраняют образцы, у которых наблюдают однородность между обучающей и валидационной выборками (не наблюдали значимого различия во всех объясняющих переменных между двумя выборками). В каждой обучающей выборке вычисляли генерализованную логистическую линейную модель переменной ответа (определяющей пациентов TBT/NTBT) относительно объясняющих переменных (биомаркеров). Для каждой модели обучающей выборки осуществляли пошаговое исключение переменных и находили оптимальную модель с помощью наименьшего информационного критерия Акаике (AIC). Таким образом, все объясняющие переменные имели коэффициент модели для каждой обучающей выборки. Медианный алгоритм строили с использованием переменных, у которых наблюдали медианный коэффициент, отличающийся от нуля, и соответствующие ему коэффициенты. Этот алгоритм валидировали (вычисле- 23 044836 ние ROC, AUC, оптимального порогового значения, общей точности, чувствительности, специфичности, положительного прогностического значения и отрицательного прогностического значения) в каждой валидационной выборке и получали оптимальное пороговое значение медианы. По сравнению с бутстреп-моделью медианная модель также применима к общему набору данных для валидации.
Бутстреп-модель.
При построении бутстреп-модели генерализованную логистическую линейную модель переменной ответа (определяющей пациентов TBT/NTBT) относительно объясняющих переменных (биомаркеров) вычисляли с использованием всех пациентов из общего набора данных. Осуществляли пошаговое исключение переменных и выбирали оптимальный алгоритм с использованием AIC. Затем тестировали значимость коэффициентов переменных из этого оптимального алгоритма, запуская алгоритм с использованием 1000 бутстреп-образцов. Коэффициенты с 95%-ным доверительным интервалом, исключающим нуль, считали значимыми. Затем алгоритм валидировали посредством вычисления ROC, AUC, оптимального порогового значения, общей точности, чувствительности, специфичности, положительного прогностического значения и отрицательного прогностического значения.
Сравнение с другими способами балльной оценки NASH.
Способы осуществления балльной оценки NASH уже описаны в литературе:
балльная оценка фиброза при NAFLD (индекс Ангуло) (Angulo et al., 2007);
ELF (Guha et al., 2 008) (см. также лист спецификаций ELF http://www.healthcare.Siemens.com/clinicalspecialities/liver-disease/elf-test-now-avail);
Fibrotest (Ratziu et al., 2006);
Fibrometer (Cales et al., 2009);
FLI (Bedogni et al., 2006);
балльная оценка стеатоза или SteatoTest (Poynard et al., 2005).
Таким образом, авторы настоящего изобретения оценивали балльную оценку NASH по изобретению с использованием ряда этих уже известных способов.
Сравнение балльной оценки по различным моделям по настоящему изобретению и других балльных оценок и сравнение балльных оценок по различным моделям по настоящему изобретению относительно индивидуальных переменных представлены в табл. 8-12.
Данные, представленные в настоящем описании, свидетельствуют о существенном улучшении точности идентификации пациентов с NASH или потенциальных пациентов с NASH, определения активности, стадии или тяжести NASH. Этот вывод имеет исключительно важное значение и будет бесценным инструментом для улучшения эффективности лечения пациентов.
Таблица 2
| Выбранные переменные среди коллинеарных переменных | Исключенные переменные среди коллинеарных переменных | ||
| Индекс массы тела | Обхват талии | Масса | |
| НОМА | Инсулин | С-пептид | |
| СК18-М65 | СК18-М30 | ACT | АЛТ |
| НВА1С | Уровень глюкозы натощак в плазме | Фруктозамин | Уровень глюкозы натощак в сыворотке |
| Базофилы (абс.) | Базофилы (%) | ||
| Эозинофилы (абс.) | Эозинофилы (%) | ||
| Гематокрит | Гемоглобин | Количество эритроцитов | |
| Лейкоциты | Нейтрофилы (абс.) | ||
| Нейтрофилы (%) | Лимфоциты (%) | ||
| Протромбиновое время (секунды) | INR | Протромбиновое время (%) | |
| Ретикулоциты (абс.) | Ретикулоциты (%RBC) | ||
| Липопротеины высокой плотности (HDL) | холестерин липопротеинов высор плотности (HDL-C) | Аполипопротеин AI (Аро AI) | |
| Липопротеины промежуточной плотности С | Общий холестерин | Аполипопротеин В (Аро В) | He-HDL-C |
| Липопротеины низкой плотности (LDL) 1 | Липопротеины промежуточной плотное А | ||
| Липопротеины низкой плотности (LDL) 2 | Аполипопротеин В (Аро В) | He-HDL-C | |
| Холестерин липопротеинов очень низкой плотности | Триглицериды | ||
| miRNA103 | miRNA155 | miRNA199a | miRNA221 |
| miRNA34a | miRNA122 | miRNA192 | |
| Удельный вес мочи | Креатинин мочи |
Выбранные и исключенные переменные при проверке на коллинеарность в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеа- 24 044836 тоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3) при измерении в плазме.
Таблица 3
| Выбранные переменные среди коллинеарных переменных | Исключенные переменные среди коллинеарных переменных | |||
| Индекс массы тела | Обхват талии | Масса | ||
| НОМА | Инсулин | С-Пептид | ||
| СК18-М65 | СК18-М30 | ACT | АЛТ | |
| FGF-21 | Гомоцистеин | |||
| Конъюгированный билирубин | Общий билирубин | |||
| С1 | Na | |||
| НВА1С | Уровень глюкозы натощак в плазме | Фруктозамин | Уровень глюкозы натощак в сыворотке | |
| Базофилы (абс.) | Базофилы (%) | |||
| Эозинофилы (абс.) | Эозинофилы (%) | |||
| Гематокрит | Гемоглобин | Количество эритроцитов | ||
| Лейкоциты | Нейтрофилы (абс.) | Нейтрофилы (%) | ||
| Лимфоциты (%) | Нейтрофилы (%) | |||
| Моноциты (абс.) | Моноциты (%) | |||
| Протромбиновое время (секунды) | INR | Протромбиновое время (%) | ||
| Ретикулоциты (% of RBC) | Ретикулоциты (абс.) | |||
| Липопротеины высокой плотности (HDL) | Холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL-C) | Аполипопротеин AI (Apo AI) | ||
| Липопротеины промежуточной плотности А | Липопротеины низкой плотности (LDL) 1 | Общий холестерин | Аполипопротеин В (Аро В) | Липопротеины промежуточной плотности В |
| He-HDL-C | ||||
| Липопротеины промежуточной плотности С | Липопротеины промежуточной плотности В | Общий холестерин | He-HDL-C | Аполипопротеин В (Аро В) |
| Липопротеины низкой плотности (LDL) 2 | Общий холестерин | He-HDL-C | Аполипопротеин В (Аро В) | |
| Холестерин липопротеинов очень низкой плотности | Триглицериды | He-HDL-C | ||
| miRNA34a | СК18-М30 | ACT | miRNA122 | |
| β-NAG в моче | AIM в моче |
Выбранные и исключенные переменные при проверке на коллинеарность в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3) при измерении в сыворотках (мкРНК в копиях/мкл log 10).
Таблица 4
| Выбранные переменные среди коллинеарных переменных | Исключенные переменные среди коллинеарных переменных | |||
| Индекс массы тела | Обхват талии | Масса | ||
| НОМА | Инсулин | С-Пептид | ||
| FGF-21 | Гомоцистеин | |||
| Конъюгированный билирубин | Общий билирубин | |||
| 01 | Na | |||
| НВА1С | Уровень глюкозы натощак в плазме | Фруктозамин | Уровень глюкозы натощак в сыворотке | |
| Базофилы (абс.) | Базофилы (%) | |||
| Эозинофилы (абс.) | Эозинофилы (%) | |||
| Гематокрит | Гемоглобин | Количество эритроцитов | ||
| Лейкоциты | Нейтрофилы (абс.) | Нейтрофилы (%) | ||
| Лимфоциты (%) | Нейтрофилы (%) | |||
| Моноциты (абс.) | Моноциты (%) | |||
| Протромбиновое время (секунды) | INR | Протромбиновое время (%) |
- 25 044836
| Ретикулоциты (%RBC) | Ретикулоциты (абс.) | |||
| Липопротеины высокой плотности (HDL) | Холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL-C) | Аполипопротеин AI (Аро AI) | ||
| Липопротеины промежуточной плотности А | Липопротеины низкой плотности (LDL) 1 | Общий холестерин | Аполипопротеин В (Аро В) | Липопротеины промежуточной плотности В |
| He-HDL-C | ||||
| Липопротеины промежуточной плотности С | Липопротеины промежуточной плотности В | Общий холестерин | He-HDL-C | Аполипопротеин В (Аро В) |
| Липопротеины низкой плотности (LDL) 2 | Общий холестерин | He-HDL-C | Аполипопротеин В (Аро В) | |
| Холестерин липопротеинов очень низкой плотности | Триглицериды | He-HDL-C | ||
| miRNA34a | СК18-М30 | ACT | АЛТ | miRNA122 |
| СК18-М65 | ||||
| β-NAG в моче | AIM в моче |
Выбранные и исключенные переменные при проверке на коллинеарность в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3) при измерении в сыворотках (мкРНК в Cq).
Таблица 5
| Значимые выбранные переменные среди коллинеарных переменных | Исключенные переменные среди коллинеарных переменных | |||
| loglO (НОМА) | Инсулин | С-пептид | ||
| НВА1С | Уровень глюкозы натощак в плазме | loglO(Фруктозамин) | Уровень глюкозы натощак в сыворотке | |
| Протромбиновое время (секунды) | INR | Протромбиновое время (%) | ||
| СК18-М65 | loglO(СК18-М30) | loglO(ACT) | ||
| loglO(miRNA34a) | loglO(miRNA122) | loglO(АЛТ) | loglO(ACT) | loglO(СК18-М30) |
Значимые выбранные и исключенные переменные при проверке на коллинеарность в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3) при измерении в сыворотках (мкРНК в копиях/мкл и loglO-трансформация).
Таблица 6
| Выбранные переменные среди коллинеарных переменных | Исключенные переменные среди коллинеарных переменных | ||||
| Индекс массы тела | Обхват талии | Масса | |||
| НОМА | Инсулин | С-Пептид | |||
| СК18-М65 | СК18-М30 | ACT | АЛТ | ||
| НВА1С | Уровень глюкозы натощак в плазме | Фруктозамин | Уровень глюкозы натощак сыворотка | ||
| Базофилы (абс.) | Базофилы (%) | ||||
| Эозинофилы (абс.) | Эозинофилы (%) | ||||
| Лимфоциты (%) | Нейтрофилы (%) | ||||
| Нейтрофилы (абс.) | Лейкоциты | ||||
| Протромбиновое время (секунды) | INR | Протромбиновое время (%) | |||
| Количество эритроцитов | Гемоглобин | Гематокрит | |||
| Ретикулоциты (абс.) | Ретикулоциты (% of RBC) | ||||
| холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL-C) | Липопротеины высокой плотности (HDL) | Аполипопротеин AI (Аро AI) |
- 26 044836
| Липопротеины низкой плотности (LDL) 1 | Липопротеины промежуточной плотности А | ||||
| Липопротеины низкой плотности (LDL) 2 | He-HDL-C | Липопротеины промежуточной плотности С | Аполипопротеин В (Аро В) | Общий холестерин | Холестерин липопротеинов очень низкой плотности |
| miRNA221 | miRNA155 | miRNA199a | miRNA103 | ||
| miRNA34a | miRNA122 | miRNA192 | |||
| Удельный вес мочи | Креатинин мочи |
Выбранные и исключенные переменные при проверке на коллинеарность в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >1 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3) при измерении в плазме.
Таблица 7
| Выбранные переменные среди коллинеарных переменных | Исключенные переменные среди коллинеарных переменных | ||
| Индекс массы тела | Обхват талии | Масса | |
| НОМА | Инсулин | С-пептид | |
| СК18-М65 | СК18-М30 | ACT | АЛТ |
| НВА1С | Уровень глюкозы натощак в плазме | Фруктозамин | Уровень глюкозы натощак в сыворотке |
| Базофилы (абс.) | Базофилы (%) | ||
| Эозинофилы (абс.) | Эозинофилы (%) | ||
| Гемоглобин | Гематокрит | Количество эритроцитов | |
| Лейкоциты | Нейтрофилы (абс.) | ||
| Лимфоциты (%) | Нейтрофилы (%) | ||
| Протромбиновое время (секунды) | INR | Протромбиновое время (%) | |
| Ретикулоциты (% of RBC) | Ретикулоциты (абс.) | ||
| Холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL-C) | Липопротеины высокой плотности (HDL) | Аполипопротеин AI (Apo AI) | |
| Липопротеины промежуточной плотности С | Общий холестерин | He-HDL-C | Аполипопротеин В (Аро В) |
| Липопротеины низкой плотности (LDL) 1 | Липопротеины промежуточной плотности А | ||
| Липопротеины низкой плотности (LDL) 2 | He-HDL-C | Аполипопротеин В (Аро В) | |
| Триглицериды | Холестерин липопротеинов очень низкой плотности | ||
| miRNA103 | miRNA155 | miRNA199a | miRNA221 |
| miRNA34a | miRNA122 | miRNA192 | |
| Удельный вес мочи | Креатинин мочи |
Выбранные и исключенные переменные при проверке на коллинеарность в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >1 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности, 2 или 3) при измерении в плазме.
Таблица 8
Сравнение балльных оценок в моделях по настоящему изобретению и других известных моделей
| AUC | Пороговое значение | Точность | Чувствительность | Специфичность | PPV | NPV | ||
| Бутстреп | 0,82 | 0,4255 | 75,94 | 73, 12 | 78,15 | 72,34 | 78,81 | |
| Полученная | медианная | 0,82 | 0,3201 | 75,94 | 72,04 | 78,99 | 72,83 | 78,33 |
- 27 044836
| модель | |||||||
| Балльная оценка фиброза NAFLD | 0,69 | 0,676 | 34,12 | 66, 67 | 8,47 | 36,47 | 24,39 |
| ELF | 0,70 | 7,7 | 45,28 | 97,28 | 4,20 | 44,39 | 71,43 |
| FibroTest | 0,68 | 0,48 | 66,51 | 40,86 | 86,55 | 70,37 | 65,19 |
| BARD | 0,64 | 2 | 59,91 | 60,22 | 59,66 | 53,85 | 65,74 |
| APRI | 0,72 | 1 | 66, 51 | 26,88 | 97,48 | 89,29 | 63,04 |
| Неинвазивная система балльной оценки | 0,68 | 0,361 | 62,26 | 67,74 | 57,98 | 55,75 | 69,70 |
| FIB-4 | 0,72 | 3,25 | 58,96 | 6,45 | 100,00 | 100,00 | 57,77 |
| Диагностическая панель NAFLD - NASH | 0,71 | 0,3641 | 71,70 | 63,44 | 78,15 | 69,41 | 73,23 |
Модели (мкРНК, измеряемой в сыворотке в копиях/мкл log10) в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3.
Обе модели, полученные из бутстреп-модели и медианной модели по настоящему изобретению, имели лучшую AUC, чем другие известные модели. Различия четко свидетельствуют о важности настоящего изобретения.
Таблица 9
Сравнение балльной оценки с использованием бутстреп-модели по настоящему изобретению и других балльных оценок
| Балльная оценка | AUC | Балльная оценка | AUC | Значение Р |
| Бутстреп-модель | 0, 82 | Полученная медианная модель | 0, 82 | 0,7968 |
| Бутстреп-модель | 0, 82 | Балльная оценка фиброза NAFLD | 0, 69 | 0,006184 |
| Бутстреп-модель | 0, 82 | ELF | 0,70 | 0,01356 |
| Бутстреп-модель | 0, 82 | FibroTest | 0, 68 | 0,007507 |
| Бутстреп-модель | 0, 82 | BARD | 0, 64 | 5,16Е-05 |
| Бутстреп-модель | 0, 82 | APRI | 0,72 | 0,03062 |
| Бутстреп-модель | 0, 82 | Неинвазивная система балльной оценки (NISS) | 0, 68 | 0,002862 |
| Бутстреп-модель | 0, 82 | FIB4 | 0,72 | 0,04898 |
| Бутстреп-модель | 0, 82 | Диагностическая панель NAFLD - NASH | 0,71 | 0,02169 |
Модели (мкРНК, измеренная в сыворотке в копиях/мкл log10) в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3).
В случае всех бутстреп-моделей, представленных в настоящем описании и соответствующих пациенту с риском, как описано выше, значения AUC были статистически лучше, чем значения AUC, полученные с использованием других моделей.
Значения, полученные с использованием полученной медианной модели, схожи со значениями, полученными с использованием бутстреп-модель, что означает, что обе модели обоснованы.
Продемонстрирована важность настоящего изобретения.
- 28 044836
Таблица 10
Сравнение балльной оценки с использованием полученных медианных моделей по настоящему изобретению с другими балльными оценками
| Балльная оценка | AUC | Балльная оценка | AUC | Значение Р |
| Полученная медианная модель | 0, 82 | Бутстреп-модель | 0, 82 | 0,7968 |
| Полученная медианная модель | 0, 82 | Балльная оценка фиброза при NAFLD | 0, 69 | 0,006828 |
| Полученная медианная модель | 0, 82 | ELF | 0,70 | 0,01561 |
| Полученная медианная модель | 0, 82 | FibroTest | 0, 68 | 0,006284 |
| Полученная медианная модель | 0, 82 | BARD | 0, 64 | 0,000129 |
| Полученная медианная модель | 0, 82 | APRI | 0,72 | 0,03337 |
| Полученная медианная модель | 0, 82 | Неинвазивная система балльной оценки (NISS) | 0, 68 | 0,003578 |
| Полученная медианная модель | 0, 82 | FIB4 | 0,72 | 0,04829 |
| Полученная медианная модель | 0, 82 | Диагностическая панель NAFLD - NASH | 0,71 | 0,0223 |
Модели (мкРНК, измеренная в сыворотке в копиях/мкл log10) в случае пациента в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3).
В случае всех полученных медианных моделей, представленных в настоящем описании и соответствующих пациенту с риском, как описано выше, значения AUC были статистически лучше, чем значения AUC, полученные с использованием других моделей.
Значения, полученные с использованием бутстреп-модели, схожи со значениями, полученными с использованием полученной медианной модели, что означает, что обе модели обоснованы.
Продемонстрирована важность настоящего изобретения.
Таблица 11
Сравнение балльных оценок с использованием бутстреп-модели по настоящему изобретению с отдельными переменными
| Балльная оценка | AUC | Показатель | AUC | Значение Р |
| Бутстреп-модель | 0, 82 | мкРНК 34а | 0, 74 | 0,002699 |
| Бутстреп-модель | 0, 82 | YKL4 0 | 0,71 | 0,00143 |
| Бутстреп-модель | 0, 82 | НВА1С | 0, 67 | 1,343е-05 |
| Бутстреп-модель | 0, 82 | А2М | 0,71 | 0,001744 |
Модели (мкРНК, измеренная в сыворотке в копиях/мкл log10) в случае пациента в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3).
Значение AUC в случае бутстреп-модели, соответствующей пациенту с риском, как описано ранее, в которой комбинируют несколько переменных, было статистически лучше, чем значение AUC, полученное в случае отдельных переменных.
Таким образом, комбинация нескольких переменных посредством логистической функции по настоящему изобретению лучше и точнее исследование переменных по отдельности. Продемонстрирована важность настоящего изобретения.
Таблица 12
Сравнение балльных оценок с использованием полученной медианной модели по настоящему изобретению с отдельными переменными
| Балльная оценка | AUC | Показатель | AUC | Значение Р |
| Полученная медианная модель | 0, 82 | мкРНК 34а | 0, 74 | 0,001128 |
| Полученная медианная модель | 0, 82 | YKL4 0 | 0,71 | 0,004108 |
| Полученная медианная модель | 0, 82 | НВА1С | 0, 67 | 1,199е-05 |
| Полученная медианная модель | 0, 82 | А2М | 0,71 | 0,003032 |
Модели (мкРНК, измеренная в сыворотке в копиях/мкл log10) в случае пациента в случае пациента с риском, подлежащего лечению, соответствующего следующим показателям при биопсии печени: баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS
-
Claims (9)
- (баллы активности NAFLD) >4 и стадия фиброза >2 (такая как стадия фиброза, равная 2, 3 или 4, в частности 2 или 3).Значение AUC в случае полученной медианной модели, соответствующей пациенту с риском, как описано ранее, в которой комбинируют несколько переменных, было статистически лучше, чем значение AUC, полученное в случае отдельных переменных.Таким образом, комбинация нескольких переменных посредством логистической функции по настоящему изобретению лучше и точнее исследование переменных по отдельности.Продемонстрирована важность настоящего изобретения.Ссылки Angulo Р, Hui JM, Marchesini G, Bugianesi E, George J,Farrell GC, Enders F, Saksena S, Burt AD, Bida JP, Lindor K, Sanderson SO, Lenzi M, Adams LA, Kench J, Therneau TM, Day CP (2007) The NAFLD fibrosis score: a noninvasive system that identifies liver fibrosis in patients with NAFLD. Hepatology45: 846-854Bedogni G, Bellentani S, Miglioli L, Masutti F, Passalacqua M, Castiglione A, Tiribelli C (2006) The Fatty Liver Index: a simple and accurate predictor of hepatic steatosis in the general population. BMC Gastroenterol6: 33Cales P, Laine F, Boursier J, Deugnier Y, Moal V, Oberti F, Hunault G, Rousselet MC, Hubert I, Laafi J, Ducluzeaux PH, Lunel F (2009) Comparison of blood tests for liver fibrosis specific or not to NAFLD. J Hepatol50: 165-173Guha IN, Parkes J, Roderick P, Chattopadhyay D, Cross R, Harris S, Kaye P, Burt AD, Ryder SD, Aithal GP, Day CP, Rosenberg WM (2008) Noninvasive markers of fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease: Validating the European Liver Fibrosis Panel and exploring simple markers. Hepatology47: 455460Poynard T, Ratziu V, Naveau S, Thabut D, Charlotte F, Messous D, Capron D, Abella A, Massard J, Ngo Y, Munteanu M, Mercadier A, Manns M, Albrecht J (2005) The diagnostic value of biomarkers (SteatoTest) for the prediction of liver steatosis. Comp Hepatol4: 10Ratziu V, Massard J, Charlotte F, Messous D, Imbert-Bismut F, Bonyhay L, Tahiri M, Munteanu M, Thabut D, Cadranel JF, Le Bail B, de Ledinghen V, Poynard T (2006) Diagnostic value of biochemical markers (FibroTest-FibroSURE) for the prediction of liver fibrosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease. BMC Gastroenterol6: 6ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ диагностики стадии или тяжести неалкогольного стеатогепатита (NASH) у индивидуума, включающий этапы измерения уровня циркулирующей hsa-miR-34 в крови, сыворотке или плазме;измерения уровня циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме; и комбинирования результатов посредством математического алгоритма для получения балловNASH, где баллы NASH вычисляют посредством следующей логистической функции:гдеY=k+axA+bxB, где S представляет собой баллы NASH;А представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в Cq;В представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;- 30 044836 к является числом от -116,08 до 40,97, в частности 12,87;а является числом от -0,82 до 0, в частности -0,42;b является числом от 0 до 1,88Е-05, в частности 8,160Е-06, где баллы NASH выше порогового значения, составляющие от 0,1387 до 0,3481, в частности равные 0,2187, свидетельствуют о тяжелом NASH или умеренной или высокой активности NASH и, таким образом, свидетельствуют о том, что пациент имеет баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1.
- 2. Способ классификации индивидуума как реципиента или нереципиента лечения NASH, включающий этапы измерения уровня циркулирующей hsa-miR-34 в крови, сыворотке или плазме;измерения уровня циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме; и комбинирования результатов посредством математического алгоритма для получения баллов NASH, где баллы NASH вычисляют посредством следующей логистической функции:гдеY=k+axA+bxB, где S представляет собой баллы NASH;А представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в Cq;В представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;к является числом от -116,08 до 40,97, в частности 12,87;а является числом от -0,82 до 0, в частности -0,42;b является числом от 0 до 1,88Е-05, в частности 8,160Е-06, где, когда баллы NASH выше порогового значения и составляют от 0,1387 до 0,3481, в частности равны 0,2187, индивидуума классифицируют как реципиента или потенциального реципиента лечения NASH.
- 3. Способ оценки эффективности медицинского лечения, и/или определения прогрессирования или регрессирования патологии у пациентов с NASH, и/или прогнозирования исхода заболевания у пациента, включающий этапы измерения уровня циркулирующей hsa-miR-34 в крови, сыворотке или плазме;измерения уровня циркулирующей YKL-40 в крови, сыворотке или плазме; и комбинирования результатов посредством математического алгоритма для получения баллов NASH, где баллы NASH вычисляют посредством следующей логистической функции:гдеY=k+axA+bxB, где S представляет собой баллы NASH;А представляет собой уровень hsa-miR-34a (в частности, hsa-miR-34a-5p) в Cq;В представляет собой уровень YKL-40 в пг/мл;к является числом от -116,08 до 40,97, в частности 12,87;а является числом от -0,82 до 0, в частности -0,42;b является числом от 0 до 1,88Е-05, в частности 8,160Е-06, где баллы NASH выше порогового значения, составляющие от 0,1387 до 0,3481, в частности равные 0,2187, свидетельствуют о тяжелом NASH или умеренной или высокой активности NASH и, таким образом, свидетельствуют о том, что пациент имеет баллы стеатоза >1, баллы баллонирования гепатоцитов >1, баллы лобулярного воспаления >1, NAS>4 и стадию фиброза >1, и где указанный балл NASH сравнивается с контрольным баллом, где увеличение балла NASH указывает на неэффективность медицинского лечения и/или прогрессирование патологии у пациентов с NASH, а уменьшение балла NASH указывает на эффективность медицинского лечения и/или регрессирование патологии у пациентов с NASH.
- 4. Способ по любому из пп.1-3, дополнительно включающий измерение уровня по меньшей мере одного другого циркулирующего в крови, сыворотке или плазме маркера повреждения печени, выбранного из группы, состоящей из альфа-2-макроглобулина, гликированного гемоглобина (HbA1c), уровня глюкозы натощак, уровня фруктозамина, инсулина, С-пептида, оценки гомеостатической модели (НОМА), N-концевого про-пептида коллагена типа III, hsa-miR-200, CK18-M30, CK18-M65, АЛТ, ACT, удельного веса мочи, креатинина мочи, базофилов, высокочувствительного С-реактивного белка (HSCRP), β-NAG в моче, лейкоцитов, нейтрофилов и фибриногена.
- 5. Способ по любому из пп.1-4, где способ дополнительно включает измерение по меньшей мере одного другого параметра, такого как рост индивидуума.
- 6. Способ по п.5, где способ включает изменение уровня hsa-miR-34a-5p, YKL-40, альфа-2-- 31 044836 макроглобулина и HbAlc.
- 7. Набор для определения уровней hsa-miR-34 и YKL40, при этом в качестве средств набор содержит антитела, специфические для белка, подлежащего количественному анализу, и/или праймеры, применимые для количественного анализа уровней микроРНК.
- 8. Набор по п.7, дополнительно содержащий средства для определения уровня по меньшей мере одного циркулирующего маркера повреждения печени в крови, сыворотке или плазме.
- 9. Набор по п.8, содержащий средства для определения уровня (i) hsa-miR-34;(ii) YKL-40, и по меньшей мере одного другого маркера, выбранного из группы, состоящей из (iii) альфа-2-макроглобулина;(iv) по меньшей мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из HbAlc, уровня глюкозы натощак, уровня фруктозамина;(ν) N-концевого про-пептида коллагена типа III; и (vi) hsa-miR-200.^gj) Евразийская патентная организация, ЕАПВРоссия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP16163048.8 | 2016-03-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044836B1 true EA044836B1 (ru) | 2023-10-05 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7274523B2 (ja) | 非アルコール性脂肪性肝炎を診断及び評価するための方法 | |
| De Gonzalo-Calvo et al. | Circulating microRNA profiles predict the severity of COVID-19 in hospitalized patients | |
| AU2017242818B2 (en) | Non-invasive diagnostic of non-alcoholic steatohepatitis | |
| US20200248261A1 (en) | Non-invasive diagnostic of non-alcoholic fatty liver diseases, non-alcoholic steatohepatitis and/or liver fibrosis | |
| US20150018238A1 (en) | Multi-biomarker-based outcome risk stratification model for pediatric septic shock | |
| JP2021502109A (ja) | 非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、及び／又は肝線維症の非侵襲的診断 | |
| CN105603101A (zh) | 检测8个miRNA表达量的***在制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用 | |
| Wan et al. | Plasma long noncoding RNA IL‐7R as a prognostic biomarker for clinical outcomes in patients with acute respiratory distress syndrome | |
| Kim et al. | High fibrosis-4 index is related with worse clinical outcome in patients with coronavirus disease 2019 and diabetes mellitus: a multicenter observational study | |
| US10815526B2 (en) | Temporal pediatric sepsis biomarker risk model | |
| TWI735470B (zh) | 糖尿病性腎病之判定方法、及於此種判定方法中生物標記之用途 | |
| EA044836B1 (ru) | Неинвазивная диагностика неалкогольного стеатогепатита | |
| Okuyan et al. | Association of miR-21-5p with routine biochemical markers and inflammatory cytokines in hemodialysis patients | |
| Jain et al. | Role of biomarkers in health care | |
| EA043166B1 (ru) | Способы диагностики и оценки неалкогольного стеатогепатита | |
| Saleh et al. | ASSESSMENT OF PROVOCATIVE INFLAMMATORY ROLE OF TRISTETRAPROLIN AND TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA GENES EXPRESSION IN CHRONIC KIDNEY DISEASE. | |
| TW201625945A (zh) | 一種用以預斷肝硬化病患發生肝癌之風險的方法 |