KR102539636B1 - 개선된 약동학을 가지는 항-c5 항체 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 무엇보다도 말단 보체(예를 들어, C5b-9 TCC의 조립 및/또는 활성) 및 C5a 아나필라톡신 매개 염증을 저해하고 따라서 보체 관련 장애를 치료하기에 유용한 항체를 제공한다. 항체는 예를 들어 인간에서 증가한 혈청 반감기를 포함하는 에쿨리주맙에 대비된 다수의 개선된 특성을 가진다.

Description

개선된 약동학을 가지는 항-C5 항체{ANTI-C5 ANTIBODIES HAVING IMPROVED PHARMACOKINETICS}
관련 출원
본원은 (2014년 3월 7일에 출원된) 미국 가특허 출원 제61/949,932호에 대한 우선권 및 이의 이익을 주장하고, 이의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용된다.
기술 분야
본 발명의 분야는 의학, 면역학, 분자 생물학 및 단백질 화학이다.
보체 시스템은 세포 및 바이러스 병원균의 침범에 대해 방어하기 위해 신체의 다른 면역계와 함께 작용한다. 혈장 단백질 및 막 보조인자의 복잡한 수집으로서 발견되는 적어도 25개의 보체 단백질이 존재한다. 혈장 단백질은 척추동물 혈청에서 약 10%의 글로불린을 구성한다. 보체 성분은 일련의 복잡하지만, 정확한 효소 절단 및 막 결합 사건에서 상호작용함으로써 이의 면역 방어 기능을 달성한다. 생성된 보체 캐스케이드는 옵소닌, 면역조절 및 용해 기능을 가지는 생성물을 생성시킨다. 보체 활성화와 연관된 생물학적 활성의 정확한 요약이 예를 들어 문헌[The Merck Manual, 16th Edition]에 제공된다.
보체 캐스케이드는 전통적인 경로(classical pathway: CP), 렉틴 경로 또는 대안적인 경로(alternative pathway: AP)를 통해 진행할 수 있다. 렉틴 경로는 통상적으로 고만노스 기질에 대한 만노스 결합 렉틴(mannose-binding lectin: MBL)의 결합에 의해 개시된다. AP는 항체 독립적일 수 있고, 병원균 표면에서의 소정의 분자에 의해 개시될 수 있다. CP는 통상적으로 표적 세포 상의 항원 부위의 항체 인식 및 이 부위에 대한 결합에 의해 개시된다. 이 경로는 보체 성분 C3이 활성 프로테아제에 의해 절단되어서 C3a 및 C3b를 생성하는 지점인 C3 전환효소에서 집중된다.
AP C3 전환효소는 보체 성분 C3의 자발적 가수분해에 의해 개시되고, 이것은 혈액의 혈장 분획에서 풍부하다. 또한 "틱오버(tickover)"로 공지된 이 과정은 C3에서의 티오에스터 결합의 자발적 절단을 통해 발생하여서 C3i 또는 C3(H2O)을 형성한다. 틱오버는 활성화된 C3의 결합을 지지하고/하거나, 중성 또는 양전하 특징을 가지는 표면(예를 들어, 박테리아 세포 표면)의 존재에 의해 촉진될 수 있다. 이 C3(H2O)의 형성은 혈장 단백질 B 인자의 결합을 허용하여서, 결국 D 인자가 B 인자를 절단하여 Ba 및 Bb가 되게 한다. Bb 단편은 C3에 결합된 채 있어서 C3(H2O)Bb - "유체 상" 또는 "개시" C3 전환효소를 함유하는 복합체를 형성한다. 적은 양으로만 생성되지만, 유체 상 C3 전환효소는 다수의 C3 단백질을 C3a 및 C3b로 절단할 수 있고, C3b를 생성시키고 이에 후속하여 표면(예를 들어, 박테리아 표면)에 공유 결합한다. 표면 결합된 C3b에 결합된 B 인자는 D 인자에 의해 절단되어서, C3b,Bb를 함유하는 표면 결합된 AP C3 전환효소를 형성한다. (예를 들어, 문헌[Muller-Eberhard (1988) Ann Rev Biochem 57:321-347] 참조.)
(C3b)2,Bb인 AP C5 전환효소는 AP C3 전환효소에 대한 제2 C3b 단량체의 첨가 시 형성된다. (예를 들어, 문헌[Medicus et al. (1976) J Exp Med 144:1076-1093 및 Fearon et al. (1975) J Exp Med 142:856-863] 참조.) 제2 C3b 분자의 역할은 C5에 결합하고 이것을 Bb에 의한 절단에 제시하는 것이다. (예를 들어, 문헌[Isenman et al. (1980) J Immunol 124:326-331] 참조.) AP C3 및 C5 전환효소는 예를 들어 상기 문헌[Medicus et al. (1976)]에 기재된 바대로 삼합체 단백질 프로퍼딘의 첨가에 의해 안정화된다. 그러나, 프로퍼딘 결합은 기능적인 대안적인 경로 C3 또는 C5 전환효소를 형성하는 데 필요하지 않다. (예를 들어, 문헌[Schreiber et al. (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3948-3952 및 Sissons et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 559-562] 참조).
CP C3 전환효소는 C1q, C1r 및 C1s와 표적 항원(예를 들어, 미생물 항원)에 결합한 항체의 복합체인 보체 성분 C1의 상호작용 시 형성된다. 항체-항원 복합체에 대한 C1의 C1q 부분의 결합은 Clr을 활성화하는 C1에서 입체구성 변화를 발생시킨다. 이후, 활성 C1r은 C1 관련 C1s를 절단하여서 활성 세린 프로테아제를 생성한다. 활성 C1s는 보체 성분 C4를 C4b 및 C4a로 절단한다. C3b과 같이, 새로 생성된 C4b 단편은 표적 표면(예를 들어, 미생물 세포 표면)에서 적합한 분자와 아마이드 또는 에스터 결합을 용이하게 형성하는 매우 반응성인 티올을 함유한다. C1s는 또한 보체 성분 C2를 C2b 및 C2a로 절단한다. C4b 및 C2a에 의해 형성된 복합체는 CP C3 전환효소이고, 이것은 C3을 C3a 및 C3b로 처리할 수 있다. C4b,C2a,C3b인, CP C5 전환효소는 CP C3 전환효소에 대한 C3b 단량체의 첨가 시 형성된다. (예를 들어, 상기 Muller-Eberhard 문헌(1988) 및 문헌[Cooper et al. (1970) J Exp Med 132:775-793] 참조.)
C3 및 C5 전환효소에서의 이의 역할 이외에, C3b는 항원 제시 세포, 예컨대 대식세포 및 수지상 세포의 표면에 존재하는 보체 수용체와의 이의 상호작용을 통해 옵소닌으로서 또한 작용한다. C3b의 옵소닌 기능은 일반적으로 보체 시스템의 가장 중요한 감염보호 기능 중 하나인 것으로 생각된다. C3b 기능을 차단하는 유전적 병변을 가지는 환자는 매우 다양한 병원성 유기체에 의한 감염에 걸리기 쉽운 반면, 차후 보체 캐스케이드 서열에서 병변을 가지는 환자, 즉 C5 기능을 차단하는 병변을 가지는 환자는 네이세리아(Neisseria) 감염에만 더 걸리기 쉽고, 이후 오직 약간 더 걸리기 쉬운 것으로 발견되었다.
AP 및 CP C5 전환효소는 C5를 C5a 및 C5b로 절단한다. C5의 절단은 C5a, 강력한 아나필라톡신 및 주화성 인자, 및 C5b를 방출하고, 이것은 용해 말단 보체 복합체, C5b-9의 형성을 허용한다. C5b는 C6, C7 및 C8과 조합되어 표적 세포의 표면에서 C5b-8 복합체를 형성한다. 여러 C9 분자의 결합 시, 막 공격 복합체(MAC, C5b-9, 말단 보체 복합체-TCC)가 형성된다. 충분한 수의 MAC가 표적 세포막으로 삽입될 때, 이들이 생성하는 개구(MAC 기공)는 표적 세포의 신속한 삼투 용해를 매개한다.
적절히 작용하는 보체 시스템이 미생물을 감염시키는 것에 대한 탄탄한 방어를 제공하지만, 보체 경로의 부적절한 조절 또는 활성화는 예를 들어 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis: RA); 루프스 신염; 천식; 허혈-재관류 손상; 비정형 용혈성 요독 증후군(atypical hemolytic uremic syndrome: aHUS); 조밀침착병(dense deposit disease: DDD); 발작성 야간혈색소 뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: PNH); 황반변성(예를 들어, 연령 관련 황반변성(age-related macular degeneration: AMD)); 용혈, 간 효소 상승, 및 저혈소판(hemolysis, elevated liver enzymes, and low platelets: HELLP) 증후군; 혈전성 혈소판감소성 자반병(thrombotic thrombocytopenic purpura: TTP); 자연 유산; 소수면역 혈관염(Pauci-immune vasculitis; 수포성 표피박리증; 재발성 유산; 다발성 경화증(multiple sclerosis: MS); 외상성 뇌 손상; 및 심근경색, 심폐 우회술 및 혈액투석으로부터 생긴 손상을 포함하는 다양한 장애의 발병에 관련된다. (예를 들어, 문헌[Holers et al. (2008) Immunological Reviews 223:300-316] 참조.) 보체 활성화의 하향조절은 다양한 동물 모델에서의 여러 질환 표시를 치료하는 데 있어서 효과적인 것으로 입증되었다. 예를 들어, 문헌[Rother t al. (2007) Nature Biotechnology 25(11):1256-1264; Wang et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93:8563-8568; Wang et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:8955-8959; Rinder et al. (1995) J Clin Invest 96:1564-1572; Kroshus et al. (1995) Transplantation 60:1194-1202; Homeister et al. (1993) J Immunol 150:1055-1064; Weisman et al. (1990) Science 249:146-151; Amsterdam et al. (1995) Am J Physiol 268:H448-H457; 및 Rabinovici et al. (1992) J Immunol 149:1744 1750]을 참조한다.
본 개시내용은, 예를 들어 치료학적 목적에 사용되는 공지된 항-C5 항체에 대비된, 하나 이상의 개선된 특징을 가지는 항-C5 항체에 관한 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 에쿨리주맙의 혈청 제거 반감기에 대비된 증가한 혈청 수명을 나타낸다. 이의 개선된 약동학적 특성으로 인해, 본 명세서에 기재된 항체는 다수의 이점, 예를 들어 전장 또는 성숙 C5에 결합하고 이의 절단을 저해하는 다른 항-C5 항체에 대비된 이점을 특징으로 한다. 이러한 항-C5 항체와 같이, 본 명세서에 기재된 항체는 C5a 매개 염증성 반응 및 C5의 절단으로부터 생긴 C5b (MAC) 의존적 세포 용해를 저해할 수 있다. 그러나, 인간 혈장에서의 C5의 농도가 대략 0.37μM이므로(Rawal and Pangburn (2001) J Immunol 166(4):2635-2642), 항-C5 항체, 예컨대 에쿨리주맙의 고농도 및/또는 빈번한 투여의 사용은 인간에서 C5를 효과적으로 저해하는 데 대개 필요하다. 본 개시내용은 실험예에서 항-C5 항체가 실험실내 및 생체내 보체를 저해하는 데 있어서 매우 효과적이라는 것을 입증하는 실험 데이터를 기재하였다(예를 들어, 문헌[Hillmen et al. (2004) N Engl J Med 350(6):552] 참조), 항체는 혈액 중의 C5의 높은 농도로 인해 표적 매개 청소에 특히 민감하다. 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 새로운 항체가 표적 매개 청소에 대한 감소한 감수성을 가지고, 이에 따라 이전에 공지된 항-C5 항체와 비교하여 혈액 중에 더 긴 혈청 제거 반감기(반감기)를 가진다는 것을 또한 보여준다.
이의 더 긴 반감기의 관점에서, 본 명세서에 기재된 항체는 이전에 공지된 항-C5 항체(예컨대, 에쿨리주맙)보다 훨씬 더 낮은 용량에서 및/또는 덜 빈번하게 인간에게 투여되고, 인간에서 C5와 동일하거나 이것 초과의 저해를 효과적으로 제공할 수 있다. 예를 들어, 에쿨리주맙의 용량과 비교하여 더 낮은 용량의 항체를 투여하는 능력은 또한 추가적인 전달 경로, 예를 들어 피하 투여, 근육내 투여, 폐내 전달, 및 생물학적으로 분해 가능한 마이크로구의 사용을 통한 투여를 허용한다.
따라서, 일 양상에서, 본 개시내용은 에쿨리주맙에 대비된 하나 이상의 개선된 특성(예를 들어, 개선된 약동학적 특성)을 가지는 항-C5 항체를 특징으로 한다. 항체 또는 이의 C5 결합 단편은 (a) 보체 성분 C5에 결합하고; (b) 단편 C5a 및 C5b로의 C5의 절단을 저해하고; (c) (ⅰ) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (ⅱ) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (ⅲ) 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (ⅳ) 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (ⅴ) 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (ⅵ) 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 것(여기서, (ⅰ)-(ⅵ) 중 적어도 1개(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개)의 아미노산(들)은 상이한 아미노산에 의해 치환됨)이다. 몇몇 실시형태에서, C5는 인간 C5이다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 중쇄 CDR1의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 중쇄 CDR2의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 중쇄 CDR3의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 경쇄 CDR1의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 4에 대해 8번 위치에서의 글리신은 상이한 아미노산(예를 들어, 히스티딘)에 의해 치환된다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 경쇄 CDR2의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 경쇄 CDR3의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 1에 대한 1번 위치에서의 글리신, 서열 번호 1에 대한 2번 위치에서의 티로신, 서열 번호 1에 대한 3번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 1에 대한 4번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 1에 대한 5번 위치에서의 세린, 서열 번호 1에 대한 6번 위치에서의 아스파라긴, 서열 번호 1에 대한 7번 위치에서의 티로신, 서열 번호 1에 대한 8번 위치에서의 트립토판, 서열 번호 1에 대한 9번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 1에 대한 10번 위치에서의 글루타민, 서열 번호 2에 대한 1번 위치에서의 글루탐산, 서열 번호 2에 대한 2번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 2에 대한 3번 위치에서의 류신, 서열 번호 2에 대한 4번 위치에서의 프롤린, 서열 번호 2에 대한 5번 위치에서의 글리신, 서열 번호 2에 대한 6번 위치에서의 세린, 서열 번호 2에 대한 7번 위치에서의 글리신, 서열 번호 2에 대한 8번 위치에서의 세린, 서열 번호 2에 대한 9번 위치에서의 트레오닌, 서열 번호 2에 대한 10번 위치에서의 글루탐산, 서열 번호 2에 대한 11번 위치에서의 티로신, 서열 번호 2에 대한 12번 위치에서의 트레오닌, 서열 번호 2에 대한 13번 위치에서의 글루탐산, 서열 번호 2에 대한 14번 위치에서의 아스파라긴, 서열 번호 2에 대한 15번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 2에 대한 16번 위치에서의 라이신, 서열 번호 2에 대한 17번 위치에서의 아스파르트산, 서열 번호 3에 대한 1번 위치에서의 티로신, 서열 번호 3에 대한 2번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 3에 대한 3번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 3에 대한 4번 위치에서의 글리신, 서열 번호 3에 대한 5번 위치에서의 세린, 서열 번호 3에 대한 6번 위치에서의 세린, 서열 번호 3에 대한 7번 위치에서의 프롤린, 서열 번호 3에 대한 8번 위치에서의 아스파라긴, 서열 번호 3에 대한 9번 위치에서의 트립토판, 서열 번호 3에 대한 10번 위치에서의 티로신, 서열 번호 3에 대한 11번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 3에 대한 12번 위치에서의 아스파르트산 및 서열 번호 3에 대한 13번 위치에서의 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 치환이 이루어진다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 4에 대한 8번 위치에서의 글리신, 서열 번호 4에 대한 10번 위치에서의 류신, 서열 번호 6에 대한 3번 위치에서의 발린 및 서열 번호 6에 대한 6번 위치에서의 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 치환이 이루어진다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 1에 대한 2번 위치에서의 티로신, 서열 번호 1에 대한 9번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 2에 대한 3번 위치에서의 류신 및 서열 번호 2에 대한 8번 위치에서의 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 치환이 이루어진다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 1에 대한 2번 위치에서의 티로신 및 서열 번호 2에 대한 3번 위치에서의 류신 둘 다는 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 상이한 아미노산은 히스티딘이다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 1에 대한 9번 위치에서의 아이소류신 및 서열 번호 2에 대한 8번 위치에서의 세린 둘 다는 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 1에 대한 9번 위치에서의 아이소류신 및 서열 번호 2에 대한 3번 위치에서의 류신 둘 다는 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 상이한 아미노산은 히스티딘이다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 1에 대한 2번 위치에서의 티로신 및 서열 번호 2에 대한 8번 위치에서의 세린 둘 다는 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1로부터 선택된 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 상이한 아미노산은 히스티딘이다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 아미노산 치환의 조합은 (ⅰ) 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 폴리펩타이드의 서열 번호 4에 대한 8번 위치에서의 글리신에 대한 상이한 아미노산의 치환; (ⅱ) 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 폴리펩타이드의 서열 번호 1에 대한 2번 위치에서의 글리신에 대한 상이한 아미노산의 치환; 및 (ⅲ) 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 폴리펩타이드의 서열 번호 2에 대한 8번 위치에서의 세린에 대한 상이한 아미노산의 치환을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 상이한 아미노산은 히스티딘이다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 1에 대한 2번 위치에서의 티로신 및 서열 번호 2에 대한 8번 위치에서의 세린은 히스티딘에 의해 치환된다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 상이한 아미노산은 히스티딘이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편은 0.1nM≤KD≤1nM의 범위인 친화도 해리 상수(KD)로 pH 7.4 및 25℃에서 C5에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편은 0.2nM≤KD≤1nM의 범위인 KD로 pH 7.4 및 25℃에서 C5에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편은 0.5nM≤KD≤1nM의 범위인 KD로 pH 7.4 및 25℃에서 C5에 결합한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편은 1nM 이상(예를 들어, 50nM 이상, 100nM 이상 또는 1μM 이상)인 KD로 pH 6.0 및 25℃에서 C5에 결합한다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, [(pH 6.0 및 25℃에서 C5에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KD)/(pH 7.4 및 25℃에서 C5에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KD)]는 25 초과이다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, [(pH 6.0 및 25℃에서 C5에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KD)/(pH 7.4 및 25℃에서 C5에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KD)]는 100 초과(예를 들어, 200 초과, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1500, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000 또는 8500)이다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, pH 7.4 및 25℃에서 C5에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KD는 1nM 미만(예를 들어, 0.9 미만, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1)이다.
실험예에 기재된 바와 같은 여러 변이체 에쿨리주맙 분자의 규명에 기초하여, 본 발명자들은 에쿨리주맙과 비교하여 개선된 약동학적 특성을 가지는 새로운 항체의 속을 발견하였다. 이 속 내의 항체는 pH 7.4에서 C5에 대한 에쿨리주맙의 친화도보다 약한 C5에 대한 친화도를 가진다. 그런데도, 항체는 1nM 이하인 pH 7.4에서 C5에 대한 친화도 해리 상수(KD)를 가진다. 본 개시내용이 어떤 특정한 이론 또는 작용 기전에 구속되지 않지만, 본 발명자들은 pH 7.4에서 C5에 대한 에쿨리주맙의 친화도를 약간 감소시키는 것, 및 pH 7.4 및 pH 6.0에서 친화도의 동일한/유사한 비율을 유지하면서 pH 6.0에서 C5에 대한 항체의 친화도에 대한 이의 후속하는 효과가 환자에서 생성된 항체의 보체 저해 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 항체의 C5 매개 청소를 실질적으로 감소시킬 것이라는 것을 믿는다. 따라서, 본 발명자들은, 각각 에쿨리주맙에 대비된, 필요한 약물학적 특성을 보전하면서, 개선된 약동학적 특성을 발생시키는 항-C5 항체에 대한 최적 친화도 범위를 한정하였다. 따라서, 또 다른 양상에서, 본 개시내용은 (a) 1nM 이하인 친화도 해리 상수(KD)로 pH 7.4 및 25℃에서 보체 성분 C5에 결합하고; (b) 10nM 이상인 KD로 pH 6.0 및 25℃에서 C5에 결합하고; (c) 단편 C5a 및 C5b로의 C5의 절단을 저해하고, [(pH 6.0 및 25℃에서 C5에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KD)/(pH 7.4 및 25℃에서 C5에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KD)]가 25 이상인, 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다.
몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 0.1nM≤KD≤1nM의 범위인 친화도 해리 상수(KD)로 pH 7.4 및 25℃에서 C5에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 0.2nM≤KD≤1nM의 범위인 KD로 pH 7.4 및 25℃에서 C5에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 0.5nM≤KD≤1nM의 범위인 KD로 pH 7.4 및 25℃에서 C5에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1nM 이상인 KD로 pH 6.0 및 25℃에서 C5에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 50nM 이상인 KD로 pH 6.0 및 25℃에서 C5에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 100nM 이상인 KD로 pH 6.0 및 25℃에서 C5에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1μM 이상인 KD로 pH 6.0 및 25℃에서 C5에 결합한다.
몇몇 실시형태에서, [(pH 6.0 및 25℃에서 C5에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KD)/(pH 7.4 및 25℃에서 C5에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KD)]는 50 초과(예를 들어, 60 초과, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000 또는 8500)이다.
몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1nM 미만의 KD로 pH 7.4 및 25℃에서 C5에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 0.8nM 미만의 KD로 pH 7.4 및 25℃에서 C5에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 0.5nM 미만의 KD로 pH 7.4 및 25℃에서 C5에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 0.2nM 미만의 KD로 pH 7.4 및 25℃에서 C5에 결합한다.
몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (ⅰ) 서열 번호 1에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (ⅱ) 서열 번호 2에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (ⅲ) 서열 번호 3에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (ⅳ) 서열 번호 4에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (ⅴ) 서열 번호 5에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (ⅵ) 서열 번호 6에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하고, (ⅰ)-(ⅵ) 중 적어도 하나의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 상이한 아미노산은 임의의 아미노산(예를 들어, 히스티딘)일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 CDR1의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 CDR2의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 CDR3의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 CDR1의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 CDR2의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 CDR3의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다.
몇몇 실시형태에서, 서열 번호 4에 대한 8번 위치에서의 글리신, 서열 번호 4에 대한 10번 위치에서의 류신, 서열 번호 6에 대한 3번 위치에서의 발린 및 서열 번호 6에 대한 6번 위치에서의 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 치환이 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 1에 대한 2번 위치에서의 티로신, 서열 번호 1에 대한 9번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 2에 대한 3번 위치에서의 류신 및 서열 번호 2에 대한 8번 위치에서의 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 치환이 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1로부터 선택된 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, CDR로 도입된 아미노산 치환의 조합은 (ⅰ) 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 폴리펩타이드의 서열 번호 4에 대한 8번 위치에서의 글리신에 대한 상이한 아미노산의 치환; (ⅱ) 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 폴리펩타이드의 서열 번호 1에 대한 2번 위치에서의 글리신에 대한 상이한 아미노산의 치환; 및 (ⅲ) 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 폴리펩타이드의 서열 번호 2에 대한 8번 위치에서의 세린에 대한 상이한 아미노산의 치환을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 아미노산 치환의 조합은 (ⅰ) 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 폴리펩타이드의 서열 번호 1에 대한 2번 위치에서의 글리신에 대한 상이한 아미노산의 치환; 및 (ⅱ) 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 폴리펩타이드의 서열 번호 2에 대한 8번 위치에서의 세린에 대한 상이한 아미노산의 치환을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 서열 번호 1에 대한 2번 위치에서의 티로신 및 서열 번호 2에 대한 8번 위치에서의 세린은 (예를 들어, 히스티딘에 의해) 치환된다.
몇몇 실시형태에서, 임의의 항체 또는 이의 단편은 변이체 인간 Fc 불변 영역이 유래한 네이티브 인간 Fc 불변 영역보다 큰 친화도로 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하는 변이체 인간 Fc 불변 영역(예를 들어, 변이체 인간 IgG Fc 불변 영역)을 포함한다. 변이체 Fc 불변 영역은 변이체 인간 Fc 불변 영역이 유래한 네이티브 인간 Fc 불변 영역에 대한 1개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이상)의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 치환은 네이티브 인간 Fc 불변 영역에 대해 예를 들어 237번, 238번, 239번, 248번, 250번, 252번, 254번, 255번, 256번, 257번, 258번, 265번, 270번, 286번, 289번, 297번, 298번, 303번, 305번, 307번, 308번, 309번, 311번, 312번, 314번, 315번, 317번, 325번, 332번, 334번, 360번, 376번, 380번, 382번, 384번, 385번, 386번, 387번, 389번, 424번, 428번, 433번, 434번, 또는 436번 아미노산 위치(EU 넘버링)에서 있을 수 있다. 치환은 237번 위치에서의 글리신에 대한 메티오닌; 238번 위치에서의 프롤린에 대한 알라닌; 239번 위치에서의 세린에 대한 라이신; 248번 위치에서의 라이신에 대한 아이소류신; 250번 위치에서의 트레오닌에 대한 알라닌, 페닐알라닌, 아이소류신, 메티오닌, 글루타민, 세린, 발린, 트립토판 또는 티로신; 252번 위치에서의 메티오닌에 대한 페닐알라닌, 트립토판 또는 티로신; 254번 위치에서의 세린에 대한 트레오닌; 255번 위치에서의 아르기닌에 대한 글루탐산; 256번 위치에서의 트레오닌에 대한 아스파르트산, 글루탐산 또는 글루타민; 257번 위치에서의 프롤린에 대한 알라닌, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 세린, 트레오닌 또는 발린; 258번 위치에서의 글루탐산에 대한 히스티딘; 265번 위치에서의 아스파르트산에 대한 알라닌; 270번 위치에서의 아스파르트산에 대한 페닐알라닌; 286번 위치에서의 아스파라긴에 대한 알라닌 또는 글루탐산; 289번 위치에서의 트레오닌에 대한 히스티딘; 297번 위치에서의 아스파라긴에 대한 알라닌; 298번 위치에서의 세린에 대한 글리신; 303번 위치에서의 발린에 대한 알라닌; 305번 위치에서의 발린에 대한 알라닌; 307번 위치에서의 트레오닌에 대한 알라닌, 아스파르트산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 라이신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 발린, 트립토판 또는 티로신; 308번 위치에서의 발린에 대한 알라닌, 페닐알라닌, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 글루타민 또는 트레오닌; 309번 위치에서의 류신 또는 발린에 대한알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 프롤린 또는 아르기닌; 311번 위치에서의 글루타민에 대한 알라닌, 히스티딘 또는 아이소류신; 312번 위치에서의 아스파르트산에 대한 알라닌 또는 히스티딘; 314번 위치에서의 류신에 대한 라이신 또는 아르기닌; 315번 위치에서의 아스파라긴에 대한 알라닌 또는 히스티딘; 317번 위치에서의 라이신에 대한 알라닌; 325번 위치에서의 아스파라긴에 대한 글리신; 332번 위치에서의 아이소류신에 대한 발린; 334번 위치에서의 라이신에 대한 류신; 360번 위치에서의 라이신에 대한 히스티딘; 376번 위치에서의 아스파르트산에 대한 알라닌; 380번 위치에서의 글루탐산에 대한 알라닌; 382번 위치에서의 글루탐산에 대한 알라닌; 384번 위치에서의 아스파라긴 또는 세린에 대한 알라닌; 385번 위치에서의 글리신에 대한 아스파르트산 또는 히스티딘; 386번 위치에서의 글루타민에 대한 프롤린; 387번 위치에서의 프롤린에 대한 글루탐산; 389번 위치에서의 아스파라긴에 대한 알라닌 또는 세린; 424번 위치에서의 세린에 대한 알라닌; 428번 위치에서의 메티오닌에 대한 알라닌, 아스파르트산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 라이신, 류신, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판 또는 티로신; 433번 위치에서의 히스티딘에 대한 라이신; 434번 위치에서의 아스파라긴에 대한 알라닌, 페닐알라닌, 히스티딘, 세린, 트립토판 또는 티로신; 및 436번 위치에서의 티로신 또는 페닐알라닌에 대한 히스티딘(모두 EU 넘버링임)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편의 몇몇 실시형태에서, 변이체 인간 Fc 불변 영역은 각각 EU 넘버링에서 428번 위치에서의 메티오닌 및 434번 위치에서의 아스파라긴을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 12 또는 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 및 서열 번호 8 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
본 개시내용은 또한 에쿨리주맙의 중쇄 가변 영역(서열 번호 7) 또는 에쿨리주맙의 중쇄 영역의 CDR(서열 번호 1-3) 및 본 명세서에 기재된 임의의 변이체 인간 Fc 불변 영역, 예를 들어 각각 EU 넘버링에서 428번 위치에서의 메티오닌 및 434번 위치에서의 아스파라긴을 포함하는 변이체 인간 Fc 불변 영역을 포함하는 항체를 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 에쿨리주맙의 혈청 중의 반감기에 대비된 인간에서 증가한 반감기를 가진다. 반감기는 본 명세서에 사용되는 바대로 신체에서의 항체 약물의 혈장 농도가 절반 또는 50%로 감소하는 데 걸리는 시간으로 정의된다. 혈청 농도에서의 이 50% 감소는 항체 청소의 천연 방법에 의해 제거되지 않는 순환하는 약물의 양을 반영한다. 에쿨리주맙의 반감기는 PNH 환자에서 272 + 82시간 또는 11.3일 및 aHUS 환자에서 12.1일인 것으로 결정되었다(솔리리스(Soliris) 처방 정보 참조). 본 명세서에 기재된 항체 또는 단편의 인간에서의 반감기는 에쿨리주맙의 인간에서의 반감기에 대비해 증가할 수 있다. 에쿨리주맙에 대비된 반감기 증가는 에쿨리주맙의 반감기의 적어도 1.5배, 에쿨리주맙의 반감기의 적어도 2배, 에쿨리주맙의 반감기의 적어도 2.5배 또는 에쿨리주맙의 반감기의 적어도 3배일 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편의 몇몇 실시형태에서, 항체는적어도 10일 또는 초과(예를 들어, 적어도 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일, 39일 또는 40일)인 인간에서의 혈청 반감기를 가진다. 이 반감기(또는 에쿨리주맙에 대비된 반감기의 연장)는 몇몇 실시형태에서 천연 발생 인간 Fc 불변 영역을 함유하는 본 명세서에 기재된 항체에 의해 달성될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 반감기는 본 명세서에 기재된 변이체 인간 Fc 불변 영역을 포함하는 항체에 대비되어 측정된다. 본 명세서에 기재된 항체 또는 단편의 인간에서의 반감기는 에쿨리주맙의 인간에서의 반감기에 대비해 증가할 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체의 인간에서의 반감기는 적어도 25일, 적어도 26일, 적어도 27일, 적어도 28일, 적어도 29일, 적어도 30일, 적어도 31일, 적어도 32일, 적어도 33일, 적어도 34일 또는 적어도 35일이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 단편은 인간화, 완전 인간, 탈면역화 또는 키메라이다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 단편은 예를 들어 재조합 항체, 단쇄 항체, 다이아바디, 인트라바디, Fv 단편, Fd 단편, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab')2 단편일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 단편은 비상동성 모이어티, 예를 들어 당을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 글라이코실화될 수 있다. 비상동성 모이어티는 또한 검출 가능한 라벨, 예를 들어 형광 라벨, 발광 라벨, 중금속 라벨, 방사성 라벨 또는 효소 라벨일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CHO 세포에서 제조될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출 가능한 시알산 잔기를 함유하지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 순환 시 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 안정화 및 (b) 순환 시 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 보유 중 하나 또는 둘 다를 개선하는 모이어티에 의해 변형될 수 있다. 이러한 모이어티는 PEG(PEG화)일 수 있다.
훨씬 또 다른 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 핵산을 특징으로 한다. 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 클로닝 또는 발현 벡터) 및 벡터를 포함하는 세포(예를 들어, 곤충 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 또는 포유동물 세포)를 또한 특징으로 한다. 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 임의로 발현 벡터(통합된 또는 염색체외)를 함유하는 상기 기재된 세포(또는 세포의 배양)를 제공하는 단계를 포함하고, 벡터는 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 핵산을 함유한다. 세포 또는 세포의 배양물은 핵산에 의해 코딩된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 세포(또는 세포의 배양물)에 의한 발현을 허용하기에 충분한, 시간 동안 및 조건 하에, 배양된다. 상기 방법은 세포(또는 배양물의 세포)로부터 또는 세포 또는 세포들이 배양되는 배지로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리시키는 것을 또한 포함할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 약제학적으로 허용되는 담체 및 하나 이상의 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 (ⅰ) 하나 이상의 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 (ⅱ) 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인간에게 전달하기 위한 수단을 포함하는 치료학적 키트를 특징으로 한다. 수단은 예를 들어 주사기 또는 펌프일 수 있다.
훨씬 또 다른 양상에서, 본 개시내용은 라벨 및 하나 이상의 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 용기를 포함하는 제조 물품을 특징으로 하고, 라벨은 조성물이 보체 관련 병태를 가지거나, 이것을 가지는 것으로 의심되거나, 이것이 발병할 위험에 처해있는 인간에게 투여된다는 것을 표시한다. 제조 물품은 보체 관련 병태를 가지거나, 이것을 가지는 것으로 의심되거나, 이것이 발별할 위험에 처해있는 인간을 치료하기 위한 용도를 위해 하나 이상의 추가적인 활성 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 보체 관련 병태를 겪는 환자를 치료하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 보체 관련 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 하나 이상의 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 보체 관련 병태는 예를 들어 류마티스 관절염, 항인지질 항체 증후군, 루프스 신염, 허혈-재관류 손상, 비정형 용혈성 요독 증후군, 정형 용혈성 요독 증후군, 발작성 야간혈색소 뇨증, 조밀침착병, 시신경 척수염, 다초점 운동 신경병증, 다발성 경화증, 황반변성, HELLP 증후군, 자연 유산, 혈전성 혈소판감소성 자반병, 소수면역 혈관염, 수포성 표피박리증, 재발성 유산, 외상성 뇌 손상, 심근염, 뇌혈관 장애, 말초 혈관 장애, 신혈관 장애, 장간막/장 혈관 장애, 혈관염, 헤노흐-쇤라인 자색반 신장염, 전신 홍반성 낭창 관련 혈관염, 류마티스 관절염을 수반한 혈관염, 면역 복합 혈관염, 타카야슈병, 확장성 심근병증, 당뇨병 혈관증, 가와사키병, 정맥 가스 색전증, 스텐트 배치 후 재협착, 회전죽상반절제술, 경피적 관상동맥 확장술, 중증 근무력증, 한냉 응집소 질환, 피부근염, 발작성 한냉 혈색소뇨증, 항인지질 증후군, 그레이브병, 죽상동맥경화증, 알츠하이머병, 전신 염증성 반응 패혈증, 패혈성 쇼크, 척수 손상, 사구체신염, 이식 거부(예를 들어, 신장 이식), 하시모토 갑상선염, 1형 당뇨병, 건선, 천포창, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소성 자반병, 굿패스쳐 증후군, 데고스병 및 재해성 항인지질 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "항체"는 2개의 경쇄 폴리펩타이드 및 2개의 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 전체 항체를 의미한다. 전체 항체는 IgM, IgG, IgA, IgD, 및 IgE 항체를 포함하는 상이한 항체 아이소타입을 포함한다. 용어 "항체"는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 키메라화 또는 키메라 항체, 인간화된 항체, 원시류화 항체, 탈면역화 항체, 및 완전 인간 항체를 포함한다. 항체는 임의의 다양한 종, 예를 들어 포유동물, 예컨대 인간, 비인간 영장류(예를 들어, 오랑우탄, 개코원숭이 또는 침팬치), 말, 소, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼, 기니아 피그, 게르빌루스쥐, 햄스터, 랫트 및 마우스에서 제조되거나 이로부터 유래할 수 있다. 항체는 정제된 또는 재조합 항체일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "항체 단편", "항원 결합 단편" 또는 유사한 용어는 표적 항원에 결합하고 표적 항원의 활성을 저해하는 능력을 보유하는 항체(예를 들어, 인간 C5)의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 예를 들어 단쇄 항체, 단쇄 Fv 단편(scFv), Fd 단편, Fab 단편, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편을 포함한다. scFv 단편은 scFv가 유래한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 다를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬이다. 또한, 인트라바디, 미니바디, 트리아바디 및 다이아바디가 항체의 정의에 또한 포함되고, 본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 문헌[Todorovska et al. (2001) J Immunol Methods 248(1):47-66; Hudson and Kortt (1999) J Immunol Methods 231(1):177-189; Poljak (1994) Structure 2(12):1121-1123; Rondon and Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 51:257-283](각각의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용됨)을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "항체 단편"은 또한 예를 들어 단일 도메인 항체, 예컨대 낙타화 단일 도메인 항체를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem Sci 26:230-235; Nuttall et al. (2000) Curr Pharm Biotech 1:253-263; Reichmann et al. (1999) J Immunol Meth 231:25-38]; PCT 출원 공보 WO 제94/04678호 및 WO 제94/25591호; 및 미국 특허 제6,005,079호(모두 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용됨)를 참조한다. 몇몇 실시형태에서, 본 개시내용은 단일 도메인 항체가 형성되도록 변형을 가지는 2개의 VH 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체를 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 항원 결합 단편은 중쇄 폴리펩타이드의 가변 영역 및 경쇄 폴리펩타이드의 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 단편은 항체의 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드의 CDR을 포함한다.
달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 당업자가 흔히 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 바람직한 방법 및 재료가 하기 기재되어 있지만, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료는 현재 개시된 방법 및 조성물의 실행 또는 시험에서 또한 사용될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참조문헌은 참조문헌으로 그 전문이 인용된다.
본 개시내용, 예를 들어 보체 관련 병태를 치료하거나 예방하는 방법의 다른 특징 및 이점은 하기 설명, 예 및 청구항으로부터 명확할 것이다.
서열의 간단한 설명
서열 번호 1은 (통합 카밧-쵸티아 정의 하에 정의된 바와 같은) 에쿨리주맙의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 2는 (카밧 정의 하에 정의된 바와 같은) 에쿨리주맙의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 3은 (통합 카밧 정의 하에 정의된 바와 같은) 에쿨리주맙의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 4는 (카밧 정의 하에 정의된 바와 같은) 에쿨리주맙의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 5는 (카밧 정의 하에 정의된 바와 같은) 에쿨리주맙의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 6은 (카밧 정의 하에 정의된 바와 같은) 에쿨리주맙의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 7은 에쿨리주맙의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 8은 에쿨리주맙 및 BNJ441 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 9는 에쿨리주맙의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 10은 에쿨리주맙의 전체 중쇄의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 11은 에쿨리주맙 및 BNJ441 항체의 전체 경쇄의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 12는 BNJ441 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 13은 BNJ441 항체의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 14는 BNJ441 항체의 전체 중쇄의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 15는 YTE 치환을 포함하는 IgG2 중쇄 불변 영역 변이체의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 16은 (상기) 서열 번호 15에 기재된 중쇄 불변 영역을 포함하는 에쿨리주맙 변이체의 전체 중쇄의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 17은 서열 번호 4에 대한 8번 위치에서의 히스티딘에 대한 글리신 치환을 가지는 (카밧 정의 하에 정의된 바와 같은) 에쿨리주맙의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 18은 BNJ423 항체의 경쇄 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 19는 8번 위치에서의 서열 번호 2에 대한 세린이 히스티딘에 의해 치환된 에쿨리주맙의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 20은 소위 "FLAG" 태그의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 21은 항원 태그로서 흔히 사용되는 폴리히스티딘 서열을 도시한다.
서열 번호 22는 소위 헤마글루티닌 태그의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 23은 (서열 번호 1에 대한) 2번 위치에서의 티로신이 히스티딘에 의해 치환된 에쿨리주맙의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 24는 EHG303 항체의 중쇄 폴리펩타이드 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 25는 EHG303 항체의 경쇄 폴리펩타이드 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 26은 EHL049 항체의 중쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 27은 EHL049 항체의 경쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 28은 EHL000 중쇄 폴리펩타이드 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 29는 EHL000 항체의 경쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 30은 BHL006의 경쇄 폴리펩타이드 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 31은 BHL006 항체의 중쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 32는 BHL009 항체의 경쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 33은 BHL009 항체의 중쇄의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 34는 BHL0011 항체의 경쇄의 아미노산 서열을 도시한다.
서열 번호 35는 BHL011 항체의 중쇄의 아미노산 서열을 도시한다.
도 1은 외인성 인간 C5의 존재 또는 부재 하의 인간 FcRn 형질전환 마우스의 혈청으로부터의 에쿨리주맙의 청소를 도시하는 선 그래프이다. Y축은 혈청에 남은 항체의 백분율을 나타내고, X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 2는 IgG2 불변 영역을 가지는 에쿨리주맙 변이체(Ecu-IgG2) 및 마우스로부터의 혈청으로부터 YTE 치환을 함유하는 Ecu-IgG2 항체(Ecu-IgG2(YTE))의 청소를 도시하는 선 그래프이다. Y축은 혈청에 남은 항체의 백분율을 나타내고, X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 3은 IgG2 불변 영역불변 영역을 가지는 에쿨리주맙 변이체(Ecu-IgG2) 및 마우스로부터의 혈청으로부터 YTE 치환을 함유하는 Ecu-IgG2 항체(Ecu-IgG2(YTE))의 청소를 도시하는 선 그래프이다. 실험을 외인성 인간 C5의 존재 또는 부재 하에 수행한다. Y축은 혈청에 남은 항체의 백분율을 나타내고, X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 4는 EHL000, EHG303 및 EHL049의 3개의 항-C5 항체에 대한 (pH 7.4에서의) 결합 및 (pH 7.4 및 pH 6.0에서의) 해리의 동역학을 도시하는 센서그램 도면이다. Y축은 임의 단위인 반면, X축은 (초 단위의) 시간을 나타낸다.
도 5a는 EHG303(Y27H-S57H 이중 치환) 항체, 에쿨리주맙의 Y27H 단일 치환 변이체 및 에쿨리주맙(ecu; Ec293F)에 대한 pH 7.4 및 pH 6.0에서의 해리의 동역학을 도시하는 센서그램 도면이다. Y축은 나노미터(nm) 단위인 반면, X축은 (초 단위의) 시간을 나타낸다.
도 5b는 EHG304(I34H-L52H 이중 치환) 항체, 에쿨리주맙의 I34H 단일 치환 변이체 및 에쿨리주맙(ecu; Ec293F)에 대한 pH 7.4 및 pH 6.0에서의 해리의 동역학을 도시하는 센서그램 도면이다. Y축은 나노미터(nm) 단위인 반면, X축은 (초 단위의) 시간을 나타낸다. EHG304 항체는 선택에 대한 제2 한계치를 충족하지 않고, 즉 이것은 pH 7.4에서의 해리에 대해 (에쿨리주맙으로부터의) 최대 허용 변경을 초과하였다.
도 5c는 EHG303(Y27H-S57H 이중 치환) 항체 및 에쿨리주맙(ecu; Ec293F)에 대한 pH 7.4 및 pH 6.0에서의 해리의 동역학을 도시하는 센서그램 도면이다. Y축은 나노미터(nm) 단위인 반면, X축은 (초 단위의) 시간을 나타낸다.
도 5d는 EHL049 [G31H(경쇄)/Y27H-S57H 이중 치환(중쇄)] 항체, 에쿨리주맙의 Y27H-S57H(EHG303) 이중 치환 변이체 및 에쿨리주맙(ecu)에 대한 pH 7.4 및 pH 6.0에서의 해리의 동역학을 도시하는 센서그램 도면이다. Y축은 나노미터(nm) 단위인 반면, X축은 (초 단위의) 시간을 나타낸다.
도 5e는 EHL058 [G31H(경쇄)/L52H-S57H 이중 치환(중쇄)] 항체, 에쿨리주맙의 L52H-S57H 이중 치환 (중쇄) 변이체 및 에쿨리주맙(ecu)에 대한 pH 7.4 및 pH 6.0에서의 해리의 동역학을 도시하는 센서그램 도면이다. Y축은 나노미터(nm) 단위인 반면, X축은 (초 단위의) 시간을 나타낸다. EHL058 항체는 선택에 대한 제2 한계치를 충족하지 않고, 즉 이것은 pH 7.4에서의 해리에 대해 (에쿨리주맙으로부터의) 최대 허용 변경을 초과하였다.
도 6은 NOD/scid/C5 결핍 마우스의 혈청으로부터의 EHL000, BNJ421 및 BNJ423의 청소를 도시하는 선 그래프이다. Y축은 혈청에 남은 항체의 백분율을 나타내고, X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 7은 인간 C5의 존재 또는 부재 하의 NOD/scid/C5 결핍 마우스의 혈청으로부터의 EHL000, BNJ421 및 BNJ423의 청소를 도시하는 선 그래프이다. Y축은 혈청에 남은 항체의 백분율을 나타내고, X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 8은 생체외 용혈성 검정에서 EHL000, BNJ423, 및 BNJ421 항체의 활성을 도시하는 선 그래프이다. Y축은 용혈의 백분율을 나타내고, X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 9a는 hFcRn-형질전환 마우스에서의 BHL011 항체의 약동학을 도시하는 선 그래프이다. 각각의 선은 상이한 동물을 나타낸다. Y축은 ㎍/㎖ 단위의 항체의 농도를 나타낸다. X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 9b는 hFcRn-형질전환 마우스에서의 BHL011 항체의 약동학을 도시하는 선 그래프이다. 각각의 선은 상이한 동물을 나타낸다. Y축은 각각의 시점에서의 혈청에 남은 1일에서의 항체의 농도(%)를 나타낸다. X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 10a는 hFcRn-형질전환 마우스에서의 BHL006 항체의 약동학을 도시하는 선 그래프이다. 각각의 선은 상이한 동물을 나타낸다. Y축은 ㎍/㎖ 단위의 항체의 농도를 나타낸다. X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 10b는 hFcRn-형질전환 마우스에서의 BHL006 항체의 약동학을 도시하는 선 그래프이다. 각각의 선은 상이한 동물을 나타낸다. Y축은 각각의 시점에서의 혈청에 남은 1일에서의 항체의 농도(%)를 나타낸다. X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 11a는 hFcRn-형질전환 마우스에서의 BHL009 항체의 약동학을 도시하는 선 그래프이다. 각각의 선은 상이한 동물을 나타낸다. Y축은 ㎍/㎖ 단위의 항체의 농도를 나타낸다. X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 11b는 hFcRn-형질전환 마우스에서의 BHL009 항체의 약동학을 도시하는 선 그래프이다. 각각의 선은 상이한 동물을 나타낸다. Y축은 각각의 시점에서의 혈청에 남은 1일에서의 항체의 농도(%)를 나타낸다. X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 12는 hFcRn-형질전환 마우스에서의 BHL011, BHL006 및 BHL009 항체의 평균 약동학의 로그 도면을 도시하는 선 그래프이다. 각각의 선은 표시된 바와 같은 상이한 항체를 나타낸다. Y축은 각각의 시점에서의 혈청에 남은 1일에서의 항체의 농도(%)를 나타낸다. X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 13은 hFcRn-형질전환 마우스에서의 BHL011, BHL006 및 BHL009 항체의 평균 약동학의 선형 도면을 도시하는 선 그래프이다. 각각의 선은 표시된 바와 같은 상이한 항체를 나타낸다. Y축은 각각의 시점에서의 혈청에 남은 1일에서의 항체의 농도(%)를 나타낸다. X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 14는 단일 투약 후 생체외 혈청 용혈성 검정에서 BHL011 항체의 차단 능력을 도시하는 선 그래프이다. Y축은 (투약 전 수준에 대한) 용혈의 백분율을 나타내고, X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 15는 단일 투약 후 생체외 혈청 용혈성 검정에서 BHL006 항체의 차단 능력을 도시하는 선 그래프이다. Y축은 (투약 전 수준에 대한) 용혈의 백분율을 나타내고, X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 16은 단일 투약 후 생체외 혈청 용혈성 검정에서 BHL009 항체의 차단 능력을 도시하는 선 그래프이다. Y축은 (투약 전 수준에 대한) 용혈의 백분율을 나타내고, X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 17은 단일 투약 후 BHL011 혈청 농도와 생체외 혈청 용혈성 활성의 상관관계를 도시하는 선 그래프이다. Y축은 (투약 전 수준에 대한) 용혈의 백분율을 나타내고, X축은 ㎍/㎖ 단위의 항체 농도를 나타낸다.
도 18은 단일 투약 후 BHL006 혈청 농도와 생체외 혈청 용혈성 활성의 상관관계를 도시하는 선 그래프이다. Y축은 (투약 전 수준에 대한) 용혈의 백분율을 나타내고, X축은 ㎍/㎖ 단위의 항체 농도를 나타낸다.
도 19는 단일 투약 후 BHL009 혈청 농도와 생체외 혈청 용혈성 활성의 상관관계를 도시하는 선 그래프이다. Y축은 (투약 전 수준에 대한) 용혈의 백분율을 나타내고, X축은 ㎍/㎖ 단위의 항체 농도를 나타낸다.
도 20은 hFcRn-형질전환 마우스에서 BHL011, BHL009 또는 BHL006의 단일 투약 후 평균 생체외 용혈성 활성을 도시하는 선 그래프이다. 각각의 선은 표시된 바와 같은 상이한 항체를 나타낸다. Y축은 (투약 전 수준에 대한) 용혈의 백분율을 나타내고, X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 21a 및 도 21b는 pH의 함수로서 BNJ441 및 에쿨리주맙의 친화도의 반로그(도 21a) 및 선형(도 21b) 도면을 도시하는 한 쌍의 선 그래프이다. Y축은 해리(%)를 나타내고, X축은 pH이다.
도 22는 NOD/scid 마우스에서의 및 인간 C5의 부재 하에 BNJ441 및 에쿨리주맙의 약동학을 도시하는 선 그래프이다. Y축은 ㎍/㎖ 단위의 항체의 농도를 나타낸다. X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 23은 NOD/scid 마우스에서의 및 인간 C5의 존재 하의 BNJ441 및 에쿨리주맙의 약동학을 도시하는 선 그래프이다. Y축은 ㎍/㎖ 단위의 항체의 농도를 나타낸다. X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 24는 시간의 함수로서 인간 C5의 존재 하의 NOD/scid 마우스의 혈청에 남은 BNJ441 및 에쿨리주맙의 백분율을 도시하는 선 그래프이다. Y축은 ㎍/㎖ 단위의 항체의 농도를 나타낸다. X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 25는 시간의 함수로서 단일 투약 후 BNJ441 항체 및 에쿨리주맙의 생체외 혈청 용혈성 차단 활성을 도시하는 선 그래프이다. Y축은 (투약 전 수준에 대한) 용혈의 백분율을 나타내고, X축은 일 단위의 시간을 나타낸다.
도 26은 건강한 지원자에 대한 200㎎ 또는 400㎎의 용량의 정맥내 투여 후 평균 혈청 BNJ441 농도-시간 프로필(상부 패널 - 선형 스케일; 하부 패널 - 로그-선형 스케일)을 도시한다.
도 27은 건강한 지원자에 대한 위약, 200㎎의 BNJ441 또는 400㎎의 BNJ441의 정맥내 투여 후 평균 닭 적혈구 용혈-시간 프로필을 도시한다.
도 28은 건강한 인간 지원자에 대한 BNJ441의 정맥내 투여 후 BNJ441 농도와 닭 적혈구 용혈(%) 사이의 관계식을 도시한다.
도 29는 말단 보체 활성 검정에서의 에쿨리주맙과 비교된 BNJ441의 효력을 도시한다.
도 30은 BNJ441의 구조를 도시한다.
도 31은 BNJ441의 사슬간 다이설파이드 결합을 도시한다.
본 개시내용은 무엇보다도 말단 보체(예를 들어, C5b-9 TCC의 조립 및/또는 활성) 및 C5a 아나필라톡신 매개 염증을 저해하고 따라서 보체 관련 장애를 치료하기에 유용한 항체를 제공한다. 항체는 예를 들어 인간에서 증가한 혈청 반감기를 포함하는 에쿨리주맙에 대비된 다수의 개선된 특성을 가진다. 어떤 방식으로든 제한이도록 의도되지 않으면서, 예시적인 항체, 접합체, 약제학적 조성물 및 제제, 및 임의의 이들을 사용한 방법이 하기 기술되고, 실험예에 예시되어 있다.
항체
본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 보체 성분 C5(예를 들어, 인간 C5)에 결합하고, 단편 C5a 및 C5b로의 C5의 절단을 저해한다. 상기 기재된 바와 같이, 이러한 항체는 또한 치료학적 목적에 사용되는 다른 항-C5 항체(예를 들어, 에쿨리주맙)에 대비된 예를 들어 개선된 약동학적 특성을 가진다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 (ⅰ) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (ⅱ) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (ⅲ) 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (ⅳ) 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (ⅴ) 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (ⅵ) 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하고, (ⅰ)-(ⅵ) 중 적어도 1개(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상)의 아미노산(들)은 상이한 아미노산에 의해 치환된다.
CDR의 정확한 경계는 상이한 방법에 따라 상이하게 한정된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 내의 CDR 또는 프레임워크 영역의 위치는 카밧 등[(1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest." NIH Publication No. 91-3242, 미국 보건사회복지부(메릴랜드주 베데스다)]에 의해 정의될 수 있다. 이러한 경우에, CDR은 "카밧 CDR"(예를 들어, "카밧 LCDR2" 또는 "카밧 HCDR1")이라 칭해질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 CDR의 위치는 쵸티아 등[(1989) Nature 342:877-883]에 의해 정의될 수 있다. 따라서, 이 영역은 "쵸티아 CDR"(예를 들어, "쵸티아 LCDR2" 또는 "쵸티아 HCDR3")이라 칭해질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR의 위치는 카밧-쵸티아 통합 정의에 의해 정의될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 이 영역은 "조합 카밧-쵸티아 CDR"이라 칭해질 수 있다. 토마스(Thomas) 등[(1996) Mol Immunol 33(17/18):1389-1401]은 카밧 및 쵸티아 정의에 따라 CDR 경계의 확인을 예시한다.
임의의 아미노산은 임의의 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 치환은 보존적 치환이다. 보존적 치환은 통상적으로 하기 기 내의 치환을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 아이소류신 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 라이신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산은 히스티딘에 의해 치환된다.
몇몇 실시형태에서, 중쇄 CDR1의 적어도 1개(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 CDR2의 적어도 1개(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 CDR3의 적어도 1개(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다.
몇몇 실시형태에서, 경쇄 CDR1의 적어도 1개(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 CDR2의 적어도 1개(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 경쇄 CDR3의 적어도 1개(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 아미노산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다.
몇몇 실시형태에서, 서열 번호 1에 대한 1번 위치에서의 글리신, 서열 번호 1에 대한 2번 위치에서의 티로신, 서열 번호 1에 대한 3번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 1에 대한 4번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 1에 대한 5번 위치에서의 세린, 서열 번호 1에 대한 6번 위치에서의 아스파라긴, 서열 번호 1에 대한 7번 위치에서의 티로신, 서열 번호 1에 대한 8번 위치에서의 트립토판, 서열 번호 1에 대한 9번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 1에 대한 10번 위치에서의 글루타민, 서열 번호 2에 대한 1번 위치에서의 글루탐산, 서열 번호 2에 대한 2번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 2에 대한 3번 위치에서의 류신, 서열 번호 2에 대한 4번 위치에서의 프롤린, 서열 번호 2에 대한 5번 위치에서의 글리신, 서열 번호 2에 대한 6번 위치에서의 세린, 서열 번호 2에 대한 7번 위치에서의 글리신, 서열 번호 2에 대한 8번 위치에서의 세린, 서열 번호 2에 대한 9번 위치에서의 트레오닌, 서열 번호 2에 대한 10번 위치에서의 글루탐산, 서열 번호 2에 대한 11번 위치에서의 티로신, 서열 번호 2에 대한 12번 위치에서의 트레오닌, 서열 번호 2에 대한 13번 위치에서의 글루탐산, 서열 번호 2에 대한 14번 위치에서의 아스파라긴, 서열 번호 2에 대한 15번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 2에 대한 16번 위치에서의 라이신, 서열 번호 2에 대한 17번 위치에서의 아스파르트산, 서열 번호 3에 대한 1번 위치에서의 티로신, 서열 번호 3에 대한 2번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 3에 대한 3번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 3에 대한 4번 위치에서의 글리신, 서열 번호 3에 대한 5번 위치에서의 세린, 서열 번호 3에 대한 6번 위치에서의 세린, 서열 번호 3에 대한 7번 위치에서의 프롤린, 서열 번호 3에 대한 8번 위치에서의 아스파라긴, 서열 번호 3에 대한 9번 위치에서의 트립토판, 서열 번호 3에 대한 10번 위치에서의 티로신, 서열 번호 3에 대한 11번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 3에 대한 12번 위치에서의 아스파르트산 및 서열 번호 3에 대한 13번 위치에서의 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 치환이 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 서열 번호 8에 대한 31번 위치에서의 글리신은 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 예를 들어, 에쿨리주맙의 경쇄의 CDR1에서의 밑줄표시된 글리신은 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있다: GASENIYGALN(서열 번호 4). 치환은 글리신에 대한 히스티딘, 즉 GASENIYHALN(서열 번호 17)일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 서열 번호 7에 대한 26번 위치에서의 글리신, 서열 번호 7에 대한 27번 위치에서의 티로신, 서열 번호 7에 대한 28번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 7에 대한 29번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 7에 대한 30번 위치에서의 세린, 서열 번호 7에 대한 31번 위치에서의 아스파라긴, 서열 번호 7에 대한 32번 위치에서의 티로신, 서열 번호 7에 대한 33번 위치에서의 트립토판, 서열 번호 7에 대한 34번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 7에 대한 35번 위치에서의 글루타민, 서열 번호 7에 대한 50번 위치에서의 글루탐산, 서열 번호 7에 대한 51번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 7에 대한 52번 위치에서의 류신, 서열 번호 7에 대한 53번 위치에서의 프롤린, 서열 번호 7에 대한 54번 위치에서의 글리신, 서열 번호 7에 대한 55번 위치에서의 세린, 서열 번호 7에 대한 56번 위치에서의 글리신, 서열 번호 7에 대한 57번 위치에서의 세린, 서열 번호 7에 대한 58번 위치에서의 트레오닌, 서열 번호 7에 대한 59번 위치에서의 글루탐산, 서열 번호 7에 대한 60번 위치에서의 티로신, 서열 번호 7에 대한 61번 위치에서의 트레오닌, 서열 번호 7에 대한 62번 위치에서의 글루탐산, 서열 번호 7에 대한 63번 위치에서의 아스파라긴, 서열 번호 7에 대한 64번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 7에 대한 65번 위치에서의 라이신, 서열 번호 7에 대한 66번 위치에서의 아스파르트산, 서열 번호 7에 대한 99번 위치에서의 티로신, 서열 번호 7에 대한 100번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 7에 대한 101번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 7에 대한 102번 위치에서의 글리신, 서열 번호 7에 대한 103번 위치에서의 세린, 서열 번호 7에 대한 104번 위치에서의 세린, 서열 번호 7에 대한 105번 위치에서의 프롤린, 서열 번호 7에 대한 106번 위치에서의 아스파라긴, 서열 번호 7에 대한 107번 위치에서의 트립토판, 서열 번호 7에 대한 108번 위치에서의 티로신, 서열 번호 7에 대한 109번 위치에서의 페닐알라닌, 서열 번호 7에 대한 110번 위치에서의 아스파르트산 및 서열 번호 7에 대한 111번 위치에서의 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항-C5 항체는 임의의 조합으로 2개 이상(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상)의 임의의 상기 치환을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항-C5 항체는 에쿨리주맙과 관련하여 하기 기준을 충족시키는 적어도 하나의 치환을 포함한다:
(1) 에쿨리주맙에 대해 관찰된 800초에서의 평균 피크 상 이동과 비교하여 800초에서의 33% 더 작은 피크 상 이동의 pH 7.4에서의 결합 동력학에 대한 최대 변경;
(2) 에쿨리주맙에 대해 관찰된 800초에서의 평균 피크 상 이동과 비교하여 800초에서의 3배 이하의 피크 상 이동 감소의 pH 7.4에서의 해리 동력학에 대한 최대 변경; 및
(3) 에쿨리주맙에 대해 관찰된 800초에서의 평균 피크 상 이동과 비교하여 800초에 걸쳐 적어도 3배의 피크 상 이동 감소의 pH 6.0에서의 해리 동력학에 대한 최대 변경.
예를 들어, 상기 기준 (1)과 관련하여, 에쿨리주맙과의 결합의 800초 후의 평균 피크 상 이동이 대략 0.75㎚인 경우, 0.5㎚ 미만의 상 이동(예를 들어, 2회 이상 재현)을 가지는 시험 항체는 상기 기준을 충족시키지 않을 것이다. 반대로, 800초에 0.5㎚ 초과의 피크 상 이동을 가지는 항-C5 항체는 제1 기준을 충족시킨다. 이러한 치환은 pH 7.4에서 에쿨리주맙의 ka 및 kd로부터 적은 정도로 오직 편차가 생기지만, pH 6.0에서 더 상당히 에쿨리주맙의 kd로부터 편차가 생기는 항-C5 항체를 생성시킨다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 서열 번호 8에 대한 31번 위치에서의 글리신, 서열 번호 8에 대한 33번 위치에서의 류신, 서열 번호 8에 대한 91번 위치에서의 발린 및 서열 번호 8에 대한 94번 위치에서의 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 적어도 1개(예를 들어, 적어도 2개, 3개 또는 4개)의 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 서열 번호 7에 대한 27번 위치에서의 티로신, 서열 번호 7에 대한 34번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 7에 대한 52번 위치에서의 류신 및 서열 번호 7에 대한 57번 위치에서의 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 적어도 1개(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 아미노산 치환(들)을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 서열 번호 8에 대한 31번 위치에서의 글리신, 서열 번호 8에 대한 33번 위치에서의 류신, 서열 번호 8에 대한 91번 위치에서의 발린 및 서열 번호 8에 대한 94번 위치에서의 트레오닌으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 이의 경쇄 가변 영역에서 함유한다. 하기 표 1을 참조한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 서열 번호 7에 대한 27번 위치에서의 티로신, 서열 번호 7에 대한 34번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 7에 대한 52번 위치에서의 류신 및 서열 번호 7에 대한 57번 위치에서의 세린으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 이의 중쇄 가변 영역에서 함유한다. 하기 표 1을 참조한다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 서열 번호 1-6에 의해 기재된 CDR에 대해 적어도 2개(예를 들어, 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개)의 아미노산 치환을 포함한다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 표 1에 기재된 아미노산 위치에서 조합으로 2개 이상의 치환을 포함한다.
Figure 112021046604377-pat00001
Figure 112021046604377-pat00002
Figure 112021046604377-pat00003
Figure 112021046604377-pat00004
Figure 112021046604377-pat00005
표 1에 기재된 치환은 표시된 아미노산 잔기와 다른 임의의 아미노산에 대한 것일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상이한 아미노산은 히스티딘이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 서열 번호 7에 대한 27번 위치에서의 티로신, 서열 번호 7에 대한 34번 위치에서의 아이소류신, 서열 번호 7에 대한 52번 위치에서의 류신 및 서열 번호 7에 대한 57번 위치에서의 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서 이루어진 치환을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 7에 대한 27번 위치에서의 티로신 및 서열 번호 7에 대한 52번 위치에서의 류신 둘 다는 각각 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 7에 대한 34번 위치에서의 아이소류신 및 서열 번호 7에 대한 57번 위치에서의 세린 둘 다는 각각 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 7에 대한 34번 위치에서의 아이소류신 및 서열 번호 7에 대한 52번 위치에서의 류신 둘 다는 각각 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 7에 대한 27번 위치에서의 티로신 및 서열 번호 7에 대한 57번 위치에서의 세린 둘 다는 각각 상이한 아미노산에 의해 치환된다. 본 명세서에 기재된 임의의 항-C5 항체의 몇몇 실시형태에서, 상이한 아미노산은 히스티딘이다. 예를 들어, 27번 위치에서의 티로신 및 57번 위치에서의 세린은 각각 히스티딘에 의해 치환될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 GHIFSNYWIQ(서열 번호 23)의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 중쇄 CDR1을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 EILPGSGHTEYTENFKD(서열 번호 19)의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 중쇄 CDR2를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG H IFSNYWIQWVRQAPGQGLEWMGEILPGSG H TEYTENFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARYFFGSSPNWYFDVWGQGTLVTVSS(서열 번호 12).
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNVLNTPLTFGQGTKVEIK(서열 번호 8).
본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 적어도 0.1nM(예를 들어, 적어도 0.15, 0.175, 0.2, 0.25, 0.275, 0.3, 0.325, 0.35, 0.375, 0.4, 0.425, 0.45, 0.475, 0.5, 0.525, 0.55, 0.575, 0.6, 0.625, 0.65, 0.675, 0.7, 0.725, 0.75, 0.775, 0.8, 0.825, 0.85, 0.875, 0.9, 0.925, 0.95 또는 0.975nM)인 친화도 해리 상수(KD)로 pH 7.4 및 25℃에서 (그리고, 달리, 생리학적 조건 하에) C5에 결합할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항-C5 항체의 KD는 1nM 이하(예를 들어, 0.9nM 이하, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3 또는 0.2nM)이다.
본 명세서에 기재된 임의의 항-C5 항체의 몇몇 실시형태에서, [(℃에서의 pH 6.0에서의 C5에 대한 항체의 KD)/(25℃에서의 pH 7.4에서의 C5에 대한 항체의 KD)]는 21 초과(예를 들어, 22 초과, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500 또는 8000)이다.
항체가 단백질 항원에 결합하는지를 결정하는 방법 및/또는 단백질 항원에 대한 항체의 친화도는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 단백질 항원에 대한 항체의 결합은 다양한 기법, 예컨대 웨스턴 블롯, 도트 블롯, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR) 방법(예를 들어, 비아코어 시스템(BIAcore system); 파마시아 바이오센서 에이비(Pharmacia Biosensor AB), 스웨덴 웁살라 및 뉴저지주 피츠카타웨이), 또는 효소 연결 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)(이들로 제한되지는 않음)을 이용하여 검출되고/되거나 정량화될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Benny K. C. Lo (2004) "Antibody Engineering: Methods and Protocols," Humana Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) "Antibody Engineering, A Practical Guide," W.H. Freeman and Co., NY; Borrebaek (1995) "Antibody Engineering," 2nd Edition, Oxford University Press, NY, Oxford; Johne et al. (1993) J Immunol Meth 160:191-198; Jonsson et al. (1993) Ann Biol Clin 51:19-26; 및 Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627]을 참조한다. 또한, 친화도(예를 들어, 해리 및 결합 상수)를 결정하는 방법이 실험예에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "ka"는 항원에 대한 항체의 결합에 대한 속도 상수를 의미한다. 용어 "kd"는 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리에 대한 속도 상수를 의미한다. 및 용어 "KD"는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 의미한다. 평형 해리 상수는 동역학 속도 상수의 비율, KD = ka/kd로부터 추론된다. 이러한 결정은 바람직하게는 25℃ 또는 37℃에서 측정된다(실험예 참조). 예를 들어, 인간 C5에 대한 항체 결합의 동역학은 항체를 부동화하기 위해 항-Fc 포획 방법을 사용하여 비아코어 3000 장치에서 표면 플라스몬 공명(SPR)을 통해 pH 8.0, 7.4, 7.0, 6.5 및 6.0에서 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 C5 단백질(예를 들어, 인간 C5 단백질)의 C5a 및/또는 C5b 활성 단편의 생성 또는 활성을 차단하는 데 있어서 활성을 가질 수 있다. 이 차단 효과를 통해, 항체는 예를 들어 C5a의 전염증성 효과 및 세포의 표면에서 C5b-9 막 공격 복합체(membrane attack complex: MAC)의 생성을 저해한다.
본 명세서에 기재된 특정한 항체가 C5 절단을 저해하는지를 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 인간 보체 성분 C5의 저해는 대상체의 체액에서의 보체의 세포 용해 능력을 감소시킬 수 있다. 체액(들)에 존재하는 보체의 세포 용해 능력의 이러한 감소는 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 종래의 용혈성 검정, 예컨대 문헌[Kabat and Mayer (eds.), "Experimental Immunochemistry, 2nd Edition," 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), 페이지 135-139]에 의해 기재된 용혈 검정, 또는 이 검정의 종래의 변형, 예를 들어 문헌[Hillmen et al. (2004) N Engl J Med 350(6):552]에 기재된 닭 적혈구 용혈 방법 등에 의해 측정될 수 있다. 후보 화합물이 C5a 및 C5b의 형태로의 인간 C5의 절단을 저해하는지를 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Moongkarndi et al. (1982) Immunobiol 162:397; Moongkarndi et al. (1983) Immunobiol 165:323; Isenman et al. (1980) J Immunol 124(1):326-31; Thomas et al. (1996) Mol Immunol 33(17-18):1389-401; 및 Evans et al. (1995) Mol Immunol 32(16):1183-95]에 기재되어 있다. 예를 들어, 체액에서의 C5a 및 C5b의 농도 및/또는 생리학적 활성은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. C5a 농도 또는 활성을 측정하는 방법은 예를 들어 주화성 검정, RIA 또는 ELISA를 포함한다(예를 들어, 문헌[Ward and Zvaifler (1971) J Clin Invest 50(3):606-16 및 Wurzner et al. (1991) Complement Inflamm 8:328-340] 참조). C5b의 경우, 용혈성 검정 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가용성 C5b-9에 대한 검정을 이용할 수 있다. 당해 분야에 공지된 다른 검정을 또한 이용할 수 있다. 이들 또는 다른 적합한 유형의 검정을 이용하여, 인간 보체 성분 C5를 저해할 수 있는 후보 물질이 스크리닝될 수 있다.
면역학적 기법, 예컨대 ELISA(이것으로 제한되지는 않음)는 생물학적 활성 생성물로의 C5의 절단을 저해하는 항-C5 항체의 능력을 결정하기 위해 C5 및/또는 이의 분할 생성물의 단백질 농도를 측정하기 위해 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, C5a 생성이 측정된다. 몇몇 실시형태에서, C5b-9 네오에피토프-특이적 항체가 말단 보체의 형성을 검출하기 위해 사용된다.
용혈성 검정은 보체 활성화에 대한 항-C5 항체의 저해 활성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 실험실내 혈청 시험 용액에서 전통적인 보체 경로 매개 용혈에 대한 항-C5 항체의 효과를 결정하기 위해, 예를 들어 헤몰리신에 의해 코팅된 양 적혈구 또는 항-닭 적혈구 항체에 의해 감작화된 닭 적혈구를 표적 세포로서 사용한다. 용해의 백분율은 저해제의 부재 하에 생긴 용해와 동일한 100%의 용해를 고려함으로써 정규화된다. 몇몇 실시형태에서, 전통적인 보체 경로는 예를 들어 위스랩(Wieslab)(등록상표) 클래시컬 패스웨이 컴플리먼트 키트(Classical Pathway Complement Kit)(Wieslab(등록상표) COMPL CP310, 유로-다이아그노스티카(Euro-Diagnostica), 스웨덴)에서 사용되는 바와 같은 인간 IgM 항체에 의해 활성화된다. 간단히 말하면, 시험 혈청은 인간 IgM 항체의 존재 하에 항-C5 항체와 항온처리된다. 혼합물을 효소 접합된 항-C5b-9 항체 및 형광성 기질과 접촉시키고 적절한 파장에서 흡광도를 측정함으로써 생성된 C5b-9의 양이 측정된다. 대조군으로서, 시험 혈청을 항-C5 항체의 부재 하에 항온처리한다. 몇몇 실시형태에서, 시험 혈청은 C5 폴리펩타이드와 재구성된 C5 결핍 혈청이다.
대안적인 경로 매개 용혈에 대한 항-C5 항체의 효과를 결정하기 위해, 비감작화된 토끼 또는 기니아 피그 적혈구는 표적 세포로서 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 혈청 시험 용액은 C5 폴리펩타이드와 재구성된 C5 결핍 혈청이다. 용해의 백분율은 저해제의 부재 하에 생긴 용해와 동일한 100%의 용해를 고려함으로써 정규화된다. 몇몇 실시형태에서, 대안적인 보체 경로는 예를 들어 위스랩(등록상표) 클래시컬 패스웨이 컴플리먼트 키트(Wieslab(등록상표) COMPL AP330, 유로-다이아그노스티카, 스웨덴)에서 사용되는 바와 같은 리포폴리사카라이드 분자에 의해 활성화된다. 간단히 말하면, 시험 혈청은 리포폴리사카라이드의 존재 하에 항-C5 항체와 항온처리된다. 혼합물을 효소 접합된 항-C5b-9 항체 및 형광성 기질과 접촉시키고 적절한 파장에서 흡광도를 측정함으로써 생성된 C5b-9의 양이 측정된다. 대조군으로서, 시험 혈청을 항-C5 항체의 부재 하에 항온처리한다.
몇몇 실시형태에서, C5 활성 또는 이의 저해는 CH50eq 검정을 이용하여 정량화된다. CH50eq 검정은 혈청에서 전체 전통적인 보체 활성을 측정하는 방법이다. 이 시험은 용해 검정이고, 이것은 전통적인 보체 경로의 활성자로서 항체 감작화된 적혈구 및 시험 혈청의 다양한 희석액을 사용하여 50%의 용해(CH50)를 얻기 위해 필요한 양을 결정한다. 용혈의 백분율은 예를 들어 분광광도계를 사용하여 결정될 수 있다. CH50eq 검정은 말단 보체 복합체(TCC) 형성의 간접 측정을 제공하는데, 왜냐하면 TCC 자체가 측정되는 용혈을 직접적으로 담당하기 때문이다.
검정은 널리 공지되어 있고, 당해 분야의 당업자에 의해 흔히 실행된다. 간단히 말하면, 전통적인 보체 경로를 활성화하기 위해, 비희석된 혈청 샘플(예를 들어, 재구성된 인간 혈청 샘플)은 항체 감작화된 적혈구를 함유하는 마이크로검정 웰에 첨가되어서 TCC를 생성한다. 다음에, 활성화된 혈청은 마이크로검정 웰 중에 희석되고, 이것은 포획 시약(예를 들어, TCC의 하나 이상의 성분에 결합하는 항체)에 의해 코팅된다. 활성화된 샘플에 존재하는 TCC는 마이크로검정 웰의 표면을 코팅하는 단일클론 항체에 결합한다. 웰을 세척하고, 각각의 웰에 검출 가능하게 표지되고 결합된 TCC를 인식하는 검출 시약을 첨가한다. 검출 가능한 라벨은 예를 들어 형광 라벨 또는 효소 라벨일 수 있다. 검정 결과는 밀리리터당 CH50 단위 당량(CH50 U Eq/㎖)으로 표현된다.
저해는, 예를 들어 이것이 말단 보체 활성에 관한 것이면서, 유사한 조건 하에 및 등몰 농도에서 대조군 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 효과와 비교하여 예를 들어 용혈성 검정 또는 CH50eq 검정에서 말단 보체의 활성의 적어도 5%(예를 들어, 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60%) 감소를 포함한다. 실질적인 저해는, 본 명세서에 사용되는 바대로, 적어도 40%(예를 들어, 적어도 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 이상)의 소정의 활성(예를 들어, 말단 보체 활성)의 저해를 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 에쿨리주맙의 CDR(즉, 서열 번호 1-6)에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하지만, 용혈성 검정 또는 CH50eq 검정에서 에쿨리주맙의 보체 저해 활성의 적어도 30%(예를 들어, 적어도 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95%)를 보유한다.
본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 적어도 20일(예를 들어, 적어도 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일 또는 36일)인 인간에서의 혈청 반감기를 가진다. 항체의 혈청 반감기를 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 실험예에 예시되어 있다. 예를 들어, 문헌[Dall'Acqua et al. (2006) J Biol Chem 281: 23514-23524; Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279:6213-6216; Hinton et al. (2006) J Immunol 176:346-356; 및 Petkova et al. (2006) Int Immunol 18(12):1759-69](각각의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용됨)을 참조한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 예를 들어 실험예에 기재된 마우스 모델 시스템 중 하나(예를 들어, C5 결핍/NOD/scid 마우스 또는 hFcRn 형질전환 마우스 모델 시스템)에서 측정된 바대로 에쿨리주맙의 혈청 반감기의 적어도 20% 초과(예를 들어, 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%)인 혈청 반감기를 가진다.
Fc 영역에 대한 변형
본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 몇몇 실시형태에서 변이체 인간 Fc 불변 영역이 유래한 네이티브 인간 Fc 불변 영역의 것보다 큰 친화도로 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하는 변이체 인간 Fc 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc 불변 영역은 변이체 인간 Fc 불변 영역이 유래한 네이티브 인간 Fc 불변 영역에 대한 1개 이상(예를 들어, 2개의, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 이상)의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 치환은 상호작용의 pH 의존성을 유지시키면서 pH 6.0에서 FcRn에 대한 변이체 Fc 불변 영역을 함유하는 IgG 항체의 결합 친화도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279:6213-6216 및 Datta-Mannan et al. (2007) Drug Metab Dispos 35:1-9]을 참조한다. 항체의 Fc 불변 영역에서의 하나 이상의 치환이 (상호작용의 pH 의존성을 유지시키면서) pH 6.0에서 FcRn에 대한 Fc 불변 영역의 친화도를 증가시키는지를 시험하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 실험예에 예시되어 있다. 예를 들어, 문헌[Datta-Mannan et al. (2007) J Biol Chem 282(3):1709-1717]; 국제 공보 WO 제98/23289호; 국제 공보 WO 제97/34631호; 및 미국 특허 제6,277,375호(각각의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용됨)을 참조한다.
FcRn에 대한 항체 Fc 불변 영역의 결합 친화도를 증대시키는 치환은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 (1) 문헌[Dall'Acqua et al. (2006) J Biol Chem 281: 23514-23524]에 의해 기재된 M252Y/S254T/T256E 3중 치환; (2) 문헌[Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279:6213-6216 및 Hinton et al. (2006) J Immunol 176:346-356]에 기재된 M428L 또는 T250Q/M428L 치환; 및 (3) 문헌[Petkova et al. (2006) Int Immunol 18(12):1759-69]에 기재된 N434A 또는 T307/E380A/N434A 치환을 포함한다. 추가적인 치환 쌍 지음: P257I/Q311I, P257I/N434H 및 D376V/N434H는 예를 들어 문헌[Datta-Mannan et al. (2007) J Biol Chem 282(3):1709-1717](이의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 변이체 불변 영역은 발린에 대한 255번 EU 아미노산 잔기에서의 치환을 가진다. 몇몇 실시형태에서, 변이체 불변 영역은 아스파라긴에 대한 309번 EU 아미노산 잔기에서의 치환을 가진다. 몇몇 실시형태에서, 변이체 불변 영역은 아이소류신에 대한 312번 EU 아미노산 잔기에서의 치환을 가진다. 몇몇 실시형태에서, 변이체 불변 영역은 386번 EU 아미노산 잔기에서의 치환을 가진다.
몇몇 실시형태에서, 변이체 Fc 불변 영역은 이것이 유래한 네이티브 불변 영역에 대한 30개 이하(예를 들어, 29개 이하, 28개, 27개, 26개, 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개 또는 2개)의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 변이체 Fc 불변 영역은 M252Y, S254T, T256E, N434S, M428L, V259I, T250I 및 V308F로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 변이체 인간 Fc 불변 영역은 각각 EU 넘버링에서 428번 위치에서의 메티오닌 및 434번 위치에서의 아스파라긴을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 변이체 Fc 불변 영역은 예를 들어 미국 특허 제8.088,376호에 기재된 바와 같은 428L/434S 이중 치환을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 변이체 불변 영역은 네이티브 인간 Fc 불변 영역에 대한 237번, 238번, 239번, 248번, 250번, 252번, 254번, 255번, 256번, 257번, 258번, 265번, 270번, 286번, 289번, 297번, 298번, 303번, 305번, 307번, 308번, 309번, 311번, 312번, 314번, 315번, 317번, 325번, 332번, 334번, 360번, 376번, 380번, 382번, 384번, 385번, 386번, 387번, 389번, 424번, 428번, 433번, 434번 또는 436번 아미노산 위치(EU 넘버링)에서의 치환을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 치환은 모두 EU 넘버링으로 237번 위치에서의 글리신에 대한 메티오닌; 238번 위치에서의 프롤린에 대한 알라닌; 239번 위치에서의 세린에 대한 라이신; 248번 위치에서의 라이신에 대한 아이소류신; 250번 위치에서의 트레오닌에 대한 알라닌, 페닐알라닌, 아이소류신, 메티오닌, 글루타민, 세린, 발린, 트립토판 또는 티로신; 252번 위치에서의 메티오닌에 대한 페닐알라닌, 트립토판 또는 티로신; 254번 위치에서의 세린에 대한 트레오닌; 255번 위치에서의 아르기닌에 대한 글루탐산; 256번 위치에서의 트레오닌에 대한 아스파르트산, 글루탐산 또는 글루타민; 257번 위치에서의 프롤린에 대한 알라닌, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 세린, 트레오닌 또는 발린; 258번 위치에서의 글루탐산에 대한 히스티딘; 265번 위치에서의 아스파르트산에 대한 알라닌; 270번 위치에서의 아스파르트산에 대한 페닐알라닌; 286번 위치에서의 아스파라긴에 대한 알라닌 또는 글루탐산; 289번 위치에서의 트레오닌에 대한 히스티딘; 297번 위치에서의 아스파라긴에 대한 알라닌; 298번 위치에서의 세린에 대한 글리신; 303번 위치에서의 발린에 대한 알라닌; 305번 위치에서의 발린에 대한 알라닌; 307번 위치에서의 트레오닌에 대한 알라닌, 아스파르트산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 라이신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 발린, 트립토판 또는 티로신; 308번 위치에서의 발린에 대한 알라닌, 페닐알라닌, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 글루타민 또는 트레오닌; 309번 위치에서의 류신 또는 발린에 대한 알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 프롤린 또는 아르기닌; 311번 위치에서의 글루타민에 대한 알라닌, 히스티딘 또는 아이소류신; 312번 위치에서의 아스파르트산에 대한 알라닌 또는 히스티딘; 314번 위치에서의 류신에 대한 라이신 또는 아르기닌; 315번 위치에서의 아스파라긴에 대한 알라닌 또는 히스티딘; 317번 위치에서의 라이신에 대한 알라닌; 325번 위치에서의 아스파라긴에 대한 글리신; 332번 위치에서의 아이소류신에 대한 발린; 334번 위치에서의 라이신에 대한 류신; 360번 위치에서의 라이신에 대한 히스티딘; 376번 위치에서의 아스파르트산에 대한 알라닌; 380번 위치에서의 글루탐산에 대한 알라닌; 382번 위치에서의 글루탐산에 대한 알라닌; 384번 위치에서의 아스파라긴 또는 세린에 대한 알라닌; 385번 위치에서의 글리신에 대한 아스파르트산 또는 히스티딘; 386번 위치에서의 글루타민에 대한 프롤린; 387번 위치에서의 프롤린에 대한 글루탐산; 389번 위치에서의 아스파라긴에 대한 알라닌 또는 세린; 424번 위치에서의 세린에 대한 알라닌; 428번 위치에서의 메티오닌에 대한 알라닌, 아스파르트산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 라이신, 류신, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판 또는 티로신; 433번 위치에서의 히스티딘에 대한 라이신; 434번 위치에서의 아스파라긴에 대한 알라닌, 페닐알라닌, 히스티딘, 세린, 트립토판 또는 티로신; 및 436번 위치에서의 티로신 또는 페닐알라닌에 대한 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 몇몇 실시형태에서 서열 번호 12 또는 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 서열 번호 8 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
항-C5 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 항-C5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체를 제조하는 방법은 대상체(예를 들어, 비인간 포유동물)를 적절한 면역원에 의해 면역화하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체를 생생하기에 적합한 면역원은 본 명세서에 기재되어 있다. 예를 들어, C5에 결합하는 항체를 생성하기 위해, 당업자는 적합한 대상체(예를 들어, 비인간 포유동물, 예컨대 랫트, 마우스, 게르빌루스쥐, 햄스터, 개, 고양이, 돼지, 염소, 말 또는 비인간 영장류)를 전장 C5 폴리펩타이드, 예컨대 전장 인간 C5 폴리펩타이드에 의해 면역화할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비인간 포유동물은 C5 결핍 마우스, 예를 들어 문헌[Levy and Ladda (1971) Nat New Biol 229(2):51-52; Crocker et al. (1974) J Clin Pathol 27(2):122-124; Wetsel et al. (1990) J Biol Chem 265:2435-2440; 및 Jungi and Pepys (1981) Immunology 43(2):271-279]에 기재된 예를 들어 C5 결핍 마우스이다.
적합한 대상체(예를 들어, 비인간 포유동물)는 포유동물에 의한 항체의 생성을 발생시키기 위해 충분한 수회 후속하는 부스터 면역화와 함께 적절한 항원에 의해 면역화된다. 면역원은 아쥬번트와 함께 대상체(예를 들어, 비인간 포유동물)에게 투여될 수 있다. 대상체에서 항체를 생성하는 데 유용한 아쥬번트는 단백질 아쥬번트; 박테리아 아쥬번트, 예를 들어 전체 박테리아(BCG, 코리네박테륨 파르븀(Corynebacterium parvum) 또는 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota)) 및 세포 벽 골격을 포함하는 박테리아 성분, 트레할로스 다이마이콜레이트, 모노포스포릴 지질 A, 결핵균(투베르클 바실러스: tubercle bacillus)의 메탄올 추출 가능한 잔류물(methanol extractable residue: MER), 완전 또는 불완전 프로인드 아쥬번트; 바이러스 아쥬번트; 화학 아쥬번트, 예를 들어 수산화알루미늄, 및 요오도아세테이트 및 콜레스테릴 헤미숙시네이트를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용될 수 있는 다른 아쥬번트는 예를 들어 콜레라 독소 및 파라폭스바이러스 단백질을 포함한다. 또한, 문헌[Bieg et al. (1999) Autoimmunity 31(1):15-24]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌[Lodmell et al. (2000) Vaccine 18:1059-1066; Johnson et al. (1999) J Med Chem 42:4640-4649; Baldridge et al. (1999) Methods 19:103-107; 및 Gupta et al. (1995) Vaccine 13(14): 1263-1276]을 참조한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 면역원에 결합하는 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 제조하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 적합한 포유동물, 예컨대 실험실 마우스를 상기 기재된 바와 같은 C5 폴리펩타이드에 의해 면역화한다. 면역화된 포유동물의 항체 생성 세포(예를 들어, 비장의 B 세포)를 면역원의 적어도 하나의 부스터 면역화 후 2일 내지 4일에 단리하고 이후 간단히 배양물 중에 성장시킨 후 적합한 골수종 세포주의 세포에 의해 융합시킬 수 있다. 세포를 융합 프로모터, 예를 들어 백시니아 바이러스 또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 존재 하에 융합할 수 있다. 융합에서 얻은 하이브리드 세포를 클로닝하고, 원하는 항체를 분비하는 세포 클론을 선택된다. 예를 들어, 적합한 면역원에 의해 면역화된 Balb/c 마우스의 비장 세포를 골수종 세포주 PAI 또는 골수종 세포주 Sp2/0-Ag 14의 세포와 융합할 수 있다. 융합 후, 세포를 적합한 배양 배지 중에 증식시키고, 이 배지는 정상 골수종 세포가 원하는 하이브리도마 세포를 과성장시키는 것을 막도록 정기적 간격으로 선택 배지, 예를 들어 HAT 배지에 의해 보충된다. 원하는 항체, 예를 들어 C5에 결합하고 단편 C5a 및 C5b로의 C5의 절단을 저해하는 항체의 분비를 위해 얻은 하이브리드 세포는 이후 분비된다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CHO 세포에서 제조될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출 가능한 시알산 잔기를 함유하지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 당업자는 예를 들어 미국 특허 제6,300,064호(Knappik 등; Morphosys AG에 허여) 및 문헌[Schoonbroodt et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(9):e81]에 기재된 바대로 비면역 바이어스 라이브러리로부터 항-C5 항체를 확인할 수 있다.
상기 방법을 이용하여 스크리닝되는 항체의 하위집단은 당해 분야에 공지된 임의의 면역학적 또는 생화학 기반 방법을 이용하여 특정한 면역원(예를 들어, C5)에 대한 이의 특이성 및 결합 친화도에 대해 규명될 수 있다. 예를 들어, C5a와 비교하여 네이티브, 전장 C5에 대한 항체의 특이적 결합은 예를 들어 면역학적 또는 생화학적 기반 방법, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 ELISA 검정, SPR 검정, 면역침전 검정, 친화도 크로마토그래피, 및 평형 투석(이들로 제한되지는 않음)을 이용하여 결정될 수 있다. 항체의 면역특이적 결합 및 교차 반응성을 분석하기 위해 사용될 수 있는 면역검정은 예컨대 웨스턴 블롯, RIA, ELISA(효소 연결 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 면역확산 검정, 응집 검정, 보체 고정 검정, 면역방사측정 검정, 형광 면역검정 및 단백질 A 면역검정과 같은 기법을 이용하는 경쟁적 및 비경쟁적 검정 시스템을 포함하지만 이들로 제한되지는 않고, 이러한 검정은 일상적이고, 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
항체는 항체와 C5의 상호작용의 동역학 매개변수를 규명하기 위해 당해 분야에 공지된 임의의 SPR 기반 검정을 이용하여 또한 평가될 수 있다. 비아코어 장치(BIAcore Instrument)(Biacore AB(스웨덴 웁살라)); lAsys 장치(Affinity Sensors(메사추세츠주 프랭클린)); IBIS 시스템(Windsor Scientific Limited(영국 벅스)), SPR-CELLIA 시스템(Nippon Laser and Electronics Lab(일본 훗카이도)), 및 SPR 검출기 스프렉타(Spreeta)(Texas Instruments(텍사스주 댈러스))(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 상업적으로 구입 가능한 임의의 SPR 장치는 본 명세서에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Mullett et al. (2000) Methods 22: 77-91; Dong et al. (2002) Reviews in Mol Biotech 82: 303-323; Fivash et al. (1998) Curr Opin Biotechnol 9: 97-101; 및 Rich et al. (2000) Curr Opin Biotechnol 11: 54-61]을 참조한다.
예를 들어, 항-C5 항체가 전장, 네이티브 C3 및/또는 C4 단백질에 결합하지 않는지를 결정하기 위해 또한 상기 방법을 이용할 수 있는 것으로 이해된다.
상기 참조문헌에 기재된 바대로, 파지 선택 후, 파지로부터의 항체 코딩 영역은 단리되고 인간 항체, 또는 임의의 원하는 단편을 포함하는 전체 항체를 생성하기 위해 사용되고, 예를 들어 하기 자세히 기재된 바와 같은 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합으로 생성하는 기법은 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대 PCT 공보 WO 제92/22324호; 문헌[Mullinax et al. (1992) BioTechniques 12(6):864-869; 및 Sawai et al. (1995) Am J Repr Immunol 34:26-34; 및 Better et al. (1988) Science 240:1041-1043]에 개시된 것을 이용하여 또한 사용될 수 있다. 단쇄 Fv 및 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 기법의 예는 미국 특허 제4,946,778호 및 5,258,498호; 문헌[Huston et al. (1991) Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al. (1993) Proc Nat Acad Sci USA 90:7995-7999; 및 Skerra et al. (1988) Science 240:1038-1040]에 기재된 것을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 에피토프 맵핑은 예를 들어 항체와 상호작용하는 C5의 영역을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 항체가 결합하는 에피토프를 확인하는 방법은 또한 당해 분야에 공지되어 있고, 상기 기재되어 있다.
본 명세서에서 확인된 항체 및 이의 단편은 "키메라"일 수 있거나, 이것으로 제조될 수 있다. 키메라 항체 및 이의 항원 결합 단편은 2개 이상의 상이한 종(예를 들어, 마우스 및 인간)으로부터의 부분을 포함한다. 키메라 항체는 인간 불변 도메인에 융합된 원하는 특이성의 마우스 가변 영역에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호). 이러한 방식으로, 비인간 항체는 인간 임상 적용(예를 들어, 대상체에서 보체 매개 장애를 치료하거나 예방하는 방법)에 더 적합하게 하도록 변형될 수 있다.
본 개시내용의 단일클론 항체는 비인간(예를 들어, 마우스) 항체의 "인간화된" 형태를 포함한다. 인간화된 또는 CDR 그래프팅된 mAb는 마우스 항체만큼 신속히 순환으로부터 청소되지 않고 통상적으로 불리한 면역 반응을 촉발하지 않으므로 인간에 대한 치료제로서 특히 유용하다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비인간 소스로부터 이것에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이 비인간 아미노산 잔기는 대개 "유입" 잔기라 불리고, 이것은 통상적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화된 항체를 제조하는 방법은 일반적으로 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열에 대해 설치류 프레임워크 또는 CDR 서열을 치환함으로써 본질적으로 윈터(Winter) 및 공동작업자의 방법에 따라 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; 및 Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536] 참조). 또한, 예를 들어 문헌[Staelens et al. (2006) Mol Immunol 43:1243-1257]을 참조한다. 몇몇 실시형태에서, 비인간(예를 들어, 마우스) 항체의 인간화된 형태는 원하는 특이성, 친화도 및 결합 능력을 가지는 비인간 항체(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류 항체)의 CDR 영역 아미노산 잔기가 인간 항체의 프레임워크 스캐폴드로 그래프팅된 인간 항체(수혜자 항체)이다.
몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 하나 이상의 프레임워크 영역 아미노산 잔기는 비인간 항체의 상응하는 아미노산 잔기에 의해 또한 대체된다(소위 "역돌연변이"). 또한, 파지 디스플레이 라이브러리는 항체 서열 내의 선택된 위치에서 아미노산을 변화시키도록 사용될 수 있다. 인간화된 항체의 특성은 인간 프레임워크의 선택에 의해 또한 영향을 받는다. 게다가, 인간화된 및 키메라화된 항체는 항체 특성, 예를 들어 친화도 또는 이팩터 기능 등을 추가로 개선하기 위해 수혜자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다.
완전 인간 항체가 본 개시내용에 또한 제공된다. 용어 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 서열, 바람직하게는 인간 생식선 서열로부터 유래한 (존재하는 경우) 가변 및 불변 영역을 가지는 항체를 포함한다. 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 실험실내 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스로부터 유래한 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 그래프팅된 항체(즉, 인간화된 항체)를 포함하지 않는다. 전체 인간 또는 인간 항체는 인간 항체 유전자(가변(V), 다양성(D), 연결(J) 및 불변(C) 엑손)를 보유하는 형질전환 마우스 또는 인간 세포로부터 유래할 수 있다.
인간 서열은 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩할 수 있고, 마우스에서 정확히 작용하여, 재배열을 겪어 인간에서의 것과 유사한 넓은 항체 레퍼토리를 제공한다. 형질전환 마우스는 다양한 특이적 항체 및 이의 코딩 RNA를 생성하기 위해 표적 단백질 면역원에 의해 면역화될 수 있다. 이러한 항체의 항체 사슬 성분을 코딩하는 핵산은 동물로부터 디스플레이 벡터로 클로닝될 수 있다. 통상적으로, 중쇄 및 경쇄 서열을 코딩하는 핵산의 별개의 집단이 클로닝되고, 별개의 집단은 이후 벡터로 삽입 시 재조합되어서, 벡터의 임의의 소정의 카피는 중쇄 및 경쇄의 랜덤 조합을 수용한다. 벡터는 항체 사슬을 발현하도록 설계되어서, 이것은 조립되고 벡터를 함유하는 디스플레이 패키지의 외부 표면에 디스플레이될 수 있다. 예를 들어, 항체 사슬은 파지의 외부 표면으로부터 파지 코트 단백질과의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 이후, 디스플레이 패키지는 표적에 대한 항체 결합의 디스플레이를 위해 선택되고 스크리닝될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 이의 상응하는 비변경 불변 영역에 대비된 감소한 이팩터 기능을 가지는(또는 가지지 않는) 변경된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 항-C5 항체의 불변 영역을 포함하는 이팩터 기능은 불변 또는 Fc 영역의 특성을 변경함으로써 조절될 수 있다. 변경된 이팩터 기능은 예를 들어 하기 특성 중 하나 이상의 조절을 포함한다: 항체 의존적 세포 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC), 보체 의존적 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity: CDC), 아폽토시스, 하나 이상의 Fc-수용체에 대한 결합 및 전염증성 반응. 조절은 불변 영역의 비변경 형태의 활성과 비교할 때 변경된 불변 영역을 함유하는 해당 항체에 의해 나타난 이팩터 기능 활성의 증가, 감소 또는 제거를 의미한다. 특정한 실시형태에서, 조절은 활성이 폐지되거나 완전히 없는 상황을 포함한다.
변경된 FcR 결합 친화도 및/또는 ADCC 활성 및/또는 변경된 CDC 활성을 가지는 변경된 불변 영역은 불변 영역의 비변경 형태와 비교하여 증대되거나 감소한 FcR 결합 활성 및/또는 ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 가지는 폴리펩타이드이다. FcR에 대한 증가한 결합을 나타내는 변경된 불변 영역은 비변경 폴리펩타이드보다 큰 친화도로 적어도 하나의 FcR에 결합한다. FcR에 대해 감소한 결합을 나타내는 변경된 불변 영역은 불변 영역의 비변경 형태보다 낮은 친화도로 적어도 하나의 FcR에 결합한다. FcR에 대해 감소한 결합을 나타내는 이러한 변이체는 FcR에 아주 적거나 미미한 결합, 예를 들어 FcR에 대한 네이티브 서열 면역글로불린 불변 또는 Fc 영역의 결합의 수준과 비교하여 FcR에 대한 결합의 0 내지 50%(예를 들어, 50% 미만, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)를 보유할 수 있다. 유사하게, 변경된 ADCC 및/또는 CDC 활성을 나타내는 변경된 불변 영역은 비변경 불변 영역과 비교하여 증가하거나 감소한 ADCC 및/또는 CDC 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 변경된 불변 영역을 포함하는 항-C5 항체는 불변 영역의 비변경 형태의 ADCC 및/또는 CDC 활성의 대략 0 내지 50%(예를 들어, 50% 미만, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)를 나타낼 수 있다. 감소한 ADCC 및/또는 CDC를 나타내는 변경된 불변 영역을 포함하는 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 감소한 ADCC 및/또는 CDC 활성을 나타내거나 이를 나타내지 않을 수 있다.
소정의 실시형태에서, 변경된 불변 영역은 네이티브 서열 불변 영역 또는 비변경 불변 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실, 예를 들어 모 폴리펩타이드의 네이티브 서열 불변 영역 또는 불변 영역에서의 약 1개 내지 약 100개의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 가진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에서의 변경된 불변 영역은 비변경 불변 영역과 적어도 약 70%의 상동성(유사성) 또는 동일성, 몇몇 경우에 적어도 약 75%, 다른 경우에 적어도 약 80%의 상동성 또는 동일성, 다른 실시형태에서 적어도 약 85%, 90% 또는 95%의 상동성 또는 동일성을 보유할 것이다. 변경된 불변 영역은 하나 이상의 아미노산 결실 또는 삽입을 또한 함유할 수 있다. 추가적으로, 변경된 불변 영역은 예를 들어 변경된 글라이코실화 패턴(예를 들어, 비변경 불변 영역에 대한 하나 이상의 당 성분의 첨가, 하나 이상의 당 성분의 소실, 또는 하나 이상의 당 성분의 조성물의 변경)을 포함하는 변경된 번역 후 변형을 발생시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 수 있다.
변경된 이팩터 기능을 가지거나 이를 가지지 않는 항체는 변이체 불변, Fc 또는 중쇄 영역을 가지는 항체를 조작하거나 생성함으로써 생성될 수 있고; 재조합 DNA 기술 및/또는 세포 배양 및 발현 조건은 변경된 기능 및/또는 활성을 가지는 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술은 이팩터 기능을 포함하는 항체 기능에 영향을 미치는 영역(예를 들어, Fc 또는 불변 영역 등)에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 조작하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 번역 후 변형의 변화, 예를 들어 글라이코실화 패턴 등은 항체가 생성되는 세포 배양 및 발현을 조작함으로써 달성될 수 있다. 항체의 Fc 영역으로 하나 이상의 치환, 첨가 또는 결실을 도입하기에 적합한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition," Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; 상기 Harlow 및 Lane(1988)의 문헌; 상기 Borrebaek(1992)의 문헌; 상기 Johne 등의 문헌(1993); PCT 공보 WO 제06/53301호; 및 미국 특허 제7,704,497호에 기재된 바와 같은 예를 들어 표준 DNA 돌연변이유발 기법을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 감소한 이팩터 기능을 나타내거나 이를 나타내지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 항-C5 항체는 하이브리드 불변 영역, 또는 이의 부분, 예컨대 G2/G4 하이브리드 불변 영역을 포함한다(예를 들어, 문헌[Burton et al. (1992) Adv Immun 51:1-18; Canfield et al. (1991) J Exp Med 173:1483-1491; 및 Mueller et al. (1997) Mol Immunol 34(6):441-452] 참조). 상기를 참조한다.
상기 기재된 바와 같은 G2/G4 작제물을 사용하는 것 이외에, 감소한 이팩터 기능을 가지는 본 명세서에 기재된 항-C5 항체는 항체의 소정의 영역의 아미노산 서열의 다른 유형의 변화를 도입함으로써 생성될 수 있다. 이러한 아미노산 서열 변화는 예를 들어 PCT 공보 WO 제94/28027호 및 WO 제98/47531호; 및 문헌[Xu et al. (2000) Cell Immunol 200:16-26]에 기재된 Ala-Ala 돌연변이를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, Ala-Ala 돌연변이를 포함하는 불변 영역 내의 하나 이상의 돌연변이를 가지는 항-C5 항체는 감소한 이팩터 기능을 가지거나 이를 가지지 않는다. 이 실시형태에 따르면, 항체의 불변 영역은 234번 위치에서의 알라닌에 대한 치환 또는 235번 위치에서의 알라닌에 대한 돌연변이를 포함할 수 있다. 추가적으로, 변경된 불변 영역은 이중 돌연변이: 234번 위치에서의 알라닌에 대한 돌연변이 및 235번 위치에서의 알라닌에 대한 제2 돌연변이를 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, 항-C5 항체는 IgG4 프레임워크를 포함하고, 여기서 Ala-Ala 돌연변이는 234번 위치에서의 페닐알라닌으로부터 알라닌으로의 돌연변이 및/또는 235번 위치에서의 류신으로부터 알라닌으로의 돌연변이를 기술할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 항-C5 항체는 IgG1 프레임워크를 포함하고, 여기서 Ala-Ala 돌연변이는 234번 위치에서의 류신으로부터 알라닌으로의 돌연변이(들)　및/또는 235번 위치에서의 류신으로부터 알라닌으로의 돌연변이를 기술할 것이다. 항-C5 항체는 CH2 도메인에서의 점돌연변이 K322A를 포함하는 다른 돌연변이를 대안적으로 또는 추가적으로 보유할 수 있다(Hezareh et al. (2001) J Virol 75:12161-12168). 불변 영역에서 상기 돌연변이(들)를 가지는 항체는 게다가 차단 또는 비차단 항체일 수 있다.
중쇄 불변 영역으로 도입될 때 감소한 이팩터 기능을 생성시키는 추가적인 치환은 예를 들어 문헌[Shields et al. (2001) J Biol Chem 276(9):6591-6604]에 기재되어 있다. 특히 쉴즈(Shields) 등의 표 1("인간 FcRn 및 FcγR에 대한 인간 IgG1 변이체의 결합")(이의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용됨)을 참조한다. 일련의 Fc 수용체(FcRn, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIIA 포함)에 대한 결합에 대해, 항-IgE 항체의 라이브러리(라이브러리의 각각의 항체는 중쇄 불변 영역에서 하나 이상의 치환이 다름)를 스크리닝함으로써, 저자는 특이적 Fc-Fc 수용체 상호작용을 조절하는 다수의 치환을 확인하였다. 예를 들어, CH2 도메인이 D265A 치환((상기) 카밧 등에 따른 중쇄 아미노산 넘버링)을 함유하는 변이체 IgG2a 중쇄 불변 영역은 변이체 불변 영역과 IgG Fc 수용체 FcγRIIB, FcγRIII, FcγRI 및 FcγRIV 사이의 상호작용의 완전한 소실을 발생시킨다. 쉴즈 등의 문헌(2001) 페이지 6595, 표 1. 또한, 문헌[Baudino et al. (2008) J Immunol 181:6664-6669 (상기)]을 참조한다.
힌지 영역 내의 변화는 또한 이팩터 기능에 영향을 미친다. 예를 들어, 힌지 영역의 결실은 Fc 수용체에 대한 친화도를 감소시킬 수 있고 보체 활성화를 감소시킬 수 있다(Klein et al. (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78: 524-528). 본 개시내용은 따라서 또한 힌지 영역의 변경을 가지는 항체에 관한 것이다.
몇몇 실시형태에서, 항-C5 항체는 증대되거나 감소한 보체 의존적 세포독성(CDC)을 나타내는 변경된 불변 영역을 함유할 수 있다. 조절된 CDC 활성은 항체의 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 도입함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제6,194,551호를 참조한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)는 Fc 영역에서 도입되어서, 이 영역에서의 사슬간 다이설파이드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이렇게 형성된 동종이합체 항체는 개선되거나 감소한 내재화 능력 및/또는 증가하거나 감소한 보체 매개 세포 사멸을 가질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Caron et al. (1992) J Exp Med 176:1191-1195 및 Shopes (1992) Immunol 148:2918-2922]; PCT 공보 WO 제99/51642호 및 WO 제94/29351호; 문헌[Duncan and Winter (1988) Nature 322:738-40]; 및 미국 특허 제5,648,260 및 5,624,821호를 참조한다.
항체의 이팩터 기능을 조절하는 또 다른 가능한 수단은 예를 들어 문헌[Raju (2003) BioProcess International 1(4):44-53]에 요약된 글라이코실화의 변화를 포함한다. 라이트(Wright) 및 모리슨(Morrison)에 따르면, 인간 IgG 올리고사카라이드의 미세이질성(microheterogeneity)은 생물학적 기능, 예컨대 CDC 및 ADCC, 다양한 Fc 수용체에 대한 결합 및 Clq 단백질에 대한 결합에 영향을 미친다. (1997) TIBTECH 15:26-32. 항체의 글라이코실화 패턴은 생성 세포 및 세포 배양 조건에 따라 다를 수 있다(상기 Raju 문헌). 이러한 차이는 이팩터 기능 및 약동학 둘 다를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Israel et al. (1996) Immunology 89(4):573-578; 및 Newkirk et al. (1996) Clin Exp Immunol 106(2):259-264]을 참조한다. 이팩터 기능의 차이는 이팩터 세포에 대한 Fcγ 수용체(FcγR)에 결합하는 IgG의 능력과 관련될 수 있다. 쉴즈 등은 FcγR에 대한 개선된 결합을 가지는 아미노산 서열의 변경을 가지는 IgG가 인간 이팩터 세포를 사용하여 100%까지 증대된 ADCC를 나타낼 수 있다는 것을 밝혀냈다. (2001) J Biol Chem 276(9):6591-6604. 이 변경이 결합 계면에서 발견되지 않는 아미노산의 변화를 포함하지만, 당 성분의 성질, 및 이의 구조 패턴 둘 다가 관찰된 차이에 또한 기여할 수 있다. 또한, IgG의 올리고사카라이드 성분에서의 푸코스의 존재 또는 부재는 결합 및 ADCC를 개선할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Shields et al. (2002) J Biol Chem 277(30):26733-26740]을 참조한다. Asn297에 연결된 푸코실화 탄수화물이 부족한 IgG는 FcγRI 수용체에 대한 일반 수용체 결합을 나타낸다. 반대로, FcγRIIIA 수용체에 대한 결합은 50배 개선되고 특히 더 낮은 항체 농도에서 증대된 ADCC가 수반된다.
항체의 이팩터 기능을 변경하기 위한 또 다른 접근법이 존재한다. 예를 들어, 항체 생성 세포는 과돌연변이유발일 수 있어서, 전체 항체 분자에 걸쳐 무작위로 변경된 폴리펩타이드 잔기를 가지는 항체를 생성시킨다. 예를 들어, PCT 공보 WO 제05/011735호를 참조한다. 과돌연변이유발 숙주 세포는 DNA 미스매치 복구가 결핍된 세포를 포함한다. 이러한 방식으로 생성된 항체는 덜 항원성이고/이거나, 유리한 약동학적 특성을 가질 수 있다. 추가적으로, 이러한 항체는 증대되거나 감소한 이팩터 기능(들)과 같은 특성에 선택될 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하기에 유용한 분자 생물학 기법의 추가적인 상세내용은 하기 기재되어 있다.
재조합 항체 발현 및 정제
본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 분자 생물학 및 단백질 화학의 분야에 공지된 다양한 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 핵산은 전사 및 번역 조절 서열을 함유하는 발현 벡터로 삽입될 수 있고, 이 서열은 예를 들어 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 시작 및 중지 서열, 번역 시작 및 중지 서열, 전사 종결자 신호, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서 또는 활성자 서열을 포함한다. 조절 서열은 프로모터 및 전사 시작 및 중지 서열을 포함한다. 또한, 발현 벡터는 하나 초과의 복제 시스템을 포함할 수 있어서, 이것은 2개의 상이한 유기체, 예를 들어 발현을 위한 포유동물 또는 곤충 세포 및 클로닝 및 증폭을 위한 원핵생물 숙주에서 유지될 수 있다.
다양한 변형, 예를 들어 치환은 당해 분야의 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 본 명세서에 기재된 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열로 도입될 수 있다. 예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR 위치에서의 히스티딘 치환의 도입은 표준 방법, 예컨대 PCR 매개 돌연변이유발을 이용하여 수행될 수 있고, 여기서 돌연변이된 뉴클레오타이드는 PCR 프라이머로 혼입되어서, PCR 생성물은 원하는 돌연변이 또는 부위 지정 돌연변이유발을 함유한다. 치환은 하나 이상의 CDR 영역으로 도입되어서 예를 들어 pH 7.4 또는 pH 6.0에서 항원에 대한 항체의 KD를 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 부위 지정 돌연변이유발에서의 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌을 참조한다.
여러 가능한 벡터 시스템은 포유동물 세포에서 핵산으로부터의 클로닝된 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 발현에 이용 가능하다. 일 종류의 벡터는 숙주 세포 게놈으로의 원하는 유전자 서열의 통합에 따라 달라진다. 안정하게 통합된 DNA를 가지는 세포는 약물 내성 유전자, 예컨대 이. 콜라이 gpt(Mulligan and Berg (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:2072) 또는 Tn5 네오(Southern and Berg (1982) Mol Appl Genet 1:327)를 동시에 도입함으로써 선택될 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 발현시키고자 하는 DNA 유전자 서열에 연결되거나, 동시형질감염에 의해 동일한 세포로 도입될 수 있다(Wigler et al. (1979) Cell 16:77). 제2 유형의 벡터는 염색체외 플라스미드에 자체적으로 복제하는 능력을 부여하는 DNA 요소를 이용한다. 이 벡터는 동물 바이러스, 예컨대 소 파필로마 바이러스(Sarver et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA, 79:7147), 사이토메갈로 바이러스, 폴리오마 바이러스(Deans et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1292) 또는 SV40 바이러스(Lusky and Botchan (1981) Nature 293:79)로부터 유래할 수 있다.
발현 벡터는 후속하는 핵산의 발현에 적합한 방식으로 세포로 도입될 수 있다. 도입의 방법은 하기 기재된 표적화된 세포 유형에 의해 주로 좌우된다. 예시적인 방법은 CaPO4 침전, 리포솜 융합, 양이온성 리포솜, 전기천공, 바이러스 감염, 덱스트란 매개 형질감염, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합 및 직접 마이크로주사를 포함한다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현에 적절한 숙주 세포는 효모, 박테리아, 곤충, 식물 및 포유동물 세포를 포함한다. 박테리아, 예컨대 이. 콜라이, 진균, 예컨대 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 곤충 세포, 예컨대 SF9, 포유동물 세포주(예를 들어, 인간 세포주), 및 1차 세포주가 특히 중요하다.
몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 형질전환 동물(예를 들어, 형질전환 포유동물)에서 발현되거나 이로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체는 예를 들어 문헌[Houdebine (2002) Curr Opin Biotechnol 13(6):625-629; van Kuik-Romeijn et al. (2000) Transgenic Res 9(2):155-159; 및Pollock et al. (1999) J Immunol Methods 231(1-2):147-157]에 기재된 바대로 형질전환 비인간 포유동물(예를 들어, 설치류)에서 생성되고 젖으로부터 단리될 수 있다.
항체 및 이의 단편은 단백질의 발현을 허용하기에 충분한, 시간 동안 및 조건 하에, 항체 또는 단편을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 세포로부터 제조될 수 있다. 단백질 발현을 위한 이러한 조건은 발현 벡터 및 숙주 세포의 선택에 의해 변할 것이고, 일상적 실험을 통해 당해 분야의 당업자에 의해 용이하게 확인될 것이다. 예를 들어, 이. 콜라이에서 발현된 항체는 봉입체로부터 재폴딩될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hou et al. (1998) Cytokine 10:319-30] 참조). 박테리아 발현 시스템 및 이의 사용 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, 및 Molecular Cloning--A Laboratory Manual --3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)] 참조). 코돈, 적합한 발현 벡터 및 적합한 숙주 세포의 선택은 다수의 인자에 따라 달라질 것이고, 필요한 바대로 용이하게 최적화될 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체(또는 이의 단편)는 포유동물 세포 또는 효모, 바큘로바이러스, 및 실험실내 발현 시스템을 포함하는 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kaszubska et al. (2000) Protein Expression and Purification 18:213-220] 참조).
발현 이후, 항체 및 이의 단편은 단리될 수 있다. 용어 "정제된" 또는 "단리된"은, 본 명세서에 기재된 임의의 단백질(항체 또는 단편)에 적용되는 것처럼, 천연으로 이것을 수반하는 성분(예를 들어, 단백질 또는 다른 천연 발생 생물학적 또는 유기 분자)으로부터 분리되거나 정제된 폴리펩타이드, 예를 들어 단백질을 발현하는 원핵생물에서의 다른 단백질, 지질 및 핵산을 의미한다. 통상적으로, 폴리펩타이드는 샘플 내의 전체 단백질의 중량 기준으로 적어도 60%(예를 들어, 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97 또는 99%)를 구성할 때 정제된다.
항체 또는 이의 단편은 다른 성분이 샘플에 존재하는 것에 따라 당해 분야의 당업자에게 공지된 다양한 방식으로 단리되거나 정제될 수 있다. 표준 정제 방법은 전기영동, 분자, 면역학적 및 크로마토그래피 기법, 예컨대 이온 교환, 소수성, 친화도, 및 역상 HPLC 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, 항체는 표준 항-항체 칼럼(예를 들어, 단백질-A 또는 단백질-G 칼럼)을 통해 정제될 수 있다. 단백질 농도와 관련하여 한외여과 및 정용여과 기법이 또한 유용하다. 예를 들어, 문헌[Scopes (1994) "Protein Purification, 3rd edition," Springer-Verlag, New York City, New York]을 참조한다. 필요한 정제의 정도는 원하는 용도에 따라 달라질 것이다. 몇몇 경우에, 발현된 항체 또는 이의 단편의 정제가 필요하지 않을 것이다.
정제된 항체 또는 이의 단편의 수율 또는 순도를 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 브래드포드(Bradford) 검정, UV 분광법, 뷰렛(Biuret) 단백질 검정, 로리(Lowry) 단백질 검정, 아미도 블랙 단백질 검정, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 질량 분광법(MS) 및 겔 전기영동 방법(예를 들어, 단백질 염색, 예컨대 쿠마시 블루 또는 콜로이드성 은 염색을 이용)을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 내독소는 항체 또는 단편으로부터 제거될 수 있다. 단백질 샘플로부터 내독소를 제거하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 내독소는 제한 없이 프로테오스핀(ProteoSpin)(상표명) 내독소 제거 키트(Norgen Biotek Corporation), 데톡시-겔(Detoxi-Gel) 내독소 제거 겔(써모 사이언티픽(Thermo Scientific); 피어스 프로테인 리서치 프로덕츠(Pierce Protein Research Products)), 미라클린(MiraCLEAN)(등록상표) 내독소 제거 키트(Mirus), 또는 아크로디스크(Acrodisc)(상표명) - 무스탕(Mustang)(등록상표) E 막(Pall Corporation)을 포함하는 다양한 상업적으로 구입 가능한 시약을 사용하여 단백질 샘플로부터 제거될 수 있다.
(정제 전 및 후 둘 다) 샘플에 존재하는 내독소의 양을 검출하고/하거나 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 상업용 키트가 구입 가능하다. 예를 들어, 단백질 샘플 중의 내독소의 농도는 QCL-1000 발색 키트(BioWhittaker) 또는 리뮐루스 아메바성 용해물(limulus amebocyte lysate: LAL) 기반 키트, 예컨대 피로텔(Pyrotell)(등록상표), 피로텔(등록상표)-T, 피로크롬(Pyrochrome)(등록상표), 크로모(Chromo)-LAL 및 어소시에이트 오브 케이프 코드 인코포레이티드(Associates of Cape Cod Incorporated)로부터 구입 가능한 CSE 키트를 사용하여 결정될 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편의 변형
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이의 발현 및 정제 후에 변형될 수 있다. 변형은 공유 또는 비공유 변형일 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 폴리펩타이드의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 부사슬 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써, 항체 또는 단편으로 도입될 수 있다. 변형에 적합한 부위는 예를 들어 항체 또는 단편의 구조 분석 또는 아미노산 서열 분석을 포함하는 임의의 다양한 기준을 이용하여 선택될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비상동성 모이어티로 접합될 수 있다. 비상동성 모이어티는 예를 들어 비상동성 폴리펩타이드, 치료제(예를 들어, 독소 또는 약물), 또는 검출 가능한 라벨, 예컨대 방사성 라벨, 효소 라벨, 형광 라벨, 중금속 라벨, 발광 라벨, 또는 친화도 태그, 예컨대 바이오틴 또는 스트렙타비딘(이들로 제한되지는 않음)일 수 있다. 적합한 비상동성 폴리펩타이드는 항체 또는 단편을 정제하는 데 사용하기 위한 예를 들어 항원 태그(예를 들어, FLAG(DYKDDDDK(서열 번호 20)), 폴리히스티딘(6-His; HHHHHH(서열 번호 21)), 헤마글루티닌(HA; YPYDVPDYA(서열 번호 22)), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 또는 말토스 결합 단백질(MBP))을 포함한다. 비상동성 폴리펩타이드는 진단학적 또는 검출 가능한 마커로서 유용한 폴리펩타이드(예를 들어, 효소), 예를 들어 루시퍼라제, 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP)) 또는 클로르암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT)를 또한 포함한다. 적합한 방사성 라벨은 예를 들어 32P, 33P, 14C, 125I, 131I, 35S 및 3H를 포함한다. 적합한 형광 라벨은 제한 없이 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC), 녹색 형광 단백질(GFP), 다이라이트(DyLight)(상표명) 488, 피코에리트린(PE), 프로피듐 요오다이드(PI), PerCP, PE-알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표) 700, Cy5, 알로피코사이아닌 및 Cy7을 포함한다. 발광 라벨은 예를 들어 임의의 다양한 발광 란탄족(예를 들어, 유로퓸 또는 테르븀) 킬레이트를 포함한다. 예를 들어, 적합한 유로퓸 킬레이트는 다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(DTPA) 또는 테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)의 유로퓸 킬레이트를 포함한다. 효소 라벨은 예를 들어 알칼리 포스파타제, CAT, 루시퍼라제 및 겨자무과산화효소를 포함한다.
2개의 단백질(예를 들어, 항체 및 비상동성 모이어티)은 임의의 다수의 공지된 화학 가교결합제를 사용하여 가교결합될 수 있다. 이러한 가교결합제의 예는 "방해" 다이설파이드 결합을 포함하는 연결을 통해 2개의 아미노산 잔기를 연결하는 것이다. 이 연결에서, 가교결합 단위 내의 다이설파이드 결합은 예를 들어 환원된 글루타티온 또는 효소 다이설파이드 환원효소의 작용에 의한 환원으로부터 (다이설파이드 결합의 측면에서 기를 방해함으로써) 보호된다. 하나의 적합한 시약, 4-숙신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α(2-피리딜다이티오) 톨루엔(SMPT)은 단백질 중 하나에서 말단 라이신을 이용하고 다른 하나에서 말단 시스테인을 이용하는 2개의 단백질 사이의 이러한 연결을 형성한다. 각각의 단백질에서의 상이한 커플링 모이어티에 의해 가교결합하는 이종작용성 시약을 또한 사용할 수 있다. 다른 유용한 가교결합제는 제한 없이 아르기닌의 부사슬에 존재하는 2개의 아미노기(예를 들어, N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드), 2개의 설프하이드릴기(예를 들어, 1,4-비스-말레이미도뷰탄), 아미노기 및 설프하이드릴기(예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스터), 아미노기 및 카복실기(예를 들어, 4-[p-아지도살리실아미도]뷰틸아민), 및 아미노기 및 구아니디늄기(예를 들어, p-아지도페닐 글라이옥살 1수화물)를 연결하는 시약을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 방사성 라벨은 항체의 아미노산 골격에 직접적으로 접합될 수 있다. 대안적으로, 방사성 라벨은 더 큰 분자(예를 들어, 유리 아미노기에 결합하여 관련 단백질의 메타-요오도페닐(mIP) 유도체를 형성하는 메타-[125I]요오도페닐-N-하이드록시숙신이미드([125I]mIPNHS) 내의 125I(예를 들어, 문헌[Rogers et al. (1997) J Nucl Med 38:1221-1229] 참조) 또는 결국 단백질 골격에 결합하는 킬레이트(예를 들어, DOTA 또는 DTPA에 대한 킬레이트)의 부분으로서 포함될 수 있다. 방사성 라벨 또는 이를 함유하는 더 큰 분자/킬레이트를 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편에 접합하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 단백질에 대한 방사성 라벨 또는 킬레이트의 결합을 수월하게 하는 조건(예를 들어, pH, 염 농도 및/또는 온도) 하에 단백질을 방사성 라벨과 항온처리하는 단계를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제6,001,329호 참조).
형광 라벨(때때로 "형광단"이라 칭함)을 단백질(예를 들어, 항체)에 접합하는 방법은 단백질 화학의 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 형광단은 형광단에 부착된 숙신이미딜(NHS) 에스터 또는 테트라플루오로페닐(TFP) 에스터 모이어티를 사용하여 단백질의 유리 아미노기(예를 들어, 라이신) 또는 설프하이드릴기(예를 들어, 시스테인)에 접합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 형광단은 이종작용성 가교결합제 모이어티, 예컨대 설포-SMCC에 접합될 수 있다. 적합한 접합 방법은 단백질에 대한 형광단의 결합을 수월하게 하는 조건 하에 항체 단백질, 또는 이의 단편을 형광단과 항온처리하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Welch and Redvanly (2003) "Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications," John Wiley and Sons (ISBN 0471495603)]을 참조한다.
몇몇 실시형태에서, 항체 또는 단편은 예를 들어 혈액, 혈청, 또는 다른 조직에서 순환 시 예를 들어 항체의 안정화 및/또는 보유를 개선하는 모이어티에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 단편은 예를 들어 문헌[Lee et al. (1999) Bioconjug Chem 10(6): 973-8; Kinstler et al. (2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 54:477-485; 및 Roberts et al. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476]]에 기재된 바대로 PEG화 또는 HES화(Fresenius Kabi(독일); 예를 들어 문헌[Pavisic et al. (2010) Int J Pharm 387(1-2):110-119] 참조)될 수 있다. 안정화 모이어티는 적어도 1.5배(예를 들어, 적어도 2배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배 또는 50배 이상)의 항체(또는 단편)의 안정성, 또는 보유를 개선할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 글라이코실화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 효소 또는 화학 처리로 처리되거나, 세포로부터 생성될 수 있어서, 항체 또는 단편은 감소한 글라이코실화를 가지거나 이것이 부재한다. 감소한 글라이코실화를 가지는 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제6,933,368호; 문헌[Wright et al. (1991) EMBO J 10(10):2717-2723; 및 Co et al. (1993) Mol Immunol 30:1361]에 기재되어 있다.
약제학적 조성물 및 제제
본 명세서에 기재된 조성물은 예를 들어 보체 관련 장애의 치료 또는 예방을 위해 대상체에 대한 투여를 위해 약제학적 용액으로서 제제화될 수 있다. 약제학적 조성물은 일반적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 것이다. 본 명세서에 사용되는 바대로, "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 의미하고 이들을 포함한다. 조성물은 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어 산 부가염 또는 염기 부가염(예를 들어, 문헌[Berge et al. (1977) J Pharm Sci 66:1-19] 참조)을 포함할 수 있다.
조성물은 표준 방법에 따라 제제화될 수 있다. 약제학적 제제는 널리 확립된 분야이고, 추가로 예를 들어 문헌[Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20th Edition, Lippincott, Williams & Wilkins (ISBN: 0683306472); Ansel et al. (1999) "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems," 7th Edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (ISBN: 0683305727); 및 Kibbe (2000) "Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association," 3rd Edition (ISBN: 091733096X)]에 기재되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은, 예를 들어 적합한 농도의, 2-8℃(예를 들어, 4℃)에서의 저장에 적합한 완충 용액으로서 제제화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 0℃ 미만의 온도(예를 들어, -20℃ 또는 -80℃)에서의 저장을 위해 제제화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 2-8℃(예를 들어, 4℃)에서의 2년 이하(예를 들어, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 1½년 또는 2년) 동안의 저장을 위해 제제화될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 2-8℃(예를 들어, 4℃)에서의 적어도 1년 동안의 저장에서 안정하다.
약제학적 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이 형태는 예를 들어 액체, 반고체 및 고체 제형, 예컨대 액체 용액(예를 들어, 주사용 및 점적주사 가능한 용액), 분산제 또는 현탁제, 정제, 환제, 산제, 리포솜 및 좌제를 포함한다. 바람직한 형태는 부분적으로 의도되는 투여 방식 및 치료학적 적용에 따라 달라진다. 예를 들어, 전신 또는 국소 전달에 의도되는 조성물을 함유하는 조성물은 주사용 또는 점적주사 가능한 용액의 형태일 수 있다. 따라서, 조성물은 비경구 방식(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사)에 의한 투여에 대해 제제화될 수 있다. "비경구 투여", "비경구로 투여된" 및 다른 문법상 동등한 구절은, 본 명세서에 사용되는 바대로, 보통 주사에 의한 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 제한 없이 정맥내, 비강내, 안내, 폐, 근육내, 동맥내, 척추강내, 관절낭내(intracapsular), 안와하, 심장내, 피내, 폐내, 복강내, 기관지내, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외, 대뇌내, 두개내, 경동맥내 및 흉골내 주사 및 점적주사(하기 참조)를 포함한다.
상기 조성물은 높은 농도에서 안정한 저장에 적합한 용액, 마이크로에멀션, 분산제, 리포솜, 또는 다른 순서화 구조로서 제제화될 수 있다. 적절한 용매 중에 필요한 양의 본 명세서에 기재된 조성물을 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이의 조합과 혼입한 후, 필터 살균하여 무균 주사용 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 조성물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 무균 비히클로 혼입함으로써 분산액을 제조한다. 무균 주사용 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 제조 방법은 이의 이전에 무균 여과된 용액으로부터 본 명세서에 기재된 조성물과 임의의 추가적인 원하는 성분(하기 참조)의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물 중에 흡수를 지연시키는 시약, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 함유함으로써 될 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물은 또한 면역리포솜 조성물에서 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 문헌[Epstein et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:3688; Hwang et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77:4030]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 4,544,545호에 기재된 방법의 의해 제조될 수 있다. 증대된 순환 시간을 가지는 리포솜은 예를 들어 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
소정의 실시형태에서, 조성물은 신속 방출에 대해 화합물을 보호하는 담체, 예컨대 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제와 제제화될 수 있다. 생분해 가능한, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스터 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제제의 많은 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[J.R. Robinson (1978) "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems," Marcel Dekker, Inc., New York]을 참조한다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 포유동물, 예컨대 인간에 대한 폐내 투여(예를 들어, 흡입기 또는 분무기를 통한 투여)에 적합한 조성물 중에 제제화될 수 있다. 이러한 조성물을 제제화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 출원 공보 제20080202513호; 미국 특허 제7,112,341호 및 6,019,968호; 및 PCT 공보 WO 제00/061178호 및 WO 제06/122257호(각각의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다. 건조 분말 흡입기 제제 및 제제의 투여에 적합한 시스템은 예를 들어 미국 특허 출원 공보 제20070235029호, PCT 공보 WO 제00/69887호; 및 미국 특허 제5,997,848호에 기재되어 있다. 폐내 투여에 적합한 추가적인 제제(및 폴리펩타이드를 제제화하는 방법)는 예를 들어 미국 특허 출원 공보 제20050271660호 및 20090110679호에 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 눈에 대한 전달을 위해 제제화될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "눈"은 눈과 연관된 임의의 및 모든 해부학적 조직 및 구조를 의미한다. 눈은 외부 공막, 중간 맥락막 층 및 외부 망막의 3개의 명확한 층으로 이루어진 벽을 가진다. 수정체 뒤의 방은 유리액이라 칭하는 젤라틴질 유체로 충전된다. 눈의 뒤에 광을 검출하는 망막이 있다. 각막은 눈의 뒤로 상을 옮기는 광학적으로 투명한 조직이다. 각막은 눈으로 약물을 침투시키기 위한 하나의 경로를 포함한다. 눈과 연관된 다른 해부학적 조직 구조는 분비 체계, 분배 체계 및 배출 체계를 포함하는 눈물 방수 체계를 포함한다. 분비 체계는 눈물 증발로 인한 온도 변화 및 깜빡거림에 의해 자극되는 분비선 및 원심성 부교감 신경 공급을 가지고 신체 또는 감정 자극에 반응하여 눈물을 분비하는 반사 분비선을 포함한다. 분배 체계는 눈꺼풀 및 열린 눈의 눈꺼풀 테두리 주위의 누도(tear meniscus)를 포함하고, 이것은 깜빡거려서 눈 표면에 걸쳐 눈물을 분산시켜 건성 부위가 진행되는 것을 감소시킨다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 국소로, 예를 들어 국소 적용 또는 유리체내 주사에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 조성물은 눈 점안액에 의한 투여를 위해 제제화될 수 있다.
눈을 치료하기 위한 치료학적 제제는 약제학적으로 허용되는 용액, 현탁제 또는 연고 중의 약 0.01 내지 약 1중량%, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.5중량%의 농도의 하나 이상의 활성제를 함유할 수 있다. 제제는 바람직하게는 예를 들어 추가적인 성분, 예컨대 보존제, 완충제, 등장화제, 항산화제 및 안정화제, 비이온성 습윤화 또는 투명화 물질, 및 점도 증가제(이들로 제한되지는 않음)를 함유하는 무균 수용액의 형태일 것이다.
이러한 용액에 사용하기에 적합한 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로로뷰탄올, 티메로살 등을 포함한다. 적합한 완충제는 약 pH 6 내지 pH 8, 바람직하게는 약 pH 7 내지 pH 7.5의 pH를 유지시키기에 충분한 양으로 예를 들어 붕산, 중탄산나트륨 및 중탄산칼륨, 붕산나트륨 및 붕산칼륨, 탄산나트륨 및 탄산칼륨, 아세트산나트륨, 및 나트륨 바이포스페이트를 포함한다. 적합한 등장화제는 덱스트란 40, 덱스트란 70, 덱스트로스, 글라이세린, 염화칼륨, 프로필렌 글리콜, 및 염화나트륨이다.
적합한 항산화제 및 안정화제는 나트륨 바이설파이트, 나트륨 메타바이설파이트, 나트륨 티오설파이트 및 티오우레아를 포함한다. 적합한 습윤 및 투명화제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 282 및 틸록사폴을 포함한다. 적합한 점도 증가제는 덱스트란 40, 덱스트란 70, 젤라틴, 글라이세린, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시메틸프로필셀룰로스, 라놀린, 메틸셀룰로스, 페트롤라툼, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈 및 카복시메틸셀룰로스를 포함한다. 제제는 종래의 방법에 의해, 예를 들어 점안액의 형태로, 또는 하나 이상의 조성물을 함유하는 치료학적 용액 중에 눈을 씻어냄으로써 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, AMD로 고통받는 대상체)의 눈에 국소로 투여될 수 있다.
또한, 눈의 유리체강으로 약물을 도입하기 위한 다양한 장치가 개발되었다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제20020026176호는 공막으로 삽입될 수 있는 의약품 함유 플러그를 기술하고, 그래서 이것은 유리체강으로 돌출되어 약제학적 물질을 유리체강으로 전달한다. 또 다른 예에서, 미국 특허 제5,443,505호는 눈의 내부로의 약물의 지속 방출을 위해 맥락막상의 공간 또는 무혈관 영역으로 도입하기 위한 이식 가능한 장치를 기술한다. 미국 특허 제5,773,019호 및 6,001,386호는 각각 눈의 공막 표면에 부착 가능한 이식 가능한 약물 전달 장치를 개시한다. 장치는 저용해도 물질에 투과성인 비생분해성 중합체에 의해 덮인 유효량의 저용해도 물질을 함유하는 내부 코어를 포함한다. 조작 동안, 저용해도 물질은 장치로부터의 지속 방출을 위한 생분해성 중합체 커버를 침투한다. 눈에 대한 치료제의 전달을 위한 추가적인 방법 및 장치(예를 들어, 경공막 패치 및 콘택트 렌즈를 통한 전달)는 예를 들어 문헌[Ambati and Adamis (2002) Prog Retin Eye Res 21(2):145-151; Ranta and Urtti (2006) Adv Drug Delivery Rev 58(11):1164-1181; Barocas and Balachandran (2008) Expert Opin Drug Delivery 5(1):1-10(10); Gulsen and Chauhan (2004) Invest Opthalmol Vis Sci 45:2342-2347; Kim et al. (2007) Ophthalmic Res 39:244-254]; 및 PCT 공보 WO 제04/073551호(이의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다.
상기 기재된 바와 같이, 비교적 고농도의 조성물이 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 약 10㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖(예를 들어, 약 9㎎/㎖ 내지 90㎎/㎖; 약 9㎎/㎖ 내지 50㎎/㎖; 약 10㎎/㎖ 내지 50㎎/㎖; 약 15㎎/㎖ 내지 50㎎/㎖; 약 15㎎/㎖ 내지 110㎎/㎖; 약 15㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖; 약 20㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖; 약 20㎎/㎖ 내지 80㎎/㎖; 약 25㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖; 약 25㎎/㎖ 내지 85㎎/㎖; 약 20㎎/㎖ 내지 50㎎/㎖; 약 25㎎/㎖ 내지 50㎎/㎖; 약 30㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖; 약 30㎎/㎖ 내지 50㎎/㎖; 약 40㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖; 또는 약 50㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖)의 농도에서 제제화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 5㎎/㎖ 초과 및 50㎎/㎖ 미만의 농도에서 제제화될 수 있다. 수용액 중에 단백질을 제제화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제7,390,786호; 문헌[McNally and Hastedt (2007), "Protein Formulation and Delivery," Second Edition, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Volume 175, CRC Press; 및 Banga (2005), "Therapeutic peptides and proteins: formulation, processing, and delivery systems, Second Edition" CRC Press]에 기재되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 수용액은 중성 pH, 예를 들어 6.5 내지 8(예를 들어, 7 내지 8(포함))의 예를 들어 pH를 가진다. 몇몇 실시형태에서, 수용액은 약 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0의 pH를 가진다. 몇몇 실시형태에서, 수용액은 6 초과(또는 이상)(예를 들어, 6.1 이상, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8 또는 7.9)이지만, pH 8 미만인 pH를 가진다.
치료학적 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은, 세포 내에 발현하고 물질을 생성하기 위해 사용될 수 있는 핵산을 전달하기 위해, 유전자 치료 프로토콜의 부분으로서 사용되는 유전자 작제물로 혼입될 수 있다. 이러한 성분의 발현 작제물, 예를 들어 생체내 세포에 성분 유전자를 효과적으로 전달할 수 있는 임의의 제제 또는 조성물은 임의의 치료학적으로 효과적인 담체 중에 투여될 수 있다. 접근법은 재조합 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티바이러스, 및 단순 포진 바이러스-1(HSV-1), 또는 재조합 박테리아 또는 진핵생물 플라스미드를 포함하는 바이러스 벡터에서의 해당 유전자의 삽입을 포함한다. 바이러스 벡터는 직접적으로 세포를 형질감염시킬 수 있고; 플라스미드 DNA는 예를 들어 양이온성 리포솜(리포펙틴) 또는 유도체화, 폴리라이신 접합체, 그라미시딘 S, 인공 바이러스 피막 또는 다른 이러한 세포내 운반체에 의해 전달될 수 있고, 유전자 작제물의 직접 주사 또는 CaPO4 침전(예를 들어, WO 제04/060407호 참조)이 생체내 수행된다. (또한, 하기 "생체외 접근법"을 참조한다.) 적합한 레트로바이러스의 예는 당해 분야의 당업자에 공지된 pLJ, pZIP, pWE 및 pEM을 포함한다(예를 들어, 문헌[Eglitis et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J Immunol 150:4104-4115]; 미국 특허 제4,868,116호 및 제4,980,286호; 및 PCT 공보 WO 제89/07136호, WO 제89/02468호, WO 제89/05345호 및 WO 제92/07573호 참조). 또 다른 바이러스 유전자 전달 시스템은 아데노바이러스 유래 벡터를 이용한다(예를 들어, 문헌[Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; 및 Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155] 참조). 아데노바이러스 균주 Ad 5형 dl324 또는 아데노바이러스의 다른 균주(예를 들어, Ad2, Ad3, Ad7 등)로부터 유래한 적합한 아데노바이러스 벡터는 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 해당 유전자의 전달에 유용한 훨씬 또 다른 바이러스 벡터 시스템은 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus: AAV)이다. 예를 들어, 문헌[Flotte et al. (1992) Am J Respir Cell Mol Biol 7:349-356; Samulski et al. (1989) J Virol 63:3822-3828; 및 McLaughlin et al. (1989) J Virol 62:1963-1973]을 참조한다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료제, 예를 들어 대상체에서 보체 관련 장애(예를 들어, AP 관련 장애 또는 CP 관련 장애)를 치료하거나 예방하기 위한 추가적인 치료제에 의해 제제화될 수 있다. 대상체에서 보체 관련 장애를 치료하기 위한 추가적인 물질은 치료되는 특정한 장애에 따라 달라질 것이지만, 제한 없이 [예를 들어, HELLP 증후군을 치료하기 위해 사용하기 위한] 항고혈압제(예를 들어, 안지오텐신 전환 효소 저해제), 항응고제, 코티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손), 또는 면역억제제(예를 들어, 빈크리스틴 또는 사이클로스포린 A)를 포함할 수 있다. 항응고제의 예는 예를 들어 와파린(Coumadin), 아스피린, 헤파린, 페닌디온, 폰다파리눅스, 이드라파리눅스 및 트롬빈 저해제(예를 들어, 아르가트로반, 레피루딘, 비발리루딘 또는 다비가트란)를 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물은 보체 관련 장애의 치료를 위해 혈소판용해제(예를 들어, 앤크로드, ε-아미노카르로산, 안티플라스민-a1, 프로스타사이클린 및 디피브로타이드)와 또한 제제화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 지질 저하제, 예컨대 하이드록시메틸글루타릴 CoA 환원효소의 저해제와 제제화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 항-CD20 물질, 예컨대 리툭시맙(Rituxan(상표명); Biogen Idec(매사추세츠주 캠브릿지))과 사용하기 위해 또는 이것과 제제화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 RA의 치료를 위해, 조성물은 인플릭시맙(Remicade(등록상표); Centocor, Inc.) 및 메토트렉세이트(Rheumatrex(등록상표), Trexall(등록상표)) 중 하나 또는 둘 다와 제제화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 비스테로이드성 소염 약물(NSAID)과 제제화될 수 있다. 많은 상이한 NSAID, 이부프로펜(Advil(등록상표), 모트린(등록상표), Nuprin(등록상표)) 및 나프록센(Alleve(등록상표))을 포함하는 몇몇 일반 의약품이 이용 가능하고, 멜록시캄(Mobic(등록상표)), 에토돌락(Lodine(등록상표)), 나부메톤(Relafen(등록상표)), 술린닥(Clinoril(등록상표)), 톨레멘틴(Tolectin(등록상표)), 콜린 마그네슘 살리실레이트(Trilasate(등록상표)), 디클로페낙(Cataflam(등록상표), Voltaren(등록상표), Arthrotec(등록상표)), 디플루시날(Dolobid(등록상표)), 인도메타신(Indocin(등록상표)), 케토프로펜(Orudis(등록상표), Oruvail(등록상표)), 옥사프로진(Daypro(등록상표)) 및 피록시캄(Feldene(등록상표))을 포함하는 많은 것들이 처방전에 의해 이용 가능하다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 항고혈압제, 항발작제(예를 들어, 황산마그네슘) 또는 항혈전성제와 사용하기 위해 제제화될 수 있다. 항고혈압제는 예를 들어 라베탈롤, 하이드랄라진, 니페디핀, 칼슘 채널 길항제, 니트로글라이세린 또는 나트륨 니트로프루시에이트를 포함한다. (예를 들어, 문헌[Mihu et al. (2007) J Gastrointestin Liver Dis 16(4):419-424] 참조.) 항혈전성제는 예를 들어 헤파린, 안티트롬빈, 프로스타사이클린 또는 저용량 아스피린을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 폐내 투여를 위해 제제화된 조성물은 폐 장애를 치료하기 위한 적어도 하나의 추가적인 활성제를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 활성제는 예를 들어 항-IgE 항체(예를 들어, 오말리주맙), 항-IL-4 항체 또는 항-IL-5 항체, 항-IgE 저해제(예를 들어, 몬테루카스트 나트륨), 교감신경흥분제(예를 들어, 알부테롤), 항생제(예를 들어, 토브라마이신), 데옥시리보뉴클레아제(예를 들어, Pulmozyme(등록상표)), 항콜린 약물(예를 들어, 이프라트로피움 브로마이드), 코티코스테로이드(예를 들어, 덱사메타손), β-아드레노수용체 효현제, 류코트리엔 저해제(예를 들어, 질루톤), 5-리폭시게나아제 저해제, PDE 저해제, CD23 길항제, IL-13 길항제, 사이토킨 방출 저해제, 히스타민 H1 수용체 길항제, 항히스타민제, 소염제(예를 들어, 크로몰린 나트륨) 또는 히스타민 방출 저해제일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 눈의 보체 관련 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 하나 이상의 추가적인 치료제에 의한 투여를 위해 제제화될 수 있다. 이러한 추가적인 치료제는 예를 들어 베바시주맙, 또는 베바시주맙 또는 라니비주맙의 Fab 단편(둘 다 로슈 파마슈티컬즈, 인코포레이티드(Roche Pharmaceuticals, Inc.)사제) 및 페갑타닙 나트륨(뮤코겐(Mucogen)(등록상표); Pfizer, Inc.(화이자, 인코포레이티드))일 수 있다. 이러한 키트는 대상체에게 조성물을 투여하기 위한 설명서를 임의로 또한 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 정맥내 감마 글로불린 치료(intravenous gamma globulin therapy: IVIG), 혈장교환(plasmapheresis), 혈장 대체 또는 혈장 교환과 함께 대상체에 대한 투여를 위해 제제화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 신장 이식 전에, 동안에 또는 후에 제제화될 수 있다.
조성물을 제2 활성제와 조합하여 사용하고자 할 때, 조성물은 제2 물질과 동시제제화될 수 있거나, 조성물은 제2 물질 제제와 별개로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 각각의 약제학적 조성물은 예를 들어 투여 바로 전에 혼합되고 함께 투여될 수 있거나, 예를 들어 동시에 또는 다른 시간에 별개로 투여될 수 있다(하기 참조).
적용
본 명세서에 기재된 조성물은 다수의 진단학적 및 치료학적 적용에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능하게 표지된 항원 결합 분자는 샘플(예를 들어, 생물학적 샘플) 중의 표적 항원의 존재 또는 양을 검출하기 위해 검정에서 사용될 수 있다. 조성물은 표적 항원 기능의 저해를 연구하기 위해 실험실내 검정에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 조성물이 보체 단백질에 결합하고 이를 저해하는 몇몇 실시형태에서, 조성물은 보체 활성을 저해하거나 달리 보체 관련 장애를 치료하기에 유용한 추가적인 신규한 화합물을 확인하도록 설계된 검정에서 양성 대조군으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, C5 저해 조성물은 MAC의 C5 생성 또는 형성을 감소시키거나 무효화하는 추가적인 화합물(예를 들어, 소분자, 압타머 또는 항체)을 확인하기 위한 검정에서 양성 대조군으로서 사용될 수 있다. 조성물은 하기에 설명된 바대로 치료학적 방법에서 또한 사용될 수 있다.
치료 방법
본 명세서에 기재된 조성물은 부분적으로 투여 경로에 따라 달라지는 다양한 방법을 이용하여 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 경로는 예를 들어 정맥내 주사 또는 점적주사(IV), 피하 주사(SC), 복강내(IP) 주사, 또는 근육내 주사(IM)일 수 있다.
피하 투여는 장치에 의해 달성될 수 있다. 장치 수단은 주사기, 프리필드 주사기, 일회용 또는 재사용을 위한 자동 주사기, 펜 주사기, 패치 주사기, 착용형 주사기, 피하 점적주사 세트를 가지는 보행용 주사기 점적주사 펌프 또는 피하 주사를 위해 항체 약물과 조합하기 위한 다른 장치일 수 있다.
투여는 예를 들어 국소 점적 주사 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있다. 임플란트는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴질 재료, 예컨대 막, 예컨대 시알라스틱(sialastic) 막 또는 섬유일 수 있다. 임플란트는 대상체에 대한 조성물의 지속 또는 정기 방출에 구성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제20080241223호; 미국 특허 제5,501,856호; 제4,863,457호; 및 제3,710,795호; 제EP488401호; 및 EP 제430539호(각각의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용됨)를 참조한다. 본 명세서에 기재된 조성물은 예를 들어 확산성, 침식성 또는 대류성 시스템에 기초한 이식 가능한 장치, 예를 들어 삼투 펌프, 생분해성 임플란트, 전기확산 시스템, 전기삼투 시스템, 증기 압력 펌프, 전해 펌프, 발포성 펌프, 압전 펌프, 부식 기반 시스템, 또는 전기기계 시스템에 의해 대상체에게 전달될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 국소 투여에 의해 대상체에게 치료학적으로 전달된다. 본 명세서에 사용되는 바대로, "국소 투여" 또는 "국소 전달"은 혈관계를 통한 의도되는 표적 조직 또는 부위로의 조성물 또는 물질의 수송에 의존하지 않는 전달을 의미한다. 예를 들어, 조성물은 조성물 또는 물질의 주사 또는 이식, 또는 조성물 또는 물질을 함유하는 장치의 주사 또는 이식에 의해 전달될 수 있다. 표적 조직 또는 부위 근처의 국소 투여 이후, 조성물 또는 물질, 또는 이의 하나 이상의 성분은 의도되는 표적 조직 또는 부위로 확산할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 관절(예를 들어, 굴절 관절)에 국소로 투여될 수 있다. 예를 들어, 장애가 관절염인 실시형태에서, 치료학적으로 적절한 조성물은 관절(예를 들어, 관절 공간)에 또는 관절의 주변에 직접적으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물이 국소로 투여될 수 있는 굴절 관절의 예는 예를 들어 엉덩이, 무릎, 팔꿈치, 손목, 흉쇄, 측두하악관절, 손수근골, 발족근골, 발목, 및 관절염 병태를 겪는 임의의 다른 관절을 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물은 점액낭, 예를 들어 견봉돌기(acromial), 거위다리(bicipitoradial), 전박요골(cubitoradial), 어깨세모근(deltoid), 슬개하(infrapatellar), 좌골(ischial), 및 의학의 분야에 공지된 임의의 다른 점액낭에 또한 투여될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 눈에 국소로 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "눈"은 눈과 연관된 임의의 및 모든 해부학적 조직 및 구조를 의미한다. 눈은 외부 공막, 중간 맥락막 층 및 외부 망막의 3개의 명확한 층으로 이루어진 벽을 가진다. 수정체 뒤의 방은 유리액이라 칭하는 젤라틴질 유체로 충전된다. 눈의 뒤에 광을 검출하는 망막이 있다. 각막은 눈의 뒤로 상을 옮기는 광학적으로 투명한 조직이다. 각막은 눈으로 약물을 침투시키기 위한 하나의 경로를 포함한다. 눈과 연관된 다른 해부학적 조직 구조는 분비 체계, 분배 체계 및 배출 체계를 포함하는 눈물 방수 체계를 포함한다. 분비 체계는 눈물 증발로 인한 온도 변화 및 깜빡거림에 의해 자극되는 분비선 및 원심성 부교감 신경 공급을 가지고 신체 또는 감정 자극에 반응하여 눈물을 분비하는 반사 분비선을 포함한다. 분배 체계는 눈꺼풀 및 열린 눈의 눈꺼풀 테두리 주위의 누도를 포함하고, 이것은 깜빡거려서 눈 표면에 걸쳐 눈물을 분산시켜 건성 부위가 진행되는 것을 감소시킨다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 눈의 후방에 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 유리체내로 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 공맥을 통해 투여된다.
몇몇 실시형태에서, 예를 들어 장애, 예컨대 COPD 또는 천식의 치료 또는 예방을 위한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 폐에 의해 대상체에 대해 투여될 수 있다. 폐 약물 전달은 흡입에 의해 달성될 수 있고, 본 명세서에서 흡입에 의한 투여는 경구 및/또는 비강일 수 있다. 폐 전달을 위한 약제학적 장치의 예는 계량 용량 흡입기, 건조 분말 흡입기(dry powder inhaler: DPI) 및 분무기를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물은 건조 분말 흡입기에 의해 대상체의 폐에 투여될 수 있다. 이 흡입기는 폐에 분산 가능하고 안정한 건조 분말 제제를 전달하는 추진제 비함유 장치이다. 건조 분말 흡입기는 의학의 분야에 널리 공지되어 있고, 제한 없이 터보할러(TurboHaler)(등록상표)(AstraZeneca(영국 런던)), AIR(등록상표) 흡입기(Alkermes(등록상표)(매사추세츠주 캠브리지)); 로타할러(Rotahaler)(등록상표)(GlaxoSmithKline(영국 런던)); 및 에클립스(Eclipse)(상표명)(Sanofi-Aventis(프랑스 파리))를 포함한다. 또한, 예를 들어 PCT 공보 WO 제04/026380호, WO 제04/024156호 및 WO 제01/78693호를 참조한다. DPI 장치는 폴리펩타이드, 예컨대 인슐린 및 성장 호르몬의 폐 투여에 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 계량 용량 흡입기에 의해 폐내로 투여될 수 있다. 이 흡입기는 폐에 화합물의 별개의 용량을 전달하기 위해 추진제에 의존한다. 계량 용량 흡입기에 의해 투여된 화합물의 예는 예를 들어 아스토벤트(Astovent)(등록상표)(Boehringer-Ingelheim(코네티컷주 릿지필드)) 및 Flovent(등록상표)(GlaxoSmithKline)를 포함한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 제6,170,717호; 제5,447,150호; 및 제6,095,141호를 참조한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 분무기에 의해 대상체의 폐에 투여될 수 있다. 분무기는 액화 에어로졸 또는 미스트로서 화합물을 전달하기 위해 압축 공기를 사용한다. 분무기는 예를 들어 제트 분무기(예를 들어, 공기 또는 액체 제트 분무기) 또는 초음파 분무기일 수 있다. 추가적인 장치 및 폐내 투여 방법은 예를 들어 미국 특허 출원 공보 제20050271660호 및 20090110679호(각각의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 자가 투여에 특히 적합할 수 있는 단위 제형으로 제시된다. 본 개시내용의 제제화된 생성물은 용기, 통상적으로, 예를 들어 바이알, 카트리지, 프리필드 주사기 또는 일회용 팬 내에 포함될 수 있다. 투약기, 예컨대 미국 특허 제6,302,855호에 기재된 투약기 장치는 예를 들어 본 개시내용의 주사 시스템과 또한 사용될 수 있다.
본 개시내용의 주사 시스템은 미국 특허 제5,308,341호에 기재된 바와 같은 전달 펜을 사용할 수 있다. 당뇨병을 가지는 환자에게 인슐린의 자가 전달에 가장 흔히 사용되는 펜 장치는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 장치는 적어도 하나의 주사침(예를 들어, 길이가 약 5 내지 8㎜인 31 게이지 침)을 포함할 수 있고, 치료학적 용액의 하나 이상의 치료학적 단위 용량으로 통상적으로 미리 충전되고, 가능한 적은 통증으로 대상체에게 용액을 신속히 전달하기에 유용하다.
하나의 약제 전달 펜은 인슐린 또는 다른 약제의 바이알이 수용될 수 있는 바이알 홀더를 포함한다. 바이알 홀더는 근위 및 원위 말단을 가지는 세장형 일반적인 관 구조이다. 바이알 홀더의 근위 말단은 이중 말단 침 캐뉼라를 맞물리기 위한 탑재 수단을 포함한다. 근위 말단은 드라이버 및 용량 설정 장치를 포함하는 펜 몸체를 맞물리기 위한 마운틴 수단을 또한 포함한다. 선행 기술의 바이알 홀더에 의해 사용하기 위한 바이알을 함유하는 일회용 약제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물의 고농도 용액)는 이중 말단 침 캐뉼라의 일 말단이 관통할 수 있는 관통 가능한 엘라스토머 격막을 가지는 근위 말단을 포함한다. 이 바이알의 근위 말단은 바이알의 원통형 벽과의 유밀 끼워맞춤으로 미끄러짐 가능하게 배치된 스톱퍼(stopper)를 포함한다. 이 약제 전달 펜은 약제의 바이알을 바이알 홀더로 삽입함으로써 사용된다. 이후, 펜 몸체는 바이알 홀더의 근위 말단에 연결된다. 펜 몸체는 펜에 의해 전달하고자 하는 약제의 용량을 지정하기 위한 용량 설정 장치 및 선택된 용량에 상응하는 거리에 대해 근위로 바이알의 스톱퍼를 이동시키기 위한 드라이빙 장치를 포함한다. 펜의 사용자는 이중 말단 침 캐뉼라를 바이알 홀더의 근위 말단에 탑재하여서 침 캐뉼라의 근위 포인트는 바이알에서의 격막을 관통한다. 이후, 환자는 용량을 선택하고 근위로 스톱퍼를 이동시키기도록 펜을 조작하여 선택된 용량을 전달한다. 용량 선택 장치는 선택된 용량의 주사 시 0으로 복귀한다. 이후, 환자는 침 캐뉼라를 제거하고 버리고, 다음 필요한 약제 투여를 위한 편리한 위치로 약제 전달 펜을 유지시킨다. 바이알 내의 약제는 이러한 여러 약제 투여 후 고갈될 것이다. 이후, 환자는 펜 몸체로부터 바이알 홀더를 분리한다. 이후, 빈 바이알을 제거하고 버릴 수 있다. 새로운 바이알을 바이알 홀더로 삽입할 수 있고, 바이알 홀더 및 펜 몸체를 재조립하고 상기 설명된 바대로 사용할 수 있다. 따라서, 약제 전달 펜은 일반적으로 정확한 투약 및 사용의 용이성을 위한 드라이브 기전을 가진다.
투약 기전, 예컨대 회전 가능한 손잡이는 사용자가 미리 포장된 약제의 바이알로부터 펜에 의해 주사되는 약제의 양을 정확하게 조절하게 한다. 약제의 용량을 주사하기 위해, 사용자는 피부 아래에 침을 삽입하고 이것이 눌러지는 거리까지 한번 손잡이를 누른다. 펜은 완전 기계적 장치일 수 있거나, 이것은 사용자에 의해 주사되는 약제의 투약량을 정확히 설정하고/하거나 표시하기 위해 전자 회로와 조합될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,192,891호를 참조한다.
몇몇 실시형태에서, 펜 장치의 침은 일회용이고, 키트는 하나 이상의 일회용 대체 침을 포함한다. 현재 특징으로 하는 조성물의 임의의 하나의 전달에 적합한 펜 장치는 예를 들어 미국 특허 제6,277,099호; 제6,200,296호; 및 제6,146,361호(각각의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용됨)에 또한 기재되어 있다. 미세침 기반 펜 장치는 예를 들어 미국 특허 제7,556,615호(이의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다. 또한, 프리시즌 펜 인젝터(Precision Pen Injector: PPI) 장치, 몰리(Molly)(상표명)(스칸디나비안 헬스 리미티드(Scandinavian Health Ltd)사제)를 참조한다.
본 개시내용은 약제, 예컨대 본 명세서에 기재된 조성물의 만성 및/또는 자가 투여에 적합한 제어 방출 또는 연장 방출 제제를 또한 제시한다. 다양한 제제는 일정한 기간에 걸쳐 볼루스로서 또는 연속 점적주사에 의해 약제에 의한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 고농도 조성물은 지속 방출, 연장 방출, 시간적 방출 제어 방출 또는 연속 방출 투여를 위해 제제화된다. 몇몇 실시형태에서, 데포 제제는 이를 필요로 하는 대상체에게 조성물을 투여하기 위해 사용된다. 이 방법에서, 조성물은 수시간 또는 수일의 기간에 걸쳐 활성제의 점진적 방출을 제공하는 하나 이상의 담체와 제제화된다. 이러한 제제는 활성제를 방출하기 위해 신체에서 점진적으로 분산된 분해 기질에 대개 기초한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에 대한 폐내 투여의 방식으로 투여된다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물은 장애, 예컨대 천식 또는 COPD를 겪는 대상체(예를 들어, 인간)에 대한 분무기 또는 흡입기의 방식으로 전달될 수 있다.
용량이 대상체에서 장애를 치료하거나 예방할 수 있는 본 명세서에 기재된 조성물의 적합한 용량은 예를 들어 치료되는 대상체의 연령, 성별 및 체중 및 사용된 특정한 저해제 화합물을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 동일한 대상체를 치료하기 위해 필요한 상이한 조성물(예를 들어, 항-TNFα 조성물)의 용량과 비교하여 RA를 가지는 대상체를 치료하기 위해 하나의 조성물(예를 들어, 항-C5 조성물)의 상이한 용량이 필요할 수 있다. 대상체에게 투여되는 용량에 영향을 미치는 다른 인자는 예를 들어 장애의 유형 또는 중증도를 포함한다. 예를 들어, RA를 가지는 대상체는 PNH를 가지는 대상체보다 본 명세서에 기재된 항-C5 조성물의 상이한 투약량의 투여를 필요로 할 수 있다. 다른 인자는 예를 들어 대상체에 동시에 또는 이전에 영향을 미친 다른 의학 장애, 대상체의 일반 건강, 대상체의 유전적 소인, 식이, 투여 시간, 배설 속도, 약물 조합, 및 대상체에게 투여되는 임의의 다른 추가적인 치료제를 포함할 수 있다. 임의의 특정한 대상체에 대한 특정한 투약량 및 치료 섭생이 치료 의학 실행자(예를 들어, 의사 또는 간호사)의 판단에 따라 또한 달라질 것이라는 것이 또한 이해되어야 한다.
본 명세서에 기재된 조성물은 고정 용량으로서, 또는 킬로그램당 밀리그램(㎎/㎏)의 용량으로 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 용량은 항체의 생성 또는 조성물 중의 하나 이상의 항원 결합 분자에 대한 다른 숙주 면역 반응을 감소시키거나 피하기 위해 또한 선택될 수 있다. 어떤 방식으로든 제한인 것으로 의도되지 않으면서, 항체, 예컨대 본 명세서에 기재된 조성물의 예시적인 투약량은 예를 들어 1-1000㎎/㎏, 1-100㎎/㎏, 0.5-50㎎/㎏, 0.1-100㎎/㎏, 0.5-25㎎/㎏, 1-20㎎/㎏, 및 1-10㎎/㎏을 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물의 예시적인 투약량은 제한 없이 0.1㎎/㎏, 0.5㎎/㎏, 1.0㎎/㎏, 2.0㎎/㎏, 4㎎/㎏, 8㎎/㎏, 또는 20㎎/㎏을 포함한다.
약제학적 용액은 본 명세서에 기재된 조성물의 치료학적 유효량을 포함할 수 있다. 이러한 유효량은 투여된 조성물의 효과, 또는 하나 초과의 물질이 사용되는 경우 조성물 및 하나 이상의 추가적인 활성제의 조합 효과에 기초하여 당해 분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물의 치료학적 유효량은 질환 상태, 개인의 연령, 성별 및 체중, 및 개인에서 원하는 반응, 예를 들어 적어도 하나의 병태 매개변수의 경감, 예를 들어 보체 매개 장애의 적어도 하나의 증상의 경감을 발생시키는 조성물(및 하나 이상의 추가적인 활성제)의 능력과 같은 인자에 따라 또한 변할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물의 치료학적 유효량은 당해 분야에 공지되거나 본 명세서에 기재된 특정한 장애 및/또는 특정한 장애의 임의의 하나의 증상을 저해(이의 중증도를 감소시키거나 이의 발생을 제거)하고/하거나 예방할 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 치료학적으로 유리한 효과가 조성물의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 것이다.
본 명세서에 기재된 임의의 조성물의 적합한 인간 용량은 예를 들어 I상 용량 상승 연구에서 추가로 평가될 수 있다. 예를 들어, 문헌[van Gurp et al. (2008) Am J Transplantation 8(8):1711-1718; Hanouska et al. (2007) Clin Cancer Res 13(2, part 1):523-531; 및 Hetherington et al. (2006) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10): 3499-3500]을 참조한다.
용어 "치료학적 유효량" 또는 "치료학적 유효 용량", 또는 본 명세서에 사용된 유사한 용어는 원하는 생물학적 또는 의학적 반응(예를 들어, 보체 관련 장애의 하나 이상의 증상의 개선)을 발생시키는 물질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물)의 양을 의미하도록 의도된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 용액은 상기 조성물 중 적어도 하나의 치료학적 유효량을 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 용액은 하나 이상의 조성물 및 1종 이상(예를 들어, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종, 10종 또는 11종 이상)의 추가적인 치료제를 함유하여서, 전체로서의 조성물이 치료학적으로 효과적이다. 예를 들어, 용액은 본 명세서에 기재된 항-C5 조성물 및 면역억제제를 함유할 수 있고, 조성물 및 물질은 각각 조합될 때 대상체에서 보체 관련 장애(예를 들어, 보체 관련 염증성 장애, 예컨대 COPD, 천식, 패혈증, 또는 RA)를 치료하거나 예방하기에 치료학적 유효 농도에 있다.
이러한 조성물의 독성 및 치료학적 효율은 세포 배양 또는 실험 동물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 보체 매개 장애의 동물 모델)에서 공지된 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치사인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해 이 절차를 이용할 수 있다. 독성과 치료학적 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이고, 이것은 LD50/ED50 비율로 표시될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 본 명세서에 기재된 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 조성물이 사용될 수 있는 반면, 이환된 조직의 부위에 이러한 화합물을 표적화하는 전달 시스템을 설계하고, 정상 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하여서 부작용을 줄이도록 주의를 기울여야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투약량의 범위를 제제화하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물의 투약량은 일반적으로 아주 적은 독성 또는 무독성으로 ED50을 포함하는 조성물의 순환 농도의 범위 내에 있다. 투약량은 사용된 제형 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에 변할 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물의 경우, 치료학적 유효 용량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 예상될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 결정되는 바대로 IC50(즉, 증상의 최대 저해의 절반을 성취하는 항체의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 성취하기 위해 동물 모델에서 제제화될 수 있다. 인간에서의 유용한 용량을 더 정확하게 결정하기 위해 이러한 정보를 이용할 수 있다. 혈장에서의 수준은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, (예를 들어, 눈 또는 관절에 대한) 국소 투여가 바람직한 몇몇 실시형태에서, 국소 부위 내에 치료학적 유효 농도를 성취하기 위해 필요한 용량을 결정하기 위해 세포 배양 또는 동물 모델링을 이용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 보체 관련 장애에 대해 다른 치료제와 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 혈장교환, IVIG 치료, 또는 혈장 교환과 동시에, 이것 전에 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Appel et al. (2005) J Am Soc Nephrol 16:1392-1404]을 참조한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 신장 이식과 동시에, 이것 전에 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다.
"대상체"는, 본 명세서에 사용되는 바대로, 임의의 포유동물일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 인간, 비인간 영장류(예를 들어, 오랑우탄, 고릴라, 마카크, 개코원숭이, 또는 침팬치), 말, 소, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼, 기니아 피그, 게르빌루스쥐, 햄스터, 랫트 또는 마우스일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 유아(예를 들어, 인간 유아)이다.
본 명세서에 사용되는 바대로, "예방을 필요로 하는", "치료를 필요로 하는" 또는 "이를 필요로 하는" 대상체는 적절한 의학 실행자(예를 들어, 인간의 경우 의사, 간호사 또는 간호 실행자; 비인간 포유동물의 경우 수의사)의 판단에 의해 소정의 치료로부터 합당하게 이익을 받는 것이다.
용어 "예방하는"은 기술 인정되고, 병태와 관련하여 사용될 때 당해 분야에서 널리 이해되고, 본 명세서에 기재된 조성물을 받지 않는 대상체에 대비해 대상체에서의 의학 병태의 증상의 빈도를 감소시키거나, 이의 발생을 지연시키는 조성물의 투여를 포함한다. 따라서, 보체 관련 장애, 예컨대 천식의 예방은 예를 들어 비치료 대조군 집단에 대비해 예방학적 치료를 받는 환자의 집단에서 기침, 천명 또는 흉통의 정도 또는 빈도를 감소시키는 것 및/또는 예를 들어 통계적으로 및/또는 임상적으로 유의적인 양만큼 비치료 대조군 집단에 대비해 치료 집단에서 기침 또는 천명의 발생을 지연시키는 것을 포함한다.
상기 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 조성물(예를 들어, 항-C5 조성물)은 다양한 보체 관련 장애, 예컨대 류마티스 관절염(RA); 루프스 신염; 허혈-재관류 손상; 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS); 전형적 또는 감염성 용혈성 요독성 증후군(tHUS); 조밀침착병(DDD); 발작성 야간혈색소 뇨증(PNH); 다발성 경화증(MS); 황반변성(예를 들어, 연령 관련 황반변성(AMD)); 용혈, 간 효소 상승, 및 저혈소판(HELLP) 증후군; 패혈증; 피부근염; 당뇨병 망막병증; 혈전성 혈소판감소성 자반병(TTP); 자연 유산; 소수면역 혈관염; 수포성 표피박리증; 재발성 유산; 다발성 경화증(MS); 및 외상성 뇌 손상(이들로 제한되지는 않음)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Holers (2008) Immunological Reviews 223:300-316 및 Holers and Thurman (2004) Molecular Immunology 41:147-152]을 참조한다. 몇몇 실시형태에서, 보체 매개 장애는 보체 매개 혈관 장애, 예컨대 심혈관 장애, 심근염, 뇌혈관 장애, 말초(예를 들어, 근골격) 혈관 장애, 신혈관 장애, 장간막/장 혈관 장애, 이식기관에 대한 재혈관화 및/또는 재이식, 혈관염, 헤노흐-쇤라인 자색반 신장염, 전신 홍반성 낭창 관련 혈관염, 류마티스 관절염을 수반한 혈관염, 면역 복합 혈관염, 장기 또는 조직 이식, 타카야슈병, 모세관 누출 증후군, 확장성 심근병증, 당뇨병 혈관증, 흉강-복강 대동맥류, 가와사키병(혈관염), 정맥 가스 색전증(VGE), 및 스텐트 배치 후 재협착, 회전죽상반절제술 및 경피적 관상동맥 확장술(PTCA)(이들로 제한되지는 않음)이다. (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제20070172483호를 참조한다.) 몇몇 실시형태에서, 보체 관련 장애는 중증 근무력증, 한랭응집소 질환(cold-agglutinin disease: CAD), 발작성 한냉 혈색소뇨증(paroxysmal cold hemoglobinuria: PCH), 피부근염, 피부경화증, 온난 자가면역 용혈성 빈혈, 그레이브병, 하시모토 갑상선염, 1형 당뇨병, 건선, 천포창, 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia: AIHA), 특발성 혈소판감소성 자반병(idiopathic thrombocytopenic purpura: ITP), 굿파스쳐 증후군, 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome: APS), 데고스병 및 재해성 APS(catastrophic APS: CAPS)이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은, 단독으로 또는 제2 소염제와 조합되어, 염증성 장애, 예컨대 RA(상기), 염증성 장 질환, 패혈증(상기, 패혈성 쇼크, 급성 폐 손상, 파종성 혈관내 응고(disseminated intravascular coagulation: DIC) 또는 크론병(이들로 제한되지는 않음)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제2 소염제는 NSAID, 코티코스테로이드, 메토트렉세이트, 하이드록시클로로퀸, 항-TNF 물질, 예컨대 에타네르셉트 및 인플릭시맙, B 세포 고갈제, 예컨대 리툭시맙, 인터류킨-1 길항제, 또는 T 세포 동시자극 차단제, 예컨대 아바타셉트로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 보체 관련 장애는 보체 관련 신경학적 장애, 예컨대 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 뇌 손상, 알츠하이머병 및 만성 염증성 탈수초성 신경병증(이들로 제한되지는 않음)이다.
보체 관련 장애는 또한 보체 관련 폐 장애, 예컨대 천식, 기관지염, 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease: COPD), 간질성 폐 질환, α-1 항-트립신 결핍증, 폐기종, 기관지확장증, 폐색성 모세기관지염, 폐포염, 유육종증, 폐 섬유증, 및 콜라겐 혈관 장애(이들로 제한되지는 않음)를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 대상체에서 보체 관련 염증성 반응(예를 들어, 보체 관련 장애의 보체 관련 염증성 반응 양상)의 적어도 하나의 증상을 치료하거나 예방하거나 경감시키기 위해 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 조성물은 보체 관련 염증성 반응과 연관된 하나 이상의 증상, 예컨대 이식편 거부/이식편 대 숙주 질환(graft rejection/graft-versus-host disease: GVHD), 재관류 손상(예를 들어, 심폐 우회술 또는 조직 이식 후), 및 다른 형태의 외상성 손상, 예컨대 화상(예를 들어, 중증 화상), 둔상, 척수 손상 또는 동상 후 조직 손상을 치료하고/하거나 예방하고/하거나 경감시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Park et al. (1999) Anesth Analg 99(1):42-48; Tofukuji et al. (1998) J Thorac Cardiovasc Surg 116(6):1060-1068; Schmid et al. (1997) Shock 8(2):119-124; 및 Bless et al. (1999) Am J Physiol 276(1):L57-L63]을 참조한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 단일치료로서 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 상기 기재된 바와 같이, 조성물은 또 다른 치료제, 예를 들어 보체 관련 장애 또는 보체 관련 염증성 반응에 대한 또 다른 치료제와 조합 치료로서 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 치료는 패혈증을 가지거나 이것이 발생할 위험에 처해있는 대상체에게 치료학적 이익을 제공하는 하나 이상의 추가적인 물질(예를 들어, 항응고제, 항고혈압제 또는 소염 약물(예를 들어, 스테로이드))을 대상체(예를 들어, 인간 환자)에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 조합 치료는 보체 관련 폐 장애, 예컨대 COPD 또는 천식을 가지거나 이것이 발별할 위험에 처해있는 대상체에게 치료학적 이익을 제공하는 하나 이상의 추가적인 물질(예를 들어, 항-IgE 항체, 항-IL-4 항체, 항-IL-5 항체, 또는 항히스타민제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물 및 하나 이상의 추가적인 활성제는 동시에 투여된다. 다른 실시형태에서, 조성물은 시간상 처음에 투여되고, 하나 이상의 추가적인 활성제는 시간상 두 번째로 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 활성제는 시간상 처음에 투여되고, 조성물은 시간상 두 번째로 투여된다.
본 명세서에 기재된 조성물은 이전에 투여되었거나 현재 투여되는 치료를 대체하거나 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물과의 반응 시, 하나 이상의 추가적인 활성제의 투여는 중지되거나 감소할 수 있고, 예를 들어 더 낮은 수준으로, 예를 들어 본 명세서에 기재된 항-C5 조성물의 투여 후 더 낮은 수준의 에쿨리주맙이 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이전의 치료의 투여가 유지될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물의 수준이 치료학적 효과를 제공하기에 충분한 수준에 도달할 때까지 이전의 치료제가 유지될 것이다. 2개의 치료제가 조합으로 투여될 수 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 장애(예를 들어, 패혈증, 중증 화상, RA, 루프스 신염, 굿파스쳐 증후군, 또는 천식)의 개선을 위해 대상체(예를 들어, 인간 환자)를 모니터링하는 것은 질환 매개변수의 변화, 예를 들어 소정의 장애의 하나 이상의 증상의 개선을 위해 대상체를 평가하는 것을 의미한다. 많은 상기 장애(예를 들어, 보체 관련 장애)의 증상은 의학의 분야에 널리 공지되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 투여 후 적어도 한(1) 시간, 예를 들어 적어도 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간 또는 48시간, 또는 적어도 1일, 2일, 4일, 10일, 13일, 20일 이상, 또는 적어도 1주, 2주, 4주, 10주, 13주, 20주 이상 평가를 수행한다. 대상체는 하기 기간 중 하나 이상에서 평가될 수 있다: 치료의 시작 전에; 치료 기간 동안; 또는 치료의 하나 이상의 요소가 투여된 후. 평가는 추가의 치료의 필요성을 평가하는 것, 예를 들어 투약량, 투여 빈도, 또는 치료 기간이 변경되어야하는지를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 이것은 선택된 치료학적 양상을 추가하거나 누락할 필요성, 예를 들어 본 명세서에 기재된 보체 관련 장애의 임의의 치료를 추가하는 것 또는 누락하는 것을 평가하는 것을 또한 포함할 수 있다.
본 개시내용을 읽을 시 당해 분야의 당업자에게 많은 변형 및 등가물이 명확하므로, 하기 실시예는 단지 예시적이고 본 개시내용의 범위를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 인용된다.
실시예
실시예 1. 에쿨리주맙의 반감기는 여러 청소율의 조합이다
처방된 투약 섭생을 받는 PNH 및 aHUS 환자에서의 에쿨리주맙의 평균 반감기는 대략 11-12일인 반면, IgG2/4 Fc를 가지는 인간화된 단일클론 항체에 대한 예상된 반감기는 IgG2 또는 IgG4 Fc를 함유하는 항체의 것과 유사한, 대략 21-28일인 것으로 예측되었다. Morell et al. (1970) J Clin Invest 49(4):673-680. 에쿨리주맙의 전체 청소율에 대한 항원 매개 청소율의 잠재적 영향을 이해하기 위해, 인간 신생아 Fc 수용체(hFcRn) 마우스 모델을 이용하여 하기 실험을 수행하였다(마우스는 내인성 FcRn이 결여되지만 hFcRn에 대해 형질전환이다(B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ; 재고 번호 014565, Jackson Laboratories(메인주 바 하버))). 형질전환 FcRn 모델은 예를 들어 문헌[Petkova et al. (2006) Int Immunology 18(12):1759-1769; Oiao et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(27):9337-9342; 및 Roopenian et al. (2010) Methods Mol Biol 602:93-104]에 기재되어 있다.
200㎕의 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 100㎍의 에쿨리주맙의 단일 용량을 각각 5마리의 hFcRn 형질전환 마우스에 정맥내(i.v.) 주사에 의해 투여하였다. 대략 100㎕의 혈액 샘플을 투여 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일에 각각의 마우스로부터 수집하였다. 혈청 중의 에쿨리주맙의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 간단히 말하면, 검정 플레이트를 양 항-인간 Igλ 경쇄 포획 항체에 의해 코팅하고 차단하였다. 이후, 플레이트의 웰을 에쿨리주맙이, 혈청 중에 존재하는 경우, 포획 항체에 결합하게 하는 조건 하에 혈청 샘플과 접촉시켰다. 각각의 웰에 결합된 에쿨리주맙의 상대 양을 탈착 가능하게 표지된 항-인간 IgG4 항체를 사용하여 검출하고, 에쿨리주맙의 공지된 분량을 함유하는 나이브 마우스 혈청으로부터 생성된 표준 곡선에 대해 정량화하였다.
하기 화학식을 이용하여 항체 혈청 반감기를 계산하였다:
Figure 112021046604377-pat00006
식 중, T는 경과 시간이고, Ao는 항체의 원래 혈청 농도(본 연구에서 1일에서의 농도)이고, At는 경과 시간(T) 후 남은 항체의 양(본 연구에서 최소 검출 가능한 농도 또는 마지막 출혈 시점(35일))이다.
실험의 결과가 도 1에 도시되어 있다. hFcRn 마우스 모델에서의 에쿨리주맙의 반감기는 13.49±0.93일이다.
hFcRn 모델을 이용하여 에쿨리주맙의 반감기에 대한 인간 C5의 효과를 결정하기 위해, 항체를 투약 전에 인간 C5(Complement Technology Inc., 카탈로그 A120호)의 4:1 몰 비로 예비 혼합하였다. 100㎍의 용량의 에쿨리주맙을 0일에 정맥내(i.v.) 투여하였다. 대략 100㎕의 혈액을 1일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일에 후안와 출혈을 통해 혈청에 대한 1.5㎖의 에펜도르프 관으로 수집하였다.
도 1에 도시된 바대로, C5의 존재 하의 hFcRn 마우스 모델에서의 에쿨리주맙의 반감기는 4.55±1.02일이다. 이 결과는, 긴 반감기가 FcRn 매개 재순환에 의해 주로 지배되는 내포작용 매개 항체 청소 기전 이외에, 에쿨리주맙의 반감기가 인간 C5를 통해 항원 매개 청소에 의해 상당히 영향을 받을 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 2. 에쿨리주맙의 Fc 도메인에서의 아미노산 치환은 에쿨리주맙의 반감기를 증가시키지만, 에쿨리주맙 청소에 대한 C5의 효과를 극복하기에 충분하지 않다
IgG 항체의 Fc 영역에서의 소정의 아미노산 치환은 순환으로부터 항체의 제거율을 줄이는 것으로 나타났다. pH 6.0에서 FcRn에 대한 IgG 항체의 결합 친화도를 증가시키는 치환은 이러한 생물학적 효과의 예이다. 예를 들어, 문헌[Dall'Acqua et al. (2006) J Immunol 117:1129-1138 및 Ghetie et al. (1997) Nat Biotech 15: 637-640]을 참조한다. 잘레브스키(Zalevsky) 등[(2010) Nat Biotech 28:157-159]은 다수의 아미노산 치환, 예를 들어 혈청에서 IgG 항체의 반감기를 증가시킬 수 있는 M428L/N434S를 기술한다. 다른 반감기 연장 아미노산 치환은 예를 들어 T250Q/M428L 및 M252Y/S254T/T256E를 포함한다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO 제2008/048545호 및 문헌[Dall'Acqua et al. (2006) J Biol Chem 281:23514-23524]을 참조한다. 에쿨리주맙의 Fc 불변 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환이 혈청에서의 에쿨리주맙의 반감기를 연장할 수 있는지를 결정하기 위해, 하기 치환: EU 넘버링 지수에 기초하여 M252Y/S254T/T256E(이하 에쿨리주맙의 이 변이체는 YTE 변이체라 칭함)를 에쿨리주맙으로 도입하였다. 중쇄 불변 영역은 하기 아미노산 서열로 이루어진다:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGMEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열 번호 15). 에쿨리주맙의 YTE 변이체의 전장 중쇄 폴리펩타이드에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 16에 기재되어 있다.
YTE 변이체를 실시예 1에 기재된 hFcRn 마우스 모델에서 에쿨리주맙과 함께 평가하였다. 즉, 100㎍의 에쿨리주맙(IgG2/4 Fc 영역), 200㎕의 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 에쿨리주맙의 Fc 또는 YTE 변이체를 함유하는 에쿨리주맙의 변이체를 각각 8마리의 hFcRn 형질전환 마우스에 정맥내(i.v.) 주사에 의해 투여하였다. 혈청을 투여 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일에 각각의 마우스로부터 수집하였다. 혈청에서의 각각의 항체의 농도를 ELISA 및 실시예 1에 기재된 바대로 계산된 반감기에 의해 측정하였다. 결과가 도 2 및 표 2에 기재되어 있다.
Figure 112021046604377-pat00007
도 2 및 표 2에 도시된 바대로, YTE 치환은 에쿨리주맙의 평균 반감기를 14.28±1일로부터 29.07±4.7일로 2배 초과로 증가시켰다.
에쿨리주맙의 YTE 변이체의 반감기에 대한 인간 C5의 효과를 결정하기 위해, 마우스에 실시예 1에서 상기 기재된 바와 같은 인간 C5를 투여하였다. 100㎍의 용량의 에쿨리주맙, 에쿨리주맙-IgG2 변이체 또는 에쿨리주맙-IgG2 YTE 변이체를 0일에 정맥내 투여하였다. 도 3 및 표 3에 기재된 바대로, 에쿨리주맙, 에쿨리주맙-IgG2 변이체 및 에쿨리주맙-IgG2 YTE 변이체의 반감기는 몰 초과의 인간 C5의 존재 하에 상당히 감소하였다. 따라서, 에쿨리주맙의 FcRn 결합 도메인에서의 아미노산 치환은 에쿨리주맙의 반감기에 대한 C5 매개 청소의 기여를 극복하기에 충분하지 않았다.
Figure 112021046604377-pat00008
실시예 3. 반감기에 대한 에쿨리주맙의 CDR에서의 아미노산 치환의 효과
상기 기재된 바와 같이, 마우스에서의 에쿨리주맙의 반감기는 이의 항원, 인간 C5(hC5)의 존재 하에 상당히 더 짧다. 어떤 특정한 또는 작용 기전에 구속되지 않으면서, 항원의 존재 하의 가속 청소는 부분적으로 음세포작용 후 초기 엔도솜 구획에서 항체:C5 복합체의 효과적인 해리를 허용하지 않는 C5에 대한 에쿨리주맙의 매우 높은 친화도(pH 7.4에서 약 30pM 및 pH 6.0에서 약 600pM의 KD)의 결과인 것으로 가정된다. 해리 없이, 항체:항원 복합체는 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통해 세포외 구획으로 재순환되거나 리소좀 분해에 표적화된다. 어느 경우에도, 항체는 이의 수명에서 2개의 C5 분자보다 더 결합할 수 없다.
C5에 대한 에쿨리주맙의 강한 친화도(KD 약 30pM)는 혈액에서의 모든 C5의 거의 완전한 결합을 허용하여서, 매우 적은 C5가 활성화되어 C5a 및 TCC를 형성하도록 보장한다. C5에 대한 에쿨리주맙의 친화도는 따라서 항체에 의해 치료된 환자에서의 항체의 생체내 효율과 직접적으로 연결된다. 본 발명자들은 생체내 에쿨리주맙의 효율을 손상시키지 않으면서 C5에 대한 에쿨리주맙의 친화도를 약하게 하도록 착수하였다. 본 개시내용이 이러한 접근법에 제한되지 않지만, 이것은 히스티딘을 에쿨리주맙의 CDR에서 하나 이상의 위치로 도입함으로써 달성되었다. 히스티딘은 6.04의 pKa를 가진다. 이것은 pH 값이 7.4(혈액)로부터 6.0 미만(초기 엔도솜)으로 하강하면서, 히스티딘이 양성자를 획득한다는 것을 의미한다. 따라서, 엔도솜에서, 히스티딘은 더 양으로 하전된다. 본 발명자들은 에쿨리주맙에서 C5에 대한 결합 부위에서 또는 그 근처에서 히스티딘을 도입하는 것을 가정하였고, 엔도솜에서의 전하 이동은 혈액 중에 중성 pH에서 C5에 대한 높은 친화도를 보전하면서 엔도솜에서의 결합을 파괴할 수 있다. 이러한 치환은, 엔도솜의 산성 환경에서 항체:C5 복합체로부터 항체의 해리를 수월하게 하여, C5가 리소좀에서 분해되는 반면 유리 항체가 재순환되게 함으로써, 반감기를 증가시키도록 가정된다.
모 항체로서 에쿨리주맙을 사용하여, 매 CDR 위치가 히스티딘에 의해 치환된 일련의 변이체 항체를 생성하였다. 에쿨리주맙의 중쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열을 가진다: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFSNYWIQWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTEYTENFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARYFFGSSPNWYFDVWGQGTLVTVSS(서열 번호 7). (중쇄 가변 영역의 CDR 영역은 밑줄표시된다.) 에쿨리주맙의 경쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열을 가진다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNVLNTPLTFGQGTKVEIK(서열 번호 8).
이 히스티딘 스캐닝 노력의 결과는 에쿨리주맙의 66개의 단일 히스티딘 치환 변이체이다. 이 항체 변이체에 대한 경쇄 및 중쇄 코딩 서열을 확인된 포유동물 세포 및 서열에서 발현에 적합한 별개의 "단일 유전자 작제물" 플라스미드로 클로닝하였다. 단일 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 단일 유전자 작제물의 동시형질감염에 의해 단일 아미노산 치환을 함유하는 항체를 HEK293F 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 비변형 에쿨리주맙 CDR 서열을 대표하는 "야생형" 중쇄 및 경쇄의 동시형질감염을 또한 수행하였다(EHL000). 조직 배양 상청액을 항체 발현 수준에 정규화하고 사용하여 옥테트 레드 장치(Octet Red instrument)(ForteBio Inc.)에서 바이오층 간섭법(biolayer interferometry)을 이용하여, EHL000에 대비된, 인간 C5에 대한 항체 결합을 평가하였다.　 간단히 말하면, 항체를 항-인간 IgG Fc 바이오센서(ForteBio, 카탈로그 18-5001호)에서 포획하였다. 이후, 로딩된 선단(tip)을 800초 동안 12.5nM의 네이티브 정제된 인간 C5를 함유하는 pH 7.4 완충 용액에 노출시켜 모 항체에 대한 결합의 동역학을 평가하였다. 선단을 800초 동안 pH 7.4 완충 용액 또는 pH 6.0 완충 용액으로 옮겨서 해리 동역학을 평가하였다. 모든 측정을 반복하여 판독의 일관성을 보장하였다.
에쿨리주맙에 대비된 일련의 3개 특성에 기초하여 에쿨리주맙의 단일 히스티딘 치환 변이체를 선택하였다. 바람직한 히스티딘 변이체는 pH 7.4에서 에쿨리주맙의 ka 및 kd로부터 적은 정도로만 다르지만, pH 6.0 초과에서 에쿨리주맙의 kd로부터 상당히 다르다. 상대 한계치 선택 기준은 하기와 같다:
(1) 에쿨리주맙에 대해 관찰된 800초에서의 평균 피크 상 이동과 비교하여 800초에서의 33% 더 작은 피크 상 이동의 pH 7.4에서의 결합 동역학에 대한 최대 변경;
(2) 에쿨리주맙에 대해 관찰된 800초에서의 평균 피크 상 이동과 비교하여 800초에서의 3배 이하의 피크 상 이동 감소의 pH 7.4에서의 해리 동역학에 대한 최대 변경; 및
(3) 에쿨리주맙에 대해 관찰된 800초에서의 평균 피크 상 이동과 비교하여 800초에 걸쳐 적어도 3배의 피크 상 이동 감소의 pH 6.0에서의 해리 동력학에 대한 최대 변경.
예를 들어, 상기 기준 (1)과 관련하여, 에쿨리주맙과의 결합의 800초 후의 평균 피크 상 이동이 대략 0.75㎚인 경우, 0.5㎚ 미만(예를 들어, 2회 이상 재현)의 상 이동을 가지는 시험 항체는 상기 기준을 충족시키지 않을 것이다. 반대로, 800초에서 0.5㎚ 초과의 피크 상 이동을 가지는 시험 항체는 제1 기준을 충족시킨다.
이 한계치를 충족시키는 경쇄 가변 영역에서의 단일 치환은 (모두 서열 번호 8에 대해) G31H, L33H, V91H 및 T94H이다. 이 한계치를 충족시키는 중쇄 가변 영역에서의 단일 치환은 (모두 서열 번호 7에 대해) Y27H, I34H, L52H 및 S57H이다. 도 5a, 도 5b, 도 5c 및 도 5d를 참조한다.
단일 치환이 한계치 기준을 충족시킨 위치에서 2개의 히스티딘 치환의 모든 가능한 조합을 함유하는 제2 일련의 항체를 생성하였다. 표 1을 참조한다. 이 결합 및 해리 동역학을 동일한 방법을 통해 분석하고, 원래 모 항체 및 단일 히스티딘 치환 둘 다와 비교하였다. 마찬가지로, 각각 3개 또는 4개의 히스티딘 치환을 함유하는 제3 및 제4 일련의 항체를 생성하고, 결합 및 해리 동역학을 분석하여 관련 2개 또는 3개의 히스티딘 치환 선행자와 비교하였다. 표 1을 참조한다. 각각의 단계에서, pH 7.4에서의 결합 동역학에 대한 최소 한계치, pH 7.4에서의 해리 동역학에 대한 최대 한계치 및 pH 6에서의 해리 동역학에 대한 최소 한계치에 동일한 기준을 이용하였다. 8개의 치환 조합은 상기 기준을 충족하였고 SPR을 통한 pH 7.4 및 pH 6.0에서의 친화도 결정에 선택되었다. 친화도는 표 4에 기재되어 있다.
Figure 112021046604377-pat00009
치환의 이 조합의 경우, C5에 대한 에쿨리주맙의 친화도는 pH 6.0에서 1000배 초과로 감소하는 반면, 친화도는 pH 7.0에서 친화도의 20배 이하의 감소를 겪었다. 이것으로부터, pH 7.4에서의 이의 높은 친화도(0.146nM) 및 8,000 초과의 (pH 6.0에서의 KD)/(pH 7.4에서의 KD)의 비율로 인해 EHG303(표 4)이 추가로 분석에 선택되었다. EHG303 항체의 중쇄 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112021046604377-pat00010
EHG303 항체의 경쇄 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112021046604377-pat00011
상기 서열에서, 밑줄표시된 부분은 각각의 폴리펩타이드의 리더 서열에 상응하고, 이탤릭표기된 부분은 클로닝에 의해 도입된 비상동성 아미노산이다.
EHL049 항체를 또한 선택하였다. 이의 중쇄 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112021046604377-pat00012
EHL049 항체의 경쇄 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112021046604377-pat00013
상기 서열에서, 밑줄표시된 부분은 각각의 폴리펩타이드의 리더 서열에 상응하고, 이탤릭표기된 부분은 클로닝에 의해 도입된 비상동성 아미노산이다.
마지막으로, EHL000 중쇄 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112021046604377-pat00014
EHL000 항체의 경쇄 폴리펩타이드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112021046604377-pat00015
상기 서열에서, 밑줄표시된 부분은 각각의 폴리펩타이드의 리더 서열에 상응하고, 이탤릭표기된 부분은 클로닝에 의해 도입된 비상동성 아미노산이다.
실시예 4. 히스티딘 치환은 혈청에서의 에쿨리주맙의 반감기를 연장시킨다
상기 각각의 EHL 및 EHG 항체의 경쇄 폴리펩타이드 및 중쇄 폴리펩타이드를 단일 유전자 작제물로부터 발현시켰다. EHG303으로부터의 중쇄 및 경쇄 코딩 서열을, EHL049 항체에 대한 경쇄 및 중쇄 서열처럼 이중 유전자 발현 벡터로 조합하였다. 생성된 EHG303 클론을 BNJ421이라 지칭하고, 생성된 EHL049 클론을 BNJ423이라 지칭하였다. BNJ421의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG H IFSNYWIQWVRQAPGQGLEWMGEILPGSG H TEYTENFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARYFFGSSPNWYFDVWGQGTLVTVSS(서열 번호 12). BNJ421에 대한 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNVLNTPLTFGQGTKVEIK(서열 번호 8).
BNJ423 항체의 중쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열을 포함한다: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG H IFSNYWIQWVRQAPGQGLEWMGEILPGSG H TEYTENFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARYFFGSSPNWYFDVWGQGTLVTVSS(서열 번호 12). BNJ423에 대한 경쇄 아미노산 서열은 하기와 같다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYHALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNVLNTPLTFGQGTKVEIK(서열 번호 18).
이 2개의 분자를 면역결핍(NOD/scid) 및 C5 결핍 마우스에서의 EHL000과 함께 평가하였다. 200㎕의 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 100㎍의 EHL000, BNJ421 또는 BNJ423의 단일 용량을 각각 8마리의 마우스에 정맥내(i.v.) 주사에 의해 투여하였다. 혈청을 투여 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일에 각각의 마우스로부터 수집하였다. 혈청 중의 각각의 항체의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 비구획 분석(non-compartmental analysis: NCA) 및 직접적인 반응 Emax를 사용함으로써 파르사이트 휘닉스(Pharsight Phoenix)(등록상표) 윈논린(WinNonlin)(등록상표) 버전 6.3 소프트웨어를 사용하여 항체 혈청 반감기를 계산하였다. 혈청 중에 남은 항체의 백분율을 하기와 같이 계산하였다:
Figure 112021046604377-pat00016
식 중, Ct는 소정의 일자에서의 항체 농도이고; C1은 1일에서의 항체 농도이다.
결과가 도 6 및 표 5에 기재되어 있다.
Figure 112021046604377-pat00017
동일한 마우스 모델을 이용하여 이 항체의 반감기에 대한 인간 C5의 효과를 결정하기 위해, 마우스에 -1일(항체가 마우스에 투여되기 전날)에 250㎍의 로딩 용량, 이어서 50㎍의 C5의 1일 2회 용량으로 인간 C5를 피하로 투여하여 혈청 C5 농도를 (실시예 1에 기재된 바대로) 대략 20㎍/㎖로 유지시켰다.
도 7(및 하기 표 6)에 기재된 바대로, 인간 (hC5)의 존재 하에 (C5 대 에쿨리주맙의 1:1 초과의 몰 비인 농도에서) 마우스 모델에서의 EHL000(에쿨리주맙-IgG1)의 반감기가 2.49±0.34일인 반면, (히스티딘 치환을 함유하는) BNJ421 및 BNJ423 항체의 반감기는 각각 15.25±0.90일 및 22.71±0.71일에서 실질적으로 더 컸다. 이 결과는 에쿨리주맙의 CDR에서의 히스티딘 치환 및 C5에 대한 생성된 pH 의존적 친화도가 에쿨리주맙에 대비해 혈청으로부터의 에쿨리주맙 변이체의 청소율을 상당히 감소시킨다는 것을 나타낸다.
Figure 112021046604377-pat00018
실시예 5. 히스티딘 치환된 쿨리주맙 변이체는 보체 저해 활성을 소실하지 않는다
또한, 실시예 4에 기재된 실험으로부터의 인간 C5를 함유하는 각각의 샘플에서의 혈청 용혈성 활성을 또한 평가하였다. 닭 적혈구를 용해시키는 능력을 평가함으로써 마우스 혈청에서의 말단 보체 활성을 결정하였다. 사용된 마우스가 C5 결핍이므로, 용혈성 활성은 샘플에서 인간 C5의 활성을 직접적으로 반영한다. 간단히 말하면, 0.1% 젤라틴, 141mM NaCl, 0.5mM MgCl2, 0.15mM CaCl2 및 1.8mM 나트륨 바르비탈을 함유하는 젤라틴 베로날 완충 식염수(Gelatin Veronal-Buffered Saline: GVBS)(콤프텍(Comptech) 카탈로그 B100호) 중의 50, 3 및 0㎍/㎖에서의 항체를 각각 저, 중 및 100% 용해 대조군으로서 사용하였다. GVBS 중에 쥣과 시험 혈청을 1:10 희석함으로써 실험 샘플을 준비하였다. 대조군 웰에서 GVBS 중의 동일 용적의 20% 마우스 C5 결핍 혈청 및 20% 인간 혈청(바이오레클라메이션(Bioreclamation), 카탈로그 HMSRM-COMP+호) 및 시험 샘플 웰에서 GVBS 중의 동일 용적의 20% 마우스 C5 결핍 혈청 및 20% 인간 C5 고갈 혈청(컴플리먼트 테크놀로지스(Complement Technologies), 카탈로그 A320호)을 함유하는 96웰 플레이트(Corning(매사추세츠주 턱스베리), MA 카탈로그 3799호)의 상응하는 3중 웰에 샘플 분취량(50㎕)을 분배하였다. EDTA(500mM에서의 2㎕, 시그마(Sigma), 카탈로그 E-9884호)를 대조군 및 샘플 둘 다의 제3 웰에 3중 첨가하여 "용혈 무" 혈청 색상 대조군을 생성하였다. 닭 적혈구를 GVBS 중에 세척하고, 감작화시켜 4℃에서 15분 동안 항-닭 RBC 다중클론 항체(인터셀 테크놀로지스(Intercell Technologies); 0.1% v/v)와의 항온처리에 의해 보체 전통적인 경로를 활성화시키고, 다시 세척하고, 약 7.5x107개의 세포/㎖의 최종 농도에서 GVBS 중에 재현탁시켰다. 감작화 닭 적혈구(약 2.5x106개의 세포)를 대조군 및 샘플을 함유하는 플레이트에 첨가하고, 플레이트 진탕기에서 간단히 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 시약을 다시 혼합하고, 845x g에서 3분 동안 원심분리하고, 85㎕의 상청액을 96웰 넓적 바닥 미량적정 플레이트(Nunc(뉴욕주 페니필드), 카탈로그 439454호)의 웰로 옮겼다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 흡광도를 415㎚에서 측정하고, 하기 화학식을 이용하여 용혈의 백분율을 결정하였다:
Figure 112021046604377-pat00019
식 중, OD는 광학 밀도이다.
도 8에 도시된 바대로, 에쿨리주맙에 대비된 pH 7.4에서의 약간의 친화도 감소에도 불구하고, BNJ421 및 BNJ423 둘 다는 여전히 순환 시 존재하는 거의 모든 인간 C5에 결합하고 용혈을 저해할 수 있다. 이 결과는 생체내 항체의 효율을 손상시키고 항체에 증가 혈청 반감기를 부여하지 않으면서 C5에 대한 에쿨리주맙의 친화도가 약해질 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 6. C5에 대한 pH 의존적 결합 및 증대된 FcRn 매개 재순환은 에쿨리주맙 변이체의 혈청 반감기에 가산적이다
상기 기재된 바대로, 인간 C5의 존재 하에, 히스티딘 치환된 에쿨리주맙 변이체의 반감기는 형질전환 마우스에서 상당히 연장되었다. 구성적 C5 합성 및 인간 FcRn의 존재 하의 항-C5 항체의 약동학(PK) 및 약물학(PD)에 대한 C5 및 FcRn에 대한 pH 의존적 결합의 가능한 가산 효과를 평가하기 위해, 인간 FcRn을 발현하는 형질전환 마우스에서 인간 불변 영역을 가지는 항-마우스 C5 항체를 사용하여 일련의 PK/PD 실험을 수행하였다. 이 쥣과 항-C5 항체를 에쿨리주맙에 대한 약리학적 대용물로서 작용하는 쥣과 항체인 BB5.1의 가변 영역으로부터 조작하였다(이것이 마우스 C5에 결합하고 활성 대사 단편 C5a 및 C5b로의 이의 절단을 방해하므로)[De Vries et al. (2003) Transplantation 3:375-382]. BB5.1 쥣과 가변 영역 및 인간 Igκ 및 인간 IgG2/G4 불변 영역의 친화도 최적화된 변이체에 의해 고친화도 항-마우스 C5 항체(BHL011이라 칭함)를 조작하였다. 3개의 히스티딘 치환을 쥣과 가변 영역(이 변이체를 BHL006이라 칭함)으로 혼입함으로써 BHL011의 pH 의존적 변이체를 조작하였다. hFcRn에 대한 친화도를 증가시키기 위해 2개의 아미노산 치환을 인간 불변 영역 중쇄(M428L, N434S)로 혼입함으로써 제3 항체를 조작하였다(이 변이체를 BHL009라 칭함).
BHL006의 경쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112021046604377-pat00020
BHL006 항체의 중쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112021046604377-pat00021
BHL009의 경쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112021046604377-pat00022
BHL009의 중쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112021046604377-pat00023
BHL011의 경쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112021046604377-pat00024
BHL011의 중쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112021046604377-pat00025
항-Fc 인간 포획 방법을 이용하여 비아코어 3000 장치에서 SPR을 통해 정제된 마우스에 대한 BHL011, BHL006 및 BHL009 결합의 동역학을 결정하였다. 간단히 말하면, 10mM 아세트산나트륨(pH 5.0) 중에 0.1㎎/㎖로 희석된 항-인간 Fc(KPL, 카탈로그 01-10-20호)를 아민 커플링에 의해 8분 동안 CM5 칩의 2개의 유세포에 부동화하였다. 항체를 실행 완충제(HBS-EP; 0.01M HEPES(pH 7.4), 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20; 지이 라이프 사이언시스(GE Life Sciences), 카탈로그 BR1001-88호) 중에 0.25㎍/㎖로 희석하였다. 이후, 희석된 항체를 하나의 유세포에 주입한 후, 세포 둘 다에 6nM 마우스 C5를 주입하였다. 제2 유세포를 기준 표면으로서 사용하였다. pH 7.4 및 pH 6.0에서 결합을 평가하였다. 20mM HCl, 0.01% P20에 의해 매회 표면을 재생하였다. '이중 리퍼런싱(referencing)'에 의해 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 4.1 소프트웨어를 이용하여 1:1 랭귀어(Langmuir) 모델에 의해 데이터를 처리하였다. pH 6.0에서 마우스 C5에 복합체화된 BHL011, BHL006 및 BHL009의 해리를 6nM 마우스 C5(pH 7.4)의 주사, 이어서 HBS-EP 완충제(pH 6.0)의 주사에 의해 유사하게 평가하였다. 이 실험의 결과가 표 7에 기재되어 있다.
Figure 112021046604377-pat00026
구성적 C5 합성의 존재 하의 항-C5 항체의 약동학(PK)에 대한 C5에 대한 pH 의존적 결합의 효과 및 반감기의 가산 증가를 부여하는 증대된 FcRn 재순환에 대한 가능성을 결정하기 위해, 실시예 1에 기재된 형질전환 FcRn 마우스 모델을 이용하여 BHL011, BHL006 및 BHL009의 전체 혈청 농도를 분석하였다. 1일 농도의 백분율로서의 전체 항체 혈청 농도 및 혈청 농도가 도 9-11에 도시되어 있다. 수컷 마우스는 실선으로 표시되어 있고, 암컷은 점선으로 표시되어 있다. 1일에서의 전체 항체 혈청 농도는 몸무게 및 분포 용적의 차이에 비례하여 수컷보다는 암컷에 더 높았다. 이 성별 변화는, 가능하게는 C5 매개 청소로부터 생긴 용량 의존적 비선형성으로 인해, BHL011 약동학에 대해 동물간 변산도에 기여하였다(도 9a 및 도 9b). 일반적으로, 동물간 변산도는 가속 청소를 나타낸 BHL006 용량 코호트(2939)에서의 1마리의 암컷을 제외하고 BHL006(도 10a 및 10B) 및 BHL009(도 11a 및 도 11b)에 대해 낮았다. 동물 2939에서의 가속 청소율에 대한 이유는 공지되어 있지 않다.
C5 및 hFcRn의 구성적 합성의 존재 하에, 고친화도 IgG2/4 항-C5 항체(BHL011)는 6일의 평균 말단 반감기를 가지고, 21일에 약 98%로 순환으로부터 청소되었다(도 12 및 도 13; 표 8). IgG2/4 Fc 영역을 가지는 pH 의존적 항-C5 항체(BHL006)에 대한 평균 청소율은 16 내지 19일의 평균 베타-상 반감기로 약화되었다. 추가적인 약 2배의 반감기 증가가 hFcRn에 대한 개선된 친화도(BHL009 반감기 약 36일)로 IgG2/4 Fc 영역을 가지는 pH 의존적 항-C5 항체에 대해 관찰되었다. 이 매개변수는 hFcRn 마우스에서 항원의 부재 하에 M428L, N434S 치환을 가지고 갖지 않는 IgG2/4 항체에 대해 관찰된 것과 일치하였다. 이 결과는 pH 의존적 C5 결합 및 FcRn에 대한 증가한 친화도가 항-C5 항체의 PK 노출을 연장시키는 가산 효과를 부여한다는 것을 나타낸다.
Figure 112021046604377-pat00027
인간 FcRn 형질전환 마우스에서의 항-마우스 C5 항체의 약물학
보체 전통적인 경로 매개 닭 적혈구(닭 적혈구; cRBC) 용혈 검정에서 혈청 샘플에서의 항-마우스 C5 항체의 약리학적 활성을 생체외 평가하였다. 용혈성 활성은 투약 전 샘플에서의 활성의 백분율로서 계산되고 도 14-16에 도시되어 있디. 수컷은 실선으로 표시되고, 암컷은 점선으로 표시된다. 생체외 용혈성 활성의 길항작용은 샘플에서의 전체 항체의 농도에 비례한다. BHL011 PK(도 9)에 대한 몸무게 의존적 동물간 생존능력에 상응하는 BHL011(도 14)에 대해 용혈성 활성의 길항작용의 기간에서의 성별 차이가 뚜렷하였다. 일반적으로, 가속 항체 청소(도 10)를 나타낸 BHL006 용량 코호트(2939)에서의 암컷을 제외하고 BHL006(도 15) 및 BHL 009(도 16)에 대해 동물간 생존능력이 낮았다.
전체 항체 혈청 농도와 생체외 용혈성 활성의 길항작용 사이의 상호작용의 차이는 C5에 대한 항체의 친화도에 비례한다. 고친화도 항체(BHL011)는 약 200㎍/㎖로 용혈성 활성을 거의 완전히 억제하는 반면(도 17), 더 약한 친화도의 pH 의존적 항-C5 항체는 생체외 완전 길항작용을 달성하기 위해 2배 내지 3배 더 높은 농도를 필요로 한다(도 18 및 도 19).
pH 의존적 항-C5 항체에서의 이의 효력 소실에도 불구하고, 각각의 코호트로부터의 동물에 걸친 cRBC 용혈에 대한 평균 활성 수준은 이들이 연장된 투약 간격을 지지할 수 있다는 것을 제안한다. 14일에, 고친화도 항-C5(BHL011) 치료 동물은 40% 초과의 평균 용혈성 활성 수준을 가지는 반면, pH 의존적 항-C5(BHL006 및 BHL009) 치료 동물은 각각 21일 및 28일에 걸쳐 40% 미만의 평균 용혈성 활성 수준을 유지시켰다(도 20).
고친화도 항-마우스 C5 항체(BHL011)에 대비해 마우스 C5(BHL006 및 BHL009)에 대한 유의적인 반감기 연장 및 pH 의존적 결합에 의한 항체의 길항작용의 상응하는 기간은 실시예 4 및 실시예 7에 기재된 연구와 일치하고, 여기서 pH 의존적 항-인간 C5 항체(BNJ421, BNJ423 또는 BNJ441)는 인간 C5가 동시투여된 마우스에서 고친화도 대응물(EHL000 또는 에쿨리주맙)에 대비해 유사한 증가 반감기를 나타냈다. 이 발견은 CDR에서의 선택 히스티딘 치환을 통한 엔지니어링 pH 의존적 항원 결합이 C5를 통한 항원 매개 청소를 상당히 약화시킬 수 있어서, 유리 항체가 순환으로 다시 재순환되게 한다는 생각을 추가로 입증한다. 게다가, BHL009에서의 pH 의존적 항원 결합 및 FcRn에 대한 증대된 친화도의 조합은 PK 특성에 대한 효과에서 가산적이고, pH 의존적 결합 단독(BHL006)에 비해 반감기를 배가시킨다. 이 관찰은 C5에 대한 pH 의존적 결합이 FcRn에 대한 개선된 친화도와 조합되어 에쿨리주맙에 대해 관찰된 PK 매개변수 및 치료학적 PD의 기간의 상당한 연장을 제공할 수 있어서, 매달 이상의 투약이 가능하게 한다는 가설과 일치한다.
실시예 7. C5에 대한 pH 의존적 결합 및 증대된 FcRn 매개 재순환을 가지는 변이체 에쿨리주맙의 생성
모 분자로서 에쿨리주맙을 사용하여 항체를 생성하였다. 에쿨리주맙에 대비해, 변이체 항체(BNJ441이라 칭함)는 중쇄에서 Tyr-27-His, Ser-57-His, Met-429-Leu 및 Asn-435-Ser의 4개 아미노산 치환을 함유한다(BNJ441의 429번 및 435번 위치가 EU 넘버링 시스템 하에 428번 및 434번 위치에 상응한다는 것에 주목한다). 중쇄 폴리펩타이드에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 14에 기재되어 있다. 경쇄 폴리펩타이드에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 11에 기재되어 있다. (1) 표적 매개 항체 청소를 통한 항체 청소의 감소 및 (2) FcRn 매개 항체 재순환의 효율의 증가의 2개의 명확한 기전을 통해 순환 반감기를 증가시킴으로써 BNJ441(비고, 에쿨리주맙)에 의해 연장된 투약 간격이 가능하게 하도록 이 돌연변이를 조작하였다.
중쇄 가변 영역의 제1 및 제2 상보성 결정 영역(CDR)에서의 2개의 아미노산 치환인, Tyr-27-His 및 Ser-57-His는 에쿨리주맙과 비교하여 pH 7.4에서 약 17배만큼 및 pH 6.0에서 약 36배만큼 C5에 대한 BNJ441의 친화도 해리 상수(KD)를 약화시켰다. 제3 중쇄 불변 영역 도메인(CH3)에서의 2개의 돌연변이인, Met-429-Leu 및 Asn-435-Ser은 에쿨리주맙과 비교하여 pH 6.0에서 약 10배만큼 FcRn에 대한 BNJ441의 친화도를 증가시켰다.
결합 동역학(C5에 대한 항체)
pH 8.0, 7.4, 7.0, 6.5 및 6.0에서 항-Fc 포획 방법을 이용하여 비아코어 3000 장치에서 표면 플라스몬 공명(SPR)을 통해 C5에 대한 BNJ441 또는 에쿨리주맙 결합의 동역학을 결정하였다. 염소 항-인간 IgG(Fc) 다중클론 항체(KPL 01-10-20호)를 10mM 아세트산나트륨(pH 5.0) 중에 0.1㎎/㎖로 희석하고, 아민 커플링에 의해 8분 동안 CM5 칩의 2개의 유세포에 부동화하였다. 시험 항체(BNJ441 또는 에쿨리주맙)를 실행 완충제(HBS-EP; 0.01M HEPES(pH 7.4), 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20; 지이 라이프 사이언시스, 카탈로그 BR1001-88호) 중에 0.20㎍/㎖로 희석하였다. 이후, 희석된 항체를 하나의 유세포(pH 7.4 실험에 대해 20㎕ 및 pH 6.0 실험에 대해 40㎕)에 주입한 후, 세포 둘 다에 다양한 농도의 C5를 주입하였다. 실행 완충제를 pH 7.0, 6.5 및 6.0 동역학에 대해 3M HCl에 의해 및 pH 8.0 동역학에 대해 0.5M NaOH에 의해 적정하였다. 표면을 20mM HCl, 0.01% P20에 의해 각각의 사이클마다 재생하였다. '이중 리퍼런싱'에 의해 비아이밸류에이션 4.1 소프트웨어(비아코어 AB(스웨덴 웁살라))를 이용하여 1:1 랭귀어 모델에 의해 데이터를 처리하였다.
하기 변형을 가지는 상기 기재된 항-Fc 포획 방법을 이용하여 비아코어 3000 장치에서 SPR을 통해 pH 8.0, 7.4, 7.0, 6.5 및 6.0에서의 BNJ441 또는 에쿨리주맙으로부터의 C5의 해리 속도를 결정하였다. 희석된 시험 항체를 하나의 유세포에 주입한 후, 세포 둘 다에 6nM C5를 주입하였다. C5 주입 직후, 다양한 pH에서의 250㎕의 실행 완충제를 주입하였다. 실행 완충제를 상기 기재된 바와 같이 준비하였다. '이중 리퍼런싱'에 의해 비아이밸류에이션 4.1 소프트웨어(비아코어 AB(스웨덴 웁살라))를 이용하여 데이터를 처리하였다. t = 0 및 t = 300초에서의 해리의 차이를 취하여 BNJ441 및 에쿨리주맙으로부터의 C5의 해리(%)를 계산하였다.
결합 동역학(FcRn에 대한 항체)
pH 7.4, 및 6.0에서 F(ab')2 포획 방법을 이용하여 비아코어 3000 장치의 SPR을 통해 인간 FcRn에 대한 BNJ441 또는 에쿨리주맙 결합의 동역학을 결정하였다. 10mM 아세트산나트륨(pH 5.0) 중에 0.04㎎/㎖로 희석된 염소 F(ab')2 항-인간 IgG F(ab')2(락랜드 이뮤노케미컬즈(Rockland Immunochemicals), 카탈로그 709-1118호)를 아민 커플링에 의해 7분 동안 CM5 칩의 2개의 유세포에 부동화하였다. 시험 항체(BNJ441 또는 에쿨리주맙)를 실행 완충제((HBS-EP; 0.01M HEPES(pH 7.4), 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20; 지이 라이프 사이언시스, 카탈로그 BR1001-88호) 중에 2㎍/㎖로 희석하였다. 이후, 희석된 항체를 하나의 유세포에 주입한 후, 세포 둘 다에 FcRn을 주입하였다. 실행 완충제를 pH 6.0 동역학을 위해 3M HCl에 의해 적정하였다. 표면을 10mM 글리신 HCl(pH 1.5)에 의해 각각의 사이클마다 재생하였다. '이중 리퍼런싱'에 의해 비아이밸류에이션 4.1 소프트웨어(비아코어 AB(스웨덴 웁살라))를 이용하여 1:1 랭귀어 모델에 의해 데이터를 처리하였다.
결합 연구의 결과
항체:C5 결합의 동역학은 pH 의존적인 것으로 밝혀졌고, 결합 속도 및 해리 속도 둘 다에 대한 효과는 표 9에 기재되어 있다.
Figure 112021046604377-pat00028
초기 엔도솜의 음세포작용 및 산성화 후 항체:C5 복합체의 상대 해리 속도를 모델링하기 위해, 항체:C5 복합체가 pH 7.4 완충제 중에 형성되게 하고, 이후 완충제 pH 조건을 해리 동안 전환하였다. 300초 후 항체 복합체 해리(공명 단위 [RU]의 감소로 예측됨)의 백분율을 각각 pH의 조건에 대해 계산하였다(표 10). pH 6.0에서의 BNJ441만이 5분 후 50% 초과로 항체:C5 복합체를 해리시켰다.
Figure 112021046604377-pat00029
도 21a 및 도 21b는 pH의 함수로서의 BNJ441:C5 복합체 또는 에쿨리주맙:C5 복합체의 해리의 반로그 및 선형 도면을 도시한다.
중쇄 가변 영역의 제1 및 제2 상보성 결정 영역(CDR)에서의 2개의 아미노산 치환인, Tyr-27-His 및 Ser-57-His는 에쿨리주맙과 비교하여 pH 7.4에서 약 17배만큼 및 pH 6.0에서 약 36배만큼 C5에 대한 BNJ441의 친화도 해리 상수(KD)를 약화시켰다. C5에 대한 BNJ441의 친화도에서의 pH 의존성이 27번 및/또는 57번 위치에서 도입된 히스티딘의 양성자화 상태의 변화의 결과인지, 또는 단순히 C5에 대한 친화도의 전체 감소인지 불명확하다. 그러나, 다른 항-C5 항체에서, 추가적인 히스티딘 치환과 조합된 이 돌연변이가 6.5 미만의 pH 수준에서 훨씬 더 현저하게 친화도를 소실시킨다는 것이 관찰되었다. 제3 중쇄 불변 영역 도메인(CH3)에서의 2개의 돌연변이인, Met-429-Leu 및 Asn-435-Ser이 에쿨리주맙과 비교하여 pH 6.0에서 약 10배만큼 FcRn에 대한 BNJ441의 친화도를 강화시켰다.
BNJ441 항체의 PK 특성
BNJ441 항체 및 에쿨리주맙을 면역결핍(NOD/scid) 및 C5 결핍인 마우스에서 평가하였다. 200㎕의 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 100㎍의 BNJ441 또는 에쿨리주맙의 단일 용량을 각각 8마리의 마우스에 정맥내(i.v.) 주사에 의해 투여하였다. 투여 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일에 각각의 마우스로부터 혈청을 수집하였다. 혈청 중의 각각의 항체의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.
도 22에 도시된 바대로, 인간 C5의 부재 하에, 혈청 항체 농도는 35일 기간에 걸쳐 BNJ441 및 에쿨리주맙이 투약된 마우스에서 유사하게 감소하였다. 그러나, 인간 C5의 존재 하에, 에쿨리주맙 혈청 농도는 14일 후 검출 불가 수준으로 신속히 감소하는 반면, BNJ441의 혈청 농도는 연구의 기간에 걸쳐 더 느리게 일치하는 속도로 붕괴하였다(도 23).
인간 C5의 존재 및 부재 하의 2개의 항체의 PK 프로필을 비교하면, 에쿨리주맙의 청소는 인간 C5의 부재 하의 것과 비교하여 인간 C5의 존재 하에 가속되는 반면, 인간 C5의 존재 하의 BNJ441의 PK 프로필은 28일에 걸쳐 인간 C5의 부재 하의 BNJ441의 것과 유사하고, 청소는 28일과 35일 사이에 오직 가속되었다(도 24). BNJ441의 반감기 및 에쿨리주맙의 반감기는 인간 C5의 부재 하에 필적하였다(BNJ441에 대해 25.37±1.02일 및 에쿨리주맙에 대해 27.65±2.28일). 그러나, 인간 C5의 존재 하에, BNJ441은 에쿨리주맙(BNJ441에 대한 13.40±2.18일 대 에쿨리주맙에 대한 3.93±0.54일)과 비교하여 3배 초과의 반감기 증가를 나타냈다. BNJ441의 청소율이 28일에 걸쳐 인간 C5의 존재 또는 부재 하에 상당히 다르지 않다는 것에 주목해야 한다. 표 11을 참조한다.
Figure 112021046604377-pat00030
Figure 112021046604377-pat00031
혈청 용혈성 활성
항체의 용혈성 활성에 대한 히스티딘 치환의 효과를 결정하기 위해, 실시예 6에 기재된 바대로 생체외 용혈성 검정을 수행하였다. BNJ441 또는 에쿨리주맙의 존재 하에, 말단 보체 활성은 각각의 항체의 각각의 PK 프로필과 일치하고(도 25), 즉 혈청 용혈성 활성의 저해의 수준은 혈청에 남은 각각의 항체의 농도에 비례한다. 항체 둘 다는 3일에 걸쳐 용혈의 거의 전체 저해를 부여하였다. 그러나, 에쿨리주맙이 14일에 길항작용이 없다는 것을 나타내는 반면, BNJ441은 14일에 약 83% 저해 및 28일에 걸쳐 부분 보체 저해를 보유하였다.
결론
이 연구로부터의 발견은, 인간 C5의 존재 하에, BNJ441이 에쿨리주맙과 비교하여 3배 초과의 반감기 연장을 나타낸다는 것을 제안한다. 또한, 에쿨리주맙에 대비된 BNJ441의 혈청 반감기는 연장된 용혈성 저해에 의해 입증된 바대로 연장된 약물학적 프로필로 번역되었다.
실시예 8. 건강한 인간 대상체에서의 BNJ441의 안전성, 관용성 PK 및 PD
1상, 무작위, 맹검, 위약 조절, 단일 상승 용량(SAD) 인간 임상 연구에서 BNJ441의 안전성, 관용성, PK 및 PD를 평가하였고, 여기서 BNJ441은 건강한 대상체에게 정맥내 투여되었다.
BNJ441은 제제 부형제에 의해 무균, 무보존제, 수용액 중에 제제화되었다. BNJ441 제제는 동물 또는 인간 기원의 임의의 특별한 부형제, 또는 부형제를 함유하지 않았다. 제제는 7.0의 pH로 인산염 완충되었다. 성분은 10㎎/㎖의 BNJ441, 1염기성 인산나트륨 3.34mM, 2염기성 인산나트륨 6.63mM, 염화나트륨 150mM, 폴리소르베이트 80 0.02% 및 적량의 물을 함유하였다.
BNJ441 제제는 20㎖의 단일 사용 바이알 중에 10㎎/㎖ 항체 용액으로서 공급되고, IV 투여를 위해 이것을 상업적으로 구입 가능한 식염수(0.9% 염화나트륨 주사, Ph Eur)로 희석함으로써 점적주사에 대해 설계되었다.
Figure 112021046604377-pat00032
10명의 건강한 대상체는 BNJ441의 단일 용량을 받았다. 4명의 대상체는 200㎎의 용량을 받고, 6명의 대상체는 400㎎의 용량을 받았다. 이 연구에 대한 PK 및 안전성 데이터가 결정되고 하기 기재되어 있다.
약동학
200㎎ 및 400㎎의 용량의 IV 투여 후 혈청 BNJ441 농도-시간 프로필은 도 26에 도시되어 있다. 농도-시간 데이터는 90일(2136시간) 및 57일(1344시간)까지 동안, 이어서 각각 200㎎ 및 400㎎의 용량에 대해 이용 가능하다. 평균 혈청 농도는 200㎎ 투약 후 2일 내지 4일(48 내지 96시간) 동안 및 400㎎ 투약 후 14일 내지 21일(336 내지 504시간) 동안 50㎍/㎖ 초과로 있었다.
BNJ441 PK 매개변수의 요약이 하기 표 12에 보고되어 있다. BNJ441의 기하 평균(CV) Cmax는 200㎎ 투약 후 78.5(10.2%)㎍/㎖이고, 400㎎ 투약 후 139(16.2%)㎍/㎖이었다. 점적주사의 시작 후 관찰된 중앙 (범위) tmax는 200㎎의 용량에 대해 2.4(0.79 내지 8.0)시간이고, 400㎎의 용량에 대해 0.58(0.58 내지 1.1)시간이었다. 기하 평균(CV) AUC(0-56일)는 200㎎의 용량에 대해 32,800(8.6%)㎍-hr/㎖이고, 400㎎의 용량에 대해 58,100(18.9%)㎍-hr/㎖이었다. 기하 평균 Cmax 및 AUC(0-56일)은 노출이 겉보기 용량 비례 방식으로 증가한다는 것을 나타낸다. 기하 평균 t½(CV)는 각각 200㎎ 및 400㎎의 용량에 대해 38.5(18.4%)일 및 32.9(13.3%)일이었다.
요약하면, PK 데이터는 평균 BNJ441 Cmax 및 AUC(0-56일)이 용량 비례 방식으로 증가한다는 것을 제시고, IV 투여 후 35.5±6.1일의 평균(표준 편차 [SD]) t½를 지지한다. 닭 적혈구(cRBC) 용혈 데이터의 분석은, BNJ441 농도가 100㎍/㎖ 초과일 때, 말단 보체가 단일 400㎎ IV 용량 후 2일까지 완전히 저해된다는 것을 나타낸다.
Figure 112021046604377-pat00033
약물학
도 27에 예시된 바대로 시간에 걸쳐 cRBC 용혈을 저해하는 BNJ441의 능력을 또한 평가하였다. 평균 cRBC 용혈 활성은 위약을 받는 대상체에서 비교적 안정하였다. cRBC 용혈 저해의 개시는 신속하고, 완전한 말단 보체 저해는 점적주사의 종료 시 관찰되었다(200㎎의 용량의 경우 0.29시간, 및 400㎎의 용량의 경우 0.58시간). BNJ441은 4일 내지 14일 동안 지속하는 용량 의존적 작용 기간을 가졌다.
BNJ441 농도와 cRBC 용혈 사의 관계식이 작도되고, 도 28에 도시되어 있다. 도 28에 도시된 바대로, 완전한 말단 보체 저해는 50㎍/㎖ 초과의 BNJ441 농도에서 발생한 반면, 25㎍/㎖ 미만의 BNJ441 농도에서 저해가 관찰되지 않았다.
실시예 9. 사이노몰거스 원숭이에서의 단일 용량 연구
BNJ441의 단일 IV 용량을 2시간 점적주사로서 60 또는 150㎎/㎏(각각 용량의 그룹에 대해 n = 4; 용량 그룹마다 2마리의 수컷 및 2마리의 암컷)의 용량으로 사이노몰거스 원숭이에 투여하였다. 1일로부터 112일에 BNJ441 분석에 대한 혈액 샘플을 수집하였다.
투약 전(0시간), 및 8일, 14일, 28일, 56일, 84일 및 112일에 사이노몰거스 항-인간 항체(CAHA)의 존재 하에 모든 BNJ441 치료 원숭이를 스크리닝하였다.
60 및 150㎎/㎏의 용량 그룹에서의 모든 원숭이는 150㎎/㎏의 용량 그룹에서의 동물 2002를 제외하고 적어도 단일 경우에 양성으로 확인되었다. 동물 2002에서의, 또는 다른 동물에 대한 비양성 시점에서의 CAHA의 존재는, 바이오티닐화 BNJ441 및 루테닐화 BNJ441 브릿징 검정에 의한 투여된 BNJ441의 가능한 방해로 인해, 배제될 수 없었다. 투약 후 56일 내지 112일에 60㎎/㎏의 용량 그룹에서, 및 투약 후 28일 내지 112일에 150㎎/㎏의 용량 그룹에서 양성 CAHA 결과가 관찰되었다. 60㎎/㎏의 처음에 확인된 CAHA 양성 샘플은 56일(동물 1002 및 1503)에 있고, 2마리는 84일(동물 1002 및 1503)에 있고, 3마리는 112일(동물 1001, 1002, 및 1502)에 있었다. 56일 및 84일에 CAHA 양성인 동물 1503은 112일에 더 이상 CAHA 양성이 아니었다. 150㎎/㎏의 용량 그룹에서의 처음에 확인된 CAHA 양성 샘플은 28일에 동물 2502이고, 이어서 2마리의 원숭이는 56일(동물 2001 및 2502)에 있고, 3마리의 원숭이는 84일(동물 2001, 2501 및 2502)에 있고, 3마리의 원숭이는 112일(동물 2001, 2501 및 2502)에 있었다.
개별적 BNJ441 농도-시간 프로필을 계산하였다. 60㎎/㎏의 용량 그룹에서, 모든 원숭이는 112일 PK 샘플에 걸쳐 정량 가능한 혈장 BNJ441 농도를 가지는 반면, 150㎎/㎏의 용량 그룹에서, 오직 1마리의 원숭이(동물 2002)는 112일에 걸쳐 정량 가능한 혈장 BNJ441 농도를 가졌다. 농도-시간 데이터는 원숭이의 전신 순환에서 BNJ441의 연장된 체류를 나타낸다.
BNJ441에 대한 비구획 PK 매개변수 및 요약 통계학은 용량 수준에 의해 모든 원숭이에 대해 계산되고, 각각 60㎎/㎏ 및 150㎎/㎏의 용량 수준에 대해 표 13 및 표 14에 기재되어 있다. 점적주사의 기간과 일치하게, 중앙 tmax는 60㎎/㎏ 및 150㎎/㎏의 용량 수준에 대해 2시간이었다. 150㎎/㎏의 용량 그룹에서의 1마리 원숭이인, 동물 2501은 투약 후 12시간의 tmax를 가지고, 투약 후 2 내지 12시간으로부터 비교적 편평한 프로필을 가지고, 12시간 투약 후 샘플 농도는 투약 후 2시간에 관찰된 것의 대략 5% 초과이다. 기하 평균 Cmax, AUC8, 및 AUClast는 모두 용량 증가에 따라 증가하였다. 기하 평균 용량 정규화 Cmax 값은 2　용량에 걸쳐 유사하여서, 용량 증가에 의해 피크 BNJ441 농도의 용량 비례 증가를 나타내지만, 기하 평균 용량 정규화 AUC8 값은 용량 그룹 사이에 달랐다. 이 차이는 아마도 150㎎/㎏의 용량 그룹에서 BNJ441 CL에서의 CAHA 매개 증가로 인하고; BNJ441의 청소는 60㎎/㎏이 투약된 원숭이와 비교하여 150㎎/㎏이 투약된 원숭이에서 대략 37% 더 높았다. 기하 평균 Vss는 2개의 용량 그룹 사이에 유사(12% 내)하였다.
Figure 112021046604377-pat00034
Figure 112021046604377-pat00035
실시예 10. 실험실내 Fc-감마 수용체 C1q에 대한 BNJ441, 에쿨리주맙 및 h5G1.1 결합의 비교 평가
항체 이팩터 기능의 매개자인 것으로 공지된 분자에 대한 3개의 인간화된 항체인, BNJ441, 에쿨리주맙 및 h5G1.1-IgG1의 결합을 조사하였다. BNJ441, 에쿨리주맙 및 h5G1.1-IgG1은 각각 독특한 기능적 및 치료학적 프로필을 가진다. 그러나, 모든 3개는 인간 보체 성분 C5에서 매우 유사한 에피토프에 결합하고 보체 활성화 동안 활성 대사물질, C5a 및 C5b로의 절단을 방지하는 말단 보체의 인간화된 항체 길항제이다.
BNJ441, 에쿨리주맙 및 h5G1.1-IgG1은 이의 경쇄 서열이 동일하고, 각각은 인간화된 가변 영역 및 인간 Ig카파 불변 영역을 가진다. BNJ441 및 에쿨리주맙은 둘 다 인간 하이브리드 IgG2-G4 Fc를 함유하고, 이것은 인간 IgG2로부터의 CH1 영역, 힌지 및 CH2 영역의 제1 29개 아미노산(인간 IgG4의 CH2 및 CH3 영역의 나머지에 융합됨)을 포함한다. 이 키메라 Fc는 IgG2의 안정한 다이설파이드 결합 쌍 지음을 IgG4의 이팩터 부족 특성과 조합한다. BNJ441 및 에쿨리주맙이 가용성 항원에 대해 지향되므로, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 개시하는 이의 능력을 직접적으로 평가할 수 없다. 대신에, Fc 감마 수용체(FcγR) 및 보체 성분 C1q에 대한 BNJ441 또는 에쿨리주맙 결합의 직접적인 측정을 수행하고, 결합의 부재 하에 이들이 각각 ADCC 또는 CDC를 매개할 수 없는 것으로 추론되었다. h5G1.1-IgG1(에쿨리주맙과 동일한 인간화된 가변 영역을 가지는 IgG1 아이소타입 항체)은 대조군으로서 포함되었다. h5G1.1-IgG1 자체가 세포 연관 항원의 부재 하에 ADCC 또는 CDC를 발생시킬 수 없지만, IgG1 아이소타입 Fc 영역이 이팩터 기능 분자에 완전히 결합하는 것으로 예상된다.
실시예 7에서 상기 기재된 바대로, 중쇄에서 4개의 아미노산 치환을 도입함으로써 생체내 반감기를 증가시키기 위해 에쿨리주맙으로부터 BNJ441을 조작하였다. 인간화된 중쇄 가변 영역에서의 2개의 아미노산 변화인, Tyr-27-His 및 Ser-57-His(카밧 등에 따른 중쇄 아미노산 넘버링)는 각각 pH 7.4에서 C5에 대한 결합에 대한 최소 영향으로 pH 6.0에서 C5에 대한 결합을 탈안정화시키도록 도입되었다. 제3 중쇄 불변 영역 도메인(CH3)에서의 돌연변이인, Met-428-Leu 및 Asn-434-Ser은 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합을 증대시키도록 도입되었다. 이들 돌연변이를 함께 취하는 것은, 음세포작용 후 초기 엔도솜의 산성화 환경에서 유리 항체에 대한 항체:C5 복합체의 해리를 증가시킴으로써 항원 매개 약물 청소를 상당히 약화시키고, 초기 엔도솜으로부터 FcRn에 의해 혈관 구획으로 다시 재순환되는 항체의 비율을 증가시키도록 설계되었다.
이 연구에서, FcγR 하위종류(FcγR1, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIb/c, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb)와 모든 3개의 항체의 다합체 상호작용을 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA)에서 평가하고, FcγR과의 단량체 상호작용을 표면 플라스몬 공명(SPR)을 이용하여 평가하였다. 3개의 항체에 대한 C1q의 결합을 조사하기 위해 바이오층 간섭법 및 SPR을 이용하였다. 이들 분석을 수행하기 위해 사용된 시약은 표 15에 기재되어 있다.
Figure 112021046604377-pat00036
FcγR에 대한 다가 항체 복합체의 결합
1.5㎖의 원심분리 관 내에서 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 2:1 항체:F(ab')2 몰 비로 BNJ441, 에쿨리주맙 또는 h5G1.1-hG1을 염소-항-인간 F(ab')2 -바이오틴(잭슨 이뮤노랩스(Jackson Immunolabs))과 밤새 항온처리함으로써 항체 복합체를 제조하였다.
Ni-NTA(퀴아젠(Qiagen))에 의해 예비 코팅된 미량적정 플레이트를 PBS 중의 5㎍/㎖의 수용체 농도로 50㎕/웰의 6X 히스티딘 태그화 인간 FcγR(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb/c, FcγRIIIa 또는 FcγRIIIb)과 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이후, 플레이트를 PBS/0.05% 트윈-20에 의해 3회 세척하였다. 세척 후, PBS/0.05% 트윈-20 중의 50㎕의 항체 복합체를 실온(RT)에서 60분 동안 플레이트에서 항온처리하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈-20에 의해 세척한 후, PBS/0.05% 트윈-20 중의 50㎕의 스트렙타비딘-HRP(Invitrogen)을 플레이트에 첨가하고 실온에서 60분 동안 항온처리하였다. 이 항온처리 및 세척 후, 75㎕의 TMB-ELISA 기질(3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘, 써모 사이언티픽)을 첨가하였다. 반응을 75㎕의 2M H2SO4에 의해 중지시키고, 흡광도를 450㎚에서 판독하였다.
샘플을 2중 실행하고, 데이터는 평균 값으로서 제시되었다. 결과를 스프레드시트 프로그램에 입력하였다. 항체 면역 복합체의 각각의 농도의 또는 항체 면역 복합체의 부재 하의 450㎚에서의 흡광도는 그래프 표시로서 작도된다. 중요한 해리 상수가 계산되고 표 16에 요약되어 있고 하기 기재되어 있다.
FcγR에 대한 다가 항체의 결합
직접적인 부동화를 이용하여 비아코어 3000 장치에서 SPR을 통해 FcγR에 대한 BNJ441, 에쿨리주맙 및 h5G1.1-IgG 결합의 동역학을 결정하였다. BNJ441, 에쿨리주맙 및 h5G1.1을 10mM 아세트산나트륨(pH 5.0) 중에 희석하고, 아민 커플링에 의해 CM5 칩의 하나의 유세포에 부동화하였다. 제2 유세포를 기준 표면으로서 사용하였다. 실행 완충제(HBS-EP(pH 7.4)) 중에 희석된 FcγR의 농도를 세포 둘 다에 주입하였다. 표면을 20mM HCl, 0.01% P20에 의해 각각의 사이클마다 재생하였다. '이중 리퍼런싱'에 의해 비아이밸류에이션 4.1 소프트웨어(비아코어 AB(스웨덴 웁살라))에서 정상 상태 친화도 모델을 이용하여 데이터를 분석하였다.
FcγRI에 대한 h5G1.1-IgG1 결합의 동역학을 이의 더 강한 친화도로 인해 단일 사이클 동역학을 통해 평가하였다. 항체를 10mM 아세트산나트륨(pH 5.0) 중에 희석하고, 아민 커플링에 의해 CM5 칩의 하나의 유세포에서 직접적으로 부동화하였다. 제2 유세포를 기준 표면으로서 사용하였다. 실행 완충제(HBS-EP(pH 7.4)) 중에 희석된 FcγR1의 농도를 세포 둘 다에서 주입하였다. 이 검정은 재생을 필요로 하지 않았다. '이중 리퍼런싱'에 의해 비아이밸류에이션 4.1 소프트웨어(비아코어 AB(스웨덴 웁살라))에서 적정 동역학 1:1 모델을 이용하여 데이터를 분석하였다.
Figure 112021046604377-pat00037
항체 면역 복합체 및 FcγR의 아비디티 추진 다합체 상호작용을 검출하기 위한 ELISA 검정을 수행하였다. 결과가 표 16에 요약되어 있다. BNJ441 및 에쿨리주맙은 FcγRI, FcγRIIb/c, FcγRIIIa 또는 FcγRIIIb에 대한 검출 가능한 결합을 나타내지 않고, 각각 FcγRIIa와 4배 내지 8배 더 약한 결합을 나타냈다. SPR에 의해 추론된 BNJ441 및 에쿨리주맙에 대한 단량체 FcγR 결합에 대한 해리 상수(KD)는 FcγR 상호작용이 매우 약하고 2개의 항체 사이에 거의 구별 불가능하다는 것을 확인시켜준다: FcγRI(약 4μM), FcγRIIa(약 2μM), FcγRIIb(약 9μM), FcγRIIIa(약 7μM) 및 FcγRIIIb(약 3μM). IgG1 아이소타입 대조군(h5G1.1-IgG1)에 대한 해리 상수는 IgG2-G4 아이소타입 항체에 대비된 FcγR1과의 고친화도 상호작용(123pM) 및 저친화도 FcγR에 대한 적절한 결합의 증가와 일치한다: FcγRIIa(약 1μM), FcγRIIb(약 3μM), FcγRIIIa(약 1μM) 및 FcγRIIIb(약 2μM). 표 16을 참조하다. 바이오층 간섭법을 통해 C1q와 BNJ441 또는 에쿨리주맙 사이의 상호작용이 검출 가능하지 않았다. 이 결과는 에쿨리주맙의 키메라 인간 IgG2-G4 Fc가 각각 ADCC 또는 CDC를 매개하는 FcγR 또는 C1q를 통한 이팩터 기능을 발생시키는 능력이 거의 없거나 없다는 것과 일치한다. 게다가, 이 결과는 BNJ441로 혼입된 중쇄 아미노산 치환이 에쿨리주맙에 대비해 이에 대한 결합을 실질적으로 변경하지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 11. 조직 교차 반응성 연구
1. GLP 인간 교차 반응성 연구
상이한 항원 특이성을 가지는 플루오레세인화 BNJ441(BNJ441-FITC라 칭함) 및 대조군 항체(OX-90G2G4-FITC)을 사용하여 인간 조직과의 잠재적 교차 반응성을 결정하였다.
BNJ441-FITC는 양성 대조군 물질(hC5라 칭하는, 정제된 인간 보체 단백질 C5 자외선 [UV] 수지 스팟 슬라이드)의 보통 내지는 강한 염색을 생성하였지만, 음성 대조군 물질(악성 펩타이드의 인간 고칼슘혈증, 1-34번 아미노산 잔기, UV 수지 스팟 슬라이드, PTHrP 1-34라 칭함)와 특이적으로 반응하지 않았다. 대조군 물품인, OX-90G2G4-FITC는 양성 또는 음성 대조군 물질과 특이적으로 반응하지 않았다. BNJ441-FITC와 양성 대조군 물질의 훌륭한 특이적 반응 및 음성 대조군 물질과의 특이적 반응성의 결여, 및 대조군 물품의 반응성의 결여는 검정이 민감하고 특이적이며 재현 가능하다는 것을 나타낸다.
BNJ441-FITC에 의한 염색은 하기 요약된 바대로 인간 조직 패널에서 관찰되었다:
Figure 112021046604377-pat00038
대부분의 인간 조직에서의 단백질성 재료:
Figure 112021046604377-pat00039
하기 조직 요소에서의 세포질 및/또는 세포질 과립:
- 대장, 식도, 림프절, 부갑상선, 비장 및 편도에서의 단핵 세포,
- 혈액 도말 및 골수에서의 혈소판,
- 골수에서의 거핵세포,
- 나팔관, 간(간세포), 췌관 및 자궁경부에서의 상피,
- 폐에서의 중피.
C5가 순환 혈청 단백질이므로, 단백질성 재료의 염색이 기대된다. 단핵 세포, 예컨대 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포, 및 혈소판은 C5를 분비하는 것으로 보고되었고; 따라서, BNJ441-FITC에 의한 이 세포 유형의 염색이 또한 기재되었다. 추가적으로, 중피 세포주는 C5를 생성하는 것으로 나타났다. 그러나, C5를 생성하는 것으로 밝혀진 혈소판이 거핵세포로부터 유래하지만, 현재의 연구에서 BNJ441-FITC에 의해 염색된 상피 세포 유형, 또는 거핵세포에 의한 C5의 발현을 기술하는 문헌이 이용 가능하지 않다. 따라서, 상피 세포 유형의 염색은 C5 발현의 이전에 인식되지 않은 부위, 또는 유사하지만 비관련된 단백질 또는 조직 절편의 다른 구성요소(들)로부터의 단백질 서열 또는 구조와의 조직 교차 반응성을 나타낸다. 그러나, 단백질성 재료의 염색을 제외하고, 이 연구에서 관찰된 모든 염색은 성질상 세포질이고, 세포질 및 세포질 구조가 생체내 시험 물품에 접근 가능하지 않을 것이다. 요약하면, BNJ441-FITC 염색이 특이적 교차 반응성이 관찰되지 않았고, 이것은 치료 관련 독성의 예상을 발생시켰다.
2. GLP 사이노몰거스 원숭이 조직 교차 반응성 연구
표준 GLP 조직 교차 반응성 연구를 또한 일련의 사이노몰거스 원숭이 조직을 사용하여 수행하여 오프표적(off-target) 및 온표적(on-target) 결합 둘 다를 검사하고, 동일한 시약을 인간 조직 결합 연구에서 사용하였다.
BNJ441-FITC에 의한 일부 염색은 하기 요약된 바대로 사이노몰거스 원숭이 조직 패널에서 관찰되었다.
Figure 112021046604377-pat00040
대부분의 사이노몰거스 원숭이 조직에서의 단백질성 재료:
Figure 112021046604377-pat00041
하기 조직 요소에서의 세포질 및/또는 세포질 과립:
- 림프절, 비장 및 편도에서의 단핵 세포,
- 나팔관에서의 상피.
사이노몰거스 원숭이 조직 패널에서 관찰된 BNJ441-FITC 염색 패턴이 동반 인간 조직 교차 반응성 연구에서 인간 조직 패널에서 관찰된 것보다 전체적으로 덜 강하고 덜 빈번하였다. 추가로, 인간 조직 패널에서, 혈소판, 거핵세포, 췌관 상피, 자궁경부 상피, 간세포 및 중피의 염색이 관찰되었지만, 이들 조직 요소는 사이노몰거스 원숭이 조직 패널에서 염색되지 않았다. 더구나, 단백질성 재료의 염색을 제외하고, 이 연구에서 관찰된 모든 염색은 성질상 세포질이고, 세포질 및 세포질 구조가 생체내 시험 물품에 접근 가능하지 않을 것이다. BNJ441이 인간 C5에 정교하게 특이적인 것(그리고 비인간 영장류로부터의 C5와 교차 반응성이 아님)으로 나타났으므로, 이 연구에서 관찰된 제한된 결합은 확인 불가능한 교차 반응성 재료와의 비특이적 결합으로 인한 것일 것이다.
실시예 12: 말단 보체 활성 검정에서의 에쿨리주맙괴 비교된 BNJ441의 효력
C5에 대한 pH 의존적 결합을 생성시키는 BNJ441에서 조작된 돌연변이는 에쿨리주맙(대략 29.3pM)에 대비해 대략 17배만큼 pH 7.4(대략 491pM)에서 이의 친화도를 감소시켰고, 에쿨리주맙과 비교하여 C5 매개 말단 보체 활성의 BNJ441 저해 효력을 감소시키는 것으로 예상되었다. 생리학적 관련 조건 하에 BNJ441 및 에쿨리주맙의 효력을 예측하기 위해, 3개의 공통으로 사용된 동물 모델(닭, 양 및 토끼)로부터의 적혈구(RBC)의 보체 매개 용혈의 길항작용이 90% 정상 인간 혈청에서 평가되었다.
RBC 및 양 적혈구(sRBC)를 항체에 의해 예비 감작화하여서 보체 전통적인 경로(CCP)의 활성화를 개시하였다. 토끼 적혈구(rRBC)를 예비 감작화하지 않고, 보체 대안적인 경로(CAP) 활성화의 모델로서 사용하였다. 항체를 100, 200 및 400nM에서 혈청 중에 예비 항온처리하여 각각 대략 0.5:1, 1:1 및 2:1의 항원 결합 부위 대 C5의 몰 비를 생성하였다. 항체 BNJ430은 BNJ441과 동일한 Fc 영역을 함유하지만, 인간 C5에 결합하지 않고, 음성 대조군으로서 포함되었다. 용혈의 백분율을 0분, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분 및 8분에서 측정하여, 초기 속도 조건 하에 반응이 관찰되는 것을 보장하였다.
도 29에 도시된 바대로, BNJ441도 에쿨리주맙도 cRBC 용혈에서 100nM에서 길항작용을 나타내지 않았다. 항체 둘 다는 200nM에서 부분 길항작용을 나타내지만(항원 결합 부위 대 C5의 대략 1:1 몰 비), BNJ441은 에쿨리주맙에 대비해 감소한 효력을 가졌다. 용혈의 저해는 항원 결합 부위 대 C5(400nM)의 2:1 몰 비에서 항온처리될 때 항체에 거의 완전하였다. sRBC 용혈 검정의 결과는 유사하여서, 200nM에서의 BNJ441의 존재 하의 20% 미만의 용혈, 및 400nM에서의 각각의 항체에 의한 거의 완전한 저해(데이터 비도시)를 나타낸다. CAP 매개 rRBC 용혈 검정은 200nM에서의 검출 불가능한 저해, 및 400nM에서의 오직 부분 저해(데이터 비도시)와 함께 항-C5 항체의 존재 하의 더 높은 수준의 용혈을 나타낸다.
결론적으로, 이 실험실내 보체 활성 검정에서 에쿨리주맙에 대비된 BNJ441의 효력의 보통의 소실은 C5에 대한 이의 더 약한 친화도와 일치한다. C5에 대한 BNJ441의 친화도는 생체내 C5의 농도 및 BNJ441의 표적화된 치료학적 수준보다 대략 1000배 훨씬 낮고, 따라서 이의 치료학적 효율을 손상시키지 않을 것이다.
실시예 13: 말단 보체 활성 검정에서의 에쿨리주맙과 비교된 BNJ441의 선택도
비인간 동물 모델에서 BNJ441의 약리학적 활성을 평가하기 위해, 침팬치, 개코원숭이, 래서스 마카크, 사이노몰거스 마카크, 비글, 토끼, 기니아 피그, 랫트 및 마우스로부터의 혈청 중의 항체 감작화된 cRBC의 보체 매개 용혈을 길항하는 BNJ441의 능력을 측정하였다. 에쿨리주맙 및 인간 IgG2/G4 Fc(BNJ430)를 가지는 항-마우스-C5 항체를 아이소타입 대조군으로서 사용하였다.
감작화된 cRBC를 각각의 검정에 대해 알서버액(Alsever's)(람파이어 바이오로지컬스(Lampire Biologicals)) 중에 400㎕의 닭 전혈로부터 준비하고, 4℃에서 1㎖의 GVBS에 의해 4회 세척하고 5x107개의 세포/㎖로 GVBS 중에 재현탁시켰다. 닭 적혈구를 감작화하기 위해, 다중클론 항-닭 RBC 항체(락랜드)를 150㎍/㎖로 세포에 첨가하고 15분 동안 얼음에서 항온처리하였다. GVBS를 한번 세척한 후, 세포를 3.6㎖의 최종 용적으로 GVBS 중에 재현탁시켰다.
하기 포유동물로부터의 혈청을 포함하는 보체 보존된 혈청을 바이오레클라메이션으로부터 얻었다: 인간; 침팬치; 개코원숭이; 래서스 마카크; 사이노몰거스 마카크; 비글; 토끼; 기니아 피그; 및 랫트. 10㎎/㎖의 항체 BNJ441; 에쿨리주맙(10㎎/㎖); 0.873㎎/㎖의 BNJ430을 GVBS 중에 30% 혈청 중에 0, 60, 300 및 600nM의 최종 농도로 희석하고 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 감작회된 cRBC를 웰당 30㎕(2.5x106개의 세포)로 항체/혈청 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 항온처리하고, 30㎕의 0.5M EDTA를 각각의 웰에 첨가함으로써 반응을 중지시켰다. 플레이트를 1800 X g에서 3분 동안 원심분리하고, 80㎕의 상청액을 새로운 넓적 바닥 96웰 플레이트로 옮겼다. 415㎚에서 흡광도를 측정하였다.
마우스 혈청이 전통적인 경로 보체 활성의 빈약한 소스이므로, 마우스 혈청을 C5 결핍 인간 혈청과 1:1 혼합하여 마우스에서의 잠재적 BNJ441 약리학적 활성을 평가하였다. 항체를 GVBS 중에 50% 전체 혈청(25% 마우스 혈청, 25% C5 결핍 인간 혈청) 중의 0, 60, 300 및 600nM의 최종 농도로 희석하고, 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 감작화된 cRBC를 웰당 30㎕(2.5x106개의 세포)로 항체/혈청 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 항온처리하고, 30㎕의 0.5M EDTA를 각각의 웰에 첨가함으로써 반응을 중지시켰다. 플레이트를 1800 x g에서 3분 동안 원심분리하고, 80㎕의 상청액을 새로운 넓적 바닥 96웰 플레이트로 옮겼다. 415㎚에서 흡광도를 측정하였다.
10mM EDTA와 함께 또는 이것 없이 항-C5 항체 없이 혈청을 함유하는 샘플을 각각 무용해 또는 완전 용해 대조군으로서 사용하였다. 2중 또는 3중 샘플 조건을 실행하였다.
결과를 스프레드시트에 입력하여 용해무 대조군의 배경 공제 및 완전한 용해 대조군에 대비된 용혈(%)의 정규화, 평균 값(±s.d.)의 계산 및 데이터의 그래프 표시를 허용한다. 용해무 대조군으로부터의 평균 배경에 대한 흡광도 값은 각각의 복제물로부터 공제되고, 샘플 흡광도는 하기 식에 따라 완전한 용해 대조군에서의 용해의 백분율로서 표시된다: cRBC 용혈(%)은 (각각의 샘플 복제물 샘플에서의 A415 값 - 용해무 대조군에서의 평균 A415 값)/(완전한 용해 대조군에서의 평균 A415 값 - 용해무 대조군에서의 평균 A415 값) x 100이다.
샘플 복제물에 대한 cRBC 용혈(%)의 평균 및 표준 편차는 그래프 표시(데이터 비도시)로 작도되어 있다.
BNJ441은 사이노몰거스 마카크로부터의 네이티브 C5에 대한 검출 가능한 결합을 가지지 않고, 항원 결합 부위 대 C5의 8배 몰 초과에서 시험된 임의의 비인간 혈청에서 실험실내 약리학적 활성을 가지지 않는 것으로 나타났다. 종합하면, 이들 데이터는 BNJ441이 인간에서 약동학 또는 약물학을 모델링하기에 적합한 임의의 용이하게 접근 가능한 비인간 종에서 임의의 관련 약리학적 활성을 가지지 않는다는 결론과 일치한다.
실시예 14: BNJ441의 물리화학적 규명
BNJ441 항체는 재조합, 인간화된 항체이고, 2개의 동일한 448개의 아미노산 중쇄 및 2개의 동일한 214개의 아미노산 경쇄로 이루어진다. 도 30을 참조한다. BNJ441의 불변 영역은 인간 카파 경쇄 불변 영역 및 하이브리드 인간 IgG2-IgG4 중쇄 불변 영역(또한 "G2/G4"라 칭함)을 포함한다. IgG2/G4 불변 영역은 항체의 이팩터 기능 활성화, 보체 활성화 및 면역원성을 감소시키도록 합당하게 설계되었다. 중쇄 CH1 도메인, 힌지 영역 및 CH2 도메인의 제1 5개 아미노산은 인간 IgG2 아미노산 서열, CH2 영역에서의 6번 내지 36번 잔기와 일치하고, 인간 IgG2 및 IgG4 아미노산 서열 둘 다에 공통인 반면, CH2 도메인 및 CH3 도메인의 나머지는 인간 IgG4 아미노산 서열과 일치한다. 인간 프레임워크 영역으로 이루어진 인간 C5 결합 부위를 형성하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 쥣과 상보성 결정 영역으로 그래프팅된다. BNJ441 항체에서의 사슬간 다이설파이드 결합은 도 31에 도시되어 있다. 잔기 번호는 모든 다이설파이드 결합 쌍 짓기 및 N 연결 글리칸 부위에 대해 도 31에 도시되어 있다.
표 17은 BNJ441 항체의 일반적인 특성을 기재한다. 하기 제시된 주요 성분에 대한 이론적 화학식 및 이론적 평균 분자량은 항체가 18개의 다이설파이드 결합, 2개의 중쇄 N 말단 피로글루타메이트, 2개의 중쇄 C 말단 라이신의 클리핑, 및 2개의 G0F 글리칸 잔기의 첨가를 함유한다는 것을 추정한다. BNJ441에서의 아미노산 잔기의 수는 아미노산 분석에 의해 예측되었다.
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BNJ441의 제조를 위해 안정한 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주 발현 BNJ441을 개발하였다. 이 세포주를 생성하기 위해 사용된 소스 CHOK1SV 세포를 론자 바이올로직스(Lonza Biologics) CHOK1SV 마스터 세포 뱅크 269-M으로부터 얻었다. 이 세포 소스는 박테리아 및 진균 오염물질 및, 감염성이 아닌 세포 내인성 레트로바이러스 입자 이외의, 모든 검출 가능한 바이러스가 없는 것으로 입증되었다. 숙주 CHOK1SV 세포를 플라스미드 pBNJ441.1에 의해 형질감염시키고, 안정한 클론을 MSX에 의해 선택하였다. BNJ441의 제조를 위한 생성 세포주로서 1차 클론 3A5를 선택하였다.
BNJ441 벌크 약물 기질 뱃취의 엔지니어링 및 GMP 뱃취를 준비하고 표 18에 기재된 시험에 의해 물리화학적으로 규명하였다. 엔지니어링 뱃취를 200ℓ 생물반응기에서 성장한 CHO 세포를 사용하여 파일럿 식물에서 제조하고, 정제된 재료를 PK 연구에서 사용하였다. GMP 뱃취를 200ℓ 생물반응기를 사용하여 파일럿 식물에서 성장한 CHO 세포를 사용하여 제조하였다. BNJ441 엔지니어링 및 GMP 벌크 약물 기질 뱃취를 대략 10㎎/㎖에서 제제화하고 시험하였다. 뱃취에 대한 물리화학 특성이 표 19에 요약되어 있다.
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표 19는 엔지니어링 뱃취에 대해 결정된 온전한 분자량이 147830.80Da이고 GMP 뱃취가 147830.72Da라는 것을 보여준다. 값은 표 17에서의 147,827.62Da의 BNJ441에 대한 계산된 주성분 분자량 값과 일치하고, 외부적으로 보정된 ESI-ToF-MS의 100ppm 질량 정확도 내에 있다. 147,000-149,500Da 범위 뒤로 주피크가 관찰되지 않았다. 이 방법은 온전한 분자량에 기초하여 분자를 확인하였다. 시험 샘플을 C4 RP-HPLC 칼럼에 주입하고, 수성:유기 용매 구배에 의해 용리하였다. 이후, 용리물을 ToF 질량 분광기로 전기분무하고, 크로마토그래피 피크의 상부 절반으로부터의 스펙트럼을 디콘볼루션하여 온전한 분자량을 제공하였다.
표 19는 BNJ441 뱃취에 대해 결정된 N 말단 서열을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄의 결정된 N 말단 서열은 BNJ441 뱃취에 대해 아미노산 서열과 일치하였다. 중쇄는 예상된 바대로 PyroQ에 의해 차단되고, 피로글루타메이트 아미노펩티다제(PGAP)에 의해 탈차단되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 순차적 Edman 분해 및 HPLC 분석에 의해 폴리펩타이드 사슬의 N 말단에서 단백질의 1차 서열을 결정하였다.
표 19는 BNJ441 뱃취에 대해 결정된 분자마다의 아미노산 분석 잔기를 나타낸다. 이 값은 모두 표 19의 제1 칼럼에 기재된 1차 서열에 기초하여 BNJ441에 대한 분자마다의 계산된 잔기의 수와 일치한다. 아미노산 분석 데이터를 3중 획득하였다. 이 방법은 개별적 아미노산 구성성분으로의 단백질의 산성 가수분해에 의해 분자의 1차 구조를 평가한다. 이 방법은 시스테인 또는 트립토판을 검출하지 않는다. 아스파라긴 및 아스파르테이트는 단일 피크 및 표지된 Asx에서 검출되었다. 글루타민 및 글루타메이트는 단일 피크 및 표지된 Glx에서 또한 검출되었다. 20개의 표준 아미노산 중에서, 전체 16개의 아미노산에 대해 Asx 및 Glx 기와 함께, 14개가 이 방법에 의해 독특하게 검출되었다. 표시된 이들 중에서, BNJ441은 이 방법에 의해 검출될 수 있는 전체 1262개의 잔기를 가진다.
표 19는 BNJ441 뱃취에 대한 원이색성(CD) 근 UV 국소 특징, 원 UV 국소 특징 및 디콘볼루션 결과를 나타낸다. 디콘볼루션은 소정의 기준 세트에 대해 CDPro 소프트웨어에 의해 결정된 α-나선, 3/10 나선, β-시트, 회전, 폴리 (Pro) II 및 비순서화 구조의 양을 기술한다. 각각의 뱃취에 대한 근 UV(3차 구조) 및 원 UV(2차 구조)에 대한 CD 스펙트럼을 결정하였다. 이 방법은 광학 활성(키랄) 분자, 예컨대 단백질의 흡수 밴드에서 나타난 왼쪽 및 오른쪽 원형으로 편광된 광의 차등 흡수에 의해 분자에서 더 높은 차수의 분자 구조(2° 및 3°)를 평가하였다. CD 스펙트럼의 디콘볼루션이 수행되고, 결과가 표 19에 기재되어 있다.
표 19는 결정된 각각의 글리칸에 대한 평균 분자량을 나타낸다. BNJ441 뱃취에 대한 관찰된 N 연결 올리고사카라이드 또는 글리칸 분자량은 표 20에 기재된 이론적 글리칸 분자량과 일치한다. MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 유리 글리칸 분자량 스펙트럼을 결정하였다. 이 방법은 분자량에 의해 약물 분자와 연관된 글리칸을 확인하였다. 글리칸은 PNGase F에 의해 이전에 항체로부터 효소로 절단되었다. 이후, 글리칸을 고상 추출하고, 3,4-디하이드록시벤조산 기질 용액과 혼합하고, MALDI 표적에서 공침하였다. 이 건조된 샘플을 TOF 질량 분광기로 질소 레이저에 의해 이온화하였다. m/z(M+Na)+ 스펙트럼을 수집하였다.
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BNJ441 뱃취에 대해 결정된 올리고사카라이드 백분율은 표 19에 기재되어 있다. 다양한 유형의 N 연결 올리고사카라이드에 대해 전체를 계산하였다: (전체 G0F, G1F), 산성, 고만노스, 중성, 모노시알릴화 및 다이시알릴화. N 연결 올리고사카라이드는 중성 올리고사카라이드를 오직 함유하였다. 중성 올리고사카라이드의 수준은 각각 엔지니어링 및 GMP 뱃취에 대해 99.99 및 100.0%이다. HPLC를 이용하여 올리고사카라이드를 검출하고, 정량적으로 크로마토그램을 평가하였다. 이 방법은 효소로 방출되고 형광으로 태그화된 올리고사카라이드의 보유 시간에 기초하여 약물 분자와 연관된 N 연결 올리고사카라이드를 확인함으로써 글라이코실화 패턴을 평가한다. 이 방법은 각각의 올리고사카라이드 종의 상대 풍부도를 제공한다. 간단히 말하면, 올리고사카라이드는 PNGase F에 의해 항체로부터 효소로 절단되고 안트라닐산에 의해 태그화되었다. HILIC 여과 단계를 이용하여 과량의 안트라닐산을 제거하였다. 샘플을 쇼와 덴코 아사이팩(Showa Denko Asahipak) 아미노 칼럼을 가지는 wAX-HPLC 시스템에 주입하고, 태그화된 올리고사카라이드를 형광 검출기(360㎚ 여기 및 420㎚ 방출)에 의해 검출하였다.
모노사카라이드 백분율은 BNJ441 뱃취에 대해 결정되고, 표 19에 기재되어 있다. 형광 라벨링, 이어서 역상 고압 크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용하여 5개의 모노사카라이드(GlcNAc, GalNAc, 갈락토스, 만노스, 푸코스)에 대해 모노사카라이드 백분율을 결정하였다. 이 검정은 형광으로 표지되 모노사카라이드의 보유 시간에 기초하여 약물 분자와 연관된 모노사카라이드를 결정함으로써 글라이코실화 패턴을 규명한다. 간단히 말하면, 산 가수분해는 단백질로부터 이의 구성성분 모노사카라이드로 올리고사카라이드를 제거하였다. 이후, 유리 모노사카라이드를 환원 아미노화에 의해 안트라닐산(AA)으로 표지하였다. 이후, 샘플을 워터스 시메트리(Waters Symmetry)(등록상표) C-18을 가지는 칼럼 RP-HPLC 시스템에 주입하고, AA 태그화된 모노사카라이드를 형광 검출기(360㎚ 여기; 420㎚ 방출)에 의해 검출하였다. 샘플을 2중 시험하고, 보고된 값은 2개의 결과의 평균이었다.
다음에, 본 발명자들은 시알산 N-아세틸뉴라민산(NANA) 및 N-글리콜릴뉴라민산(NGNA)을 결정하였다. 각각의 경우에, BNJ441 뱃취의 결정된 NANA 및 NGNA 시알산 함량은 표 19에 기재된 정량 한계보다 낮았다(6mmol/mol 미만). NGNA는 어느 한 뱃취에도 관찰되지 않았다. 형광 표지화 후 및 다점 보정을 이용하여 RP-HPLC에서 시알산을 측정하였다. 이 방법은 약물 분자와 연관된 시알산의 유형 및 상대 양을 결정함으로써 글라이코실화 패턴을 평가한다. 시알산을 황산수소나트륨과 항온처리함으로써 항체로부터 화학적으로 절단한 후, O-페닐렌다이아민에 의해 태그화하였다. 샘플을 벡만 C18 울트라스피어(Beckman C18 Ultrasphere) 칼럼을 가지는 RP-HPLC 시스템에 주입하고, 태그화된 시알산을 형광 검출기(230㎚ 여기; 425㎚ 방출)에 의해 검출하였다. 샘플을 2중 시험하고, 2개의 결과의 평균이 보고되었다.
각각의 BNJ441 뱃취의 결정된 Tm 값은 표 19에 기재된 바대로 67.0℃이다. 시차 주사 열량법(DSC) 스캔을 수행하고, 20℃로부터 95℃로 75℃/hr의 속도로 업스캐닝함으로써 마이크로-Cal VP-DSC를 이용하여 열량법 데이터를 획득하였다. 샘플 시험 전에 Y축 및 온도 보정을 수행하였다. Y축 편향 % 오차는 1% 미만이고, 전이 중간점은 28.2℃ 및 75.9℃ 둘 다의 ±0.2℃의 인정 범위 내에 있다. 동일한 완충제 조성물 및 용적의 블랭크에 대해 샘플을 스캐닝하였다. DSC는 열 변성으로 인한 비폴딩의 엔탈피(ΔH)를 측정한다. 용액 중의 바이오분자는 네이티브(폴딩된) 입체구성과 이의 변성(비폴딩) 상태 사이의 평형에 있다. 전이 중간점(Tm)은 단백질의 50%가 이의 네이티브 입체구성에 있고 50%가 변성되는 온도이다. 각각의 샘플에 대한 Tm은 블랭크 세포의 것과 비교하여 샘플 세포에서의 온도 구배에 걸쳐 ΔH를 측정함으로써 결정된다.
BNJ441 엔지니어링 및 GMP 뱃취 재료에 대한 친화도(KD)는 우수한 피트(fit)로 각각 461pM 및 421pM이다. 각각의 BNJ441 뱃취의 결합 동역학은 표 19에 기재되어 있다. 인간 C5에 대한 항-C5 항체(BNJ441)의 결합 동역학을 평가하기 위해 표면 플라스몬 공명(비아코어 3000)을 이용하였다. 센서그램이 도시되어 있지 않다. 항-Fc 인간 포획 방법을 이용하여 C5에 대한 BNJ441의 동역학을 결정하였다. 10mM 아세트산나트륨(pH 5.0) 중에 0.1㎎/㎖로 희석된 항-Fc-인간(KPL 01-10-20호)을 아민 커플링에 의해 8분 동안 CM5 칩의 2개의 유세포에 부동화하였다. 항-C5 항체(BNJ441)를 실행 완충제(HBS-EP, 0.01M HEPES, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% P20(pH 7.4)) 중에 0.35㎍/㎖로 희석하였다. 이후, 희석된 항체를 다른 유세포에 주입한 후, 유세포 둘 다에 C5(0.19-6nM)를 주입하였다. 2차 유세포를 기준으로서 사용하였다. 표면을 20mM HCl, 0.01% P20(100㎕/분, 200㎕ 주사)에 의해 매회 재생하였다. '이중 리퍼런싱'에 의해 비아이밸류에이션 4.1을 이용하여 1:1 랭귀어 모델에서 데이터를 처리하였다.
BNJ441 엔지니어링 및 GMP 뱃취 재료의 자가 결합에 대한 친화도(KD)는 각각 7.1mM 및 0.27mM이었다. 표 19를 참조한다. 빈약한 피트는 BNJ441 엔지니어링 및 GMP 뱃취 재료 둘 다에 관찰된 낮은 수준의 결합으로 인하고, 자가 결합 및 측정된 친화도는 기기의 검출 한계의 수준보다 낮았다. 낮은 수준의 자가 결합은 제조능력 및 궁극적으로 환자에 대한 투여를 위해 유리하다.　 센서그램이 도시되어 있지 않다. 항-C5 항체(BNJ441)의 자가 결합 동역학을 평가하기 위해 표면 플라스몬 공명(비아코어 3000)을 이용하였다. BNJ441의 자가 결합 동역학을 항체(BNJ441)의 직접적인 부동화에 의해 결정하였다. BNJ441을 10mM 아세트산나트륨(pH 5.0) 중에 대략 31㎍/㎖로 희석하고, 아민 커플링에 의해 2000RU를 얻기 위해 CM5 칩의 하나의 유세포에 부동화하였다. 2차 유세포를 기준으로서 사용하였다. 이후, 항-C5 항체, BNJ441(실행 완충제 중 1.6 내지 50μM, HBS-EP, 0.01M HEPES, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% P20(pH 7.4))의 희석액을 유세포 둘 다에 주입하였다. 빈약한 결합으로 인해 재생이 필요하지 않았다. '이중 리퍼런싱'에 의해 비아이밸류에이션 4.1을 이용하여 정상 상태 친화도 모델에 의해 데이터를 처리하였다.
BNJ441의 물리화학적 규명은 엔지니어링 및 GMP 뱃취를 사용하여 수행되고, 항체에 대한 아미노산 서열과 일치하는 것으로 나타났다. 이 실시예에 요약된 물리화학 데이터는 순도, 분자 크기, 동일성, 구조, 글라이코실화, 열안정성, 동역학 및 자기 결합을 포함하는 일련의 특성을 포함하고, BNJ441 벌크 약물 기질의 규명을 위한 기준으로서 작용하는 것으로 기대된다.
본 개시내용이 이의 구체적인 실시형태를 참조하여 기재되어 있지만, 본 개시내용의 진정한 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 이루어질 수 있고, 균등물이 치환될 수 있는 것으로 당해 분야의 당업자에 의해 이해되어야 한다. 또한, 본 개시내용의 객관적인 정신 및 범위에 특정한 상황, 재료, 물질의 조성물, 공정, 공정 단계 또는 단계를 적용하기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ALEXION PHARMACEUTICALS, INC. <120> ANTI-C5 ANTIBODIES HAVING IMPROVED PHARMACOKINETICS <130> AXJ-186PC <140> <141> <150> 61/949,932 <151> 2014-03-07 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Tyr Ile Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Gln 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Gly Ala Ser Glu 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Claims (18)

  1. 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    (a) 보체 성분 인간 C5에 결합하고;
    (b) 단편 C5a 및 C5b로의 C5의 절단을 저해하고;
    (c) (ⅰ) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (ⅱ) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (ⅲ) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (ⅳ) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (ⅴ) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (ⅵ) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하고, 여기서 (i)-(vi)의 적어도 하나의 아미노산은 히스티딘으로 치환되고, 상기 치환은 서열 번호 4의 8번 위치, 서열 번호 4의 10번 위치, 서열 번호 6의 3번 위치, 서열 번호 6의 6번 위치, 서열 번호 1의 2번 위치, 서열 번호 1의 9번 위치, 서열 번호 2의 3번 위치 및 서열 번호 2의 8번 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 있고;
    (d) 서열 번호 7의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 8의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 비교하여 개선된 특성을 가지고,
    여기서 개선된 특성은
    (i) 1nM 이하의 해리 상수(KD)로 pH 7.4 및 25℃에서 보체 성분 C5에 결합하는 것이거나;
    (ii) 10nM 이상의 KD로 pH 6.0 및 25℃에서 C5에 결합하는 것이거나;
    (iii) 25 이상의 [(pH 6.0 및 25℃에서의 C5에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KD)/(pH 7.4 및 25℃에서의 C5에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 KD)]이거나;
    (iv) 각각 서열 번호 7 및 8의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 비교하여 연장된 혈청 반감기인,
    단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 히스티딘으로의 치환이 서열 번호 4의 8번 위치 또는 10번 위치에서 이루어지는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 히스티딘으로의 치환이 서열 번호 6의 3번 위치 또는 6번 위치에서 이루어지는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 히스티딘으로의 치환이 서열 번호 1의 2번 위치 또는 9번 위치에서 이루어지는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 히스티딘으로의 치환이 서열 번호 2의 3번 위치 또는 8번 위치에서 이루어지는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 서열 번호 1의 2번 위치에서의 티로신이 히스티딘으로 치환되고, 서열 번호 2의 8번 위치에서의 세린이 히스티딘으로 치환되는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 인간에서 적어도 10일의 혈청 반감기를 가지는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 변이체 인간 Fc 불변 영역이 유래한 네이티브 인간 Fc 불변 영역의 친화도보다 큰 친화도로 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하는 변이체 인간 Fc 불변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항에 있어서, 각각 EU 넘버링에서, 428번 위치에서의 메티오닌 및 434번 위치에서의 아스파라긴을 포함하는 변이체 인간 Fc 불변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항에 있어서, 항체가 검출 가능한 시알산 잔기를 함유하지 않거나 CHO 세포에서 제조되는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 폴리펩티드를 코딩하고, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 폴리펩티드를 추가로 코딩하는 핵산.
  12. 제11항에 따른 핵산을 포함하는 벡터로서, 임의로 발현 벡터인 벡터.
  13. (i) 발현 벡터인, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 폴리펩티드를 코딩하고, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 폴리펩티드를 추가로 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터; 또는
    (ii) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터 및 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터
    를 포함하는 세포.
  14. 핵산에 의해 코딩된 항체 또는 항원 결합 단편의 세포에 의한 발현을 허용하기에 충분한 조건 하에 그리고 충분한 시간 동안 제13항의 세포를 배양하는 단계 및 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리시키는 단계를 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
  15. 약제학적으로 허용되는 담체 및 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 보체 관련 병태의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 보체 관련 병태는 류마티스 관절염, 항인지질 항체 증후군, 루프스 신염, 허혈-재관류 손상, 비정형 용혈성 요독 증후군, 정형 용혈성 요독 증후군, 발작성 야간혈색소 뇨증, 조밀침착병, 시신경 척수염, 다초점 운동 신경병증, 다발성 경화증, 황반변성, HELLP 증후군, 자연 유산, 혈전성 혈소판감소성 자반병, 소수면역 혈관염(Pauci-immune vasculitis), 수포성 표피박리증, 재발성 유산, 외상성 뇌 손상, 심근염, 뇌혈관 장애, 말초 혈관 장애, 신혈관 장애, 장간막/장 혈관 장애, 혈관염, 헤노흐-쇤라인 자색반 신장염(Henoch-Sch
    Figure 112022088370543-pat00090
    nlein purpura nephritis), 전신 홍반성 낭창 관련 혈관염, 류마티스 관절염을 수반한 혈관염, 면역 복합 혈관염, 타카야슈병(Takayasu's disease), 확장성 심근병증, 당뇨병 혈관증, 가와사키병(Kawasaki's disease), 정맥 가스 색전증, 스텐트 배치 후 재협착, 회전죽상반절제술, 경피적 관상동맥 확장술, 중증 근무력증, 한냉 응집소 질환, 피부근염, 발작성 한냉 혈색소뇨증, 항인지질 증후군, 그레이브병(Graves' disease), 죽상동맥경화증, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 전신 염증성 반응 패혈증, 패혈성 쇼크, 척수 손상, 사구체신염, 이식 거부, 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 1형 당뇨병, 건선, 천포창, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소성 자반병, 굿패스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome), 데고스병(Degos disease) 및 재해성 항인지질 증후군으로 이루어진 군으로부터 임의로 선택되는 것인 약제학적 조성물.
  16. (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 (ii) 인간에게 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 전달하기 위한 수단을 포함하고, 여기서 수단은 임의로 주사기인, 보체 관련 병태의 치료에 사용하기 위한 치료학적 키트로서, 보체 관련 병태는 류마티스 관절염, 항인지질 항체 증후군, 루프스 신염, 허혈-재관류 손상, 비정형 용혈성 요독 증후군, 정형 용혈성 요독 증후군, 발작성 야간혈색소 뇨증, 조밀침착병, 시신경 척수염, 다초점 운동 신경병증, 다발성 경화증, 황반변성, HELLP 증후군, 자연 유산, 혈전성 혈소판감소성 자반병, 소수면역 혈관염(Pauci-immune vasculitis), 수포성 표피박리증, 재발성 유산, 외상성 뇌 손상, 심근염, 뇌혈관 장애, 말초 혈관 장애, 신혈관 장애, 장간막/장 혈관 장애, 혈관염, 헤노흐-쇤라인 자색반 신장염(Henoch-Sch
    Figure 112022088370543-pat00091
    nlein purpura nephritis), 전신 홍반성 낭창 관련 혈관염, 류마티스 관절염을 수반한 혈관염, 면역 복합 혈관염, 타카야슈병(Takayasu's disease), 확장성 심근병증, 당뇨병 혈관증, 가와사키병(Kawasaki's disease), 정맥 가스 색전증, 스텐트 배치 후 재협착, 회전죽상반절제술, 경피적 관상동맥 확장술, 중증 근무력증, 한냉 응집소 질환, 피부근염, 발작성 한냉 혈색소뇨증, 항인지질 증후군, 그레이브병(Graves' disease), 죽상동맥경화증, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 전신 염증성 반응 패혈증, 패혈성 쇼크, 척수 손상, 사구체신염, 이식 거부, 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 1형 당뇨병, 건선, 천포창, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소성 자반병, 굿패스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome), 데고스병(Degos disease) 및 재해성 항인지질 증후군으로 이루어진 군으로부터 임의로 선택되는 것인 치료학적 키트.
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Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5624276B2 (ja) 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
EP4368721A2 (en) 2007-09-26 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
MY195714A (en) 2008-04-11 2023-02-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-Binding Molecule Capable of Binding to Two or More Antigen Molecules Repeatedly
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
KR102385507B1 (ko) 2010-11-30 2022-04-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복해서 결합하는 항원 결합 분자
CA2827923C (en) 2011-02-25 2021-11-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc.gamma.riib-specific fc antibody
TW201326209A (zh) 2011-09-30 2013-07-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
WO2013047748A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
RU2739792C1 (ru) 2011-11-30 2020-12-28 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Содержащий лекарственное средство переносчик в клетку для формирования иммунного комплекса
HUE041996T2 (hu) 2012-02-20 2019-07-29 Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ A C5 humán komplementhez kötõdõ polipeptidek
CN103382223B (zh) * 2012-04-01 2015-06-10 上海益杰生物技术有限公司 针对表皮生长因子受体隐蔽表位和t细胞抗原的多功能抗体多肽
KR102273985B1 (ko) 2012-08-24 2021-07-06 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ영역 개변체
DK2940135T5 (da) 2012-12-27 2021-09-20 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Heterodimeriseret polypeptid
CN113621057A (zh) 2013-04-02 2021-11-09 中外制药株式会社 Fc区变体
NZ631007A (en) * 2014-03-07 2015-10-30 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
WO2016063204A1 (en) * 2014-10-20 2016-04-28 Nestec S.A. Methods for prediction of anti-tnf alpha drug levels and autoantibody formation
WO2016094834A2 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method for treating a complement mediated disorder caused by an infectious agent in a patient
MA41294A (fr) 2014-12-19 2017-11-08 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticorps anti-myostatine, polypeptides contenant des variants de régions fc, et procédés d'utilisation
HUE056489T2 (hu) 2014-12-19 2022-02-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-C5 antitestek és alkalmazási eljárások
CN107428823B (zh) * 2015-01-22 2021-10-26 中外制药株式会社 两种以上抗-c5抗体的组合与使用方法
EP3253778A1 (en) 2015-02-05 2017-12-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof
KR101892883B1 (ko) 2015-02-27 2018-10-05 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-6 관련 질환 치료용 조성물
EP3274359B1 (en) * 2015-03-23 2022-11-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Virus filtration
WO2016160756A2 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Alexion Pharmaceuticlas, Inc. Identifying and treating subpopulations of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) patents
WO2016178980A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Efficacy of an anti-c5 antibody in the prevention of antibody mediated rejection in sensitized recipients of kindney thansplant
CN107683158B (zh) 2015-06-04 2021-05-14 麦迪麦珀医疗工程有限公司 用于药物释放装置的筒***
WO2017044811A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 Bruce Andrien Recombinant glycosylated eculizumab and eculizumab variants
WO2017048495A1 (en) 2015-09-14 2017-03-23 Children's Hospital Medical Center Methods and compositions for treatment of gaucher disease via modulation of c5a receptor
EP3359566A1 (en) 2015-10-07 2018-08-15 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method for treating age-related macular degeneration in a patient
IL258525B2 (en) 2015-10-07 2023-03-01 Apellis Pharmaceuticals Inc Dosing regimens
EP3368073B1 (en) 2015-10-30 2024-05-15 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method of inhibiting exacerbations of t cell-mediated allograft vasculopathy
EP3390442B1 (en) * 2015-12-18 2023-11-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
EP3395835B1 (en) * 2015-12-25 2021-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody having enhanced activity, and method for modifying same
EP3402816A1 (en) 2016-01-11 2018-11-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment
MA53248A (fr) * 2016-01-25 2022-02-16 Takeda Pharmaceuticals Co Anticorps anti-c5 à commutation ph améliorée
PL234632B1 (pl) * 2016-03-02 2020-03-31 Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Polskiej Akademii Nauk Przeciwciała oddziałujące z komórkami psich chłoniaków typu B i ich zastosowania
KR20190012199A (ko) * 2016-05-27 2019-02-08 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 난치성 전신 중증 근무력증의 치료를 위한 방법
US20190127453A1 (en) 2016-06-07 2019-05-02 Novartis Ag An anti-c5 antibody dosing regimen
MA45235A (fr) 2016-06-14 2019-04-17 Regeneron Pharma Anticorps anti-c5 et leurs utilisations
KR102226975B1 (ko) * 2016-06-17 2021-03-11 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-c5 항체 및 사용 방법
AU2017305073B2 (en) 2016-08-05 2024-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for prevention or treatment of IL-8 related diseases
EP3526250A1 (en) 2016-10-12 2019-08-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Efficacy of an anti-c5 antibody in the prevention of antibody mediated rejection in sensitized recipients of a kidney transplant
WO2018075758A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method of quantitating unbound c5 in a sample
US20200057046A1 (en) 2016-10-27 2020-02-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Assay for c5b-9 deposition in complement-associated disorders
WO2018109588A2 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 Samsung Bioepis Co., Ltd Stable aqueous anti-c5 antibody composition
US11608374B2 (en) 2017-01-30 2023-03-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-sclerostin antibodies and methods of use
IL307593A (en) * 2017-01-31 2023-12-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Pharmaceutical preparation for use in the treatment and prevention of C5-related diseases and methods for the treatment and prevention of C5-related diseases
AU2018230657A1 (en) * 2017-03-06 2019-09-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Anti-C5 antibodies and uses thereof
JP7247099B2 (ja) * 2017-03-31 2023-03-28 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ヒト血清または尿におけるａｌｘｎ１２１０およびエクリズマブの同時定量のための方法
KR20190139931A (ko) 2017-04-07 2019-12-18 아펠리스 파마슈티컬스 인코포레이티드 투여 요법 및 관련 조성물 및 방법
EP3612561A1 (en) 2017-04-19 2020-02-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Efficacy of an anti-c5 antibody in the prevention of antibody mediated rejection in sensitized recipients of a kidney transplant
WO2018200422A1 (en) 2017-04-24 2018-11-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibody immune cell inhibitor fusion proteins
JP7185884B2 (ja) 2017-05-02 2022-12-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
KR102078292B1 (ko) 2017-05-30 2020-02-19 주식회사 종근당 신규한 항 c-Met 항체 및 이의 용도
WO2019014360A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Alexion Pharmaceuticals, Inc. POLYPEPTIDES BINDING COMPONENT C5 OR SERUM ALBUMIN COMPONENT AND FUSION PROTEINS THEREOF
CN116271012A (zh) 2017-07-27 2023-06-23 瑞颂医药公司 高浓度抗c5抗体制剂
CN111278857A (zh) * 2017-10-04 2020-06-12 亚力兄制药公司 抗c5抗体治疗患有膜增生性肾小球肾炎的患者的剂量和施用
US20200254092A1 (en) * 2017-10-26 2020-08-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) and atypical hemolytic uremic syndrome (ahus)
WO2019112984A1 (en) * 2017-12-04 2019-06-13 Ra Pharmaceuticals, Inc. Modulators of complement activity
EP3724226A1 (en) 2017-12-13 2020-10-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-c5 antibody combinations and uses thereof
WO2019126421A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 West Pharma. Services Il., Ltd. Injector usable with different dimension cartridges
WO2019143761A1 (en) * 2018-01-17 2019-07-25 Children's Hospital Medical Center Compositions and methods for treatment of hunter's syndrome
JP2021525718A (ja) * 2018-05-31 2021-09-27 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 小児患者における発作性夜間ヘモグロビン尿症（ｐｎｈ）の治療のための抗ｃ５抗体の用量および投与
EP3802603A1 (en) 2018-06-04 2021-04-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of atypical hemolytic uremic syndrome (ahus) in pediatric patients
MA52969A (fr) * 2018-06-19 2021-04-28 Atarga Llc Molécules d'anticorps se liant au composant du complément 5 et leurs utilisations
US20210122806A1 (en) * 2018-06-28 2021-04-29 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing anti-c5 antibodies
EP3841086A4 (en) 2018-08-20 2022-07-27 Achillion Pharmaceuticals, Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF MEDICAL DISORDERS RELATED TO COMPLEMENT FACTOR D
CA3111396A1 (en) * 2018-09-06 2020-03-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Humanized anti-c5 antibodies and uses thereof
WO2020058759A1 (en) 2018-09-17 2020-03-26 Kyoto University Administration of an anti-c5 agent for treatment of hepatic injury or failure
WO2020061496A1 (en) 2018-09-21 2020-03-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Eculuzimab for the treatment of neuromyelitis opticae
CN113164544A (zh) * 2018-10-12 2021-07-23 三钰生物科技股份有限公司 双功能性融合蛋白及其用途
WO2020092546A1 (en) 2018-10-30 2020-05-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Co-administration of a hyaluronidase and anti-c5 antibody for treatment of complement-associated conditions
EA202191189A1 (ru) * 2018-10-30 2021-08-06 Алексион Фармасьютикалс, Инк. Подкожное введение и дозировка антител к c5 для лечения пароксизмальной ночной гемоглобинурии (пнг)
US20220002393A1 (en) 2018-11-20 2022-01-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of refractory generalized myasthenia gravis in pediatric patients
DK3914617T3 (da) 2019-01-25 2024-05-27 Alexion Pharmaceuticals Inc Dosering og administration af anti-c5-antistoffer til behandling af atypisk hæmolytisk uræmisk syndrom (ahus)
US11642470B2 (en) * 2019-02-11 2023-05-09 West Pharma. Services IL, Ltd. Anti-C5 antibody dispensing injector and method of injection
CN113614106A (zh) 2019-02-14 2021-11-05 亚力兄制药公司 抗c5抗体用于治疗全身型重症肌无力的剂量和施用
WO2020219922A1 (en) * 2019-04-24 2020-10-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Bi-functional humanized anti-c5 antibodies and factor h fusion proteins and uses thereof
US20220227851A1 (en) 2019-05-24 2022-07-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating vitiligo using an anti-c5 antibody
WO2021026160A1 (en) 2019-08-05 2021-02-11 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of refractory generalized myasthenia gravis with eculizumab
US20220356234A1 (en) 2019-10-02 2022-11-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Complement inhibitors for treating drug-induced complement-mediated response
EP4054634A1 (en) 2019-11-08 2022-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. High concentration anti-c5 antibody formulations
AU2020401102A1 (en) 2019-12-09 2022-07-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anti-C5 antibody for the treatment of neuromyelitis optica spectrum disorder
WO2021133660A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating pregnancy-associated atypical hemolytic uremic syndrome using an anti-c5 antibody
EP4135837A1 (en) 2020-04-16 2023-02-22 Assistance Publique, Hopitaux De Paris Methods for treating a complement mediated disorder caused by viruses
BR112022021136A2 (pt) 2020-04-30 2022-11-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de fator b de complemento (cfb) e métodos de uso das mesmas
US20230172930A1 (en) 2020-05-12 2023-06-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of complement factor d inhibitors alone or in combination with anti-c5 antibodies for treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
CN115667925A (zh) 2020-05-15 2023-01-31 阿雷克森制药公司 使用细胞外囊泡来检测补体激活的方法以及其用于评估和/或监测补体介导的疾病的治疗的用途
CN113754763B (zh) * 2020-06-05 2024-03-08 天辰生物医药(苏州)有限公司 分离的抗原结合蛋白及其用途
WO2021262329A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Subcutaneous (sc) administration of anti-c5 antibodies for treatment of complement-associated conditions
WO2021263056A1 (en) * 2020-06-25 2021-12-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
JP2023533030A (ja) 2020-07-09 2023-08-01 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 小児患者において発作性夜間血色素尿症（ｐｎｈ）を治療するための抗ｃ５抗体の投薬量及び投与
JP2023539047A (ja) 2020-08-13 2023-09-13 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 造血幹細胞移植関連血栓性微小血管症（ｈｓｃｔ－ｔｍａ）を処置するための抗ｃ５抗体の用量及び投与
JP2023542521A (ja) 2020-09-21 2023-10-10 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ループス腎炎（ｌｎ）及び／又はｉｇａ腎症（ｉｇａｎ）を含むｃ５媒介性糸球体腎炎（ｇｎ）の治療のための抗ｃ５抗体の投与量及び投与
WO2022087339A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating patients having complement disorders using anti-c5 antibodies
AU2021397693A1 (en) * 2020-12-07 2023-07-13 Invetx, Inc. Compositions for increasing half-life of a therapeutic agent in livestock animals and methods of use
CN114149501B (zh) * 2020-12-11 2023-05-26 天士力生物医药股份有限公司 抗c5抗体及其应用
EP4267612A1 (en) * 2020-12-25 2023-11-01 The Trustees of the University of Pennsylvania Humanized anti-c5 antibodies and factor h fusion proteins and uses thereof
EP4281472A1 (en) 2021-01-22 2023-11-29 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating complement mediated thrombotic microangiopathy using an anti-c5 antibody
WO2022251446A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for detecting cm-tma biomarkers
WO2022265915A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treating dermatomyositis (dm)
WO2023287991A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of myasthenia gravis
WO2023023220A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating sickle cell disease or beta thalassemia using a complement alternative pathway inhibitor
WO2023044048A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Novartis Ag Methods for prevention of graft rejection in xenotransplantation
TW202333749A (zh) 2021-10-29 2023-09-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 補體因子ｂ（ｃｆｂ）ｉｒｎａ組成物及其使用方法
WO2024054436A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Diagnostic and prognostic biomarker profiles in patients with hematopoietic stem cell transplant-associated thrombotic microangiopathy (hsct-tma)
WO2024054408A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Supplemental dosage and administration of anti-c5 antibodies for treating hematopoietic stem cell transplant-associated thrombotic microangiopathy (hsct-tma)
WO2024072798A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for preventing or minimizing cardiac surgery associated acute kidney injury (csa-aki) and/or subsequent major adverse kidney events (make) in patients with chronic kidney disease
CN116712390B (zh) * 2023-08-04 2023-11-14 上海览屹医药科技有限公司 一种高浓度高稳定性的抗体制剂及其制备方法

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
AU6131086A (en) 1985-07-05 1987-01-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Epithelial cells expressing foreign genetic material
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
JP2703764B2 (ja) * 1986-04-28 1998-01-26 シータス オンコロジー コーポレイション 補体成分Ｃ５ａに対するモノクローナル抗体
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4863457A (en) 1986-11-24 1989-09-05 Lee David A Drug delivery device
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
EP0378576B1 (en) 1987-09-11 1995-01-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Transduced fibroblasts and uses therefor
WO1989005345A1 (en) 1987-12-11 1989-06-15 Whitehead Institute For Biomedical Research Genetic modification of endothelial cells
WO1989007136A2 (en) 1988-02-05 1989-08-10 Whitehead Institute For Biomedical Research Modified hepatocytes and uses therefor
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5164188A (en) 1989-11-22 1992-11-17 Visionex, Inc. Biodegradable ocular implants
WO1992007573A1 (en) 1990-10-31 1992-05-14 Somatix Therapy Corporation Genetic modification of endothelial cells
KR0185215B1 (ko) 1990-11-30 1999-05-01 요시다 쇼오지 서방성 안구삽입용 약제
GB9026191D0 (en) 1990-12-01 1991-01-16 Harris Pharma Ltd Breath actuated dispensing device
EP0590067A1 (en) 1991-06-14 1994-04-06 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
CA2137667A1 (en) 1992-07-23 1994-02-03 Todd A. Berg Shaped abrasive particles and method of making same
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
DE69334305D1 (de) 1992-08-21 2010-01-28 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne leichte Ketten
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
IT1265573B1 (it) 1993-09-17 1996-11-22 Zanussi Grandi Impianti Spa Forno di cottura di alimenti con porta perfezionata
US5308341A (en) 1993-09-28 1994-05-03 Becton, Dickinson And Company Method of testing the dose accuracy of a medication delivery device
US5443505A (en) 1993-11-15 1995-08-22 Oculex Pharmaceuticals, Inc. Biocompatible ocular implants
ES2218543T3 (es) 1994-03-07 2004-11-16 Nektar Therapeutics Procedimiento y preparacion para la administracion de insulina por via pulmonar.
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
DK0859841T3 (da) 1995-08-18 2002-09-09 Morphosys Ag Protein/(poly)peptidbiblioteker
US5773019A (en) 1995-09-27 1998-06-30 The University Of Kentucky Research Foundation Implantable controlled release device to deliver drugs directly to an internal portion of the body
ATE279947T1 (de) 1996-03-18 2004-11-15 Univ Texas Immunglobulinähnliche domäne mit erhöhten halbwertszeiten
AU3117697A (en) 1996-05-06 1997-11-26 Uab Research Foundation, The Radiolabeled fusion toxins for cancer therapy
US6146361A (en) 1996-09-26 2000-11-14 Becton Dickinson And Company Medication delivery pen having a 31 gauge needle
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
GB9626960D0 (en) 1996-12-27 1997-02-12 Glaxo Group Ltd Valve for aerosol container
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
WO1998047531A2 (en) 1997-04-21 1998-10-29 Arch Development Corporation Fc receptor non-binding anti-cd3 monoclonal antibodies deliver a partial tcr signal and induce clonal anergy
NZ504021A (en) 1997-10-17 2003-04-29 Systemic Pulmonary Delivery Lt Method and apparatus for delivering aerosolized medication having air discharged through air tube directly into plume of aerosolized medication
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6302855B1 (en) 1998-05-20 2001-10-16 Novo Nordisk A/S Medical apparatus for use by a patient for medical self treatment of diabetes
BR0008758A (pt) 1999-01-15 2001-12-04 Genentech Inc Variantes de polipeptìdeos parentais com funçãoefetora alterada, polipeptìdeos, composição ácidonucleico isolado, vetor, célula hospedeira,método para produzir uma variante depolipeptìdeo, método para o tratamento de umadesordem em mamìferos e método para produziruma região fc variante
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2000061178A1 (en) 1999-04-13 2000-10-19 Inhale Therapeutics Systems, Inc. Pulmonary administration of dry powder formulations for treating infertility
TWI277425B (en) 1999-04-13 2007-04-01 Lilly Co Eli Pulmonary administration of dry powder formulations for treating infertility
US6192891B1 (en) 1999-04-26 2001-02-27 Becton Dickinson And Company Integrated system including medication delivery pen, blood monitoring device, and lancer
GB9910975D0 (en) 1999-05-13 1999-07-14 Univ Strathclyde Rapid dehydration of proteins
US6277099B1 (en) 1999-08-06 2001-08-21 Becton, Dickinson And Company Medication delivery pen
PE20011227A1 (es) 2000-04-17 2002-01-07 Chiesi Farma Spa Formulaciones farmaceuticas para inhaladores de polvo seco en la forma de aglomerados duros
DE60135352D1 (de) 2000-08-30 2008-09-25 Univ Johns Hopkins Vorrichtung zur intraokularen wirkstoffverabreichung
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
ATE360441T1 (de) * 2001-08-17 2007-05-15 Tanox Inc Komplement-inhibitoren die an c5 und c5a binden ohne die bildung von c5b zu hemmen
CA2460063C (en) 2001-09-12 2010-07-20 Becton, Dickinson And Company Microneedle-based pen device for drug delivery and method for using same
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
WO2003105757A2 (en) 2002-06-12 2003-12-24 Genencor International, Inc. Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target
US20050271660A1 (en) 2002-09-06 2005-12-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Nebulization of monoclonal antibodies for treating pulmonary diseases
US9415102B2 (en) 2002-09-06 2016-08-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. High concentration formulations of anti-C5 antibodies
US20040102469A1 (en) 2002-09-13 2004-05-27 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Method for reducing the mortality rate
GB0222023D0 (en) 2002-09-21 2002-10-30 Aventis Pharma Ltd Inhaler
EP2042517B1 (en) 2002-09-27 2012-11-14 Xencor, Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
FR2849436B1 (fr) 2002-12-27 2007-01-05 Patrick Frayssinet Particules et ceramiques de phosphates de calcium pour transfection in vivo et in vitro
US20060167435A1 (en) 2003-02-18 2006-07-27 Adamis Anthony P Transscleral drug delivery device and related methods
CA2534077A1 (en) 2003-07-29 2005-02-10 Morphotek Inc. Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with enhanced effector function
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
US20050249723A1 (en) 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
AU2005227326B2 (en) 2004-03-24 2009-12-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
US8685435B2 (en) 2004-04-30 2014-04-01 Allergan, Inc. Extended release biodegradable ocular implants
US7919094B2 (en) 2004-06-10 2011-04-05 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
GB0416328D0 (en) 2004-07-21 2004-08-25 Univ Cardiff Use of dry powder compositions for pulmonary delivery
WO2006031994A2 (en) 2004-09-14 2006-03-23 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin fc domains
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
EP2845865A1 (en) 2004-11-12 2015-03-11 Xencor Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
WO2006094234A1 (en) 2005-03-03 2006-09-08 Xencor, Inc. Methods for the design of libraries of protein variants
EP1871808A2 (en) 2005-03-31 2008-01-02 Xencor, Inc. Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES
WO2007041635A2 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
CA2634131C (en) 2005-12-21 2014-02-11 Wyeth Protein formulations with reduced viscosity and uses thereof
PL1988882T3 (pl) 2006-03-02 2015-04-30 Alexion Pharma Inc Wydłużanie przeżycia alloprzeszczepu poprzez inhibowanie aktywności dopełniacza
SI2359834T1 (sl) * 2006-03-15 2017-02-28 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Zdravljenje pacientov,ki imajo paroksizmalno nočno hemoglobinurijo, z zaviralcem komplementa
JP5624276B2 (ja) 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
US8037880B2 (en) 2006-04-07 2011-10-18 The University Of Western Ontario Dry powder inhaler
US20100034194A1 (en) 2006-10-11 2010-02-11 Siemens Communications Inc. Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks
WO2008048545A2 (en) 2006-10-16 2008-04-24 Medimmune, Llc. Molecules with reduced half-lives, compositions and uses thereof
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
CN101848733A (zh) 2007-07-13 2010-09-29 艾博特生物技术有限公司 用于肺部给予TNFα抑制剂的方法和组合物
EP4368721A2 (en) 2007-09-26 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
WO2009086320A1 (en) 2007-12-26 2009-07-09 Xencor, Inc Fc variants with altered binding to fcrn
MY195714A (en) 2008-04-11 2023-02-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-Binding Molecule Capable of Binding to Two or More Antigen Molecules Repeatedly
EP3524620A1 (en) 2008-10-14 2019-08-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
LT2894165T (lt) * 2008-11-10 2023-03-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Būdai ir kompozicijos, skirti su komplementu susijusių sutrikimų gydymui
WO2010151526A1 (en) * 2009-06-23 2010-12-29 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antibodies that bind to complement proteins
KR20120130748A (ko) * 2009-11-05 2012-12-03 알렉시온 캠브리지 코포레이션 발작성 야간 혈색소뇨증, 용혈성 빈혈, 및 혈관내 및 혈관외 용혈을 수반한 질환 상태의 치료
SG10201507722QA (en) * 2010-03-11 2015-10-29 Rinat Neuroscience Corp ANTIBODIES WITH pH DEPENDENT ANTIGEN BINDING
TWI667257B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
EP2824111B1 (en) * 2010-04-30 2017-03-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anti-C5A Antibodies and Methods for Using the Antibodies
WO2011137362A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 Rother Russell P Antibodies having reduced immunogenicity in a human
KR102385507B1 (ko) 2010-11-30 2022-04-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복해서 결합하는 항원 결합 분자
WO2012088247A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Medimmune, Llc Anti-c5/c5a/c5adesr antibodies and fragments
DK2698431T3 (da) 2011-03-30 2020-11-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Opretholdelse af antigen-bindende molekyler i blodplasma og fremgangsmåde til modifikation af immunogenicitet
WO2013047748A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
TW201326209A (zh) 2011-09-30 2013-07-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
ES2746103T3 (es) * 2012-04-30 2020-03-04 Medimmune Llc Moléculas con función efectora reducida y semividas prolongadas, composiciones y usos de las mismas
NZ631007A (en) * 2014-03-07 2015-10-30 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
WO2016160756A2 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Alexion Pharmaceuticlas, Inc. Identifying and treating subpopulations of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) patents
WO2016178980A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Efficacy of an anti-c5 antibody in the prevention of antibody mediated rejection in sensitized recipients of kindney thansplant
EP3368073B1 (en) 2015-10-30 2024-05-15 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method of inhibiting exacerbations of t cell-mediated allograft vasculopathy
MA45235A (fr) * 2016-06-14 2019-04-17 Regeneron Pharma Anticorps anti-c5 et leurs utilisations
EP3526250A1 (en) 2016-10-12 2019-08-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Efficacy of an anti-c5 antibody in the prevention of antibody mediated rejection in sensitized recipients of a kidney transplant

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nat. Biotechnol., 28(2):157-159(2010)

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US9107861B1 (en) 2015-08-18
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HUE030944T2 (en) 2017-06-28

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