JP7282689B2 - リフォールディングした組み換えヒト化ラニビズマブの製造方法 - Google Patents
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Description
a)抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、
b)宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
c)グルコース及びIPTGを含む混合物の存在下での誘導により、宿主細胞の細胞質中で前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で共発現させること
を含む。
(i)組み換え抗体フラグメントの等しい割合の軽鎖及び重鎖を含む封入体を可溶化緩衝液の存在下で可溶化して、可溶化した軽鎖及び重鎖を得ること、及び
(ii)変性剤を希釈し、続いて酸化剤の存在下で酸化してジスルフィド結合の酸化を起こすことにより、可溶化した抗体フラグメントをリフォールディングして、rHuラニビズマブの生物学的活性型を得ること
を更に含む。
以下、本発明を、その様々な側面がより十分に理解され、評価され得るように、ある好ましく及び任意的な実施形態と関連付けて詳細に記載する。
d)抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、
e)宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
f)グルコース及びIPTGを含む混合物の存在下での誘導により、宿主細胞の細胞質中で前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で共発現させること
を含む。
(i)ラニビズマブの重鎖及び軽鎖をコードする配列番号1及び配列番号3を含むベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、
(ii)宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
(iii)グルコース及びIPTGを含む混合物の存在下での誘導により、宿主細胞の細胞質中で前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で共発現させること
を含む。
(i)組み換え抗体フラグメントの等しい割合の軽鎖及び重鎖を含む封入体を可溶化緩衝液の存在下で、可溶化して、可溶化した軽鎖及び重鎖を得、続いて酸化すること、及び
(ii)変性剤を希釈し、続いて酸化剤の存在下で酸化してジスルフィド結合の酸化を起こすことにより、可溶化した抗体フラグメントをリフォールディングして、rHuラニビズマブの生物学的活性型を得ること
を更に含む、リフォールディングした組み換えヒト化抗体フラグメントを調製する方法を提供する。
rHuラニビズマブの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列は、Drug Bankから取得し、コドンの最適化を行った(アクセッション番号:DB01270)。
マルチクローニングサイトI(MCS I)中の、T7プロモーターに続くNcoI/HindIII部位に5‘末端で配列番号3の軽鎖ヌクレオチド配列を挿入し、マルチクローニングサイトII(MCS II)中の、T7プロモーターに続くNdeI/XhoI部位に5’末端で配列番号1の重鎖ヌクレオチド配列を挿入することで、デュエットベクターA(図2)を構築した。
マルチクローニングサイトI(MCS I)中の、T7プロモーターに続くNcoI/HindIII部位に5’末端で配列番号3の軽鎖ヌクレオチド配列を挿入し、マルチクローニングサイトII(MCS II)中の、T7プロモーターに続くNdeI/XhoI部位に5‘末端で配列番号1の重鎖ヌクレオチド配列を挿入することで、デュエットベクターB(図3)を構築した。
軽鎖遺伝子構築物を有するデュエットベクターA及びBを、コンピテントBL21(DE3)発現系でトランスフォームした。トランスフォーメーション法は、100μlの宿主細胞の0.5μgベクターによる氷上での30分間のインキュベーションと、続く、42℃で35秒間のヒートショックを含む[22]。ヒートショック後、氷上で15分間、細胞を再びインキュベートした。次いで、800μlのカタボライト抑制された超最適ブロス(Super Optimal broth with Catabolite repression、SOC)培地を反応混合物に加え、続いて1時間45分間、450rpmでインキュベーションした。形質転換した細胞は、2000rpmで5分間遠心した。BL21(DE3)E.coli形質転換体を30μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天プレート上にプレーティングした。形質転換体を含むプレートを37℃で一晩インキュベートした。抗生物質選択マーカーに基づいて、形質転換陽性の細胞をプレートから分離し、タンパク質発現のために用いた。
選別されたBL21(DE3)細胞の形質転換体をrHuラニビズマブ発現に関して試験した。選別されたコロニーを30μg/mlのカナマイシンと共に10mlのLBブロスに播種した。600nmでの光学密度が1から1.5までの値に達するまで、細胞を増殖させた。これらの良く増殖したコロニーの2mlを100mlのTerrific HiVeg(登録商標)ブロスに移し替え、37℃で250rpmでインキュベートした。600nmで1~1.50の光学密度に達した後、E.coli培養を5mMのIPTGで誘導した。5時間の誘導後に細胞を回収し、6000rpmで20分間遠心した。上澄みを捨て、細胞ペレットを20mMのトリス、0.1mMのEDTA pH9.0溶解緩衝液中に再懸濁した。細胞を高圧ホモジナイザー中で15000バール圧で20分間溶解した。溶解した細胞を6000rpmで25分間遠心した。上澄み及びペレット中の発現したタンパク質の存在を、還元及び非還元SDS-PAGE分析を用いて確認した。図4は、デュエットベクターA及びデュエットベクターBを用いた軽鎖及び重鎖の発現を示し、そのことは、非誘導E.coli細胞におけるいかなる漏出発現もない、ほとんど等しい両鎖の発現を裏付けた。デュエットAベクターを用いて、rHuラニビズマブの軽鎖及び重鎖のより高い水準の発現が、12%還元SDS-PAGEを用いて観察された(図5)。振盪フラスコレベルのE.coli発酵は、600nmで3.78±0.05の光学密度をもたらし、0.868±0.01g/lの封入体生産の発生をもたらす9.3±0.12g/lのバイオマスを伴った。封入体中のrHuラニビズマブの軽鎖及び重鎖の量及び純度は、逆相HPLCによって測定した(図8)。
タンパク質発現を1Lバイオリアクター中で行った。選択的に形質転換したBL21(DE3)細胞をrHuラニビズマブ発現について評価した。選別したコロニーを30μg/mlのカナマイシンを含む10mlのLBブロスに播種した。細胞を600nmでの光学密度が1から1.5までに達するまで増殖させた。これらの良く増殖したコロニーの2mlを100mlのLBブイヨン中でに移し替え、37℃で250rpmでインキュベートした。100mlの種培養物を900mlのTerrific HiVeg(登録商標)中に移し替えた。ダイレクトドライブモーター、2つのラッシュトンインペラー、リングスパージャー(マクロスパージャー)を備えたバッフルアセンブリを有する2L熱ブランケットガラス管を使用することにより、1SLPMのガス流量で自動ガス混合を行いながら、BioFlo(登録商標)/GelliGen(登録商標)115ベンチトップ発酵層を用いて高密度細胞発酵を行った。自動DOカスケード撹拌、GasFlo及びO2ミックスを30%のDO設定点となるように選択した。撹拌カスケードの下限を300rpmに保ち、上限を1000rpmに保った。GasFloカスケードを1SLPMに保ち、O2ミックスを0~80%に保った。E.coli培養物を5mMのIPTGで対数中期で誘導した。5時間の誘導後、細胞を回収し、6000rpmで20分間遠心した。上澄みを捨て、細胞ペレットを20mMのトリス、0.1mMのEDTA pH9.0可溶化緩衝液中に再懸濁した。細胞を高圧ホモジナイザー中で20分間15000barの圧で可溶化した。上澄み及びペレット中の発現したrHuラニビズマブの存在は、SDS-PAGE分析を用いて測定した。高細胞密度E.coli発酵は、600nmで75.0±1.2の光学密度をもたらし、7.0±0.1g/lの封入体生産の発生をもたらす182±2.9g/lバイオマスを伴った(図7)。
可溶化手順:
まず、170mgの湿潤重量の封入体を0.1Mのトリス10 pH9.0、2mMのEDTA、及び変性剤として6Mの塩酸グアニジンを含む10mlの可溶化緩衝液中で30分間可溶化した。5mMのDTTを添加して還元を行い、還元のために25℃で1時間保った。この可溶化し還元した封入体に10mM酸化グルタチオンを添加して、酸化のために3時間25℃に保った。
この可溶性で、還元し、酸化した封入体を0.1Mのトリス pH9.0、0.6Mのアルギニン、5%のソルビトール、2mMのEDTAを含むリフォールディング緩衝液中で、10±2℃で75倍希釈した。インビトロにおけるリフォールディング方法で、1SLPM(標準リットル毎分)の流量で純酸素を通過させることで、酸化リフォールディングを行った。酸素は、システインアミノ酸中のチオール基の酸化により、ジスルフィド結合の形成と反応速度を起こした。レドックスシャッフルも使用されて、それは、タンパク質のシステインアミノ酸の混成したジスルフィド結合を形成し、続いて求核攻撃によりタンパク質分子のシステインアミノ酸間に正しいジスルフィド結合が形成されるのを可能にした。リフォールディング産物を5KDa Ultrasette(登録商標)Labタンジェント流ろ過装置を用いて限外ろ過し、続いて緩衝液を20mMのトリスpH9.0に交換した。非還元12%SDS-PAGE上48kDaで、リフォールディングしたrHuラニビズマブが観察された(図6)。リフォールディングしたrHuラニビズマブの量及び性質を逆相及びサイズ排除HPLCで測定した(図8)。
rHuラニビズマブ試料のA280での吸光度測定
UV吸光度測定を用いて、リフォールディング及びクロマトグラフィー産物中の総タンパク質を280nmで測定した。Nanodrop(登録商標)2000及びUV-1800 島津製作所 紫外可視分光光度計を用いて、採取された全ての画分を280nmで読み取った。
総タンパク質推定に使用したオルトゴナル技術は、Nanodrop(登録商標)2000を用いた595nmでのブラッドフォードアッセイであった。5μlの試料を250μlのブラッドフォード試薬に添加後、30分間撹拌機で混合を行った。混合した後、試料を染料の存在下で25分間インキュベートし、595nmでの吸光度を測定した[25]。
rHuラニビズマブの軽鎖及び重鎖の発現の同定のために、還元条件で、12%(厚さ1mm)の分離ゲルを用いて、SDS-PAGE分析を行い(図4)、リフォールディングしたrHuラニビズマブを非還元SDS-PAGEにて、濃縮ゲル定電圧120V及び分離ゲル定電圧100Vの条件で観察した(図7)。各試料をゲルに流し込む前に、開始バッファ中で10分間沸騰させた。ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動分離後に、タンパク質を検出するために、4:1:5(水:氷酢酸:メタノール)中の0.05%(w/v)クマシーブリリアントブルーG-250を用いた[26]。
例11:rHuラニビズマブの逆相HPLC分析
アジレント1260システムで4.6mm×50mm Poroshell 120 EC-C18 2.7μmカラムを用いた逆相クロマトグラフィーを用いて、rHuラニビズマブの定量及び定性分析を行った(図8)。移動相は、水中の0.1%(v/v)TFA(溶媒A)と、100%(v/v)のアセトニトリル中の0.1%(v/v)TFA(溶媒B)からなっていた。214nmの波長でAからBへの線形勾配を用いて、流量を1ml/分で維持した。図8は、イノベーター及びリフォールディングしたrHuラニビズマブのRP-HPLCクロマトグラムを示す。
リフォールディングしたrHuラニビズマブを含む試料をプレートにコーティングされたVEGF抗原と反応させた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)酵素で標識された抗ヒトIgGにより、結合したrHuラニビズマブを検出した。免疫学的反応により、固相の抗体と結合したVEGF-ラニビズマブ-抗体を標識した酵素のサンドウィッチ複合体が形成する。マイクロタイターストリップを洗浄し、結合していない反応物を除去する。次に、基質であるテトラメチルベンジジン(TMB)を反応させる。加水分解された基質の量は、マイクロタイタープレートリーダー上で450nmで読み取り、存在するrHuラニビズマブの濃度に正比例する。生物学的に活性なリフォールディングしたrHuラニビズマブをインビトロでの生物学的アッセイを用いて定量した。102μg/mlの機能的に活性なrHuラニビズマブを得た[27]。
例13:rHuラニビズマブのSE HPLC分析
様々な手順における産生物中の凝集体含量をYarra(登録商標)3μm SEC-2000(300×7.8mm ID)カラムを使用して行ったSEC-HPLC分析を用いて決定した(図9)。移動相は、pH5.50で50mMの塩化ナトリウム緩衝液と共に20mMの酢酸緩衝液から成る。分析は、イソクラティック方式で0.5ml/分の流量にて25℃で行った。フォトダイオードアレイ検出器を用いて、280nmでタンパク質検出を行った。図9は、0.5%の凝集体を含むイノベーターrHuラニビズマブに匹敵する、99.5%の精製したrHuラニビズマブの純度を示す。
リフォールディング産物中のDNAの存在量をQuant-iT(登録商標)ピコグリーンアッセイを用いて推定した。二本鎖ラムダDNAを用いて標準曲線を作成した。0.5mlの方法産生物試料を0.5mlの希釈したQuant-iT(登録商標)dsDNA BR試薬に添加し、反応混合物を5分間インキュベートした。5分後、蛍光分光光度計を用いて蛍光を測定した(励起波長480nm、発光波長520nm)。
標準及びリフォールディングした精製rHuラニビズマブをシナピン酸マトリックスと1:1の割合で混合し、MALDI-TOF分析を行った(図11)。同様に、還元し及びアルキル化した、標準及びリフォールディングしたrHuラニビズマブをシナピン酸マトリックスと1:1の割合で混合し、MALDI-TOF分析した(図12)。高純度水中の50%v/vアセトニトリル、0.1%v/vTFA中にシナピン酸マトリックス(10mg/ml)を調製した。1μlの試料及びマトリックスの均一混合物を清潔な384ウェルMALDIプレートに載せた。プレートをAB SCIEX TOF/TOF(登録商標)5800計器に挿入した。計器を陽イオンモードで使用した。337nm放射の窒素レーザーをイオン化源として維持した。4000から5000までのレーザー強度を試料の分析に使用した。データエクスプローラー(登録商標)ソフトウェア バージョン4.11を用いて結果の分析を行った。図10は、イノベーターrHuラニビズマブとの、リフォールディングしたrHuラニビズマブのインタクトな質量の比較を示す。図11は、還元しアルキル化したイノベーターrHuラニビズマブとの、精製したrHuラニビズマブの軽鎖及び重鎖の質量の比較を示す。
ペプチドマッピングをウシ血清アルブミン(BSA)、標準イノベーターrHuラニビズマブ、及びリフォールディングしたrHuラニビズマブのIn-solution消化により行った。6.0Mの塩酸グアニジンを用いて室温で1時間、タンパク質の変性を行った。変性したタンパク質の還元のために10mMのDTTを添加し、1時間室温でインキュベートした。15mMのヨードアセトアミド(IAA)を用いてアルキル化し、15分間暗条件でインキュベートし、再び5mMのDTTを加えて過剰なIAAを中和した。変性し、還元し及びアルキル化したタンパク質試料を50mMの重炭酸アンモニウム中で緩衝液交換した。タンパク質試料の消化のために、1:50(トリプシン:タンパク質)の割合で、トリプシンを用いた。消化混合物を37℃で18時間インキュベートし、続いてZiptip(登録商標)ピペットチップを用いて試料を洗浄した。洗浄した試料をSPD1010 Speedvac(登録商標)濃縮装置を用いて乾燥した。消化したタンパク質試料を質量グレード水中の3%アセトニトリル及び0.1%ギ酸中で再構成した。ペプチドフィンガープリンティングをAB SCIEX TripleTOF(登録商標)5600システムを用いて行い、データをProteinPilot(登録商標)Softwareを用いて記録し、分析した。結果は、イノベーターrHuラニビズマブと、開発されたrHuラニビズマブとの間で、85.4%の理論的な配列重複度の良好な一致を示す[29]。
・本発明に開示されるベクター構築物を用いることにより、軽鎖及び重鎖の均等な発現が得られ、mAbフラグメントの軽鎖及び重鎖の均等な発現を得るための手動プロセスが省略される。
以下に、本願発明の実施態様を付記する。
[1] a)抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖をコードする配列番号1及び配列番号3を有するヌクレオチド配列を含むベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、
b)前記宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
c)グルコース及びIPTGを含む混合物の存在下での誘導により、前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で前記宿主細胞の細胞質中に共発現させ、封入体を得ることを含む、リフォールディングした組み換えヒト化ラニビズマブを製造する方法。
[2] d)等しい割合の組み換え抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を含む前記封入体を可溶化緩衝液の存在下で可溶化し、可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を得ること、
e)変性剤を希釈し、続いて酸化剤の存在下で酸化してジスルフィド結合の酸化を起こすことにより、可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖をリフォールディングし、rHuラニビズマブの生物学的活性型を得ること、及び
f)工程(v)で得たrHuラニビズマブを、20mMのトリスpH9.0により後続される、5kDaタンジェント流ろ過装置を用いて限外ろ過すること、を更に含む、[1]に記載のリフォールディングした組み換えヒト化ラニビズマブを生産する方法。
[3] 前記可溶化は、0.1Mのトリス緩衝液pH9.0、2mMのEDTA、変性剤及び還元剤を含む可溶化緩衝液を用いて行う、[2]に記載の方法。
[4] 前記変性剤は、塩酸グアニジン又は尿素から成る群から選択される、[3]に記載の方法。
[5] 前記還元剤は、ジチオトレイトール(DTT)又はβ-メルカプトエタノールから成る群から選択される、[3]に記載の方法。
[6] 前記可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖は、インビトロでのリフォールディング方法中に、10mM酸化型グルタチオンの添加に続いて、1SLPM(標準リットル毎分)の流量で純酸素を通過させることで、酸化される、[2]に記載の方法。
[7] 前記リフォールディングは、0.1MのトリスpH9.0、0.6Mのアルギニン、5%のソルビトール、2mMのEDTAを含むリフォールディング緩衝液を用いて行われる、[2]に記載の方法。
[8] rHuラニビズマブの軽鎖及び重鎖遺伝子の発現のためのデュエット(バイシストロニック)ベクター発現系であって、前記デュエットベクターは、軽鎖をコードする配列番号3のヌクレオチド配列、重鎖をコードする配列番号1のヌクレオチド配列、プロモーター配列、及び制限部位を含む、該ベクター発現系。
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Claims (7)
- a)1つのベクターにつき、抗体フラグメントの重鎖をコードする配列番号1を有するヌクレオチド配列及び抗体フラグメントの軽鎖をコードする配列番号3を有するヌクレオチド配列を両方とも含む、ベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、
b)前記宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
c)グルコース及びIPTGを含む混合物の存在下での誘導により、前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で前記宿主細胞の細胞質中に共発現させ、封入体を得ること、
d)等しい割合の組み換え抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を含む前記封入体を可溶化緩衝液の存在下で可溶化し、可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を得ること、
e)変性剤を希釈し、続いて酸化剤の存在下で酸化してジスルフィド結合の酸化を起こすことにより、可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖をリフォールディングし、rHuラニビズマブの生物学的活性型を得ること、及び
f)上記e)で得たrHuラニビズマブを、20mMのトリスpH9.0により後続される、5kDaタンジェント流ろ過装置を用いて限外ろ過すること、
を含む、リフォールディングした組み換えヒト化ラニビズマブを生産する方法。 - 前記可溶化は、0.1Mのトリス緩衝液pH9.0、2mMのEDTA、変性剤及び還元剤を含む可溶化緩衝液を用いて行う、請求項1に記載の方法。
- 前記変性剤は、塩酸グアニジン又は尿素から成る群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記還元剤は、ジチオトレイトール(DTT)又はβ-メルカプトエタノールから成る群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖は、インビトロでのリフォールディング方法中に、10mM酸化型グルタチオンの添加に続いて、1SLPM(標準リットル毎分)の流量で純酸素を通過させることで、酸化される、請求項1に記載の方法。
- 前記リフォールディングは、0.1MのトリスpH9.0、0.6Mのアルギニン、5%のソルビトール、2mMのEDTAを含むリフォールディング緩衝液を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- rHuラニビズマブの軽鎖及び重鎖遺伝子の発現のためのデュエット(バイシストロニック)ベクター発現系であって、
第1のT7プロモーターに続くNcol/HinkIII部位に5’末端で挿入された状態で、前記第1のT7プロモーターに連結されている軽鎖をコードする配列番号3のヌクレオチド配列、及び第2のT7プロモーターに続くNdel/Xhol部位に5’末端で挿入された状態で、第2のT7プロモーターに連結されている重鎖をコードする配列番号1のヌクレオチド配列を含む、デュエットベクターと、
前記デュエットベクターのトランスフォーメーションに供するためのE.coli BL21(DE3)コンピテント細胞と、
を含む、該ベクター発現系。
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