KR102078292B1 - 신규한 항 c-Met 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 간 세포 성장 인자 수용체 (c-Met)에 특이적으로 결합하는 신규 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 항체는 적은 양으로도 우수한 암 세포 증식 저해 활성 및 현저히 우수한 항암활성을 나타내어 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

신규한 항 c-Met 항체 및 이의 용도 {A novel anti c-Met antibody and use thereof}
본 발명은 인간 간 세포 성장 인자 수용체 (c-Met)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
RTK (Receptor tyrosine kinases)는 세포 성장, 분화, 신혈관 형성, 조직 복구 등에 중요한 조절자로서 작용한다. 이와 같은 일반적인 생리과정 외에도, 특정 RTK의 비정상적인 발현은 많은 종류의 암의 발생 (development) 및 진행 (progression)과 관련이 있다. 따라서 이러한 RTK는 암 치료를 위한 유망한 약물 타겟으로 여겨져 왔다.
HGFR (Hepatocyte growth factor receptor; c-Met)은 RTK의 일종으로 HGF/SF (scatter factor로 알려진 hepatocyte growth factor)에 대한 세포 표면의 수용체이다 (Laird AD et al., Expert. Opin. Investig. Drugs 12: 51-64 (2003)). HGF에 의한 비정상적인 c-Met의 활성화는 종양 발생의 대표적인 기전 중 하나로 종양의 증식, 세포 자멸사의 저해, 신생 혈관의 형성, 침습 및 전이 등과 관련된 것으로 알려져 있다 (Bottaro DP et al., Science 251: 802-804 (1991), Day RM et al., Oncogene 18: 3399-3406 (1999)). 또한, c-Met의 변이 및 증폭에 의한 c-Met의 비정상적인 활성화는 폐암, 대장암, 두경부암, 위암, 유방암 등 다양한 암에 관련되어 있으며, 종양의 공격성 증가 및 불량한 예후와 관련된 것으로 보고되고 있다 (Lefebvre J et al., FASEB J 26: 1387-1399 (2012), Liu X et al., Trends Mol Med 16: 37-45 (2010), Smolen GA et al., Proc Natl Acad Sci USA 103: 2316-2321 (2006), Foveau B et al., Mol Biol Cell 20: 2495-2507 (2009)).
따라서, c-Met은 이와 같은 다양한 암을 치료하기 위한 표적 항원으로서 주목받고 있으며, c-Met의 발현 및 활성을 억제하기 위한 다양한 접근방법들이 시도되고 있다. 현재까지 알려진 c-Met 특이적인 저분자 타이로신 키나제 억제제 (small molecule tyrosine kinase inhibitor)는 Tivantinib (ArQule), INC280 (Novatis), AMG337 (Amgen) 등이 있으며, c-Met의 리간드인 HGF 특이적인 단일클론 항체로는 Rilotumumab (Amgen), Ficlatuzumab (AVEP Pharmaceuticals), HuL2G7 (Galaxy Biotech) 등이 개발되고 있다. 또한, c-Met을 표적으로 하는 길항제 단일클론 항체는 임상 3 상의 Genentech에서 개발 중인 Onartuzumab (WO 2006/015371), 임상 2 상 중인 Lilly사의 Emibetuzumab (WO 2010/059654), 임상 1 상 개발 중인 SAIT-301 (US 2014154251), ABT-700 (Wang J et al., BMC Cancer. 16: 105-118(2016)) 등이 있다. Onartuzumab의 경우, c-Met에 작용제로 작용하는 이가 단일클론 항체 (5D5)로부터 유래된 일가 길항성 항체이다 (Mark Merchant, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 110(32): E2987-E299 (2013)). 이와 같이 c-Met에 대한 다양한 약물들이 개발되어 왔으나, 상술한 바와 같이 c-Met은 다양한 암의 발생 및 진행에 관련되어 있으므로, c-Met을 표적으로 하여 암을 치료할 수 있는 새로운 치료제 개발이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 c-Met에 특이적으로 결합하는 신규 항체를 개발하고자 예의 노력한 결과, c-Met에 높은 친화력으로 결합하는 신규한 항 c-Met 항체를 개발하고, 이러한 항 c-Met 항체, 이의 키메라, 인간화 및 친화도 최적화 항체가 종양 세포의 증식을 현저히 저해시킬 뿐 아니라, 항암 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 간 세포 성장 인자 수용체 (c-Met)에 특이적으로 결합하는 항체, 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 숙주 세포, 상기 숙주 세포를 이용한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 c-Met 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이들을 이용한 c-Met 항원을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 간 세포 성장 인자 수용체(c-Met)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
본 발명의 c-Met에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 c-Met에 높은 친화도로 결합하여 이의 발현 또는 활성을 억제함으로써 우수한 종양 세포 증식 억제 활성을 나타내므로, 항체 단독 또는 통상의 약제학적으로 허용되는 담체, 기타 항암제, 항암 보조제 등과 함께 암의 예방 또는 치료를 위한 항암 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 그 예로, 단일클론항체, 다클론항체, 전장항체 (full-length antibody) 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한 상기 용어는 이가 (bivalent) 또는 이중 특이성 분자 (예컨대, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명에서 용어, "전장항체"는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마 (γ), 뮤 (μ), 알파 (α), 델타 (δ) 및 엡실론 (ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1 (γ1), 감마2 (γ2), 감마3 (γ3), 감마4 (γ4), 알파1 (α1) 및 알파2 (α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파 (κ) 및 람다 (λ) 타입을 가진다. IgG는 아형 (subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 발명에서 용어, "단편", "항체 단편" 및 "항원 결합 단편"은 항체의 항원결합 기능을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역 (CH1 도메인)을 가지는 구조로 1 개의 항원 결합 부위를 가진다. 항체 분자의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344 등에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv (two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv (single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있음), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
구체적으로 본 발명에 있어, 상기 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체는,
(a) 서열번호 1로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 3으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 9로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(b) 서열번호 4로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 10으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 11로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 12로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체, 또는
(c) 이들의 친화도 최적화 항체일 수 있다.
본 발명에서 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 항체는 마우스로부터 생산된 마우스 항체 및 이로부터 항체의 친화도, 면역성 등을 개선시키기 위해 모항체의 아미노산 서열에 일부를 치환, 부가 및/또는 결실시킨 변이체를 모두 포함할 수 있다. 상기 변이체는 이에 제한되지 않으나, 그 예로 키메라 항체, 인간화 항체, 친화도 최적화 항체 등을 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 변이체는 모항체와 동일한 CDR을 포함하거나, 혹은 동일한 에피토프를 표적으로 하는 조건으로 모항체 CDR 아미노산 서열의 일부가 변이 (치환, 부가 또는 결실)된 항체를 포괄적으로 지칭한다. 이러한 변이체는 동일한 에피토프에 대한 결합능이 유지되는 범위 내에서 항체의 친화도 및 면역성 등을 개선시키기 위하여 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
다시 말해서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 c-Met을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항 c-Met 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
본 발명에서 용어, "키메라항체"는 생쥐 항체의 가변영역 및 인간 항체의 불변영역을 재조합 시킨 항체로서, 생쥐 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
본 발명에서 용어, "인간화 항체"는 인간이 아닌 종에서 유래한 항체의 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체와 유사하도록 변형시킨 항체를 의미한다. 그 예로 상기 인간화 항체는 생쥐 유래의 CDR을 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변영역을 제조하고 이를 바람직한 인간 항체의 불변 영역과 재조합시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다. 다만, 단순히 CDR 그래프팅만을 할 경우, 인간화 항체의 친화도가 떨어지게 되므로, CDR의 3 차원 구조에 영향을 줄 것으로 생각되는 몇 개의 중요한 FR 아미노산 잔기를 생쥐 항체의 것으로 친화시킴으로써 원래 생쥐 항체의 친화도와 같은 수준으로 올릴 수 있다.
본 발명에서 용어, "친화도 최적화 항체"는 특정 항체의 CDR 서열의 일부가 치환, 부가, 결실된 변이체로서, 상기 특정 항체와 동일한 항원 에피토프에 결합하면서도 항원에 대한 결합 친화도가 향상된 항체를 말한다. 구체적으로, 본 발명의 친화도 최적화 항체는 본 발명의 (a) 서열번호 1로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 3으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 9로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 또는 (b) 서열번호 4로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 10으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 11로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 12로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 변이체 항체를 말한다. 통상의 기술자는 특정된 경쇄 및 중쇄 CDR 서열을 기반으로 공지된 기술을 이용하여 상기 친화도 최적화 항체를 제조할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 친화도 최적화 항체는 파지 디스플레이를 통하여 제조될 수 있다. 본 발명에서 용어, "파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 항체는 (a) 서열번호 13으로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 15로 기재된 중쇄 가변영역; 또는 (b) 서열번호 14로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 16으로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다. 일례로, 상기 항체는 (a) 서열번호 17로 기재된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 19로 기재된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄 가변영역; 또는 (b) 서열번호 18로 기재된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 20으로 기재된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 인간의 c-Met Sema domain/Fc 융합 단백질을 항원으로 하여 마우스로부터 하이브리도마 세포군을 확보하였으며, 이들로부터 c-Met/His 융합 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석방법을 통해 스크리닝을 수행함으로써, c-Met에 특이적으로 결합하는 항 c-Met 항체를 선별하였다. 상기 선별된 항체 및 이의 키메라 항체는 이미 공지되어 시판 중인 LY2875358 및 OA-5D5와 비교하더라도 대등하거나 더욱 우수한 종양 세포 증식 저해 활성을 가지므로 (표 3 및 도 1), 암의 예방 또는 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 항체는
(a) 서열번호 21로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 23으로 기재된 중쇄 가변영역; (b) 서열번호 22로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 24로 기재된 중쇄 가변영역; (c) 서열번호 29로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 31로 기재된 중쇄 가변영역; 또는 (d) 서열번호 30으로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 32로 기재된 중쇄 가변영역;을 포함하는 것일 수 있다. 일예로, 상기 항체는 (a) 서열번호 25로 기재된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 27로 기재된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄 가변영역; (b) 서열번호 26으로 기재된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 28로 기재된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄 가변영역; (c) 서열번호 33으로 기재된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 35로 기재된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄 가변영역; 또는 (d) 서열번호 34로 기재된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 36으로 기재된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄 가변영역;을 포함하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 항체는 서열번호 37 내지 서열번호 44 중 어느 하나로 기재된 힌지 (hinge) 영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 파지디스플레이 선별을 통해 확보된 항체의 CDR을 포함하는 인간화 항체를 제조하였으며, 이들 항체가 본 발명의 키메라 항체 대비 유사한 수준의 항암 활성을 나타내는 것을 확인하였다 (실시예 2 및 실시예 3). 또한 본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는, 힌지 영역 서열에 따른 항체의 종양 세포 증식 저해 활성을 평가하였으며, 힌지 서열의 차이에 따라 활성에 다소 차이는 있었으나, 대부분 종양 세포의 증식을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다 (표 7).
본 발명의 또 다른 구현예로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 인간화 항체에 대한 친화도 최적화 항체는, 서열번호 1로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 3으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 9로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체에서 적어도 하나의 아미노산 서열이 치환된 항체로서, (i) 경쇄 CDR1의 1번째 위치의 G가 A, E, K, L, N, R, S, V 또는 W; 2번째 위치의 A가 C, G, I, P, S, T 또는 V; 3번째 위치의 S가 G, M, N, P, Q, R, S 또는 T; 4번째 위치의 E가 A, D, F, G, H, K, M, Q, R, S, T 또는 V; 5번째 위치의 N이 A, D, E, G, K, L, P, Q, R, S, T 또는 V; 6번째 위치의 I가 A, F, L, M, Q, R, S, T 또는 V; 7번째 위치의 Y가 F, H, R 또는 V; 또는 8번째 위치의 G가 D, F, H, M, N, R, S, T 또는 V로 치환; (ii) 경쇄 CDR2의 1번째 위치의 G가 D, F, H, K, P, Q, S, V 또는 Y; 3번째 위치의 T가 Q; 또는 4번째 위치의 N이 G로 치환; (iii) 경쇄 CDR3의 1번째 위치의 Q가 E, G, I, M 또는 N; 2번째 위치의 N이 A, D, E, H, L, Q, S 또는 T; 3번째 위치의 V가 I, L, M, N, Q, S 또는 T; 4번째 위치의 L이 F, H, I, M, R, S, V, W 또는 Y; 5번째 위치의 S가 C, D, E, F, G, H, K, L, N, Q, R, T, V 또는 Y; 6번째 위치의 S가 D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V 또는 Y; 7번째 위치의 P가 A, D, E, G, N, Q, S 또는 V; 8번째 위치의 Y가 E, F, L, M 또는 Q; 또는 9번째 위치의 T가 D, F, G, I, L, N, S, V, W 또는 Y로 치환; (iv) 중쇄 CDR1의 1번째 위치의 D가 G 또는 Q; 2번째 위치의 Y가 Q; 또는 4번째 위치의 I가 A 또는 Q로 치환; (v) 중쇄 CDR2의 3번째 위치의 F가 D, E, W 또는 Y; 5번째 위치의 G가 D, H 또는 Y; 6번째 위치의 S가 F, P, W 또는 Y; 7번째 위치의 G가 A, F, L, N 또는 T; 8번째 위치의 N이 F, P, S, T 또는 Y; 9번째 위치의 T가 A, D, E, F, G, H, L, P, S 또는 V; 10번째 위치의 H가 A, D, F, M, R, S, T, V, W 또는 Y; 11번째 위치의 F가 G, H, I, L, M, N, P, Q, V 또는 Y; 12번째 위치의 S가 A, D, G, H, I, L, P, T 또는 V; 13번째 위치의 A가 D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, R, S, T, V 또는 Y; 14번째 위치의 R이 A, E, G, H, L, N, P, Q, S, W 또는 Y; 15번째 위치의 F가 D, E, G, L, M, P, R, S, V 또는 W; 16번째 위치의 K가 A, E, F, G, H, L, R, S, T, V 또는 Y; 또는 17번째 위치의 G가 E, F, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로 치환; 또는 (vi) 중쇄 CDR3의 1번째 위치의 G가 E, F, H, N, Q, V 또는 W; 2번째 위치의 D가 E; 3번째 위치의 Y가 L, Q, T 또는 V; 4번째 위치의 G가 W; 5번째 위치의 F가 L 또는 Y; 6번째 위치의 L이 Q, S 또는 Y; 또는 7번째 위치의 Y가 C, L, M, N 또는 Q로 치환된 것일 수 있다. 여기서 경쇄 CDR1은 0 내지 5개, 경쇄 CDR2는 0 내지 1개, 경쇄 CDR3는 0 내지 7개, 중쇄 CDR1은 0 내지 1개, 중쇄 CDR2는 0 내지 11개, 및 중쇄 CDR3는 0 내지 6개의 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 친화도 최적화 항체는 구체적으로, 서열번호 1, 및 서열번호 229 내지 268 중 어느 하나로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 2, 서열번호 182 내지 190, 서열번호 227 및 서열번호 228 중 어느 하나로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 3, 서열번호 142 내지 181, 서열번호 191 내지 226, 및 서열번호 269 내지 301 중 어느 하나로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 7, 및 서열번호 108 내지 112 중 어느 하나로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 8, 서열번호 54 내지 63, 서열번호 72 내지 107, 및 서열번호 118 내지 141 중 어느 하나로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 9, 서열번호 64 내지 71, 및 서열번호 113 내지 117 중 어느 하나로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 서열번호 21, 및 306 내지 311 중 어느 하나로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 23, 및 302 내지 305 중 어느 하나로 기재된 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 보다 더 구체적으로, (a) 서열번호 21로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 302로 기재된 중쇄 가변영역; (b) 서열번호 21로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 305로 기재된 중쇄 가변영역; (c) 서열번호 310로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 23으로 기재된 중쇄 가변영역; (d) 서열번호 308로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 305로 기재된 중쇄 가변영역; (e) 서열번호 306으로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 303으로 기재된 중쇄 가변영역; (f) 서열번호 307로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 304로 기재된 중쇄 가변영역; (g) 서열번호 308로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 304로 기재된 중쇄 가변영역; (h) 서열번호 309로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 304로 기재된 중쇄 가변영역; (i) 서열번호 311로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 304로 기재된 중쇄 가변영역; 또는 (j) 서열번호 306으로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 302로 기재된 중쇄 가변영역;을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적 일 실시예에서는 상기 인간화 항체보다 친화도가 향상된 항체를 선별하기 위하여 경쟁적 선별 방법을 사용하였으며, 이를 통해 다수의 친화도 최적화 항체를 확보하였다 (표 8 내지 표 10, 및 표 12). 상기 친화도 최적화 항체는 인간화 항체 대비 4.3 내지 28.5 배 우수한 종양 세포 증식 저해 효과를 갖는다 (표 11, 표 13 및 도 3).
본 발명에서 상기 항체는, c-Met에 특이적으로 결합하는 것 외에, 추가로 표피성장인자수용체 (EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.
EGFR (Epidermal growth factor receptor)은 ErbB 타이로신 키나제 중의 하나로 비소세포폐암종을 포함한 많은 상피 세포 종양에서 비정상적으로 활성화되어 있고, 세포 증식, 침범, 전이, 혈관 형성을 일으키며 세포 생존을 증가시킨다고 알려져 있다. 대표적인 폐암 치료제로 EGFR 타이로신 키나제 억제제인 gefitinib (Iressa), elotinib (Tarceva) 및 osimertinib (Tagrisso); 대장암 치료제로 EGFR 타겟 항체인 cetuximab (Erbitux)과 panitumumab (Vectibix)가 사용되고 있다 (Yewale C et al., Biomaterials. 2013 34(34):8690-707 (2013), Deric L. Wheeler et al., Nature Reviews Clinical Oncology 7, 493-507 (2010)).
이러한 EGFR 타겟 치료제는 치료 1 년 전후 저항성이 발생하게 되는데 주요 저항성 기전으로 c-Met의 증폭, 변이 및 HGF에 의한 활성화가 알려져 있다 (Simona Corso Cancer Discovery 3:978-992 (2013), Curtis R Chong et al., Nature Medicine 19, 1389-1400 (2013)). 또한 EGFR과 c-Met은 다양한 종양 세포에서 동시 발현되어 있고, EGFR을 저해했을 때 c-Met이 활성화되고, 이를 통해 EGFR TKI의 저항성을 빠르게 진행시킨다고 보고되었다 (Engelman, J.A., et al., Science, 316:1039-43 (2007)).
이러한 기전을 바탕으로 현재 c-Met 타겟 약물 단독 치료 및 EGFR 타겟 약물과의 병용 치료가 임상 시험 진행 중에 있으나, 아직 임상에서 치료제로서의 효능이 검증되지 않았고, 주요 저항성 원인으로 알려진 c-Met 관련 암종에 대한 치료제 개발의 필요성이 있다. 이에, 본 발명자들은 상술한 항체를 기반으로 c-Met/EGFR 이중 특이적 항체를 제작하였다. 상기 이중 특이적 항체는 기존 EGFR 치료제에 저항성이 있는 종양 세포의 증식을 효과적으로 저해할 뿐만 아니라, 종양 세포의 우수한 증식 억제 활성을 나타내므로, 다양한 메카니즘을 통해 c-Met에 의해 매개되는 암 등 질환을 치료하는데 있어서 치료상 유용하게 사용할 수 있다.
상기 이중 특이적 항체는 c-Met 특이적 항체의 경쇄 또는 중쇄 일 말단에 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 연결한 것일 수 있으며, 예를 들어 중쇄 C-말단에 연결한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 EGFR에 특이적으로 결합하는 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 Fv는 scFv 절편일 수 있고, 상기 scFv 절편의 연결은 c-Met 항체의 경쇄 또는 중쇄 일 말단에 scFv 절편을 연결할 수 있는 커넥터를 이용하여 연결할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 서열번호 312로 기재된 커넥터로 연결하여 추가로 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체를 제작하였다.
상기 EGFR scFv 절편은 EGFR에 특이적으로 결합할 수 있는 당업계에 공지된 EGFR scFv 일 수 있으며, 예컨대 Erbitux, Vectibix, Portrazza 또는 TheraCIM 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 EGFR scFv는 Erbitux 또는 Vectibix scFv 절편일 수 있으며, 구체적으로 상기 EGFR scFv는 서열번호 313 또는 서열번호 314로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 상기 Vectibix scFv는 서열번호 315로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 이중 특이적 항체의 종양 세포 증식 저해 활성을 확인한 결과, hu8C4 최적화 항체에 비해 종양 활성 억제 효능이 우수함을 확인하였다 (표 16, 표 17, 도 4, 도 5, 도 16 및 도 17). 특히, 본 발명의 항체는 c-Met 및 EGFR이 정상적으로 발현되는 세포주인 NCI-H292 및 NCI-H1648 세포주에 대해서도 우수한 세포 증식 억제 효과를 가지는 것으로 확인되었다 (표 17, 표 19 및 도 6). 이러한 결과로부터, 본 발명의 항체가 가지는 항암 효과가 c-Met의 발현 이상 또는 변이 유무 등에 특별히 제한되지 않는다는 것을 알 수 있다.
아울러, 본 발명의 이중항체는 두 항체의 병용 요법보다 종양 세포 증식 저해능이 우수한 것을 확인하였다 (표 18 내지 표 21 및 도 6 내지 도 8). 또한, 본 발명의 이중항체가 항원 및 신호전달 물질의 활성에 미치는 영향을 확인한 결과, 항체 단독 대비 신호전달 저해 효능이 우수함을 확인하였다(도 11).
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 331, 서열번호 332, 서열번호 333 및/또는 서열번호 334로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 기재된 에피토프 영역에 결합하는 것일 수 있다. 특정 항체 (기준 항체)를 기반으로 제작된 친화도 최적화 항체는 기준 항체와 가변영역의 경쇄 및 중쇄 CDR 서열과 높은 상동성을 가져 기준 항체와 동일한 에피토프 영역에 결합하는 것을 특징으로 하므로, 결합 위치, 특이성, 그리고 항체에 의해 야기되는 약리기전, 약리효과와 같은 생물학적 특성을 모두 공유할 수 있으며, 결합 친화도 측면에서 기준 항체보다 더 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
상기 에피토프 영역은, 예컨대 기준 c-Met 항원 (서열번호 335)에서 N-말단으로부터 321번째 내지 329번째 위치의 YVSKPGAQL (서열번호 331), 333번째 내지 341번째 위치의 IGASLNDDI (서열번호 332), 366번째 내지 372번째 위치의 PIKYVND (서열번호 333) 및 464번째 내지 474번째 위치의 QVVVSRSGPST (서열번호 334)를 각각 의미하며, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 결합하는 c-Met 항원 서열이 일부 변이 (치환, 부가 또는 삭제)를 포함하거나, 또는 결합하는 항원이 c-Met의 단편, 전구체 또는 아형의 형태로 존재함에 따라 그 결합 위치 또는 서열이 다소 달라지더라도 통상의 기술자는 기준 c-Met 항원의 에피토프 서열 정보를 기초로 본 발명의 항원 또는 그의 항원 결합 단편이 결합하는 위치 및 서열을 명확하게 특정할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 이중항체 hu8C4 x Vectibix scFv가 인간 c-Met 세마 도메인 β 사슬의 Y321 ~ L329 (서열번호 331), I333 ~ I341 (서열번호 332), P366 ~ D372 (서열번호 333), Q464 ~ S474 (서열번호 334) 4 개의 에피토프 영역에 결합하는 것을 확인하였다 (표 28).
본 발명의 "c-Met에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편"은, 인간 c-Met과 KD 1 ×10-7 M 이하로 결합하는 것을 의미한다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 예컨대 인간 c-Met과 KD 5 ×10-8 M 이하, KD 1 ×10-8 M 이하, KD 5 ×10-9 M 이하, 또는 KD 1 ×10-9 M 이하로 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, c-Met ECD에 대한 hu8C4, hu8C4 AH71 및 hu8C4 × Vectibix scFv의 결합 친화도를 확인하여, 각각 3.173 × 10-10, 9.993 × 10-11 및 2.78 × 10-10의 KD 값을 확인함으로써, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편들이 c-Met 항원에 대한 높은 결합 친화도를 직접적으로 확인하였다 (표 22). 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 같은 유인원인 사이노몰거스 원숭이의 c-Met 항원에는 교차 반응성을 가지나 (표 22), 기타 동물 유래 항원 (예컨대 설치류)에는 결합하지 않는 것을 확인하였다 (도 9). 또한, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 c-Met 이외의 세포 표면 수용체에 결합하지 않는 것을 확인하였다 (표 24). 따라서, 상기 결과로부터 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간과 원숭이의 c-Met 항원에 결합 특이성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "결합상수 (Kon)"는 특정 항체-항원 상호 작용의 결합 비율을 의미하고, 용어 "해리상수 (Koff)"는 특정 항체-항원 상호 작용의 해리 비율을 의미하는 것이다. 또한, 본 발명에서 용어 "항원에 대한 친화도 (KD)"는 Koff : Kon의 비율 (즉, Koff / Kon)을 몰 농도 (M)로 나타낸 것이다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에서 널리 확립된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 KD 값을 측정하기 위한 방법으로 바이오코어TM 시스템을 사용한 표면 플라스몬 공명 분석을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 숙주 세포, 상기 숙주 세포를 이용한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생산방법이다.
상기 항체 및 그의 항원 결합 단편은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "핵산 분자"는 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 상기 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, (1990) 90:543-584). 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있으며, 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 본 발명에서 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80 %의 상동성, 구체적으로 최소 90 %의 상동성, 보다 구체적으로는 최소 95 %의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하며, 구체적으로 플라스미드 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터에서 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동가능하게 연결 (operatively linked)된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현조절서열 (예컨대, 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예컨대, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli (예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., (1984) 158:1018-1024), 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., (1980) 14:399-445)가 조절부위로서 이용될 수 있다. 숙주 세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터 (Appl. Environ. Microbiol. (1998) 64:3932-3938; Mol. Gen. Genet. (1996) 250:734-741) 또는 바실러스균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 조절부위로 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 재조합 벡터는 pCL 발현 벡터, 구체적으로 pCLS05 (대한민국 등록특허 제10-1420274호) 발현벡터를 조작하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인바 바이러스 (EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스 (RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 구체적으로, 본 발명의 재조합 벡터는 CMV 프로모터를 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 예컨대 동시 형질전환 (co-transfomation) 또는 표적 형질전환 (targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주 세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄 (또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 선별된 세포를 중쇄 (또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포라면 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 및 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 슈도모나스 (Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 (Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스 (Staphylococcus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 벡터의 적합한 진핵 숙주 세포는 아스페르길러스 속 (Aspergillus species)과 같은 진균, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시아 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 (Schizosaccharomyces) 및 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵 세포, 곤충-유래 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포, 그리고 식물 또는 포유동물로부터 유래한 세포를 이용할 수 있다.
구체적으로, 숙주 세포는 COS7 세포 (monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장 (BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 또는 293 세포일 수 있으며, 보다 구체적으로는 차이니즈 햄스터 난소 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 숙주 세포로의 "형질전환" 및/또는 "형질감염"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 상기와 같은 방법에는 전기충격유전자전달법 (electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개 형질전환 방법 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 숙주 세포를 이용한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생산하는 방법은, 구체적으로 (a) 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 숙주 세포에서 항-c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 항체 제조에서 형질전환 된 숙주 세포의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 배양 방법은 다양한 문헌 (예를 들면, James M. Lee, Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions, 138-176)에 개시되어 있다. 세포 배양은, 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
동물 세포 배양에 있어, 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예는, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분 및 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글라이세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 그리고 아세트산과 같은 유기산을 포함할 수 있으며, 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 질소원은, 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 (CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원을 포함할 수 있으며, 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이다.
상기 생산방법은, (c) 상기 숙주 세포에서 발현된 항-c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 추가적로 포함할 수 있다. 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 수득한 항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또는 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전 및 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피를 이용하는 방법이 가장 많이 사용되며, 컬럼의 종류와 순서는 항체의 특성, 배양방법 등에 따라 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에서 선택할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 c-Met 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이들을 이용한 c-Met 항원을 검출하는 방법이다.
상기 c-Met 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트는 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 검체 시료에 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성함으로써 효과적으로 c-Met을 검출할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원-항체 복합체"는, 시료 중의 c-Met을 발현하는 종양 또는 암 세포를 확인하기 위한, c-Met과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.
c-Met 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 이용한 c-Met 항원의 정량방법은 항원-항체 복합체의 형성을 확인하여 수행될 수 있으며, 상기 항원-항체 복합체의 형성 확인은 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블로팅 (Western Blotting), 면역형광 (Immunofluorescence), 면역조직화학염색 (Immunohistochemistry staining), 유세포분석법 (Flow cytometry), 면역세포화학법 (Immunocytochemistry), 방사능면역분석법 (RIA), 면역침전분석법 (Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay) 또는 단백질 칩 (Protein Chip) 등에 의해 이루어질 수 있으며, 이로 제한되지는 않는다. 상기 효소면역분석법 (ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2 차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코오스 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코오스 옥시다제와 루시퍼라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태는, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 암이 발병할 위험이 있거나 또는 암을 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 암 치료 용도, 및 항암제 제조 용도이다.
상기 항체 및 그의 항원 결합 단편은 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 c-Met 단독 또는 c-Met과 EGFR에 높은 친화도로 결합하여 암 세포의 성장을 억제할 수 있으므로 항체 단독으로 또는 통상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 암과 같은 과증식성 질환의 치료, 예방 및 진단에 사용가능하다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암 등의 질환의 발생 또는 재발을 막거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 암 등의 질환 발전의 억제, 암의 경감 또는 암의 제거를 의미한다.
본 발명의 조성물에 적용되는 질환인 암은 구체적으로 폐암, 위암, 대장암, 직장암, 삼중음성 유방암 (TNBC, triple negative breast cancer), 교모세포종, 췌장암, 두경부암, 유방암, 난소암, 신장암, 방광암, 전립선암, 자궁내막암, 침샘암 또는 갑상선암일 수 있으며, 보다 구체적으로는 폐암, 위암, 대장암, 직장암, 삼중음성 유방암 (TNBC, triple negative breast cancer), 교모세포종, 췌장암, 두경부암, 유방암이며, 보다 더 구체적으로는 폐암, 위암, 대장암, 직장암, 삼중음성 유방암 (TNBC, triple negative breast cancer), 교모세포종, 췌장암, 두경부암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 암은 특히 c-Met의 과발현, 증폭, 돌연변이 또는 활성화에 의한 암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 본 발명의 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물은 c-Met의 이상발현 또는 돌연변이와 관계없이 모든 암종에 대해 증식 억제 효과를 가지므로, 본 발명의 의약용도가 c-Met의 발현 양태 또는 돌연변이 여부에 따라 제한되지 않는다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 의약외품 조성물, 건강식품용 조성물의 형태일 수 있다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 암의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여될 수 있다. 경구 투여 시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1 일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏ 또는 그 이상일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암 등 질환의 치료, 예방 및 진단하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항체-치료제 (기능성 분자) 및 이중특이성항체-치료제 (기능성 분자) 결합체 형태로 생체 내로 투입하여 암의 치료에 이용할 수 있으며, 이에 대한 설명은 상기에서 설명한 바와 같다. 약제를 특이적 표적 부위로 표적화하는데 적당하고 바람직한 여러 가지 조건은 예를 들어 문헌 Trouet et al., Plenum Press, New York and London, (1982) 19-30에 보고되어 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 이종이식 마우스 모델에서 본 발명의 암의 예방 또는 치료용 조성물의 항-종양 활성을 확인한 결과, 대조군에 비해 종양 활성 억제 효능이 현저히 우수함을 확인하였다 (도 12 및 도 13).
본 발명의 조성물에 포함되는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 표적으로 하는 c-Met은 암 세포의 표면에 발현되는 분자이므로 본 발명의 항체에 기능성 분자를 추가적으로 결합하거나 병용 투여하여 c-Met과 관련된 암의 예방, 치료 및 진단에 이용할 수 있다. 상기 기능성 분자는 화학물질, 방사성핵종, 면역치료제, 사이토킨, 케모킨, 독소, 생물작용제 및 효소 저해물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편과 커플링시켜 항체 약물-결합체 (antibody drug-conjugates; ADC)를 형성할 수 있는 기능성 분자는 화학물질, 사이토킨 또는 케모킨을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 화학물질은 예컨대, 항암제이고, 구체적으로 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린 (BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA773U82, BW502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로 갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5'-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴,파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF (tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 탁소텔, 탁솔 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 간 세포 성장 인자 수용체 (c-Met)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 신규한 서열을 가지며, 적은 양으로도 우수한 암 세포 증식 저해 활성 및 현저히 우수한 항암활성을 나타내어 암 등의 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 하이브리도마 c-Met 항체의 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 scFv의 디스플레이를 위한 별도의 전사체를 발현하는 벡터의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 hu8C4 친화도 최적화 항체에 의한 종양 세포 증식 저해 활성에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 이중항체에 의한 종양 세포 증식 저해 활성에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 이중항체에 의한 종양 세포 증식 저해 활성에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 이중항체 및 병용 요법의 종양 세포 증식 저해 활성을 U-87 MG (glioblatoma), NCI-H292 (NSCLC), NCI-H1648 (NSCLC) 및 NCI-H596 (NSCLC) 세포주에서 비교한 결과이다.
도 7은 본 발명의 이중항체 및 병용 요법의 종양 세포 증식 저해 활성을 LS174T (colon), BT20 (TNBC) 및 KP4 (pancreatic) 세포주에서 비교한 결과이다.
도 8은 본 발명의 이중항체 및 병용 요법의 종양 세포 증식 저해 활성을 HCC827 (NSCLC) 및 NCI-H596 (NSCLC) 세포주에서 비교한 결과이다.
도 9는 본 발명의 항 c-Met 항체 및 이중항체의 결합력을 여러 종의 c-Met 및 EGFR 항원에 대하여 ELISA 방법으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 이중항체에 의한 수용체 수준 감소 효과를 NCI-H820 (NSCLC) 세포주에서 측정한 결과이다.
도 11은 본 발명의 항 c-Met 항체 및 이중항체에 의한 c-Met과 EGFR 인산화의 억제를 NCI-H820 (NSCLC) 세포주에서 측정한 결과이다.
도 12는 U-87 MG (glioblastoma) 세포 이종이식편 모델에서 본 발명의 이중항체의 항암 효과를 측정한 결과이다.
도 13은 NCI-H820 (NSCLC) 세포 이종이식편 모델에서 본 발명의 이중항체의 항암 효과를 측정한 결과이다.
도 14는 NCI-H2170 (NSCLC) 세포주에서 본 발명의 항 c-Met 항체 및 항 HER2 항체를 병용 요법으로 처리하여 종양 세포 증식 저해 활성을 분석한 결과이다.
도 15는 NCI-H2170 (NSCLC) 세포 이종이식편 모델에서 본 발명의 항 c-Met 항체 및 항 HER2 항체 병용 요법의 항암 효과를 측정한 결과이다.
도 16은 NCI-H596 (NSCLC) 세포 이종이식편 모델에서 본 발명의 이중항체의 항암 효과를 측정한 결과이다.
도 17은 EBC-1 (NSCLC) 세포 이종이식편 모델에서 본 발명의 이중항체의 항암 효과를 측정한 결과이다.
도 18은 HCC827 세포주에 이중항체 (hu8C4 x Vectibix scFv) 등을 처리한 후 측정한 세포 표면 c-Met 양을 나타낸 결과이다.
도 19은 HCC827 세포주에 이중항체 (hu8C4 x Vectibix scFv) 등을 처리한 후 측정한 세포 표면 EGFR 양을 나타낸 결과이다.
도 20은 수소-중수소 교환 질량 분광법 (HDX-MS)을 이용하여 이중항체의 에피토프를 분석한 결과를 3 차 구조로 나타낸 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. c-Met 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 제작 및 이의 종양 세포 증식 억제 활성 확인
(1) c-Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 제작 및 선별
동물면역화를 통해 하이브리도마 세포주 개발에 필요한 면역화된 마우스를 얻기 위하여, 인간의 c-Met Sema domain/Fc 융합 단백질 (자체 제작)을 항원으로 마우스의 복강 내 주사하였다. 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여, 인간의 c-Met/His 융합 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법으로 스크리닝을 수행하였다.
(2) c-Met 항체
선별된 하이브리도마 세포주로부터 얻어진 마우스 항체의 경쇄 및 중쇄 CDR 아미노산 서열을 각각 표 1 및 표 2에 나타내었다.
하이브리도마 경쇄 CDR
항체 CDR 1 서열번호 CDR 2 서열번호 CDR 3 서열번호
8C4 GASENIYGALN 1 GATNLAD 2 QNVLSSPYT 3
5G3 SATSSVRYMY 4 DTSNLAS 5 QQWSSYPRT 6
하이브리도마 중쇄 CDR
항체 CDR 1 서열번호 CDR 2 서열번호 CDR 3 서열번호
8C4 DYYIN 7 EIFPGSGNTHFSARFKG 8 GDYGFLY 9
5G3 DYTLH 10 YINPYSGYTNYNQKFKD 11 GHMDY 12
(3) 하이브리도마 c-Met 항체의 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성
하이브리도마 세포주를 이용하여 얻어진 c-Met 특이적 마우스 항체, 그리고 상기 항체와 인간 중쇄 및 경쇄 불변영역을 융합하여 제작한 키메라 항체의 종양 세포 증식 저해 활성을 인간 교모세포종 세포주인 U-87 MG와 인간 위암 세포주인 MKN45에서 시험하였다.
구체적으로, U-87 MG 세포 (ATCC, #HTB14)를 10 % (v/v) FBS, 100 U / 500 ml 페니실린 및 100 ㎍ / 500 ml 스트렙토마이신 (Invitrogen, #15140-122)을 함유하는 배양 배지 EMEM (ATCC, #30-2003)에 희석하여 96-웰 플레이트의 각 웰 당 2.5 × 103 개 세포의 농도로 100 ㎕씩 첨가한 후, 플레이트를 18 ~ 24 시간 동안 37 ℃, 95 % 상대습도 및 5 % (v/v) CO2 조건 하에 배양하였다. 각 웰에서 세포 배양 배지를 제거한 후, 2 % (v/v) FBS를 함유하는 EMEM 배지를 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하고, 최종 농도 (100 nM)의 2X로 제조한 항체를 1/10 연속 희석하여 각 항체별 6 개 농도 (즉, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM 및 2 pM)로 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 그 다음, 상기 플레이트를 37 ℃, 95 % 상대습도 및 5 % (v/v) CO2 조건 하에서 5 일 동안 배양하고, 마지막 날 10 % TCA (Trichloroacetic acid; Sigma, #T0699) 용액으로 세포를 고정하였다. 고정화된 세포는 각 웰에 80 ㎕의 0.4 % SRB (sulforhodamine B) 용액을 첨가하여 25 분 동안 염색한 후, 1 % 아세트산 용액으로 5 회 씻어내었다. 그 다음, 건조시킨 플레이트의 각 웰에 150 ㎕의 10 mM Tris 용액을 넣어 SRB dye를 용해시킨 후, microplate reader 기기를 이용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
또한, MKN45 (#JCRB0254) 세포주는 10 % (v/v) FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지 (Gibco, #A10491)에 희석하여 96-웰 플레이트의 각 웰에 2.5 × 103 개 씩 분주해 넣은 후 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 밤새 배양하였다. 이 후 상기 플레이트의 각 웰의 배지를 1 % (v/v) FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지 100 ㎕로 교체한 후 시험 항체를 최종 농도 100 nM에서 1 pM이 되도록 1/10씩 순차적으로 희석 (즉, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM 및 1 pM)하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 그 다음 상기 플레이트를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 5 일 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 TCA 용액을 200 ㎕씩 각 웰에 넣어 세포를 고정하였다. 상기 U87 MG 세포에 대한 시험과 마찬가지로 통상적인 SRB colorimetric assay 방법에 따라 플레이트의 세포를 염색하고 microplate reader를 이용하여 540 nm 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 상기 U87 MG 및 MKN45 세포주에 대한 결과를 표 3 및 도 1에 나타내었다.
하이브리도마 c-Met 항체의 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성 시험 결과
U-87 MG
(GBM, HGF autocrine)
IC50 (nM)		 MKN45
(Gastric cancer, c-Met amplified)
IC50 (nM)
LY2875358
(Eli Lilly)		 > 100 0.34
OA-5D5
(Genentech)		 > 100 > 100
hybridoma 8C4 17.5 9.78
hybridoma 5G3 > 100 0.32
8C4 chimera IgG1 32.4 > 100
8C4 chimera IgG2 > 100 12.92
5G3 chimera IgG2 > 100 0.41
상기 표 3 및 도 1에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 항 c-Met 항체인 8C4, 5G3 항체, 그리고 이들의 키메라 항체는 모두 공지된 c-Met 항체인 LY2875358 및 OA-5D5 (대조군)과 비교하여 대등하거나 더욱 우수한 종양 세포 증식 저해 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 8C4, 5G3 항체, 및 이들의 키메라 항체, 인간화 항체, 항원에 대한 친화도를 최적화시킨 항체 등 변이체들은 c-Met과 관련된 암의 예방 또는 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 8C4, 5G3 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 대한 구체적인 컨센서스 서열을 하기 표 4에 나타내었다.
8C4, 5G3 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 대한 컨센서스 서열번호
아미노산 컨센서스 서열 뉴클레오타이드 컨센서스 서열
경쇄 중쇄 경쇄 중쇄
8C4 DILMTQSPASLSASVGETVTITCGASENIYGALNWYQRKQGKSPQLLIYGATNLADGMSSRFSGSGSGRQFSLKITSLHPDDVATYYCQNVLSSPYTFGGGTKLEIK (서열번호 13) EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFSDYYINWVKQGTGQGLEWIGEIFPGSGNTHFSARFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSTDSAVYFCAGGDYGFLYWGRGTLVTVSA (서열번호 15) gatattctgatgacccagtctccagcttcactgtctgcatctgtgggagaaactgtcaccatcacatgtggagcaagtgagaatatttacggtgctttaaattggtatcagcgaaaacagggaaaatctcctcagctcctgatctatggtgcaaccaacttggcagatggcatgtcatcgaggttcagtggcagtgggtctggtagacagttttctctcaagatcactagcctgcatcctgacgatgttgcaacgtattactgtcaaaatgtgctaagtagtccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaatcaaa (서열번호 17) gaggttcagctgcagcagtctggagctgagctggcgaggcccggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttcagtgactactatataaactgggtgaagcaggggactggacagggccttgagtggattggagagatttttcctggaagtggaaatactcacttcagtgcgaggttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctacggactctgcagtctatttctgtgccgggggtgactacgggtttctttactggggccgagggactctggtcactgtctctgca (서열번호 19)
5G3 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSATSSVRYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPGRFSGSGSGTSNSLTISRLEAEDAATYYCQQWSSYPRTFGGGTKLEIK (서열번호 14) QGQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTDYTLHWVKQRPGQGLEWIGYINPYSGYTNYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVFYCARGHMDYWGQGTSVTVSS (서열번호 16) caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccacctcaagtgtacgttacatgtactggtaccagcagaagccaggatcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctggtcgcttcagcggcagtgggtctgggacctctaactctctcacaatcagccgattggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagttacccacggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa (서열번호 18) cagggccagctgcagcagtctggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttactgactacacgctgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatccttacagtggttatactaattacaatcagaaattcaaggacaaggccacattgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcggcctgacatctgaagactctgcagtcttttattgtgcaagaggacatatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca (서열번호 20)
실시예 2. 8C4 항체의 인간화 항체 제조 및 이의 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성 확인
본 발명에서 제조된 항체의 효과를 추가적으로 확인하기 위해, 일 예시로서 상기 마우스 항체 8C4를 인간화 시키고, in vitro에서 이의 종양 세포 증식 저해 활성을 확인하였다.
8C4 항체 중쇄의 인간화 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 8C4의 중쇄 가변영역 유전자와 상동성이 높은 인간의 생식선 (germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, IGHV3-23이 8C4 항체와 아미노산 레벨에서 48 %의 상동성을 가짐을 확인하였으며, IGHV3-11이 8C4 항체와 아미노산 레벨에서 46 %의 상동성을 가짐을 확인하였다.
마우스 항체 8C4의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 8C4의 CDR 부분이 IGHV3-23의 골격 (framework)에 도입되도록 디자인하여 hu8C4-1을 제작하였다. 이때, 48 번 (V→I), 49 번 (S→G), 71 번 (R→A), 73 번 (N→K), 78 번 (L→A), 94 번 (K→G) 아미노산은 원래 마우스 8C4 항체의 아미노산 서열로 back-mutation하여 최종적으로 hu8C4-1의 중쇄를 구축하였다. hu8C4-2의 경우, 마우스 항체 8C4의 CDR 부분이 IGHV3-11의 골격 (framework)에 도입되도록 디자인하였고, 48 번 (V→I), 49 번 (S→G), 71 번 (R→A), 73 번 (N→K), 78 번 (L→A), 94 번 (R→G) 아미노산은 원래 마우스 8C4 항체의 아미노산 서열로 back-mutation하여 최종적으로 hu8C4-2의 중쇄를 구축하였다.
8C4 항체 경쇄의 경우에도, 인간화 디자인을 위하여, Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 8C4의 경쇄 가변영역 유전자와 상동성이 높은 인간의 생식선 (germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, IGKV1-27이 8C4 항체와 아미노산 레벨 65.3 %의 상동성을 가지며, IGKV1-33이 8C4 항체와 아미노산 레벨에서 64.2 %의 상동성을 가짐을 확인하였다.
마우스 항체 8C4의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 8C4의 CDR 부분이 IGKV1-33의 골격 (framework)에 도입되도록 디자인하여 hu8C4-1을 제작하였고, IGKV1-27의 골격에 도입되도록 디자인하여 hu8C4-2을 제작하였다. 이때, hu8C4-1, hu8C4-2 모두 69 번 (T→R) 아미노산을 원래 마우스 8C4 항체의 아미노산 서열로 back-mutation하였다.
상기 8C4 인간화 항체를 pCLS05 벡터 (대한민국 등록특허 제10-1420274호)를 사용하여 293T 세포에 발현시켰다. 이렇게 얻은 IgG1 형태의 인간화 항체들에 대하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 인간 교모세포종 세포주인 U-87 MG에서 종양 세포 증식 저해 활성을 확인하였다.
그 결과, hu8C4-1과 hu8C4-2의 IC50 값은 각각 30 nM 및 24.6 nM로 키메라 8C4 항체 (IC50 = 32.4 nM) 대비 유사한 수준의 항암활성을 나타내는 것을 확인하였다.
상기 hu8C4-1, hu8C4-2 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역에 대한 구체적인 컨센서스 서열을 표 5에 나타내었다.
hu8C4-1, hu8C4-2 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역에 대한 컨센서스 서열번호
아미노산 컨센서스 서열 뉴클레오타이드 컨센서스 서열
경쇄 중쇄 경쇄 중쇄
hu8C4-1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGRDFTFTISSLQPEDIATYYCQNVLSSPYTFGQGTKVEIK (서열번호 21) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSDYYINWVRQAPGKGLEWIGEIFPGSGNTHFSARFKGRATLSADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDYGFLYWGQGTLVTVSS (서열번호 23) gatatccagatgacccagtctcccagcagtctttccgcttctgtgggtgatagggtgacgataacttgcggagcaagtgagaatatttacggtgctttaaattggtaccagcagaagcctgggaaagctccaaagctgctgatctatggtgcaaccaacttggcagatggcgtccctagcaggttcagcggcagtggaagcggcagagacttcactttcacaatctcctccctgcaacccgaggacattgcaacctactattgtcaaaatgtgctaagtagtccgtacacgtttggccagggaaccaaggttgaaattaaa (서열번호 25) gaggttcagttagtggaatccggaggaggactggtgcagcctggtggaagtttgaggctgtcatgcgcagccagtggctacaccttcagtgactactatataaactgggtaagacaggctcccggaaaagggctggagtggattggagagatttttcctggaagtggaaatactcacttcagtgcgaggttcaagggccgagccaccctctcagcagacaaaagcaagaataccgcctatctgcagatgaatagccttcgcgcagaagatactgccgtgtattactgtgccgggggtgactacgggtttctttactggggacagggcaccttggtgacagtctcttct (서열번호 27)
hu8C4-2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKVPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDVATYYCQNVLSSPYTFGQGTKVEIK (서열번호 22) QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFSDYYINWIRQAPGKGLEWIGEIFPGSGNTHFSARFKGRATISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDYGFLYWGQGTLVTVSS (서열번호 24) gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgcggagcaagtgagaatatttacggtgctttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagttcctaagctcctgatctatggtgcaaccaacttggcagatggggtcccatctcggttcagtggcagtggatctgggcgagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatgttgcaacttattactgtcaaaatgtgctaagtagtccgtacacgtttggccagggaaccaaggttgaaattaaa (서열번호 26) caggttcagttagtggaatccggaggaggactggtgaagcctggtggaagtttgaggctgtcatgcgcagccagtggctacaccttcagtgactactatataaactggatcagacaggctcccggaaaagggctggagtggattggagagatttttcctggaagtggaaatactcacttcagtgcgaggttcaagggccgagccaccatctcagcagacaaagcgaagaatagcgcctatctgcagatgaatagccttcgcgcagaagatactgccgtgtattactgtgccgggggtgactacgggtttctttactggggacagggcaccttggtgacagtctcttct (서열번호 28)
실시예 3. 5G3 항체의 인간화 항체 제조 및 이의 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성 확인
다음으로, 본원발명의 마우스 항체 5G3을 인간화 시키고, in vitro에서 이의 종양 세포 증식 저해 활성을 확인하였다.
구체적으로, hu5G3-1의 중쇄 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 5G3의 중쇄 가변영역 유전자와 가장 상동성이 높은 인간의 생식선 (germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, IGHV1-46이 5G3 항체와 아미노산 레벨에서 67.3 %의 상동성을 가짐을 확인하였다. 마우스 항체 5G3의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 5G3의 CDR 부분이 IGHV1-46의 골격 (framework)에 도입되도록 디자인하였다. 이때, 48 번 (M→I), 69 번 (M→L), 71 번 (R→A), 73 번 (T→K), 78 번 (V→A) 아미노산은 원래 마우스 5G3 항체의 아미노산 서열로 back-mutation하였다. 이를 통하여 hu5G3-1의 중쇄를 구축하였다.
hu5G3-1의 경쇄는 5G3 항체와 63.5 %의 상동성을 가지는 IGKV3-20 유전자에 CDR-grafting을 수행하였으며, 43 번 (A→S), 60 번 (D→A), 71 번 (F→N) 아미노산은 back-mutation을 수행하여 hu5G3-1의 경쇄를 구축하였다.
또한, hu5G3-2의 중쇄를 디자인하기 위하여 기존에 가장 안정하다고 알려진 VH3 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 5G3의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 도입하였다. 이때, 67 번 (F→A), 69 번 (I→L), 73 번 (T→K), 90 번 (Y→F), 94 번 (T→R) 아미노산은 원래 마우스 5G3 항체의 아미노산 서열로 back-mutation하였다. 이를 통하여 hu5G3-2의 중쇄를 구축하였다.
hu5G3-2의 경쇄는 VH3 subtype과 안정하게 구조를 형성한다고 알려진 IGVK Ⅲ 유전자에 CDR-grafting을 수행하였으며, back-mutation은 수행하지 않았다.
상기 5G3 인간화 항체를 pCLS05 벡터 (대한민국 등록특허 제10-1420274호)를 사용하여 293T 세포에 발현시켰다. 이렇게 얻은 IgG2 형태의 인간화 항체들에 대해 실시예 1과 동일한 방법으로 인간 위암 세포주인 MKN45에서 종양 세포 증식 저해 활성을 확인하였다.
그 결과, hu5G3-1과 hu5G3-2의 IC50값은 각각 0.52 nM, 0.5 nM로 키메라 5G3 항체 (IC50 = 0.41 nM) 대비 유사한 수준의 항암활성을 나타내는 것을 확인하였다.
상기 hu5G3-1, hu5G3-2 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역에 대한 컨센서스 서열을 표 6에 나타내었다.
hu5G3-1, hu5G3-2 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역에 대한 컨센서스 서열번호
아미노산 컨센서스 서열 뉴클레오타이드 컨센서스 서열
경쇄 중쇄 경쇄 중쇄
hu5G3-1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVRYMYWYQQKPGQSPRLLIYDTSNLASGIPARFSGSGSGTDNTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSYPRTFGGGTKVEIK (서열번호 29) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYTLHWVRQAPGQGLEWIGYINPYSGYTNYNQKFKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGHMDYWGQGTLVTVSS (서열번호 31) gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagtgccacctcaagtgtacgttacatgtactggtaccagcagaaacctggccagtctcccaggctcctcatctatgacacatccaacctggcttctggcatcccagcaaggttcagtggcagtgggtctgggacagacaacactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggagtagttacccacggacgttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa (서열번호 33) caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccgactacacgctgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggataggatacattaatccttacagtggttatactaattacaatcagaaattcaaggacagagtcaccttgaccgcagacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgctagaggacatatggactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctca (서열번호 35)
hu5G3-2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVRYMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSYPRTFGQGTKVEIK (서열번호 30) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTDYTLHWVRQAPGKGLEWVGYINPYSGYTNYNQKFKDRATLSADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVFYCARGHMDYWGQGTLVTVSS (서열번호 32) gacatccagatgactcagagtccctcttctctgtctgcctcagtgggagatcgggtcacaatcacatgttcagcaacaagctcagtgcgatacatgtattggtaccagcagaagccaggcaaagccccaaagctgctgatctatgacacatctaatctggccagcggcgtcccatctcgcttctcaggctccggaagcggtactgattttaccctgactatttcttccttgcagcctgaggacttcgcaacctattattgccagcagtggtctagctaccctcgcacattcggccagggaaccaaggtcgaaattaaa (서열번호 34) gaagtccaacttgtggagtcaggaggcgggctcgtgcagccaggcggatcattgcgactttcttgtgctgcctcagggtacaccttcactgattataccttgcattgggttcgccaagcacccggtaagggtctcgaatgggtaggatacattaatccatacagcggctacaccaactacaaccagaaattcaaagacagggctacccttagtgccgacaagtctaagaacaccgcctaccttcagatgaactcccttagagccgaggatactgctgtgttttattgcgctaggggtcatatggactactggggacaggggaccttggtgactgtgtcttcc (서열번호 36)
실시예 4. 힌지 (hinge) 변이체 제작 및 이의 종양 세포 증식 저해 활성 시험
다음으로, 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 힌지 (hinge) 서열에 따른 종양 세포 증식 저해 활성 시험을 수행하였다.
먼저, 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 힌지는 'EPKSCDKTHTCPPCP (서열번호 37)'의 아미노산 서열을 가지며, 이를 치환하여 서열번호 38 내지 서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역 변이체를 얻었다.
이를 상기 실시예 2에서 제작한 hu8C4-1, hu8C4-2 인간화 항체의 중쇄 가변영역을 포함하는 벡터에 각각 클로닝 하였다. in vitro에서 힌지 서열에 따른 종양 세포 증식 저해 활성을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 U-87 MG에서 확인하였다.
또한, 비소세포폐암 세포주 NCI-H1993 (ATCC, #CRL-5909)에 대해 다음과 같이 8C4 인간화 항체의 효과를 분석하였다. NCI-H1993 세포주를 10 % (v/v) FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지 (Gibco, #A10491)에 희석하여 96-웰 플레이트의 각 웰에 3.0 × 103 개 씩 분주해 넣은 후 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 밤새 배양하였다. 이 후 상기 플레이트의 각 웰의 배지를 2 % (v/v) FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지 100 ㎕로 교체한 후 시험 항체를 최종 농도 100 nM에서 0.001 nM이 되도록 1/10씩 순차적으로 희석 (즉, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM 및 1 pM)하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 그 다음, 상기 플레이트를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 5 일 동안 배양 한 후, 배지를 제거하고 TCA 용액 (Sigma, #T0699)을 200 ㎕씩 각 웰에 넣어 세포를 고정하였다. 통상적인 SRB colorimetric assay 방법에 따라 플레이트의 세포를 염색하고 microplate reader를 이용하여 540 nm 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
U-87 MG 및 NCI-H1993 (ATCC, #CRL-5909)에서 hu8C4-1의 결과를 표 7에 나타내었다.
힌지 영역 변이체 서열 및 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성 시험 결과
서열
번호		 아미노산 서열
번호		 뉴클레오타이드 U-87 MG
(GBM, HGF autocrine)
(IC50 nM)		 NCI-H1993
(NSCLC, c-Met amplified)
(IC50 nM)
37 EPKSCDKTHTCPPCP 45 gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgccca 12.6 > 100
38 ERKCCVECPPCP 46 gagcgaaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgccca 31.0 0.30
39 ECCVECPPCP 47 gagtgttgtgtcgagtgcccaccgtgccca 57.3 > 100
40 ERKCCCPPCP 48 gagcgaaaatgttgttgcccaccgtgccca 37.6 0.23
41 ECCCPPCP 49 gagtgttgttgcccaccgtgccca 25.3 > 100
42 EKCCVECPPCP 50 gagaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgccca 31.4 0.48
43 ERKCCVCPPCP 51 gagcgaaaatgttgtgtctgcccaccgtgccca 30.8 0.47
44 EKCCVCPPCP 52 gagaaatgttgtgtctgcccaccgtgccca 75.9 0.38
표 7에서 확인되는 바와 같이, 힌지 서열의 차이에 따라 hu8C4 항체의 종양 세포 증식 저해 활성이 다소 차이가 있으나, 대부분 종양 세포의 증식을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이에, 이하에서는 대표적으로 hu8C4-1에 서열번호 38의 힌지 영역을 가지는 IgG1 인간화 항체를 hu8C4로 명명하고, 이에 대한 친화도 최적화 항체를 제작하여 그 효과를 확인하고자 하였다.
실시예 5. hu8C4의 친화도 최적화 항체 제작 및 이의 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성 확인
hu8C4의 친화도 최적화 항체를 제작하기 위해, 먼저 scFv와 pIII가 결합된 형태로 디스플레이 되는 파지미드 벡터를 사용하여 파지-디스플레이된 scFv 라이브러리를 제작하였으며, 상기 벡터의 대략적인 구조를 도 2에 도시하였다. 상기 파지미드 벡터는 IPTG-유도성 lac 프로모터의 제어 하의 항체의 scFv 절편을 포함하며, 링커 서열은 GGGGS GGGGS GGGGS (서열번호 53)를 사용하였다.
다음으로, hu8C4의 중쇄와 경쇄 CDR 부위에 다양성을 도입하기 위해서 NNK 코돈을 갖는 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 이에 따라 His, HA 및 pIII가 융합된 hu8C4 scFv 라이브러리를 제작하였고, 제작된 항체 라이브러리로부터 인간 c-Met에 특이적인 항체를 선별하였다.
구체적으로, 친화도가 향상된 항체를 선별하기 위하여 경쟁적인 선별방법을 사용하였다. Dynabeads® M-280 (Thermo Fisher Scientific, 11205D)에 인간 c-Met 항원을 제조사 지침에 따라 결합시켜주었다. 항원이 결합된 비드를 수퍼블록 TBS (Superblock Tris buffered saline, Pierce)로 2 시간 동안 차단하였다. 또한 37 ℃에서 재조합 파지를 밤새 성장시킨 후 원심분리하여 상등액의 파지를 수퍼블록 TBS, 0.05 % Tween 20으로 2 시간 동안 차단하였다. 이후, 비드를 0.05 % 트윈 20이 포함된 PBS로 세척하였다. 차단된 파지 용액을 세척된 비드에 첨가하고, 파지 결합을 위해 로테이터에서 2 시간 인큐베이션한 후, 비드를 0.05 % 트윈 20이 포함된 PBS로 세척하였다. 그 다음, 인간 c-Met 항원을 0.05 % 트윈 20이 포함된 PBS 1 ml 에 첨가하여 로테이터에서 24 시간 인큐베이션 하였다 (Rouet R et al. (2012) Nat Protoc . 7:364-373). 그 다음, 비드에 결합된 파지를 100 mM 트리에탄올아민으로 5 분 동안 용리하고, 용리액을 0.5 M Tris/Cl (pH 7.2)로 중화하였다. 용리된 파지 중화액을 대장균 TG1에 감염시켰다.
상기 실험을 통하여 선택된 개별 클론을 카베니실린 및 암피실린이 첨가된 2xYT 브로쓰 200 ㎕에서 96-웰 포맷에서 성장시키고, 배양 상층액을 ELISA에 직접 사용하여, 표적 단백질로 코팅된 플레이트에 결합하는 파지-디스플레이된 scFv를 선별하였다. 검출된 항체의 경쇄 및 중쇄 CDR 영역 아미노산 서열을 표 8 및 표 9에 나타내었으며, 대표적인 경쇄 및 중쇄 친화도 최적화 항체 가변영역 아미노산 서열을 표 10에 나타내었다.
Figure 112018053250749-pat00001
Figure 112018053250749-pat00002
Figure 112018053250749-pat00003
Figure 112018053250749-pat00004
Figure 112018053250749-pat00005
Figure 112018053250749-pat00006
Figure 112018053250749-pat00007
경쇄 및 중쇄 친화도 최적화항체 가변영역 서열 목록
아미노산 서열 서열번호
AH71 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSDYYINWVRQAPGKGLEWIGEIFPGWGNTHFSARFKGRATLSADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAGQDYGFLYWGQGTLVTVSS 302
AH72 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSDYYINWVRQAPGKGLEWIGEIFPGWGNTHFSRSPTPRATLSADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDYGFLYWGQGTLVTVSS 303
AH73 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSDYYINWVRQAPGKGLEWIGEIFPGWGNSHVVSRFKGRATLSADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDYGFLYWGQGTLVTVSS 304
AH85 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSDYYINWVRQAPGKGLEWIGEIFPGWGNSHVVSRFKGRATLSADKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAGQDYGFLYWGQGTLVTVSS 305
AL130 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASMPLFHALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGRDFTFTISSLQPEDIATYYCQNVLSSPYTFGQGTKVEIK 306
AL135 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGRDFTFTISSLQPEDIATYYCQNVLEEPYTFGQGTKVEIK 307
AL165 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATGLADGVPSRFSGSGSGRDFTFTISSLQPEDIATYYCQNVLESPYTFGQGTKVEIK 308
AL166 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATGLADGVPSRFSGSGSGRDFTFTISSLQPEDIATYYCQNVLSEPYTFGQGTKVEIK 309
AL194 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASMPLFHALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGRDFTFTISSLQPEDIATYYCQNVLSIPETFGQGTKVEIK 310
AL195 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASRSTFSALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGVPSRFSGSGSGRDFTFTISSLQPEDIATYYCQNVLEEPYTFGQGTKVEIK 311
또한, in vitro에서 상기 친화도 최적화 항체 중 일부를 이용하여 U-87 MG 세포주에 대한 증식 저해 활성 시험을 수행하였으며, 그 결과를 표 11에 나타내었다.
hu8C4 경쇄 및 중쇄 친화도 최적화 항체에 의한 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성
항체 U-87 MG (GBM, HGF autocrine)
Cell proliferation inhibition assay, IC50 (nM)		 IC50 Fold
친화도 최적화 항체 hu8C4
hu8C4 AH71 11.3 95.5 8.5
hu8C4 AH72 10.9 95.5 8.8
hu8C4 AH73 10.9 95.5 8.8
hu8C4 AH85 10.1 95.5 9.5
hu8C4 AL130 5.0 45.0 9.0
hu8C4 AL135 7.1 31.9 4.5
hu8C4 AL165 6.8 39.0 5.7
hu8C4 AL166 9.1 39.0 4.3
hu8C4 AL194 9.6 94.5 9.8
hu8C4 AL195 18.0 94.5 5.3
표 11에서 확인되는 바와 같이, U-87 MG 세포에서 hu8C4 친화도 최적화 항체의 종양 세포 증식 저해 활성의 IC50은 5.0 ~ 18 nM로 모항체 hu8C4과 대비하여 4.3 ~ 9.8 배 효능이 증가됨을 확인하였다. 상기 결과는 표 8 내지 표 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 항체 중 일부에 대해 수행된 것이나, 모체가 되는 hu8C4 항체의 친화도를 최적화한 것이고, 이들은 모두 선별과정에서 항원 친화도를 기반으로 선별된 것인바, 나머지 친화도 최적화 항체, 그리고 제시된 중쇄 및 경쇄 가변영역 CDR을 조합한 항체에 대해서도 충분히 이와 동등한 효과가 있을 것으로 예상된다.
추가적인 실험을 위해 상기 경쇄와 중쇄 가변영역을 조합하여 10 종의 친화도 최적화 항체를 제작하였다. 구체적인 경쇄 및 중쇄 서열 조합을 표 12에 나타내었다.
친화도 최적화항체 가변영역 조합 서열 목록
중쇄 가변영역 경쇄 가변영역
hu8C4 AH71 AH71(서열번호 302) hu8C4-1 항체 경쇄 가변영역 (서열번호 21)
hu8C4 AH85 AH85(서열번호 305) hu8C4-1 항체 경쇄 가변영역 (서열번호 21)
hu8C4 AL194 hu8C4-1 항체 중쇄 가변영역 (서열번호 23) AL194(서열번호 310)
hu8C4 A56 AH85(서열번호 305) AL165(서열번호 308)
hu8C4 A62 AH72(서열번호 303) AL130(서열번호 306)
hu8C4 A71 AH73(서열번호 304) AL135(서열번호 307)
hu8C4 A72 AH73(서열번호 304) AL165(서열번호 308)
hu8C4 A73 AH73(서열번호 304) AL166(서열번호 309)
hu8C4 A76 AH73(서열번호 304) AL195(서열번호 311)
hu8C4 A78 AH71(서열번호 302) AL130(서열번호 306)
그 다음, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 종양 세포 증식 저해 활성 평가를 수행하여, 그 결과를 표 13 및 도 3에 나타내었다.
친화도 최적화항체에 의한 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성
항체 U-87 MG (GBM, HGF autocrine)
Cell proliferation inhibition assay, IC50 (nM)		 IC50 Fold
친화도 최적화 항체 hu8C4
hu8C4 AH71 3.6 49.0 13.6
hu8C4 AH85 3.2 49.0 15.2
hu8C4 AL194 5.3 49.0 9.2
hu8C4 A56 1.7 49.0 28.5
hu8C4 A62 1.8 49.0 27.6
hu8C4 A71 5.0 49.0 9.7
hu8C4 A72 3.6 49.0 13.8
hu8C4 A73 4.0 49.0 12.3
hu8C4 A76 4.3 49.0 11.3
hu8C4 A78 2.6 49.0 18.9
상기 표 13에서 확인되는 바와 같이, hu8C4 뿐만 아니라, 이의 친화도 최적화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역을 조합한 주요 항체 10 종 역시 종양 세포 증식 저해 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 특히, 상기 항체 10 종은 IC50이 1.7 ~ 5.3 nM로, 모항체인 hu8C4와 대비하여 9.2 ~ 28.5 배 우수한 종양 세포 증식 저해 효과를 가지는 것을 확인하였다.
실시예 6. 이중 특이적 항체 제작 및 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성
c-Met 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 이중항체를 제작하기 위하여, EGFR에 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 Erbitux와 Vectibix scFv 절편을 각각 본원발명의 c-Met 항체의 중쇄 C-말단에 GGGGSGGGGS (서열번호 312) 커넥터로 연결하여 이중항체를 제작하였다.
상기 scFv의 안정성을 증가시키기 위하여 중쇄 44 번째 잔기와 경쇄 100 번째 잔기를 시스틴으로 치환하였다 (Reiter Y. et al., Biochemistry 33(18):5451-5459 (1994)). Erbitux와 Vectibix scFv 서열, 이중항체 중쇄 아미노산 서열 및 이중항체 가변영역 조합을 아래 표 14 및 표 15에 나타내었다.
Figure 112018053250749-pat00008
Figure 112018053250749-pat00009
Figure 112018053250749-pat00010
Figure 112018053250749-pat00011
Figure 112018053250749-pat00012
Figure 112018053250749-pat00013
이중항체 가변영역 조합 서열 목록
중쇄 가변영역 경쇄 가변영역
hu8C4 x Erbitux scFv HL hu8C4 x Erbitux scFv HL (서열번호 316) hu8C4-1 항체 경쇄 가변영역 (서열번호 21)
hu8C4 AH71 x Erbitux scFv HL hu8C4 AH71 x Erbitux scFv HL (서열번호 317) hu8C4-1 항체 경쇄 가변영역 (서열번호 21)
hu8C4 AH85 x Erbitux scFv HL hu8C4 AH85 x Erbitux scFv HL (서열번호 320) hu8C4-1 항체 경쇄 가변영역 (서열번호 21)
hu8C4 AL194 x Erbitux scFv HL hu8C4 x Erbitux scFv HL (서열번호 316) AL194(서열번호 310)
hu8C4 A56 x Erbitux scFv HL hu8C4 AH85 x Erbitux scFv HL (서열번호 320) AL165(서열번호 308)
hu8C4 A62 x Erbitux scFv HL hu8C4 AH72 x Erbitux scFv HL (서열번호 318) AL130(서열번호 306)
hu8C4 A71 x Erbitux scFv HL hu8C4 AH73 x Erbitux scFv HL (서열번호 319) AL135(서열번호 307)
hu8C4 A72 x Erbitux scFv HL hu8C4 AH73 x Erbitux scFv HL (서열번호 319) AL165(서열번호 308)
hu8C4 A73 x Erbitux scFv HL hu8C4 AH73 x Erbitux scFv HL (서열번호 319) AL166(서열번호 309)
hu8C4 A76 x Erbitux scFv HL hu8C4 AH73 x Erbitux scFv HL (서열번호 319) AL195(서열번호 311)
hu8C4 A78 x Erbitux scFv HL hu8C4 AH71 x Erbitux scFv HL (서열번호 317) AL130(서열번호 306)
hu8C4 x Erbitux scFv LH hu8C4 x Erbitux scFv LH (서열번호 321) hu8C4-1 항체 경쇄 가변영역 (서열번호 21)
hu8C4 AH71 x Erbitux scFv LH hu8C4 AH71 x Erbitux scFv LH (서열번호 322) hu8C4-1 항체 경쇄 가변영역 (서열번호 21)
hu8C4 AH85 x Erbitux scFv LH hu8C4 AH85 x Erbitux scFv LH (서열번호 325) hu8C4-1 항체 경쇄 가변영역 (서열번호 21)
hu8C4 AL194 x Erbitux scFv LH hu8C4 x Erbitux scFv LH (서열번호 321) AL194(서열번호 310)
hu8C4 A56 x Erbitux scFv LH hu8C4 AH85 x Erbitux scFv LH (서열번호 325) AL165(서열번호 308)
hu8C4 A62 x Erbitux scFv LH hu8C4 AH72 x Erbitux scFv LH (서열번호 323) AL130(서열번호 306)
hu8C4 A71 x Erbitux scFv LH hu8C4 AH73 x Erbitux scFv LH (서열번호 324) AL135(서열번호 307)
hu8C4 A72 x Erbitux scFv LH hu8C4 AH73 x Erbitux scFv LH (서열번호 324) AL165(서열번호 308)
hu8C4 A73 x Erbitux scFv LH hu8C4 AH73 x Erbitux scFv LH (서열번호 324) AL166(서열번호 309)
hu8C4 A76 x Erbitux scFv LH hu8C4 AH73 x Erbitux scFv LH (서열번호 324) AL195(서열번호 311)
hu8C4 A78 x Erbitux scFv LH hu8C4 AH71 x Erbitux scFv LH (서열번호 322) AL130(서열번호 306)
hu8C4 x Vectibix scFv hu8C4 x Vectibix scFv (서열번호 326) hu8C4-1 항체 경쇄 가변영역 (서열번호 21)
hu8C4 AH71 x Vectibix scFv hu8C4 AH71 x Vectibix scFv (서열번호 327) hu8C4-1 항체 경쇄 가변영역 (서열번호 21)
hu8C4 AH85 x Vectibix scFv hu8C4 AH85 x Vectibix scFv (서열번호 330) hu8C4-1 항체 경쇄 가변영역 (서열번호 21)
hu8C4 AL194 x Vectibix scFv hu8C4 x Vectibix scFv (서열번호 326) AL194(서열번호 310)
hu8C4 A56 x Vectibix scFv hu8C4 AH85 x Vectibix scFv (서열번호 330) AL165(서열번호 308)
hu8C4 A62 x Vectibix scFv hu8C4 AH72 x Vectibix scFv (서열번호 328) AL130(서열번호 306)
hu8C4 A71 x Vectibix scFv hu8C4 AH73 x Vectibix scFv (서열번호 329) AL135(서열번호 307)
hu8C4 A72 x Vectibix scFv hu8C4 AH73 x Vectibix scFv (서열번호 329) AL165(서열번호 308)
hu8C4 A73 x Vectibix scFv hu8C4 AH73 x Vectibix scFv (서열번호 329) AL166(서열번호 309)
hu8C4 A76 x Vectibix scFv hu8C4 AH73 x Vectibix scFv (서열번호 329) AL195(서열번호 311)
hu8C4 A78 x Vectibix scFv hu8C4 AH71 x Vectibix scFv (서열번호 327) AL130(서열번호 306)
그 다음, Erbitux와 Vectibix scFv 절편을 연결한 이중항체의 in vitro 항암 효능을, 실시예 1과 동일한 방법으로 U-87 MG 종양 세포주에서 평가하였다.
또한, NCI-H1993, NCI-H292, NCI-H820 폐암 세포주를 이용하여 종양 세포 증식 저해 활성을 평가하였다. 구체적으로, c-Met 유전자가 과발현 되어있는 세포주인 NCI-H1993 (ATCC, #CRL-5909), EGFR과 c-Met이 정상적으로 발현되는 세포주인 NCI-H292 (ATCC, #CRL-1848)와 EGFR 아미노산 790번에 쓰레오닌 (T)이 메티오닌 (M)으로 변이가 생긴 NCI-H820 (ATCC, #HTB-181) 종양 세포 증식 저해 활성을 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 각 세포주를 10 % (v/v) FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지 (Gibco, #A10491)에 희석하여 96-웰 플레이트의 각 웰에 2.0 × 103 개 씩 분주해 넣은 후 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 밤새 배양하였다. 이 후 상기 플레이트 각 웰을 무혈청 배지 100 ㎕으로 교체한 후 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 18 시간 배양하였다. 그 다음, 배지를 2 % (v/v) FBS 혹은 HGF 50 ng/ml을 함유하는 RPMI-1640 배지 100 ㎕로 교체한 후, 시험 항체를 최종 농도 100 nM에서 0.001 nM이 되도록 1/10씩 순차적으로 희석 (즉, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM 및 1 pM)하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 그 다음 상기 플레이트를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 5 일 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 TCA 용액을 200 ㎕씩 각 웰에 넣어 세포를 고정하였다. 통상적인 SRB colorimetric assay 방법에 따라 플레이트의 세포를 염색하고 microplate reader를 이용하여 540 nm 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
상기 각 세포주에서의 증식 저해 활성 결과를 표 16, 표 17, 도 4 및 도 5에 나타내었다.
이중항체에 의한 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성
이중항체 Cell proliferation inhibition assay, IC50 (nM)
U-87 MG
(GBM, HGF autocrine)		 NCI-H1993
(NSCLC, c-Met amplified)
hu8C4 x Vectibix scFv 0.06 0.32
hu8C4 AH71 x Erbitux scFv HL 0.06 0.41
hu8C4 AH85 x Erbitux scFv HL 0.06 0.48
hu8C4 AL194 x Erbitux scFv HL 0.07 0.64
hu8C4 A56 x Erbitux scFv HL 0.07 0.57
hu8C4 A62 x Erbitux scFv HL 0.08 0.65
hu8C4 A70 x Erbitux scFv HL 0.07 0.67
hu8C4 A72 x Erbitux scFv HL 0.06 0.49
hu8C4 A73 x Erbitux scFv HL 0.06 0.50
hu8C4 A76 x Erbitux scFv HL 0.06 0.49
hu8C4 A78 x Erbitux scFv HL 0.06 0.76
이중항체에 의한 in vitro 폐암 세포주 증식 저해 활성
이중항체 Cell proliferation inhibition assay, IC50 (nM)
NCI-H292
(NSCLC)		 NCI-H820
(NSCLC : EGFR T790M, c-Met amplified)
no HGF HGF 50ng/ml no HGF HGF 50ng/ml
hu8C4 x Vectibix scFv 0.70 0.24 > 100 4.2
hu8C4 AH71 x Erbitux scFv HL 0.51 0.22 > 100 8.5
hu8C4 AH85 x Erbitux scFv HL 0.43 0.23 > 100 7.6
hu8C4 AL194 x Erbitux scFv HL 0.41 0.24 > 100 19.0
hu8C4 A56 x Erbitux scFv HL 0.42 0.29 > 100 21.7
hu8C4 A62 x Erbitux scFv HL 0.74 0.28 > 100 40.2
hu8C4 A70 x Erbitux scFv HL 0.74 0.23 > 100 40.9
hu8C4 A72 x Erbitux scFv HL 0.78 0.23 > 100 19.5
hu8C4 A73 x Erbitux scFv HL 0.87 0.26 > 100 38.4
hu8C4 A76 x Erbitux scFv HL 0.73 0.21 > 100 10.3
hu8C4 A78 x Erbitux scFv HL ND ND > 100 7.4
hu8C4 AH71 x Erbitux scFv LH 0.85 0.29 > 100 > 100
hu8C4 AH85 x Erbitux scFv LH 1.00 0.32 > 100 62.9
hu8C4 AL194 x Erbitux scFv LH 0.97 0.36 > 100 > 100
hu8C4 AH71 x Vectibix scFv 0.60 0.17 > 100 24.2
hu8C4 AH85 x Vectibix scFv 0.64 0.20 > 100 26.2
hu8C4 A76 x Vectibix scFv 0.62 0.19 > 100 28.3
그 결과, U-87 MG 종양 세포주에서 상기 방법으로 제작된 이중항체간의 효능에는 차이가 없었으며, hu8C4 최적화 항체의 IC50 대비 약 15 배 이상의 활성 억제 효능이 우수함을 확인하였다. 또한, NCI-H1993, NCI-H292, NCI-H820 폐암 세포주를 이용한 종양 세포 증식 저해 활성 평가 결과 제작된 이중항체간의 효능 차이는 없음을 확인하였다.
이러한 결과는 본 발명의 항체가 c-Met, EGFR의 이상발현 또는 돌연변이와 관계없이 모든 암종에 대해 증식 억제 효과가 있으며, 따라서 이들 암종에 효과적으로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 7. 병용 요법 대비 이중항체의 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성 비교 평가
c-Met과 EGFR을 각각 표적으로 하는 각 항체의 병용 요법과 본 발명의 이중항체의 종양 세포 증식 저해 활성을 비교하기 위하여 8 가지 암 종을 이용하였다.
구체적으로, 폐암 세포주 NCI-H292 (ATCC, #CRL-1848), HGF-자가분비 교모세포종 세포주 U-87 MG (ATCC, #HTB-14), 폐암 세포주 NCI-H1648 (ATCC #CRL-5882)와 NCI-H596 (ATCC #HTB-178), HCC827 (ATCC, #CRL2868), 대장암 세포주 LS174T (ATCC, #CL-188), 삼중음성 유방암 (TNBC, triple negative breast cancer) 세포주 BT20 (ATCC, #HTB-19) 및 췌장암 세포주 KP4 (JCRB, #RCB1005)에서 종양 세포 증식 저해 활성 평가를 수행하였다. 상기 NCI-H1648 세포주는 EGFR과 c-Met이 정상적으로 발현되어 있고, NCI-H596 세포주는 MET 유전자의 exon 14번에 일부 서열이 결손되어 있고, HCC827 세포주는 EGFR 유전자의 엑손 19번에 일부 서열이 결손되어 있는 특징을 갖는다. 또한, LS174T 세포주는 KRAS 변이를 갖고 있으며, KP4는 HGF를 자가분비하는 특징을 갖는다.
U-87 MG 세포주는 실시예 1의 방법으로, NCI-H292 세포주는 실시예 6의 방법으로 평가를 수행하였다. 또한, NCI-H1648, NCI-H596 및 HCC827 세포주의 경우, 10 % (v/v) FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지 (Gibco, #A10491)에 희석하여 96-웰 플레이트의 각 웰에 2.0 × 103 개 씩 분주, LS174T 세포주는 10 % (v/v) FBS를 함유하는 DMEM 배지 (Gibco, #11995-065)에 희석하여 2.0 × 103 개 씩 분주, BT20 세포주는 10 % (v/v) FBS를 함유하는 EMEM 배지 (ATCC, #30-2003)에 희석하여 3.0 × 103 개 씩 분주, KP4 세포주는 10 % (v/v) FBS 함유하는 RPMI-1640 배지 (Gibco, #A10491)에 희석하여 1.5 × 103 개 씩 분주해 넣은 후 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 밤새 배양하였다. 이 후 플레이트의 각 웰을 무혈청 배지 100 ㎕로 교체한 후 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 18 시간 배양하였다. 그 다음 배지를 2 % (v/v) FBS 혹은 HGF 50 ng/ml을 함유하는 RPMI-1640 배지 100 ㎕로 교체한 후 시험 항체를 최종 농도 100 nM에서 1 pM이 되도록 1/10씩 순차적으로 희석(즉, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM 및 1 pM)하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 그 다음 플레이트를 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 5 일 동안 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고 TCA 용액을 200 ㎕씩 각 웰에 넣어 세포를 고정하였다. 통상적인 SRB colorimetric assay 방법에 따라 플레이트의 세포를 염색하고 microplate reader를 이용하여 540 nm 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
본 실시예의 결과를 표 18 내지 21, 도 6 내지 도 8에 나타내었다.
U-87 MG, NCI-H292 세포주에서 병용 요법과 이중항체 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성 비교평가
항체 Cell proliferation inhibition assay, IC50 (nM)
U-87 MG
(GBM, HGF autocrine)		 NCI-H292 (NSCLC)
No HGF HGF 50 ng/ml
Vectibix >100 0.09 >100
hu8C4 83.9 >100 >100
hu8C4 + Vectibix 병용 79.0 0.10 0.34
hu8C4 x Vectibix scFv 0.4 0.15 0.12
C-EM1-MAb > 100 5.29 5.73
C-LA480 858.8 - -
C-OA-5D5 171.9 - -
C-AbF46 > 100 - -
NCI-H1648, NCI-H596 세포주에서 병용 요법과 이중항체 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성 비교평가
항체 Cell proliferation inhibition assay, IC50 (nM)
NCI-H1648
(NSCLC)		 NCI-H596
(NSCLC, c-Met mutated)
No HGF HGF 50ng/ml No HGF HGF 50ng/ml
Vectibix > 100 > 100 > 100 > 100
hu8C4 > 100 > 100 > 100 2.3
hu8C4 + Vectibix 병용 > 100 > 100 > 100 2.4
hu8C4 x Vectibix scFv 15.4 29.5 > 100 0.4
LS174T, BT20, KP4 세포주에서 병용 요법과 이중항체 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성 비교평가
항체 Cell proliferation inhibition assay, IC50 (nM)
LS174T
(Colon, KRAS G12V)		 BT20
(TNBC)		 KP4
(Pancreas)
HGF 50ng/ml HGF 50ng/ml HGF autocrine
Vectibix > 100 > 100 > 100
hu8C4 > 100 > 100 42.0
hu8C4 + Vectibix 병용 34.4 > 100 36.4
hu8C4 x Vectibix scFv 33.4 ~ 100 27.0
C-EM1-MAb - > 100 > 100
HCC827, NCI-H596 세포주에서 병용 요법과 이중항체 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성 비교평가
항체 Cell proliferation inhibition assay, IC50 (nM)
HCC827
(NSCLC, EGFR mutated)		 NCI-H596
(NSCLC, c-Met mutated)
No HGF HGF 50 ng/ml HGF 50 ng/ml
Tarceva 2.96 > 100 > 100
Vectibix > 100 > 100 > 100
hu8C4 > 100 > 100 67.2
hu8C4 x Vectibix scFv > 100 > 100 0.8
LA480 > 100 > 100 > 100
INC280 > 100 > 100 42.5
EMD1214063 > 100 > 100 68.2
Xalkori - - 87.3
Tarceva + hu8C4 병용 3.24 3.09 -
Tarceva + hu8C4 x Vectibix scFv 병용 2.35 2.42 -
Tarceva + LA480 병용 3.24 4.78 -
Tarceva + INC280 병용 3.06 2.88 -
Tarceva + EMD1214063 병용 2.80 4.10 -
그 결과, 상기 8 가지 종양 세포주 모두에서 hu8C4, Vectibix 혹은 두 항체의 병용 요법 보다 본원발명의 이중항체의 종양 세포 증식 저해능이 우수한 것을 확인하였다. 또한, 대조 이중항체로 사용된 EM1-MAb (Janssen)과 비교했을 때 U-87MG, NCI-H292, BT20, KP4 세포주에서 현저히 우수한 종양 세포 증식 저해능을 확인하였다.
또한, U-87MG 세포주에서 c-Met 타겟 항체인 LA480 (Lilly), OA-5D5 (Genentech), AbF46 (삼성)과 비교했을 때, hu8C4와 hu8C4 x Vectibix scFv 모두 대조 항체 대비 우수한 종양 세포 증식 저해능을 확인하였다.
또한, HCC827 세포주에서 EGFR 타이로신 키나제 억제제인 Tarceva는 HGF 처리 조건에서 저항성을 보였으나, 이 조건에서 Tarceva와 hu8C4, hu8C4 x Vectibix scFv 또는 cMet 억제제를 병용 처리했을 때 종양 세포 증식 저해능이 우수함을 확인하였다.
또한, NCI-H596 세포주에서 다양한 EGFR 억제제 및 c-Met 억제제와 비교한 결과, EGFR 또는 c-Met 단일 타겟 약물에 비해 hu8C4 x Vectibix scFv의 종양 세포 증식 저해능이 우수함을 확인하였다.
실시예 8. ECD에 대한 결합력 측정 ( BIAcore )
다음으로, 세포외 도메인 (ECD)에 대한 본 발명의 c-Met 항체의 결합력을 측정하기 위해, 인간과 사이노몰거스 원숭이의 c-Met ECD와 EGFR ECD 대한 c-Met 항체 및 이중항체의 결합을 BIAcore를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 인간 c-Met ECD (ACROBiosystems, MET-H5227), 사이노몰거스 원숭이 c-Met ECD (Sino Biological, 90304-C08H), 인간 EGFR ECD strep (ACROBiosystems, EGR-H5285) 및 사이노몰거스 원숭이 EGFR ECD (Sino Biological, 90285-C08B)를 사용하였다.
먼저, 항-c-Met 항체와 이중항체를 포획하기 위해 Fc에 특이적인 항 Human IgG 항체 (SouthernBiotech, 2047-01)를 10000 RU의 수준으로 CM5 센서 칩에 고정시켰다. 항체를 1 - 2 μg/ml 농도로 HBS-EP 버퍼 (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005 % (v/v) Surfactant P20)에 희석하여 항 Human Ig Fc가 고정된 CM5 칩에 30 ㎕/min의 유속으로 10 - 120 초 동안 주입한 다음, 150 - 200 RU 범위로 포획하였다. 각각의 항원을 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 및 0.15625 nM로 희석하여 사용하였고, 낮은 농도부터 순차적으로 주입하였다. 그 다음 30 ㎕/min의 유속으로 5 분간 주입하여 결합시키고, 10 - 15분간 러닝 버퍼를 주입하여 해리시켰다. 15 ㎕의 10 mM Glycine-HCl (pH 1.5)을 사용하여 칩을 재생하였다. 각각의 사이클에 대한 결합 및 해리 속도는 BIAevaluation 소프트웨어 버전 4.1에서 "1:1 (랭뮈어 (Langmuir))결합" 모델을 이용하여 평가하였으며, 바이아코어 데이터를 표 22 및 표 23에 요약하여 나타내었다.
c-Met ECD에 대한 친화도 측정
hu8C4 결합상수
(kon, 1/Ms)		 해리상수
(koff, 1/s)		 항원에 대한 친화도
(KD, M)
인간 c-Met 6.77 x 105 2.148 x 10-4 3.173 x 10-10
사이노몰거스 원숭이 c-Met 7.467 x 105 3.447 x 10-4 4.616 x 10-10
hu8C4 AH71 결합상수
(kon, 1/Ms)		 해리상수
(koff, 1/s)		 항원에 대한 친화도
(KD, M)
인간 c-Met 8.306 x 105 8.301 x 10-5 9.993 x 10-11
사이노몰거스 원숭이 c-Met - - -
hu8C4 x Vectibix scFv 결합상수
(kon, 1/Ms)		 해리상수
(koff, 1/s)		 항원에 대한 친화도
(KD, M)
인간 c-Met 7.339 x 105 2.041 x 10-4 2.78 x 10-10
사이노몰거스 원숭이 c-Met 7.77 x 105 3.37 x 10-4 4.338 x 10-10
EGFR ECD에 대한 친화도 측정
Vectibix 결합상수
(kon, 1/Ms)		 해리상수
(koff, 1/s)		 항원에 대한 친화도
(KD, M)
인간 EGFR 5.278 x 105 1.5 x 10-4 2.841 x 10-10
사이노몰거스 원숭이 EGFR 9.37 x 105 1.963 x 10-4 2.095 x 10-10
hu8C4 x Vectibix scFv 결합상수
(kon, 1/Ms)		 해리상수
(koff, 1/s)		 항원에 대한 친화도
(KD, M)
인간 EGFR 7.776 x 104 1.257 x 10-4 1.617 x 10-9
사이노몰거스 원숭이 EGFR 1.424 x 105 1.274 x 10-4 8.942 x 10-10
상기 데이터는 본 발명의 hu8C4, hu8C4 x Vectibix scFv 이중항체가 인간 및 사이노몰거스 원숭이 c-Met ECD에 우수한 친화도로 결합함을 입증하는 것이다.
실시예 9. 다양한 동물 종의 c-Met ECD , EGFR ECD에 대한 c-Met 항체의 결합력 측정 (ELISA)
쥐, 사이노몰거스 원숭이 및 인간 c-Met ECD와 EGFR ECD 대한 c-Met 항체 및 이중항체의 결합을 ELISA를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 쥐 c-Met (Sino Biological Inc, 50622-M08H), 사이노몰거스 원숭이 c-Met (Sino Biological Inc, 90304-C08H), 인간 c-Met (R&D Systems, 358-MT), 쥐 EGFR (Sino Biological Inc, 51091-M08H), 사이오몰거스 원숭이 EGFR (Sino Biological, 90285-C08B) 및 인간 EGFR (Abcam, 155639) 항원을 모두 2 ㎍/ml 농도로 96-웰 플레이트에 분주하여 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 상온에서 1 시간 블록킹을 진행 후, hu8C4 x Vectibix scFv 이중항체를 100 nM부터 1/5씩 순차 희석하여 7 개 농도 구간 (즉, 100 nM, 20 nM, 4 nM, 800 pM, 160 pM, 32 pM 및 6.4 pM)에서의 결합능을 측정하고자 하였다.
hu8C4 x Vectibix scFv 이중항체를 상온에서 1 시간 결합시킨 후, 항-인간 IgG, F(ab’)2 fragment specific-HRP conjugated 항체 (Jackson Immunoresearch, 109-035-097)를 1 : 2500으로 희석하여 상온에서 1 시간 반응시켰다. 발색은 TMB (Sigma, T4444) 용액을 이용하여 이루어졌으며, 값은 450 nm의 흡광도에서 측정하고, ELISA 결과를 도 9에 나타내었다.
그 결과, hu8C4 단독항체와 hu8C4 x Vectibix scFv 이중항체는 쥐 c-Met과 쥐 EGFR에는 결합하지 않고, 원숭이와 인간 c-Met, EGFR에는 결합함을 확인하였다. 또한, 음성 대조군으로 사용한 인간 IgG 항체는 모두 결합하지 않았음을 확인하였다. 상기 결과는 본 발명의 c-Met 항체가 인간과 원숭이의 c-Met 및 EGFR에만 특이적이라는 것을 시사한다.
실시예 10. 세포 표면의 다양한 수용체에 대한 c-Met 항체의 교차반응성
본 발명에 따른 c-Met에 특이적으로 결합하는 hu8C4 항체의 특이성 및 타 receptor tyrosine kinase 항원에 대한 교차반응성을 간접 ELISA 방법으로 분석하였으며, 주요 receptor tyrosine kinase 중 FGF R3, VEGFR R2, IGF IR, PDGF R 및 RON의 5 가지 항원을 선택하여 분석을 진행하였다.
본 실시예에서는 항원으로 인간 c-Met Fc 키메라 (R&D systems, 358-MT_CF), 인간 FGF R3 (IIIc) Fc 키메라 (R&D systems, 766-FR), 인간 IGF-I R (R&D systems, 391-GR-050), 인간 PDGF Rβ Fc 키메라 (R&D systems, 385-PR_CF), 인간 VEGF R2 Fc 키메라 (R&D systems, 357-KD_CF) 및 인간 MSP R/Ron (R&D systems, 1947-MS-050)을 사용하였다.
0.05 M carbonate-bicarbonate (Sigma, C3041) 버퍼에 1 ㎍/ml의 농도로 각 항원을 희석하여 96-웰 플레이트 (Corning, #2592)의 각 웰에 첨가한 뒤, 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 상기 플레이트를 TBS-T로 1 회 세척하고 비특이적인 결합을 저해하기 위하여 4 % - skim milk가 포함된 TBS-T로 각 웰에 200 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응하였다. 이후 TBS-T 버퍼로 1 회 세척 후, 일차 항체를 2 % - skim milk가 포함된 TBS-T 버퍼에 최고 농도 30 nM에서 0.002 nM까지 순차적으로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. TBS-T 버퍼로 3 회 세척 후, 이차항체로 항-인간 kappa light chains-peroxidase (Sigma, A7164)를 1 : 5000 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이후 TBS-T 버퍼로 3 회 세척한 후 TMB 용액 (Sigma, T4444)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 발색 반응을 진행시킨 후, 2 N ammonium sulfate 용액을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 중단시켰다. 흡광도 측정은 microplate reader를 이용하여 450 nm 파장의 값을 측정하였으며 레퍼런스 파장은 570 nm를 사용하였다. 각 항원에 대한 항 c-Met 항체의 결합 정도는 흡광도 신호 값에 비례적이며, 그 결과를 표 24에 나타내었다.
다양한 항원에 대한 항 c-Met 항체 hu8C4의 결합 특이성
　 hu8C4 binding (A 450nm - A 570nm )
Ab.농도 (nM) c-Met IGF-IR RON PDGFR VEGFR2 FGFR3
30.000 2.55 2.51 0.00 0.00 0.00 0.00 0.01 0.01 0.00 0.01 0.01 0.02
6.000 1.96 2.03 0.00 0.00 0.00 0.00 -0.01 -0.01 -0.01 -0.01 0.00 0.01
1.200 1.81 1.74 0.00 0.00 0.00 0.00 -0.01 -0.01 -0.01 -0.01 0.00 0.01
0.240 1.48 1.54 0.00 0.00 0.00 0.00 -0.01 -0.01 -0.02 -0.02 -0.01 0.00
0.048 0.76 0.76 0.00 0.00 0.00 0.00 -0.01 -0.01 -0.02 -0.01 0.00 0.00
0.010 0.21 0.20 0.00 0.00 0.00 0.00 -0.01 -0.01 -0.01 -0.01 0.00 0.00
0.002 0.05 0.05 0.00 0.00 0.00 0.00 -0.01 -0.01 -0.01 -0.01 0.00 0.00
Blank 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
표 24에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 hu8C4 항체는 c-Met에 대하여 우선적으로 결합하며, 타 항원인 FGF R3, VEGFR R2, IGF IR, PDGF R 및 RON에 대하여는 거의 결합하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 11. c-Met 항체의 in vitro 내재화 (internalization) 활성 및 이중항체의 c-Met 레벨 억제활성
본 발명의 c-Met 항체의 in vitro 종양 세포 내 내재화 활성 및 c-Met과 EGFR에 동시에 결합할 수 있는 이중항체에 의한 수용체 레벨 감소 효과를 확인하였다.
먼저, 항체 내재화 (internalization)는 정상적인 수용체 생리활성에 의해 일어나는데, 보통 세포 외부에 발현되어 있는 수용체는 특이적인 리간드와 결합하면 호모- 또는 헤테로-이합체화 반응(dimerization)을 통해 활성화되며 수용체-매개 엔도시토시스를 일으키게 된다. 세포의 수용체에 특이적인 항체는 이러한 현상을 유도할 능력을 가지고 있으며, 엔도시토시스를 유발하여 세포 내부로 내재화되고, 결과적으로 수용체의 분해를 유도하여 그 발현 정도를 낮추고 특정 수용체에 의한 신호전달을 저해시킬 가능성이 있다. FACS (Fluorescence-activated cell sorting) 분석기기를 이용하여 세포 외부에 결합되어 있는 항체의 양을 탐지할 수 있으므로, 세포 내부로 내재화된 항체의 양을 알 수 있다. 측정 하고자 하는 항체의 경쇄에 대한 이차항체로 항-인간 kappa LC에 FITC가 결합되어 있는 항체를 사용하여 결합시키면, 내재화되지 않고 세포 외부의 표적 수용체에 결합한 채로 남아있는 항체의 양을 정량적으로 측정할 수 있어, 이로부터 내재화된 항체의 양을 확인할 수 있다. 항원에 대하여 비특이적인 인간 IgG 항체를 이용하여 시험에 사용하는 항체의 비특이적 결합에 의한 백그라운드 신호를 측정하여 실제 특이적 결합에 의한 형광 신호를 측정하는 것이 가능하다.
본 실시예에서는 in vitro에서 c-Met 항체의 종양 세포 내 내재화 활성을 확인하기 위하여, 위암 세포주인 MKN45 세포주 (#JCRB0254)를 사용하였다. MKN45는 MET 유전자의 증폭에 의하여 c-Met 수용체를 고수준으로 발현하며, 그 결과 HGF-비의존적 양상으로 c-Met 수용체의 인산화가 유도된다. 항 c-Met 항체인 hu8C4에 의하여 c-Met 수용체가 세포 내부로 내재화되어 발현 수준을 감소시킬 수 있는지 알아보기 위하여 다음과 같이 시험하였다.
먼저, 10 % (v/v) FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지 (2 ml)가 포함된 6-웰 플레이트에 MKN45 위암 세포주를 각 웰 당 5.0 x 105 개 씩 분주하고, 상기 플레이트를 24 시간 동안 37 ℃, 상대 습도 95 % 및 5 % CO2 조건에서 배양하였다. 분석하고자 하는 항 c-Met 항체 및 항 IgG 항체 (대조군)를 최종 농도 100 nM이 되도록 희석하여 처리하고 밤새 반응시켰다. 비-내재화 대조군으로 사용할 플레이트는 항 c-Met 항체 및 인간 IgG 항체 (대조군)로 처리하고 4 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이 후 무효소 세포 (enzyme-free cell) 해리버퍼 (Gibco, #13151) 1 ml로 각 웰의 세포를 채취하고 차가운 PBS로 두 번 세척하였다. 이차항체로 항-인간 kappa LC-FITC (LSBio #LS-C60539)를 1 : 2000 희석하여 첨가한 후, 4 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 다음, PBS로 세포를 2 회 세척한 후 BD Cytofix(BD, #554655) 100 ㎕씩으로 고정시키고, PBS로 1 회 세척 후 BD FACS Canto II 유세포 분석기를 이용하여 형광 염색 정도 FITC Geo-mean(MFI) 값을 측정하였다. 세포 외부에 결합되어 있는 항체의 양은 하기의 계산식에 의하여 얻었으며, 그 결과를 표 25에 나타내었다.
Surface bound Ab(%) = [(MFI [37℃ exp.] - MFI [IgG control] ) / (MFI [4℃ control] - MFI [IgG control] )] x 100
MKN45 위암 세포주에 대한 hu8C4 및 OA-5D5 대조 항체의 internalization 측정
Antibody OA-5D5 hu8C4
FITC MFI [IgG control] 127 127
FITC MFI [4℃ control] 1763 1444
FITC MFI [37℃ exp.] 1724 858
Surface bound Ab(%) 98 56
상기 표 25에서 확인되는 바와 같이, 대조군으로 사용한 항 c-Met 항체인 OA-5D5는 세포 내부로 거의 내재화되지 않은 반면, 본 발명의 hu8C4 항체는 MKN45 위암 세포주에서 세포 내부로 약 40 % 이상이 내재화됨을 알 수 있었다. 이는 곧 hu8C4 항체가 c-Met 수용체의 발현 수준을 현저히 감소시킴을 나타낸다.
다음으로, c-Met 수용체와 EGFR 수용체에 동시에 결합할 수 있는 이중항체에 의한 수용체 레벨 감소 효과를 확인하기 위하여 NCI-H820 폐암 세포주에 대한 수용체 레벨 측정 시험을 수행하였다. 상기 NCI-H820 세포주는 c-Met 수용체가 약 83,000 SABC (Specific antibody-binding capacity), EGFR 수용체가 약 74,000 SABC 수준으로 발현되어 있어, 항 c-Met x EGFR 이중항체에 의한 수용체 레벨 감소 효과를 측정하기에 적합한 세포주이다.
먼저, 10 % (v/v) FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지 (2 ml)가 포함된 6-웰 플레이트에 NCI-H820 세포주를 각 웰 당 1.0 x 105 개 씩 분주하고, 상기 플레이트를 24 시간 동안 37 ℃, 상대 습도 95 % 및 5 % CO2 조건에서 밤새 배양하였다. 이후 혈청이 포함되어 있지 않은 배지로 교체하고, 플레이트를 24 시간 동안 37 ℃, 상대 습도 95 % 및 5 % CO2 조건에서 밤새 배양하였다. 그 다음, 분석하고자 하는 항 c-Met 항체, 항 c-Met x EGFR 이중항체, 항 EGFR 항체 및 대조군으로 인간 IgG 항체를 2 % - FBS가 포함된 배지에 최종 농도 10 nM이 되도록 희석하여 처리하고, 5 일 간 배양시켰다. 그 다음, 각 웰의 세포를 무효소 세포 해리버퍼 1 ml로 채취하고 차가운 PBS로 두 번 세척하였다. 그 다음, 이차항체로 Goat F(ab`)2 항-마우스 IgG-CSF (R&D Systems Cat.#F0103B)를 각 웰에 10 ㎕씩 첨가한 후, 4 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 다음, PBS로 세포를 2 회 세척한 후 BD Cytofix (BD, #554655) 100 ㎕로 고정시키고, 이후 PBS로 1 회 세척 후 BD FACS Canto II 유세포 분석기를 이용하여 형광 염색 정도 FITC Geo-mean(MFI) 값을 측정하였다.
그 결과, 항 c-Met 항체인 hu8C4 처리 시 EGFR 수용체는 거의 감소되지 않았으나, c-Met 수용체는 2 % 수준으로 현저히 감소되었다 (도 10). 또한, 항 EGFR 항체인 Vectibix는 EGFR 수용체를 약 83 % 수준으로 감소시켰으나, c-Met 수용체는 거의 감소되지 않았다. 이에 비하여 c-Met과 EGFR 수용체에 동시에 결합하는 본 발명의 hu8C4 x Vectibix 이중항체를 처리한 경우, EGFR 수용체는 약 21 % 수준으로, c-Met 수용체는 약 4 % 수준으로 감소된 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 hu8C4 x Vectibix 이중항체는 c-Met 및 EGFR 수용체의 발현 수준을 동시에 현저히 감소시킴을 확인하였다.
실시예 12. 이중항체의 c-Met 및 EGFR in vitro 신호저해 활성 확인
다음으로, 본 발명의 이중항체가 항원 및 신호전달 물질의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, NCI-H820 세포주를 이용하여 실험을 수행하였다.
먼저, NCI-H820 세포주를 웰 당 5 x 105 개 세포의 농도로 6-웰 플레이트에 분주하고, 37 ℃, 5 % CO₂조건에서 밤새 배양시킨 후, 무혈청 배지로 교체하여 다시 밤새 배양하였다. 항체는 100 nM 농도로 무혈청 배지에 희석한 것을 처리하여 24 시간 반응시키고, 세포 채취 15 분 전 HGF (Gibco, PHG0254)와 EGF (R&D Systems, 236-EG-200)를 각각 50 ng/ml 및 10 ng/ml의 농도로 처리하였다. 그 다음, 용해버퍼에 상기 세포를 용해하여 세포 채취를 진행하고, Lowry assay 법을 이용하여 단백질 농도를 정량하였다. SDS-PAGE에 웰당 20 ㎍의 단백질을 로딩하여 런닝한 후, 니트로섬유소막에 블롯팅하였다. 상기 막을 블록킹 후, 모든 일차항체를 1 : 1,000 비율로 희석하여 반응시키고, 이차항체는 HRP-결합 항-토끼 항체를 1 : 5,000으로 희석하여 반응시켰다. 그 다음, 막에 흡착된 항체를 ECL (enhanced chemiluminescence)과 반응시킨 후, LC-3000 기기를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 11에서 확인되는 바와 같이, hu8C4 x Vectibix scFv 이중항체 처리 시, EGFR 인산화, Erk 인산화 및 Akt 인산화가 hu8C4 또는 Vectibix 항체를 단독으로 처리했을 때보다 현저히 감소함을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 hu8C4 x Vectibix scFv 이중항체는 NCI-H820 세포주에서 EGFR, Erk, Akt 등의 수용체 및 하위 신호전달 물질의 활성을 감소시킬 수 있다. 이는 곧 본 발명의 항체가 신호전달 저해를 통해 효능을 나타냄을 보여주는 결과이다.
실시예 13. U-87 MG 이종이식 마우스 모델에서의 종양 세포 증식 저해 활성 확인
HGF 의존적 U-87 MG 세포 이종이식편 모델에서 본 발명의 이중항체에 의한 종양 세포 증식 저해 활성을 확인하기 위하여, 대표적으로 hu8C4 IgG2 x Vectibix scFv를 이용하여 실험을 수행하였다.
먼저, 인간 교모세포종 U-87 MG 세포주를 L-글루타민 (300 ㎎/ℓ), 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO3 및 10 % 비동화 (heat inactivated) FBS 등이 함유된 EMEM (ATCC® 30-2003™) 배지를 이용하여 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 배양시켰다. 그 다음, 6 - 8 주령의 수컷 무흉선 누드 마우스 (Harlan)의 옆구리에 U-87 MG 세포를 마우스 당 1 x 107 개의 농도로 200 ㎕씩 피하 접종하였다. 접종 25 일 후 형성된 종양 부피가 60 - 130 mm3에 도달한 것을 확인한 뒤 그룹 분리를 실시하였으며, 시험물질을 주 1 회 4 주간 총 5 회 (0, 7, 14, 21 및 28 일) 복강 투여하였다. 시험물질은 5 mg/kg으로 투여하였으며, 종양 부피와 마우스 체중은 주 2 회 측정하였다. 데이터에 대한 부형제 대조군과 시험물질 투여군 간의 비교는 일반적으로 Student t-test를 사용하여 검정하였으며, 통계방법은 Origin Pro 8.5 프로그램을 이용하였다. "최대 저해 %"는 용매 대조군 처리에 비해 종양 성장의 저해 %를 나타낸다.
그 결과, hu8C4 IgG2 x Vectibix scFv의 3.5 mg/kg 및 6.8 mg/kg 투여군은 용매 대조군 대비 종양 부피를 최대 저해 96 %, 1.5 mg/kg 투여군은 최대 80 %로 저해하여, 투여 7 일부터 시험 종료일까지 유의성 있는 수준으로 종양 부피를 감소시켰다 (p < 0.01) (도 12). 또한, 양성 대조군인 BsAB-01와 비교했을 때, 본 발명의 이중항체는 유의성 있는 수준으로 종양 성장을 감소시켰다 (p < 0.01).
따라서, 상기 결과로부터, 본 발명의 이중항체는 종양 성장을 현저히 감소시켜 항-종양 효능이 우수함을 확인하였다.
실시예 14. NCI-H820 이종이식 마우스 모델에서의 종양 세포 증식 저해 활성 확인
NCI-H820 세포주는 EGFR 아미노산 790 번의 트레오닌 (T)이 메티오닌 (M)으로 변이되고, MET 유전자가 증폭된 세포주로, 3 세대 EGFR TKI인 AZD9291 (osimertinib, tagrisso)의 저항성 세포주로 알려져 있다 (Darren A. E. Cross, et al., Cancer Discov. 4(9): 1046-1061 (2014)). 이러한 EGFR TKI에 저항성을 갖는 NCI-H820 세포주에서 이중항체의 종양 세포 증식 저해 활성을 알아보기 위하여, 본 발명의 이중항체 중 대표적으로 hu8C4 x Vectibix scFv을 이용하여 NCI-H820 이종이식 마우스 모델에서의 평가를 수행하였다.
구체적으로, 본 실시예에 사용된 마우스는 마우스 HGF 유전자를 제거하고, 인간 HGF 유전자를 발현할 수 있도록 형질변환시킨 마우스 (Jackson Laboratory, STOCK Hgftm1.1(HGF)Aveo Prkdcscid/J)로 6 주령의 수컷을 사용하였다. NCI-H820 (ATCC, #HTB-181) 세포주를 10 % FBS가 함유된 RPMI1640 배지와 함께 세포 배양용 플라스크에 넣고 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 배양시켰다. 그 다음, 세포를 PBS로 세척하고, 2.5 % 트립신-EDTA (Gibco, 15090)를 10 배 희석한 다음, 이를 첨가하여 세포를 분리하였다. 그 다음, 원심분리 (1,000 rpm, 5 분)하여 상층액을 버린 뒤, 새로운 배지에 세포 부유액을 얻었다. 그 다음, 현미경을 이용하여 생존도를 확인한 후, 5.0 x 107 개 세포/ml의 농도로 무혈청 배지에 희석하여 세포주를 준비하였다. 상기 준비된 세포주를 0.1 ml/head의 투여액량으로 마우스에 피하 투여하였다. 투여 후, 세포주를 이식한 부위의 종양 크기가 약 100 - 150 mm3에 도달하였을 때, 순위화한 종양의 크기에 따라 각 군의 종양 크기가 최대한 균일하게 분포하도록 분배하였다. 그 다음, 세포 투여 개시 후 7 일째부터 군 분리일 (시험물질 투여개시일) 및 시험물질 투여 종료 후 28 일째까지 주 2 회 종양 발생을 확인하고, 캘리퍼스 (calipers)를 이용하여 종양의 장축 및 단축을 측정하여 종양 크기 (ab2/2 (a:장축 길이, b: 단축 길이))를 산출하였다. 통계학적 분석은 Prism 5.03 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 실시하였으며, p 값이 0.05 미만일 경우, 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다.
그 결과, 시험물질 투여 개시 후 4 일째부터 28 일째까지 hu8C4 x Vectibix scFv 투여한 모든 군에서 종양 증식 저해 활성이 용매 대조군에 비하여 유의하게 높은 것으로 나타났고 (p<0.001), 종양 저해율은 최대 100 %임을 확인하였다 (도 13). 반면, 양성 대조군으로 사용한 AZD9291 (Selleckchem)은 용매 대조군과 유의적 차이가 없었다.
실시예 15. 5G3 c-Met 항체 및 HER2 항체 병용 투여에 의한 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성 확인
본 발명의 항 c-Met 항체인 5G3과 항 HER2 항체의 병용에 따른 종양 세포 증식 저해 활성을 평가하기 위하여, NCI-H2170 세포주를 이용하여 in vitro 세포 증식 저해 활성 시험을 수행하였다. NCI-H2170 세포주 (ATCC #CRL-5928)는 NSCLC (nonsmall cell lung cancer) 종양 세포주로서 수용체 레벨 측정 결과 EGFR은 약 2,700 SABC (Specific antibody-binding capacity), c-Met은 약 11,000 SABC 수준으로 발현하고 있었다.
구체적으로, NCI-H2170 세포를 10 % (v/v) FBS 함유하는 RPMI-1640 배양 배지에 희석하여 각 웰 당 3.0 × 103 개 세포의 농도로 100 ㎕씩 첨가한 후, 플레이트를 18 ~ 24 시간 동안 37 ℃, 95 % 상대습도 및 5 % (v/v) CO2 조건 하에 배양하였다. 그 다음, 각 웰의 세포 배양 배지를 제거한 후, 2 % (v/v) FBS가 포함된 RPMI-1640 배지를 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하였다. 그 다음, 최종 농도 (100 nM)의 2X로 제조한 항체를 1/10 연속 희석하여 각 항체 별 6 개 농도 (즉, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM 및 2 pM)로 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 상기 플레이트를 37 ℃, 95 % 상대습도 및 5 % (v/v) CO2 조건 하에서 5 일 동안 배양하고, 마지막 날 각 웰에 20 ㎕의 WST-8 용액 (CCK-8, Dojindo)을 첨가하여 1 - 2시간 동안 발색한 후, microplate reader 기기를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
세포 증식 저해 활성에 대한 결과를 표 26 및 도 14에 나타내었다.
항 c-Met 항체와 항 HER2 항체 병용 요법 in vitro 종양 세포 증식 저해 활성
항체 Cell proliferation inhibition assay, IC50 (nM)
NCI-H2170 (NSCLC)
No HGF HGF 50ng/ml
A091-F1 > 100 > 100
5G3 > 100 > 100
A091-F1 + 5G3 병용 > 100 11.22
표 26에서 확인되는 바와 같이, NCI-H2170 종양 세포주에서 5G3 및 항 HER2 항체인 A091 항체 (대한민국 등록특허 제10-1515535호)의 병용 처리는 각 항체의 단독처리 보다 종양 세포 증식 저해능이 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 16. NCI-H2170 인간 폐암 세포주 이종이식 마우스 모델에서의 5G3 c-Met 항체 및 HER2 항체 병용 투여에 의한 in vivo 종양 세포 증식 저해 활성 확인
HER2 항체 및 c-Met 항체의 병용 효능을 알아보기 위하여, 폐암 세포주인 NCI-H2170 이종이식 마우스 모델에서 항암 활성 실험을 수행하였다.
구체적으로, 본 실시예에서는 상기 실시예 13과 동일한 마우스를 이용하여, 실시예 14와 동일한 방법으로 마우스의 종양 크기를 측정하였다. NCI-H2170 폐종양 세포 이종이식편 모델에서 A091과 5G3 병용에 의한 항-종양 효능 평가 결과를 도 15에 나타내었다.
그 결과, A091 단독 또는 A091과 5G3을 병용 투여한 경우, 투여 14 일 이후부터 종양 부피가 용매 대조군에 비해 유의성 있는 수준으로 감소하였다 (p < 0.05). 또한, A091과 5G3을 병용 투여한 군은 단독 투여군인 A091 또는 대조 이중항체인 BsAB02 (US2010/0254988 A1) 투여군에 비해 유의성 있는 종양 부피의 감소가 나타났다 (p < 0.01).
실시예 17. NCI-H596 이종이식 마우스 모델에서의 종양 세포 증식 저해 활성 확인
NCI-H596 세포주는 c-Met의 exon14에 변이가 있는 폐암 세포주로, hu8C4 x Vectibix scFv의 항암효과를 확인하기 위하여 NCI-H596 이종이식 마우스 모델에서 평가를 수행하였다.
본 실시예에서는 상기 실시예 14와 동일한 마우스 및 동일한 방법을 이용하여 마우스의 종양 크기를 측정하였다.
NCI-H596 폐종양 세포 이종이식편 모델에서 hu8C4 x Vectibix scFv를 주 2 회, 혹은 주 1 회로 4 주 투여한 항암 효능 평가 결과를 도 16에 나타내었다.
종양 크기 측정 결과, 시험물질 투여 개시 후 11 일째부터 실험 종료 시까지 hu8C4 x Vectibix scFv 10 mg/kg, 주 2 회 투여군의 종양 크기 수준이 대조군 대비 통계학적으로 유의미한 차이를 나타내었으며, hu8C4 x Vectibix scFv 5 mg/kg, 주 2 회 투여군 및 hu8C4 x Vectibix scFv 10 mg/kg, 주 1 회 투여군 또한 시험물질 투여개시 후 18 일째부터 대조군에 비하여 유의하게 낮은 것으로 나타났다. 또한, 시험물질 투여군의 종양 크기 수준은 시험물질 투여량에 따라 용량상관성 있는 종양 크기 수준의 변화 경향을 나타내었고, 시험물질 투여 종료일 (Day 28) 이후 시험군의 종양 크기 또한 대조군에 비하여 낮은 것으로 나타났다.
실시예 18. EBC -1 이종이식 마우스 모델에서의 종양 세포 증식 저해 활성 확인
EBC-1은 c-Met 유전자가 증폭된 폐암 세포주로, hu8C4 x Vectibix scFv의 항암효과를 확인하기 위하여, EBC-1 이종이식 마우스 모델에서의 평가를 수행하였다.
본 실시예에 사용된 마우스는 Athymic nude 마우스(Harlan)로 6 주령의 암컷을 사용하였다. EBC-1 (JCRB, #JCRB0820) 세포주를 10 % FBS가 함유된 EMEM 배지와 함께 세포 배양용 플라스크에 넣고 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 배양시켰다. 5.0 x 107 개 세포/ml의 농도로 무혈청 배지에 희석하여 세포주를 준비하고, 0.1 ml/head의 투여액량으로 마우스에 피하 투여하였다. 세포주를 이식한 부위의 종양 크기가 약 100 - 150 mm3에 도달하였을 때 hu8C4 x Vectibix scFv를 주 2 회, 혹은 주 1 회로 4 주 동안 투여하였고, 실시예 14와 동일한 방법을 이용하여 마우스의 종양 크기를 측정하였다.
EBC-1 폐종양 세포 이종이식편 모델에서 hu8C4 x Vectibix scFv에 의한 항암 효능 평가 결과를 도 17에 나타내었다.
종양 크기 측정 결과, 시험물질 투여 개시 후 7 일째부터 시험물질 투여 개시 후 56 일째까지 hu8C4 x Vectibix scFv 10 mg/kg, 주 2 회 투여군의 종양 크기 수준이 대조군 대비 통계학적으로 유의미한 차이를 나타내었다. hu8C4 x Vectibix scFv 5 mg/kg, 주 2 회 투여군과 10 mg/kg, 주 1 회 투여군은 시험물질 투여 개시 후 18 일째부터 대조군에 비하여 유의하게 낮은 것으로 나타났다. 또한, 시험물질 투여군의 종양 크기 수준은 시험물질 투여량에 따라 용량상관성 있는 종양 크기 수준의 변화 경향을 나타내었고, 시험물질 투여 종료일 (Day 28) 이후 관찰 기간 동안 hu8C4 x Vectibix scFv 10 mg/kg, 주 2 회 투여군의 종양 크기 수준은 시험물질 투여 개시 후 56 일째까지 대조군에 비하여 유의하게 낮은 것으로 나타났다. 특히, 시험물질 투여개시 후 18 일째에 hu8C4 x Vectibix scFv 10 mg/kg, 주 2 회 투여군 중 한 개체는 완전 반응 (Complete response)이 관찰되었다.
실시예 19. 이중항체의 암 세포 표면 c-Met, EGFR 감소 효과
본 발명의 이중항체 (hu8C4 x Vectibix scFv)에 의한 in vitro 종양 세포 표면의 c-Met과 EGFR 감소 효과를 확인하고, 본 발명의 c-Met 항체 (hu8C4), vectibix, c-Met/EGFR 병용 및 기타 항체에 의한 효과와 비교하였다.
일반적으로 세포막에 위치하는 수용체는 항체와 결합 시 세포 내로 내재화 (internalization)되어 세포막에 위치하는 양이 감소한다. 이러한 세포막에서의 수용체 감소는 리간드 결합에 의한 수용체 활성화 억제 및 수용체에 의한 그 하위 신호의 저하를 유발한다.
본 실시예에서는 세포막 c-Met과 EGFR의 감소를 관찰하기 위하여 폐선암 세포주인 HCC827을 이용하였다. HCC827은 EGFR E746-A750 결손 변이를 가지고 있으며, c-Met을 과발현한다. HCC827에 본 발명의 이중항체 (hu8C4 x Vectibix scFv) 및 기타 항체를 처리하고 c-Met과 EGFR에 특이적인 항체를 이용하여 면역형광염색 (immunofluorescence staining)을 한 후 유세포분석기 (fluorescence activated cell sorter)로 분석하여, 세포 표면의 c-Met과 EGFR의 양을 측정하였다. 구체적인 실시 방법은 다음과 같다.
먼저, 10 % (v/v) FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지 (2 ml)가 포함된 6-웰 플레이트에 HCC827 세포 (ATCC® CRL-2868™)를 각 웰 당 3.0 x 105 개 씩 분주하고, 상기 플레이트를 24 시간 동안 37 ℃, 상대 습도 95 % 및 5 % CO2 조건에서 배양하였다. 본 발명의 이중항체 (hu8C4 x Vectibix scFv), 본 발명의 c-Met 항체 (hu8C4), vectibix, 본 발명의 c-Met 항체 (hu8C4)와 vectibix의 혼합물, C-EM1 및 LA480을 최종 농도 100 nM이 되도록 희석하여 처리하고 18 시간 동안 반응시켰다. c-Met과 EGFR의 비-감소 대조군으로 사용할 플레이트는 인간 IgG 항체를 처리하고 18 시간 동안 반응시켰다. 이후 무효소 세포 (enzyme-free cell) 해리버퍼 (Gibco, #13151) 500 ㎕로 각 웰의 세포를 채취하고 원심분리기로 세포와 무효소 세포 해리버퍼를 분리한 후 무효소 세포 해리버퍼를 제거하였다. 면역형광염색을 위해 염소 유래 c-Met 항체 (R&D systems, AF276), 염소 유래 EGFR 항체 (R&D systems, AF231) 또는 비특이적 염색양 측정을 위한 비특이적 염소 유래 항체 각 2 ㎍을 2 % (v/v) FBS를 함유하는 차가운 PBS 200 ㎕와 섞어 각 웰에 처리한 후, 4 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이 후 2 % (v/v) FBS를 함유하는 차가운 PBS로 두 차례 세척하였다. 이차항체로 ALEXA488이 결합되었으며 염소 항체와 결합하는 당나귀 유래 항체 (Thermo Fisher, A-11055) 1 ㎕를 2 % (v/v) FBS를 함유하는 차가운 PBS 200 ㎕에 희석하여 사용하였다. 이차항체와 4 ℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후 2 % (v/v) FBS를 함유하는 차가운 PBS로 세포를 2 회 세척하였으며, 이후 BD Cytofix(BD, #554655) 200 ㎕를 사용하여 고정시켰다. PBS로 1 회 세척 후 BD FACS Canto II 유세포분석기를 이용하여 형광 염색 정도 ALEXA488 Geo-mean (MFI) 값을 측정하였다. 세포막에 위치하는 c-Met과 EGFR의 양은 하기의 계산식에 의해 geo MFI (mean fluorescence intensity)로 나타내었다. 3 회 시험을 반복 수행한 값의 평균과 표준편차를 표 27과 도 18 및 19에 나타내었다.
c-Met or EGFR surface amount = geo MFI [실험군] - geo MFI [비특이적 염소유래 항체]
HCC827 세포주에 이중항체 (hu8C4 x Vectibix scFv) 등을 처리한 후 측정한 세포 표면 c-Met 및 EGFR 양
처리 항체 c-Met EGFR
평균
(geo MFI)		 표준편차 평균
(geo MFI)		 표준편차
human IgG 5653 1032 11494 3276
hu8C4 3436 892 11593 3448
Vectibix 5653 1309 10326 3256
hu8C4 + Vectibix 병용 3551 1047 10111 2932
hu8C4 x Vectibix scFv 1689 321 9930 3305
C-EM1 3665 878 11503 3715
C-LA480 3267 764 11655 4156
상기 표 27에서 확인되는 바와 같이, c-Met과 결합하는 항체들은 모두 세포 표면의 c-Met을 40~70% 감소시켰으며, EGFR과 결합하는 항체들은 10~15%의 미약한 감소 효과를 보였다. c-Met 감소 효과를 좀 더 살펴 보면 hu8C4, hu8C4 + Vectibix 병용, C-EM1 및 C-LA480은 약 40 % 내외의 세포 포면 c-Met을 감소시킨 반면, hu8C4 x Vectibix scFv는 70 %의 세포 표면 c-Met을 감소 시켜 타 항체 및 항체 조합 보다 우수한 세포 표면 c-Met 감소 효과를 보였다.
위의 결과는 본 발명의 이중항체 (hu8C4 x Vectibix scFv)가 세포 표면의 c-Met 양을 현격히 감소시킴을 보여주었다.
실시예 20. 에피토프 맵핑
본 발명의 이중항체 (hu8C4 x Vectibix scFv)의 인간 c-Met 항원에 대한 에피토프를 규명하기 위하여 오송첨단의료산업진흥재단 분자모델설계지원팀(Korea)에 분석을 의뢰하였다. 수소-중수소 교환 질량 분광법 (Hydrogen-deuterium exchange Mass Spectrometry, HDX-MS)을 사용하여 분석을 수행하였다.
c-Met 세마도메인은 α/β 두 사슬로 구성되어 있어서 두 사슬에 대한 각각의 커버리지 (coverage)를 확인하였으며, 시료 내 이황화결합이 다수 존재하는 이유로 퀀치 홀딩 (quench holding) 시간, TCEP 농도, 펩신 농도 등을 조절하여 펩타이드 커버리지를 최적화하였다. 최종적으로 퀀치 버퍼 (Quench buffer) 조건은 100 mM K. Phosphate, 125 mM TCEP, 0.5 M Guanidine-HCl, pH 2.66으로 실험을 수행하였다.
항원과 항체는 각각 3.3 mg/ml과 65 mg/ml 농도로 준비하였고, 37 pmol cMET 항원과 36 pmol 항체를 실험 전에 3 시간 이상 미리 결합시켰다. 중수소 라벨링 버퍼 (deuterium labeling buffer)를 0 분, 0.33 분, 10 분, 60 분, 240 분 동안 반응시켰다. 각각의 라벨링 시간에 맞춰 퀀치 버퍼로 라벨링을 중단하고 vortexing한 후 액체질소에 바로 얼려 분석 전까지 -80 ℃에 보관하였다. 질량분석기 (MS)로 펩신 컬럼에 로딩하여 분석하였다.
분석 결과, 본 발명의 이중항체 (hu8C4 x Vectibix scFv)는 인간 c-Met 세마도메인 β 사슬의 Y321~L329 (서열번호 331), I333~I341 (서열번호 332), P366~D372 (서열번호 333), 및 Q464~S474 (서열번호 334) 4 개의 부위에 입체적형태의 에피토프에 결합함을 확인하였다 (표 28). PyMOL 프로그램을 이용하여 인간 c-Met 항원 (PDB No. 4K3J) 3 차 구조상에 표지하여 도 20에 나타내었다.
에피토프 영역의 아미노산 서열
에피토프 영역 아미노산 서열 서열번호
Y321~L329 YVSKPGAQL 331
I333~I341 IGASLNDDI 332
P366~D372 PIKYVND 333
Q464~S474 QVVVSRSGPST 334
상기와 같은 결과들로부터, 본 발명의 c-Met에 특이적으로 결합하는 마우스 항체, 인간화 항체, 친화도 최적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 c-Met에 선택적으로 작용하여, 적은 양으로도 우수한 암 세포 증식 저해 활성 및 현저히 우수한 항암활성을 나타내며, 따라서 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> CHONG KUN DANG PHARMACEUTICAL CORP. <120> A novel anti c-Met antibody and use thereof <130> P17-025-REA-CKD <150> KR 10-2017-0067106 <151> 2017-05-30 <160> 335 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hybridoma 8C4 light chain CDR 1 <400> 1 Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hybridoma 8C4 light chain CDR 2 <400> 2 Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hybridoma 8C4 light chain CDR 3 <400> 3 Gln Asn Val Leu Ser Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hybridoma 5G3 light chain CDR 1 <400> 4 Ser Ala Thr Ser Ser Val Arg Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hybridoma 5G3 light chain CDR 2 <400> 5 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hybridoma 5G3 light chain 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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 340 345 350 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu 450 455 460 Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly 465 470 475 480 Ser Val Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro 485 490 495 Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr 500 505 510 Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr 515 520 525 Ser Lys Thr Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 530 535 540 Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp 545 550 555 560 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 565 570 575 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 580 585 590 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 595 600 605 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 610 615 620 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 625 630 635 640 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 645 650 655 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 660 665 670 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu 675 680 685 Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 690 695 <210> 330 <211> 699 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu8C4 AH85 x Vectibix scFv <400> 330 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Phe Pro Gly Trp Gly Asn Ser His Val Val Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Gln Asp Tyr Gly Phe Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 340 345 350 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu 450 455 460 Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly 465 470 475 480 Ser Val Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro 485 490 495 Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr 500 505 510 Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr 515 520 525 Ser Lys Thr Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 530 535 540 Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp 545 550 555 560 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 565 570 575 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 580 585 590 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 595 600 605 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 610 615 620 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 625 630 635 640 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 645 650 655 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 660 665 670 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu 675 680 685 Ala Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 690 695 <210> 331 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope region Y321~L329 <400> 331 Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu 1 5 <210> 332 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope region I333~I341 <400> 332 Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile 1 5 <210> 333 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope region P366~D372 <400> 333 Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp 1 5 <210> 334 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope region Q464~S474 <400> 334 Gln Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr 1 5 10 <210> 335 <211> 1390 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met reference sequence <400> 335 Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys 20 25 30 Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala 35 40 45 Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu 50 55 60 Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys 65 70 75 80 Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe 85 90 95 Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp 100 105 110 Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp 115 120 125 Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His 130 135 140 Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys 145 150 155 160 Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val 165 170 175 Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe 180 185 190 Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp 195 200 205 His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp 210 215 220 Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu 225 230 235 240 Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn 245 250 255 Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln 260 265 270 Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu 275 280 285 His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg 290 295 300 Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala 305 310 315 320 Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser 325 330 335 Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp 340 345 350 Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys 355 360 365 Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg 370 375 380 Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg 385 390 395 400 Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr 405 410 415 Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly 420 425 430 Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly 435 440 445 Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln 450 455 460 Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu 465 470 475 480 Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu 485 490 495 Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys 500 505 510 Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln 515 520 525 Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys 530 535 540 Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile 545 550 555 560 Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu 565 570 575 Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg 580 585 590 Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu 595 600 605 Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys 610 615 620 Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile 625 630 635 640 Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp 645 650 655 Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly 660 665 670 Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg 675 680 685 His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn 690 695 700 Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe 705 710 715 720 Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe 725 730 735 Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser 740 745 750 Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn 755 760 765 Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg 770 775 780 Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys 785 790 795 800 Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys 805 810 815 Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp 820 825 830 Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val 835 840 845 Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp 850 855 860 Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys 865 870 875 880 Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val 885 890 895 Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys 900 905 910 Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp 915 920 925 Gln Asn Phe Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser Thr Ala 930 935 940 Leu Leu Leu Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln 945 950 955 960 Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His 965 970 975 Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr 980 985 990 Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro 995 1000 1005 Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg Gln Val 1010 1015 1020 Gln Tyr Pro Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly Asp Ser 1025 1030 1035 1040 Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile Asp Leu Ser 1045 1050 1055 Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His Val Val Ile Gly 1060 1065 1070 Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His 1075 1080 1085 Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys 1090 1095 1100 Ile His Cys Ala Val Lys Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu 1105 1110 1115 1120 Val Ser Gln Phe Leu Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His 1125 1130 1135 Pro Asn Val Leu Ser Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser 1140 1145 1150 Pro Leu Val Val Leu Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe 1155 1160 1165 Ile Arg Asn Glu Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe 1170 1175 1180 Gly Leu Gln Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe 1185 1190 1195 1200 Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe 1205 1210 1215 Thr Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys 1220 1225 1230 Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys 1235 1240 1245 Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr Lys Ser 1250 1255 1260 Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu Met Thr Arg Gly 1265 1270 1275 1280 Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile Thr Val Tyr Leu 1285 1290 1295 Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Pro Leu 1300 1305 1310 Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro 1315 1320 1325 Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe 1330 1335 1340 Ile Gly Glu His Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys 1345 1350 1355 1360 Cys Val Ala Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp 1365 1370 1375 Asp Glu Val Asp Thr Arg Pro Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser 1380 1385 1390

Claims (31)

  1. 서열번호 331, 서열번호 332, 서열번호 333 및 서열번호 334로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 기재된 어느 하나 이상의 에피토프 영역에 결합하는 것인, 간 세포 성장 인자 수용체(c-Met)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 c-Met에 1 × 10-7 M 이하의 KD로 결합하며, 여기서 상기 KD는 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance; Biacore) 분석으로 측정된 것인, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. (a) 서열번호 1로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 3으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 9로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
    (b) 서열번호 4로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 10으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 11로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 12로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체, 또는
    (c) 상기 (a) 항체에서 적어도 하나의 아미노산 서열이 치환된 친화도 최적화 항체로서,
    (i) 경쇄 CDR1의 1번째 위치의 G가 A, E, K, L, N, R, S, V 또는 W; 2번째 위치의 A가 C, G, I, P, S, T 또는 V; 3번째 위치의 S가 G, M, N, P, Q, R, S 또는 T; 4번째 위치의 E가 A, D, F, G, H, K, M, Q, R, S, T 또는 V; 5번째 위치의 N이 A, D, E, G, K, L, P, Q, R, S, T 또는 V; 6번째 위치의 I가 A, F, L, M, Q, R, S, T 또는 V; 7번째 위치의 Y가 F, H, R 또는 V; 또는 8번째 위치의 G가 D, F, H, M, N, R, S, T 또는 V로 치환;
    (ii) 경쇄 CDR2의 1번째 위치의 G가 D, F, H, K, P, Q, S, V 또는 Y; 3번째 위치의 T가 Q; 또는 4번째 위치의 N이 G로 치환;
    (iii) 경쇄 CDR3의 1번째 위치의 Q가 E, G, I, M 또는 N; 2번째 위치의 N이 A, D, E, H, L, Q, S 또는 T; 3번째 위치의 V가 I, L, M, N, Q, S 또는 T; 4번째 위치의 L이 F, H, I, M, R, S, V, W 또는 Y; 5번째 위치의 S가 C, D, E, F, G, H, K, L, N, Q, R, T, V 또는 Y; 6번째 위치의 S가 D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V 또는 Y; 7번째 위치의 P가 A, D, E, G, N, Q, S 또는 V; 8번째 위치의 Y가 E, F, L, M 또는 Q; 또는 9번째 위치의 T가 D, F, G, I, L, N, S, V, W 또는 Y로 치환;
    (iv) 중쇄 CDR1의 1번째 위치의 D가 G 또는 Q; 2번째 위치의 Y가 Q; 또는 4번째 위치의 I가 A 또는 Q로 치환;
    (v) 중쇄 CDR2의 3번째 위치의 F가 D, E, W 또는 Y; 5번째 위치의 G가 D, H 또는 Y; 6번째 위치의 S가 F, P, W 또는 Y; 7번째 위치의 G가 A, F, L, N 또는 T; 8번째 위치의 N이 F, P, S, T 또는 Y; 9번째 위치의 T가 A, D, E, F, G, H, L, P, S 또는 V; 10번째 위치의 H가 A, D, F, M, R, S, T, V, W 또는 Y; 11번째 위치의 F가 G, H, I, L, M, N, P, Q, V 또는 Y; 12번째 위치의 S가 A, D, G, H, I, L, P, T 또는 V; 13번째 위치의 A가 D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, R, S, T, V 또는 Y; 14번째 위치의 R이 A, E, G, H, L, N, P, Q, S, W 또는 Y; 15번째 위치의 F가 D, E, G, L, M, P, R, S, V 또는 W; 16번째 위치의 K가 A, E, F, G, H, L, R, S, T, V 또는 Y; 또는 17번째 위치의 G가 E, F, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로 치환; 또는
    (vi) 중쇄 CDR3의 1번째 위치의 G가 E, F, H, N, Q, V 또는 W; 2번째 위치의 D가 E; 3번째 위치의 Y가 L, Q, T 또는 V; 4번째 위치의 G가 W; 5번째 위치의 F가 L 또는 Y; 6번째 위치의 L이 Q, S 또는 Y; 또는 7번째 위치의 Y가 C, L, M, N 또는 Q로 치환되고, 여기서 경쇄 CDR1은 0 내지 5개, 경쇄 CDR2는 0 내지 1개, 경쇄 CDR3는 0 내지 7개, 중쇄 CDR1은 0 내지 1개, 중쇄 CDR2는 0 내지 11개, 및 중쇄 CDR3는 0 내지 6개의 치환을 포함하는 것인,
    간 세포 성장 인자 수용체(c-Met)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체는 (a) 서열번호 13으로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 15로 기재된 중쇄 가변영역; 또는 (b) 서열번호 14로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 16으로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제4항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 서열번호 21로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 23으로 기재된 중쇄 가변영역;
    (b) 서열번호 22로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 24로 기재된 중쇄 가변영역;
    (c) 서열번호 29로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 31로 기재된 중쇄 가변영역; 또는
    (d) 서열번호 30으로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 32로 기재된 중쇄 가변영역;을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제4항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 37 내지 서열번호 44 중 어느 하나로 기재된 힌지 (hinge) 영역을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 삭제
  9. 제4항에 있어서, 상기 친화도 최적화 항체는
    서열번호 1, 및 서열번호 229 내지 268 중 어느 하나로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 2, 서열번호 182 내지 190, 서열번호 227 및 서열번호 228 중 어느 하나로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 3, 서열번호 142 내지 181, 서열번호 191 내지 226, 및 서열번호 269 내지 301 중 어느 하나로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역 및
    서열번호 7, 및 서열번호 108 내지 112 중 어느 하나로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 8, 서열번호 54 내지 63, 서열번호 72 내지 107, 및 서열번호 118 내지 141 중 어느 하나로 기재된 중쇄 CDR2; 서열번호 9, 서열번호 64 내지 71, 및 서열번호 113 내지 117 중 어느 하나로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 상기 친화도 최적화 항체는 서열번호 21, 및 306 내지 311 중 어느 하나로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 23, 및 302 내지 305 중 어느 하나로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, 상기 친화도 최적화 항체는
    (a) 서열번호 21로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 302로 기재된 중쇄 가변영역;
    (b) 서열번호 21로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 305로 기재된 중쇄 가변영역;
    (c) 서열번호 310로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 23으로 기재된 중쇄 가변영역;
    (d) 서열번호 308로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 305로 기재된 중쇄 가변영역;
    (e) 서열번호 306으로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 303으로 기재된 중쇄 가변영역;
    (f) 서열번호 307로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 304로 기재된 중쇄 가변영역;
    (g) 서열번호 308로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 304로 기재된 중쇄 가변영역;
    (h) 서열번호 309로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 304로 기재된 중쇄 가변영역;
    (i) 서열번호 311로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 304로 기재된 중쇄 가변영역; 또는
    (j) 서열번호 306으로 기재된 경쇄 가변영역 및 서열번호 302로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 제4항에 있어서, 상기 항체는 추가로 표피성장인자수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체는 c-Met 특이적 항체의 경쇄 또는 중쇄 일 말단에 표피성장인자수용체(EGFR)에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 연결한 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  14. 제12항에 있어서, 상기 EGFR에 결합하는 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, 상기 Fv는 Erbitux, Vectibix, Portrazza 및 TheraCIM로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 scFv 절편인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, 상기 Erbitux scFv는 서열번호 313 또는 서열번호 314으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  17. 제15항에 있어서, 상기 Vectibix scFv는 서열번호 315로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  18. 제13항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 연결은 서열번호 312로 기재된 커넥터로 연결된 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  19. 제4항에 있어서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  20. 제1항, 제3항 내지 제7항 및 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자.
  21. 제20항의 핵산분자를 포함하는 발현벡터.
  22. 제21항의 발현벡터가 도입된 숙주 세포.
  23. 제22항의 숙주 세포를 이용한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생산하는 방법.
  24. 제1항, 제3항 내지 제7항 및 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, c-Met 검출용 조성물.
  25. 제24항의 c-Met 검출용 조성물을 포함하는, c-Met 검출용 키트.
  26. 제1항, 제3항 내지 제7항 및 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 이용한 c-Met 항원을 검출하는 방법.
  27. 제1항, 제3항 내지 제7항 및 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 c-Met에 결합하여 수용체 활성을 저해하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 추가적으로 EGFR에 결합하여 수용체 활성을 저해하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  30. 제27항에 있어서, 상기 암은 c-Met의 과발현, 증폭, 돌연변이 또는 활성화에 의한 것인, 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  31. 제27항에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 대장암, 직장암, 삼중음성 유방암(TNBC, triple negative breast cancer), 교모세포종, 췌장암, 두경부암, 유방암, 난소암, 간암, 신장암, 방광암, 전립선암, 뇌암, 자궁암, 자궁내막암, 갑상선암, 급성골수성백혈병, 만성골수성백혈병, 골수종, 다발성 골수종, 흑색종, 림프종 및 부신피질암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 암의 예방 또는 치료용 조성물.
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