JP2023548840A - 肝線維化を診断する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、52週間以内に肝線維化進展を示す可能性が高いNAFLD患者を識別するための方法に関する。

Description

本発明は、52週間以内に肝線維化進展(advanced liver fibrosis)を示す可能性が高いNAFLD(非アルコール性脂肪性肝疾患)患者を識別するための方法に関する。

細胞外マトリックスの異常且つ過大な沈着は、肝臓、肺、腎臓、又は心臓の線維化を含めた全ての線維症の特徴である。罹患臓器の範囲、線維形成過程の進行の性質、罹患者数の多さ、及び疾患が生命を脅かすようになる前に症状がないことから、非常に多くの難題が提起される。

肝臓が損傷を受けると、線維層が形成され、それが肝臓での瘢痕組織となる。この損傷の初期段階を線維化と呼ぶ。

線維化を引き起こす可能性がある幾つかのタイプの肝疾患が存在する。それらには、以下が含まれる:
・ 自己免疫性肝炎
・ 胆管閉塞
・ 非アルコール性脂肪性肝疾患、これには、非アルコール性脂肪肝(NAFL)及び非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)が含まれる
・ B型及びC型ウイルス性肝炎
・ アルコール性肝疾患
・ D型肝炎:この型の肝炎は肝硬変も引き起こすことがある。既にB型肝炎を有している人に見られることが多い。
・ 胆汁を排出する機能を果たす、胆管への損傷:そのような状態の一例は、原発性胆汁性肝硬変である。
・ 鉄及び銅を扱う身体の能力に影響を及ぼす障害:二つの例は、血色素症及びウィルソン病である。
・ 医薬品(アセトアミノフェン、幾つかの抗生物質、及び幾つかの抗鬱薬は、肝硬変に至ることがある)。

肝線維化の最も一般的な原因は非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)であるが、二番目は長期の過剰なアルコールの飲酒によるアルコール性肝疾患である。

肝臓損傷は、以下の範囲を有し得る:
* わずか～軽度の損傷
* 軽度～中等度の損傷(線維化)
* 中等度～重度の損傷(線維化～代償性肝硬変)
* 重度～肝不全(非代償性肝硬変)

「肝線維化」とは、肝生検の染色(H&E、トリクローム、又はピクロシリウスレッド染色)切片の鏡検時に線維性結合組織が存在することを指す。本発明の文脈において、「線維化ステージ」という用語は、組織学的検査での線維化の局在及び程度を表し、以下の通りである:
類洞周囲又は門脈周囲の線維化 1
軽度の類洞周囲の線維化(ゾーン3) 1a
中等度の類洞周囲の線維化(ゾーン3) 1b
門脈/門脈周囲の線維化 1c
類洞周囲及び門脈/門脈周囲の線維化 2
架橋線維化 3
肝硬変 4
(Kleinerら、Design and Validation of a Histological Scoring System for Nonalcoholic Fatty Liver Disease Hepatology、2005年;41:1313～1321頁)。
多くの場合、肝臓損傷が十分に重度になる(肝硬変)まで、線維化は症状が皆無かそれに近く、十分に重度になると患者は、重度の疲労感、食欲減退、明瞭な思考における困難、錯乱、腹部膨満(腹水)及び下肢腫脹、皮膚の痒み、並びに消化管での出血等を経験することがある。

線維化からの軽度の肝臓損傷は、損傷が大きくなり過ぎる前に原因を見出して排除すれば回復させられ得るが、瘢痕化が長期間にわたって継続するならば、線維化は永久的なものになる。損傷は継続して、肝臓全体にわたる帯を形成し、肝臓の内部構造を破壊し、肝臓の再生能力を破壊し、肝機能を低下させて肝硬変に至る。

肝臓損傷(瘢痕組織)からの合併症は、肝機能を妨害することがある。瘢痕組織は、肝機能を実施するのに必要な健常な肝細胞に置き換わる。瘢痕組織は、血液が肝臓に流れるのを妨害する。肝臓に十分な血液がないと、細胞は死滅し、より多くの瘢痕組織が形成される。

形成される瘢痕組織が多くなれば、最も重度の合併症を引き起こす可能性がある。

最終的には、人の線維化が進行して肝硬変及び肝不全になれば、人は以下のような合併症を有する可能性がある:
腹水(腹部内での重度の液体の蓄積)
肝性脳症(錯乱を引き起こす老廃物の蓄積)
肝腎症候群
門脈圧亢進症
静脈瘤出血。

肝線維化の最も著しい合併症は、肝硬変であるか、又は人が病気になるほど肝臓を損傷させる重度の瘢痕化であり得る。通常、これは生じるまでに長い時間がかかり、例えば、10年又は20年の経過をこえて生じる。

肝硬変は、全世界で主要な死因の一つである。肝硬変は、がん性の肝腫瘍、肝不全に至るおそれがあり、肝臓移植が必要となることもある。したがって、肝硬変に進行する前に、人は可能な限り早く肝線維化の診断及び治療を受けることが重要である。世界人口の推定6～7パーセントが肝線維化を有しており、これらの人は症状がないためにそれに気付いていない。

この疾患は、十分に早く診断されれば、回復する可能性があり得るか、又は少なくともその結果を限定的なものにすることができるため、そのような早期の迅速且つ正確な診断を可能とする適合した手段を医療分野に提供できることが極めて重要であると思われる。

WO2017046181 WO2017167934

Kleinerら、Design and Validation of a Histological Scoring System for Nonalcoholic Fatty Liver Disease Hepatology、2005年;41:1313～1321頁 Harrisonら(The Lancet Gastroenterology & Hepatology、第5巻、第11号、970～985頁、2020年11月1日;オンライン公開2020年8月3日)

肝線維化の重症度を診断し、決定するための非侵襲的方法を提案する幾つかの試みが為されたが、現在のところ、線維化のステージを評価する最適な手法は、依然として肝生検の組織学的解析にとどまっている。しかし、肝生検には幾つもの明らかな欠点がある。第一に、肝生検で採集された物質は、診断される対象の肝臓の極めて小さい一部分を表すに過ぎず、よって採集された試料が対象の臓器の全体的な状態を表しているのかどうかという疑問が生じる。更にまた、肝生検は、患者にとって厄介で心配な、痛みを伴うものであり得る極めて侵襲的な手技であり、罹患及び死亡の懸念も生じる。最後に、上記を考慮すると、肝生検は、線維化を有しているかどうかを決定するための常法として合理的に提案することができない。

生検ベースの診断のこれらの欠点から、NASH(非アルコール性脂肪性肝炎)を検出するための非侵襲的方法が活発に開発されるようになった。例えば、WO2017046181及びWO2017167934は、循環バイオマーカーのレベルの測定に基づいた非侵襲的な診断を提供している。

別の選択肢は、トランジェントエラストグラフィとして公知の画像検査である。これは、肝臓がどれくらい硬いかを測定する検査である。肝線維化を有すると、瘢痕化細胞によって肝臓は硬くなる。この検査は、低周波の音波を使用して、肝組織がどれくらい硬いかを測定する。しかし、肝組織が硬く見えることがある、偽陽性を有する可能性がある。

本発明は、52週間経過以内に線維化進展(F≧3)に進行するリスクのある、NAFLDの対象の部分母集団を識別するための方法に関する。そのようにして識別された対象は、「急速進行者(fast progressor)」として認定される。

本発明の方法は、急速進行者を識別するための当技術分野で利用可能な他の検査、例えば、FIB-4(Fibrosis 4)、ELF(Enhanced Liver Fibrosis)、及びNFS(NAFLD線維化スコア)よりも良好な予後値を有することが以降の実験の部で示される。

特定の実施形態では、本発明の方法は、物理的方法を用いて前記対象の肝線維化を測定する工程を更に含む。特に、該方法は、前記対象の肝硬度を測定する工程を含むことができる。更なる特定の実施形態では、肝硬度は、肝臓における弾性せん断波伝播の速度の差を測定する工程によって決定される。

本発明によれば、「線維化」、「線維症」、「線維性障害」という用語及びそれらの語形変化(declination)は、肝臓における線維性結合組織の過剰な沈着という病的状態を表す。より詳細には、線維化は、組織損傷への応答としての、結合組織による持続的な線維性瘢痕形成及び細胞外マトリックスの過剰産生を含む病的過程である。生理学的には、結合組織が沈着すると、下にある臓器又は組織の構造及び機能が消失するおそれがある。

本発明によれば、「非アルコール性脂肪性肝炎」、又はNASHという用語は、過剰なアルコール摂取がなく、ウイルス性肝炎(HCV、HBV)のような他の肝疾患を除いた後で、組織学的検査での脂肪肝、肝細胞風船様変性、及び肝臓炎の併存によって特徴付けられるNAFLDの状態を指す。本発明によれば、「脂肪化」という用語は、肝臓内での脂質又は脂肪の蓄積の異常な滞留を表す過程を指す。本発明によれば、「肝細胞風船様変性」という用語は、通常、ヘマトキシリン(hemotoxylin)及びエオジン(H&E)染色に基づいた光学顕微鏡レベルでの、細胞質が希薄化した、正常な肝細胞の直径の1.5～2倍の細胞の肥大として定義される。それは、より一般的には、肝細胞の細胞死の過程を指す。本発明によれば、「小葉内炎症」という用語は、ヘマトキシリン及びエオジン(H&E)で染色された肝生検の切片の鏡検での小葉内の炎症性病巣(炎症細胞群)の存在を指す。

本発明によれば、「NAFLD活動性スコア」又は「NAS」は、以下の通りの脂肪化スコア、肝細胞風船様変性スコア、小葉内炎症スコアの合計を指す:
S:脂肪化スコア:0:<5%;1:5～33%;2:34～66%、及び3:>66%;
LI:小葉内炎症スコア(病巣/20倍の視野):0:なし;1:<2;2:2～4、及び3:>4;
HB:風船様変性スコア:0:なし;1:少数;2:多数の細胞/顕著な風船様変性。

したがって、NASHは、次の肝生検由来の点数:NAS≧3(脂肪化スコアで少なくとも1点、小葉内炎症スコアで少なくとも1点、及び肝細胞風船様変性スコアで少なくとも1点を有する)によって特徴付けられるNAFLDの状態を指す。

より重症型のNASHは、上記のS、LI、及びHBスコアのうちの一つにおける、より高い点数、及び/又は肝線維化の存在によっても特徴付けられる。

上で述べたように、線維化ステージの範囲は、F=0(又はF0)、すなわち線維化なし、からF4、すなわち肝硬変までである。本発明の文脈において3以上のF(すなわち、F3又はF4)の線維化ステージを、本明細書において「線維化進展」と呼ぶ。

本発明の方法によって進行の速い者として識別される対象は、0、1、又は2の線維化ステージ、並びにNAFLD、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、増殖性線維化、胆管閉塞、アルコール又は薬剤に誘導される肝線維化、肝硬変、感染に誘導される、特にA型、B型、又はC型肝炎のようなウイルス感染に誘導される肝線維化、放射線又は化学療法剤に誘導される線維化、慢性線維化胆管症、例えば、原発性硬化性胆管炎(PSC)、原発性胆汁性胆管炎(PBC)、胆道閉鎖、血色素症、ウィルソン病、及び医薬品に誘導される肝線維化からなる群から選択される状態を有する対象であり得る。特定の実施形態では、本発明の方法によって進行の速い者として識別される対象は、NASH及び0、1、又は2の線維化ステージを有する対象であり得る。本発明は、より具体的には、前記対象がこの決定から52週間以内に線維化進展に進行する尤度を決定する方法を提供する。

本発明の方法では、対象からの血液由来の試料から少なくとも4つの循環マーカーのレベルを測定する。前記の少なくとも4つの循環マーカーは、hsa-miR34a、アルファ2マクログロブリン(A2M)、YKL40、及び糖化ヘモグロビン(HbA1c)である。

これらのマーカーのレベルの測定は、対象の血液由来の試料、例えば、血液、血清又は血漿、特に血小板不含の血漿、例えば、無細胞の、クエン酸塩で誘導された血小板不含の血漿サンプルにおいて行われる。特定の実施形態では、対象からの1つ又は複数の血清試料からのhsa-miR34a、A2M、及びYKL40のレベルが測定される。別の特定の実施形態では、対象の血液試料からのHbA1cのレベルが測定される。

特定の実施形態では、hsa-miR34a、A2M、YKL40、及びHbA1cのレベルは、WO2017167934に記載される通りに測定される。

本明細書に開示される全ての実施形態及び変形形態において、hsa-miR34aは、より具体的にはhsa-miR34a-5pであり得ることを理解されたい。本出願では、hsa-miR34a-5p、アルファ2マクログロブリン(A2M)、YKL40、及び糖化ヘモグロビン(HbA1c)の組み合わせをNIS4(商標)とも呼ぶ。

特定の実施形態では、本明細書で測定される循環マーカーのレベルは、例えば、出願WO2017167934で提供される通りの、スコアを算出するためのロジスティック関数に使用される。簡潔に述べれば、ロジスティック関数は、組入れ時のF0、F1、又はF2ステージから線維化進展に進行した、NASHを有する参照対象から得られたデータによって決定され得る。そのようなデータは、以下によって得たものであり得る:
参照対象が、肝生検によって決定したときにF0、F1、又はF2ステージであった場合の、第一の一組の循環マーカーレベルの測定、及び
前記参照対象が、別の肝生検によって決定したときにF≧3ステージであった場合の、前記第一の一組の測定から52週間後に実行された同じ参照対象における循環レベルの測定。

当業者であれば、本明細書の実験の部で提供される情報及びWO2017167934の教示を使用して、ロジスティック関数、並びに必要とされる検査の感度、特異度、陽性的中率及び/又は陰性的中率に関連するカットオフを決定することができる。

特定の実施形態によれば、スコアは、ブートストラップモデルから誘導されるロジスティック関数として定義される:

式中:
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D
式中:
Sは、スコアであり;
Aは、hsa-miR-34a(特にhsa-miR-34a-5p)の血清レベル(Cq)であり;
Bは、アルファ2マクログロブリンの血清レベル(g/L)であり;
Cは、YKL-40の血清レベル(pg/ml)であり、
Dは、HbA1cのレベル(パーセント)であり(例えば、Dは、測定されたHbA1cの百分率が10%であれば、10に等しい);
kは、ロジスティック関数の定数であり
aは、hsa-miR-34a(特にhsa-miR-34a-5p)の血清レベルに関連する係数であり;
bは、アルファ2マクログロブリンの血清レベルに関連する係数であり;
cは、YKL-40の血清レベルに関連する係数であり;
dは、HbA1cのレベルに関連する係数である。

出願WO2017167934の実験の部に記載される通りのブートストラップモデルから誘導される、更なる特定の実施形態では:
kは、9.51～34.37の間に含まれる数であり;
aは、-1.17～-0.47の間に含まれる数であり;
bは、0.02～0.84の間に含まれる数であり;
cは、6.10E-06～2.09E-05の間に含まれる数であり;
dは、0.07～0.89の間に含まれる数である。

上で述べたように、当業者であれば、本明細書で提供される情報及びWO2017167934の教示を使用して、ロジスティック関数、並びに必要とされる検査の感度、特異度、陽性的中率及び/又は陰性的中率に関連するカットオフを決定することができる。特定の実施形態では、低カットオフは0.36であり、高カットオフは0.63である。実験の部に示す通り、この特定の実施形態によって、0.36より低いスコアを有する対象は、進行する確率は2%に過ぎず、線維化進展に進行する尤度が低いと識別され得る(除外される)、それに対して、0.63以上のスコアを有する者は、52週間に線維化進展に進行する確率は38%(38%(23～56)の陽性的中率)、特異度88%(81～92)、及び感度69%(44～86)であり、線維化進展に進行する尤度が高いと識別され得る(確定される)

特定の実施形態では、該方法は、物理的方法を用いて前記対象の肝線維化を測定する工程を更に含む。この測定は、当技術分野で周知の幾つもの方法によって行われ得る。例示的な方法には、限定するものではないが、医用イメージング及び/又は臨床的測定が含まれる。特定の実施形態では、物理的方法は弾性率測定法である。弾性率測定法は、更に具体的には、音響放射力インパルスイメージング(ARFIイメージング)、トランジェントエラストグラフィ(TE)、及びMRI硬度からなる群から選択することができる。本発明の特定の実施形態では、物理的方法は、肝臓における弾性せん断波伝播の速度の差を測定するトランジェントエラストグラフィである。好ましい方法によれば、肝臓の硬さ又は硬度を評価するために使用される技法である、トランジェントエラストグラフィ(FIBROSCAN(登録商標)等)が使用され、これは、キロパスカル(kPa)で測定され、線維化に関連する、侵襲的な調査を伴わない技法である。TEの結果(FIBROSCAN(登録商標)の結果等)は、2.5kPa～75kPaの範囲であり得る。肝疾患のない健常な対象の90～95%は、7.0kPa未満の肝硬度測定値を有することとなる。特定の実施形態では、該方法は、前記対象の肝硬度を測定する工程を含み得る。更なる特定の実施形態では、肝硬度は、肝臓における弾性せん断波伝播の速度の差を測定する工程によって測定される。

本発明を、以下の非限定的な実施例を参照して更に説明する。

(実施例1)
NASHにおける線維化進展及び肝硬変への組織学的進行。
本解析は、フェーズ2臨床試験であるGOLDEN-505(NCT01694849)試験からの部分母集団に対して実施したものであり、この部分母集団は、ベースライン及び試験終了時(52週)の両方で生検を受け、組織学的にNASHが確認された、3以上のNAFLD活動性スコア(NAS)及び線維化ステージ0～2を有する161人の患者を含んでいた。GOLDEN-505は、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を有する患者における1日1回のエラフィブラノル(1-[4-メチルチオフェニル]-3-[3,5-ジメチル-4-カルボキシジメチルメチルオキシフェニル]プロパ-2-エン-1-オン)の効力及び安全性を評価するための多施設、無作為化、二重盲検、プラセボ対照試験であった。

疾患の組織学的進行をモニタリングするために、組入れ時の肝生検及び1年間の治療の終了時の生検を組織学的病変の検査及びスコアリングに使用した。NASH-CRNシステム(NASH Clinical Research Network)に従う組織学的スコアリングは病理学者によって一元化され、実施された。

52週間にF0～F2の線維化を有するNASH(NAS≧3)から線維化進展(F≧3)に移行した「急速進行者」の患者(n=16)とF≧3に進行しなかった患者(n=145)の間で患者の特性を比較した。

NIS4(商標)スコアを決定するために、アルゴリズムを算出する前にhsa-miR-34a-5p、アルファ-2-マクログロブリン、YKL-40、及びヘモグロビンA1cを定量化した。

簡潔に述べれば、YKL-40、hsa-miR-34a-5pレベル、及びアルファ2-マクログロブリンA2Mを測定するために、患者の血液を血清分離チューブ(SST)に採集した。HbA1cを測定するために、血液をEDTA採集管にも採集した。YKL40(CHI3L1とも呼ぶ)は、ELISA(Human Chitinase 3-like 1 Immunoassay Quantikine(登録商標)ELISAカタログ番号DC3L10)によって定量した。値はng/mLとして表した。アルファ2マクログロブリンのレベルは、BN IIシステム(Siemens Healthcare社)で比濁法によって測定した。値はg/Lとして表した。HbA1cは、イオン交換高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法(Menarini社HA-8160 HbA1c自動分析器)によって測定し、全ヘモグロビンの百分率として報告した。

miR-VanaParis抽出キット(AM1556、Ambion、Life Technologies社、Carlsbad、CA)を製造業者の指示書に従って使用して、保存されたmiRNAを含有する全RNAを100μlの個々の血清から抽出した。抽出効率をモニタリングし、試料間のばらつきを最小限にするために、i)RNA抽出の前に合成線虫(C.elegans)miR-39[3,125fmole](MSY0000010、Qiagen社、Venlo、The Netherlands)を各試料に添加し、ii)公知のmiR-34aのCq値を有する標準血清を、検査される試料と同時に処理した。次いで、miR-VanaParis洗浄溶液(8680G & 8543G14 Ambion)を使用して洗浄工程を実施し、エタノールの持込みを回避するために遠心分離した。miRNAを含む全RNAを、遠心分離によってDNアーゼ/RNアーゼ不含の水中に溶出し、使用するまで、直ちに-80℃で保管した。5μlの固定量の、血清試料からの全RNA、又は3.125fmol/mLに希釈した合成hsa-miRNA-34a(一本鎖配列=5'Phos-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3'(配列番号1);Integrated DNA Technologies社)(検量線の構築及びmiR-34aのコピー数の算出のために使用)を、TaqMan MicroRNA Reverse transcription Kit(4366597、Applied Biosystems社)を使用して同時に逆転写した。逆転写反応は、10μLのTaqMan MicroRNA Assay 5Xを含有する15μLの最終混合物中で実行し、Applied Biosystem社製のサーモサイクラーGeneAmp(登録商標)PCR System 9400中でインキュベートした。cDNAを、更に使用するまで、低吸着チューブ中、-20℃で保管した。

Taqman miRNA RT-qPCR Assay 20X及びTaqMan Universal Master Mix II, no Uracil-N-Glycosidase (UNG) 2X(Applied Biosystems社)を使用して、製造業者の指示書に従って成熟miRNAの発現を定量化した。5μLの固定量の全RNAを、CFX96TM Real-Time Systemを使用するqPCRアッセイの鋳型として使用した。hsa-miR-34a-5p TaqManアッセイを使用した。合成miRNAからのRT産物を連続希釈し、PCRを全ての試料(標準及び血清由来RNA)について実施した。検量線を二重で実施し、Cqデータをコピー/μLに変換するために使用した。Cq決定モードは回帰であった。転写物の存在量はCqで表す。

成熟miRNAの配列及びTaq ManアッセイIDを以下の表に報告する:

アルゴリズムの構築に使用したデータはCq形式であった。

次いで、Cq単位で表されるhas-miR-34a-5pの血清レベルを有するロジスティック関数として定義される、NIS4(商標)スコアを出願WO2017167934に提供される通りに算出した。

NIS4(商標)を他の非侵襲的スコアと比較するために、確立された臨床的カットオフによって層別化された以下の非侵襲的スコアを評価し、予測モデルとして使用した:
・ Fibrosis-4[FIB-4;年齢、AST、ALT、血小板数]
・ NAFLD線維化スコア[NFS;年齢、BMI、IGF/糖尿病状態、AST、ALT、血小板数、アルブミン]
・ Enhanced liver fibrosis[ELF(商標);ヒアルロン酸(HA)、プロコラーゲンIIIアミノ末端ペプチド(PIIINP)、及びマトリックスメタロプロテアーゼの組織阻害剤(TIMP-1)]。

カイ2又はウィルコクソンのP値を使用して、F≧3に進行した患者群からのデータ及びスコアを、F≧3に進行しなかった患者群からのデータと比較した。

「急速進行者」の患者は、非急速進行者の患者と比較して、悪い臨床的及び生化学的特徴を有する傾向があり(Table 1(表2))、それらの特徴には以下が含まれる:
・ 年齢が高い
・ 肥満、2型真性糖尿病(T2DM)、及び高血圧を含めた代謝併存症が多い
・ ALT、ASTが高い
・ 平均非侵襲的スコア(FIB-4、NFS、NIS4(商標)、及びELF(商標))が高い
次いで、線維化進展スコアに進行した患者をスコアゾーンによって分類した。

スコアが確定のための高カットオフを上回る場合は高スコアゾーンに決定し、スコアが高カットオフと低カットオフの間である場合は未定ゾーンに定義し、スコアが除外のための低カットオフより低い場合は低スコアゾーンに決定した。実際の臨床での使用を可能とするために、除外判定をもたらすための低カットオフは0.36未満に定め、その場合、感度は81,5%、特異度は63%、及びNPVは77.9%であった。加えて、確定判定を可能にするための高カットオフは0.63以上に設定し、その場合、特異度は87,1%、感度は50,7%、及びPPVは79,2%であった(Harrisonら(The Lancet Gastroenterology & Hepatology、第5巻、第11号、970～985頁、2020年11月1日;オンライン公開2020年8月3日)。

NIS4(商標)スコアは、WO2017167934及びHarrisonら(The Lancet Gastroenterology & Hepatology、第5巻、第11号、970～985頁、2020年11月1日;オンライン公開2020年8月3日)に提供される方法に従って算出した。簡潔に述べれば、ブートストラップモデルから誘導されるロジスティック関数は、上で定義された低及び高カットオフの、求められる特異度、感度、PPV、及びNPVに適合させた、以下の特徴で定義される:

式中:
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D
式中:
Sは、NIS4(商標)スコアであり;
Aは、hsa-miR-34a(特にhsa-miR-34a-5p)の血清レベル(Cq)であり;
Bは、アルファ2マクログロブリンの血清レベル(g/L)であり;
Cは、YKL-40の血清レベル(pg/ml)であり、
Dは、HbA1cのレベル(パーセント)であり(例えば、Dは、測定されたHbA1cの百分率が10%であれば、10に等しい);
kは、9.51～34.37の間に含まれる数であり;
aは、-1.17～-0.47の間に含まれる数であり;
bは、0.02～0.84の間に含まれる数であり;
cは、6.10E-06～2.09E-05の間に含まれる数であり;
dは、0.07～0.89の間に含まれる数である。

Table 2(表3)に示すように、NASH(NAS≧3)及びF0～F2線維化から線維化進展(F≧3)に移行した≪急速進行者≫の患者の絶対数及び相対百分率を、NIS4(商標)、FIB-4、NFS、及びELFの各検査/スコアゾーンについて定量化した。

NIS4(商標)及びELF(商標)では、低～中間スコアゾーンから高スコアゾーンに分類される≪急速進行者≫の患者の割合が段階的に増加した。NIS4(商標)は、ELF(商標)(56%)と比較して、より多くの≪急速進行者≫の患者を高スコアゾーン(69%)に分類した。対照的に、FIB-4及びNFSは、大部分の≪急速進行者≫の患者を低又は中間スコアゾーンに類別した。

52週間に線維化進展に進行する確率をベースラインのスコア範囲ごとに算出した(Table 3)(表4))。

このコホートでは、評価した検査の低スコアゾーンは、線維化進展(F≧3)に進行するリスクがより低い(52Wに0～6%)ことが概して強調された。一方で、高スコアゾーンは概して、52週間の経過をこえて最も高い進行のリスクを与えた。

最後に、各検査での高カットオフで、≪急速進行者≫を識別する臨床性能を算出した(Table 4(表5))。診断指標(感度、特異度、陽性的中率/PPV、陰性的中率/NPV)を、二項分布に対する正規近似に基づいた漸近公式で算出した95%CI(Fleiss、2003)と共に示した。

全ての統計解析は、Rバージョン3.4.1(R Core Team、2017)を使用して実施した。

総じて、NIS4(商標)は、最もバランスの取れたプロファイルを有しており、評価した検査(Se=0%～67%)のうちで感度が最も高く(Se=69～83%)、等しく特異度が高かった(Sp=88～89%)。

NIS4≧0.63は、FIB-4≧2.67(25%)、NFS≧0.676(13%)、及びELF≧9.8(56%)と比較して、ほとんどの(69%)≪急速進行者≫集団を正確に識別した。

結論として、NIS4(商標)は、1年間の経過以内に線維化進展に進行する尤度が高い≪急速進行者≫の臨床的部分母集団を識別することができる。加えて、NIS4(商標)は、FIB-4、ELF、及びNAFLD線維化スコアより、急速進行者の患者を識別する良好な予後有用性を有する。

Claims (6)

1. 対象を、52週間の経過以内に肝線維化進展に進行する尤度が高いNAFLDを有するとして識別するための方法であって、前記方法が、前記対象の血液由来の試料中のhsa-miR34a、アルファ2マクログロブリン(A2M)、YKL40、及び糖化ヘモグロビン(HbA1c)のレベルを測定することを含み、測定されたレベルが、スコアSを算出するためにロジスティック関数に使用され、スコアSが、以下のロジスティック関数:
   式中:
   Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D
   に従って算出され、前記方法が、ブートストラップモデルから誘導され、
   式中:
   Sは、スコアであり;
   Aは、hsa-miR-34a(特にhsa-miR-34a-5p)の血清レベル(Cq)であり;
   Bは、アルファ2マクログロブリンの血清レベル(g/L)であり;
   Cは、YKL-40の血清レベル(pg/ml)であり、
   Dは、HbA1cのレベル(パーセント)であり(例えば、Dは、測定されたHbA1cの百分率が10%であれば、10に等しい);
   kは、ロジスティック関数の定数であり
   aは、hsa-miR-34a(特にhsa-miR-34a-5p)の血清レベルに関連する係数であり;
   bは、アルファ2マクログロブリンの血清レベルに関連する係数であり;
   cは、YKL-40の血清レベルに関連する係数であり;
   dは、HbA1cのレベルに関連する係数であり
   ここで:
   kは、9.51～34.37の間に含まれる数であり;
   aは、-1.17～-0.47の間に含まれる数であり;
   bは、0.02～0.84の間に含まれる数であり;
   cは、6.10E-06～2.09E-05の間に含まれる数であり;
   dは、0.07～0.89の間に含まれる数であり
   0.63であるカットオフ値以上のスコアSが、52週間の経過以内に線維化進展に進行する尤度が高いことの指標である、
   方法。
2. hsa-miR34a-5p、HbA1c、YKL-40、及びA2Mのレベルを測定することを含む、請求項1に記載の方法。
3. 対象が、線維化ステージが0、1、又は2であるNAFLDを有する、請求項1又は2に記載の方法。
4. 物理的方法を用いて前記対象の肝線維化を測定することを更に含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
5. 物理的方法を用いて肝線維化を測定することが、前記対象の肝硬度を測定する工程によって実行される、請求項4に記載の方法。
6. 肝硬度が、肝臓における弾性せん断波伝播の速度の差を測定する工程によって測定される、請求項5に記載の方法。