KR102572663B1 - Fgf21 모방 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 β-클로토에 결합하는 단클론 항체 및 이의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 제약 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.

Description

FGF21 모방 항체 및 이의 용도
본 출원은 2017년 2월 8일자로 출원된 미국 가출원 제62/456,609호의 이익을 주장하며, 이는 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출되고, 전체적으로 본원에 참고로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2018년 1월 19일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 PAT057578-WO-PCT_SL.txt이며, 크기가 80,531 바이트이다.
본 발명은 섬유모세포 성장 인자 21(FGF21) 모방 항체에 관한 것이다. FGF21-관련 장애, 예컨대 비만, 제1형 및 제2형 진성 당뇨병, 췌장염, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 및 기타 대사 장애의 치료 방법, 및 중환자의 사망률 및 이환율의 감소 방법이 또한 개시된다.
섬유모세포 성장 인자(FGF) 패밀리는 22개의 유전적으로 구별되는 상동 리간드를 특징으로 하고, 이들은 7개의 하위패밀리로 나뉘어진다. 공개된 문헌에 따르면, 현재 FGF 패밀리는 적어도 23개의 구성원, FGF-1 내지 FGF-23으로 이루어진다(문헌[Reuss et al. (2003) Cell Tissue Res. 313:139-157]).
섬유모세포 성장 인자 21(FGF21)는 마우스 배아로부터 단리되었으며 FGF19 및 FGF23에 가장 가깝다. 이 FGF 하위패밀리는 고전적인 FGF에는 흔하지 않은 다양한 생리학적 과정, 즉, 에너지 및 담즙산 항상성, 글루코스 및 지질 대사, 및 포스페이트와, 비타민 D의 항상성을 조절한다. 게다가, 고전적인 FGF와는 달리, 이 하위패밀리는 내분비 방식으로 작용한다(문헌[Moore, D.D. (2007) Science 316, 1436-8]). FGF21은 간에서 우선적으로 발현되는 것으로 보고되었으며(문헌[Nishimura et al. (2000) Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206]; 국제 공개 제01/36640호; 및 국제 공개 제01/18172호), 허혈성 혈관 질환, 창상 치유, 및 폐, 기관지 또는 폐포 세포 기능의 손실과 관련된 질환 및 다수의 기타 장애를 위한 치료제로서 기술되었다.
FGF21은 강력한 대사 조절자로 확인되었다. 식이 유도성 또는 유전성 비만 및 당뇨병이 있는 설치류 및 붉은털 원숭이에게 FGF21을 전신 투여하면 강한 항-고혈당 효과 및 트리글리세리드-저하 효과와, 체중 감소를 나타낸다(문헌[Coskun,T, et al. (2008) Endocrinology 149:6018-6027]; 문헌[Kharitonenkov, A. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635]; 문헌[Kharitonenkov, A., et al. (2007) Endocrinology 148:774-781]; 문헌[Xu, J, et al. (2009) 당뇨병 58:250-259]). FGF21은 28개 아미노산 리더 서열을 포함하는 209개 아미노산 폴리펩티드이다. 인간 FGF21은 마우스 FGF21에 대하여 약 79%의 아미노산 동일성을 가지며 래트 FGF21에 대하여 약 80%의 아미노산 동일성을 갖는다.
포유류에서, FGF는 4가지 FGF 수용체 FGFR1~4(이는 다시 다수의 스플라이싱된 변이체로 발현됨)의 세트를 통하여 그의 작용을 매개한다. 각각의 FGF 수용체는 리간드 결합시에 활성화되어 MAPK(Erk1/2), RAF1, AKT1 및 STAT를 포함하는 하류 신호전달 경로로 이어지는 세포내 타이로신 키나아제 도메인을 포함한다. (문헌[Kharitonenkov, A. et al. (2008) BioDrugs 22:37-44]). 몇몇 보고서는 FGFR1~3의 "c"-리포터 스플라이스 변이체가 β-클로토에 대하여 특이적 친화성을 나타내며 FGF21의 내인성 수용체로 작용할 수 있음을 제안하였다(문헌[Kurosu et al., 2007 J. Biol. Chem. 282:26687-26695)]; 문헌[Ogawa et al., 2007 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7432-7437]; 문헌[Kharitonenkov et al., 2008 J. Cell Physiol. 215, 1-7]). 3T3-L1 세포 및 백색 지방 조직에서, FGFR1은 지금까지 가장 풍부한 수용체이며, 따라서, 이 조직에서의 FGF21의 주요 기능성 수용체는 β-클로토-FGFR1c 복합체일 가능성이 가장 크다.
FGF21은 FGF 수용체 및 하류 신호전달 분자(FRS2a 및 세포외 신호-조절 키나아제(ERK)를 포함함)를 활성화시키지만, FGFR과 FGF21의 직접적 상호작용은 탐지된 바 없다. 더욱이, 다양한 비-지방 세포는, 다수의 FGFR 이소형을 발현함에도 불구하고, FGF21에 반응하지 않는다. 모든 이러한 데이터는 보조 인자가 FGFR을 통한 FGF21 신호전달을 매개함이 틀림없음을 시사하고 있다. 연구에 의해 베타-클로토(β-클로토)가 확인된 바 있는데, 베타-클로토는 FGF21에 대한 세포 반응의 결정자로서 간, 지방 세포 및 췌장에서 고도로 발현된다(문헌[Kurosu, H. et al. (2007) J Biol Chem 282, 26687-95]). 시험관 내에서 β-클로토-FGFR 복합체가 FGF21에 결합하며, FGFR 단독은 FGF21에 결합하지 않는다(문헌[Kharitonenkov, A., et al. (2008) J Cell Physiol 215, 1-7]). FGF21은 FGFR1c, 2c, 또는 3c와의 복합체 형태로 β-클로토에 결합하며; FGFR4과의 복합체 형태로는 β-클로토에 결합하지 않는다(문헌[Owen et al., 2015 Trends in Endocrinology 26: 22-29]). 유사한 기작이 FGF23-클로토-FGFR 시스템에서 확인된 바 있다(문헌[Urakawa, I. et al. (2006) Nature 444, 770-4]).
FGF21의 생활성은 처음에 마우스 3T3-L1 지방세포 글루코스 흡수 분석에서 확인된 바 있다(문헌[Kharitonenkov, A. et al. (2005) J Clin Invest 115, 1627-35]). 그 후, FGF21은 인슐린-비의존적 글루코스 흡수 및 GLUT1 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 또한 FGF21은 다양한 설치류 당뇨병 모델에서 고혈당증을 개선하는 것으로 밝혀진 바 있다. 게다가, FGF21을 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 체중 및 지방량의 감소와, 인슐린 감수성의 향상을 비롯한 식이-유도 대사 이상에 대하여 저항성인 것으로 밝혀졌다(문헌[Badman, M.K. et al. (2007) Cell Metab 5, 426-37]). 당뇨병 비-인간 영장류(NHP)에게 FGF21을 투여하면 공복 혈장 글루코스, 트리글리세리드, 인슐린 및 글루카곤 수준의 저하가 야기되었으며, HDL 콜레스테롤이 거의 80% 증가하는 것을 비롯하여 리포단백질 프로파일의 유의한 개선이 초래되었다(문헌[Kharitonenkov, A. et al. (2007) Endocrinology 148, 774-81]). 중요하게는, 저혈당은 이러한 NHP 연구 중에 어떠한 시점에서도 관찰되지 않았다. 다른 연구에서 FGF21이 공복 상태에의 적응의 제어를 돕는 중요한 내분비 호르몬으로 확인되었다. 이것은 에너지 항상성의 생물학적 특성을 조절하는 데 있어서 간이 신체의 나머지와 통신하는 PPARα의 하류의, 이전에는 빠져 있었던 고리를 제공한다. FGF21이 지방(지방 분해), 간(지방산 산화 및 케톤체 생성) 및 뇌(무감각)를 조절한다는 조합된 관찰은 이것을 공복에 대한 반응의 주요 내분비 조절자로서 확립하는 것이다(문헌[Kharitonenkov, A. & Shanafelt, A.B. (2008) BioDrugs 22, 37-44]).
FGF21을 직접적으로 바이오치료제로서 사용하는 것의 문제는 이의 반감기가 매우 짧다는 것이다. 마우스에서, 인간 FGF21의 반감기는 0.5 내지 1시간이며, 시노몰구스 원숭이에서 반감기는 2 내지 3시간이다. 더욱이, 야생형 FGF21이 제약 제형 또는 제제에 사용될 때, 이의 안정성은 방부제, 예를 들어 m-크레졸에 의해 부정적인 영향을 받는다.
본 발명은FGF21 모방 항체, 즉, 베타-클로토(β-클로토)에 결합하여 인간 섬유모세포 성장 인자 21(이하, 때때로 "FGF21"로 지칭됨) 수용체 복합체 및 FGF21-매개 신호전달(예를 들어, FGF21-수용체-의존성 신호전달)을 활성화시키는 단클론 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 제약 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.
특정한 양태에서, 본 발명의 (FGF21 모방, β-클로토-결합 항체의) 항원 결합 단편은 FGF21-유사 활성 및 선택성을 갖지만 치료적으로 바람직한 특성, 예컨대 단백질 안정성, 낮은 면역원성, 생성의 용이함 및 바람직한 생체 내 반감기가 더해진 분자일 수 있다.
본 발명의 단클론FGF21 모방 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 제약 조성물은 FGF21-관련 장애, 예컨대 비만, 제2형 진성 당뇨병, 제1형 진성 당뇨병, 췌장염, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성 동맥 경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 관상동맥성 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병 합병증, 신경병증, 위마비 및 기타 대사 장애의 치료와, 중환자의 사망률 및 이환율의 감소에 유용하다.
특정 양태에서, 본원에 개시된 단리된 FGF21 모방 항체, 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어 BIACORE™ 결합 분석법으로 결정할 경우, 500 pM 또는 400 pM 이하의 평형 해리 상수(KD)로 β-클로토에 결합하며, 또한 예를 들어 세포외 신호-조절 키나아제(ERK) 인산화(pERK 또는 포스포-ERK) 세포 분석법으로 측정할 경우, 50 nM 이하의 EC50으로 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시킬 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 단리된 FGF21 모방 항체, 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어 BIACORE™ 결합 분석법으로 결정할 경우, 300 pM 또는 400 pM 이하의 평형 해리 상수(KD)로 β-클로토에 결합하며, 또한 예를 들어 pERK 세포 분석법으로 측정할 경우, 50 nM 이하의 EC50으로 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시킬 수 있다.
특정 양태에서, 본원에 개시된 단리된 FGF21 모방 항체, 또는 항원 결합 단편은 100 pM 또는 50 pM 이하의 평형 해리 상수(KD)로 β-클로토에 결합한다. 예를 들어, 본원에 개시된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 100 pM 이하, 50 pM 이하, 45 pM 이하, 40 pM 이하, 35 pM 이하, 25 pM 이하, 또는 15 pM 이하의 KD로 인간 β-클로토에 결합할 수 있다. 더 구체적으로, 본원에 개시된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 BIACORE™ 결합 분석법 또는 용액 평형 적정 분석법(SET)으로 측정할 경우, 10 pM 이하의 KD로 인간 β-클로토에 결합할 수 있으며; 또한 예를 들어 pERK 세포 분석법으로 측정할 경우, 50 nM 이하의 EC50으로 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시킬 수 있다.
본 발명은 인간 및 시노몰구스 원숭이 β-클로토에 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 또한 본 발명은 β-클로토에 결합하여 FGF21 수용체 복합체 및 FGF21-매개 신호전달(예를 들어, FGF21-수용체-의존성 신호전달)을 활성화시키는 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 FGFR2c_β-클로토, FGFR3c_β-클로토, 또는 FGFR4_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시키지 않는다.
또한 본 발명은 β-클로토에 결합하고, 또한 결합에 대하여 표 1에 기술된 바와 같은 항체, 예를 들어 항체 NOV005 또는 NOV006과 경쟁하는 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 또한 본 발명은 추가로, 표 1에 기술된 바와 같은 항체, 예를 들어 항체 NOV005 또는 NOV006과 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
여기에 기술된 바와 같이, 항체들 및/또는 이의 항원 결합 단편들 사이의 "경쟁"은 (예를 들어 경쟁적 결합 분석법에 의해, 당업자에게 잘 알려진 임의의 방법에 의해 결졍할 경우) 둘 다의 항체(또는 이의 결합 단편)가 동일 β-클로토 에피토프에 결합함을 나타낸다. 또한, 소정 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명의 β-클로토 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)과 "경쟁한다"(상기 경쟁 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편과 동일한 β-클로토 에피토프, 또는 중첩 β-클로토 에피토프에 결합할 경우). 본원에서 사용되는 바와 같이, 경쟁 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편이 그의 표적에 결합하는 것을 입체적으로 차단하는 것(예를 들어, 상기 경쟁 항체가 인근의 비-중첩 β-클로토 및/또는 β-클로토 에피토프에 결합하여 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편이 그의 표적에 결합하는 것을 물리적으로 방지하는 경우); 및/또는 (ii) 상이한 비-중첩 β-클로토 에피토프에 결합하여 β-클로토 단백질에 대하여 배좌 변화를 유도하여서 상기 단백질에 본 발명의 β-클로토 항체 또는 항원 결합 단편이 상기 배좌 변화 없이 일어나는 방식으로 결합하는 것이 더 이상 가능하지 않도록 하는 것을 또한 포함할 수 있다.
본원에 개시된 단리된 항체 및 항원 결합 단편의 결합 친화도는 용액 평형 적정(SET)에 의해 결정될 수 있다. SET를 위한 방법들은 본 기술 분야에 공지되어 있으며 하기에 더 상세하게 기술되어 있다. 대안적으로, 본원에 개시된 단리된 항체 또는 단편의 결합 친화도는 Biacore 분석법에 의해 결정될 수 있다. Biacore 동태 검사(kinetic assay)에 대한 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 하기에 더 상세하게 기술되어 있다.
단리된 FGF21 모방 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 FGF21 수용체 복합체의 활성화, 및 이에 의한 FGF21 신호전달 경로의 활성화를 증가시키는 데 이용될 수 있다. 특정 양태에서, 단리된 FGF21 모방 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 FGF21 수용체 복합체의 활성화, 및 이에 의한 FGF21 신호전달 경로의 활성화를 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 증가시키는 데 이용될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 단리된 FGF21 모방 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 단클론 항체, 인간 또는 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, Fab 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편, 또는 scFv 단편, 및/또는 IgG 이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2, 또는 IgG4)일 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 단리된 FGF21 모방 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 아미노산이 각각의 인간 VH 또는 VL 생식세포 계열 서열로부터의 항체 프레임워크로 치환된 프레임워크를 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 표 1에 기술된 Fab, 예를 들어 항체 NOV005 또는 NOV006의 전체 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 더 구체적으로, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab NOV005 또는 NOV006의 중쇄 및 경쇄 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 표 1에 기술된 Fab, 예를 들어 NOV005 또는 NOV006의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 더 구체적으로, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab NOV005 또는 NOV006의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
또한 본 발명은 본원에 개시된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)을 포함하는 조성물(예를 들어, 제약 조성물)과, 제약상 허용가능한 담체와 조합된 항체 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 표 1의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 항체 NOV005 또는 NOV006을 포함하는 제약 조성물을 추가로 포함한다. 또한 본 발명은 2가지 이상의 표 1의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 조합물, 예를 들어 항체 NOV005 또는 NOV006을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 특정 양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 16, 36, 또는 38의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 본 발명의 추가 양태에서, 본원에 제공된 핵산 분자는 서열 번호 16, 36, 또는 38의 핵산 서열을 포함한다.
또한 본 발명은 서열 번호 26 또는 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 특정 양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 27, 54, 33, 또는 40의 핵산 서열에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 본 발명의 추가 양태에서, 본원에 제공된 핵산 분자는 서열 번호 27, 54, 33, 또는 40의 핵산 서열을 포함한다.
또한 본 발명은 본원에 개시된 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 특정한 양태에서, 제1 벡터는 본원에 제공된 항체, 예컨대 NOV005 또는 NOV006의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄를 코딩하며, 제2 벡터는 본원에 제공된 항체, 예컨대 NOV005 또는 NOV006의 경쇄 가변 영역 또는 중쇄를 코딩한다. 제1 벡터 및 제2 벡터는 이러한 중쇄 및 이러한 경쇄를 포함하는 항체를 형성하도록 공동발현을 위한 숙주 세포 내로 형질도입된다.
또한 본 발명은 상기에 기술된 항체의 중쇄를 코딩하는 재조합 DNA 서열, 및 상기에 기술된 항체의 경쇄를 코딩하는 제2 재조합 DNA 서열을 포함하는 단리된 숙주 세포에 관한 것이며, 여기서, 상기 DNA 서열들은 프로모터에 작동가능하게 연결되고 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 항체는 인간 단클론 항체일 수 있음이 고려된다. 숙주 세포는 비-인간 포유류 세포, 예를 들어 CHO 세포 또는 HEK293 세포임이 또한 고려된다.
또한 본 발명은 섬유모세포 성장 인자 21(FGF21) 수용체를 활성화시키고 이에 의해 FGF21-매개 신호전달(예를 들어, FGF21-수용체-의존성 신호전달)을 활성화시키는 것에 관한 것이며, 여기서, 본 방법은 세포를 본원에 개시된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함한다.
하나의 특정 양태에서, 세포는 인간 세포임이 고려된다. 세포는 대상체 내에 있음이 추가로 고려된다. 일 실시 형태에서, 세포는 지방세포임이 고려된다. 다른 실시 형태에서, 세포는 간세포, 췌장 세포, 내피 세포, 근육, 또는 신장 세포 중 하나 이상일 수 있다. 특정한 양태에서, 대상체는 인간임이 또한 추가로 고려된다.
또한 본 발명은 대상체에서 FGF21-관련 장애를 치료하거나, 관리하거나, 개선하거나, 예방하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 본 방법은 대상체에게 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, FGF21-관련 장애는 비만이다. 일 양태에서, FGF21-관련 장애는 제2형 당뇨병이다. 대상체는 인간임이 고려된다.
임의의 전술한 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
본 발명의 비제한적 실시 형태는 하기 양태로 기술된다:
1. Β-클로토의 에피토프에 결합하며, 다음을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
서열 번호 6, 9, 10 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1);
서열 번호 7, 11 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(HCDR2);
서열 번호 8 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(HCDR3);
서열 번호 19, 31, 22, 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LCDR1);
서열 번호 20 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(LCDR2); 및
서열 번호 21 또는 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(LCDR3).
2. 다음을 포함하는, 양태 1에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
서열 번호 6, 9, 10 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1);
서열 번호 7, 11 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(HCDR2);
서열 번호 8 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(HCDR3);
서열 번호 31, 22, 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LCDR1);
서열 번호 20 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(LCDR2); 및
서열 번호 21 또는 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(LCDR3).
3. 다음을 포함하는, 양태 1에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
서열 번호 6, 9, 10 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1);
서열 번호 7, 11 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(HCDR2);
서열 번호 8 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(HCDR3);
서열 번호 19, 31, 22, 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LCDR1);
서열 번호 20 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(LCDR2); 및
서열 번호 21 또는 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(LCDR3).
4. 다음을 포함하는, 양태 1에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(i) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3;
(ii) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3;
(iii) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3; 또는
(iv) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
5. 다음을 포함하는, 양태 1에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(i) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3;
(ii) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3;
(iii) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3; 또는
(iv) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
6. 다음을 포함하는, 양태 1에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편: 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 19 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
7. 다음을 포함하는, 양태 1에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편: 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 19 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
8. 다음을 포함하는, 양태 1에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편: 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
9. 다음을 포함하는, 양태 1에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편: 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
10. β-클로토 및 FGFR1c의 활성을 증가시키는, 양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
11. BIACORE™ 결합 분석법으로 측정할 경우 450 pM 이하의 KD로 인간 β-클로토 단백질에 결합하는, 양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
12. 상기 에피토프는 (i) β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986 중 1개 이상의 아미노산; 또는 (ii) β-클로토 서열(서열 번호 52)의 하기 잔기 스트레치 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986 각각으로부터의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진, 양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
13. 상기 에피토프는 (i) β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 646~670, 696~700, 및 646~689의 아미노산 중 1개 이상; 또는 (ii) β-클로토 서열(서열 번호 52)의 하기 잔기 스트레치 646~670, 696~700, 및 646~689 각각으로부터의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진, 양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
14. pERK 세포 분석법으로 측정할 경우 50 nM 이하의 EC50으로 시노몰구스 원숭이 FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체를 활성화시킬 수 있는, 양태 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
15. 인간 β-클로토(서열 번호 52)의 잔기 701(Tyr) 또는 703(Arg)과 접촉하지 않는, 양태 1 내지 14 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
16. 서열 번호 15의 아미노산 서열 또는 이와의 동일성이 적어도 90% 또는 95%인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열 번호 26 또는 32의 아미노산 서열 또는 이와의 동일성이 적어도 90% 또는 95%인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 양태 1 내지 15 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
17. 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는, 양태 1 내지 16 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
18. 서열 번호 26 또는 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 양태 1 내지 17 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
19. (i) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 (ii) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 양태 17의 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
20. (i) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 (ii) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 양태 1 내지 19 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
21. 양태 1 내지 20 중 어느 하나에 따른 단리된 항체 또는 단편과 동일한 에피토프에 결합하며, (i) 표 2에 개시된 항체 NOV004의 조합 또는 카바트(Kabat) CDR; 및/또는 (ii) 서열 번호 43 또는 55의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 47 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
22. Β-클로토에의 결합에 대하여 양태 1 내지 20 중 어느 하나에 따른 단리된 항체 또는 단편과 경쟁하며, (i) 표 2에 개시된 항체 NOV004의 조합 또는 카바트 CDR; 및/또는 (ii) 서열 번호 43 또는 55의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 47 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
23. (i) 표 2에 개시된 항체 NOV004의 조합 또는 카바트 CDR; 및/또는 (ii) 서열 번호 43 또는 55의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 47 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는, 양태 1 내지 20 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
24. 상기 양태 중 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
25. 대사 장애를 치료하는 방법으로서, 대사 장애를 앓고 있는 대상체에게 양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
26. 대상체는 비만, 제1형 및 제2형 진성 당뇨병, 췌장염, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 고트리글리세리드혈증, 및 대사 증후군 중 하나 이상을 앓고 있는, 양태 25의 방법.
27. 대상체는 비만, 당뇨병, 및 이상지질혈증 중 하나 이상을 앓고 있는, 양태 25의 방법.
28. 심혈관 장애를 치료하는 방법으로서, 심혈관 장애를 앓고 있는 대상체에게 상기 전 양태 중 어느 하나에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
29. 대상체는 아테롬성 동맥 경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 및 관상동맥성 심장 질환 중 하나 이상을 앓고 있는, 양태 28의 방법.
30. 약제로서 사용하기 위한, 양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
31. 체중을 감소시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
32. 식욕 또는 식품 섭취를 감소시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
33. 대상체에서 혈장중 트리글리세리드(TG) 농도 또는 혈장중 전체 콜레스테롤(TC) 농도를 감소시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
34. 대상체는 대사 장애를 앓고 있는, 양태 31, 32, 또는 33의 방법.
35. 대상체는 하기 중 하나 이상을 앓고 있는, 양태 34의 방법: 비만, 제1형 및 제2형 진성 당뇨병, 췌장염, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 및 대사 증후군.
36. 상기 전 양태 중 어느 하나에 따른 항체들 중 하나 이상을 코딩하거나, 상기 항체 중 어느 하나의 VL 및/또는 VH를 코딩하는 핵산.
37. 표 1에 개시된 서열에 대하여 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산.
38. 표 1에 개시된 서열에 대하여 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산.
39. 표 1에 개시된 서열을 포함하는 핵산.
40. 양태 36, 37, 38, 또는 39에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
41. 양태 40의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
42. 대사 장애의 치료에 사용하기 위한, 양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 제약 조성물.
43. Β-클로토에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 항체 또는 이의 단편의 발현에 적합한 조건 하에 양태 41의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
44. 대사 장애는 비만, 당뇨병, 고트리글리세리드혈증, 또는 이상지질혈증인, 양태 42의 제약 조성물.
45. 심혈관 장애의 치료에 사용하기 위한, 양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 제약 조성물.
46. 대상체에서의 체중의 감소 방법, 식욕 또는 식품 섭취의 감소 방법, 혈장중 트리글리세리드(TG) 농도 또는 혈장중 전체 콜레스테롤(TC) 농도의 감소 방법에 사용하기 위한, 양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 제약 조성물.
47. 대상체에서의 대사 장애의 치료, 심혈관 장애의 치료, 체중의 감소, 식욕 또는 식품 섭취의 감소, 혈장중 TG 농도 또는 혈장중 TC 농도의 감소를 위한 약제의 제조에 있어서의 양태 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
도 1: NOV004, NOV005, 및 NOV006에 의한 인간(도 1a) 및 시노몰구스 원숭이(도 1b) FGFR1c_β-클로토_HEK293 세포의 pERK 활성화. pERK 활성화 데이터는 (i) NOV004가 각각 약 3 nM 및 20 nM의 EC50으로 인간 및 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시켰으며; (ii) NOV005가 각각 약 3 nM 및 16 nM의 EC50으로 인간 및 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시켰으며; (iii) NOV006은 각각 약 4 nM 및 18 nM의 EC50으로 인간 및 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시켰음을 나타낸다.
도 2: 인간 FGFR2c_β-클로토(도 2a), FGFR3c_β-클로토(도 2b), 및 FGFR4_β-클로토(도 2c) HEK293 세포의 pERK 활성화에 대한 NOV004, NOV005, 및 NOV006의 프로파일링. FGF21은 FGFR2c_β-클로토 또는 FGFR3c_β-클로토의 활성화에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. FGF19는 FGFR4_β-클로토의 활성화에 대한 양성 대조군으로 사용되었다.
도 3: α-클로토, Egr1-루시퍼라아제 및 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제로 형질감염된 HEK293 세포를 이용한 FGF23 활성에 대한 NOV004, NOV005, 및 NOV006의 프로파일링. FGF23이 양성 대조군으로 사용되었다.
도 4: 인간 β-클로토에 대한, NOV004에 대한 NOV005 및 NOV006의 경쟁적 결합 활성. Forte Bio® Biosensor 시스템이 인간 β-클로토에 대한 경쟁적 결합 활성의 결정에 사용되었다. 단계 1에서, 재조합 인간 β-클로토가 센서에 로딩되고, 이어서 단계 2에서 포화될 때까지 NOV004가 로딩되었다. 그 후 NOV005 또는 NOV006이 로딩되고, NOV004에 대한 경쟁적 결합 활성이 탐지되었다. 제2 결합 신호의 부재는 항체들이 인간 β-클로토에의 결합에 대하여 경쟁함을 나타낸다. 비관련 항체가 음성 대조군으로 사용되고, NOV004가 자가-경쟁에 대한 양성 대조군으로 사용되었다.
도 5: 래트에서의 정맥내 주사 후의 NOV004, NOV005, 및 NOV006의 농도-시간 프로파일. 동물은 NOV004(도 5a), NOV005(도 5b), 또는 NOV006(도 5c)의 정맥내 투여 후 1시간에 대략 200 μg/mL의 평균 Cmax를 나타냈으며, 이때 3가지 항체는 모두 비슷한 PK 프로파일을 보여주었다.
도 6a: 2회의 피하 1 mg/kg 용량의 NOV005(n = 5마리의 동물) 또는 비히클(n = 3마리의 동물)이 1주일 간격으로(투약일은 화살표로 나타냄) 수컷 정상혈당성 비만 시노몰구스 원숭이에게 투여되었다. 일반 사료에 대한 먹이 소비 데이터는 군의 평균 ± SEM을 이용하여 기준선의 퍼센트로서 정규화되었다. 원숭이는 연구 내내 과일, 야채 및 땅콩을 간식으로 소비하였다.
도 6b: 2회의 피하 1 mg/kg 용량의 NOV005(n = 5마리의 동물) 또는 비히클(n = 3마리의 동물)이 1주일 간격으로(투약일은 화살표로 나타냄) 수컷 정상혈당성 비만 시노몰구스 원숭이에게 투여되었다. NOV005 및 비히클 처리 동물의 기준선 체중은 각각 11.3 + 1.2 및 11.4 + 1.3 kg이었다. 체중 데이터는 (A) 군의 평균 ± SEM 및 (B) 나타낸 개별 동물 데이터를 이용하여 기준선의 퍼센트로서 정규화되었다.
본 발명은 부분적으로, 특이적으로 β-클로토에 결합하여 FGF 수용체, 예를 들어, FGFR1c의 활성화, 및 FGF21-매개 신호전달(예를 들어, FGF21-수용체-의존성 신호전달)의 활성화를 초래하는 항체 분자의 발견을 기반으로 한다. 본 발명은 전체 IgG 포맷 항체와, 이의 항원 결합 단편, 예컨대 Fab 단편(예를 들어, 항체 NOV005 또는 NOV006) 둘 다에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 β-클로토(예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 특이적으로 결합하는 항체, 제약 조성물, 이러한 항체 및 조성물의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다.
용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 관련된 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "FGF21"이라는 용어는 섬유모세포 성장 인자(FGF) 단백질 패밀리의 구성원을 지칭한다. FGF21의 예시적인 아미노산 서열(젠뱅크(GenBank) 등록 번호 NP_061986.1)은 서열 번호 1로 개시되며, 이의 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2로 개시된다(NCBI 기준 서열 번호 NM_019113.2).
본원에서 사용되는 바와 같이, "FGF21 수용체"라는 용어는 FGF21의 수용체를 지칭한다(문헌[Kharitonenkov,A, et al. (2008) Journal of Cellular Physiology 215:1-7]; 문헌[Kurosu,H, et al. (2007) JBC 282:26687-26695]; 문헌[Ogawa, Y, et al. (2007) PNAS 104:7432-7437]).
"FGF21 폴리펩티드"라는 용어는 인간에서 발현되는 자연 발생 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명의 목적상, "FGF21 폴리펩티드"라는 용어는 임의의 전장 FGF21 폴리펩티드, 예를 들어, 서열 번호 1(이는 209개 아미노산 잔기로 이루어지고 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨); 임의의 성숙 형태의 폴리펩티드(이는 181개 아미노산 잔기로 이루어지고, 전장 FGF21 폴리펩티드의 아미노 말단의 28개 아미노산 잔기(즉, 신호 펩티드를 구성하는 잔기)가 제거됨), 및 이들의 변이체를 지칭하도록 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체"라는 용어는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원 결합 부분) 또는 단쇄를 의미한다. 전체 항체는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H chain) 및 2개의 경쇄(L chain)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 더 보존된 영역들이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역들로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 첫 번째 구성요소(Clq)를 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 항체의 "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 단편"이라는 용어는 주어진 항원(예를 들어, β-클로토)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 온전한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 온전한 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 단편이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; 힌지(hinge) 영역에서 디술피드 가교체에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인 또는 VL 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체(dAb) 단편(문헌[Ward et al., 1989 Nature 341:544-546]); 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
더욱이, Fv 단편의 두 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 상기 두 도메인은, VL 및 VH 영역이 1가 분자(단쇄 Fv(scFv)로 알려져 있음; 예를 들어, 문헌[Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; 및 문헌[Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)를 형성하도록 쌍을 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있게 하는 합성 펩티드 링커에 의해, 재조합적 방법을 이용하여, 연결될 수 있다. 이러한 단쇄 항체는 항체의 하나 이상의 항원 결합 부분 또는 단편을 포함한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 종래의 기술을 사용하여 수득되고, 이러한 단편은 온전한 항체에서와 동일한 방식으로 그 유용성에 대해 스크리닝된다.
항원 결합 단편은 또한, 단일 도메인 항체, 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), v-NAR 및 비스-scFv 내로 혼입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136] 참조). 항체의 항원 결합 부분은 폴리펩티드, 예컨대 피브로넥틴 III형(Fn3)을 기반으로 한 스캐폴드 내로 그래프트될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기술한 미국 특허 제6,703,199호 참조).
항원 결합 단편은, 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fv 절편(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 단쇄 분자 내로 포함될 수 있다(문헌[Zapata et al.(1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062]; 및 미국 특허 제5,641,870호).
본원에서 사용되는 바와 같이, "친화도"라는 용어는 단일 항원성 부위에서의 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원성 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 많은 부위들에서 약한 비-공유 힘을 통해 항원과 상호작용하며; 상호작용이 많을수록, 친화도는 더 강하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, Fab 단편)에 대하여 "고 친화도"라는 용어는 일반적으로 10-9 M 이하의 Kd를 갖는 항체, 또는 항원 결합 단편을 지칭한다.
"아미노산"이라는 용어는 자연 발생 및 합성 아미노산과, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산으로는 유전 암호에 의해 코딩되는 것들뿐만 아니라 추후에 변형된 아미노산, 예를 들어, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이 있다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합된 α-탄소를 갖는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 특이성"이라는 용어는 단지 1개의 항원성 결정 부위(antigenic determinant)와 반응하는 개별 항체 조합 부위의 능력을 지칭한다.
항체(예를 들어 β-클로토-결합 항체)에 "특이적으로(또는 선택적으로) 결합한다"라는 어구는, 단백질 및 다른 생물제제의 불균질한 집단 내에서 동족 항원(예를 들어 인간 β-클로토 또는 시노몰구스 β-클로토)의 존재의 결정 요인인 결합 반응을 지칭한다. "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"라는 어구는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 상호교환가능하게 사용된다.
"FGF21 매개된"이라는 용어 또는 유사 용어는 FGF21 수용체 및/또는 본 발명의 항체가 β-클로토에의 결합시에 세포 반응 및 FGF21 신호전달 경로를 매개하고, 이에 의해 혈장중 트리글리세리드, 혈장중 인슐린, 혈장중 글루코스, 식품 섭취, 및 체중 중 하나 이상의 감소를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 다양한 생리학적 효과를 트리거링한다는 사실을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "FGF21-관련 장애", "FGF21-관련 병태", "FGF21과 관련된 질환 또는 병태" 또는 이와 유사한 용어는 (예를 들어, FGF21 수용체 신호전달의 활성화에 의한) FGF21 신호전달 경로의 활성화에 의한 예방, 진단, 및/또는 치료가 추구되는 많은 병태 또는 질환을 지칭한다. 이것은 비정상적 FGF21 신호전달(예를 들어, FGF21-매개 신호전달 및/또는 FGF21 수용체 신호전달의 비정상적 활성화)을 특징으로 하는 병태, 질환, 또는 장애를 포함할 수 있다. 이러한 병태는 대사 장애, 내분비 장애 및 심혈관 장애, 예컨대 비만, 제1형 및 제2형 진성 당뇨병, 췌장염, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비알코올성 지방간염(NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 급성 심근 경색, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성 동맥 경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 관상동맥성 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병 합병증, 신경병증, 위마비, 인슐린 수용체, 및 기타 대사 장애에 있어서의, 그리고 중환자의 사망률 및 이환율의 감소에 있어서의 심각한 불활성화 돌연변이와 연관된 장애를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
"제2형 진성 당뇨병"은 인슐린의 이용가능성에도 불구하고 글루코스가 과도하게 생성되는 것을 특징으로 하는 병태이며, 혈중 글루코스 수준은 부적당한 글루코스 제거의 결과로 여전히 과도하게 높은 채로 있다.
"제1형 진성 당뇨병"은 인슐린의 전적인 결여에 의해 야기되는 높은 혈당 수준을 특징으로 하는 병태이다. 이것은 신체의 면역계가 췌장 내의 인슐린-생산 베타 세포를 공격하여 파괴할 때 일어난다. 그 후 췌장은 인슐린을 거의 생산하지 않거나 전혀 생산하지 않는다.
"췌장염"은 췌장의 염증이다.
"이상지질혈증"은 리포단백질의 과다생산 또는 결핍을 포함하는 리포단백질 대사의 장애이다. 이상지질혈증은 혈중 총 콜레스테롤, 저밀도 리포단백질(LDL) 콜레스테롤 및 트리글리세리드 농도의 상승, 및 고밀도 리포단백질(HDL) 콜레스테롤 농도의 감소로 표출될 수 있다.
"비알코올성 지방간염(NASH)"은 알코올 소비와 연관되지 않으며, 간세포의 지방 변화를 특징으로 하고, 소엽내 염증 및 섬유증을 동반하는 간질환이다.
"포도당 불내성", 또는 내당능 장애(IGT)는 심혈관 병상의 위험 증가와 연관된 당뇨전 상태의 이상혈당증이다. 당뇨전 병태는 대상체에서 글루코스가 세포 내로 효율적으로 이동하여 이것이 효율적인 연료원으로 이용되는 것을 막아서, 혈당 수준의 상승 및 약간의 정도의 인슐린 저항성이 초래된다.
"고혈당증"은 과도한 혈당(혈중 글루코스)으로 정의된다.
낮은 혈당으로도 칭해지는 "저혈당"은, 혈당 수준이 너무 낮게 저하되어서 신체 활동에 충분한 에너지를 제공할 수 없을 때 일어난다.
"고인슐린혈증"은 정상 수준보다 높은 수준의 혈중 인슐린으로 정의된다.
"인슐린 저항성"은 정상적인 양의 인슐린이 정상보다 낮은 생물학적 반응을 생성하는 상태로 정의된다.
인간 대상체의 면에서 "비만"은 주어진 집단에 있어서 이상적인 체중보다 20% 넘게 초과하는 체중으로 정의될 수 있다(문헌[R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, p. 904-916]). 또한 비만은 30 이상의 체질량 지수(BMI, 사람의 체중(kg)을 키의 제곱(m2)으로 나눈 것(kg/m2)으로 정의됨)로 정의될 수 있다.
"대사 증후군"은 하기 징후 중 적어도 3가지의 클러스터로 정의될 수 있다: 복부 지방--대부분의 남성에 있어서, 40인치 이상의 허리; 고혈당--공복 후 적어도 110 밀리그램/데시리터(mg/dl); 고 트리글리세리드--혈류 중 적어도 150 mg/dL; 저 HDL--40 mg/dl 미만; 및 130/85 mmHg 이상의 혈압.
"고혈압" 또는 높은 혈압은 심혈관 손상 또는 다른 부정적인 결과를 유도할 가능성이 있는 수준까지의 전신 동맥 혈압의 일시적 또는 지속적 상승이다. 고혈압은 140 mmHg 초과의 수축기 혈압 또는 90 mmHg 초과의 이완기 혈압으로 임의로 정의된 바 있다.
"심혈관 질환"은 심장 또는 혈관과 관련된 질환이다.
"말초 동맥 질환"은 혈액을 두부, 장기 및 사지로 나르는 동맥에서 플라크가 증가할 때 일어난다. 시간이 지남에 따라, 플라크는 동맥을 경화시키고 협착시킬 수 있는데, 이는 산소-풍부 혈액이 장기 및 신체의 다른 부분으로 유동하는 것을 제한한다.
"아테롬성 동맥 경화증"은 큰 크기 및 중간 크기의 동맥의 내막에 지질 침착물이 불규칙적으로 분포하여서, 동맥 내강의 협착 및 궁극적인 섬유증 및 석회화로의 진행을 야기하는 것을 특징으로 하는 혈관 질환이다. 병변은 보통 국소 병변이며, 느리게 간헐적으로 진행한다. 혈액 유동의 제한은 대부분의 임상 증상을 설명하는데, 상기 임상 증상은 병변의 분포 및 중증도에 따라 달라진다.
"뇌졸중"은 24시간 넘게 지속되는, 뇌혈액 순환 장애와 관련된 임의의 급성 임상 사건이다. 뇌졸중은 비가역적 뇌손상을 수반하며, 증상의 유형 및 중증도는 순환이 손상된 뇌조직의 위치 및 정도에 따라 달라진다.
울혈성 심부전으로도 칭해지는 "심부전"은 심장이 더 이상 충분한 혈액을 나머지 신체로 펌핑할 수 없는 병태이다.
관상 동맥 질환으로도 칭해지는 "관상동맥성 심장 질환"은 혈액 및 산소를 심장으로 공급하는 소혈관의 협착이다.
"신장 질환" 또는 신장병증은 신장의 임의의 질환이다. 당뇨병성 신장병증은 제1형 또는 제2형 진성 당뇨병에 걸린 사람에 있어서 이환 및 사망의 주요 원인이다.
"당뇨병 합병증"은 높은 혈당 수준에 의해 야기되는 신장, 신경(신경병증), 족부(족부의 궤양 및 불량한 순환) 및 눈(예를 들어 망막병증)과 같은 기타 신체 기능에서의 문제이다. 당뇨병은 또한 심장 질환 및 골 및 관절 장애의 위험을 증가시킨다. 당뇨병의 다른 장기간 합병증은 피부 문제, 소화기 문제, 성기능 장애 및 치아 및 치은에서의 문제를 포함한다.
"신경병증"은 뇌신경 또는 말초 또는 자율 신경계에 관련되는 임의의 질환이다.
"위마비"는 위 연동운동 쇠약이며, 이는 장 배출을 지연시킨다.
본 발명에 포함되는 중환자는 일반적으로 불안정한 대사항진 상태를 경험한다. 이러한 불안정한 대사 상태는 기질 대사의 변화로 인한 것인데, 이는 일부 영양소의 상대적인 결핍을 초래할 수 있다. 일반적으로, 지방 및 근육 둘 다의 산화의 증가가 있다.
게다가, 중환자는 바람직하게는, 전신 염증 반응 증후군 또는 호흡 곤란을 경험하는 환자이다. 이환율의 감소는 중환자에서 추가의 병, 병태, 또는 증상이 발병될 가능성의 감소 또는 추가의 병, 병태, 또는 증상의 중증도의 감소를 의미한다. 예를 들어, 이환율의 감소는 다발성 장기 부전과 연관된 합병증 또는 패혈증 또는 균혈증의 발생률의 감소에 상응할 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체"라는 용어는 아미노산 서열 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전 암호의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, GCA, GCC, GCG 및 GCU 코돈 모두 알라닌 아미노산을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 이 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 바꾸지 않으면서 기술된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이"이고, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한, 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 설명한다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG는 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이가 각각의 기술된 서열에 내포된다.
폴리펩티드 서열에 대해, "보존적으로 변형된 변이체"는, 소정 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환하는, 폴리펩티드 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환에 대한 표는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 더하여 존재하고 이를 배제하지 않는다. 다음의 8개 군이 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins (1984)] 참조). 일부 실시 형태에서, 용어 "보존적 서열 변형"은 이 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의미하게 영향을 미치거나 또는 이를 유의미하게 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 데 사용된다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 통상, 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹핑(grouping), 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄로 이루어지고, 통상, 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가진다. 입체구조적 및 비입체구조적 에피토프는, 변성 용매의 존재 하에 비입체구조적 에피토프가 아니라 입체구조적 에피토프에의 결합이 상실된다는 점에서 구별된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "인간 항체"라는 용어는 프레임워크 영역 및 CDR 영역 둘 다가 인간 기원의 서열들로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하고자 한다. 더욱이, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역도 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 생식세포 계열 서열, 또는 돌연변이된 버전의 인간 생식세포 계열 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내에서의 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체 내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다.
"인간 단클론 항체"라는 용어는 프레임워크 영역 및 CDR 영역 둘 다가 인간 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 일 실시 형태에서, 인간 단클론 항체는, 불멸화된 세포에 융합된 인간 중쇄 이식유전자 및 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉(transgenic) 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
"인간화" 항체는 인간에 있어서 덜 면역원성이면서 비-인간 항체의 반응성을 보유하는 항체이다. 이는 예를 들어, 비-인간 CDR 영역을 보유하고, 항체의 나머지 부분들을 이들의 인간 대응물들(즉, 불변 영역과, 가변 영역의 프레임워크 부분)로 대체함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984]; 문헌[Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988]; 문헌[Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988]; 문헌[Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991]; 및 문헌[Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994]을 참조한다. 인간 조작 기술의 다른 예는 미국 특허 제5,766,886호에 개시된 Xoma 기술을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서, 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 다음의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 시각적 조사에 의해 측정할 경우, 비교창 또는 표기된 영역에 걸친 최대 상응성에 대하여 비교 및 정렬한 경우, 2개의 서열에 소정의 백분율(즉, 소정의 영역에 걸쳐, 또는 특정되지 않은 경우 전체 서열에 걸쳐, 60% 동일성, 선택적으로는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성)의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 있으면 2개의 서열은 "실질적으로 동일"하다. 선택적으로, 동일성은 적어도 약 50개 뉴클레오티드(또는 10개 아미노산)의 길이의 영역에 걸쳐, 또는 더욱 바람직하게는 100개 내지 500개 또는 1000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드(또는 20개, 50개, 200개 또는 그 이상의 아미노산)의 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 테스트 서열과 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 테스트 및 기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우에 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 그런 다음, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대한 테스트 서열의 서열 동일성(%)을 계산한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비교창"은 20 내지 600, 통상적으로 약 50 내지 약 200, 보다 통상적으로 약 100 내지 약 150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 연접 위치의 수 중 임의의 하나의 수의 절편에 대한 언급을 포함하며, 여기서 서열 및 기준 서열이 최적으로 정렬된 후, 서열이 동일한 수의 연접 위치들의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 문헌[Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현에 의해(Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group; 미국 위스콘신주 매디슨, 575 사이언스 드라이브 소재) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 시각적 조사에 의해(예를 들어 문헌[Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)] 참조) 수행될 수 있다.
서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 두 가지 예로는 각각 문헌[Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977]; 및 문헌[Altschul et al., J. Mol.Biol. 215:403-410, 1990]에 기술된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학 정보 센터를 통해 공개적으로 입수 가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드(word)와 정렬될 때 약간의 양의 값의 역치 점수 T와 매칭(matching)되거나 이를 충족시키는, 쿼리 서열 내의 길이 W의 짧은 워드들을 확인함으로써 고득점 서열 쌍(HSP)을 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 워드 점수 역치로 지칭된다(Altschul et al., 위 참조). 이러한 초기 이웃 워드 히트(hit)는 이를 함유하는 더 긴 HSP를 찾는 검색 개시를 위한 시드(seed)로서 작용한다. 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 워드 히트는 각 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라미터 M(한 쌍의 매치되는 잔기에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(미스매치된 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 < 0)을 사용하여 누적 점수가 계산된다. 아미노산 서열에 대해서는, 스코어링 매트릭스가 누적 점수를 계산하는 데 사용된다. 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락하거나; 하나 이상의 음의 채점 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하가 되거나; 또는 어느 한 서열의 끝에 도달했을 때, 각 방향으로의 워드 히트의 확장이 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X가 정렬의 감수성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 워드길이(W), 10의 기댓값(E), M=5, N=-4, 및 양 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 워드길이, 및 10의 기댓값(E)을 사용하고, BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌[Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989] 참조)는 50의 정렬(B), 10의 기댓값(E), M=5, N=-4, 및 양 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한, 2개의 서열들 사이에서 유사성의 통계학적 분석을 수행한다(예를 들어 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 알고리즘이 제공하는 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 기준 핵산에 대한 테스트 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 아미노산 서열 사이의 동일성(%)은 또한, PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내에 포함된 문헌[E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열들 사이의 동일성(%)은 문헌[Needleman and Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있는데, 이는 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용가능함) 내의 GAP 프로그램 내에 포함된 것이었다.
상기 주지된 서열 동일성 퍼센트 외에, 2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드들이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가, 하기 기술된 바와 같이 제2 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 예를 들어, 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에, 폴리펩티드는 전형적으로 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 아래에 기술된 바와 같이, 2개의 분자 또는 이들의 상보체가 엄격한 조건 하에 서로 혼성화한다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 동일한 프라이머가 서열 증폭에 사용될 수 있다는 것이다.
"단리된 항체"라는 용어는, 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체(예를 들어 β-클로토에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 β-클로토 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음)를 지칭한다. 그러나 β-클로토에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 게다가, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
"아이소타입"이라는 용어는 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 클래스(예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다. 아이소타입은 또한, 이들 클래스 중 하나의 변형된 버전을 포함하며, 여기서, 변형은 Fc 기능을 변경하도록, 예를 들어 Fc 수용체에 대한 이펙터 기능 또는 결합을 증강시키거나 감소시키도록 이루어졌다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도를 지칭하고자 하며, 반면 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하고자 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하고자 하며, 이러한 해리 상수는 Ka에 대한 Kd의 비(즉, Kd/Ka)로부터 수득되고 몰 농도(M)로서 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 본 기술 분야에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD의 결정 방법은 바이오센서 시스템, 예컨대 Biacore® 시스템을 사용하여 표면 플라스몬 공명을 측정하는 것, 또는 용액 평형 적정(SET)에 의해 용액 중 친화도를 측정하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
용어 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환가능하게 사용되고, 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 중합체를 지칭한다. 이러한 용어는 합성, 자연 발생적, 및 비-자연 발생적이고, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 기준 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는, 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포괄한다. 이러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 제한 없이 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한, 명시적으로 지시된 서열뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보성 서열을 암시적으로 포괄한다. 구체적으로, 아래에서 상술되는 바와 같이, 축퇴성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991]; 문헌[Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985]; 및 문헌[Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994]).
용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어 DNA) 절편들 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 전형적으로, 이 용어는 전사된 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열이 적절한 숙주 세포 또는 기타 발현 시스템에서의 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조절할 경우, 프로모터 또는 인핸서 서열은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사되는 서열에 물리적으로 연접해 있다(즉, 시스(cis)-작용성이다). 그러나 일부 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는 자신이 전사를 증강시키는 코딩 서열에 물리적으로 연접해 있거나 이에 근접하여 위치할 필요가 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "최적화된"이라는 용어는, 뉴클레오티드 서열이, 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어 피치아(Pichia) 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경되었음을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 "모" 서열로도 공지되어 있는 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 본래 코딩된 아미노산 서열을 완전히 또는 가능한 한 많이 유지하도록 조작된다. 본원에서 최적화된 서열은 포유류 세포에서 바람직한 코돈을 갖도록 조작되었다. 그러나, 다른 진핵 세포 또는 원핵 세포에서의 이들 서열의 최적화된 발현도 본원에서 구상된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열도 최적화된 것으로 지칭된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 이 용어는 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 폴리펩티드 서열은 또한, 이의 보존적으로 변형된 변이체를 암시적으로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합적 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 트랜스제닉이거나 염색체도입된(transchromosomal) 동물(예컨대 마우스)로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합, 조합적 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 면역글로불린 유전자, 서열의 모두 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는, 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식세포 계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진다. 그러나, 특정 실시 형태에서 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 유발(또는, 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용될 때, 생체 내 체세포 돌연변이 유발)을 받을 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식세포 계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체 내 인간 항체 생식세포 계열 레퍼토리 내에 천연적으로는 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손까지 지칭하고자 하는 것으로 이해되어야 한다. 다음 세대에서 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 소정의 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "숙주 세포"의 범주 내에는 여전히 포함된다.
용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물(예를 들어, 포유류 및 비-포유류), 예컨대 비-인간 영장류(예를 들어 시노몰구스 원숭이), 양, 개, 소, 닭, 양서류, 및 파충류를 포함한다. 언급된 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "시노" 또는 "시노몰구스"는 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 질환 또는 장애(예를 들어, FGF21 관련 장애)를 "치료하는" 또는 이의 "치료"라는 용어는 일 실시 형태에서 질환 또는 장애를 개선시키는 것(즉, 질환 또는 이의 임상 증상들 중 적어도 하나의 발생을 늦추거나 저지하거나 감소시키는 것)을 지칭한다. 또 다른 실시 형태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 환자가 식별하지 못할 수도 있는 것을 비롯하여 적어도 하나의 신체 파라미터를 완화시키거나 개선시키는 것을 지칭한다. 또 다른 실시 형태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 물리적으로(예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화), 생리적으로(예를 들어, 물리적 파라미터의 안정화) 또는 이들 둘 다로 질환 또는 장애를 조절하는 것을 지칭한다. 또 다른 실시 형태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애의 발병 또는 발생 또는 진행을 예방 또는 지연시키는 것을 지칭한다.
본원에 기술된 징후(예를 들어, FGF21 관련 장애를 포함함)와 관련된 바와 같은 "예방"은, 하기에 기술된 바와 같이, 예를 들어 FGF21 관련 질환 파라미터의 악화를, 상기 악화 위험이 있는 환자에 있어서 예방하거나 늦추는 임의의 행동을 의미한다.
용어 "벡터"는, 폴리뉴클레오티드 분자로서, 이것이 연결된 또 다른 폴리뉴클레오티드를 수송할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하고자 한다. 하나의 유형의 벡터로는 "플라스미드"가 있으며, 이는 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터로는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV, 또는 AAV2)가 있으며, 여기서, 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 소정의 벡터는, 이들 벡터(예컨대 박테리아 복제 원점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜(episomal) 포유류 벡터)가 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다. 다른 벡터(예컨대 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내에 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 게다가, 소정의 벡터는, 이들 벡터가 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")로 지칭된다.
일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용성이 있는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는, 플라스미드가 가장 보편적으로 사용되는 형태의 벡터이므로, 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능의 역할을 하는 이러한 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터(예컨대 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하고자 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "FGF21 활성의 조절"은 예를 들어 에이전트와 FGF21 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상호작용의 결과일 수 있는 FGF21 활성의 증가 또는 감소, FGF21 신호전달 경로의 활성화 및/또는 FGF21-매개 신호전달(예를 들어, FGF21-수용체-의존성 신호전달)의 활성화 등을 지칭한다. 예를 들어, 생물학적 활성의 조절은 생물학적 활성의 증가 또는 감소를 지칭한다. FGF21 활성은 제한 없이, 대상체에서 혈중 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드, 또는 콜레스테롤 수준을 분석하는 것을 포함하는 수단에 의해; 베타-클로토 및/또는 FGF 수용체(예를 들어, FGFR-1c)의 폴리펩티드 수준의 평가에 의해; 또는 FGF21-매개 신호전달(예를 들어, FGF21-수용체-의존성 신호전달)의 활성화의 평가에 의해 평가될 수 있다.
또한 FGF21 활성의 비교는 예를 들어 FGF21 하류 바이오마커의 수준의 측정, 및 FGF21 신호전달의 증가의 측정에 의해 성취될 수 있다. 활성은 또한 다음의 측정에 의해 평가될 수 있다: 세포 신호전달; 키나아제 활성; 지방세포 내로의 글루코스의 흡수; 혈중 인슐린, 트리글리세리드, 또는 콜레스테롤 수준의 변동; 간 지질 또는 간 트리글리세리드 수준 변화; FGF21 및/또는 베타-클로토와 FGF21 수용체 사이의 상호작용; 또는 FGF21 수용체의 인산화. 일부 실시 형태에서, FGF21 수용체의 인산화는 티로신 인산화일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGF21 활성의 조절은 FGF21-관련 표현형의 조절을 야기할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "FGF21 하류 바이오마커"는 유전자 또는 유전자 생성물, 또는 측정가능한 유전자 또는 유전자 생성물 지표이다. 일부 실시 형태에서, FGF21의 하류 마커인 유전자 또는 활성은 변경된 발현 수준을 나타내거나, 혈관 조직에서 나타난다. 일부 실시 형태에서, 하류 마커의 활성은 FGF21 조절제의 존재 하에서 변경된다. 일부 실시 형태에서, 하류 마커는 FGF21이 본 발명의 FGF21 조절제에 의해 동요될 때 변경된 발현 수준을 나타낸다. FGF21 하류 마커는, 제한 없이, 글루코스 또는 2-데옥시-글루코스 흡수, pERK 및 기타 인산화 또는 아세틸화 단백질 또는 NAD의 수준을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상향조절하다"라는 용어는 활성 또는 양의 증가, 활성화 또는 촉진을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서, FGF21 조절제는 FGF21 수용체 및/또는 베타-클로토의 활성을 증가시킬 수 있다. 일 실시 형태에서, FGFR-1c는 FGF21 조절제에 반응하여 상향조절될 수 있다. 상향조절은 또한 FGF21-관련 활성, 예를 들어 혈중 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드, 또는 콜레스테롤 수준을 낮추거나; 간 지질 또는 트리글리세리드 수준을 감소시키거나; 체중을 감소시키거나; 내당능, 에너지 소비, 또는 인슐린 감수성을 개선시키거나; FGF21 수용체의 인산화를 야기하거나; FGF21 하류 마커를 증가시키는 능력을 지칭할 수 있다. FGF21 수용체는 β-클로토 및 FGFR-1c일 수 있다. 상향조절은 대조군과 비교하여 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 250%, 적어도 400%, 또는 적어도 500%일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "조절제"라는 용어는 FGF21-관련 장애, 예컨대 제1형 또는 제2형 진성 당뇨병 또는 대사성 병태, 예컨대 비만과 연관된 하나 이상의 생리학적 또는 생화학적 사건을 조절하는 조성물을 지칭한다. 상기 사건은 혈중 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드, 또는 콜레스테롤 수준을 낮추고; 간 지질 또는 간 트리글리세리드 수준을 감소시키고; 체중을 감소시키고; 내당능, 에너지 소비, 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
FGF21 단백질
본 발명은, 본원에 정의된 바와 같이, FGF21-매개 신호전달(예를 들어, FGF21-수용체-매개 신호전달)을 유도할 수 있는 FGF21 모방 항체(예를 들어, 베타-클로토(β-클로토)에 결합하는 단클론 항체)를 제공한다. 생체 내에서, 성숙 형태의 FGF21은 활성 형태의 분자이다. 예시적인 인간 FGF21 야생형 서열은 NCBI 기준 서열 번호 NP_061986.1을 가지며, 예를 들어 하기에 개시된 바와 같이(서열 번호 1) 예를 들어 미국 특허 제6,716,626 B1호와 같은 허여된 특허에서 발견될 수 있다.
전장 FGF21 폴리펩티드(NCBI 기준 서열 번호 NM_019113.2)를 코딩하는 상응하는 mRNA 서열이 하기에 예시되어 있다(서열 번호 2):
성숙 FGF21 서열은 리더 서열이 결여되어 있으며, 폴리펩티드의 다른 변형, 예컨대 아미노 말단(리더 서열을 갖거나 갖지 않음) 및/또는 카르복실 말단의 단백질 분해적 프로세싱, 더 큰 전구체로부터의 더 작은 폴리펩티드의 절단, N-결합 및/또는 O-결합 글리코실화, 및 당업자에 의해 이해되는 기타 번역 후 변형을 또한 포함할 수 있다. 성숙 FGF21 서열의 대표적인 예는 하기 서열을 갖는다(서열 번호 53, 이는 전장 FGF21 단백질 서열(NCBI 기준 서열 번호 NP_061986.1)의 아미노산 위치 29~209를 나타냄):
성숙 FGF21 폴리펩티드(서열 번호 53)를 코딩하는 상응하는 cDNA 서열이 하기에 예시되어 있다(서열 번호 63):
FGF21 모방 항체 및 항원 결합 단편
본 발명은 β-클로토(예를 들어, 인간 β-클로토)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 인간 및 시노몰구스 원숭이 β-클로토에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 실시예에 설명된 바와 같이 단리된 인간 단클론 항체 및 Fab를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
β-클로토 야생형 서열은 NCBI 기준 서열 번호 NP_783864.1을 가지며, 문헌[Xu, et al. (2007) J Biol Chem. 282(40):29069-72] 및 문헌[Lin, et al. (2007) J Biol Chem. 282(37):27277-84]과 같은 문헌에서 발견될 수 있다. 인간 β-클로토를 코딩하는 전장 cDNA는 젠뱅크(GenBank) 등록 번호 NM_175737을 갖는다. 이 단백질 서열은 다음과 같다(서열 번호 52).
본 발명은 β-클로토 단백질(예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 특이적으로 결합하고, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성의 증가 또는 활성화가 가능한 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서, 항체는 표 1에 기술되어 있으며, 예를 들어, NOV005 또는 NOV006이다. 특정한 양태에서, β-클로토 단백질(예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 특이적으로 결합하고, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성의 증가 또는 활성화가 가능한 본원에 제공된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 표 2에 기술된 항체, 예를 들어 NOV001, NOV002, NOV003, 또는 NOV004가 아니다. 표 2에 기술된 항체는 2016년 8월 2일자로 출원된 국제 특허 출원 제PCT/IB2016/054660호에 개시되었는데, 상기 국제 특허 출원은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
본 발명은 β-클로토 단백질(예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 여기서, 항체는 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함한다. 또한 본 발명은 β-클로토 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 여기서, 항체는 아래에서 표 1에 열거된 VH CDR들 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 β-클로토 단백질(예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 여기서, 항체는 아래에서 표 1에 열거된 임의의 VH CDR의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 VH CDR을 포함한다(또는 대안적으로, 이로 이루어진다).
본 발명은 β-클로토 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열 번호 26 또는 32의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 또한 본 발명은 β-클로토 단백질(예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 아래에서 표 1에 열거된 VL CDR들 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 β-클로토 단백질(예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 아래에서 표 1에 열거된 임의의 VL CDR의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 VL CDR을 포함한다(또는 대안적으로, 이로 이루어진다).
본 발명의 다른 항체는 돌연변이되었지만 표 1에 기술된 서열에 나타난 CDR 영역과의 동일성 퍼센트가 CDR 영역에서 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95%인 아미노산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이는 표 1에 기술된 서열들에서 도시된 CDR 영역들과 비교할 때, CDR 영역들에 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된, 돌연변이 아미노산 서열들을 포함한다.
또한 본 발명은 β-클로토 단백질(예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 특이적으로 결합하는 항체의 VH, VL, 전장 중쇄, 및 전장 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 핵산 서열은 포유류 세포에서의 발현에 최적화될 수 있다(예컨대 표 1은 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 최적화된 핵산 서열을 보여줌).
[표 1]
[표 2]
본 발명의 다른 항체는 아미노산 또는 아미노산을 코딩하는 핵산이 돌연변이되었지만, 표 1에 기술된 서열에 대하여 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95%의 동일성을 갖는 항체를 포함한다. 일부 실시 형태는 표 1에 기술된 서열들에서 도시된 가변 영역들과 비교할 때, 가변 영역들에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된 한편 실질적으로 동일한 항원 결합 활성을 보유하는 돌연변이 아미노산 서열들을 포함한다.
본 발명의 다른 항체는 아미노산 또는 아미노산을 코딩하는 핵산이 돌연변이되었지만, 표 1에 기술된 서열에 대하여 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95%의 동일성을 갖는 항체를 포함한다. 일부 실시 형태는 표 1에 기술된 서열들에서 도시된 가변 영역들과 비교할 때, 가변 영역들에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된 한편 실질적으로 동일한 항원 결합 활성을 보유하는 돌연변이 아미노산 서열들을 포함한다.
이들 항체가 각각 β-클로토에 결합할 수 있기 때문에, VH, VL, 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열(아미노산 서열, 및 이러한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)은 "혼합 및 매칭되어", 본 발명의 다른 β-클로토-결합 항체를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭된" β-클로토 결합 항체는 본 기술 분야에 공지된 결합 분석법(예컨대 ELISA, 및 실시예 섹션에 기술된 다른 분석법)을 사용하여 테스트될 수 있다. 이들 사슬이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 26 또는 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 영역을 제공하며, 여기서, 항체는 β-클로토(예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 특이적으로 결합한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 포유류 세포에서의 발현에 최적화된, 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄, 및 포유류 세포에서의 발현에 최적화된, 서열 번호 28 또는 34의 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄를 갖는 단리된 항체; 또는 (ii) 이의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질을 제공한다. 더 구체적으로, 특정 양태에서, 본 발명은 각각 서열 번호 17 및 28; 또는 17 및 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 제공한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 단편은 서열 번호 15의 아미노산 서열 또는 이와의 동일성이 적어도 90% 또는 95%인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열 번호 26 또는 32의 아미노산 서열 또는 이와의 동일성이 적어도 90% 또는 95%인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 단편은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 단편은 서열 번호 26 또는 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 단편은 (i) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 (ii) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체는 (i) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 (ii) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 2에 개시된 바와 같은 항체 NOV004의 조합 또는 카바트 CDR을 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화성을 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR(HCDR1, HCDR2, HCDR3)이 있고, 각각의 경쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 있다.
주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 다수의 잘 알려진 체계 중 임의의 것을 사용하여 쉽게 결정될 수 있으며, 이는 문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]("카바트" 넘버링 체계), 문헌[Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948]("초티아" 넘버링 체계), 및 ImMunoGenTics(IMGT) 넘버링(문헌[Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)]; 문헌[Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)])("IMGT" 넘버링 체계)에 기술된 것들을 포함한다. 예를 들어, 고전적인 형식의 경우, 카바트 하에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 내의 CDR 아미노산 잔기는 31~35(HCDR1), 50~65(HCDR2), 및 95~102(HCDR3)로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인(VL) 내의 CDR 아미노산 잔기는 24~34(LCDR1), 50~56(LCDR2), 및 89~97(LCDR3)로 넘버링된다. 초티아 하에서, VH 내의 CDR 아미노산은 26~32(HCDR1), 52~56(HCDR2), 및 95~102(HCDR3)로 넘버링되고; VL 내의 아미노산 잔기는 26~32(LCDR1), 50~52(LCDR2), 및 91~96(LCDR3)으로 넘버링된다. 카바트 및 초티아 둘 다의 CDR 정의를 조합함으로써, CDR은 인간 VH 내의 아미노산 잔기 26~35(HCDR1), 50~65(HCDR2), 및 95~102(HCDR3) 및 인간 VL 내의 아미노산 잔기 24~34(LCDR1), 50~56(LCDR2), 및 89~97(LCDR3)로 이루어진다. IMGT 하에서 VH 내의 CDR 아미노산 잔기는 대략 26~35(CDR1), 51~57(CDR2) 및 93~102(CDR3)로 넘버링되고, VL 내의 CDR 아미노산 잔기는 대략 27~32(CDR1), 50~52(CDR2), 및 89~97(CDR3)("카바트"에 따른 넘버링)로 넘버링된다. IMGT 하에서, 항체의 CDR 영역은 프로그램 IMGT/DomainGap Align을 사용하여 결정될 수 있다. 카바트 및 초티아 둘 다의 CDR 정의를 조합함으로써, "조합" CDR은 인간 VH 내의 아미노산 잔기 26~35(HCDR1), 50~65(HCDR2), 및 99~108(HCDR3) 및 인간 VL 내의 아미노산 잔기 24~39(LCDR1), 55~61(LCDR2), 및 94~102(LCDR3)로 이루어질 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표 1에 기술된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합을 포함하는 β-클로토 결합 항체를 제공한다. 특정한 양태에서, 이러한 CDR은 카바트 시스템을 이용하여 묘사된다. 또 다른 특정한 양태에서, 이러한 CDR은 조합 시스템을 이용하여 묘사된다.
이들 항체가 각각 β-클로토에 결합할 수 있고, 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공됨을 고려하면, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있다(즉, 상이한 항체들로부터의 CDR들은, 본 발명의 다른 β-클로토 결합 분자를 생성하기 위해 각각의 항체가 바람직하게는 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유하더라도, 혼합 및 매칭될 수 있음). 이러한 "혼합 및 매칭된" β-클로토 결합 항체는 본 기술 분야에 공지된 결합 분석법 및 실시예에 기술된 분석법(예컨대 ELISA, SET, Biacore® 결합 분석법)을 사용하여 테스트될 수 있다. VH CDR 서열들이 혼합 및 매치될 때, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열들이 혼합 및 매치될 때, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 신규 VH 및 VL 서열이, 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 발명의 단클론 항체에 대해 본원에 예시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 생성될 수 있다는 것은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다. 전술한 것에 더하여, 일 실시 형태에서, 본원에 개시된 항체의 항원 결합 단편은 VH CDR1, 2, 및 3, 또는 VL CDR 1, 2, 및 3을 포함할 수 있으며, 여기서, 본 단편은 단일 가변 도메인으로서 β-클로토에 결합한다.
본 발명의 특정 실시 형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 기술된 Fab의 중쇄 및 경쇄 서열을 가질 수 있다. 더 구체적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab NOV005 또는 NOV006의 중쇄 및 경쇄 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 특정 실시 형태에서, β-클로토에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어 표 1에 개시된 바와 같이, Fab NOV005 또는 NOV006의 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3과, Fab NOV005 또는 NOV006의 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, β-클로토에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 카바트에 의해 정의되고 표 1에 기술된 바와 같이 중쇄 가변 영역 CDR1, 중쇄 가변 영역 CDR2, 중쇄 가변 영역 CDR3, 경쇄 가변 영역 CDR1, 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시 형태에서, β-클로토에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 초티아에 의해 정의되고 표 1에 기술된 바와 같이 중쇄 가변 영역 CDR1, 중쇄 가변 영역 CDR2, 중쇄 가변 영역 CDR3, 경쇄 가변 영역 CDR1, 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시 형태에서, β-클로토에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 카바트와 초티아의 조합에 의해 정의되고 표 1에 기술된 바와 같이 중쇄 가변 영역 CDR1, 중쇄 가변 영역 CDR2, 중쇄 가변 영역 CDR3, 경쇄 가변 영역 CDR1, 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시 형태에서, β-클로토에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 IMGT에 의해 정의되고 표 1에 기술된 바와 같이 중쇄 가변 영역 CDR1, 중쇄 가변 영역 CDR2, 중쇄 가변 영역 CDR3, 경쇄 가변 영역 CDR1, 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 표 1에 기술된 바와 같은 β-클로토에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 예를 들어, 항체 NOV005 또는 NOV006을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, β-클로토에 결합하고 FGF21 수용체 복합체를 활성화시키는 항체, 또는 항원 결합 단편은 Fab NOV005 또는 NOV006이다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(i) 서열 번호 6, 9, 10 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1);
(ii) 서열 번호 7, 11 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(HCDR2);
(iii) 서열 번호 8, 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(HCDR3);
(iv) 서열 번호 19, 31, 22, 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LCDR1);
(v) 서열 번호 20 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(LCDR2); 및
(vi) 서열 번호 21 또는 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(LCDR3).
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(i) 서열 번호 6, 9, 10 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1);
(ii) 서열 번호 7, 11 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(HCDR2);
(iii) 서열 번호 8, 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(HCDR3);
(iv) 서열 번호 31, 22, 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LCDR1);
(v) 서열 번호 20 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(LCDR2); 및
(vi) 서열 번호 21 또는 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(LCDR3).
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(i) 서열 번호 6, 9, 10 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1);
(ii) 서열 번호 7, 11 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(HCDR2);
(iii) 서열 번호 8, 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(HCDR3);
(iv) 서열 번호 19, 31, 22, 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LCDR1);
(v) 서열 번호 20 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(LCDR2); 및
(vi) 서열 번호 21 또는 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(LCDR3).
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 VH와, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고, HCDR1은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하며, HCDR2는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR3은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 VH와, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고, HCDR1은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하며, HCDR2는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR3은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 VH와, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고, HCDR1은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하며, HCDR2는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR3은 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 VH와, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고, HCDR1은 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하며, HCDR2는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR3은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 VH와, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
(i) HCDR1은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하며, HCDR2는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR3은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(ii) HCDR1은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하며, HCDR2는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR3은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 VH와, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고, HCDR1은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하며, HCDR2는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR3은 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 VH와, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고, HCDR1은 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하며, HCDR2는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, LCDR3은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDR들인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 VH와, CDR들인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 19 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하며 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDR들인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 VH와, CDR들인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 19 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 단편은 β-클로토 및/또는 FGFR1c의 활성을 증가시킨다. 특정한 양태에서, 상기 항체 또는 이의 단편은, 예를 들어 포스포-ERK 활성에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 및/또는 FGFR1c의 활성을 적어도 약 10% 또는 20% 증가시킨다. 특정한 양태에서, 상기 항체 또는 이의 단편은, 예를 들어 포스포-ERK 활성에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 및/또는 FGFR1c의 활성을 적어도 약 30% 또는 40% 증가시킨다. 특정한 양태에서, 상기 항체 또는 이의 단편은, 예를 들어 포스포-ERK 활성에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 및/또는 FGFR1c의 활성을 적어도 약 50% 또는 60% 증가시킨다. 특정한 양태에서, 상기 항체 또는 이의 단편은, 예를 들어 포스포-ERK 활성에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 및/또는 FGFR1c의 활성을 적어도 약 70% 또는 80% 증가시킨다. 특정한 양태에서, 상기 항체 또는 이의 단편은, 예를 들어 포스포-ERK 활성에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 및/또는 FGFR1c의 활성을 적어도 약 90% 또는 95% 증가시킨다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어 BIACORE™ 결합 분석법에 의해 결정되는 바와 같이, 500 pM 또는 450 pM 이하의 KD로 인간 β-클로토 단백질에 결합한다. 특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어 BIACORE™ 결합 분석법에 의해 결정되는 바와 같이, 450 pM 또는 400 pM 이하의 KD로 인간 β-클로토 단백질에 결합한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어 BIACORE™ 결합 분석법에 의해 결정되는 바와 같이, 10 pM 또는 20 pM 이하의 KD로 인간 β-클로토 단백질에 결합한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 β-클로토의 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986의 하나 이상의 아미노산을 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 646~670, 696~700, 및 646~689의 아미노산들 중 하나 이상을 포함한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 수소-중수소 교환(HDx)에 의해 결정되는 바와 같이, 인간 β-클로토(서열 번호 52)의 잔기 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986의 하나 이상의 아미노산을 보호한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 646~670, 696~700, 및 646~689의 아미노산들 중 하나 이상을 보호한다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 단편은 인간 β-클로토(서열 번호 52)의 잔기 701(Tyr) 또는 703(Arg)과 접촉하지 않는다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, pERK 세포 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 50 nM 이하의 EC50으로 인간 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시킬 수 있다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, pERK 세포 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 100 nM 이하의 EC50으로 인간 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시킬 수 있다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, pERK 세포 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 40 nM 또는 30 nM 이하의 EC50으로 인간 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시킬 수 있다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, pERK 세포 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 50 nM 이하의 EC50으로 인간 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시킬 수 있고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 FGFR2c-β-클로토 수용체 복합체, FGFR3c-β-클로토 수용체 복합체, 및/또는 FGFR4-β-클로토 수용체 복합체를 활성화시킬 수 없다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pERK 세포 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 50 nM 이하의 EC50으로 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시킬 수 있다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pERK 세포 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 40 nM 또는 30 nM 이하의 EC50으로 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시킬 수 있다.
특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하여 FGF21 수용체 복합체, 예를 들어, FGFR1c-β-클로토 수용체 복합체의 활성을 유도하는 단리된 항체(예를 들어, 단클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pERK 세포 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 20 nM 이하의 EC50으로 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 인간 항체는, 항체의 가변 영역 또는 전장 사슬이 인간 생식세포 계열 면역글로불린 유전자를 이용하는 시스템으로부터 수득되는 경우, 특정 생식세포 계열 서열"의 생성물"이거나 "이로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 면역글로불린 유전자를 지닌 트랜스제닉 마우스를 관심 항원을 이용하여 면역화시키는 것, 또는 파지(phage) 상에 디스플레이되는 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원을 이용하여 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 생식세포 계열 면역글로불린 서열"의 생성물"이거나 "이로부터 유래된" 인간 항체는, 이러한 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식세포 계열 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 서열 면에서 인간 항체의 서열에 가장 가까운(즉, 가장 큰 동일성 %) 인간 생식세포 계열 면역글로불린 서열을 선발함으로써 그와 같이 식별될 수 있다.
특정 인간 생식세포 계열 면역글로불린 서열"의 생성물"이거나 "이로부터 유래된" 인간 항체는, 예를 들어 천연 발생 체세포 돌연변이, 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적 도입으로 인해, 생식세포 계열 서열과 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, VH 또는 VL 프레임워크 영역에서, 선발된 인간 항체는 전형적으로 아미노산 서열 면에서, 인간 생식세포 계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 생식세포 계열 면역글로불린 아미노산 서열(예컨대 쥣과 생식세포 계열 서열)과 비교하여 인간 항체를 인간인 것으로 식별하는 아미노산 잔기를 함유한다. 소정의 경우, 인간 항체는 아미노산 서열 면에서, 인간 생식세포 계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 적어도 95% 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
전형적으로, 재조합 인간 항체는 VH 또는 VL 프레임워크 영역에서 인간 생식세포 계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 소정의 경우, 인간 항체는 생식세포 계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다. 인간 생식세포 계열 면역글로불린 유전자의 예는 하기에 기술된 가변 도메인의 생식세포 계열 단편과, DP47 및 DPK9를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
상동성 항체
또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 표 1에 기술된 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 이 항체는 β-클로토 단백질(예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 결합하고, 표 1에 기술된 항체의 원하는 기능적 특성(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성 및/또는 FGF21의 하나 이상의 활성을 활성화하거나 증가시킴)을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체), 또는 이의 기능성 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서, 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 15의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 26 또는 32의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며; 항체는 β-클로토(예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 특이적으로 결합하여 β-클로토의 활성을 유도하고, 중쇄 가변 도메인은 표 2에 개시된 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 43 또는 55의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 경쇄 가변 영역은 표 2에 개시된 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 47 또는 57의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 특정 양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열은 예를 들어 표 1에 개시된 바와 같이, 카바트에 의해 정의된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 특정 양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열은 각각, 예를 들어 표 1에 개시된 바와 같이, 초티아에 의해 정의된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 특정 양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열은 각각, 예를 들어 표 1에 개시된 바와 같이, 조합에 의해 정의된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 특정 양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열은 각각, 예를 들어 표 1에 개시된 바와 같이, IMGT에 의해 정의된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 추가로 포함한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체), 또는 이의 기능성 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서, 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 15의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 26 또는 32의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며; 항체는 β-클로토(예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 특이적으로 결합하고, 중쇄 가변 도메인은 표 2에 개시된 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 43 또는 55의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 경쇄 가변 영역은 표 2에 개시된 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 47 또는 57의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 특정 양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열은 예를 들어 표 1에 개시된 바와 같이, 카바트에 의해 정의된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 특정 양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열은 예를 들어 표 1에 개시된 바와 같이, 초티아에 의해 정의된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 특정 양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열은 예를 들어 표 1에 개시된 바와 같이, 조합에 의해 정의된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 특정 양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열은 예를 들어 표 1에 개시된 바와 같이, IMGT에 의해 정의된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 추가로 포함한다.
다른 실시 형태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 표 1에 개시된 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있으며, 여기서, 중쇄 가변 도메인은 표 2에 개시된 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 43 또는 55의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 경쇄 가변 영역은 표 2에 개시된 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 47 또는 57의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 다른 실시 형태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 제외하고는 동일할 수 있다. 표 1에 기술된 것들의 VH 및 VL 영역과 높은(즉, 80% 이상) 동일성을 갖는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는, 각각 서열 번호 10, 30, 50, 또는 70 및 서열 번호 20, 40, 60, 또는 80의 서열을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이 유발(예를 들어, 부위 지정 또는 PCR-매개 돌연변이 유발), 이어서 본원에 기술된 기능적 분석법을 이용하여, 코딩된 변경 항체를 유지된 기능에 대하여 테스트하는 것에 의해 수득될 수 있으며, 여기서, 중쇄 가변 도메인은 표 2에 개시된 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 43 또는 55의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 경쇄 가변 영역은 표 2에 개시된 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 47 또는 57의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
다른 실시 형태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 아미노산 서열은 표 1에 개시된 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있으며, 여기서, 중쇄는 표 2에 개시된 중쇄 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 45, 56, 59, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 경쇄는 표 2에 개시된 경쇄 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 49, 58, 60, 또는 62의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 서열 번호 17의 전장 중쇄, 및 서열 번호 28 또는 34의 전장 경쇄에 대하여 높은(즉, 80% 이상) 동일성을 갖는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 갖는 항체는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이 유발(예를 들어, 부위 지정 또는 PCR-매개 돌연변이 유발), 이어서 본원에 기술된 기능적 분석법을 이용하여, 코딩된 변경 항체를 유지된 기능에 대하여 테스트하는 것에 의해 수득될 수 있으며, 여기서, 중쇄는 표 2에 개시된 중쇄 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 45, 56, 59, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 경쇄는 표 2에 개시된 경쇄 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 49, 58, 60, 또는 62의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 서열 번호 17의 전장 중쇄, 및 서열 번호 28 또는 34의 전장 경쇄에 대하여 높은(즉, 80% 이상) 동일성을 갖는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 갖는 항체는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이 유발(예를 들어, 부위 지정 또는 PCR-매개 돌연변이 유발), 이어서 본원에 기술된 기능적 분석법을 이용하여, 코딩된 변경 항체를 유지된 기능에 대하여 테스트하는 것에 의해 수득될 수 있으며, 여기서, 중쇄는 표 2에 개시된 중쇄 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 45, 56, 59, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 경쇄는 표 2에 개시된 경쇄 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 49, 58, 60, 또는 62의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
다른 실시 형태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 표 1에 개시된 서열과 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있으며, 여기서, 중쇄는 표 2에 개시된 중쇄 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 45, 56, 59, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 경쇄는 표 2에 개시된 경쇄 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 49, 58, 60, 또는 62의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
다른 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 표 1에 개시된 서열과 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있으며, 여기서, 중쇄는 표 2에 개시된 중쇄 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 45, 56, 59, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 경쇄는 표 2에 개시된 경쇄 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 49, 58, 60, 또는 62의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 2개의 서열들 사이의 동일성 퍼센트는 상기 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이며(즉, 동일성 %는 동일한 위치의 수/위치의 총 수 × 100과 동일함), 이는 2개 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 2개 서열들 사이에서의 서열의 비교 및 동일성 퍼센트의 결정은 하기 비제한적 예에 기술된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은 또한, 예를 들어 관련 서열을 식별하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "쿼리 서열"로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 검색은 문헌[Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10]의 BLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다.
보존적 변형을 갖는 항체
특정 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지며, 여기서, 이들 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에 기술된 항체를 기반으로 한 명시된 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형을 가지고, 항체는 본 발명의 β-클로토-결합 항체의 원하는 기능적 특성을 보유한다.
따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체), 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서, 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 번호 6의 서열, 및 이의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 번호 7의 서열, 및 이의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 8의 서열, 및 이의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 번호 19 및 31의 서열, 및 이의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 번호 20의 서열, 및 이의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 21의 서열, 및 이의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 β-클로토에 특이적으로 결합한다.
따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체), 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서, 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 번호 6, 9, 10 및 12의 서열, 및 이의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 번호 7, 11 및 13의 서열, 및 이의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 8 및 14의 서열, 및 이의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 번호 19, 31, 22 및 25의 서열, 및 이의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 번호 20 및 23의 서열, 및 이의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 21 또는 24의 서열, 및 이의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 β-클로토에 특이적으로 결합한다.
일 양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 포유류 세포에서의 발현에 최적화된 단리된 항체를 제공하며, 여기서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 15의 서열, 및 이의 보존적 변형의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; 전장 경쇄는 서열 번호 26 및 32의 서열, 및 이의 보존적 변형의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고; 항체는 β-클로토(예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 특이적으로 결합하고, 중쇄 가변 영역은 표 2에 개시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 43 또는 55의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 경쇄 가변 영역은 표 2에 개시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 47 또는 57의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
다른 실시 형태에서, 포유류 세포에서의 발현에 최적화된 본 발명의 항체는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 가지며, 여기서, 이들 서열 중 하나 이상은 본원에 기술된 항체를 기반으로 한 명시된 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형을 가지고, 항체는 본 발명의 β-클로토 결합 항체의 원하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄로 이루어지며 포유류 세포에서의 발현에 최적화된 단리된 항체를 제공하며, 여기서, 전장 중쇄는 서열 번호 17의 서열, 및 이의 보존적 변형의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; 전장 경쇄는 서열 번호 28 및 34의 서열, 및 이의 보존적 변형의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고; 항체는 β-클로토(예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 β-클로토)에 특이적으로 결합하고, 중쇄는 표 2에 개시된 중쇄 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 45, 56, 59, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 경쇄는 표 2에 개시된 경쇄 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 49, 58, 60, 또는 62의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
동일 에피토프(들)에 결합하거나 동일 에피토프(들)에의 결합에 대하여 경쟁하는 항체
본 발명은 표 1에 기술된 β-클로토 결합 항체(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)와 동일한 에피토프에 결합하는 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체)를 제공한다. 특정 양태에서, 이러한 항체 및 항원 결합 단편은 β-클로토 및 FGFR1c의 활성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 추가의 항체는, β-클로토 결합 분석법(예컨대 실시예에 기술된 것)에서 본 발명의 다른 항체와 경쟁하는(예를 들어, 이의 결합을 통계학적으로 유의한 방식으로 경쟁적으로 억제하는) 능력을 기반으로 하여 식별될 수 있다. 본 발명의 항체가 β-클로토 단백질에 결합하는 것을 억제하는 테스트 항체의 능력은, 이러한 테스트 항체가 β-클로토에의 결합에 대해 본 항체와 경쟁할 수 있으며; 이러한 항체는 비제한적 이론에 따르면, 상기 항체가 경쟁하는 항체와 동일한, 또는 관련된(예를 들어 구조적으로 유사한 또는 공간적으로 근접한) β-클로토 단백질 에피토프에 결합할 수 있음을 입증한다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 항체와 동일한 β-클로토 에피토프에 결합하는 항체는 인간 단클론 항체이다. 이러한 인간 단클론 항체는 본원에 기술된 바와 같이 제조되고 단리될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 등몰 농도의 경쟁 항체의 존재 하에 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 β-클로토 결합을 경쟁 항체가 50% 넘게(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 넘게) 억제하는 경우 항체는 결합에 대하여 "경쟁한다". 특정 실시 형태에서, 본 발명의 항체와 동일한 β-클로토 에피토프에 결합하는 항체는 인간화 단클론 항체이다. 이러한 인간화 단클론 항체는 본원에 기술된 바와 같이 제조되고 단리될 수 있다.
특정한 양태에서, 본 발명은 β-클로토 결합 항체 NOV005 또는 NOV006과 동일한 에피토프에 결합하는 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체)를 제공한다.
특정 양태에서, 본 발명은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호 26 또는 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 β-클로토 결합 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체)를 제공한다.
특정 양태에서, 본 발명은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 β-클로토 결합 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체)를 제공한다.
특정 양태에서, 본 발명은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 β-클로토 결합 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
특정한 양태에서, 본 발명은 β-클로토 결합 항체 NOV005 또는 NOV006과 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체)를 제공한다.
특정한 양태에서, 본 발명은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호 26 또는 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 β-클로토 결합 항체와 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체)를 제공한다.
특정한 양태에서, 본 발명은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 β-클로토 결합 항체와 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체)를 제공한다.
특정한 양태에서, 본 발명은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 β-클로토 결합 항체와 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체)를 제공한다.
특정 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 246~265의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 특정 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 536~550의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 특정 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 834~857의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 특정 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 959~986의 하나 이상의 아미노산을 포함한다.
특정 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986의 2개 이상의 아미노산을 포함한다. 특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986의 3개 이상의 아미노산을 포함한다. 특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986의 아미노산들을 포함한다. 특정한 양태에서, β-클로토의 에피토프에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 하기 아미노산 잔기 스트레치 각각으로부터의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함한다: 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986.
특정 양태에서, β-클로토의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 646~670의 아미노산 중 하나 이상을 포함한다. 특정 양태에서, β-클로토의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 696~700의 아미노산 중 하나 이상을 포함한다. 특정 양태에서, β-클로토의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 646~689의 아미노산 중 하나 이상을 포함한다.
특정 양태에서, β-클로토의 하나 이상의 에피토프(예를 들어, 불연속 에피토프들)에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 646~670, 696~700, 및 646~689의 아미노산 중 1개, 또는 2개, 또는 3개, 또는 4개, 또는 5개, 또는 그 이상을 포함한다. 특정 양태에서, β-클로토의 2개 이상의 에피토프(예를 들어, 불연속 에피토프들)에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 646~670, 696~700, 및 646~689의 아미노산 중 하나 이상을 포함한다. 특정한 양태에서, β-클로토의 3개 이상의 에피토프(예를 들어, 불연속 에피토프들)에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 646~670, 696~700, 및 646~689의 아미노산 중 하나 이상을 포함한다. 특정한 양태에서, β-클로토의 3개 이상의 에피토프(예를 들어, 불연속 에피토프들)에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 646~670, 696~700, 및 646~689의 아미노산들을 포함한다. 특정한 양태에서, β-클로토의 3개 이상의 에피토프(예를 들어, 불연속 에피토프들)에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 에피토프는 β-클로토 서열(서열 번호 52)의 하기 범위의 아미노산 잔기 각각으로부터의 아미노산 잔기를 포함한다: 646~670, 696~700, 및 646~689.
특정 양태에서, 수소-중수소 교환(HDx)에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토(서열 번호 52)의 하기 펩티드 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상을 보호하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다: 아미노산 잔기 245~266, 246~265, 343~349, 344~349, 421~429, 488~498, 509~524, 536~550, 568~576, 646~669, 646~670, 696~700, 773~804, 834~857, 및 959~986.
특정 양태에서, 수소-중수소 교환(HDx)에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토(서열 번호 52)의 하기 펩티드를 보호하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다: 아미노산 잔기 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986.
특정 양태에서, 수소-중수소 교환(HDx)에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토(서열 번호 52)의 하기 펩티드를 보호하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다: 아미노산 잔기 245~266, 246~265, 343~349, 344~349, 421~429, 488~498, 509~524, 536~550, 568~576, 646~669, 646~670, 696~700, 773~804, 834~857, 및 959~986.
특정 양태에서, β-클로토 및 FGFR1c의 활성을 증가시키는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 β-클로토(서열 번호 52)의 잔기 701(Tyr) 또는 703(Arg)과 접촉하지 않는다.
특정 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 246~265의 하나 이상의 아미노산과 접촉한다. 특정 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 536~550의 하나 이상의 아미노산과 접촉한다. 특정 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 834~857의 하나 이상의 아미노산과 접촉한다. 특정 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 959~986의 하나 이상의 아미노산과 접촉한다.
특정 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986의 하나 이상의 아미노산과 접촉한다. 특정한 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986의 2개 이상의 아미노산과 접촉한다. 특정한 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986의 3개 이상의 아미노산과 접촉한다. 특정한 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986의 아미노산들과 접촉한다. 특정한 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 하기 아미노산 잔기 스트레치 각각으로부터의 적어도 하나의 아미노산 잔기와 접촉한다: 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986.
특정 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 646~670의 하나 이상의 아미노산과 접촉한다. 특정 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 696~700의 하나 이상의 아미노산과 접촉한다. 특정 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 646~689의 하나 이상의 아미노산과 접촉한다.
특정 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 잔기 646~670, 696~700, 및 646~689의 아미노산 중 1개, 또는 2개, 또는 3개, 또는 4개, 또는 5개, 또는 그 이상과 접촉한다. 특정 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 하기 아미노산 잔기 스트레치 각각으로부터의 아미노산 잔기 중 하나 이상과 접촉한다: 646~670, 696~700, 및 646~689. 특정한 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 하기 아미노산 잔기 스트레치 각각으로부터의 아미노산 잔기 중 하나 이상과 접촉한다: 646~670, 696~700, 및 646~689. 특정한 양태에서, β-클로토에 결합하는 단리된 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 x선 결정학, 수소-중수소 교환 분석법, 또는 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 결정되는 바와 같이, β-클로토 서열(서열 번호 52)의 아미노산 잔기 646~670, 696~700, 및 646~689와 접촉한다.
특정한 양태에서, 본 발명은 β-클로토에의 결합에 대하여 항체 NOV005 또는 NOV006과 경쟁하는 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체)를 제공한다.
특정한 양태에서, 본 발명은 β-클로토에의 결합에 대하여 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호 26 또는 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 β-클로토 결합 항체와 경쟁하는 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체)를 제공한다.
특정한 양태에서, 본 발명은 β-클로토에의 결합에 대하여 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 β-클로토 결합 항체와 경쟁하는 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체)를 제공한다.
특정한 양태에서, 본 발명은 β-클로토에의 결합에 대하여 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 β-클로토 결합 항체와 경쟁하는 항체(예를 들어, β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시키거나 활성화시킬 수 있는 항체)를 제공한다.
조작 및 변형된 항체
나아가, 본 발명의 항체(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)는 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 본원에 예시된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있으며, 이러한 변형된 항체는 출발 항체로부터의 특성이 변경된 것일 수 있다. 항체는 1개 또는 2개의 가변 영역(즉, VH 및/또는 VL) 내의, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 내 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해, 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.
수행될 수 있는 하나의 유형의 가변 영역 조작으로는 CDR 그래프팅이 있다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유에서, CDR 내의 아미노산 서열은 개별 항체들 사이에서 CDR 외부의 서열보다 더 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 책임지기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상으로 그래프팅된 특이적 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적 천연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다(예컨대 문헌[Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327]; 문헌[Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525]; 문헌[Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033]; Winter의 미국 특허 제5,225,539호, 및 Queen 등의 미국 특허 제5,530,101호; 미국 특허 제5,585,089호; 미국 특허 제5,693,762호 및 미국 특허 제6,180,370호 참조).
따라서, 본 발명의 또 다른 실시 형태는 표 1에 개시된 HCDR1 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 표 1에 개시된 HCDR2 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 표 1에 개시된 HCDR3 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 표 1에 개시된 LCDR1 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 표 1에 개시된 LCDR2 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 및 표 1에 개시된 LCDR3 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 따라서, 그러한 항체는 단클론 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하지만, 상기 단클론 항체와는 상이한 프레임워크 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시 형태는 서열 번호 6 및 9의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 서열; 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 서열; 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 19 및 31의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 서열; 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 서열; 및 서열 번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 따라서, 그러한 항체는 단클론 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하지만, 상기 단클론 항체와는 상이한 프레임워크 서열을 포함할 수 있다.
이러한 프레임워크 서열은 생식세포 계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개 참고 문헌으로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식세포 계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식세포 계열 서열 데이터베이스(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 입수가능함)와, 문헌[Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]; 문헌[Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798]; 및 문헌[Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836]에서 찾을 수 있으며; 이들 각각의 내용은 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 항체에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 일례로는, 본 발명의 선발된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어, 컨센서스(consensus) 서열 및/또는 본 발명의 단클론 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이 있다. VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은, 프레임워크 서열이 유래되는 생식세포 계열 면역글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상으로 그래프팅될 수 있거나, CDR 서열은 생식세포 계열 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상으로 그래프팅될 수 있다. 예를 들어, 소정의 경우, 항체의 항원 결합 능력을 유지시키거나 증강시키기 위해 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시키는 것이 유익함이 밝혀졌다(예컨대 Queen 등의 미국 특허 제5,530,101호; 미국 특허 제5,585,089호; 미국 특허 제5,693,762호 및 미국 특허 제6,180,370호 참조). 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편을 만들기 위한 스캐폴드로서 이용될 수 있는 프레임워크는 VH1A, VH1B, VH3, Vk1, Vl2, 및 Vk2를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가적인 프레임워크는 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, www.vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1의 vBase 데이터베이스에서 찾을 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시 형태는 서열 번호 15의 아미노산 서열, 또는 이러한 서열의 프레임워크 영역 내에 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 추가로, 서열 번호 26 또는 32의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이러한 서열의 프레임워크 영역 내에 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 β-클로토 결합 항체, 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서, 중쇄 가변 영역은 표 2에 개시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 예를 들어, 서열 번호 43 또는 55의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 경쇄 가변 영역은 표 2에 개시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 47 또는 57의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
또 다른 유형의 가변 영역 변형으로는 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성(예컨대 친화성)을 향상시키는 것이 있으며, 이는 "친화성 성숙"으로 공지되어 있다. 부위 지정 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이 유발은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합 또는 다른 관심있는 기능적 특성에 대한 영향은 본원에 기술되고 실시예에 제공된 바와 같이 시험관 내 또는 생체 내 분석법에서 평가될 수 있다. 보존적 변형(상기 고찰된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 더욱이, 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
특정 아미노산 서열 모티프는 번역 후 변형(PTM), 예컨대 글리코실화(즉, NxS/T, x는 P를 제외한 임의의 것임), 자유 시스테인의 산화, 탈아미드화(예를 들어, NG) 또는 이성질체화(예를 들어, DG)를 겪을 수 있는 것으로 공지되어 있다. 상기 모티프는, CDR 영역 내에 존재할 경우, 생성물 균질성을 증가시키기 위하여 이상적으로는 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 제거된다.
친화성 성숙의 과정은 본 기술 분야에 잘 개시되어 있다. 많은 디스플레이 시스템 중에서, 파지 디스플레이(문헌[Smith GP (1985) Science 228:1315-1317]) 및 효모와 같은 진핵 세포에서의 디스플레이(문헌[Boder ET and Wittrup KD (1997) Nature Biotechnology 15: 553-557])가 항체-항원 상호작용에 대한 선발을 위하여 가장 일반적으로 적용되는 시스템인 것으로 보인다. 상기 디스플레이 시스템들의 장점은 이들이 넓은 범위의 항원에 적합하고 선발 엄격도가 용이하게 조정될 수 있다는 것이다. 파지 디스플레이에서, scFv 또는 Fab 단편이 디스플레이될 수 있으며, 게다가 효모 디스플레이에서 전장 IgG가 디스플레이될 수 있다. 상기 일반적으로 적용되는 방법들은 10E7 초과의 다양성을 갖는 더 큰 라이브러리로부터의 원하는 항체 변이체의 선발을 허용한다. 더 작은 다양성, 예를 들어 10E3을 갖는 라이브러리는 마이크로-발현 및 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있다.
비-표적화 또는 무작위 항체 변이체 라이브러리는 예를 들어 실수-유발 PCR에 의해 생성될 수 있으며(문헌[Cadwell RC and Joyce GF (1994) Mutagenic PCR. PCR Methods Appl. 3:S136-S140]), 매우 단순하지만 때때로 제한된 접근법을 제공할 수 있다. 또 다른 전략은 항체 후보의 CDR 지시된 다양화이다. 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 위치가 예를 들어 축퇴 올리고(문헌[Thompson J et al. (1996) J.Mol.Biol. 256:77-88]), 트리뉴클레오티드 돌연변이 유발(TRIM)(문헌[Kayushin AL et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:3748-3755]) 또는 본 기술 분야에 공지된 임의의 다른 접근법을 이용하여 특이적으로 표적화될 수 있다.
따라서, 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 6 및 9의 서열을 갖는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 6 및 9의 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VH CDR1 영역; 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 7의 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 영역; 서열 번호 8의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 8의 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역; 서열 번호 19 또는 31의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 19 또는 31의 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1 영역; 서열 번호 20의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 20의 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 영역; 및 서열 번호 21의 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3 영역으로 이루어진, 단리된 β-클로토-결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
대안적인 프레임워크 또는 스캐폴드 내로의 항원 결합 도메인의 그래프팅
생성된 폴리펩티드가 β-클로토에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 영역을 포함하는 한, 매우 다양한 항체/면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드가 이용될 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 5개의 주요 이디오타입(idiotype)의 인간 면역글로불린, 또는 이의 단편을 포함하고, 바람직하게는 인간화된 양태를 갖는, 다른 동물 종의 면역글로불린을 포함한다. 이와 관련하여 낙타과(camelid)에서 식별된 것들과 같은 단일 중쇄 항체가 특히 관심의 대상이 된다. 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편은 당업자에 의해 계속해서 발견 및 개발된다.
일 양태에서, 본 발명은, 본 발명의 CDR이 그래프팅될 수 있는 비-면역글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-면역글로불린 기반 항체를 생성하는 것에 관한 것이다. 공지된 또는 미래의 비-면역글로불린 프레임워크 및 스캐폴드는, 이들이 표적 β-클로토 단백질에 특이적인 결합 영역을 포함하는 한, 이용될 수 있다. 공지된 비-면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 피브로넥틴(Compound Therapeutics, Inc., 미국 매사추세츠주 월섬 소재), 안키린(Molecular Partners AG, 스위스 취리히 소재), 도메인 항체(Domantis, Ltd.(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재) 및 Ablynx nv(벨기에 쥐즈나르데 소재)), 리포칼린(Pieris Proteolab AG, 독일 프라이싱 소재), 소형 모듈 면역-약제(Trubion Pharmaceuticals Inc., 미국 워싱턴주 시애틀 소재), 맥시바디(maxybody)(Avidia, Inc., 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재), 단백질 A(Affibody AG, 스웨덴 소재) 및 아필린(affilin)(감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴)(Scil Proteins GmbH, 독일 할레 소재)을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
피브로넥틴 스캐폴드는 피브로넥틴 타입 III 도메인(예컨대 제10 모듈의 피브로넥틴 타입 III(10 Fn3 도메인))을 기반으로 한다. 피브로넥틴 타입 III 도메인은 2개의 베타 시트들 사이에 분포되고 그 자체가 서로에 대해 패킹되어 단백질 코어를 형성하는 7 또는 8개의 베타 가닥을 가지고, 추가로, 베타 가닥을 서로 연결하고 용매 노출되는 루프(CDR과 유사함)를 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각각의 에지에는 이러한 루프가 적어도 3개 존재하며, 여기서, 에지는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다(미국 특허 제6,818,418호 참조). 이들 피브로넥틴-기반 스캐폴드는, 전체 폴드(overall fold)가, 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 최소 기능성 항체 단편, 중쇄의 가변 영역의 전체 폴드와 밀접하게 관련이 있더라도, 면역글로불린이 아니다. 이러한 구조 때문에, 비-면역글로불린 항체는 성질 및 친화도 면에서 항체의 것과 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이들 스캐폴드는, 생체 내에서 항체의 친화성 성숙 과정과 유사한 루프 무작위화 및 시험관 내 셔플링 전략에 사용될 수 있다. 이들 피브로넥틴-기반 분자는, 분자의 루프 영역이 표준 클로닝 기술을 사용하여 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
안키린 기술은 안키린-유래 반복 모듈을 갖는 단백질을, 상이한 표적에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 갖기 위한 스캐폴드로서 사용하는 것을 기반으로 한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역평행 α-나선 및 β-턴으로 이루어진 33개 아미노산 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보솜 디스플레이를 사용함으로써 대체로 최적화된다.
아비머(avimer)는 LRP-1과 같은 단백질을 함유하는 천연 A-도메인으로부터 유래된다. 이들 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용에 사용되고, 인간에서 250개가 넘는 단백질이 구조적으로 A-도메인을 기반으로 한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 많은 상이한 "A-도메인" 단량체(2-10)로 이루어진다. 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머는 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20040175756호; 제20050053973호; 제20050048512호; 및 제20060008844호에 기술된 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
아피바디(affibody) 친화성 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인들 중 하나의 스캐폴드를 기반으로 한 3개-나선 꾸러미로 구성된 작고 단순한 단백질이다. 단백질 A는 스타필로콕커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 박테리아로부터의 표면 단백질이다. 이러한 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 이루어지며, 그 중 13개의 아미노산은 다수의 리간드 변이체들을 갖는 아피바디 라이브러리를 생성시키기 위해 무작위화된다(예를 들어 미국 특허 제5,831,012호 참조). 아피바디 분자는 항체를 모방하며, 150 kDa인 항체의 분자량과 비교하여, 6 kDa의 분자량을 갖는다. 아피바디 분자의 작은 크기에도 불구하고, 아피바디 분자의 결합 부위는 항체의 결합 부위와 유사하다.
안티칼린은 Pieris ProteoLab AG사에 의해 개발된 제품이다. 이들 안티칼린은, 화학적으로 감수성이거나 불용성인 화합물의 생리학적 수송 또는 저장에 통상적으로 관여하는 작고 강력한 단백질들의 광범위한 군인 리포칼린으로부터 유래된다. 몇몇 천연 리포칼린은 인간 조직 또는 체액에서 나타난다. 단백질 아키텍쳐(architecture)는 면역글로불린을 연상시키며, 초가변 루프는 강성(rigid) 프레임워크의 상부 상에 존재한다. 그러나, 항체 또는 이의 재조합 단편과는 대조적으로, 리포칼린은 160 내지 180개 아미노산 잔기를 갖는 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 이는 단일 면역글로불린 도메인보다 단지 미미하게 더 크다. 결합 포켓을 만드는 4개 루프들의 세트는 확연한 구조적 가소성(structural plasticity)을 보여주고, 여러 가지 측쇄들을 용인한다. 따라서, 결합 부위는 상이한 형상의 규정된 표적 분자를 고 친화도 및 특이성으로 인식하기 위해 독점 과정(proprietary process)에서 개조될 수 있다. 리포칼린 패밀리의 하나의 단백질인 피에리스 브라씨카에(Pieris Brassicae)의 빌린(bilin)-결합 단백질(BBP)은 4개 루프의 세트의 돌연변이 유발에 의해 안티칼린을 개발하는 데 사용되어 왔다. 안티칼린이 개시된 특허 출원의 일례는 국제 공개 제199916873호에 있다.
아필린 분자는, 단백질 및 소분자에 대한 특이적인 친화성을 위하여 디자인된 작은 비-면역글로불린 단백질이다. 새로운 아필린 분자는 2개의 라이브러리들로부터 매우 신속하게 선발될 수 있으며, 이들 라이브러리 각각은 상이한 인간-유래 스캐폴드 단백질을 기반으로 한다. 아필린 분자는 면역글로불린 단백질에 대한 구조적 상동성을 전혀 보여주지 않는다. 현재, 2개의 아필린 스캐폴드가 이용되며, 이들 스캐폴드 중 하나는 인간의 구조적 안구 수정체 단백질인 감마 크리스탈린이고, 다른 하나는 "유비퀴틴" 슈퍼패밀리 단백질이다. 상기 둘 다의 인간 스캐폴드는 매우 작으며, 높은 온도 안정성을 보여주고, pH 변화 및 변성제에 대해 대체로 내성이다. 이러한 높은 안정성은 주로, 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 크리스탈린-유래 단백질의 예는 국제 공개 제200104144호에 기술되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 국제 공개 제2004106368호에 기술되어 있다.
단백질 에피토프 모방체(PEM)는, 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 주요 2차 구조인, 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간-크기의 환형 펩티드-유사 분자(MW 1 내지 2 kDa)이다.
본 발명은 β-클로토 단백질에 특이적으로 결합하는 완전 인간 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명의 인간 β-클로토-결합 항체는, 키메라 또는 인간화 항체와 비교하여, 인간 대상체에게 투여될 때 더 감소된 항원성을 갖는다.
낙타과 항체
신세계 구성원, 예컨대 라마 종(라마 팍코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 포함하여 낙타 및 단봉 낙타(카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 칼렐루스 드로마데리우스(Calelus dromaderius)) 과(family)의 구성원들로부터 수득된 항체 단백질은 크기, 구조적 복합성 및 인간 대상체에 대한 항원성에 관하여 특성화된 바 있다. 자연에서 발견되는 바와 같은 이러한 포유류 과로부터의 특정 IgG 항체는 경쇄가 결여되어 있고, 따라서 다른 동물로부터의 항체의 경우 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4개 사슬 4차 구조와는 구조적으로 구별된다. PCT/EP93/02214(1994년 3월 3일에 공개된 국제 공개 제94/04678호)를 참조한다.
VHH로서 식별된 작은 단일 가변 도메인인 낙타과 항체의 영역은, 표적에 대해 고 친화도를 갖는 작은 단백질을 생성하도록 유전자 조작에 의해 수득될 수 있으며, 이는 "낙타과 나노바디"로 공지된 저분자량 항체-유래 단백질을 초래한다. 1998년 6월 2일자로 허여된 미국 특허 제5,759,808호를 참조하며; 또한, 문헌[Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261]; 문헌[Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788]; 문헌[Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448]; 문헌[Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62]; 및 문헌[Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520]을 참조한다. 낙타과 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는 예를 들어 벨기에 헨트 소재의 Ablynx로부터 구매가능하다. 비-인간 기원의 다른 항체와 같이, 낙타과 항체의 아미노산 서열을 재조합적으로 변경하여 인간 서열과 더 밀접하게 닮은 서열을 수득할 수 있다(즉, 나노바디가 "인간화"될 수 있다). 따라서, 인간에 대한 낙타과 항체의 천연적으로 낮은 항원성이 더 감소될 수 있다.
낙타과 나노바디는 인간 IgG 분자의 분자량의 대략 1/10의 분자량을 가지며, 상기 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 가진다. 작은 크기로 인한 하나의 결과는, 더 큰 항체 단백질에게는 기능적으로 보이지 않는 항원성 부위에 결합하는 낙타과 나노바디의 능력이다(즉, 낙타과 나노바디는, 숨은 항원을 고전적인 면역학적 기술을 사용하여 검출하는 시약으로서, 및 가능한 치료제로서 유용하다). 따라서, 작은 크기로 인한 또 다른 결과는, 낙타과 나노바디가 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈에서 특이적 부위에 결합한 결과 억제할 수 있고, 따라서, 고전적인 항체의 기능보다는 고전적인 저분자량 약물의 기능과 더 밀접하게 닮은 수용력(capacity)에서 역할을 할 수 있다는 것이다.
저분자량 및 소형 크기는 추가로, 극도로 열안정성이며, 극도의 pH 및 단백질 분해적 절단에 대해 안정하고, 불량하게 항원성인 낙타과 나노바디를 초래한다. 또 다른 결과는, 낙타과 나노바디가 순환계로부터 조직 내로, 심지어 혈액-뇌 장벽을 가로질러 쉽게 이동하고, 신경 조직에 영향을 주는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 추가로, 나노바디는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 약물 수송을 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일자로 공개된 미국 특허 출원 제20040161738호를 참조한다. 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이들 특징은 큰 치료적 잠재성을 보여 준다. 추가로, 이들 분자는 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이에서 전적으로 발현될 수 있고, 박테리오파지에 의해 융합 단백질로서 발현되고, 기능적이다.
따라서, 본 발명의 특징은 β-클로토(예를 들어, 인간 β-클로토)에 대해 특이적 친화성을 갖는 낙타과 항체 또는 나노바디이다. 본원의 특정 실시 형태에서, 낙타과 항체 또는 나노바디는 낙타과 동물에서 천연적으로 생성된다(즉, 다른 항체에 대해 본원에 설명된 기술을 사용하여 β-클로토 또는 이의 펩티드 단편으로 면역화한 후 낙타과에 의해 생성된다). 대안적으로, β-클로토-결합 낙타과 나노바디는 조작된다(즉, 예를 들어 본원의 실시예에 기술된 바와 같이 표적으로서 β-클로토를 이용하는 패닝 절차(panning procedure)를 사용하여 적절하게 돌연변이 유발된 낙타과 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지 라이브러리로부터의 선발에 의해 생성된다). 조작된 나노바디는 추가로, 수령자(recipient) 대상체에서 45분 내지 2주의 반감기를 갖도록 유전자 조작에 의해 맞춤화될 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 낙타과 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT/EP93/02214에 기술된 바와 같이 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열 내로 그래프팅함으로써 수득된다.
이중특이성 분자 및 다가 항체
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 β-클로토-결합 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 항체 NOV005 또는 NOV006을 포함하는 이중특이성 또는 다중특이성 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 영역은 또 다른 기능성 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질(예컨대 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)로 유도체화되거나 이에 연결되어, 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이성 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 사실상, 1개 초과의 다른 기능성 분자로 유도체화되거나 이에 연결되어, 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이성 분자를 생성할 수 있으며; 이러한 다중특이성 분자도 본원에서 사용되는 바와 같은 "이중특이성 분자"라는 용어에 포함시키고자 한다. 본 발명의 이중특이성 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 이중특이성 분자가 생성되도록, 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 (예컨대 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 회합 또는 다른 방법에 의해) 기능적으로 연결될 수 있다.
따라서, 본 발명은 β-클로토에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이성 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와는 상이한, β-클로토의 또 다른 에피토프이다.
추가로, 이중특이성 분자가 다중특이성인 본 발명에 있어서, 이러한 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프에 더하여 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 이중특이성 분자는 적어도 하나의 항체 또는 이의 항체 단편(예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단쇄 Fv를 포함함)을 결합 특이성으로서 포함한다. 항체는 또한, 경쇄 또는 중쇄 이량체 또는 이의 임의의 최소 단편, 예컨대 래드너(Ladner) 등의 미국 특허 제4,946,778호에 기술된 바와 같은 Fv 또는 단쇄 구축물일 수 있다.
디아바디는 2가, 이중특이성 분자이며, 이 분자에서 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되고, 동일한 사슬 상의 2개의 도메인들 사이에서 쌍을 형성하게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 연결된다. VH 및 VL 도메인은 또 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 형성함으로써 2개의 항원 결합 부위를 생성한다(예를 들어 문헌[Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]; 문헌[Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123] 참조). 디아바디는 동일한 세포 내에서 구조 VHA-VLB 및 VHB-VLA(VH-VL 배열) 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA(VL-VH 배열)를 갖는 2개의 폴리펩티드 사슬을 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 이들 대부분의 디아바디는 박테리아에서 가용성 형태로 발현될 수 있다. 단쇄 디아바디(scDb)는 2개의 디아바디-형성 폴리펩티드 사슬들을 대략 15개 아미노산 잔기의 링커를 이용하여 연결함으로써 생성된다(문헌[Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30]; 문헌[Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36] 참조). scDb는 박테리아 내에서 가용성, 활성 단량체 형태로 발현될 수 있다(문헌[Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34):128-30]; 문헌[Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36]; 문헌[Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2):83-105]; 문헌[Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21] 참조). 디아바디는 Fc에 융합되어, "디-디아바디"를 생성할 수 있다(문헌[Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65] 참조).
본 발명의 이중특이성 분자에 이용될 수 있는 다른 항체로는 쥣과, 키메라 및 인간화 단클론 항체가 있다.
이중특이성 분자는 구성원 결합 특이성들을 본원에 공지된 방법을 사용하여 콘쥬게이션시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이성 분자의 각각의 결합 특이성은 개별적으로 발생된 다음, 서로 콘쥬게이션될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링제 또는 가교제가 공유적 콘쥬게이션에 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-l-카르복실레이트(술포-SMCC)를 포함한다(예를 들어, 문헌[Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686]; 문헌[Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조).다른 방법은 문헌[Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132]; 문헌[Brennan et al., 1985 Science 229:81-83], 및 문헌[Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139:2367-2375]에 기술된 것을 포함한다. 콘쥬게이션제는 SATA 및 술포-SMCC이며, 이들은 둘 다 Pierce Chemical Co.(미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 입수가능하다.
결합 특이성이 항체인 경우, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합에 의해 콘쥬게이션될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 힌지 영역은 콘쥬게이션 이전에 홀수의, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 2개의 결합 특이성들은 동일한 벡터 내에서 코딩되고, 동일한 숙주 세포 내에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이러한 방법은 특히, 이중특이성 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 유용하다. 본 발명의 이중특이성 분자는 1개의 단쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단쇄 분자 또는 2개의 결합 결정기들을 포함하는 단쇄 이중특이성 분자일 수 있다. 이중특이성 분자는 적어도 2개의 단쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이성 분자의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호; 미국 특허 제5,455,030호; 미국 특허 제4,881,175호; 미국 특허 제5,132,405호; 미국 특허 제5,091,513호; 미국 특허 제5,476,786호; 미국 특허 제5,013,653호; 미국 특허 제5,258,498호; 및 미국 특허 제5,482,858호에 기술되어 있다.
이중특이성 분자가 그의 특이적 표적에 결합하는 것은 예를 들어 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사성 면역 측정법(REA), FACS 분석, 생물학적 분석법(예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석법에 의해 확인될 수 있다. 일반적으로, 이러한 분석법 각각은 특히 관심 있는 단백질-항체 복합체에 특이적인 표지된 시약(예를 들어, 항체)을 이용하여 이러한 관심 있는 복합체의 존재를 탐지한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 β-클로토에 결합하는 본 발명의 항체의 적어도 2개의 동일한 또는 상이한 항원 결합 부분을 포함하는 다가 화합물을 제공한다. 항원 결합 부분은 단백질 융합 또는 공유적 또는 비공유적 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 대안적으로, 연결 방법은 이중특이성 분자에 대해 기술되었다. 4가 화합물은 예를 들어 본 발명의 항체와, 본 발명의 항체의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체의 가교에 의해 수득될 수 있다.
삼량체화 도메인은 예를 들어 보레안 특허(Borean patent) EP 1 012 280B1에 기술되어 있다. 오량체화 모듈은 예를 들어 PCT/EP97/05897에 기술되어 있다.
반감기가 연장된 항체
본 발명은 생체 내에서 연장된 반감기를 갖는, β-클로토 단백질에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)를 제공한다.
많은 요인들이 생체 내에서 단백질의 반감기에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 신장 여과, 간에서의 대사, 단백질 분해 효소(프로테아제)에 의한 분해 및 면역원성 반응(예컨대 항체에 의한 단백질 중화 및 대식세포 및 수지상 세포에 의한 흡수). 본 발명의 항체의 반감기를 연장하기 위해 다양한 전략들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG), reCODE PEG, 항체 스캐폴드, 폴리시알산(PSA), 히드록시에틸 전분(HES), 알부민-결합 리간드 및 탄수화물 차폐물에 대한 화학적 연결에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 알부민, IgG, FcRn 및 트랜스페린에 결합하는 단백질에 대한 유전적 융합에 의해; 혈청 단백질에 결합하는 다른 결합 모이어티, 예컨대 나노바디, Fab, DARPin, 아비머, 아피바디 및 안티칼린에 대한 커플링(유전적으로 또는 화학적으로)에 의해; rPEG, 알부민, 알부민 도메인, 알부민-결합 단백질 및 Fc에 대한 유전적 융합에 의해; 또는 나노캐리어, 지연 방출 제형 또는 의료 장치 내로의 혼입에 의해.
생체 내에서 항체의 혈청 순환을 연장하기 위해, 불활성 중합체 분자, 예컨대 고분자량 PEG가, 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위-특이적 콘쥬게이션을 통해, 또는 라이신 잔기 상에 존재하는 엡실론-아미노기를 통해, 다작용성 링커를 이용하거나 이용하지 않고서 항체 또는 이의 단편에 부착될 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 항체, 이의 단편을 전형적으로, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되게 되는 조건 하에, PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)를 이용한 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 실시될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은, 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용되어 온 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노(C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하고자 한다. 일 실시 형태에서, 페길화되는 항체는 비글리코실화(aglycosylated) 항체이다. 생물학적 활성의 최소 손실을 초래하는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 것이다. 콘쥬게이션 정도는, 항체에 대한 PEG 분자의 적당한 콘쥬게이션을 보장하기 위해 SDS-PAGE 및 질량 분광법에 의해 엄중히 모니터링될 수 있다. 미반응 PEG는 크기-배제 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 콘쥬게이트로부터 분리될 수 있다. PEG-유도체화된 항체는 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 본원에 기술된 면역분석법에 의해, 결합 활성뿐만 아니라 생체 내 효능에 대해서도 테스트될 수 있다. 단백질의 페길화 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, Nishimura 등의 EP 0 154 316 및 Ishikawa 등의 EP 0 401 384를 참조한다.
다른 변형된 페길화 기술은, 화학적으로 명시된 측쇄를 tRNA 신테타아제 및 tRNA를 포함하는 재구성 시스템을 통해 생합성 단백질 내로 혼입하는 재구성 화학적 직교성 지향성 조작 기술(ReCODE PEG)을 포함한다. 이러한 기술은 이. 콜라이, 효모 및 포유류 세포에서의 생합성 단백질 내로의 30개 초과의 새로운 아미노산의 혼입을 가능하게 한다. tRNA는 앰버 코돈이 위치하는 임의의 장소에 비천연 아미노산을 혼입하여, 앰버를 정지 코돈으로부터, 화학적으로 명시된 아미노산의 혼입을 신호화하는 것으로 전환시킨다.
재조합 페길화 기술(rPEG)도 혈청중 반감기 연장에 사용될 수 있다. 이러한 기술은 300 내지 600개 아미노산의 비구조화 단백질 테일을 기존의 의약용 단백질에 유전적으로 융합시키는 것을 수반한다. 이러한 비구조화 단백질 사슬의 겉보기 분자량이 이의 실제 분자량보다 약 15배 더 크기때문에, 단백질의 혈청중 반감기가 크게 증가된다. 화학적 콘쥬게이션 및 재정제(repurification)를 필요로 하는 전통적인 페길화와는 대조적으로, 제조 과정은 크게 단순화되고, 생성물은 균질하다.
폴리시알화는 치료용 펩티드 및 단백질의 활성 수명을 연장하고 안정성을 향상시키기 위해 천연 중합체 폴리시알산(PSA)을 사용하는 또 다른 기술이다. PSA는 시알산 중합체(당)이다. 폴리시알산은 단백질 및 치료용 펩티드 약물 전달에 사용되는 경우, 콘쥬게이션에 보호적 미세환경을 제공한다. PSA는 순환 중 치료용 단백질의 활성 수명을 증가시키고, 이러한 단백질이 면역계에 의해 인식되는 것을 방지한다. PSA 중합체는 인체 내에서 천연적으로 발견된다. 이러한 PSA는 수백만년에 걸쳐 진화한 소정의 박테리아에 의해, 이들 박테리아의 벽을 PSA로 코팅하도록 채택되었다. 그 후에, 이들 천연적으로 폴리시알화된 박테리아는 분자 모방 덕분에, 신체의 방어 시스템을 저지할 수 있었다. 자연의 궁극적인 잠행(stealth) 기술인 PSA는 이러한 박테리아로부터 대량으로, 그리고 소정의 물리적 특징을 갖고서 쉽게 제조될 수 있다. 박테리아 PSA는 인체 내의 PSA와 화학적으로 동일하기 때문에 단백질에 커플링된 경우에조차 완전히 비-면역원성이다.
또 다른 기술은 항체에 연결된 히드록시에틸 전분("HES") 유도체의 사용을 포함한다. HES는 왁스질의(waxy) 옥수수 전분으로부터 유래된 변형된 천연 중합체이고, 신체의 효소에 의해 대사될 수 있다. HES 용액은 통상, 부족 혈액 용적을 치환하고 혈액의 유동학적 특성을 향상시키기 위해 투여된다. 항체의 헤실화(hesylation)는 분자의 안정성의 증가와, 신장 제거율(renal clearance)의 감소에 의해 순환 반감기의 연장을 가능하게 하여서 생물학적 활성을 증가시킨다. 상이한 파라미터들, 예컨대 HES의 분자량을 다르게 함으로써, 광범위한 HES 항체 콘쥬게이트들이 맞춤화될 수 있다.
생체 내에서 증가된 반감기를 갖는 항체는 또한, 하나 이상의 아미노산 변형(즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인 또는 이의 FcRn 결합 단편(바람직하게는 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 단편) 내로 도입하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 제98/23289호; 국제 공개 제97/34631호; 및 미국 특허 제6,277,375호를 참조한다.
나아가, 항체는, 항체 또는 항체 단편을 생체 내에서 더 안정하게 만들거나 생체 내에서 더 긴 반감기를 갖게 하기 위해 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민; HSA)에 콘쥬게이트될 수 있다. 상기 기술은 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 국제 공개 제93/15199호, 국제 공개 제93/15200호 및 국제 공개 제01/77137호와; 및 유럽 특허 EP 413,622를 참조한다. 게다가, 상기에 기술된 이중특이성 항체의 맥락에서, 항체의 특이성들은 항체의 하나의 결합 도메인이 FGF21에 결합하는 한편 항체의 제2 결합 도메인이 혈청 알부민, 바람직하게는 HSA에 결합하도록 설계될 수 있다.
반감기를 증가시키기 위한 전략은 특히, 나노바디, 피브로넥틴-기반 바인더, 및 증가된 생체 내 반감기가 요망되는 다른 항체 또는 단백질에 유용하다.
항체 콘쥬게이트
본 발명은 융합 단백질을 생성하기 위해, 이종성 단백질 또는 폴리펩티드(또는 이의 단편, 바람직하게는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개 아미노산의 폴리펩티드)에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 콘쥬게이션된(공유 및 비-공유 콘쥬게이션을 둘 다 포함) β-클로토 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 본원에 기술된 항체, 예를 들어 NOV005 또는 NOV006의 항원 결합 단편(예컨대 Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F (ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인 또는 VL CDR) 및 이종성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 항체 또는 항체 단편에 융합시키거나 콘쥬게이션시키는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,336,603호, 미국 특허 제5,622,929호, 미국 특허 제5,359,046호, 미국 특허 제5,349,053호, 미국 특허 제5,447,851호 및 미국 특허 제5,112,946호; 유럽 특허 EP 307,434 및 EP 367,166; 국제 공개 제96/04388호 및 국제 공개 제91/06570호; 문헌[Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539]; 문헌[Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600]; 및 문헌[Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341]을 참조한다.
추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링("DNA 셔플링"으로 통칭됨)의 기법을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 활성을 변경시키기 위해 이용될 수 있다(예컨대 더 높은 친화도 및 더 낮은 해리 속도를 갖는 항체 및 이의 단편). 일반적으로, 미국 특허 제5,605,793호, 미국 특허 제5,811,238호, 미국 특허 제5,830,721호, 미국 특허 제5,834,252호, 및 미국 특허 제5,837,458호; 문헌[Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33]; 및 문헌[Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82]; 문헌[Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76]; 및 문헌[Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313]을 참조한다(이들 특허 및 간행물 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 항체 및 이의 단편 또는 코딩된 항체 또는 이의 단편은 재조합 이전에, 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 다른 방법에 의해 무작위 돌연변이 유발을 가함으로써 변경될 수 있다. β-클로토 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 이종성 분자의 하나 이상의 구성요소, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
더욱이, 항체 또는 이의 단편은 정제를 용이하게 하기 위해 마커 서열, 예컨대 펩티드에 융합될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드(서열 번호 64), 예컨대 특히 pQE 벡터(QIAGEN, Inc., 미국 91311 캘리포니아주 채츠워스 이튼 애비뉴 9259 소재)에 제공된 태그이며, 이들 중 많은 것들이 구매가능하다. 문헌[Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘(서열 번호 64)은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌("HA") 태그(문헌[Wilson et al., 1984, Cell 37:767]) 및 "플래그(flag)" 태그를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 진단제 또는 검출제(detectable agent)에 콘쥬게이션된다. 이러한 항체는 임상 시험 절차의 일부로서 질환 또는 장애의 발병, 발생, 진행 및/또는 중증도를 모니터링하거나 예측하는 데, 예컨대 특정 요법의 효능을 결정하는 데 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 항체를, 서양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제 또는 아세틸콜린에스테라아제와 같은, 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 다양한 효소; 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴과 같은, 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 보결 분자단(prosthetic group); 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린과 같은, 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 형광 물질; 루미놀과 같은, 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 발광 물질; 루시퍼라아제, 루시페린 및 에쿼린(aequorin)과 같은, 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 생체발광 물질; 요오드(131I, 125I, 123I 및 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(115In, 113In, 112In 및 111In), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149 Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tin과 같은, 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 방사성 물질; 및 다양한 양전자 방사 단층 촬영을 사용하는 양전자 방출 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 검출가능한 물질에 커플링함으로써 달성될 수 있다.
나아가, 본 발명은 치료적 모이어티에 콘쥬게이션된 항체 또는 이의 단편의 용도를 포함한다. 항체 또는 이의 단편은 치료적 모이어티, 예컨대 세포독소, 예를 들어 세포증식 억제제(cytostatic agent) 또는 살세포제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예를 들어, 알파-방출체(emitter)에 콘쥬게이션될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 에이전트를 포함한다.
나아가, 항체 또는 이의 단편은 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 치료적 모이어티 또는 약물 모이어티에 콘쥬게이션될 수 있다. 치료적 모이어티 또는 약물 모이어티는 고전적인 화학적 치료제에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 요망되는 생물학적 활성을 갖는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어, 독소, 예컨대 아브린(abrin), 리신(ricin) A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아폽토시스제(apoptotic agent), 항-혈관형성제; 또는 생물학적 반응 조절제, 예컨대 림포카인을 포함할 수 있다.
더욱이, 항체는 치료적 모이어티, 예컨대 방사성 금속 이온, 예컨대 알파-방출체, 예컨대 213Bi, 또는 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm을 포함하지만 이에 한정되지 않는 방사성금속 이온을 폴리펩티드에 콘쥬게이션시키는 데 유용한 거대환식(macrocyclic) 킬레이터에 콘쥬게이션될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 거대환식 킬레이터는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 본 기술 분야에 일반적으로 공지되어 있고, 문헌[Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90]; 문헌[Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7]; 및 문헌[Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50]에 기술되어 있는데, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함된다.
치료적 모이어티를 항체에 콘쥬게이션시키는 기술은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.(eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; 문헌[Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; 문헌[Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; 문헌["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)], 및 문헌[Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]을 참조한다.
항체는 또한, 표적 항원의 면역분석 또는 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
항체의 생성 방법
항체를 코딩하는 핵산
본 발명은 상기 기술된 β-클로토-결합 항체 사슬의 절편 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 정제된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 중 일부는 서열 번호 15에 예시된 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 서열 번호 26 또는 32에 예시된 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정한 양태에서, 본원에 제공된 핵산 분자는 표 1에서 식별된 것, 예를 들어, VH를 코딩하는 서열 번호 16, 36, 또는 38의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 VL을 코딩하는 서열 번호 27, 54, 33 또는 40의 서열을 포함하는 핵산 분자이다. 본 발명의 일부 다른 핵산 분자는 표 1에 식별된 것들, 예를 들어, VH를 코딩하는 서열 번호 16, 36, 또는 38의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 VL을 코딩하는 서열 번호 27, 54, 33 또는 40의 서열을 포함하는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한(예컨대 적어도 65, 80%, 95% 또는 99%) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적절한 발현 벡터로부터 발현된 경우, 이들 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드는 FGF21 항원 결합력을 나타낼 수 있다.
본원에 개시된 β-클로토-결합 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 서열의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 표 1에 개시된 것이 본 발명에서 또한 제공된다. 특정한 양태에서, 본 발명은 β-클로토-결합 항체 NOV005의 VH 및/또는 VL의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정한 양태에서, 본 발명은 β-클로토-결합 항체 NOV005의 중쇄 및/또는 경쇄의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정한 양태에서, 본 발명은 β-클로토-결합 항체 NOV006의 VH 및/또는 VL의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정한 양태에서, 본 발명은 β-클로토-결합 항체 NOV006의 중쇄 및/또는 경쇄의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
코드의 축퇴성 때문에, 다양한 핵산 서열들이 각각의 면역글로불린 아미노산 서열을 코딩할 것이다. 예를 들어, 서열 번호 16 및 36은 NOV005의 VH를 코딩하는 두 핵산 서열이며, 서열 번호 27 및 54는 NOV005의 VL을 코딩하는 두 핵산 서열이다.
본 발명의 핵산 분자는 항체의 가변 영역 및 불변 영역 둘 다를 코딩할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열 중 일부는 서열 번호 17에 개시된 중쇄 서열과 실질적으로 동일한(예컨대 적어도 80%, 90% 또는 99%) 중쇄 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 다른 핵산 서열은 서열 번호 28 또는 34에 개시된 경쇄 서열과 실질적으로 동일한(예컨대 적어도 80%, 90%, 또는 99%) 경쇄 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 특정한 양태에서, 본원에 제공된 핵산 분자는 표 1에서 식별된 것, 예를 들어, 중쇄를 코딩하는 서열 번호 18, 37, 30, 또는 39의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 경쇄를 코딩하는 서열 번호 29, 51, 35, 또는 41의 서열을 포함하는 핵산 분자이다.
특정한 양태에서, VH를 코딩하는 서열 번호 16의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 특정한 양태에서, VH를 코딩하는 서열 번호 36의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 특정한 양태에서, VH를 코딩하는 서열 번호 38의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 특정한 양태에서, VL을 코딩하는 서열 번호 27의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 특정한 양태에서, VL을 코딩하는 서열 번호 54의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 특정한 양태에서, VL을 코딩하는 서열 번호 29의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 특정한 양태에서, VL을 코딩하는 서열 번호 51의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
특정한 양태에서, 중쇄를 코딩하는 서열 번호 18의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 특정한 양태에서, 중쇄를 코딩하는 서열 번호 37의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 특정한 양태에서, 중쇄를 코딩하는 서열 번호 30의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 특정한 양태에서, 중쇄를 코딩하는 서열 번호 39의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
특정한 양태에서, 경쇄를 코딩하는 서열 번호 29의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 특정한 양태에서, 경쇄를 코딩하는 서열 번호 51의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 특정한 양태에서, 경쇄를 코딩하는 서열 번호 35의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 특정한 양태에서, 경쇄를 코딩하는 서열 번호 41의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
이 폴리뉴클레오티드 서열들은 β-클로토-결합 항체 또는 이의 결합 단편을 코딩하는 기존의 서열(예컨대 하기 실시예에 기술된 바와 같은 서열)의 드 노보(de novo) 고상 DNA 합성 또는 PCR 돌연변이 유발에 의해 생성될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 본 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대, 문헌[Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌[Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌[Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981]의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고체 지지체 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은, 예를 들어, 문헌 [PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification, H.A.Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992]; [PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications, Innis et al.(Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990]; [Mattila et al., Nucleic Acids Res.19:967, 1991]; 및 [Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
또한, 본원에 기술된 β-클로토-결합 항체, 예를 들어 NOV005 또는 NOV006의 생성을 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 본 발명에서 제공된다. β-클로토-결합 항체 사슬 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터들이 이용될 수 있다. 바이러스 기반 발현 벡터와 비-바이러스 발현 벡터가 포유류 숙주 세포에서 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 에피솜 벡터(전형적으로는, 단백질 또는 RNA 발현을 위한 발현 카세트가 있음), 및 인간 인공 염색체를 포함한다(예를 들어, 문헌[Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997] 참조). 예를 들어, 포유류(예를 들어, 인간) 세포에서의 FGF21-결합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 유용한 비-바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), MPSV 벡터, 및 다른 단백질 발현을 위한, 본 기술 분야에 공지된 다수의 기타 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스를 기반으로 한 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바 바이러스를 기반으로 한 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스(SFV)를 포함한다. 문헌[Brent et al., 위 참조]; 문헌[Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995]; 및 문헌[Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992]을 참조한다.
발현 벡터의 선택은, 벡터가 발현되는 의도된 숙주 세포에 따라 다르다. 전형적으로, 발현 벡터는, β-클로토-결합 항체 사슬 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열(예컨대 인핸서)을 함유한다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터가 유도 조건 하인 경우를 제외하고는 삽입된 서열의 발현을 방지하기 위해 사용된다. 유도성 프로모터는, 예를 들어, 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 충격 프로모터를 포함한다. 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 더 잘 용인되는 코딩 서열에 대해 집단을 편향시키지 않으면서, 형질전환된 유기체의 배양물을 비유도 조건 하에 확장시킬 수 있다. 프로모터에 더하여, β-클로토-결합 항체 사슬 또는 단편의 효율적인 발현을 위해서는 다른 조절 요소가 또한 필요하거나 요망될 수 있다. 이러한 요소들은 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 기타 서열을 포함한다. 또한, 사용되는 세포 시스템에 적절한 인핸서를 포함하는 것에 의해 발현 효율을 향상시킬 수 있다(예를 들어, 문헌[Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994]; 및 문헌[Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서가 포유류 숙주 세포에서의 발현의 증가에 사용될 수 있다.
발현 벡터는 또한, 삽입된 FGF21-결합 항체 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드와 융합 단백질을 형성하도록 분비 신호 서열 위치를 제공할 수 있다. 삽입된 β-클로토-결합 항체 서열이 벡터에 포함되기 이전에 신호 서열에 연결되는 경우가 더 빈번하게 있다. β-클로토-결합 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열을 수령하는 데 사용되는 벡터는 때때로, 불변 영역 또는 이의 일부를 또한 코딩한다. 이러한 벡터는 가변 영역이 불변 영역과의 융합 단백질로서 발현되게 하고, 이에 의해 온전한 항체 또는 이의 단편이 생산되게 한다. 전형적으로, 이러한 불변 영역은 인간 불변 영역이다.
β-클로토-결합 항체 사슬을 갖고 이를 발현시키는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및 발현에 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용하기에 적합한 기타 미생물 숙주는 바실루스(bacillus), 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 기타 엔테로박테리아세아에(enterobacteriaceae), 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이러한 원핵 숙주에서, 숙주 세포와 상용성인 발현 제어 서열(예를 들어, 복제 원점)을 전형적으로 함유하는 발현 벡터도 제조될 수 있다. 또한, 다수의 다양한 주지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마아제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로, 선택적으로 오퍼레이터 서열과 함께, 발현을 제어하고, 전사 및 번역 개시 및 완료를 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가지고 있다. 다른 미생물, 예컨대 효모도 본 발명의 FGF21-결합 폴리펩티드를 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 또한, 곤충 세포가 배큘로바이러스 벡터와 조합되어 사용될 수 있다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 포유류 숙주 세포가 본 발명의 β-클로토-결합 폴리펩티드를 발현시키고 생성하는 데 사용된다. 예를 들어, 이는 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주(예를 들어, 실시예에 기술된 바와 같은 1D6.C9 골수종 하이브리도마 클론), 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유류 세포주(예를 들어, 아래에 예시된 SP2/0 골수종 세포)일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 사멸성 동물 또는 인간 세포 또는 정상적 또는 비정상적인 불멸성 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함하여, 온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주들이 개발되어 왔다. 폴리펩티드 발현을 위하여 포유류 조직 세포 배양을 사용하는 것이, 예를 들어, 문헌[Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에 전반적으로 논의되어 있다. 포유류 숙주 세포용 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 원점, 프로모터, 및 인핸서(예를 들어, 문헌[Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터들은 보통 포유류 유전자로부터 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적, 및/또는 조정 가능 또는 조절 가능한 프로모터일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터(예컨대 인간 극초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 본 기술 분야에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하기 위한 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 다르다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염이 원핵 세포에 대해 통상적으로 사용되는 반면, 인산칼슘 처리 또는 전기천공이 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다. (일반적으로 상기 Sambrook 등 참조). 기타 방법은, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜-매개 형질전환, 주입 및 미세주입, 탄도 방법, 비로솜(virosome), 이뮤노리포솜(immunoliposome), 다가 양이온:핵산 콘쥬게이트, 네이키드(naked) DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합(문헌[Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997]), 에이전트에 의해 향상된 DNA 흡수, 및 생체 외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기적인 고수율 생산을 위하여, 안정적인 발현이 종종 요망될 것이다. 예를 들어, β-클로토-결합 항체 사슬 또는 결합 단편을 안정하게 발현하는 세포주는, 바이러스 복제 원점 또는 내인성 발현 요소 및 선발가능 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조될 수 있다. 벡터의 도입 후, 세포는, 이들 세포가 선발 배지에 옮겨지기 전에, 농화된 배지 내에서 1 내지 2일 동안 성장하도록 허용될 수 있다. 선발가능 마커의 목적은 선발에 대한 저항성을 부여하는 것이고, 이의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포가 선발 배지에서 성장하게 한다. 안정적으로 형질감염된 저항성 세포를 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다.
단클론 항체의 생성
단클론 항체(mAb)는 종래의 단클론 항체 방법, 예를 들어 문헌[Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함하는 다양한 기술들에 의해 생성될 수 있다. 단클론 항체를 생성하기 위한 많은 기술들, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환이 이용될 수 있다.
하이브리도마의 제조를 위한 동물 시스템은 쥣과, 래트 및 토끼 시스템을 포함한다. 마우스에서의 하이브리도마 생성은 잘 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위한 면역화 비장세포의 단리를 위한 기술은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 융합 파트너(예컨대 쥣과 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.
본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기술된 바와 같이 제조된 쥣과 단클론 항체의 서열을 기반으로 하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 DNA는 관심 쥣과 하이브리도마로부터 수득되고, 비-쥣과(예컨대 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다(표준 분자생물학 기술을 사용하여). 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 쥣과 가변 영역은 본 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 연결될 수 있다(예를 들어, Cabilly 등의 미국 특허 제4,816,567호 참조). 인간화된 항체를 생성하기 위해, 쥣과 CDR 영역은 본 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, Winter의 미국 특허 제5225539호 및 Queen 등의 미국 특허 제5530101호; 미국 특허 제5585089호; 미국 특허 제5693762호 및 미국 특허 제6180370호를 참조한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 인간 단클론 항체이다. β-클로토에 대해 유도되는 이러한 인간 단클론 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 부분을 지닌 트랜스제닉 또는 염색체이식 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 염색체이식 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하고, 본원에서 "인간 Ig 마우스"로 통칭된다.
HuMAb 마우스®(Medarex, Inc.)는, 내인성 μ 및 ĸ 사슬 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니유전자좌(miniloci)를 함유한다(예를 들어, 문헌[Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474):856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 겪어서, 고 친화도 인간 IgGκ 단클론을 생성한다(상기 문헌[Lonberg, N. et al., 1994]; 문헌[Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]에 개관됨; 문헌[Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13:65-93], 및 문헌[Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546]. HuMAb 마우스, 및 이러한 마우스가 지니는 게놈 변형의 제조 및 용도는 문헌[Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; 문헌[Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5:647-656]; 문헌[Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724]; 문헌[Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123]; 문헌[Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830]; 문헌[Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920]; 문헌[Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591]; 및 문헌[Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851]에 더 기술되어 있으며, 이들 전부의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 구체적으로 포함된다. 추가로, 미국 특허 제5,545,806호; 미국 특허 제5,569,825호; 미국 특허 제5,625,126호; 미국 특허 제5,633,425호; 미국 특허 제5,789,650호; 미국 특허 제5,877,397호; 미국 특허 제5,661,016호; 미국 특허 제5,814,318호; 미국 특허 제5,874,299호; 및 미국 특허 제5,770,429호(전부 Lonberg 및 Kay의 미국 특허); Surani 등의 미국 특허 제5,545,807호; 국제 공개 제92103918호, 국제 공개 제93/12227호, 국제 공개 제94/25585호, 국제 공개 제97113852호, 국제 공개 제98/24884호 및 국제 공개 제99/45962호(전부 Lonberg 및 Kay의 국제 공개); 및 Korman 등의 국제 공개 제01/14424호를 참조한다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 인간 항체는, 트랜스진 및 트랜스크로모좀 상에 인간 면역글로불린 서열을 지닌 마우스, 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀을 지닌 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되는 이러한 마우스는 Ishida 등의 국제 공개 제02/43478호에 상세하게 기술되어 있다.
더 나아가, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스제닉 동물 시스템은 본 기술 분야에서 입수 가능하고, 본 발명의 β-클로토-결합 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, Xenomouse(Abgenix, Inc.)로 지칭되는 대안적인 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어, Kucherlapati 등의 미국 특허 제5,939,598호; 미국 특허 제6,075,181호; 미국 특허 제6,114,598호; 미국 특허 제6,150,584호 및 미국 특허 제6,162,963호에 기술되어 있다.
더욱이, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 염색체이식 동물 시스템은 본 기술 분야에서 입수가능하고, 본 발명의 β-클로토-결합 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스크로모좀 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀 둘 다를 지닌 마우스가 사용될 수 있으며; 이러한 마우스는 문헌[Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad.Sci. USA 97:722-727]에 기술되어 있다. 더욱이, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모좀을 지닌 소는 본 기술 분야에 기술되어 있으며(문헌[Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894]), 본 발명의 FGF21-결합 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 단클론 항체는 또한, 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 본 기술 분야에 확립되어 있거나 하기 실시예에 기술되어 있다. 예를 들어, Ladner 등의 미국 특허 제5,223,409호; 미국 특허 제5,403,484호; 및 미국 특허 제5,571,698호; Dower 등의 미국 특허 제5,427,908호 및 미국 특허 제5,580,717호; McCafferty 등의 미국 특허 제5,969,108호 및 미국 특허 제6,172,197호; 및 Griffiths 등의 미국 특허 제5,885,793호; 미국 특허 제6,521,404호; 미국 특허 제6,544,731호; 미국 특허 제6,555,313호; 미국 특허 제6,582,915호 및 미국 특허 제6,593,081호를 참조한다.
본 발명의 인간 단클론 항체는 또한, 면역화시에 인간 항체 반응이 발생될 수 있도록 인간 면역 세포가 마우스 안으로 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어, Wilson 등의 미국 특허 제5,476,996호 및 미국 특허 제5,698,767호에 기술되어 있다.
프레임워크 또는 Fc 조작
본 발명의 조작된 항체는, 예를 들어 항체의 특성을 개선하기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형이 이루어진 것들을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식세포 계열 서열로 "역돌연변이시키는" 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪은 항체는, 항체가 유래된 생식세포 계열 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을, 항체가 유래된 생식세포 계열 서열과 비교함으로써 식별될 수 있다. 프레임워크 영역 서열들을 이들의 생식세포 계열 구성으로 복귀시키기 위해, 체세포 돌연변이는 예를 들어, 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 생식세포 계열 서열로 "역돌연변이될" 수 있다. 이러한 "역돌연변이된" 항체도 본 발명에 포함시키고자 한다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은, 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜, T 세포-에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한, "탈면역화"로 지칭되고, Carr 등의 미국 특허 공개 제20030153043호에 더 상세히 기술되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 더하여, 또는 이에 대하여 대안적으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청중 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포성 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나(예컨대 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 항체의 글리코실화를 변경시키도록, 마찬가지로, 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경시키도록 변형될 수 있다. 이들 실시 형태는 각각 하기에 더 상세히 기술된다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 넘버링이다.
일 실시 형태에서, CH1의 힌지 영역은, 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가되거나 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 Bodmer 등에 의한 미국 특허 제5,677,425호에 더 기술되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가시키거나 감소시키도록 변경된다.
또 다른 실시 형태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는, 항체가 본래의 Fc-힌지 도메인의 SpA 결합에 비하여 손상된 스타필로콕킬(Staphylococcyl) 단백질 A(SpA) 결합을 갖도록, Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 중간면(interface) 영역 내로 도입된다. 이러한 접근법은 Ward 등의 미국 특허 제6,165,745호에 더 상세히 기술되어 있다.
또 다른 실시 형태에서, 항체는 이의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법들이 가능하다. 예를 들어, 돌연변이 T252L, T254S, T256F 중 하나 이상이 도입될 수 있으며, 이는 Ward의 미국 특허 제6,277,375호에 기술된 바와 같다. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는, Presta 등의 미국 특허 제5,869,046호 및 미국 특허 제6,121,022호에 기술된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프들로부터 취해진 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능을 변경시키기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산은, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 구성성분일 수 있다. 이러한 접근법은 Winter 등의 미국 특허 제5,624,821호 및 미국 특허 제5,648,260호에 더 상세히 기술되어 있다.
또 다른 실시 형태에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 소멸된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은 Idusogie 등의 미국 특허 제6,194,551호에 더 상세히 기술되어 있다.
또 다른 실시 형태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 변경되어, 항체가 보체를 고정시키는 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 Bodmer 등의 국제 공개 제94/29351호에 더 상세히 기술되어 있다.
또 다른 실시 형태에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써, 항체가 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 매개하는 능력을 증가시키고/시키거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다. 이러한 접근법은 Presta의 국제 공개 제00/42072호에 더 상세히 기술되어 있다. 게다가, FcγRl, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn을 위한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 매핑되었으며, 개선된 결합성을 갖는 변이체가 기술된 바 있다(문헌[Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조).
또 다른 실시 형태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어, "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 초래함으로써 그 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 Co 등의 미국 특허 제5,714,350호 및 미국 특허 제6,350,861호에 더 상세히 기술되어 있다.
추가로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 하이포푸코실화된(hypofucosylated) 항체 또는 증가된 이등분형(bisecting) GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체를 변경된 글리코실화 머시너리를 갖는 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 머시너리를 갖는 세포는, 본 기술 분야에서 개시된 바 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현시킴으로써 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Hang 등의 EP 1,176,195는 푸코실 트랜스퍼라아제를 코딩하는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기술하고 있으며, 따라서 이러한 세포주에서 발현된 항체는 하이포푸코실화를 나타낸다. Presta의 국제 공개 제03/035835호는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되어, 해당 숙주 세포에서 발현되는 항체의 하이포푸코실화를 또한 초래하는 변이형 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기술하고 있다(또한 문헌[Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). Umana 등의 국제 공개 제99/54342호는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라아제(예컨대 베타 (1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 III(GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기술하고 있으며, 따라서 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이등분형 GlcNac 구조를 나타내는데, 이는 항체의 증가된 ADCC 활성을 초래한다(또한 문헌[Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).
변경된 항체의 조작 방법
상기 고찰된 바와 같이, 본원에 예시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 β-클로토-결합 항체를 사용하여, 이에 부착된 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열 또는 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 새로운 β-클로토-결합 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 β-클로토-결합 항체의 구조적 특징은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성, 예컨대 인간 β-클로토에의 결합 및 또한 FGF21-수용체 복합체의 하나 이상의 기능적 특성의 활성화(예를 들어, FGF21-수용체 신호전달의 활성화)를 유지하는 구조적으로 관련된 β-클로토-결합 항체를 생성하는 데 사용된다.
예를 들어, 본 발명의 항체, 또는 이의 돌연변이의 하나 이상의 CDR 영역은 공지된 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어, 본 발명의 추가의 재조합적으로 조작된 β-클로토-결합 항체를 생성할 수 있으며, 이는 상기 고찰된 바와 같다. 다른 유형의 변형은 이전의 섹션에서 기술된 것들을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에 제공된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열 또는 이의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에 제공된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열 또는 이의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조하는 것(즉, 단백질로서 발현하는 것)은 필요하지 않다. 그보다는, 서열(들)에 들어 있는 정보가, 원래의 서열(들)로부터 유래된 "제2세대" 서열(들)을 생성하기 위한 출발 물질로서 사용되고, 그 후에, "제2세대" 서열(들)이 제조되고 단백질로서 발현된다.
따라서, 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 6 또는 9의 CDR1 서열, 서열 번호 7의 CDR2 서열, 및/또는 서열 번호 8의 CDR3 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및 서열 번호 19 또는 31의 CDR1 서열, 서열 번호 20의 CDR2 서열, 및/또는 서열 번호 21의 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 항체 서열로 이루어진 β-클로토-결합 항체(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)를 제조하고; 선택적으로, 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경하여 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키기 위한 방법을 제공한다.
따라서, 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 17의 서열을 포함하는 전장 중쇄 항체 서열; 및 서열 번호 28 또는 34의 서열을 포함하는 전장 경쇄 항체 서열로 이루어진, 포유류 세포에서의 발현에 최적화된 β-클로토-결합 항체를 제조하고; 선택적으로, 전장 중쇄 항체 서열 및/또는 전장 경쇄 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경하여 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키기 위한 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 중쇄 또는 경쇄의 변경은 중쇄 또는 경쇄의 프레임워크 영역 내에 있다.
변경된 항체 서열은 또한, US2005/0255552에 기술된 바와 같은 고정된 CDR3 서열 또는 최소 필수 결합 결정기를 갖고 CDR1 및 CDR2 서열 상의 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 제조될 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터 항체를 스크리닝하는 데 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예컨대 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다.
표준 분자생물학 기술은 변경된 항체 서열을 제조하고 발현하도록 사용될 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩된 항체는, 본원에 기술된 β-클로토-결합 항체의 기능적 특성 중 하나, 일부 또는 모두를 보유하는 것이며, 이러한 기능적 특성은 인간, 시노몰구스, 래트, 및/또는 마우스 β-클로토에 특이적으로 결합하는 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니고; 항체는 FGFR1c_ β-클로토_HEK293 pERK 세포 분석법에서 FGF21-매개 신호전달, 예를 들어, FGF21-수용체-의존성 신호전달을 활성화한다.
본 발명의 항체의 조작 방법의 특정 실시 형태에서, 돌연변이는 β-클로토-결합 항체 코딩 서열의 모두 또는 일부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성된 변형된 β-클로토-결합 항체는 결합 활성 및/또는 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있으며, 이는 본원에 기술된 바와 같다. 돌연변이 방법은 본 기술 분야에 개시된 바 있다. 예를 들어, Short의 국제 공개 제02/092780호는 포화 돌연변이 유발, 합성적 라이게이션 어셈블리 또는 이들의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하기 위한 방법을 기술하고 있다. 대안적으로, Lazar 등의 국제 공개 제03/074679호는 항체의 생리화학적 특성을 최적화하기 위해 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용하는 방법을 기술하고 있다.
본 발명의 특정 실시 형태에서, 항체는 탈아미드화 부위가 제거되도록 조작되었다. 탈아미드화는 펩티드 또는 단백질에서 구조적 변화 및 기능적 변화를 야기하는 것으로 공지되어 있다. 탈아미드화는 단백질 의약품의 약동학적 특성 및 항원성의 변경뿐만 아니라 생활성의 감소도 초래할 수 있다. (문헌[Anal Chem. 2005 Mar 1;77(5):1432-9]).
본 발명의 특정 실시 형태에서, 항체는 pI를 증가시키고 약물-유사 특성을 개선시키도록 조작되었다. 단백질의 pI는 분자의 전체적인 생물물리학적 특성의 핵심 결정자이다. 낮은 pI를 갖는 항체는 덜 가용성이고, 덜 안정하고, 응집되기 쉬운 것으로 공지된 바 있다. 또한, 낮은 pI를 갖는 항체의 정제는 어려우며, 특히 임상적 사용을 위한 규모 확대 중에 문제시될 수 있다. 본 발명의 항-β-클로토 항체, 또는 Fab의 pI의 증가는 이의 용해성을 향상시켜서, 항체가 더 높은 농도(>100 mg/ml)로 제형화되는 것을 가능하게 하였다. 항체를 고농도(예를 들어 >100 mg/ml)로 제형화하는 것은 더 높은 용량의 항체를 유리체내 주입을 통하여 환자의 눈 내에 투여할 수 있다는 장점을 제공하는데, 이는 다시 심혈관 장애를 비롯한 만성 질환의 치료에 있어서 상당한 장점인 투약 빈도 감소를 가능하게 할 수 있다. 또한 더 높은 pI는 IgG 버전의 항체의 FcRn-매개 재활용을 증가시켜서 약물이 체내에서 더 오랜 지속 기간 동안 지속되는 것을 가능하게 하여서 더 적은 주입을 요구할 수 있다. 마지막으로, 전체 항체 안정성은 더 높은 pI로 인하여 유의하게 향상되어서 더 긴 보관 수명 및 생체 내 생활성으로 이어진다. 바람직하게는, 상기 pI는 8.2 이상이다.
변경된 항체의 기능적 특성은 본 기술 분야에서 이용가능하고/하거나 본원에 기술된 표준 분석법, 예컨대 실시예에 개시된 것들(예컨대 ELISA)을 사용하여 평가될 수 있다.
예방적 및 치료적 용도
본원에 기술된 바와 같은 β-클로토 결합 항체(예를 들어, NOV005 또는 NOV006) 및 이의 항원 결합 단편은 비정상적 FGF21 신호전달(예를 들어, FGF21-매개 신호전달 및/또는 FGF21 수용체 신호전달의 비정상적 활성화)과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 위하여 치료적으로 유용한 농도로 사용될 수 있으며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편, 예를 들어, NOV005 또는 NOV006을 투여함에 의한 것이다. 본 발명은 FGF21-관련 대사 장애의 치료 방법을 제공하며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체, 예를 들어, NOV005 또는 NOV006을 투여함에 의한 것이다. 본 발명은 FGF21-관련 심혈관 장애의 치료 방법을 제공하며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체, 예를 들어, NOV005 또는 NOV006을 투여함에 의한 것이다.
본 발명의 항체(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)는 특히, 대사 장애, 내분비 장애 및 심혈관 장애, 예컨대 비만, 제1형 및 제2형 진성 당뇨병, 췌장염, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비알코올성 지방간염(NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 고트리글리세리드혈증, 대사 증후군, 급성 심근 경색, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성 동맥 경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 관상동맥성 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병 합병증, 신경병증, 위마비, 인슐린 수용체에서의 심각한 불활성화 돌연변이와 연관된 장애, 및 기타 대사 장애를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 FGF21 관련 병태 또는 장애의 치료, 예방 및 개선과, 중환자의 사망률 및 이환율의 감소에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)는 특히, 인슐린 저항성과 연관된 대사성 질환, 예컨대 제2형 진성 당뇨병, 제1형 진성 당뇨병, 인슐린 수용체 돌연변이 장애(INSR 장애, 예를 들어 B형 인슐린 저항성), 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 및 다양한 형태의 부분 지방이영양증(가족성 부분 지방이영양증 및 HIV-고활성 항레트로바이러스 치료법(HIV-HAART) 유도성 부분 지방이영양증을 포함함)과, 인슐린 생산과 연관된 질환(예를 들어, 제1형 진성 당뇨병)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 다수의 질환, 장애, 또는 병태의 치료, 진단, 개량, 개선, 또는 예방과, 중환자의 사망률 및 이환율의 감소에 사용될 수 있다.
INSR의 다수의 불활성화 돌연변이가 다양한 표현형과 함께 기술된 바 있다. 전형적으로, 환자는 사춘기에 고혈당증으로 진행하는 중증 인슐린 작용 저항성을 나타낸다. 현재의 케어 표준은 대상체가 고혈당이 된 경우 매우 높은 용량의 인슐린을 이용한 치료인데, 이는 전형적으로 고혈당증의 제어에 있어서 부적당하다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)는 특히, 제1형 진성 당뇨병, 이상지질혈증, 고혈당증, 저혈당, 포도당 불내성, 고트리글리세리드혈증, 또는 HIV-HAART 유도성 부분 지방이영양증의 치료 또는 관리에 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 FGF21 관련 장애의 예방, 치료 또는 개선을 위한 다른 에이전트와 병용될 수 있다. 예를 들어, 심혈관 또는 대사 장애 환자의 치료를 위하여 스타틴 요법제가 본 발명의 FGF21 모방 항체 및 항원 결합 단편과 병용될 수 있다.
특정 양태에서, 대상체에서 체중을 (예를 들어, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%,적어도 12%, 적어도 15%, 또는 적어도 20%) 감소시키는 방법이 본원에 제공되며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 β-클로토에 결합하여 β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시킬 수 있는 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 대상체에서 식욕 또는 식품 섭취를 (예를 들어, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%,적어도 12%, 적어도 15%, 또는 적어도 20%) 감소시키는 방법이 본원에 제공되며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 β-클로토에 결합하여 β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시킬 수 있는 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 대상체에서 혈장중 트리글리세리드(TG) 농도 또는 혈장중 총 콜레스테롤(TC) 농도를 (예를 들어, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%,적어도 12%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%) 감소시키는 방법이 본원에 제공되며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 β-클로토에 결합하여 β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시킬 수 있는 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 제공된 방법의 특정한 양태에서, 대상체는 대사 장애, 예컨대 비만, 제1형 및 제2형 진성 당뇨병, 췌장염, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 고트리글리세리드혈증, 및 대사 증후군을 앓고 있다. 본원에 제공된 방법의 특정한 양태에서, 대상체는 심혈관 장애를 앓고 있다. 특정 양태에서, 대상체는 인간이다.
특정 양태에서, 대상체에서 비만을 치료하거나 관리하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 β-클로토에 결합하여 β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시킬 수 있는 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 대상체에서 제2형 당뇨병을 치료하거나 관리하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 β-클로토에 결합하여 β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시킬 수 있는 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 대상체에서 제1형 당뇨병을 치료하거나 관리하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 β-클로토에 결합하여 β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시킬 수 있는 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 대상체에서 지방이영양증, 예컨대 HIV-HAART 유도성 부분 지방이영양증을 치료하거나 관리하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 β-클로토에 결합하여 β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시킬 수 있는 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 대상체에서 NASH를 치료하거나 관리하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 β-클로토에 결합하여 β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시킬 수 있는 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 대상체에서 인슐린 수용체 돌연변이 장애를 치료하거나 관리하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에게 β-클로토에 결합하여 β-클로토/FGFR1c 수용체 복합체의 활성을 증가시킬 수 있는 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, NOV005 또는 NOV006)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
제약 조성물
본 발명은 제약상 허용가능한 담체와 함께 제형화된 β-클로토-결합 항체(온전한 항체 또는 결합 단편)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 조성물은 예를 들어 심혈관 장애의 치료 또는 예방에 적합한 하나 이상의 다른 치료제를 추가로 함유할 수 있다. 제약상 허용가능한 담체는 조성물을 증강시키거나 안정화시키거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 제약상 허용가능한 담체는 생리학적으로 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 본 기술 분야에 공지된 다양한 방법들에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 투여 방식은 요망되는 결과에 따라 다르다. 투여는 유리체내, 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하 투여이거나, 표적 부위에 근접하여 투여되는 것이 바람직하다. 제약상 허용가능한 담체는 유리체내, 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 상피 투여(예컨대 주사 또는 주입에 의함)에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 이중특이성 및 다중특이성 분자는, 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용 및 다른 천연 조건으로부터 이러한 화합물을 보호하기 위한 물질 내에서 코팅될 수 있다. 특정한 양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한, 본원에 개시된 β-클로토-결합 항체, 예컨대 항체 NOV005 또는 NOV006을 포함하는 제약 조성물은 피하 투여된다. 특정한 양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한, 본원에 개시된 β-클로토-결합 항체, 예컨대 항체 NOV005 또는 NOV006을 포함하는 제약 조성물은 정맥내 투여된다.
조성물은 살균되고 유체이어야 한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨 및 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직하다. 주사 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 에이전트, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 유발될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 본 기술 분야에 잘 알려져 있고 일상적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000]; 및 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다. 제약 조성물은 바람직하게는, GMP 조건 하에 제조된다. 전형적으로, 치료적 유효 용량 또는 효과적인 용량의 β-클로토-결합 항체가 본 발명의 제약 조성물에 이용된다. β-클로토-결합 항체는 당업자에게 공지된 종래의 방법에 의해 제약상 허용가능한 투여 형태로 제형화된다. 투여 요법(dosage regimen)은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료적 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단회 볼루스(bolus)가 투여될 수 있으며, 몇몇 분할된 용량들이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 응급성에 의해 지시된 바와 같이 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 특히, 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 유리하다. 본원에서 사용되는 바와 같이 투여 단위 형태는, 치료받을 대상체를 위한 일원화 투여형으로 적합한 물리적으로 별개인 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 제약적 담체와 결부되어 요망되는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이지 않으면서, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 요망되는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변화될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 이용되는 본 발명의 특정 조성물 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 지속 기간, 이용되는 특정 조성물과 병용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 상태 및 과거 병력 및 유사한 요인들을 포함하는 다양한 요인들에 따라 달라진다.
의사 또는 수의사는, 제약 조성물에 이용되는 본 발명의 항체의 용량을 요망되는 치료 효과를 달성하는 데 필요한 용량보다 더 낮은 수준에서 시작하고, 요망되는 효과가 달성될 때까지, 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본원에 기술된 심혈관 장애의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약제, 및 치료가 예방적인지 치료적인지의 여부를 포함하여 많은 상이한 요인들에 따라 다르다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 필요가 있다. 특정 실시 형태에서, 항체를 이용한 전신 투여에 있어서, 투여량은 숙주 체중 1 kg당 약 0.0001 내지 100 mg, 또는 0.01 내지 15 mg의 범위이다. 예시적인 치료 요법은 격주로 1회, 또는 1개월에 1회, 또는 매 3개월 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반한다. 예시적인 치료 요법은 격주로 1회, 또는 1개월에 1회, 또는 매 3개월 내지 6개월마다 1회, 또는 필요에 따른(PRN) 전신 투여를 수반한다.
항체는 통상, 여러번 투여된다. 단회 투여량 사이의 간격은 주, 월 또는 년일 수 있다. 간격은 또한, 환자에서 β-클로토-결합 항체의 혈중 수준을 측정함으로써 나타난 바와 같이 불규칙할 수 있다. 게다가, 대안적인 투약 간격은 의사에 의해 결정되고 매달 또는 필요에 따라 투여되어 효과적이게 될 수 있다. 일부 전신 투여 방법에서, 투여량은 1 내지 1000 μg/ml, 일부 방법에서는 25 내지 500 μg/ml의 혈장중 항체 농도를 달성하기 위해 조정된다. 대안적으로, 항체는 지속 방출 제형으로 투여될 수 있으며, 이러한 경우, 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투여량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 다르다. 일반적으로, 인간화된 항체는 키메라 항체 및 비인간 항체보다 긴 반감기를 보여준다. 투여량 및 투여 빈도는, 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 다를 수 있다. 예방적 적용에서, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 저빈도의 간격으로 투여된다. 일부 환자는 이들의 삶의 남은 기간 동안 치료를 계속 받는다. 치료적 적용에서, 질환 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적인 또는 완전한 개선을 보여줄 때까지, 비교적 높은 투여량이 비교적 짧은 간격으로 이따금 필요하다. 그 후에, 환자는 예방적 요법을 투여받을 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서 본 발명을 더 예시하기 위해 제공된다. 본 발명의 다른 변화는 당업자에게 쉽게 자명해질 것이고, 첨부된 청구범위에 포함된다.
실시예 1: 항체 스크리닝 및 생산
항원으로 사용하기 위한 인간 FGFR1c_β-클로토_300.19 세포의 제조
인간 FGFR1c(1-386 aa) 및 β-클로토를 안정하게 발현하는 300.19 세포를 전세포 항원으로 사용하기 위해 생성하였다. 인간 β-클로토를 인코딩하는 전장 cDNA(GenBank 기탁 번호 NM_175737)를 pEF1/Myc-His B(Invitrogen 카탈로그 번호 V92120)의 EcoRI 및 EcoRV 부위내로 클로닝하였다. 인간 FGFR1c의 아미노산 1-386을 인코딩하는 cDNA(GenBank 기탁 번호 NM_023106)를 pEF6/Myc-His B(Invitrogen, Cat. number V96220)의 BamHI 및 NotI 부위 내로 클로닝하였다. 두 구축물 모두에서 코작(Kozak) 서열(CACC)을 개시 코돈 바로 전에 포함시켰으며 벡터에서 Myc-His 태그 전에 정지 코돈을 추가하였다. 쥣과 pre-B 300-19 세포를 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector) 장치 및 뉴클레오펙터 키트(Lonza, 카탈로그 번호 VCA-1003)를 이용한 전기천공에 의해 β-클로토 및 FGFR1c 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 3주 동안 1 mg/ml 제네티신(Geneticin)(Invitrogen, 카탈로그 번호 10131) 및 8 ㎍/ml 블라스티시딘(Blasticidin)(Invitrogen, 카탈로그 번호 46-1120)을 이용하여 안정한 클론을 선발하였다.
세포 분석에서 사용하기 위한 FGFR/β-클로토-발현 HEK293 세포의 제조
β-클로토 항체의 결합 특이성, 기능적 활성 또는 오르토로그 교차반응성을 테스트하기 위하여, 인간 FGFR1c_β-클로토, 인간 FGFR2c_β-클로토, 인간 FGFR3c_β-클로토, 인간 FGFR4_β-클로토, 또는 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 표준 리포펙타민 2000 형질감염 및 세포 클론 선발 방법을 이용하여 생성하였다.
전장 인간 β-클로토(NM_175737), 인간 FGFR1c(NM_023106), 인간 FGFR2c(NP_001138387), 인간 FGFR3c (NP_000133), 또는 인간 FGFR4(NP_998812) cDNA를 인코딩하는 하기 포유류 발현 플라스미드를 이용하였다: 시노몰구스 원숭이 β-클로토를 위해, 인간 및 붉은털 원숭이 β-클로토 서열에 기초한 프라이머를 이용하여 시노몰구스 원숭이 지방 조직 cDNA(BioChain, 카탈로그 번호 C1534003-Cy)로부터 전장 서열을 PCR 증폭시키고, 클로닝하였다. 시노몰구스 원숭이 FGFR1c cDNA는 인간 FGFR1c 서열(#NM_023106)을 기반으로 한 프라이머를 이용하여 시노몰구스 원숭이 지방 조직 cDNA(BioChain, 카탈로그 번호 C1534003-Cy)로부터 클로닝하였으며 아미노산 수준에서 인간 FGFR1c와 100% 동일한 것으로 나타났다. 따라서, 인간 및 시노몰구스 원숭이 FGFR1c 아미노산 서열이 동일하므로, 시노몰구스 원숭이 β-클로토 및 인간 FGFR1c(#NM_023106)를 안정하게 발현하는 HEK293 세포를 만들기 위하여 상기에 개시한 인간 FGFR1c cDNA 구축물을 이용하였다.
β-클로토에의 항체의 결합 친화성의 결정
항체의 결합 친화성은 Biacore 동적 분석을 이용하여 결정하였다. 시리즈(Series) S 센서 칩 CM5(GE Healthcare, 카탈로그 번호 BR-1005-30)를 약 30분 동안 주위 온도에 평형화시켰다. 시스템을 1x HBS-EP+ 완충제(10x 용액, GE Healthcare, 카탈로그 번호 BR-1006-69)로 프라임시키고 칩을 Biacore 장비내로 로딩하였다. BIAnormalizing(GE Healthcare, 카탈로그 번호 BR-1006-51) 용액을 이용하여 칩을 정규화시키고 모든 유동 경로에 대해 60 μL/분의 유속을 이용하여 50 mM NaOH로 칩을 컨디셔닝하였다. 60초의 대기 시간을 가지고 30초 주입을 3회 반복하였다. 10 mM 소듐 아세테이트 pH 5.0을 120초 동안 60 μL/분으로 주입하고 2회 반복하였다. 그 후 인간 항체 포획 키트(GE Healthcare, 카탈로그 번호 BR-1008-39)를 이용하여 항-인간 IgG Fc를 고정시키기 위해 새로운 사이클을 시작하였다. 항-인간 Fc Ab를 고정 완충제(10 mM 소듐 아세테이트 pH 5.0)에서 50 ㎍/mL로 희석시켰다. 아민 커플링 시약을 1:1(EDC 및 NHS) 혼합하고 10μL/분으로 7분 동안 주입하였다. 그 후 항-인간 Fc Ab를 10μL/분으로 6분 동안 주입하였다. 마지막으로 60초의 대기 시간으로 에탄올아민을 10 μL/분으로 7분 동안 주입하였다. 이로써 약 8000~10000 RU로 고정될 것이다. 그 후 NOV004, NOV005 및 NOV006에 대해 10 RU의 Rmax(포획 수준 = 대략 28 RU)를 위해 테스트 주입을 수행하였다. 이것은 10 uL/mL의 유속 및 3 M MgCl2 재생 완충제를 이용하여 이루어졌다. 칩 표면에서의 변화, IgG의 친화성, IgG 단백질 품질, 및 희석의 차이로 인해 각 유동 세포를 매번 평가하였다. 본 발명자들은 0.5 ug/mL의 IgG 농도로 시작하였으며 샘플 주입으로부터의 결과에 따라 농도를 증가(또는 감소)시켰다. 예를 들어, 만일 15초에 100 RU가 관찰되면, Ab 용액을 0.25 ug/mL로 희석시키고 주입을 반복하였다. 각 유동 세포에서 각 항체에 대한 포획 파라미터가 결정된 후, 다양한 농도의 인간 β-클로토를 칩상에 통과시키고 Biacore 동력학에 의해 ka(1/Ms), kd(1/s), KD(M), 및 Rmax(RU)를 계산하였다.
상이한 항체가 β-클로토에 경쟁적으로 결합하는지 여부의 결정
포르테 바이오(Forte Bio)를 이용하여 항체가 인간 β-클로토에 경쟁적으로 결합하는지 여부를 결정하였다. 모든 샘플과 시약은 PBS 완충제를 가진 10x 동력학 완충제(Forte Bio 카탈로그 번호 18-1092)에서 1/10 (v/v) 비율로 희석시켰다. 인간 β-클로토 (R and D Systems 5889-KB-050)는 동력학 완충제로 원하는 농도(5 ug/ml)로 희석시켰다. 인간 β-클로토를 20초 동안 항-his 센서(Forte Bio, 카탈로그 번호 18-5114) 상에 로딩한 후, 포화 조건이 도달될 때까지(200 nM) 항체 1을 400초 동안 센서 상에 로딩하였다. 마지막으로 경쟁 항체를 200 nM 항체 1의 존재하에서 200 nM로 100초 동안 센서 상에 로딩하였다. 제2 결합 신호의 부재는 항체들이 인간 β-클로토에의 결합에 대하여 경쟁함을 나타낸다.
pERK 세포 분석을 이용한 FGFR_β-클로토 수용체 활성화 측정
세포 배양을 위해 그리고 포스포-ERK 1/2(pERK) 수준을 측정하기 위해 표준 기술을 이용하였다. 요약하면, 인간 FGFR1c_β-클로토, 인간 FGFR2c_β-클로토, 인간 FGFR3c_β-클로토, 인간 FGFR4_β-클로토, 또는 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토를 안정하게 발현하는 HEK293 세포를 5% CO2에서 37℃에서 10% FBS(Hyclone, SH30071), 블라스티시딘(Invitrogen, A1113902), 및 제네티신(Invitrogen, 10131035)을 함유하는 DMEM 배지(Invitrogen, 11995)에서 유지하였다. 세포를 384웰 폴리-D-리신-코팅 플레이트(BD Biosciences, 354663)내로 도말하고 5% CO2에서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후 혈청-고갈시켰다.
하이브리도마 상청액 또는 β-클로토 항체를 프리스타일(Freestyle) 293 배지에서 희석시키고 다양한 농도의 항체를 플레이트에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, 그 후 용해 완충제로 용해시켰다. 세포 용해물을 384웰 분석 플레이트(PerkinElmer, 카탈로그 번호 6008280)로 옮기고 알파스크린 슈어파이어(AlphaScreen SureFire)TM pERK 1/2 키트(Perkin Elmer, TGRES10K)를 이용하여 포스포-ERK 1/2 수준을 측정하였다. 플레이트를 EnVision 2104 멀티-라벨 판독기(Perkin Elmer)에서 표준 알파스크린 세팅을 이용하여 판독하였다. 용량-반응 데이터를 기본 대 단백질 농도에 대해 pERK 활성 배수로서 그래프를 그려서 식 Y = Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X) x HillSlope)) 및 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 결정하였다.
단클론 항체의 제조
항-인간-β-클로토 항체는 본질적으로 문헌[Dreyer et al (2010)(Dreyer AM et.al.(2010) BMC Biotechnology 10:87)]에 개시된 대로 전세포 면역화에 의해 Balb/c(Jackson Laboratory 유형(strain):BALB/cJ) 또는 Bcl2 22 wehi(Jackson Laboratory 유형:C.Cg-Tg(BCL2)22Wehi/J) 마우스에서 생성하였다.
요약하면, 1x107 인간 FGFR1c_β-클로토_300.19 세포를 10 내지 30일 간격으로 Balb/c 마우스내로 6회 주입하였다. 제1 전세포 주입은 프로인트 완전 아쥬반트(Sigma-Aldrich F5881)를 이용하여 이루어졌다. 세포 및 아쥬반트는 혼합되지 않았고, 두 개의 가깝지만 구별되는 피하 부위에 개별적으로 주입되었다. 이후에 시그마 아쥬반트 시스템(Sigma Adjuvant System)(Sigma-Aldrich S6322)과 또는 아쥬반트 없이 동일한 세포의 복강내 주입이 이어졌다.
Bcl2 22 wehi 마우스를 이용하여, 1x107 인간 FGFR1c_β-클로토_300.19 세포를 7일 간격으로 이들 동물에게 4회 주입하였다. 제1 주입은 프로인트 완전 아쥬반트(Sigma-Aldrich F5881)를 이용하여 이루어졌다. 세포 및 아쥬반트는 두 개의 가깝지만 구별되는 피하 부위의 두 세트 내로 개별적으로 주입되었다. 세포의 후속 주입은 아쥬반트 없이 피하로 이루어졌다.
면역화된 마우스에서 면역 반응은 형광-활성화 세포 분류(FACS) 분석에 의해 측정하였다. 1,000배 또는 10,000배 희석된 면역 마우스로부터의 혈청을 이용하여 인간 FGFR1c_β-클로토_HEK 및 인간 FGFR1c_β-클로토_300.19 세포를 염색하고, 이어서 알로피코시아닌(APC) 이차 항-쥣과 IgG 검출 항체(Jackson ImmunoResearch 카탈로그 번호 115-136-071)로 염색하였다. 형광을 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) LSRII 또는 포레사(Foressa) 유세포분석기에서 판독하였다. 최고 역가를 가진 4마리 마우스를 전기융합을 위해 선택하였다.
하이브리도마 스크리닝, 서브클로닝 및 선택
2x108 비장세포 및 5x107 융합 파트너 F0 세포(ATCC, CRL-1646)를 Cytofusion Medium(LCM-C, Cyto Pulse Sciences)에서 세척하고 600 볼트의 피크 펄스로 제조사의 설명서에 따라 Hybrimune Waveform Generator(Cyto Pulse Sciences, 모델 CEEF-50B)를 이용하여 융합시켰다. 세포를 웰당 3,000개의 F0 세포의 계산된 밀도로 384웰 플레이트내에 도말하고 HAT 선발 배지(Sigma-Aldrich Cat.H0262)에서 배양하였다.
일차 스크린은 고처리량 FACS 플랫폼(문헌[Anderson, Paul. Automated Hybridoma Screening, Expansion, Archiving and Antibody Purification.In:3rd Annual 2014 SLAS Conference. Jan. 18-22, 2014, San Diego, CA])을 이용하여 수행하였다. 요약하면, 하이브리도마 상청액을 인간 FGFR1c_β-클로토 안정 발현 및 비-발현 세포주와 인큐베이션하고 항체 결합을 항-쥣과 IgG-APC 이차 항체(Jackson ImmunoReseach 카탈로그 번호 115-136-071)로 결정하였다.
각 하이브리도마 상청액으로부터의 항체를 4가지의 바코드 세포주 300.19 모 세포, 인간_FGFR1c_β-클로토_300.19 세포, 모 HEK 293 세포, 및 인간 FGFR1c-β-클로토_HEK 293 세포에 대해 동시에 결합에 대해 테스트하였다. 일차 스크린에서 348 히트가 선택되었다. 일차 히트를 96웰 플레이트에서 확장시키고 결합은 FACS에 의해 인간 FGFR1c_β-클로토_HEK 293 세포에서 다시 확인하여 122 확인 히트를 수득하였다. 115 FACS 결합 재확인 히트의 HAT(하이포잔틴-아미노프테린-티미딘) 배지-함유 상청액을 본 명세서에 개시된 포스포-ERK 1/2 분석을 이용하여 인간 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체의 세포 활성화에 대해 프로파일링하였다.
그들의 상청액에서 최고의 포스포-ERK 1/2 세포 활성을 가진 하이브리도마를 증식시키고 그들의 상청액으로부터 IgG를 정제하였다. 74개 하이브리도마로부터 정제된 IgG를 실시예 2에 개시된 포스포-ERK 1/2 분석을 이용하여 인간 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체의 세포 활성화에 대해 프로파일링하였다. 인간 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체의 포스포-ERK 1/2 활성화에 대해 최상의 효능을 가진 하이브리도마로부터의 IgG를 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체에의 오르토로그 교차-반응성 및 인간 FGFR2c_β-클로토 및 인간 FGFR3c_β-클로토 수용체 복합체에 대한 선택성에 대해 실시예 2에 개시된 포스포-ERK 1/2 분석을 이용하여 프로파일링하였다. 이들 프로파일링 결과에 기초하여, 추가 프로파일링을 위해 몇몇 하이브리도마 클론, 예를 들어, 127F19를 선발하였다. 구체적으로, 클론 127F19와 같은, 가장 강력한 정제된 IgG를 교차-반응성에 대해 프로파일링하였으며 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토를 활성화시키지만; 인간 FGFR2c_β-클로토, FGFR3c_β-클로토, FGFR4_β-클로토 또는 클로토_FGFR를 활성화시키지 않는 것으로 나타났다. 선발된 IgG, 예를 들어, 클론 127F19는 β-클로토 또는 FGFR1c_β-클로토 발현 세포에는 결합하지만 FGFR1c 단독 발현 세포에는 결합하지 않았다.
α-클로토를 발현하는 세포에서 127F19 신호전달을 평가하기 위하여, HEK293 세포를 α-클로토, Egr1-루시퍼라아제 및 레닐라 루시퍼라아제로 형질감염시켰다. 요약하면, HEK293 세포를 DMEM, 10% FBS에서 배양하고 30000 세포/웰로 도말하고 리포펙타민 2000을 이용하여 클로토, Egr-1-luc 및 TK-Rennila로 형질감염시켰다. 다음날, FGF23, FGF21, 및 127F19를 0.1% FBS로 보충된 DMEM에서 표시된 농도로 희석시키고 형질감염된 세포에 하룻밤 첨가하였다. 루시퍼라아제 활성을 제조사의 설명서에 따라 듀얼-글로(Dual-Glo) 루시퍼라아제 분석 키트(Promega, E2920)에 의해 검출하였다. 예상한 대로, 그의 신호전달을 위하여 α-클로토 발현을 요구하는 FGF23은 강한 루시퍼라아제 발현을 나타냈다. 하지만, FGF21 또는 127F19는 어떤 유의한 루시퍼라아제 발현도 나타내지 않아, α-클로토가 FGF21 또는 이들 FGF21 모방 항체를 위해 공동-수용체로서 작용하지 않음을 제안한다.
단클론 항체의 인간화 및 친화성-성숙
인간화
인간화 과정은 본 기술 분야에 잘 개시되어 있다(문헌[Jones PT et al.1986 Nature 321:522-525]; 문헌[Queen C et al.(1989) PNAS USA 86:10029-10033]; 문헌[Riechmann L et al.(1988) Nature 33:323-327]; 문헌[Verhoeyen M et al.(1988) Science 239:1534-1536]). 용어 인간화는 비-인간 항체, 예를 들어, 쥣과 유래 항체의 항원 결합 부위를 인간 수용자 프레임워크, 예를 들어, 인간 생식세포 계열 서열(문헌[Retter I et al.(2005). Nucleic Acids Res.33: D671-D674])에 전달하는 것을 설명한다.
항체의 인간화에 대한 주요 이유는 인간에서 항체에 대한 면역성 반응을 일으킬 위험을 최소화하는 것이다(문헌[Rebello PR et al.(1999) Transplantation 68:1417-1420]). 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDR)(문헌[Chothia C and Lesk AM (1987) Journal of Molecular Biology 196:901-917]; 문헌[Kabat E et al.(1991) Anon.5th Edition ed; NIH Publication No. 91:3242]) 및 CDR 외부의, 즉, 결합에 직접 또는 간접적으로 영향을 미치는 가변 도메인(VL 및 VH)의 프레임워크 영역내의 위치를 포함한다. 결합에 직접적으로 영향을 미칠 수 있는 프레임워크 잔기는, 예를 들어 CDR2와 CDR3 사이에 위치하는 소위 "외부" 루프 영역에서 발견될 수 있다. 결합에 간접적으로 영향을 미치는 잔기는 예를 들어, 소위 베르니에르 존(Vernier Zones)(문헌[Foote J, Winter G. (1992) Journal of Molecular Biology 224:4 87-499])에서 발견된다. 이들은 CDR 입체형태를 지지하는 것으로 생각된다. CDR 외부의 그러한 위치는 프레임워크 영역 내 인간 생식계 수여자 서열에 대한 최종 인간화 항체의 편차의 수를 최소화하도록 적합한 수용자 프레임워크를 선택할 때 고려된다.
경쇄 및 중쇄 둘 모두의 인간화에 대해 다수의 인간 생식계 수용자 프레임워크를 테스트하였다. 예를 들어, 인간 프레임워크 VBase_VH4_4-30.1 및 VBase_VH3_3-21을 중쇄의 인간화에 대해 테스트하였으며, 인간 프레임워크 VBase_VK1_O18 및 VBase_VK3_L25를 경쇄의 인간화에 대해 테스트하였다.
서열 최적화 친화성 성숙
일부 아미노산 서열 모티프는 당화(즉, NxS/T, x P외의 임의의 것), 유리 시스테인의 산화, 탈아미드화(예를 들어, NG) 또는 이성질체화(예를 들어, DG)와 같은 번역후 변형(PTM)을 겪는 것으로 알려져 있다. 만일 CDR 영역에 존재하면, 이들 모티프는 이상적으로는 생성물 균질성을 증가시키기 위하여 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 제거된다.
친화성 성숙의 과정은 본 기술 분야에서 잘 개시되어 있다. 많은 디스플레이 시스템 중에서, 파지 디스플레이(문헌[Smith GP, 1985, Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228:1315-1317]) 및 효모와 같은 진핵 세포상의 디스플레이(문헌[Boder ET and Wittrup KD, 1997, Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nature Biotechnology 15:553-557])가 항체-항원 상호작용을 위해 선발하기 위해 가장 일반적으로 적용되는 시스템으로 보인다. 이들 디스플레이 시스템의 이점은 그들이 광범위한 항원에 적합하며 선발 엄격성이 쉽게 조정될 수 있다는 것이다. 파지 디스플레이에서는, scFv 또는 Fab 단편이 디스플레이될 수 있으며 효모 디스플레이에서는 추가로 전장 IgG가 디스플레이될 수 있다. 일반적으로 적용되는 이들 방법은 10E7보다 큰 다양성을 가진 더 큰 라이브러리로부터 원하는 항체 변이체의 선발을 허용한다. 10E3과 같은 작은 다양성을 가진 라이브러리는 미세-발현 및 ELISA에 의해 스크린될 수 있다. 비-표적화된 또는 무작위 항체 변이체 라이브러리는 예를 들어, 실수-유발 PCR(문헌[Cadwell RC and Joyce GF, 1994, Mutagenic PCR.PCR Methods Appl.3:S136-S140])에 의해 생성될 수 있으며 매우 간단하지만 때로는 제한된 접근을 제공한다. 다른 전략은 항체 후보의 CDR 지시된 다양화이다. 하나 이상의 CDR내의 하나 이상의 위치가 예를 들어 축퇴 올리고(문헌[Thompson J et al., 1996, Affinity maturation of a high-affinity human monoclonal antibody against the third hypervariable loop of human immunodeficiency virus: use of phage display to improve affinity and broaden strain reactivity.J.Mol.Biol.256:77-88]), 트리뉴클레오티드 돌연변이유발(TRIM)(문헌[Kayushin AL et al., 1996, A convenient approach to the synthesis of trinucleotide phosphoramidites--synthons for the generation of oligonucleotide/peptide libraries. Nucleic Acids Res.24:3748-3755]) 또는 본 기술 분야에 알려진 임의의 다른 접근법을 이용하여 특이적으로 표적화될 수 있다. PTM을 제거하기 위하여 인간화 후보에게 아미노산 변형이 이루어졌다.
발현 플라스미드의 생성
호모사피엔스를 위한 코돈 최적화를 비롯하여, 인간화 VL 및 VH 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 진아트(GeneArt)™(독일 레겐스부르크의 Life Technologies Inc.)에 주문하였다. 진아트 유래 벡터로부터 포유류 세포에서의 분비에 적합한 발현 벡터내로의 잘라 붙이기에 의해 VL 및 VH 도메인을 코딩하는 서열을 서브클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄를 개별 발현 벡터내로 클로닝하여 공동-형질감염을 허용하였다. 발현 벡터의 요소는 프로모터(사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서-프로모터), 분비를 촉진하기 위한 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결자(소 성장 호르몬(BGH) 유전자), 에피솜 복제 및 원핵세포에서의 복제를 허용하는 요소(예를 들어, SV40 오리진 및 ColE1 또는 본 기술 분야에 알려진 기타) 및 선발을 허용하는 요소(암피실린 내성 유전자 및 제오신 마커)를 포함한다.
인간화 항체 후보의 발현 및 정제
SV40 대형 T 항원을 구성적으로 발현하는 인간 배아 신장 세포(HEK293-T ATCC11268)는 인간화 및/또는 최적화 IgG 단백질의 일시적 발현을 위해 일반적으로 사용되는 숙주 세포주 중 하나이다. 형질감염은 형질감염 시약으로서 PEI(폴리에틸렌이민, MW 25.000 선형, Polysciences, USA 카탈로그 번호 23966)를 이용하여 수행하였다.
첫번째 정제는 HiTrap ProtA MabSelect®SuRe 컬럼에서의 친화성에 의해 수행하였다. 용출액을 응집(SEC-MALS) 및 순도(SDS-PAGE, LAL 및 MS)에 대해 테스트하였다. 필요하면, 첫번째 정제로부터의 풀을 SPX(Hi Load 16/60 Superdex 200 등급 120 mL(GE-Helthcare)에 로딩하였다. NOV004, NOV005, 및 NOV006은 마우스 하이브리도마 127F19로부터 유래된 인간화 mAb이다. IgG1 L234A/L235A(LALA) 또는 IgG1κ D265A/P329A(DAPA) 이소타입은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및 보체-의존성 세포독성(CDC)을 촉진하는 항체 능력을 감소시키기 위한 예방책으로서 선발하였다(예를 들어, 문헌[Hezareh M et al.(2001) Journal of Virology 75:12161-12168] 참고). IgG1(DAPA) 이소타입인 인간화 후보 NOV004, NOV005, 및 NOV006을 개시된 대로 발현시키고 정제하였다.
실시예 2: 단클론 항체의 생체외 특성규명
NOV004, NOV005, 및 NOV006의 결합 및 세포 활성 특성을 보여주기 위하여 생체외 작업이 이루어졌다. 실시예 1에서 개시된 Biacore를 이용하여 인간 β-클로토에의 mAb의 KD를 추정하였다. NOV004, NOV005, 및 NOV006은 각각 약 3xE-10M, 3xE-10M, 및 4xE-10M로 계산된 KD를 가진다.
실시예 1에 개시된 pERK 분석을 이용하여 FGFR_β-클로토 수용체 활성에 대해 mAb를 프로파일링하였다. NOV004는 각각 약 3 nM 및 20 nM로 계산된 EC50으로 인간 및 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화하였다(도 1). NOV005는 각각 약 3 nM 및 16 nM로 계산된 EC50으로 인간 및 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화하였다(도 1). NOV006은 각각 약 4 nM 및 18 nM로 계산된 EC50으로 인간 및 시노몰구스 원숭이 FGFR1c_β-클로토 수용체 복합체를 활성화하였다(도 1). NOV005, NOV006, 및 NOV006은 인간 FGFR2c_β-클로토, FGFR3c_β-클로토, 또는 FGFR4_β-클로토 수용체 복합체를 활성화하지 않았다(도 2). 실시예 1에 개시된 대로 FGF23 활성에 대해 mAb를 프로파일링하였다. NOV005, NOV006, 및 NOV004는 FGF23 활성을 나타내지 않았다(도 3). 포르테 바이오 데이터는 NOV005 및 NOV006이 인간 β-클로토에의 결합을 위해 NOV004와 경쟁함을 보여준다(도 4).
인간 IgG1-LALA 이소타입을 가진 NOV004의 버전을 가진 인간 β-클로토 세포외 도메인의 수소 중수소 교환에 의한 에피토프 매핑 연구는 하기 펩티드: 246~265, 343~349, 421~429, 488~498, 509~524, 536~550, 568~576, 646~669, 773~804, 834~857, 및 959~986 aa가 mAb-β-클로토 ECD 복합체에서 유의하게 보호되며; 하기 영역: 246~265, 536~550, 834~857 및 959~986 aa가 가장 강하게 보호됨을 보여준다(데이터는 예시되어 있지 않음; 그 전체가 참고로 본원에 포함되는 국제 공개 제2017/021893호 참고). 이들 연구는 결합, 활성 및 경쟁 데이터와 함께, NOV005 및 NOV006이 또한 그러한 β-클로토 ECD 영역을 유의하게 보호할 것임을 나타낸다.
실시예 3: 래트에서 단클론 항체의 약동학적 프로파일
동물 및 유지 조건
동물 보호 및 관리는 실험 동물의 보호 및 이용에 대한 안내(Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council)에 따라 제공하였다. 모든 절차는 미국 보건사회복지부에 의해 정해진 표준에 의해 통제되었으며 노바티스 생물의약 연구소(Novartis Institutes for BioMedical Research)(NIBR) 동물 보호 및 이용 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트(n = 3/군)를 자유롭게 물을 자동 제공하도록 구비된 선반위의 고형-바닥 우리에 수용하였으며, 12 hr 명/암 주기(6am에서 6pm까지)에서 유지하고, 표준 설치류 사료(Harlan-Teklad; 메릴랜드주 프레데릭; 카탈로그 번호 8604)에 자유롭게 접근하게 하였다. 사육장은 30 내지 70% 습도로 68 내지 76℉에서 유지하였다.
NOV004, NOV005, 또는 NOV006의 제조 및 투약
10 mM His/His-HCl, 220 mM 수크로스 내의 NOV004, NOV005, 및 NOV006의 스톡 용액을 사용 전에 냉장하에서 해동시켰다. 투약일 아침에, 세 항체를 모두 PBS에서 약 3 mg/mL로 희석시키고 적절한 부피를 투약 시린지내로 넣고(3mL/kg) 투여할 때까지 실온에서 보관하였다. 동물을 튜브 리스트레이너(tube restrainer)에 두고 꼬리 정맥내로의 정맥내(IV) 주사를 통해 NOV004, NOV005, 또는 NOV006을 투여하였다(10 mg/kg).
혈액 샘플 수집
혈액 샘플을 제-3일(기준선), 제0일(투약후 1 및 6 h), 및 투약후 제1, 2, 3, 4, 8, 16 및 28일에 수집하였다. 모든 시점은 제0일에 주어진 용량의 투여 마지막으로부터 측정하였다. 각 시점에, 약 70 ㎕(70 μL)의 혈액을 EDTA가 있는 BD 마이크로테이너(Microtainer) 수집/분리기 튜브(Becton, Dickinson, and Company; 뉴저지주 프랭클린 레이크스; 카탈로그 번호 365973) 내로 수집하였다. 출혈을 멈추기 위하여 거즈로 압력을 가하였다. 샘플을 20,817 x g에서 10분 동안 원심분리한 후, 대략 30 μL 혈장을 0.2 mL 서모-스트립(Thermo-strip) 튜브(Thermo-Scientific; 펜실베니아주 피츠버그; 카탈로그 번호 AB-0451)로 옮기고 80℃에서 동결시켰다. 각 수집 후 래트를 그들의 우리로 돌려보냈다.
혈장중 총 NOV004, NOV005, 또는 NOV006 농도의 측정
래트 혈장 내의 인간 IgG(즉, NOV004, NOV005, 또는 NOV006)는 포획 항체로서 염소 항-인간 Fc-감마 항체(KPL #109-005-098)를 그리고 검출 항체로서 HRP 라벨을 가진 염소 항-인간-IgG를 이용한 맞춤 샌드위치 면역분석을 이용하여 정량하였다. 포획 항체(PBS내에 2 ㎍/mL, 30 μL/웰)를 384웰 백색 미세적정 플레이트(Greiner Bio-One; 미국 노스캐롤라이나주 먼로 소재; 카탈로그 번호 781074)상에 코팅하였다. 플레이트를 교반 없이 실온(RT)에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 세척 없이 코팅 용액을 뽑아낸 후, 90 μL의 1x 밀크 희석제(Milk Diluent)/차단 용액(Blocking solution) (KPL; 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재; 카탈로그 번호 50-82-01)을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 RT에서 2 h 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 마지막에, 용액을 뽑아내고 플레이트를 -80℃에서 건조제를 가진 호일 파우치에 저장하였다.
분석일에, 0.244~4000 pM 범위의 16가지 NOV004, NOV005, 및 NOV006 표준 농도를 카제인 완충제에서의 연속 희석에 의해 준비하였으며 완충제 음성 대조군도 포함하였다. 모든 연구 샘플을 카제인 완충제에서 수동으로 1:50 희석시킨 후 총 3회 희석 동안 바이오멕(Biomek) Fx를 이용하여 연속으로 5배 희석시켰다. 플레이트를 RT에서 2 h 동안 인큐베이션한 후 포스페이트 세척 완충제(90 μL/웰)로 3회 세척하였다. HRP-라벨링된 염소 항-인간-IgG(카제인 완충제내에 400 ng/mL, 30 μL/웰)를 각 플레이트에 첨가하고 플레이트를 RT에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 포스페이트 세척 완충제(90 μL/웰)로 3회 세척한 후, KPL 루미글로(LumiGLO) 화학발광 기질을 첨가하였다(30 μL/웰; 카탈로그 번호 54-61-00). 화학발광은 50 ms 적분 시간으로 모든 파장에서 스펙트라맥스(SpectraMax) M5 플레이트 판독기(Molecular Devices)에서 즉시 판독되었다. 혈장 샘플 내의 인간 Fc 농도(pM)는 NOV004, NOV005, 또는 NOV006 표준 곡선으로부터 내삽하고, 희석 배수를 곱하고, nM 농도로 변환하였다.
동물은 NOV004, NOV005, 또는 NOV006의 IV 투여 후 1 h에 약 200 ㎍/mL의 평균 Cmax를 나타냈다. NOV004, NOV005, 및 NOV006은 스프라그-돌리 래트에서 동등한 PK 프로파일을 나타냈다(도 5).
실시예 4: 개발성 및 제형화의 평가
항체 NOV004, NOV005, 및 NOV006에 대한 생산 공정 및 제형화 연구를 실시하였다. NOV004의 이전 평가 중에 관찰된 고분자량 종(HMW)의 형성은 용액에서의 높은 응집도를 시사하였으며, 비슷한 기능적 활성을 갖지만 더 양호한 생산성 및 제형화 프로파일을 갖는, 예를 들어 HMW 형성이 전혀 또는 거의 관찰되지 않는(예를 들어, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만) 다른 FGF21 모방 항체의 개발 및 평가를 촉발하였다.
호모사피엔스를 위한 코돈 최적화를 비롯하여, 항체 NOV005 및 NOV006을 코딩하는 DNA 서열을 진아트™(독일 레겐스부르크의 Life Technologies Inc.) 및 ATUM(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)에 주문하였다. NOV004, NOV005 및 NOV006을 발현하는 벡터를 선형화하고, CHO 세포주를 형질감염시켰다. >95% 생존성까지 회복될 때까지 10 nM 메토트렉세이트(MTX)를 사용하여 풀을 선발하였다. 각각의 분자를 위한 하나의 풀을 웨이브(wave) 생성용으로 선발하고, 적절하게 규모 확대하였다. 웨이브 생성으로부터의 배양 상청액을 13일 후에 수확하고, 여과하였다.
NOV005 및 NOV006의 웨이브 수확 물질을 표준 항체를 위한 2개 컬럼 크로마토그래피 정제 공정을 이용하여 프로세싱하였다(친화성 크로마토그래피(수지 - GE Healthcare MabSelect SuRe)를 이용하여 포획하고 양이온 교환 크로마토그래피(CEC)(수지 - Fractogel EMD So3-)를 이용하여 폴리싱함). 포획된 물질에 바이러스 불활성화(pH를 3.5로 조정, 이 pH에서 실온에서 70분 동안 인큐베이션, 이어서 pH를 5.0으로 조정) 및 살균 여과를 가한 후 CEC를 통하여 이를 프로세싱하였다. CEC 후, 접선 유동 여과를 이용하여 10 mM 히스티딘/히스티딘-HCl(pH 5.0) 내로 완충제 교환되도록 이 물질을 정용여과하였다. 그 후, 상기 물질을 약 200 mg/mL까지 농축시켜 제형 연구를 위한 물질을 제공하였다. 예를 들어, 항체를 제형화 완충제에서 평가하고, 특정 파라미터, 구체적으로 HMW의 형성을 결정하였다(40℃에서 4주 후). 하기 표 3에는 40℃에서 4주 후 NOV004, NOV005, 및 NOV006의 샘플에서 관찰되는 HMW의 형성을 평가하는 예시적인 실험으로부터의 데이터가 요약되어 있다.
[표 3]
NOV004와 비교하여, NOV005 및 NOV006의 서열의 차이는 보관시에 HMW의 형성의 유의한 개선을 주었다. NOV005 및 NOV006 둘 다는 40℃에서 4주 동안 대략 1% 미만의 HMW 형성을 나타낸 반면, NOV004는 40℃에서 4주 동안 훨씬 더 많은 HMW 형성, 대략 64%의 HMW 형성을 나타냈다.
NOV005와 NOV004의 VH 및 VL의 서열 정렬이 하기에 제공되어 있다:
이 데이터는, 놀랍게도 NOV005 및 NOV006이 NOV004와는 대조적으로 HMW의 형성에 의해 나타나는 바와 같이 최소 응집 경향을 나타냈음을 보여주며, NOV005 및 NOV006이 제약 제형에 있어서 적합한 특성을 나타내고, 더 바람직할 것임을 시사한다.
실시예 5: 비만, 시노몰구스 원숭이에서의 연구
비만 시노몰구스 원숭이에서 음식물 소비, 체중, 및 혈장 바이오마커에 대한 FGF21 모방 mAb, 예컨대 NOV004, NOV005, 또는 NOV006의 영향을 연구한다.
예시적인 프로토콜:
5마리의 수컷 시노몰구스 원숭이를 2회 피하(s.c.), 1 mg/kg 용량의 FGF21 모방 mAb, 예컨대 NOV004, NOV005, 또는 NOV006(1주 간격(제0 연구일 및 제7 연구일)으로 투여)으로 처리하고, 음식물 소비, 체중, 및 혈장 바이오마커를 100일 초과의 투약 후에 대하여 평가한다. 각각의 용량에 있어서, 동물을 우리 내에 가두고, 혈액 샘플을 수집하고, 그 후 각각의 동물에게 1 mg/kg의 피하 용량의 FGF21 모방 mAb, 예컨대 NOV004, NOV005, 또는 NOV006을 준다. 음식물 소비 측정을 첫 번째 용량 1주일 전에 시작하고, 연구 내내 계속한다. 연구용 규정식을 급이 전 칭량하고, 매일 동등한 두 부분으로 나눈다. 다음날 아침, 나머지 규정식을 수집하고, 칭량한다. 캐치 팬(catch pan) 내에 떨어진 펠렛(각각 1 g)의 수를 계수하고, 잔존 음식물의 중량에 더한다. 일일 음식물 소비량은 제공된 음식물의 중량에서 수집된 음식물을 제한 것으로 계산한다. 과일 및 야채 소비량은 측정하지 않는다. 저울눈 상의 동적 기능(dynamic feature)을 사용하여 (혈액 수집 또는 투약 전) 주당 세 번의 아침에 이중으로 비-급이 체중을 측정한다.
혈장중 FGF21 모방 mAb 농도의 측정
시노몰로구스 원숭이 혈장 중 인간 Fc IgG를 ELISA 기반 샌드위치 면역분석을 이용하여 정량화한다. 인간 IgG에 대한 마우스 단클론 항체인 항-인간-IgG 마우스 IgG1을 포획 항체로서 사용한다. 백색, 그라이너(Greiner), 384웰 플레이트를 2 μg/mL의 항-인간-IgG 마우스 IgG1(30 μL/웰)로 코팅하고, 실온(RT)에서 하룻밤 인큐베이션한다. 코팅 항체를 흡인하고, 1x 밀크 차단제(KPL #50-82-01)를 90 μL/웰로 첨가한다(실온에서 2 h 동안). 차단 용액을 흡인하고, 플레이트를 분석할 때까지 건조제를 갖는 플레이트 백에서 -80℃에서 보관한다. 분석일에, 플레이트 및 시약을 실온까지 되게 한다. 정제 IgG를 구매 카제인 샘플 희석제에서 4000 pM로부터 16 pM까지 희석시키고 완충제 대조군을 포함시킴으로써 표준물을 제조한다. 샘플을 상기 희석제에서 표준물로서 이중으로 1:50, 1:250, 1:1250, 및 1:6250으로 희석시키고, 그 후 표준물, 희석 샘플, 및 대조군을 플레이트에 첨가한다(실온에서 2시간 동안(모든 단계에 있어서 실제 부피는 웰당 30 μL였다)). 그 후 플레이트를 포스페이트계 세척 완충제로 3회 세척한다. 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)-라벨링된 항-인간 Fc-감마 항체를 실온에서 1시간 동안 플레이트에 첨가하고, 그 후 플레이트를 포스페이트계 세척 완충제로 3회 세척한다. 화학발광 기질을 상기 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 발광 플레이트 판독기에서 즉시 판독한다.
FGF21 모방 mAb, 예를 들어, NOV004, NOV005 또는 NOV006 표준물을 플레이트당 삼중으로 분석한다. 희석된 혈장 샘플을 이중으로 분석한다. 비공지 샘플은 IgG 표준 곡선으로부터 내삽된다. 샘플 농도의 곡선 피팅, 역계산, 회복률 %, 및 내삽은 SoftMax Pro Software v5.4.1을 사용하여 수행한다. IgG 표준물에 의해 생성된 신호를 도시하고, 4개-파라미터 로지스티칼(logistical) 곡선-피팅 옵션을 사용하여 피팅한다. 혈장 샘플 중 Fc 농도(pM)를 FGF21 모방 mAb 표준 곡선으로부터 내삽하고, 희석 배수를 곱한다. 분석의 정량 하한(LLOQ) 및 정량 상한(ULOQ)을 결정한다. LLOQ 및 ULOQ는 회복률이 100% ± 20%이고 CV가 20% 미만이며 후에 희석 배수가 곱해진 하한 및 상한 표준 농도로 정의된다.
항-약물 항체의 검출
혈장 샘플을 LowCross Buffer(Boca Scientific; 미국 플로리다주 보카 레이턴 소재; 카탈로그 번호 100 500)에서 1:5로 희석시킨다. LowCross Buffer 중 0.6 μg/mL의 바이오틴-라벨링된 FGF21 모방 mAb 및 0.6 μg/mL의 디그옥시제닌-라벨링된 FGF21 모방 mAb를 함유하는 반응 혼합물을 제조한다. 96웰 U자형-바닥 플레이트(BD Falcon; 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재; 카탈로그 번호 351177)에서 희석 혈장(80 μL)을 160 μL의 반응 혼합물과 조합한다. 플레이트의 에지를 파라필름으로 밀봉하고, 플레이트를 진탕 플랫폼 상에서 37℃에서 2 h 동안(150 rpm, 광이 차단됨) 인큐베이션한다. 그 후 각각의 혼합물의 분취물(100 μL)을 스트렙타비딘-코팅된 96웰 플레이트(Roche; 카탈로그 번호 11734776001)의 이중 웰에 옮기는데, 상기 웰은 먼저 0.05% (v/v) Tween-20을 함유하는 1X PBS로 이루어진 세척 완충제(웰당 300 μL)로 3회 세척한다. 상기 플레이트를 밀봉하고, 그 후 진탕 플랫폼 상에서 실온에서 1 h 동안 인큐베이션한다(300 rpm, 광이 차단됨). 플레이트를 세척 완충제(300 μL/웰)로 3회 세척하고, 그 후, LowCross Buffer에서 1:2500으로 희석한 100 μL의 항-디그옥시제닌 퍼옥시다아제_POD Fab 단편(Roche; 카탈로그 번호 11633716001)을 각각의 웰에 첨가한다. 플레이트를 밀봉하고, 진탕 플랫폼 상에서 실온에서 45분 동안 인큐베이션하고(300 rpm, 광이 차단됨), 그 후 세척 완충제(300 μL/웰)로 3회 세척한다. TMB One Component HRP Microwell Substrate(Bethyl Laboratories; 미국 텍사스주 몽고메리 소재; 카탈로그 번호 E102; 100 μL/웰)를 각각의 웰에 첨가하고, 청색을 9 내지 10분 동안 발색시켰다(광이 차단됨). 색 반응은 100 μL의 0.18 N H2SO4를 각각의 웰에 첨가하여 중지시키고, 플레이트를 잠시 진탕시키고, 황색을 OD450에서 측정한다.
혈장중 글루코스 농도의 측정
Autokit Glucose assay(Wako Chemicals; 미국 버지니아주 리치몬드 소재; 카탈로그 번호 439-90901)를 사용하여 혈장중 글루코스 농도를 측정한다. 캘리브레이터를 500, 200, 100, 50, 20, 및 0 mg/dL 표준물까지 희석시킴으로써 표준 곡선을 작성한다. 37℃까지 사전 가온한 분석용 시약(300 μL)을 투명, 편평 바닥, 96웰 플레이트(Thermo Scientific; 카탈로그 번호 269620) 내의 2 μL의 혈장, 표준물, 및 대조 샘플에 첨가한다. 상기 플레이트를 플레이트 진탕기에서 30초 동안 혼합하고, 그 후 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한다. 20초의 혼합 후, Molecular Devices SPECTRAmax PLUS 384(미국 캘리포니아주 서니베일 소재)를 이용하여 505/600 nm에서 플레이트를 판독한다. 샘플중 글루코스 농도를 표준 곡선과의 비교에 의해 계산한다.
혈장중 인슐린 농도의 측정
제조사의 설명서에 따라 Millipore Human Insulin Specific RIA Kit(미국 매사추세츠주 빌레리카 소재, 카탈로그 번호 HI-14K)를 사용하여 혈장중 인슐린 농도를 측정한다.
적당량의 분석용 완충제, 표준물, 또는 희석 혈장 샘플을 125I-인슐린 및 항-인슐린 항체와 혼합한다(5 mL, 75 x 12 mm PP SARSTEDT 튜브(카탈로그 번호 55.526)에서). 상기 튜브를 와동시키고, 뚜껑을 덮고, 실온에서 20시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 1 mL의 4℃ 침전용 시약을 첨가하고, 튜브를 와동시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 모든 튜브를 30분 동안(3000 rpm, 4℃) 원심분리하고, 상청액을 경사분리시키고, 펠렛을 PerkinElmer WIZARD2 Automatic Gamma Counter(모델 번호 2470; PerkinElmer; 미국 매사추세츠주 월섬 소재)에서 계수한다. 공지된 양의 인슐린을 사용하여 생성한 표준 곡선과의 비교에 의해 인슐린 농도를 계산한다.
혈장중 트리글리세리드 농도의 측정
Triglyceride (GPO) Liquid Reagent 세트(Pointe Scientific; 미국 미시간주 캔톤 소재; 카탈로그 번호 T7532-500)를 사용하여 혈장중 트리글리세리드(TG) 농도를 측정한다. 사전 가온한 분석용 시약(300 μL, 37℃)을 투명한 편평 바닥 96웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific; 미국 매사추세츠주 턱스베리 소재; 카탈로그 번호 269620) 내의 5 μL의 혈장에 첨가한다. 상기 플레이트를 플레이트 진탕기에서 30초 동안 혼합하고, 그 후 37℃에서 5분 동안 인큐베이터 내에 둔다. 20초의 혼합 후, SPECTRAmax PLUS 플레이트 판독기를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정한다. 공지된 양의 TG 표준물(Pointe Scientific; 카탈로그 번호 T7531-STD)을 사용하여 생성한 보정 곡선과의 비교에 의해 TG 농도를 계산한다.
혈장중 콜레스테롤 농도의 측정:
Cholesterol (Liquid) Reagent Set(Pointe Scientific; 카탈로그 번호 C7510-500)를 사용하여 혈장중 총 콜레스테롤(TC)을 정량화한다. 사전 가온한 분석용 시약(200 μL, 37℃)을 투명한 편평 바닥 96웰 분석 플레이트(Thermo Fisher Scientific; 카탈로그 번호 269620) 내의 10 μL의 혈장에 첨가한다. 상기 플레이트를 플레이트 진탕기에서 30초 동안 혼합하고, 그 후 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한다. 20초의 혼합 후, SPECTRAmax PLUS 플레이트 판독기를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정한다. 공지된 양의 콜레스테롤 표준물(Stanbio Laboratory; Boerne, TX; 카탈로그 번호 1012-030)을 사용하여 생성한 보정 곡선과의 비교에 의해 콜레스테롤 농도를 계산한다.
혈장중 고밀도 리포단백질 콜레스테롤 농도의 측정
고밀도 리포단백질(HDL) 콜레스테롤 농도의 측정을 위하여, 50 μL의 혈장 샘플을 0.5 mL의 마이크로원심분리 튜브 내의 50 μL의 Cholesterol Precipitating Reagent(Wako Chemicals; 미국 버지니아주 리치몬드 소재; 카탈로그 번호 431-52501)와 조합하고, 잠시 와동시킨다. 상기 튜브를 실온에 10분 동안 두고, 그 후 2000 x g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리한다. 원심분리 후, 대략 절반의 상청액(원래 혈장 샘플의 HDL 콜레스테롤 부분을 함유함)을 꺼내고, 10 μL를 상기에 설명된 콜레스테롤 분석에 사용한다.
혈장중 β-히드록시부티레이트 농도의 측정
β-Hydroxybutyrate LiquiColor Test 키트(Stanbio Laboratory; 카탈로그 번호 2440-058)를 사용하여 혈장중 β-히드록시부티레이트 (β-HB) 농도를 측정한다. 분석용 시약 R1(215 μL, 37℃까지 사전 가온)을 투명한 편평 바닥 96웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific; 카탈로그 번호 269620) 내의 20 μL의 품질 관리 또는 혈장 샘플에 첨가한다. 상기 플레이트를 플레이트 진탕기에서 30초 동안 혼합하고, 그 후 37℃에서 5분 동안 인큐베이터 내에 둔다.
SPECTRAmax PLUS 플레이트 판독기에서 505 nm에서 사전 판독 흡광도를 측정한다. 분석용 시약 R2 (35 μL, 37℃까지 사전 가온)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 다시 플레이트 진탕기에서 30초 동안 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한다. 20초의 혼합 후, 최종 흡광도를 500 nm에서 측정하는데, 사전 판독 값을 상기 최종 흡광도로부터 차감한다. 공지된 양의 β-HB 캘리브레이터(Wako Diagnostics; Richmond, VA; 카탈로그 번호 412-73791)를 사용하여 생성한 보정 곡선과의 비교에 의해 β-HB 농도를 계산한다.
통계학적 분석
통계학적 분석은 그래프패드 프리즘(Version 6.05; GraphPad Software; 미국 캘리포니아주 라욜라 소재)을 이용하여 수행된다. 각 동물을 위한 음식물 섭취 데이터는 기준선의 퍼센트로서 정규화되며(제-6일 내지 제0일의 평균으로 계산됨) 그 후 군 평균 ± 평균의 표준편차(SEM)가 계산되며; 각각의 일은 던 다중 비교 사후-검정(Dunn's multiple comparisons post-test)을 이용한 비모수 프리드만 검정(nonparametric Friedman's test)에 의해 제0일에 비교된다. 체중은 군 평균 ± 기준선(제 -7, -5, -3, 및 0일의 평균으로 계산됨)의 퍼센트로서 계산된 평균의 표준 편차(SEM)로서 제시된다. 미가공 체중 및 혈장 바이오마커 데이터는 또한 던 다중 비교 사후-검정을 이용한 비모수 프리드만 검정에 의해 분석된다. P < 0.05가 유의한 것으로 간주된다.
실시예 6: 비만, 시노몰구스 원숭이에서의 연구
수컷 정상혈당성 비만 시노몰구스 원숭이에서 NOV005의 효과를 평가하기 위하여, 피하 1 mg/kg 용량의 NOV005(n = 5마리의 동물) 또는 비히클(n = 3마리의 동물)을 1주 간격으로 두 번 투여하였다. 잠정적인 연구 결과가 하기에 요약된다:
·NOV005는 일반 사료의 음식물 소비를 감소시켰으며, 기준선에 비하여 피크 평균이 약 60% 감소되고(도 6a) NOV005 처리된 동물에서의 기준선에 비하여 평균 피크 중량이 약 10% 감소되었다(도 6b)
·비-절식 동물로부터의 혈장을 지질 및 탄수화물 대사의 바이오마커에서의 변화에 대해 분석하였다:
o 제35일에 기준선에 비하여 NOV005 처리 동물에서 혈장 TG 수준에 대해 약 65%의 평균 감소가 관찰되었다
o NOV005는 또한 제35일에 기준선에 비하여 총 콜레스테롤 및 인슐린을 감소시켰으나, 이들 변화는 통계적으로 유의하지 않았다
o 연구의 마지막에 측정될 다른 바이오마커는 아디포넥틴, β-히드록시부티레이트, ApoCIII, HDL-C 및 리포단백질 프로파일을 포함한다.
[표 4]
값은 군 평균 ± SEM을 나타낸다.
1바이오마커 측정을 위하여 비-절식 동물로부터 혈액을 수집하였다.
2기준선 값은 제 -7, -3 및 0일의 평균을 반영한다.
3퍼센트 변화는 각 개체에 대해 계산한 후 군 평균 ± SEM을 위해 평균하였다.
*던 사후-검정을 이용한 비모수 프리드만 검정에 의한 P < 0.05 (기준선에 대하여).
참고에 의한 포함
특허, 특허 출원, 논문, 교과서 등을 비롯하여 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌 및 그안에서 인용된 참고문헌은, 이미 언급되지 않았다면, 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> FGF21 MIMETIC ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> PAT057578-WO-PCT <140> <141> <150> 62/456,609 <151> 2017-02-08 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 Ser <210> 2 <211> 938 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctgtcagctg aggatccagc cgaaagagga gccaggcact caggccacct gagtctactc 60 acctggacaa ctggaatctg gcaccaattc taaaccactc agcttctccg agctcacacc 120 ccggagatca cctgaggacc cgagccattg atggactcgg acgagaccgg gttcgagcac 180 tcaggactgt gggtttctgt gctggctggt cttctgctgg gagcctgcca ggcacacccc 240 atccctgact ccagtcctct cctgcaattc gggggccaag tccggcagcg gtacctctac 300 acagatgatg cccagcagac agaagcccac ctggagatca gggaggatgg gacggtgggg 360 ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc ctgcagctga aagccttgaa gccgggagtt 420 attcaaatct tgggagtcaa gacatccagg ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg 480 tatggatcgc tccactttga ccctgaggcc tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac 540 ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac ggcctcccgc tgcacctgcc agggaacaag 600 tccccacacc gggaccctgc 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caagtccagc tgcaagaatc cggacccggc ctcgtcaagc cgtcccagac tctgtctctc 60 acttgcacgg tgtcaggcta cagcatcacc agcggttaca cctggcactg gatcaggcag 120 catcctggaa aggggctgga atggattggg tacattcact actcggtgta caccaactac 180 aacccatcgc tcaagtcgag agtcaccatt tcccgggaca cctccaagaa ccagttcagc 240 ctcaagctgt cctctgtgac cgccgctgat actgccgtgt actattgcgc acgccggact 300 acttccctgg agcgctactt cgacgtctgg ggccagggca ctttggtcac cgtcagctcc 360 gccagcacta agggccccag cgtgtttccg ctggccccct cctccaaaag cacctccggc 420 ggaactgccg cgctcggatg tctcgtgaag gactatttcc ccgagcctgt gacagtgtca 480 tggaactcgg gagcactgac cagcggagtg catacttttc ccgcggtcct gcagtcctcc 540 ggattgtaca gcctgtcatc ggtcgtgacc gtgccgtcct catcgctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caaacctagc aacaccaaag tggataagcg ggtggaacct 660 aagtcctgcg acaagactca cacttgtccg ccatgcccag cgcctgaact cctgggtggt 720 ccttcggtgt tcctgttccc gccaaagccg aaggacaccc tgatgatctc ccggacgcct 780 gaagtgacct gtgtggtggt ggctgtgtca catgaggacc ctgaagtcaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 40 gaaatcgtga tgactcagtc ccccgccact ctctccctgt cccctggcga acgggccacc 60 ctgtcgtgcc gggcgtcgca ggacatctca aactatctga actggtacca gcagaagcct 120 ggacaggcac ccaggctcct gatctactac acctcgcgcc tgcaatccgg aatcccagcc 180 cgcttctccg gttccggctc cggcgctgat tacaccctca ccattagcag cctgcagccg 240 gaggacttcg ccgtgtactt ctgtcaacaa ggaaacaccc tcccgtacac atttgggcag 300 ggaaccaagc tggagattaa g 321 <210> 41 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 41 gaaatcgtga tgactcagtc ccccgccact ctctccctgt cccctggcga acgggccacc 60 ctgtcgtgcc gggcgtcgca ggacatctca aactatctga actggtacca gcagaagcct 120 ggacaggcac ccaggctcct gatctactac acctcgcgcc tgcaatccgg aatcccagcc 180 cgcttctccg gttccggctc cggcgctgat tacaccctca ccattagcag cctgcagccg 240 gaggacttcg ccgtgtactt ctgtcaacaa ggaaacaccc tcccgtacac atttgggcag 300 ggaaccaagc tggagattaa gcgtacggtg 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ccccgatgtg 480 ggctcctcgg accctctgag catggtggga ccttcccagg gccgaagccc cagctacgct 540 tcctga 546 <210> 64 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 64 His His His His His His 1 5

Claims (38)

  1. 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및
    서열 번호 26 또는 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
    을 포함하는, β-클로토에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는, 비만을 치료하기 위한 제약 조성물.
  5. 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 체중 감소를 필요로 하는 대상체에서 체중을 감소시키기 위한 제약 조성물.
  6. 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 식욕 또는 식품 섭취 감소를 필요로 하는 대상체에서 식욕 또는 식품 섭취를 감소시키기 위한 제약 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제2항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는, 이상지질혈증을 치료하기 위한 제약 조성물.
  10. 제7항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는, 이상지질혈증을 치료하기 위한 제약 조성물.
  11. 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 대상체에서 혈장중 트리글리세리드(TG) 농도 또는 혈장중 총 콜레스테롤(TC) 농도를 감소시키기 위한 제약 조성물.
  12. 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 대사 장애를 갖는 대상체에서 대사 장애를 치료하기 위한 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 대상체가 비만, 제1형 및 제2형 진성 당뇨병, 췌장염, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비알코올성 지방간염(NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 급성 심근 경색, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성 동맥 경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 관상동맥성 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병 합병증, 신경병증, 위마비, 및 인슐린 수용체에서의 심각한 불활성화 돌연변이와 연관된 장애 중 하나 이상을 갖는 것인 제약 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 대상체가 급성 심근 경색, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성 동맥 경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전 및 관상동맥성 심장 질환 중 하나 이상을 갖는 것인 제약 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 대상체가 비만을 갖는 것인 제약 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 대상체가 이상지질혈증을 갖는 것인 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 이상지질혈증이 고트리글리세리드혈증인 제약 조성물.
  18. 제13항에 있어서, 대상체가 당뇨병을 갖는 것인 제약 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 당뇨병이 제2형 진성 당뇨병인 제약 조성물.
  20. 제13항에 있어서, 대상체가 인슐린 저항성을 갖는 것인 제약 조성물.
  21. 제13항에 있어서, 대상체가 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)을 갖는 것인 제약 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 대상체가 비알코올성 지방간염(NASH)을 갖는 것인 제약 조성물.
  23. 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 심혈관 장애를 갖는 대상체에서 심혈관 장애를 치료하기 위한 제약 조성물.
  24. 제13항에 있어서, 대상체가 아테롬성 동맥 경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전 및 관상동맥성 심장 질환 중 하나 이상을 갖는 것인 제약 조성물.
  25. 서열 번호 16, 36 또는 38에 개시된 바와 같은 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 54, 27, 33 또는 40에 개시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, β-클로토에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  26. 제25항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 18, 37, 30 또는 39에 개시된 바와 같은 중쇄; 및 서열 번호 29, 51, 35 또는 41에 개시된 바와 같은 경쇄를 코딩하는 것인 핵산.
  27. 제25항 또는 제26항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  28. 제27항의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  29. β-클로토에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 항체 또는 이의 단편의 발현에 적합한 조건 하에 제28항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제25항 또는 제26항에 있어서, 서열 번호 16 또는 36에 개시된 바와 같은 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 54 또는 27에 개시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 내의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  31. 제25항 또는 제26항에 있어서, 서열 번호 16 또는 38에 개시된 바와 같은 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 33 또는 40에 개시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 내의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  32. 제25항 또는 제26항에 있어서, 서열 번호 18 또는 37에 개시된 바와 같은 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 29 또는 51에 개시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 내의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  33. 제25항 또는 제26항에 있어서, 서열 번호 30 또는 39에 개시된 바와 같은 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 35 또는 41에 개시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 내의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  34. 제25항 또는 제26항의 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, β-클로토에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
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