KR102607655B1

KR102607655B1 - 리폴딩된 재조합 인간화 라니비주맙의 제조 방법

Info

Publication number: KR102607655B1
Application number: KR1020197037079A
Authority: KR
Inventors: 라훌 샤라드 밤부레; 카야나트 마하마드타키 가니
Original assignee: 카운슬 오브 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치
Priority date: 2017-05-19
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2023-11-28
Also published as: US20200165332A1; WO2018211529A1; CN110636859B; JP7282689B2; US20200140535A1; MX2019013750A; EP3624847A1; KR20200008147A; CN110636859A; BR112019023795A2; JP2020520642A; US11524996B2; US11578122B2; CA3063320A1

Abstract

본 발명은 항체 단편을 제조하는 신규한 클로닝, 발현 및 리폴딩(refolding) 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 재조합 인간화(rHu) 라니비주맙을 제조하는 클로닝, 발현 및 리폴딩 플랫폼에 관한 것이다.

Description

리폴딩된 재조합 인간화 라니비주맙의 제조 방법

표적 치료 단백질의 시간 및 비용 효과적인 제조는 바이오시밀러 산업의 성공에 있어서 핵심적 요소이다. 바이오제약 연구 및 개발의 현행 경향은 항체 단편 개발에 더 초점을 두고 있다. 항체 단편은 완전 크기 단클론 항체 치료제를 능가하는 특정한 장점, 예컨대 완전 크기 mAb 등에 의해 접근불가한 향상되고 심도 있는 종양 관통 및 특이적 에피토프 결합을 제공한다(참조 문헌 1 및 2).

글리코실화되지 않은 작은 항체 단편의 박테리아 발현은 포유 동물 세포계에서 단클론 항체를 생산하는 것보다 쉽고 저렴하다. 라니비주맙은 습식(wet type) 연령 관련 황반 변성의 치료에 사용되는 재조합 인간화 단클론 항체이다(참조 문헌 3). 이는 항-혈관형성성이고 인간 혈관 내피 생성 인자 A(VEGF A)의 생물학적 활성을 억제한다. 인간화 단클론 항체 단편은 통상적으로 대장균(E.coli)에서 재조합 DNA 기술에 의해 발현되고, 인간 혈관 내피 생성 인자 A에 대한 표적이 된다(참조 문헌 3 및 4).

rHu 라니비주맙은 중쇄의 231-잔기 N-말단 부분으로 다이설파이드 결합에 의해 이의 C-말단이 연결된 214-잔기 경쇄를 함유한다(참조 문헌 5). rHu 라니비주맙의 분자량은 48,380 Da이다(중쇄 분자량은 24,953 Da이고 경쇄 분자량은 23,430 Da임). E . coli 세포를 사용하여 제조된 rHu 라니비주맙은 불용성 단백질 응집물 형태의 봉입체를 형성한다.

봉입체로서 발현되는 rHu 라니비주맙에 있어서, 리폴딩은 전반적인 제조에서 주요한 속도 결정 단계이다. 이러한 Fab 분자에 대한 기존의 상업상 리폴딩 방법은 단백질의 응집된 형태를 생물학적 활성의 가용성 형태로 전환하는 "3D" 기법 중 하나(희석, 정용여과(diafiltration) 또는 투석)를 기반으로 한다(참조 문헌 6 내지 9). 현재는, 라니비주맙 제조를 위한 생체내 및 시험관내 폴딩 경로에 대해 거의 이해된 바가 없다. rHu 라니비주맙의 시험관내 리폴딩에 이용가능한 이해 및 문헌이 제한됨에 기인하여, 항체 단편은 종종 E.coli 세포주변질(periplasm)에서 가용성 형태로 발현된다. 그러나, 박테리아 세포주변질은 총 세포 부피의 단지 8 내지 16%만을 구성할 뿐이므로, 발현되는 가용성 단백질의 양이 제한된다. 또한, 세포주변질에 더 높은 수준의 단백질 발현은 봉입체 형성을 야기하는데, 이는 제조되는 단백질의 정량 및 제조에 요구되는 시간 둘다에 있어서의 생산성을 심히 제한한다.

E. coli의 세포주변질 부에서의 발현은 항체 단편의 가장 통상적인 제조 기법이다. 세포주변질 발현의 치명적 단점은 낮은 수율에 있고, 이는 이러한 공정의 상업상 이용을 어렵게 한다. E . coli에서 항체 단편의 세포주변질 발현에 대해 몇몇 보고된 바가 존재한다. 파상풍균 톡소이드(tetanus toxoid)에 대한 항체 단편이 단일 서열을 항체 단편의 경쇄 및 중쇄와 접합되어 세포주변질 공간에 발현됨으로써 16 mg/L의 수율을 야기하였다.

항체 단편의 세포주변질 분비가 단백질 합성을 최소 수율로 야기한 몇몇 선행기술의 개시를 살펴볼 필요가 있다. 험프리스 디피(Humphreys DP) 등은 E . coli에서 듀얼 프로모터 벡터 pDPH128을 사용한 항-인간 IgG의 항체 단편의 제조를 설명한다. 이러한 항체 단편의 기능적 수용성 형태는 세포주변질 분비에 의해 150 mg/L의 수율로 성취되었다. 소 항체 단편 Fab가 E. coli HB2151에서 pComBov 벡터를 사용하여 제조되었다. 상기 항체 단편을 세포주변질에 발현하여 2 mg/L의 전체 수율이 야기되었다(참조 문헌 13). HuMAb4D5-8의 항체 단편의 세포주변질 발현은 E. coli에서 1 내지 2 g/L의 수율을 성취하였다(참조 문헌 14). 치료 단백질의 세포주변질 발현은 미스폴딩(misfolding) 및 응집에 기인하여 더 낮은 발현 수준을 야기하곤 한다(참조 문헌 15).

항체 단편의 세포주변질 발현에 관한 특허 문헌 및 기법(예컨대 태깅(tagging) 사용)이 사용되었지만, 이 중 어떠한 시도도 항체 단편 제제를 수득할 수는 없었다.

US 2016/289314에는 rHu 라니비주맙의 경쇄 및 중쇄를 E.coli 세포의 세포주변질로 반출하는 신호 전달 서열이 개시되어 있다. 상기 특허 공보에는 상이한 발현 벡터를 사용하되 세포주변질에서 단백질 발현을 위해서는 동일 숙주 세포를 사용하는 rHu 라니비주맙의 중쇄 및 경쇄의 발현 기법이 기재되어 있다. 경쇄 및 중쇄가 희석 방법에 의해 시험관내 리폴딩을 위해 동일 비율로 합쳐졌다.

PCT 공보 WO 98/45331에는 하기를 포함하는 치료적으로 유망한 특성을 갖는 인간화 및 변형 항 VEGF 항체 제조가 개시되어 있다: (a) VEGF 항원에 대한 강한 결합 친화성; (b) 내피 세포의 VEGF-유도 증식을 억제하는 능력; 및 (c) 생체내 VEGF-유도 혈관생성을 억제하는 능력. 상기 특허 공보에는 가변 경쇄 및 가변 중쇄의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있고, 이는 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)를 함유하는 형질전환 벡터를 E.coli 세포에 형질전환에 의해 발현된다.

PCT 공보 WO 20130/76657에는 BL21 (DE3) E. coli 세포에서 관심 대상인 가용성 단백질을 수득하기 위한 융합 태그(fusion tag)로서 메티오닌 아미노펩티다제(MAP) 단백질이 개시되어 있다. rHu 라니비주맙 경쇄 및 중쇄 유전자 서열은 s MAP 단백질로 태깅되었고, MAPLC 및 MAPHC 융합 단백질이 가용성 형태로 발현되었다.

PH 12015501593　(A1)에는 토끼 단클론 항체로부터의 CDR을 포함하는 가용성이고 안정한 항-VEGF 면역 바인더(binder)를 포함하는 항-VEGF 항체를 합성하기 위한 하이브리도마 기법이 개시되어 있다. 또한, 상기 문헌에는 경쇄 및 중쇄의 가변부의 뉴클레오티드 서열 및 재조합 항체 단편의 발현을 위한 발현 구축물이 개시되어 있다. scFv 또는 Fab 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드는 적합한 숙주, 바람직하게는 E. coli 균주 JM83(세포주변질 발현을 위함) 또는 BL21(봉입체에서의 발현을 위함)에 도입된다. 폴리펩티드는 세포주변질 또는 봉입체로부터 수득되고, 표준적인 기법(예컨대 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 및/또는 겔 여과)을 사용하여 정제된다.

US 2008/125580에는 이종 숙주 세포에서 리폴딩된 재조합 단백질을 정제하고 높은 pH의 완충제에서 단백질을 리폴딩하는 방법이 개시되어 있다. 성장 인자, 예컨대 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자 및 혈관 내피 생성 인자와 같은 재조합 단백질이 숙주 세포에 발현되고, 환원제 및 카오트로픽제(chaotropic agent)를 함유하는 완충제의 첨가 및 공기 또는 산소의 첨가에 의해 리폴딩되었다.

항체 단편의 세포주변질 발현에 의해 마주하게 되는 단점들에 비추어, 당업계에서, 향상된 순도 및 수율을 갖는 동일 비율의 항체 단편의 세포질 발현을 위한 방법을 개발할 필요가 있다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 항체 단편의 제조를 위한 클로닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 항체 단편의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 재조합 구축물 및 이의 숙주 세포에서 동일 발현을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 항체 단편의 세포질 발현을 수득하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 항체 단편의 경제적인 생성을 위한 고밀도 세포 발효를 사용하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 인간화(rHu) 라니비주맙의 제조를 위한 고 수율 리폴딩 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명의 양상은 리폴딩된 항체 단편의 제조를 위한 클로닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 리폴딩된 재조합 인간화 항체 단편을 제조하기 위한 클로닝 방법으로서 하기를 포함하는 방법을 제공하는 것이다:

(a) 숙주 세포에서 항체 단편의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 벡터를 형질전환하는 단계;

(b) 상기 숙주 세포를 고밀도 세포 발효시키는 단계; 및

(c) 글루코스 및 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 포함하는 혼합물의 존재하에 유도에 의해 상기 숙주 세포의 세포질에 상기 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 동일 비율로 공동-발현시키는 단계.

리폴딩된 재조합 인간화 항체 단편의 제조 방법은 하기를 추가로 포함한다:

(i) 가용화 완충제의 존재하에 재조합 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 동일 비율로 함유하는 봉입체를 가용화시킴으로써 가용화된 경쇄 및 중쇄를 수득하는 단계; 및

(ii) 가용화된 항체 단편을, 변성제를 희석한 후 산화제의 존재하에 산화시켜 다이설파이드 결합의 산화를 촉발하여 생물학적 활성 형태의 rHu 라니비주맙을 수득하는 단계.

또 다른 양상에서, 본 발명은 재조합 인간화 라니비주맙의 클로닝 및 리폴딩 방법을 제공한다.

도 1은 rHu 라니비주맙을 위한 신규한 클로닝, 발현 및 리폴딩 플랫폼을 도시한 것이다.
도 2는 rHu 라니비주맙의 경쇄 및 중쇄 유전자의 발현을 위한 듀엣 벡터(Duet vector) A를 도시한 것이다.
도 3은 rHu 라니비주맙의 경쇄 및 중쇄 유전자의 발현을 위한 듀엣 벡터 B를 도시한 것이다.
도 4는 레인(lane) 1이 환원된 표준 이노베이터(innovator) rHu 라니비주맙이고 레인 2가 듀엣 벡터 A를 사용한 경쇄 및 중쇄 유전자 발현이고 레인 3이 듀엣 벡터 B를 사용한 경쇄 및 중쇄 유전자 발현이고 레인 4가 비유도된 E.coli 세포인, 환원성 SDS-PAGE를 도시한 것이다.
도 5는 레인 1 및 2가 환원된 개발된 rHu 라니비주맙이고 레인 3이 환원된 표준 이노베이터 rHu 라니비주맙인, 환원성 SDS-PAGE를 도시한 것이다.
도 6은 레인 1이 단백질 분자량 마커이고 레인 2가 표준 이노베이터 rHu 라니비주맙이고 레인 3이 리폴딩된 rHu 라니비주맙인, 비환원성 SDS-PAGE를 도시한 것이다.
도 7은 rHu 라니비주맙 제조를 위한 고밀도 세포 E.coli 발효에 대한 성장 곡선을 도시한 것이다.
도 8은 A가 표준 이노베이터 rHu 라니비주맙이고 B가 리폴딩된 라니비주맙인, 역상 HPLC 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 9는 A가 표준 이노베이터 rHu 라니비주맙이고 B가 리폴딩된 rHu 라니비주맙인, 크기 배제 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 10은 A가 이노베이터 rHu 라니비주맙이고 B가 리폴딩된 rHu 라니비주맙인, MALDI-TOF에 의한 rHu 라니비주맙의 완전 질량 분석을 도시한 것이다.
도 11은 A가 표준 이노베이터 rHu 라니비주맙 경쇄 및 중쇄이고 B가 개발된 rHu 라니비주맙 경쇄 및 중쇄인, MALDI-TOF에 의한 환원되고 알킬화된 rHu 라니비주맙 질량 분석을 도시한 것이다.
도 12는 E.coli에 대한 성장 곡선을 도시한 것으로, 이는 시간에 따라 증가하는 바이오매스 수율을 나타낸다.

이후로, 본 발명은 특정 바람직하고 임의적인 양태들과 결부되어 상세히 기재될 것이고, 이에 따라 이의 다양한 양상이 보다 충실히 이해되고 인식될 것이다.

생물학적 재료의 공급원인 E. coli BL21(DE3)은 인도 소재의 메르크 밀리포어 라이프 사이언스 프라이빗 리미티드(Merck Millipore life science private limited)로부터 구입하였다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 리폴딩된 재조합 인간화 항체 단편을 제조하기 위한 클로닝 방법으로서 하기를 포함하는 방법을 제공한다:

(d) 숙주 세포에서 항체 단편의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 벡터를 형질전환하는 단계;

(e) 상기 숙주 세포를 고밀도 세포 발효시키는 단계; 및

(f) 글루코스 및 IPTG를 포함하는 혼합물의 존재하에 유도에 의해 상기 숙주 세포의 세포질에 상기 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 동일 비율로 공동-발현시키는 단계.

본원에서 "벡터를 형질전환하는 단계"는 숙주 세포에서 항체 단편의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 하나 이상의 듀엣 벡터를 형질전환함을 지칭한다.

특정한 양태에서, 본 발명은 리폴딩된 재조합 인간화 라니비주맙을 제조하기 위한 클로닝 방법으로서 하기를 포함하는 방법을 제공한다:

(i) 숙주 세포에서 항체 단편의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 서열번호 1 및 서열번호 3을 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 듀엣 벡터를 형질전환하는 단계;

(ii) 상기 숙주 세포를 고밀도 세포 발효시키는 단계; 및

(iii) 글루코스 및 IPTG를 포함하는 혼합물의 존재하에 유도에 의해 상기 숙주 세포의 세포질에 상기 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 동일 비율로 공동-발현시키는 단계.

하나의 양태에서, 본 발명은 서열번호 2의 라니비주맙의 중쇄를 암호화하는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 라니비주맙의 경쇄를 암호화하는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 항체 단편의 중쇄 및 경쇄의 동일 발현을 위해 서열번호 1 및 서열번호 3을 보유하는 벡터 구축물을 제공한다.

따라서, 듀엣 벡터는 다중 클로닝 부위 I(MCS I)에서 T7 프로모터에 후행하는 NcoI/HindIII 부위에 5' 말단으로 삽입되는 항체 단편의 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열번호 3; 및 다중 클로닝 부위 II(MCS II)에서 T7 프로모터에 후행하는 NdeI/XhoI 부위로의 5' 말단에서 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열번호 1을 포함한다(도 2 참고).

추가의 양태에서, 본 발명은 다중 클로닝 부위 I(MCS I)에서 T7 프로모터에 후행하는 NcoI/HindIII 부위에 5' 말단으로 삽입되는 항체 단편의 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열번호 3; 및 다중 클로닝 부위 II(MCS II)에서 T7 프로모터에 후행하는 NdeI/XhoI 부위로의 5' 말단에서 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열번호 1을 포함하는 듀엣 벡터를 제공한다(도 3 참고).

또 다른 바람직한 양태에서, 경쇄 및 중쇄 유전자 구축물을 보유하는 하나 이상의 듀엣 벡터가 발현 시스템에서 형질전환된다. 형질전환되는 가장 바람직한 발현 시스템은 적격 E. coli BL21(DE3) 세포이다. BL21(DEE) 세포의 선택되는 형질전환체(transformant)는 rHu 항체 단편 발현에 대해 결정된다.

도 4는 듀엣 벡터 A 및 듀엣 벡터 B를 사용한 경쇄 및 중쇄의 발현을 나타낸 것이고, 비유도된 E. coli 숙주 세포에서 어떠한 누출성 발현(leaky expression)도 없이 쇄 둘다에서 거의 동일 발현이 확인되었다. 보다 바람직하게는, 12% 환원성 SDS-PAGE를 사용하여 rHu 라니비주맙의 경쇄 및 중쇄의 동일 발현의 일관성 및 더 높은 수준이 듀엣 벡터 A를 사용하여 관찰되었고, 이는 도 5에 나타나 있다.

하나 이상의 양태에서, 본 발명은 약 5 내지 약 15 g/L의 봉입체를 포함하는 약 175 내지 190 g/L의 바이오매스 수율을 제공한다. 도 7은 rHu 라니비주맙 제조를 위해 고밀도 세포 발효된 형질전환 E. coli 세포의 성장 속도의 증가를 나타낸다.

도 12는 E. coli의 성장 곡선을 나타내고, 이는 시간에 따라 바이오매스 수율의 증가를 나타낸다.

또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 하기를 추가로 포함하는 리폴딩된 재조합 인간화 항체의 제조 방법을 제공한다:

(i) 동일 비율의 재조합 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 함유하는 봉입체를 가용화 완충제의 존재하에 가용화시킴으로써 가용화된 경쇄 및 중쇄를 수득하는 단계; 및

하나의 양태에서, 본 발명은 트리스(Tris) 완충제, 에틸렌 다이아민 테트라아세트산(EDTA), 변성제 및 환원제를 포함하는 가용화 완충제를 제공한다.

바람직한 변성제는 구아니딘 하이드로클로라이드 및 우레아로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직한 환원제는 다이티오트레이톨(DTT) 및 β-머캅토에탄올로 이루어진 군으로부터 선택된다.

따라서, Tris 완충제의 바람직한 농도는 0.1 내지 0.5 M(7 내지 10의 pH)이다. EDTA의 바람직한 농도는 1 내지 4 mM이고, 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도는 약 3 내지 약 6 mM이다.

가장 바람직하게는, 가용화 완충제는 0.1 M Tris pH 9.0, 2 mM EDTA 및 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드(변성제)를 포함하고, 환원제, 즉 5 mM DTT를 추가로 포함한다.

가용성이고 환원된 봉입체 용액은 10 mM 산화 글루타티온을 첨가하여 산화된다. 이어서, 0.1 M Tris pH 9.0, 0.6 M 아르기닌, 5% 소비톨 및 2 mM EDTA를 함유하는 리폴딩 완충제에서 75배 희석액을 10 ± 2℃에서 사용하여 리폴딩을 수행한다. 또한, 산화성 리폴딩을 순수한 산소를 1 SLPM(표준 L/분)으로 시험관내 리폴딩 공정으로 통과시킴으로써 수행한다.

산소는 다이설파이드 결합의 형성 및 반응 속도를 시스테인 아미노산에서 티올 기의 산화에 의해 촉발한다. 산화-환원 셔플(redox shuffle)을 사용하여 단백질의 시스테인 아미노산과 혼합형 다이설파이드 결합을 형성한 후 친핵성 공격(nucleophilic attack)을 함으로써 단백질 분자의 시스테인 아미노산들간의 교정된 다이설파이드 결합을 형성한다.

생물학적 활성을 갖도록 리폴딩되고 기능적 활성인 rHu 라니비주맙이 100 내지 110 μg/mL로 수득된다.

또한, 이노베이터 rHu 라니비주맙 및 개발된 rHu 라니비주맙간의 우수한 일치성(펩티드 핑거 프린팅(peptide finger printing) 분석에 의해 85.4%의 이론적 서열 범위(sequence coverage))이 수득된다.

하기 실시예는 설명을 목적으로 제시되고, 따라서 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 여겨지지 않는다.

실시예

실시예 1: 경쇄 및 중쇄 유전자 서열의 구축을 위한 코돈 최적화

rHu 라니비주맙의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 드러그 뱅크(drug bank)로부터 입수하여 코돈 최적화를 수행하였다(수탁 번호 DB01270).

실시예 2: rHu 라니비주맙의 경쇄 및 중쇄의 발현을 위한 듀엣 벡터 A의 구축

듀엣 벡터 A(도 2 참고)를, MCS I에서 T7 프로모터에 후행하는 NcoI/HindIII 부위로의 말단 5'에서 경쇄 뉴클레오티드 서열번호 3; 및 MCS II에서 T7 프로모터에 후행하는 NdeI/XhoI 부위로의 말단 5'에서 중쇄 뉴클레오티드 서열번호 1을 삽입하여 구축하였다.

실시예 3: rHu 라니비주맙의 경쇄 및 중쇄의 발현을 위한 듀엣 벡터 B의 구축

듀엣 벡터 B(도 3 참고)를, MCS I에서 T7 프로모터에 후행하는 NcoI/HindIII 부위로의 말단 5'에서 경쇄 뉴클레오티드 서열번호 3; 및 MCS II에서 T7 프로모터에 후행하는 NdeI/XhoI 부위로의 말단 5'에서 중쇄 뉴클레오티드 서열번호 1을 삽입하여 구축하였다.

실시예 4: BL21(DE3) 숙주 세포에서 발현 구축물의 형질전환

경쇄 및 중쇄 유전자 구축물을 갖는 듀엣 벡터 A 및 B를 적격 BL21(DE3) 발현 시스템에서 형질전환하였다. 형질전환 방법은 하기를 포함하였다: 0.5 μg 벡터를 갖는 100 μL 숙주 세포를 얼음 상에서 30분 동안 항온배양한 후 42℃에서 35초 동안 열 충격(heat shock)을 가했다. 열 충격을 가한 후 세포를 얼음 상에서 다시 15분 동안 항온배양하였다. 이어서, 분해대사물 억제에 의한 슈퍼 옵티멀 브로쓰(Super Optimal broth)(SOC) 배지를 반응 혼합물에 첨가한 후 1시간 45분 동안 450 rpm으로 항온배양하였다. 형질전환된 세포를 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. BL21(DE3) E.coli 형질전환체를 30 μg/mL 카나마이신을 함유하는 LB 아가(agar) 플레이트 상에 플레이팅하였다. 형질전환된 세포를 함유하는 플레이트를 37℃에서 밤새 항온배양하였다. 항생 선택 마커를 기반으로, 확실히 형질전환된 세포를 상기 플레이트로부터 단리하고 단백질 발현에 사용하였다.

실시예 5: 진탕 플라스크 수준에서 rHu 라니비주맙 발현

BL21(DE3)의 선택된 형질전환체를 rHu 라니비주맙 발현에 대해 시험하였다. 선택된 군락을 30 μg/mL 카나마이신을 갖는 10 mL LB 브로쓰에 접종하였다. 세포를 600 nm에서 1 내지 1.5의 값의 최적 밀도에 도달할 때까지 배양하였다. 상기 잘 배양된 군락 2 mL를 100 mL 테러픽 하이벡(Terrific HiVeg: 상표명) 브로쓰에서 형질전환하고 37℃ 및 250 rpm으로 항온배양하였다. 600 nm에서 1 내지 1.50의 최적 밀도를 성취한 후 E.coli 배양물을 5 mM IPTG에 의해 유도하였다. 세포를 유도 5시간 후 수확하고 6000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세포 펠릿(pellet)을 20 mM Tris, 0.1 mM EDTA pH 9.0 용해 완충제 중에 재현탁시켰다. 세포를 고압 균질기에서 15000 bar 압력으로 20분 동안 용해시켰다. 용해된 세포를 6000 rpm으로 25분 동안 원심분리하였다. 상청액에 발현된 단백질의 존재 및 펠릿을 환원성 및 비환원성 SDS-PAGE 분석을 사용하여 확인하였다. 도 4는 듀엣 벡터 A 및 듀엣 벡터 B를 사용하여 경쇄 및 중쇄의 발현을 나타낸 것이고, 비유도된 E.coli 숙주 세포에서 어떠한 누출성 발현도 없이 거의 동일한 경쇄 및 중쇄의 발현이 확인되었다. 12% 환원성 SDS-PAGE를 사용한 rHu 라니비주맙의 경쇄 및 중쇄의 더 높은 수준의 동일 발현이 듀엣 벡터 A를 사용하여 관찰되었다(도 5 참고). 진탕 플라스크 수준 E.coli 발효는 600 nm에서 9.3 ± 0.12 g/L 바이오매스로 3.78 ± 0.05의 광학 밀도를 야기하여 0.868 ± 0.01 g/L의 봉입체 생성을 야기하였다. 봉입체에서 rHu 라니비주맙의 경쇄 및 중쇄의 정량 및 순도를 역상 HPLC에 의해 측정하였다(도 8 참고).

실시예 6: 생체반응기 수준에서의 rHu 라니비주맙 발현

단백질 발현을 1 L 생체반응기에서 수행하였다. 선택적으로 형질전환된 BL21(DE3) 세포를 rHu 라니비주맙 발현에 대해 평가하였다. 선택된 군락을 30 μg/mL 카나마이신을 갖는 10 mL LB 브로쓰에 접종하였다. 세포를 600 nm에서 1 내지 1.5의 값의 최적 밀도에 도달할 때까지 배양하였다. 상기 잘 배양된 군락 2 mL를 100 mL LB 브로쓰에서 형질전환하고 37℃ 및 250 rpm으로 항온배양하였다. 100 mL 시드(seed) 배양물을 900 mL 테러픽 하이벡(상표명) 브로쓰에서 형질전환하였다. 고밀도 세포 발효를 바이오플로(BioFlo: 등록상표)/셀리젠(CelliGen: 등록상표) 115 벤치탑(benchtop) 반응기를 사용하여 1 SPLM 기체 유동 범위의 자동 기체 혼합물로 직접 구동 모터, 2개의 러시턴 임펠러(Rushton Impeller) 및 고리 스파저(ring sparger)(매크로스파저(Macrosparger))를 갖는 방해판(baffle) 조립체를 갖는 2 L 열 블랭킷 유리 용기를 사용하여 수행하였다. 자동 DO 케스케이드 교반, 가스플로(GasFlo) 및 O₂ 혼합을 DO 설정점을 30%로 하여 선택하였다. 교반 케스케이드 하한치를 300 rpm으로 유지하고 상한치를 1000 rpm으로 유지하였다. 가스플로 케이케이드를 1 SLPM으로 유지하고, O₂ 혼합을 0 내지 80%로 유지하였다. E.coli 배양물을 5 mM IPTG에 의해 미드-로그 상(mid-log phase)에서 유도하였다. 세포를 유도 5시간 후 수확하고 6000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세포 펠릿(pellet)을 20 mM Tris, 0.1 mM EDTA pH 9.0 용해 완충제 중에 재현탁시켰다. 세포를 고압 균질기에서 15000 bar 압력으로 20분 동안 용해시켰다. 용해된 세포를 6000 rpm으로 25분 동안 원심분리하였다. 상청액 및 펠릿에서 발현된 rHu 라니비주맙의 존재를 SDS-PAGE 분석을 사용하여 측정하였다. 고밀도 세포 E.coli 발효는 600 nm에서 182 ± 2.9 g/L 바이오매스로 75.0 ± 1.2의 광학 밀도를 야기하여 7.0 ± 0.1 g/L의 봉입체 생성을 야기하였다(도 7 참고).

실시예 7: rHu 라니비주맙의 경쇄 및 중쇄의 봉입체를 위한 단백질 리폴딩 및 전처리

가용화 프로토콜

170 mg 습윤 중량의 봉입체를 0.1 M Tris pH 9.0, 2 mM EDTA 및 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드(변성제)를 함유하는 10 mL 가용화 완충제 중에 30분 동안 초기 가용화하였다. 환원을 5 mM DTT를 첨가하여 수행하고, 환원을 위해 이를 1시간 동안 25℃에서 유지하였다. 상기 가용성이고 환원된 봉입체 용액을 산화를 위해 10 mM 산화 글루타티온을 첨가하여 3시간 동안 25℃에서 유지하였다.

리폴딩 프로토콜

상기 가용성이고 환원되고 산화된 봉입체를 10 ± 2℃에서 0.1 M Tris pH 9.0, 0.6 M 아르기닌, 5% 소비톨 및 2 mM EDTA를 함유하는 리폴딩 완충제에서 75배 희석하였다. 산화성 리폴딩을 순수한 산소를 1 SLPM(표준 L/분) 유동 속도로 시험관내 리폴딩 공정으로 통과시킴으로써 수행하였다. 산소는 다이설파이드 결합의 형성 및 반응 속도를 시스테인 아미노산에서 티올 기의 산화에 의해 촉발하였다. 산화-환원 셔플을 사용하여 단백질의 시스테인 아미노산과 혼합형 다이설파이드 결합을 형성한 후 친핵성 공격을 함으로써 단백질 분자의 시스테인 아미노산들간의 보정된 다이설파이드 결합을 형성하였다. 리폴딩 결과물을 5 KDa 울트라세테(Ultrasette: 상표명) 실험용 탄젠트 유동 여과(Lab Tangential Flow Filtration) 장치를 사용하여 한외 여과한 후 20 mM Tris pH 9.0으로 완충제를 교환하였다. 리폴딩된 rHu 라니비주맙을 48 kDa에서 12% 비환원성 SDS-PAGE로 관찰하였다(도 6 참고). 리폴딩된 rHu 라니비주맙의 정량 및 정성을 역상 HPLC 및 크기 배제 HPLC에 의해 측정하였다(도 8 참고).

실시예 8: rHu 라니비주맙 샘플에 대한 A280에서의 재조합 rHu 라니비주맙 흡수율의 분석적 특성규명

리폴딩된 총 단백질 및 크로마토그래피 결과를 280 nm에서 자외선 흡수 측정을 사용하여 측정하였다. 채집된 모든 분획을 280 nm에서 나노드랍(Nanodrop: 상표명) 2000 및 UV-1800 시마즈 UV 비저블(Shimadzu UV Visible) 스펙트럼 광도계를 사용하여 판독하였다.

실시에 9: rHu 라니비주맙에 대한 총 단백질 평가를 위한 브래드퍼 드(Bradford) 분석

총 단백질 평가에 사용되는 직교분석 기법은 595 nm에서 나노드랍(상표명) 2000을 사용한 브래드퍼드 분석이었다. 5 μL의 샘플을 250 μL의 브래드퍼드 시약에 첨가한 후 진탕기에서 30초 동안 혼합을 수행하였다. 혼합 후, 샘플을 염료의 존재하에 25분 동안 항온배양하고, 흡수율을 595 nm에서 측정하였다(참조 문헌 25).

실시예 10: rHu 라니비주맙 샘플의 SDS PAGE 분석

rHu 라니비주맙의 경쇄 및 중쇄의 발현을 동정하기 위한 SDS PAGE 분석을 환원 조건하에 12%(1 mm 두께)의 분해성 겔(resolving gel)을 사용하여 수행하고(도 4 참고), 리폴딩된 rHu 라니비주맙을 비환원성 SDS-PAGE에서 적층성 겔 정전압 120 V 및 분해성 겔 정전압 100 V 조건으로 관찰하였다(도 7 참고). 각각의 샘플을 10분 동안 출발 완충제에서 끓인 후, 상기 겔에 로딩하였다. 폴리아크릴아미드 겔에서의 전기영동 분리 후, 4:1:5(물:빙초산:메탄올) 중 0.05%(w/v) 쿠마씨 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) G250을 단백질 검출에 사용하였다(참조 문헌 26).

실시예 11: rHu 라니비주맙의 역상 HPLC 분석

rHu 라니비주맙의 정량 및 정성 분석을 어질런트(Agilent) 1260 HPLC 시스템 상에서 4.6 mm x 50 mm 포로쉘(Poroshell) 120 EC-C18 2.7 μm 컬럼을 사용한 역상 크로마토그래피를 사용하여 수행하였다(도 8 참고). 이동상은 물(용매 A) 중 0.1%(v/v) TFA 및 100%(v/v) 아세토니트릴(용매 B) 중 0.1%(v/v) TFA로 이루어졌다. 유동 속도를 214 nm의 파장에서 A에서 B로의 선형 구배를 사용하여 1 mL/분으로 유지하였다. 도 8은 이노베이터 및 리폴딩된 rHu 라니비주맙의 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

실시예 12: rHu 라니비주맙의 시험관내 생활성의 ELISA 정량 분석

리폴딩된 rHu 라니비주맙을 함유하는 샘플을 플레이트 상에 코팅된 VEGF 항원과 반응시켰다. 결합된 rHu 라니비주맙을 항-인간 IgG로 표지된 서양 고추냉이 퍼옥사이드(HRP) 효소에 의해 검출하였다. 상기 면역 반응은 고상의 VEGF가 결합된 항체-라니비주맙-효소 표지된 항체의 샌드위치 복합체의 형성을 야기하였다. 마이크로타이터 스트립(microtiter strip)을 세척하여 임의의 미결합 반응물을 제거하였다. 이어서, 기질, 즉 테트라메틸 벤지딘(TMB)을 반응시켰다. 가수분해된 기질의 양을 450 nm로 마이크로타이터 플레이트 상에서 판독하였고, 이는 존재하는 rHu 라니비주맙의 농도에 정비례하였다. 생물학적 활성의 리폴딩된 rHu 라니비주맙을 시험관내 생물 검정을 사용하여 정량 분석하였다. 102 μg/mL의 작용적 활성의 rHu 라니비주맙을 수득하였다(참조 문헌 27).

실시예 13: rHu 라니비주맙의 SE HPLC 분석

다양한 공정 결과물 중 응집물 함량을 야라(Yarra: 상표명)3 ㎛ SEC-2000(300 x 7.8 mm ID) 컬럼을 사용하여 수행된 SEC-HPLC 분석을 사용하여 측정하였다(도 9 참고). 이동상은 5.50 pH로, 20 mM 아세테이트 완충제 및 50 mM 나트륨 클로라이드 완충제로 이루어졌다. 분석을 등용매(isocratic) 모드에서 0.5 mL/분 유동 속도로 25℃에서 수행하였다. 단백질 검출을 280 nm에서 포토 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 수행하였다. 도 9는 0.5% 응집물 함량으로, 이노베이터 rHu 라니비주맙과 필적하는 정제 rHu 라니비주맙의 99.5% 순도를 나타낸다.

실시예 14: 이중 가닥 DNA 평가

리폴딩된 결과물 중 DNA의 존재를 퀀티-잇(Quant-iT: 상표명) 피코그린(picogreen) 분석을 사용하여 평가하였다. 표준 곡선을 이중 가닥 람다 DNA를 사용하여 작성하였다. 0.5 mL의 공정 결과물 샘플을 0.5 mL의 희석된 퀀티-잇 dsDNA BR 시약에 첨가하고, 반응 혼합물을 5분 동안 항온배양하였다. 5분 후, 형광을 형광 스펙트럼 광도계를 사용하여 측정하였다(480 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장).

실시예 15: 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화( MALDI - TOF )( 비과 시간(time-of-flight) 질량 스펙트럼계)에 의한 리폴딩된 rHu 라니비주맙의 온전 질량 분석

표준의 리폴딩된 정제 rHu 라니비주맙과 시나핀산(sinapinic acid) 매트릭스를 1:1 비로 혼합하여 MALDI-TOF 분석을 수행하였다(도 11 참고). 유사하게, 환원된 알킬화 표준의 리폴딩된 rHu 라니비주맙을 시나핀산 매트릭스와 1:1 비로 혼합하여 MALDI-TOF 분석을 수행하였다(도 12). 시나핀산 매트릭스(10 mg/mL)를 고순도 물 중 50% v/v 아세토니트릴 및 0.1% v/v TFA에서 제조하였다. 샘플과 매트릭스의 균질화된 혼합물 1 μL를 투명한 384 웰 MALDI 플레이트에 침작시켰다. 플레이트를 AB SCIEX TOF/TOF(상표명) 5800 계기에 삽입하였다. 상기 계기를 양이온 모드에서 사용하였다. 337 nm에서의 질소 레이저 복사를 이온화 공급원으로서 유지하였다. 4000 내지 5000의 레이저 강도를 샘플의 분석에 사용하였다. 결과 분석을 데이터 익스플로러(Data Explorer: 등록상표) 소프트웨어 버전 4.11을 사용하여 수행하였다. 도 10은 리폴딩된 rHu 라니비주맙과 이노베이터 rHu 라니비주맙의 온전 질량 비교를 나타낸다. 도 11은 정제 rHu 라니비주맙과 환원된 알킬화 이노베이터 rHu 라니비주맙의 경쇄 및 중쇄 질량 비교성을 나타낸다.

실시예 16: LC-MS에 의한 펩티드 핑거 프린팅

펩티드 사상(mapping)을 소 혈청 알부민(BSA), 표준 이노베이터 rHu 라니비주맙 및 리폴딩된 rHu 라니비주맙의 용액 소화에 의해 성취하였다. 단백질의 변성을 6.0 M 구아니딘 하이드로클로라이드를 사용하여 실온에서 1시간 동안 수행하였다. 10 mM의 DTT를 변성 단백질의 환원을 위해 첨가하고 1시간 동안 실온에서 항온배양하였다. 알킬화를 15 mM 요오도아세트아미드(IAA)를 사용하여 수행하고 15분 동안 암 조건에서 항온배양하고, 다시 5 mM DTT를 첨가하여 과량의 IAA를 중화시켰다. 변성되고 환원된 알킬화 단백질 샘플을 50 mM 암모늄 바이카보네이트 중에서 완충제 교환하였다. 트립신을 단백질 샘플의 소화에 1:50(트립신:단백질) 비로 사용하였다. 소화 혼합을 37℃에서 18시간 동안 항온배양한 후 샘플을 집팁(Ziptip: 등록상표) 피펫 팁을 사용하여 청소하였다. 청소된 샘플을 SPD1010 스피드백(Speedvac: 상표명) 농축기를 사용하여 건조시켰다. 소화된 단백질 샘플을 질량 등급수 중 3% 아세토니트릴 및 0.1% 포름산 중에 재구성하였다. 펩티드 핑거 프린팅을 AB SCIEX TripleTOF(상표명) 5600을 사용하여 수행하였다. 시스템 데이트를 기록하고 프로틴파일럿(ProteinPilot: 상표명) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 결과는 이노베이터 rHu 라니비주맙과 개발된 rHu 라니비주맙간에 85.4%의 이론적 서열 범위로 우수한 일치성을 나타냈다(참조 문헌 29).

본 발명의 장점

ㆍ 경쇄 및 중쇄의 동일 발현이 본 발명에 개시된 벡터 구축물을 사용하여 수득되고, mAb 단편의 경쇄 및 중쇄의 동일 발현을 수득하는데 있어서 수동식 가공 단계가 배제된다.

ㆍ 재조합 항체 단편의 세포주변질 발현이 아닌 세포질 발현으로 높은 바이오매스 수율이 야기됨으로써, 재조합 단백질의 수율이 증가한다.

ㆍ 본 발명에 사용되는 고밀도 세포 발효는 바이오매스 제조의 증가를 제공한다.

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SEQUENCE LISTING <110> COUNCIL OF SCIENTIFIC & INDUSTRIAL RESEARCH <120> A METHOD FOR PRODUCING REFOLDED RECOMBINANT HUMANIZED RANIBIZUMAB <130> P100342-WO <140> PCT/IN2018/050315 <141> 2018-05-18 <150> IN201711017654 <151> 2017-05-19 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 721 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA <400> SEQUENCE 1 gagctcatat ggaagttcag ctggttgaaa gcggtggtgg tctggttcag cctggtggta 60 gcctgcgtct gagctgtgca gcaagcggtt atgattttac ccattatggt atgaattggg 120 ttcgtcaggc accgggtaaa ggtctggaat gggttggttg gattaatacc tataccggtg 180 aaccgaccta tgcagcagat tttaaacgtc gttttacctt tagcctggat accagcaaaa 240 gcaccgcata tctgcagatg aatagcctgc gtgcagagga taccgcagtg tattattgtg 300 caaaatatcc gtattattac ggcaccagcc attggtattt cgatgtttgg ggtcagggca 360 ccctggttac cgttagcagc gcaagcacca aaggtccgag cgtttttccg ctggcaccga 420 gcagcaaaag taccagcggt ggcaccgcag cactgggttg tctggttaaa gattattttc 480 cggaaccggt taccgtgagc tggaatagcg gtgcactgac cagcggtgtt catacctttc 540 cggcagttct gcagagcagc ggtctgtata gcctgagcag cgttgttacc gttccgagca 600 gcagcctggg cacccagacc tatatttgta atgttaatca taaaccgagc aataccaaag 660 tggataaaaa agtggaaccg aaaagctgcg ataaaaccca tctgtaatag ctcgagccgc 720 g 721 <210> 2 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Polypeptide sequence of heavy chain of Ranibizumab <400> SEQUENCE 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu <210> 3 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA <400> SEQUENCE 3 gagctccatg gatattcagc tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcaa gcgttggtga 60 tcgtgttacc attacctgta gcgcaagcca ggatattagc aattatctga attggtatca 120 gcagaaaccg ggtaaagcac cgaaagtgct gatctatttt accagcagcc tgcatagcgg 180 tgttccgagc cgttttagcg gtagcggtag tggcaccgat tttaccctga ccattagcag 240 cctgcagccg gaagattttg caacctatta ttgtcagcag tatagcaccg ttccgtggac 300 ctttggtcag ggcaccaaag ttgaaattaa acgtaccgtt gcagcaccga gcgtttttat 360 ctttccgcct agtgatgaac agctgaaaag cggcaccgca agcgttgttt gtctgctgaa 420 taacttttat ccgcgtgaag caaaagttca gtggaaagtt gataatgcac tgcagagcgg 480 taatagccaa gaaagcgtta ccgaacagga tagcaaagat agcacctata gcctgagcag 540 caccctgacc ctgagcaaag cagattatga aaaacacaaa gtgtatgcct gcgaagttac 600 ccatcagggt ctgagcagtc cggttaccaa aagttttaat cgtggtgaat gctaatagaa 660 gcttggtac 669 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Polypeptide sequence of light chain of Ranibizumab <400> SEQUENCE 4 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

Claims

(a) 숙주 세포에서 항체 단편의 중쇄를 암호화하는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 항체 단편의 경쇄를 암호화하는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 모두 포함하는 듀엣 벡터를 형질전환하는 단계;
(b) 상기 숙주 세포를 고밀도 세포 발효시키는 단계;
(c) 글루코스 및 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 포함하는 혼합물의 존재하에 유도에 의해 상기 숙주 세포의 세포질에 상기 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 동일 비율로 공동-발현시켜 봉입체를 수득하는 단계;
(d) 가용화 완충제의 존재하에 재조합 항체 단편의 경쇄 및 중쇄를 동일 비율로 함유하는 봉입체를 가용화시킴으로써 항체 단편의 가용화된 경쇄 및 중쇄를 수득하는 단계;
(e) 상기 항체 단편의 가용화된 경쇄 및 중쇄를 변성제에 희석한 후 산화제의 존재하에 산화시켜 다이설파이드 결합의 산화를 촉발하여 리폴딩함으로써 생물학적 활성 형태의 재조합 인간화(rHu) 라니비주맙을 수득하는 단계; 및
(f) 상기 단계 (e)에서 수득된 rHu 라니비주맙을 5 KDa 탄젠트 유동 여과 장치를 사용한 후 20 mM 트리스(Tris) pH 9.0을 사용하여 한외 여과함으로써 정제된 리폴딩된 rHu 라니비주맙을 수득하는 단계
를 포함하는 리폴딩된 재조합 인간화 라니비주맙의 제조 방법.
제1항에 있어서,
가용화를 0.1 M Tris 완충제 pH 9.0, 2 mM 에틸렌 다이아민 테트라아세트산(EDTA), 변성제 및 환원제를 포함하는 가용화 완충제를 사용하여 수행하는, 리폴딩된 재조합 인간화 라니비주맙의 제조 방법.
제2항에 있어서,
변성제가 구아니딘 하이드로클로라이드 및 우레아로 이루어진 군으로부터 선택되는, 리폴딩된 재조합 인간화 라니비주맙의 제조 방법.
제2항에 있어서,
환원제가 다이티오트레이톨 및 β-머캅토에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는, 리폴딩된 재조합 인간화 라니비주맙의 제조 방법.
제1항에 있어서,
항체 단편의 가용화된 경쇄 및 중쇄를 10 mM 산화 글루타티온을 첨가한 후 순수한 산소를 1 SLPM(표준 L/분) 유동 속도로 시험관내 리폴딩 공정에 통과시킴으로써 산화시키는, 리폴딩된 재조합 인간화 라니비주맙의 제조 방법.
제1항에 있어서,
리폴딩을 0.1 M Tris pH 9.0, 0.6 M 아르기닌, 5% 소비톨 및 2 mM EDTA를 포함하는 리폴딩 완충제를 사용하여 수행하는, 리폴딩된 재조합 인간화 라니비주맙의 제조 방법.
rHu 라니비주맙의 경쇄 및 중쇄 유전자의 발현을 위한 듀엣(바이시스트로닉(bicistronic)) 벡터로서, 상기 듀엣 벡터가
경쇄를 암호화하는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열,
중쇄를 암호화하는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열,
다중 클로닝 부위 I(MCS I), MCS II 또는 이들 모두로부터 선택되는 클로닝 부위,
상기 경쇄 및 중쇄 각각에 대한 2개의 동일한 T7 프로모터 서열, 및
상기 MCS I 및 MCS II에 포함된, NcoI/HindIII 부위 및 NdeI/XhoI 부위로부터 선택되는 하나 이상의 제한 부위
를 포함하며,
상기 서열번호 3의 경쇄 뉴클레오티드 서열은, 제1 시스트론의 MCS I에서 T7 프로모터에 후행하는 NcoI/HindIII 부위에 5' 말단으로 삽입되고,
상기 서열번호 1의 중쇄 뉴클레오티드 서열은, 제2 시스트론의 MCS II에서 T7 프로모터에 후행하는 NdeI/XhoI 부위에 5' 말단으로 삽입되고,
상기 듀엣(바이시스트로닉) 벡터는 숙주 세포의 세포질 영역에서 등몰(equimolar) 비율의 경쇄 및 중쇄를 발현하는,
듀엣 벡터.