KR102375707B1 - 생물학적 분석 시스템 및 방법 - Google Patents

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Abstract

생물학적 분석 시스템이 제공된다. 시스템은 시료 블록 어셈블리를 포함한다. 시료 블록 어셈블리는 시료 홀더를 수용하도록 구성된 시료 블록을 포함하고, 시료 홀더는 복수의 시료를 수용하도록 구성된다. 시스템은 또한 일련의 온도를 통해 복수의 시료를 순환시키도록 구성된 제어 시스템을 포함한다. 시스템은 슬라이드 어셈블리를 포함하는 자동화된 트레이를 추가로 포함하며, 트레이는 시료 블록 어셈블리를 폐쇄 위치에서 개방 위치로 가역적으로 밀어서 복수의 시료 홀더에 대한 사용자 접근을 허용하도록 구성된다.

Description

생물학적 분석 시스템 및 방법
본 발명은 일반적으로 하나 이상의 생물학적 시료를 관찰, 검사 및/또는 분석하는 시스템, 장치 및 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 생물학적 시료 어레이를 관찰, 검사 및/또는 분석하는 시스템, 장치 및 방법에 관한 것이다.
일반적으로 생물학적 분석 시스템을 점점 더 자동화하여 효율을 높일 필요가 있다. 예를 들어, 자동화된 생물학적 시료 처리 장비의 발달은 시료에 대한 보다 빠르고 효율적인 분석을 허용한다.
또한 용이한 설치, 용이한 사용, 최소로 필요한 실험실 공간과 같은 사용자의 요구를 충족하는 설계의 생물학적 분석 시스템을 제공할 필요성이 증가하고 있다.
본 발명의 일실시예에서. 생물학적 분석 시스템이 제공된다. 상기 시스템은 복수의 시료를 수용하도록 구성된 시료 홀더를 수용하도록 구성된 시료 블록을 포함하는 시료 블록 어셈블리를 포함한다. 시스템은 일련의 온도를 통해 복수의 시료를 순환시키도록 구성된 제어 시스템 및 샘플 블록 어셈블리를 폐쇄 위치에서 개방 위치로 가역적으로 밀어서 복수의 시료 홀더에 대한 사용자 접근을 허용하도록 구성된 트레이를 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 생물학적 분석 시스템이 제공된다. 시스템은 복수의 블록 웰을 갖는 시료 블록을 포함하는 블록 어셈블리를 포함하고, 시료 블록은 시료 홀더를 수용하도록 구성되며, 시료 홀더는 복수의 시료를 수용한다. 시스템은 일련의 온도를 통해 복수의 시료를 순환시키도록 구성된 제어 시스템 및 복수의 시료에 여기광을 전달하여 복수의 시료로부터 방출된 형광 레벨을 감지하는 광학계를 추가로 포함할 수 있다. 시스템은 하부 플레이트, 히터, 및 복수의 상부 플레이트 개구를 갖는 상부 플레이트를 포함하는 가열 덮개를 추가로 포함할 수 있다. 하부 플레이트는 시료 홀더의 상부면과 체결된 체결면을 가질 수 있고, 체결면은 각각 복수의 블록 웰 중 연관된 하나와 정렬되어 여기광이 블록 웰까지 통과하는 것을 허용하는 복수의 하부 플레이트 개구를 가진다.
또 다른 실시예에서, 생물학적 분석 시스템이 제공된다. 시스템은 복수의 시스템 모듈을 포함하고, 모듈은 검출기 모듈, 발광 모듈, 여기 모듈, 및 기본 모듈을 포함한다. 복수의 시스템 모듈은 가역적으로 연결되도록 구성되어 제1 생물학적 장치 유형을 형성한다.
또 다른 실시예에서, 생물학적 분석 시스템이 제공된다. 시스템은 장비 및 장비를 보정하는 보정 시스템을 포함한다. 장비는 복수의 반응 자리를 갖는 시료 홀더를 수용하도록 구성된 시료 블록, 및 복수의 반응 자리 중 형광 방출을 촬영할 수 있는 광학계를 포함하는 블록 어셈블리를 포함할 수 있다. 보정 시스템은 영상에서 반응 자리 위치를 결정하도록 구성된 관심영역(ROI) 보정기를 포함할 수 있다. 보정 시스템은 또한 형광 염료의 원시 스펙트럼을 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교하여 각 반응 자리에 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하도록 구성된 순수 염료 보정기를 포함한다. 보정 시스템은 필터 정규화 인자를 결정하도록 구성된 장비 정규화 보정기를 추가로 포함할 수 있다. 보정 시스템은 장비가 시료의 두 다른 양을 구별할 수 있음을 검증하도록 구성된 알앤에이즈피(RNase P) 검증기를 추가로 포함할 수 있다. 보정 시스템은 또한 보정 결과를 디스플레이하도록 구성된 디스플레이 엔진을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가적인 양상, 특징, 및 이점은, 특히 동일한 부분에는 동일한 참조번호가 부여된 첨부도면과 함께 고려되어 다음의 상세한 설명과 청구범위에서 개진된다.
도 1은 본 교시 내용의 실시예들이 구현될 수 있는 예시적인 장비 시스템을 도시한 블록도이다.
도 2는 본 교시 내용의 실시예들이 구현될 수 있는 컴퓨터 시스템을 도시한 블록도이다.
도 3은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 예시적인 분산형 네트워크 시스템을 도시한다.
도 4는 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 하우징을 갖는 열 사이클러 시스템(thermal cycler system)을 도시한다.
도 5는 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 개방 위치에서 이동형 트레이를 갖는 도 4의 열 사이클러 시스템을 도시한다.
도 6은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 모듈러 장비 시스템을 도시한다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 시스템의 개략도이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 광원을 포함한 다양한 광원의 정규화된 스펙트럼선도이다.
도 9는 도 8에 나타낸 광원 스펙트럼의 다양한 파장 범위에 대한 스펙트럼 적분도이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 광학적 시료 처리 시스템의 솔리드 모델 도면이다.
도 11은 도 7에 나타낸 광학 시스템의 확대된 솔리드 모델 도면이다.
도 12는 도 10에 나타낸 광학 시스템의 일부에 대한 단면도이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 촬영부의 상부 사시도이다.
도 14는 도 13에 나타낸 촬영부의 단면도이다.
도 15 및 16은 도 13에 나타낸 촬영부의 하부 사시도이다.
도 17 내지 19는 도 13에 나타낸 촬영부 부분들에 대한 확대도이다.
도 20은 도 11에 나타낸 시스템의 단면도이다.
도 21은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 생물학적 장비를 위한 보정 작업 흐름을 도시한다.
도 22는 qPCR 장비들의 보정에 사용된 일련의 단계들을 도시한다.
도 23은 96-웰 시료 용기에 대한 관심영역을 도시한다.
도 24는 FAM 염료가 96-웰 보정 플레이트의 각 웰을 점유한 보정 플레이트에 대한 영상이다.
도 25 및 26은 본 개시 내용의 일실시예에 따른 작업 흐름 예이다.
도 27a는 본 개시 내용의 일실시예에 따른 체커보드 구성을 갖는 보정 플레이트들을 도시한다.
도 27b는 도 11a에서 플레이트(3100)로 도시된 것과 동일한 구성의 FAM, VIC, ROX, 및 SYBR 염료를 갖는 4개 염료 체커보드의 96-웰 보정 플레이트에 대한 영상이다.
도 28a는 본 교시 내용의 다양한 실시예에 사용된 염료 혼합물을 도시한다.
도 28b는 본 교시 내용의 다양한 실시예에 대한 순수 염료와 주요 채널 필터의 결합물을 도시한다.
도 29는 본 교시 내용의 다양한 실시예에 따른 정규화 이전 염료 혼합물의 % 편차를 도시한다.
도 30은 본 교시 내용의 다양한 실시예에 따른 정규화 후 염료 혼합물의 % 편차를 도시한다.
도 31은 본 교시 내용의 다양한 실시예에 따른 정규화 후 염료 혼합물의 % 편차의 상세도를 나타낸다.
도 32는 본 교시 내용의 다양한 실시예에 따른 정규화 프로세스를 설명한 흐름도이다.
도 33은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 장비를 검증하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 34는 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 다른 예시적인 장비 검증방법을 도시한다.
도 35는 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 증폭 데이터로부터 형광 임계치들을 결정하는 단계를 도시한다.
도 36은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 장비 검증 시스템을 도시한다.
도 37은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 장비 보정 시스템을 도시한다.
도 38은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 슬라이드식 어셈블리를 도시한다.
도 39는 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른, 시료 블록 어셈블리가 제거된 도 38의 슬라이드식 어셈블리를 도시한다.
도 40은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 도 38의 실시예에 대한 측면도이다.
도 41a, 41b, 및 41c는 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 슬라이드식 어셈블리의 광학센서들에 대한 다른 도면을 제공한다.
도 42a 및 42b는 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 슬라이드식 어셈블리의 광학센서들에 대한 다른 도면을 제공한다.
도 43은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 시료 블록 어셈블리의 일실시예를 도시한다.
도 44a는 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 가열 덮개를 도시한다.
도 44b 및 44c는 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 압력 플레이트의 평면도를 제공한다.
도 45는 여기서 설명된 다양한 실시예에 따른 가열 덮개의 도르래 시스템을 도시한다.
다음의 설명은 일반적으로 생물학적 시료 어레이를 마련, 관찰, 검사 및/또는 분석하는 시스템, 장치, 및 방법에 관한 본 발명의 실시예를 제공한다. 그러한 설명은 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 단순히 실시예들에 대한 설명을 제공하는 것이다.
시스템 개요
생물학적 시료 어레이를 마련, 관찰, 검사, 및/또는 분석하기 위해, 다양한 실시예에 따라 사용될 수 있는 장비의 일례는 종말점(end-point) 폴리머라아제연쇄반응(PCR) 장비 또는 정량, 또는 실시간, PCR 장비와 같은 열 사이클러 장치이다. 도 1은 본 교시 내용의 실시예들이 구현될 수 있는 예시적인 열 사이클러 시스템(100)을 도시한 블록도이다. 열 사이클러 시스템(100)은 복수의 반응 영역 또는 시료 블록 웰을 가지는 시료 블록(114) 위에 위치하고, 아래에서 더 상세하게 논의될 시료 홀더(도시되지 않음) 상에 복수의 시료(112)가 로딩되도록 구성되고, 이하에서 더 상세하게 논의될 가열 덮개(110)를 포함할 수 있다.
다양한 실시예에서, 시료 홀더는 복수의 시료를 수용하는 복수의 시료 영역 또는 웰을 가질 수 있고, 그 웰들은 뚜껑, 모자, 밀봉 필름 또는 웰들과 가열 덮개(110) 사이의 다른 밀봉 메커니즘을 통해 시료 홀더 내에서 밀봉될 수 있다. 시료 홀더의 일부 예들은 24-웰 마이크로역가(microtiter) 플레이트, 48-웰 마이크로역가 플레이트, 96-웰 마이크로역가 플레이트, 384-웰 마이크로역가 플레이트, 마이크로카드, 쓰루홀(through-hole) 어레이, 또는 유리 또는 플라스틱 슬라이드와 같은 실질적인 평면 홀더를 비제한적으로 포함하는 임의의 크기의 다중 웰 플레이트 또는 어레이를 포함할 수 있지만, 그에 한정되지 않는다. 시료 홀더의 다양한 실시예에서 웰들은 시료 홀더 기판 표면에 형성되어 규칙적으로 또는 비규칙적으로 패터닝된 함몰부, 압입부, 융부 및 이들의 결합을 포함할 수 있다. 시료 또는 반응 공간(reaction volumes)은 또한, 미세 유체 시스템의 검사 위치 또는 공간 내에, 또는 작은 비드(bead) 또는 구(sphere) 상에 또는 그 안에 위치한 시료 또는 용액과 같이, 기판에 형성된 웰들 또는 압입부 내에, 기판 표면에 분산된 용액 스팟들(spots) 내에, 또는 다른 유형의 반응 챔버 또는 포맷 내에 위치할 수 있다.
다른 실시예에서, 초기 시료 또는 용액은 수백, 수천, 수만, 수십만, 또는 수백만개의 반응 자리로 분할될 수 있고, 각각은, 예를 들어, 수 나노리터, 약 1 나노리터 또는 1 나노리터 미만 (예를 들어, 수십 또는 수백 피코리터 이하)의 부피를 가질 수 있다.
열 사이클러 시스템(100)은 또한 시료 블록(114), 가열 및 냉각용 소자들(116), 열 교환기(118), 제어 시스템(120) 및 사용자 인터페이스(122)를 포함할 수 있고, 부품들(114, 116, 118)은 열 블록 어셈블리 내에 포함될 수 있다. 열 블록 어셈블리에 대한 상세한 내용이 후술될 것이다.
일실시예에서, 가열 및 냉각 소자들(116)은, 예를 들어, 펠티어 장치들과 같은 열전 장치일 수 있다. 열 블록 어셈블리 내에 사용된 열전 장치들의 개수는 비용, 원하는 독립 구역의 수, 및 시료 홀더의 크기를 포함한 여러 인자들에 의존될 수 있지만 그에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 48 웰 마이크로역가 플레이트를 보유하는 시료 블록은 단일 열전 장치를 수용하는 크기일 수 있는 반면, 더 많은 웰들을 갖는 플레이트들용으로 구성된 시료 블록들은 하나 초과의 열전장치들, 예를 들어, 4개의 열전 장치들을 수용할 수 있다. 또한 시료 블록상의 다수의 구역에 대한 제어를 원하는 경우, 열전 장치들의 개수는 하나에서, 예를 들어, 시료 블록상의 시료 영역 (예를 들어, 웰, 쓰루 홀, 반응 자리 등) 당 하나의 열전 장치까지 변할 수 있다. 예를 들어, 시료 블록의 경우, 예를 들어, 96-웰 마이크로역가 플레이트를 수용할 수 있는 96-웰 어레이를 형성하는 16 웰 포맷의 6개 서브 블록으로 분할될 수 있다. 각 서브 블록에 대해 독립 구역 제어를 하고자 하여 6개 열전 장치를 허용한다면, 그 각각은 관련 서브 블록에 대응한다.
대안적인 실시예에서, 열 사이클러 시스템(100)은 가열 및 냉각 소자들(116) 및 열 교환기(118)이 시료 블록(114)의 위(상부면)와 아래(하부면)에 배치될 수 있는 양면 열 어셈블리를 가질 수 있다. 그러한 실시예에서, 시료 블록(114) 위에 배치된 양면 열 어셈블리의 상부면은 가열 덮개(110)를 대체할 수 있다. 그러한 구성은 시료들의 상하부를 보다 균일하게 가열할 수 있다. 실시간 열 사이클러(thermal cycler)의 경우, 상부면은 투명한 구조 부분을 가져 여기광 소스와 방출된 형광의 통과를 허용한다. 그 부분들은, 예를 들어, 플라스틱 및 유리를 포함한 투명한 재질로 만들어질 수 있다.
열 사이클러 시스템(100)은 또한 광학계(124)를 가질 수 있다. 도 1에서, 광학계(124)는 전자기 에너지를 방출하는 조명 소스(도시되지 않음), 시료들(112)로부터 전자기 에너지를 수신하는 광 센서, 검출기, 또는 촬상기(도시되지 않음), 및 각 DNA 시료로부터 촬상기로 전자기에너지를 유도하도록 사용된 광학기를 가질 수 있다. 광학계는 이하에서 더 자세하게 논의된다.
제어 시스템(120)은 광학계(124), 가열 덮개(110), 및 시료 블록(114), 냉각 소자(116) 및 열 교환기(118)를 포함할 수 있는 열 블록 어셈블리의 기능들을 제어하도록 사용될 수 있다. 제어 시스템(120)은 도 1의 열 사이클러 시스템(100)의 사용자 인터페이스(122)를 통해 최종 사용자에게 접근할 수 있다. 제어 시스템(120)은 이하에서 상세하게 논의되는 것과 같이, 열 사이클러 시스템(100)의 보정을 제어하도록 사용될 수 있다.
컴퓨터 구현 시스템
본원에서 설명된 실시예들에 따른 방법들은 컴퓨터 시스템에서 구현될 수 있다.
당업자는 다양한 실시예의 동작이, 적절하게, 하드웨어, 소프트웨어, 펌웨어, 또는 이들의 조합을 이용하여 구현될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 프로세스는 소프트웨어, 펌웨어, 또는 하드웨어에 내장된 논리의 제어 하에 프로세서 또는 다른 디지털 회로를 이용하여 수행될 수 있다. (본원에서 용어 "논리"는 언급된 기능을 실행하는 것으로 당업자가 인식하는, 고정 하드웨어, 프로그램 가능한 논리 및/또는 이들의 적절한 조합을 말한다.) 소프트웨어 및 펌웨어는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체 상에 저장될 수 있다. 일부 다른 프로세스는, 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 아날로그 회로를 이용하여 구현될 수 있다. 또한, 또한, 통신 구성 요소와 더불어 메모리 또는 다른 기억 장치가 본 발명의 실시예들에서 이용될 수 있다.
도 2는 다양한 실시예에 따른, 처리 기능을 수행하기 위해 채용될 수 있는 컴퓨터 시스템(200)을 도시한 블록도이다. 실험을 수행하기 위한 장비는 예시적인 컴퓨팅 시스템(200)에 연결될 수 있다. 다양한 실시예에 따르면, 사용될 수 있는 장비들은, 예를 들어, 도 1의 열 사이클러 시스템(100)을 포함한다. 컴퓨팅 시스템(200)은 프로세서(204)와 같은 하나 이상의 프로세서들을 포함할 수 있다. 프로세서(204)는, 예를 들어, 마이크로프로세서, 제어기 또는 다른 제어 로직과 같은 범용 또는 전용 프로세싱 엔진을 사용하여 구현될 수 있다. 프로세서(204)는 버스(202) 또는 다른 통신 매체에 연결될 수 있다.
도 2를 참조하면, 컴퓨터 시스템(200)은 사용자 인터페이스 기능뿐만 아니라 도 1의 열 사이클러 시스템(100)의 기능을 제어할 수 있다. 또한 도 2의 컴퓨터 시스템(200)은 데이터 프로세싱, 디스플레이 및 보고 준비 기능을 제공할 수 있다. 모든 그러한 장비 제어 기능들은 국부적으로 PCR 장비 전용으로 사용될 수 있다. 이와 같이, 컴퓨터 시스템(200)은 도 1에 도시된 제어 시스템(120)으로 사용될 수 있다. 또한 도 2의 컴퓨터 시스템(200)은 이어서 더 상세하게 논의되는 것처럼, 제어, 분석 및 보고 기능의 일부 또는 모두에 대한 원격제어를 제공할 수 있다.
도 2의 컴퓨팅 시스템(200)은 또한 랙(rack)-장착 컴퓨터, 메인프레임, 수퍼컴퓨터, 서버, 클라이언트, 데스크톱 컴퓨터, 랩톱 컴퓨터, 태블릿 컴퓨터, 핸드헬드 컴퓨팅 장치(예컨대, PDA, 셀룰러폰, 스마트폰, 팜톱 등), 클러스터 그리드, 넷북, 임베디드 시스템, 또는 임의의 다른 유형의 전용 또는 범용 컴퓨팅 장치와 같은 다수의 형태 중 임의의 형태로 구현될 수 있다. 또한, 컴퓨팅 시스템(200)은 클라이언트/서버 환경 및 하나 이상의 데이터베이스 서버를 비롯한 종래의 네트워크 시스템, 또는 LIS/LIMS 인프라구조와의 통합을 포함할 수 있다. 근거리 통신망(LAN) 또는 광역 통신망(WAN)을 포함하고 무선 및/또는 유선 부품을 포함하는 다수의 종래의 네트워크 시스템은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 클라이언트/서버 환경, 데이터베이스 서버, 및 네트워크가 당업계에 문서로 잘 기록되어 있다. 본원에 기술되는 다양한 실시예에 따르면, 컴퓨팅 시스템(200)은 분산형 네트워크 내의 하나 이상의 서버에 접속하도록 구성될 수 있다. 컴퓨팅 시스템(200)은 분산형 네트워크로부터 정보 또는 업데이트를 수신할 수 있다. 컴퓨팅 시스템(200)은, 또한, 분산형 네트워크에 접속된 다른 클라이언트에 의해 액세스될 수 있는 분산형 네트워크 내에 저장될 정보를 송신할 수 있다.
도 2의 컴퓨팅 시스템(200)은 또한 버스(202)에 결합되고 프로세서(204)에 의해 실행될 명령어들을 저장하는 랜덤 엑세스 메모리(RAM) 또는 다른 동적 메모리일 수 있는 메모리(206)를 포함한다. 메모리(206)는, 또한, 프로세서(204)에 의해 실행될 명령어의 실행 동안에 일시적 변수 또는 다른 중간 정보를 저장하는 데 사용될 수 있다.
컴퓨팅 시스템(200)는 버스(202)에 연결되고 프로세서(204)에 대한 정적 정보 및 명령어를 저장하는 읽기 전용 메모리(ROM, 208) 또는 다른 정적 저장장치를 추가로 포함한다.
컴퓨팅 시스템(200)은, 또한, 정보 및 명령어를 저장하기 위해 제공되고 버스(202)에 연결되는 저장 장치(210), 예컨대 자기 디스크, 광 디스크, 또는 솔리드 스테이트 드라이브(SSD)를 포함할 수 있다. 저장 장치(210)는 매체 드라이브 및 제거가능한 저장소 인터페이스를 포함할 수 있다. 매체 드라이브는 고정된 또는 제거가능한 저장 매체를 지원하는 드라이브 또는 다른 메커니즘, 예컨대 하드 디스크 드라이브, 플로피 디스크 드라이브, 자기 테이프 드라이브, 광 디스크 드라이브, CD 또는 DVD 드라이브(R 또는 RW), 플래시 드라이브, 또는 다른 제거가능한 또는 고정된 매체 드라이브를 포함할 수 있다. 이 예들이 도시하는 것처럼, 저장 매체는 특별한 컴퓨터 소프트웨어, 명령어들 또는 데이터가 내부에 저장된 컴퓨터 독출가능한 저장 매체를 포함할 수 있다.
다른 대안적인 실시예에서, 저장 장치(210)는 컴퓨터 프로그램 또는 다른 명령어들 또는 데이터가 컴퓨팅 시스템(200)으로 로딩되는 것을 허용하는 다른 유사 수단을 포함할 수 있다. 그러한 수단은, 예를 들어, 프로그램 카트리지 및 카트리지 인터페이스, 착탈식 메모리(예를 들어, 플래시 메모리 또는 다른 착탈식 메모리 모듈) 및 메모리 슬롯과 같은 착탈식 저장 유닛 및 인터페이스, 및 소프트웨어와 데이터가 저장 장치(210)로부터 컴퓨팅 시스템(200)으로 전달되는 것을 허용하는 다른 착탈식 저장 유닛 및 인터페이스를 포함할 수 있다.
도 2의 컴퓨팅 시스템(200)은 또한 통신 인터페이스(218)를 포함할 수 있다. 통신 인터페이스(218)는 소프트웨어 및 데이터가 컴퓨팅 시스템(200) 및 외부 장치들 사이에서 전달되는 것을 허용하는데 사용될 수 있다. 통신 인터페이스(218)의 예로는 모뎀, 네트워크 인터페이스(예컨대, 이더넷 또는 다른 NIC 카드), (예를 들어 USB 포트, RS-232C 직렬 포트와 같은) 통신 포트, PCMCIA 슬롯 및 카드, 블루투스 등이 포함될 수 있다. 통신 인터페이스(218)를 통해 이송되는 소프트웨어 및 데이터는 전자, 전자기, 광학, 또는 통신 인터페이스(218)에 의해 수신될 수 있는 다른 신호일 수 있는 신호의 형태의 것이다. 이들 신호는 무선 매체, 유선 또는 케이블, 광섬유, 또는 다른 통신 매체와 같은 채널을 통해 통신 인터페이스(218)에 의해 송신 및 수신될 수 있다. 채널의 일부 예로는 전화선, 셀룰러폰 링크, RF 링크, 네트워크 인터페이스, 근거리 또는 광역 통신망, 및 다른 통신 채널이 포함된다.
컴퓨팅 시스템(200)은 정보를 컴퓨터 사용자에게 디스플레이하기 위해 버스(202)를 통해 음극선관(CRT) 또는 액정 디스플레이(LCD)와 같은 디스플레이(212)에 연결될 수 있다. 문자숫자 및 다른 키를 비롯한 입력 디바이스(214)가, 예를 들어, 정보 및 커맨드 선택을 프로세서(204)에 전달하기 위해 버스(202)에 연결된다. 입력 장치는 또한 터치 스크린 입력 기능을 갖도록 구성된 LCD 디스플레이와 같은 디스플레이일 수 있다. 다른 유형의 사용자 입력 장치는, 방향 정보 및 명령 선택을 프로세서(204)에 전달하고 디스플레이(212)상에서 커서(cursor) 움직임을 제어하는 마우스, 트랙볼, 또는 커서 방향 키와 같은 커서 제어기(216)이다. 일반적으로 이러한 입력 장치는 2개의 축, 제1 축(예컨대, x) 및 제2 축(예컨대, y)에서 장치가 평면에서의 위치를 특정할 수 있도록 하는 2개의 자유도를 갖는다. 컴퓨팅 시스템(200)은 데이터 프로세싱을 제공하고, 그러한 데이터에 대한 신뢰도 레벨을 제공한다. 본 교시내용의 실시예의 소정 구현예에 따라, 데이터 프로세싱 및 신뢰도 값은 프로세서(204)가 메모리(206)에 포함된 하나 이상의 명령어의 하나 이상의 시퀀스를 실행한 것에 응답하여 컴퓨팅 시스템(200)에 의해 제공된다. 그러한 명령어는 저장 디바이스(210)와 같은 다른 컴퓨터 판독가능 매체로부터 메모리(206) 내로 판독될 수 있다. 메모리(206) 내에 포함된 명령어들의 시퀀스의 실행은 프로세서(204)가 본원에 기술되는 프로세스 상태를 수행하게 한다. 대안으로, 하드-와이어 회로가 소프트웨어 명령어 대신에 또는 그와 조합해서 사용되어, 본 교시내용의 실시예를 구현하게 할 수 있다. 따라서, 본 교시내용의 실시예의 구현은 하드웨어 회로와 소프트웨어의 임의의 특정 조합으로 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "컴퓨터 판독가능 매체" 및 "컴퓨터 프로그램 제품"은, 전반적으로, 실행을 위해 하나 이상의 시퀀스 또는 하나 이상의 명령어를 프로세서(204)에 제공하는 데 수반되는 임의의 매체를 지칭한다. 일반적으로 "컴퓨터 프로그램 코드"(컴퓨터 프로그램 또는 다른 그룹으로 그룹화될 수 있음)로 지칭되는 그러한 명령어는, 실행될 때, 컴퓨팅시스템(200)이 본 발명의 실시예의 특징부 또는 기능을 수행하게 한다. 이들 및 다른 형태의 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 비휘발성 매체, 휘발성 매체, 및 전송 매체를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 비휘발성 매체는, 예를 들어 솔리드 스테이트, 광 또는 자기 디스크, 예컨대 저장 디바이스(210)를 포함한다. 휘발성 매체는 동적 메모리, 예컨대 메모리(206)를 포함한다. 전송 매체는 버스(202)를 포함하는 와이어를 비롯해서 동축 케이블, 구리선, 및 광섬유를 포함한다.
컴퓨터 판독가능 매체의 통상적인 형태는, 예를 들어 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 또는 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드, 종이 테이프, 구멍 패턴을 갖는 임의의 다른 물리적 매체, RAM, PROM, 및 EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 이하에 기술되는 바와 같이 반송파, 또는 컴퓨터가 판독할 수 있는 임의의 다른 매체를 포함한다.
다양한 형태의 컴퓨터 판독가능 매체는 실행을 위해 하나 이상의 명령어의 하나 이상의 시퀀스를 프로세서(204)에 전달하는 데 수반될 수 있다. 예를 들어, 초기에 원격 컴퓨터의 자기 디스크 상에 명령이 전달될 수 있다. 원격 컴퓨터는 그의 동적 메모리 내로 명령어를 로딩할 수 있고, 모뎀을 사용하여 전화선을 통해 명령어를 전송할 수 있다. 컴퓨팅 시스템(200)에 대해 국부적인 모뎀은 전화선 상에서 데이터를 수신할 수 있고, 적외선 송신기를 사용하여 데이터를 적외선 신호로 변환할 수 있다. 버스(202)에 연결된 적외선 검출기가 적외선 신호에서 전달되는 데이터를 수신할 수 있고, 데이터를 버스(202) 상에 둘 수 있다. 버스(202)는 데이터를 메모리(206)에 전달하고, 프로세서(204)는 메모리로부터 명령을 검색하고 실행한다. 메모리(206)에 의해 수신된 명령은 선택적으로 프로세서(204)에 의한 실행 전 또는 후에 저장 장치(210)에 저장될 수 있다.
명확성을 위해, 상술한 설명은 다른 기능 유닛과 프로세서를 참조하여 발명의 실시예를 설명했음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 상이한 기능 유닛들, 프로세서들, 또는 도메인들 사이의 임의의 적합한 기능성 분포가 본 발명을 손상시키지 않고서 이용될 수 있음은 명백할 것이다. 예를 들어, 개별 프로세서 또는 제어기에 의해 수행되는 것으로 예시된 기능성이 동일한 프로세서 또는 제어기에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 특정 기능 유닛에 대한 언급은 엄격한 논리적 또는 물리적 구조 또는 조직을 나타내는 것이 아니라, 단지, 기술된 기능성을 제공하기 위한 적합한 수단에 대한 언급으로만 이해되어야 한다.
분산형 시스템
일반적인 인터넷 네트워크 구성(2500)의 일부 소자들이 도 5에 도시되어 있고, 도 5는 가능하게 원격 지역 사무실 내에 있는 다수의 클라이언트 머신들(2502)이 일부 인터넷 서비스 공급자(ISP) 연결(2510)을 통해 그 자체가 인터넷(2508)에 연결된 게이트웨어/허브/터널-서버/등(2510)에 연결됨을 보여주고 있다. 또한 다른 가능한 클라이언트들(2512)이 유사하게 ISP 연결(2514)을 통해 인터넷(2508)에 연결된 것으로 도시되었고, 이 유닛들은 가능하게 중앙 실험실 또는 사무실과 ISP 연결(2516)을 통해 게이트웨어/터널-서버(2518)에 연결되며, 게이트웨어/터널-서버(2518)는 다른 허브/라우터(2526)를 통해 다양한 지역 클라이언트(2530)에 연결될 수 있는 다양한 기업 어플리케이션 서버(2522)에 연결된다(2520). 이들 서버(2522) 중 임의의 것은, 아래에 더 충분히 기술되는 바와 같이, 본 발명에서 기술되는 바와 같은, 잠재적 콘텐츠 관리 및 전달 설계 솔루션의 분석을 위한 개발 서버로서 기능할 수 있다.
모듈러 시스템
도 4는 앞서 논의된 열 사이클러 시스템(100)의 많은 소자들을 감싸고 있는 하우징(140)을 구비한 시스템(100)의 실시예를 도시한다. 본 실시예에서, 사용자 인터페이스(122)는 시스템(100)의 정면에 제공되며, 트레이면(150)은 인터페이스(122) 하부에 제공된다. 하우징(140)은 선호도에 기반하여 단일 피스(piece) 또는 다수의 피스들로 만들어질 수 있다.
도 5는 이동형 트레이(160)가 개방, 노출된 위치에서 있는 도 4의 실시예를 도시한다. 이동형 트레이(160)는 도시된 바와 같이 시료 블록(114)을 포함할 수 있다. 개방 위치에서, 시료 블록(114)은 시료 로딩을 위해 사용될 수 있다. 시료 블록(114) 이외에, 이동형 트레이(160)는 이동형 트레이(160)가 개방 위치에 있을 때 사출되는 다른 부품들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이동형 트레이(160)은 시료 블록(114)과 연관된 가열 및 냉각 소자들을 포함할 수 있다. 또한 이동형 트레이(160)는 결합된 열 교환기 또는 방열판(heat sink)를 포함할 수 있다. 이동형 트레이(160)는 수작업으로 또는 기계적으로 이동될 수 있다. 예를 들어, 트레이(160)가 수작업으로 이동가능한 경우, 핸들 또는 그립이 구비될 수 있다. 기계적으로 이동가능한 경우, 아래에서 상세하게 논의되는 바와 같이 모터 시스템이 시스템(100) 내에 구비될 수 있다.
도 6은 모듈러 부품으로 이루어진 열 사이클러 시스템(100)의 실시예를 도시한다. 모듈러 구성을 이용하여, 모듈들은 다수의 장비 시스템들에 적합하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 광학 모듈은 다른 유형의 장비들에 사용되도록 구성될 수 있다. 더욱이, 모듈러 구성은 처음부터 완전한 장비 구성이 필요하기 보다는 이미 구성된 장비 부분들을 구비함으로써 용이한 구성을 가능하게 한다. 또한 모듈러 구성은 용이한 사용을 가능하게 한다. 완전한 장비를 만들기 위해 몇몇 모듈들만 연결하면 되기 때문에, 정비를 위해 특정 모듈에 액세스하기 위해서는 해당 프로세스를 역으로 하기만 하면 될 것이다.
도 6에서, 시스템(100)은 검출기 모듈(405) (센서 보드/검출기 보드. 검출기 및 PSB의 결합), 발광 모듈(410) (발광 필터 휠, 카메라), 여기 모듈(415) (여기 소스 및 여기 필터 휠), 기본 모듈(420) (빔 스플레터, 접이식 거울) 및 페이스 플레이트(face plate, 425)를 포함한다.
검출기 모듈(405)은, 예를 들어, 발광 센서, 발광 검출기, 광학계(124)와 결합된 센서 인쇄회로기판 및 검출기 인쇄회로기판을 포함할 수 있다. 발광 모듈(410)은, 예를 들어, 광학계(124)와 결합된 카메라 및 발광 필터 휠을 포함할 수 있다. 여기 모듈(415)은, 예를 들어, 광학계(124)와 결합된 여기 소스, 소스 냉각 부품 및 발광 필터 휠을 포함할 수 있다. 기본 모듈(420)은, 예를 들어, 시료 블록, 블록 가열 및 냉각 소자, 열 교환기/방열판, 제어 시스템 및 히터 덮개뿐만 아니라, 예를 들어, 광학계(124)와 결합된 빔 스플리터 및 접이식 거울을 포함할 수 있다. 최종적으로, 페이스 플레이트(425)는, 예를 들어, 기본 모듈(420)의 거울 부품을 덮고, 기본 모듈(420)의 발광 모듈(410)로의 연결을 지원하며, 및/또는 사용자 인터페이스(122)를 수용하도록 납작한 면을 제공한다. 상술한 부품들은 이하에서 더 상세하게 기술될 것이다. 더욱이, 위에서 논의된 특정 모듈에 포함된 부품들은 예시적인 목적만을 위한 것이고, 필요에 따라 교체될 수 있다. 또한, 모듈들의 개수는 필요에 따라 증가 또는 감소될 수 있다. 예를 들어, 검출기 모듈(405) 및 발광 모듈(410)은 단일 모듈로 결합될 수 있다. 한편, 기본 모듈(420)은 다수의 작은 모듈들로 분리될 수 있다.
하나 이상의 모듈들(405, 410, 415, 및 420)은 또한 다른 장비 유형들을 위한 모듈들로 사용될 수 있다. 이러한 유연성은 여러 유형의 장비를 공통 모듈들로 구성할 때 더 효율적인 제조를 가능하게 한다. 예를 들어, 위에서 논의된 모듈들이 연결되어 96 웰 포맷을 갖는 qPCR 장비를 형성할 수 있다. 하나 이상의 모듈들은 또한, 예를 들어, 384 웰 포맷, 쓰루홀 포맷, 납작한 블록 포맷 등을 갖는 qPCR 포맷을 만드는 데 사용될 수 있다. 하나 이상의 모듈들은 또한, 예를 들어, 종말점 PCR 장비를 만드는 데 사용될 수 있다. 하나 이상의 모듈들은 또한, 예를 들어, 4 색 또는 6 색 광학계를 포함한 다른 광학계를 갖는 qPCR 장비를 만드는 데 사용될 수 있다. 하나 이상의 모듈들은 또한, 예를 들어, 모세관 전기영동 장비(capillary electrophoresis instrument)를 형성하도록 사용될 수 있다. 하나 이상의 모듈들은 또한, 예를 들어, 디지털 PCR 장비를 형성하도록 사용될 수 있다. 하나 이상의 모듈들은 또한, 예를 들어, 광학 판독이기(optical reader)를 형성하도록 사용될 수 있다.
광학계
상술되고 도 1에 도시된 바와 같이, 열 사이클러 시스템(100)은 광학계(124)를 포함할 수 있다.
여기서 사용된 것처럼, 용어 "복사" 또는 "전자기 복사"는 하나 이상의 가시광선(예를 들어, 400 나노미터 및 700 나노미터 사이 또는 380 나노미터 및 800 나노미터 사이에서 하나 이상의 파장을 갖는 것을 특징으로 하는 복사 에너지) 또는 비가시 전자기 복사(예를 들어, 적외선, 근적외선, 자외선(UV), X-선 또는 감마선 복사)를 포함할 수 있는 어떤 전자기 프로세스에 의해 발광된 복사 에너지를 의미한다.
본원에서 설명된 바와 같이, 여기 소스는 하나 이상의 화합물를 포함하는 적어도 하나의 시료를 향하는 전자기 복사가 그 시료와 상호작용하여 그 시료의 조건을 나타내는 발광 전자기 복사를 생성하게 하는 전자기 복사 소스를 의미한다. 여기 소소는 광 소스를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "광 소스"는 전자기 스펙트럼의 가시파장 대역(예를 들어, 400 나노미터 내지 700 나노미터 범위 또는 380 나노미터 및 800 나노미터 범위의 파장 내 전자기 복사) 내에 있는 피크 또는 최대 출력(예를 들어, 파워, 에너지, 또는 강도)을 갖는 전자기 스펙트럼을 포함하는 전자기 복사 소스를 말한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 여기 소스는 전자기 스펙트럼의 적외선(근적외선, 중적외선, 및/또는 원적외선) 또는 자외선(근자외선 및/또는 극자외선) 부분들의 적어도 일부 내에 있는 전자기 복사를 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 여기 소스는 전자기 스펙트럼의 다른 파장 대역 내, 예를 들어, 전자기 스펙트럼의 X-선 및/또는 전파 부분 내 전자기 복사를 포함할 수 있다. 여기 소스는 단일 광원, 예를 들어, 백열등, 가스 방전등 (예를 들어, 할로겐등, 크세논등, 아르곤등, 크립톤등, 등), 발광 다이오드(LED), 유기 LED(OLED), 레이저 등을 포함할 수 있다. 여기 소스는 복수의 개별 광원 (예를 들어, 복수의 LED, 또는 레이저)를 포함할 수 있다. 여기 소스는 또한 고역통과필터, 저역통과필터, 또는 대역통과필터와 같은 하나 이상의 여기 필터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 여기 필터는 칼라 필터 및/또는 다이크로익(dichroic) 필터를 포함할 수 있다. 여기 소스는 단일 빔 또는 공간적으로 및/또는 시간적으로 분리된 복수의 빔을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발광"은 여기 소소에 의한 복사와, 하나 이상의 화학적 또는 생물학적 분자 또는 관심 화합물을 포함하거나 포함한 것으로 여겨지는 하나 이상의 시료들과의 상호작용의 결과로 생성된 전자기 복사를 의미한다. 발광은 여기 소스로부터의 복사를 시료가 반사, 굴절, 분극, 흡수, 및/또는 다른 광학 효과를 내서 기인한 것일 수 있다. 예를 들어, 방출은 하나 이상의 시료에 의한 여기 전자기 복사를 흡수하여 유도된 조광 또는 형광을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "발광된 광"은 전자기 스펙트럼의 가시파장 대역(예를 들어, 420 나노미터 내지 700 나노미터 범위의 파장 내 전자기 복사) 내에 있는 피크 또는 최대 출력(예를 들어, 파워, 에너지, 또는 강도)을 갖는 전자기 스펙트럼를 포함하는 발광을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 렌즈는 유한한 거리 또는 광학적 무한대에서 실상 또는 허상을 제공하기 위해 입사한 전자기 복사를 유도하거나 집중시키도록 구성되어 그러한 복사를 수렴하거나 발산하게 하는 광학 소자를 의미한다. 렌즈는 입사한 전자기 복사의 굴절, 반사 및/또는 회절에 의해 공급된 광 파워를 갖는 단일 광학 소자를 포함할 수 있다. 대안적으로, 렌즈는, 예를 들어, 색지움 렌즈, 이중 렌즈, 삼중 렌즈 또는 카메라 렌즈를 포함하지만, 그에 한정되지 않는 복수의 광학 소자를 포함하는 화합물계를 포함한다. 렌즈는 렌즈 케이스 또는 렌즈 마운트에 의해 적어도 부분적으로 수용되거나 적어도 부분적으로 감싸일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "광 파워"는 렌즈 또는 광학기기가 공기중에 놓였을 때 광을 수렴 또는 분기하여 초점(실초점 또는 허초점)을 제공하는 능력을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "초점 길이" 는 광 파워의 역수를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "회절력" 또는 "광 회절력"은 입사 광을 1 이상의 회절 차수로 회절시키는 렌즈 또는 광학기기의 파워 또는 그 일부를 의미한다. 달리 알려진 것을 제외하고, 렌즈, 광학기기, 또는 광 소자의 광 파워는 렌즈 또는 광학기기와 연관된 기준 평면(예를 들어, 광학기기의 주 평면)으로부터 나온다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 시료"는 생물학적 검정, 실험 또는 검사를 수행할 목적으로 사용된 관련 화학약품 또는 화합물을 포함하는 임의의 시료 또는 용액뿐만 아니라, 임의의 유형의 생물학적, 화학적, 또는 본원에서 설명된, 본 발명의 다양한 실시예의 사용자, 제조자 또는 배포자의 관심 대상 부품 및/또는 분자를 포함하는 시료 또는 용액을 의미한다. 이 생물학적 화학약품, 부품, 또는 타겟 분자는 (세포 유리(cell-free) DNA를 포함한) DNA 염기서열, RNA 염기서열, 유전자, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides), 분자, 프로틴, 바이오마커(biomarker), 세포(예를 들어, 순환종양세포), 또는 어떤 다른 적절한 타겟 생체분자를 포함하지만, 그에 한정되지 않는다. 생물학적 시료는 적어도 하나의 타겟 핵산 서열, 적어도 하나의 프라이머, 적어도 하나의 버퍼, 적어도 하나의 뉴클레오티드, 적어도 하나의 효소, 적어도 하나의 세제(detergent), 적어도 하나의 차단 에이전트, 또는, 타겟 또는 참조 핵산 서열 감지에 적합한 적어도 하나의 염료, 마커, 및/또는 프로브 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 다양한 실시예에서, 그러한 생물학적 부품들은 태아진단, 다중 dPCR, 바이러스 탐지, 및 정량화 기준, 유전형질분석, 서열검정, 실혐, 또는 프로토콜, 서열검증, 돌연변이 탐지, 유전적으로 변형된 유기체 탐지, 희귀 대립형질(rare allele), 및/또는 복제수 변이(copy number variation)와 같은 하나 이상의 PCR 방법 및 시스템과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따라, 적어도 하나의 관심 생물학적 타겟을 포함하는 하나 이상의 시료 또는 용액은 복수의 작은 시료 공간 또는 반응 영역(예를 들어, 10 나노리터 이하, 1 나노리터 이하, 또는 100 피코리터 이하의 공간 또는 영역에) 사이에 분포 또는 분할되어 포함될 수 있다. 본원에서 개시된 반응영역은 일반적으로 기판 재질에 포함된 웰들에 포함된 것으로 도시된다; 그러나 본 발명의 실시예에 따른 다른 형태의 반응 영역은 기판 내에 형성된 쓰루홀 또는 압입부 내에 위치한 반응공간, 기판 표면상에 분산된 용액 스팟, 모세관 또는 미세유체 시스템의 검사 자리 또는 공간 내에, 또는 복수의 마이크로비즈 또는 마이크로구 상에 또는 그 안에 위치한 시료 또는 용액일 수 있다.
본 발명에 실시예에 따른 장치, 장비, 시스템 및 방법은 일반적으로 dPCR 및 qPCR을 가리키지만, 본 발명의 실시예는 대량의 반응 영역들이 처리, 관찰, 및/또는 측정된 임의의 PCR 프로세스, 실험, 검정, 또는 프로토콜에 적용될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 dPCR 검정 또는 실험에서, 적어도 하나의 타겟 폴리뉴클레오티드 또는 뉴클레어티드 서열을 포함하는 희석 용액은 적어도 이 반응영역들의 일부가 타겟 뉴클레오티드 서열중 하나의 분자를 포함하거나 아무 것도 포함하지 않도록 복수의 반응영역로 세분된다. 반응영역들이 순차적으로 PCR 프로토콜, 절차, 검정, 프로세스 또는 실험에서 열적으로 순환되면, 타겟 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 분자들을 포함하는 반응영역들은 크게 증폭되어 양(positive)의 탐지가능한 탐지 신호를 생성하고, 반면, 타겟 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는 것들은 증폭되지 않아 탐지신호를 생성하지 않거나, 소정 역치보다 작거나 잡음 레벨의 신호를 생성한다. 포아송(Poisson) 통계를 사용하면, 반응 영역들 사이에 분산된 원래 용액에서 타겟 뉴클레오티드 서열의 수는 양의 탐지신호를 생성하는 반응영역의 개수와 상관될 수 있다. 일부 실시예에서, 탐지된 신호는 원래 용액에 포함된 타겟 분자의 수 또는 수의 범위 결정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 탐지 시스템은 하나의 타겟 분자를 포함하는 반응영역과 둘 또는 적어도 두 타겟 분자들을 포함하는 반응 영역 사이를 구별하도록 구성될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 탐지 시스템은 소정 양 이하의 많은 타겟 분자들을 포함한 반응영역들 및 소정 양보다 많이 포함한 반응영역 사이를 구별하도록 구성될 수 있다. 특정 실시예에서, qPCR 및 dPCR에 대한 프로세스, 검정 또는 프로토콜은 동일한 장치, 장비, 또는 시스템, 및 방법 중 하나를 사용하여 수행된다.
도 7을 참조하면, 시스템(100)은 컴퓨터 시스템, 전자 프로세서, 또는 제어기(200), 생물학적 또는 생화학적 시료를 수용 및/또는 처리하도록 구성된 시료 블록(114), 및/또는 광학계(124) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 범위를 제한하지 않고, 시스템(100)은 염기서열 분석 장비, 중합연쇄반응(PCR) 장비(예를 들어, 실시간 PCR (qPCR) 장비 및/또는 디지털 PCR(dPCR) 장비), 모세관 전기영동 장비, 유전형 분석 정보 제공 장비, 등을 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템(200)은 광학계(124) 및/또는 시료 블록(114)으로부터 출력된 데이터를 제어, 감시, 및/또는 수신하도록 구성된다. 컴퓨터 시스템(200)은 광학계(124) 및/또는 시료 블록(114)과 물리적으로 통합될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 컴퓨터 시스템(200)은 광학계(124) 및 시료 블록(114)과 분리되고, 예를 들어, 외부 데스크탑 컴퓨터, 랩탑 컴퓨터, 노트패드 컴퓨터, 태블릿 컴퓨터 등일 수 있다. 컴퓨터 시스템(200)과 광학계(124) 및/또는 시료 블록(114)간 통신은, USB 케이블 등과 같은 물리적 연결을 통해 직접 이뤄지거나, 무선 또는 네트워크 연결 (예를 들어, Wi-FI 연결, 근거리 통신망, 인터넷 연결, 클라우드 연결 등)을 통해 간접적으로 이뤄질 수 있다. 컴퓨터 시스템(200)은 명령어, 루틴, 알고리즘, 검사 및/또는 구성 파라미터, 검사 및/또는 실험 데이터 등을 포함한 전자 메모리 저장소를 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템(200)은, 예를 들어, 광학계(124)의 다양한 부품을 동작사키도록 구성되거나 시료블록(114)에 의해 제공된 데이터를 얻고/얻거나 처리하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템(200)은 광학계(124)의 하나 이상의 광 검출기에 의해 제공된 광 데이터를 얻고/얻거나 처리하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 컴퓨터 시스템(200)은 광학계(124) 및/또는 시료 블록(114)에 통합될 수 있다. 컴퓨터 시스템(200)은 외부 컴퓨터와 통신하고/하거나 추가 처리를 위해, 예를 들어, 하드와이어 연결, 근거리 통신망, 인터넷 연결, 클라우드 컴퓨팅 시스템 등을 사용하여 외부 컴퓨터로 데이터를 전송할 수 있다. 외부 컴퓨터는 시스템(100) 내 또는 근처에 위치한 데스크탑 컴퓨터, 랩탑 컴퓨터, 노트패드 컴퓨터, 태블릿 컴퓨터 등과 같은 물리적인 컴퓨터일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 외부 컴퓨터 및 컴퓨터 시스템(200) 중 어느 하나 또는 모두는 클라우드 컴퓨팅 또는 저장 시스템과 같은 가상 장치 또는 시스템을 포함할 수 있다. 데이터는 그 둘 사이에서 무선 통신, 클라우드 저장 또는 컴퓨팅 시스템 등을 통해 전달될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 컴퓨터 시스템(200)(예를 들어, 광학계(124) 및/또는 시료 블록(114))에서 출력된 데이터는, 예를 들어, 외부 하드 드라이브, USB 메모리 모듈, 클라우드 저장 시스템 등 외부 메모리 저장 장치로 전달될 수 있다.
특정 실시예에서, 시료 블록(114)은 시료 홀더(305)를 수용하도록 구성된다. 시료 홀더(305)는 복수의 생물학적 또는 생화학적 시료(114) 또는 그 어레이를 포함하는 복수의 공간적으로 분리된 반응 영역, 자리, 또는 위치(308) 또는 그 어레이를 포함할 수 있다. 반응 영역들(308)은 복수의 생물학적 또는 생화학적 시료(114)를 격리하도록 구성된 복수의 공간 또는 위치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응영역들(308)은 기판 또는 어셈블리에 복수의 쓰루홀 또는 웰(예를 들어, 표준 마이크로역가 플레이트 내 시료 웰), 채널 또는 챔버 내 복수의 시료 비즈, 마이크로 비즈 또는 마이크로 구, 흐름 세포(flow cell) 내 복수의 투명한 위치, 기판 표면 상의 복수의 시료 스팟, 또는 시료 홀더(예를 들어, 마이크로역가 플레이트를 수용하는 시료 블록 어셈블리 내 구멍)를 수용하도록 구성된 복수의 웰 또는 개구를 포함할 수 있다.
시료 블록(114)은 시료 블록(305)을 포함할 수 있다. 반응 공간들(308) 중 적어도 일부는 하나 이상의 생물학적 시료들(114)을 포함할 수 있다. 생물학적 또는 생화학적 시료(114)는 적어도 하나의 타겟 핵산 서열, 적어도 하나의 프라이머, 적어도 하나의 버퍼, 적어도 하나의 뉴클레오티드, 적어도 하나의 효소, 적어도 하나의 세제, 적어도 하나의 차단 에이전트, 또는, 타겟 또는 기준 핵산 서열 감지에 적합한 적어도 하나의 염료, 마커, 및/또는 프로브 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 시료 홀더(305)는 적어도 하나의 PCR 검정, 서열 검정, 또는 모세관 전기영동 검정, 블럿 검정(blot assay) 중 적어도 하나를 수행하도록 구성될 수 있다. 특정 실시예에서, 시료 홀더(305)는 마이크로역가 플레이트, 복수의 웰 또는 쓰루홀을 포함하는 기판, 하나 이상의 채널을 포함하는 기판, 또는 하나 이상의 생물학적 시료들을 포함하는 복수의 비즈 또는 구를 포함하는 챔버 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 반응 영역들(308)은 복수의 웰, 기판 내 복수의 쓰루홀, 기판상의 또는 채널 내 복수의 투명한 위치, 반응 공간 내 복수의 마이크로비즈 또는 마이크로 구 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 시료 홀더(305)는 마이크로역가 플레이터를 포함하되, 예를 들어, 반응 영역들(308)은 적어도 96개 웰, 적어도 384개 웰, 또는 적어도 1536개 웰을 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 시료 홀더(305)는 제1 표면, 대향하는 제2 표면, 및 그 표면들 사이에 배치된 복수의 쓰루홀을 포함할 수 있고, 복수의 쓰루홀은, 예를 들어, 여기에서 충분히 기술된 것처럼 참조로써 본원에 포함된 특허출원공개번호 US 2014-0242596 및 WO 2013/138706에서 논의된 바와 같이, 하나 이상의 생물학적 시료들을 포함하도록 구성된다. 그러한 실시예들에서, 기판은 적어도 3097개 쓰루홀 또는 적어도 20,000개 쓰루홀들을 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, 시료 홀더(305)는 하나 이상의 타겟 분자 또는 일련의 분자들을 통과시키도록 구성된 모세관 어레이를 포함할 수 있다.
특정 실시예들에서, 시스템(100)은 시료 홀더(305) 및/또는 시료 블록(114) 위에 배치된 가열 덮개(110)를 포함할 수 있다. 가열 덮개(110)는, 예를 들어, 시료 홀더(305)에 포함된 시료들 위의 응결을 방지할 수 있고, 이는 생물학적 시료들(114)로의 광 접근 유지에 도움을 줄 수 있다.
특정 실시예들에서, 광학계(124)는 제1 파장을 갖는 것을 특징으로 하는 제1 여기 빔(1405a) 및 제1 파장과 다른 제2 파장을 갖는 것을 특징으로 하는 제2 여기 빔(1405b)을 생성하는 여기 소스, 발광 소스, 복사 소스 또는 광 소스(1402)를 포함한다. 광학계(124)는 또한 여기 소스(1410) 및/또는 하나 이상의 여기 빔들(1405a, 1405b)에 반응하여 하나 이상의 생물학적 시료로부터의 발광 또는 복사를 수신하도록 구성된 광 센서 또는 광 검출기(1408)를 포함한다. 광학계(124)는 추가적으로 여기 소스(1402) 및 발광될 하나 이상의 생물학적 시료 사이에서 여기 광 경로(1412)를 따라 배치된 여기 광학계(1410)를 포함한다. 광학계(124)는 발광된 시료(들) 및 광 센서(1408) 사이에서 발광 광경로(1417)를 따라 배치된 발광 광학계(1415)를 추가로 포함한다. 특정 실시예들에서, 광학계(124)는 빔스플리터(1420)를 포함할 수 있다. 광학계(124)는 빔스플리터(1420)에 영향을 주는 여기 소스(1420)로부터의 복사에 대한 발광 광경로(1417)로의 반사를 감소시키거나 방지하는 빔 덤프(beam dump) 또는 복사 배플(radiation baffle)을 선택적으로 포함할 수 있다.
본원에 개시된 발명의 다른 실시예들 뿐만 아니라, 도 7에 도시된 실시예에서, 여기소스(1420)는 복사 소스(1425)를 포함한다. 복사 소스(1425)는 적어도 하나의 백열등, 적어도 하나의 가스 방전등, 적어도 하나의 발광 다이오드, 적어도 하나의 유기 발광 다이오드, 및/또는 적어도 하나의 레이저 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 복사 소스(1425)는 적어도 하나의 할로겐등, 크세논등, 아르곤등, 크립톤등, 다이오드 레이저, 아르곤 레이저, 크세논 레이저, 엑시머 레이저, 고체 레이저, 헬륨-네온 레이저, 색소 레이저(dye laser), 또는 그 결합을 포함할 수 있다. 복사 소스(1425)는 전자기 스펙트럼의 가시대역에서 최대 또는 중심 파장을 갖는 것을 특징으로 하는 광 소스를 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 복사 소스(1425)는 전자기 스펙트럼의 해당 파장 대역 내 해당 최대 또는 중심 파장을 갖는 자외선, 적외선, 또는 근적외선 소스를 포함할 수 있다. 복사 소스(1425)는, 예를 들어, 적어도 100 나노미터, 적어도 200 나노미터, 또는 적어도 300 나노미터를 갖는 광대역 소스일 수 있고, 대역폭은 강도, 에너지 또는 파워 출력이 소정량 (예를 들어, 여기서 소정량은 복사 소스의 최대 또는 중심 파장의 약 1%, 5%, 또는 10%임)보다 큰 범위로 정의된다. 여기 소스(1402)는 추가적으로 복사 소스(1425)의 발광 조건을 만족하도록 구성된, 예를 들어, 시료 홀더(305)에서 및/또는 생물학적 시료(114)로 수용되는 여기 복사의 양을 증가시키는 소스 렌즈(1428)를 포함할 수 있다. 소스 렌즈(1428)는 단순 렌즈를 포함하거나 둘 이상의 소자를 포함한 복합 렌즈일 수 있다.
특정 실시예들에서, 여기 소스(1402)는 여기 광 경로(1412) 안팎으로 이동가능하고, 예를 들어, 광대역 여기 소스(1402)와 결합되어 사용된 둘 이상의 여기 필터(1430)을 추가로 포함한다. 그러한 실시예들에서, 다른 여기 필터들(1430)은 생물학적 시료(114) 내의 개별 염료 또는 마커로부터 형광 유도에 적합한 다른 파장 범위 또는 여기 채널 선택에 사용될 수 있다. 하나 이상의 여기 필터들(1430)은 적어도 ±10 나노미터 또는 적어도 ±15 나노미터의 파장 대역폭을 가질 수 있다. 여기 필터들(1430)은 SYBR® 염료 또는 프로브, FAMTM 염료 또는 프로브, VIC® 염료 또는 프로브, ROXTM 염료 또는 프로브, 또는 TAMRATM 염료 또는 프로브 중 하나 이상을 형광을 내는데 적합한 복수의 대역통과를 제공하는 복수의 필터를 포함할 수 있다. 여기 필터(1430)는 회전형 필터 휠(도시되지 않음) 또는 여기 소스(1402)를 사용하여 다른 여기 채널들을 제공하는 다른 적절한 장치 또는 장비에 배열될 수 있다. 특정 실시예들에서, 여기 필터(1430)는 적어도 5개의 필터 또는 적어도 6개의 필터를 포함한다.
특정 실시예들에서, 여기 소스(1402)는 하나 이상의 빔 스플리터 또는 빔 결합기를 사용하여 각 개별 여기 소스로부터의 복사가 공통 광 경로를 따라, 예를 들어, 도 7에 도시된 여기 광 경로(1412)를 따라 전송되도록 결합될 수 있는 복수의 개별 여기 소스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 개별 여기 소스들 중 적어도 일부는 중복되지 않는 다른 광 경로를 따라 전파하는 여기 빔들을 공급하여, 예를 들어, 복수의 반응 영역(308)의 다른 반응 영역을 조사하도록 배열될 수 있다. 개별 여기 소스들 각각은 반응 영역들(308)을, 예를 들어, 개별적으로 또는 그룹으로, 또는 모두 동시에 조사하도록 지정되거나 활성화되거나 또는 선택될 수 있다. 특정 실시예들에서, 개별 여기 소스들은 1차원 또는 2차원으로 배열될 수 있고, 하나 이상의 개별 여기 소스들은 어레이에서 다른 개별 여기 소스들 중 적어도 하나의 최대 또는 중심 파장과는 다른 최대 또는 중심 파장을 갖는 것을 특징으로 한다.
특정 실시예들에서, 제1 여기 빔(1405a)은 제1 여기 빔(1405a)의 강도, 파워, 또는 에너지가 제1 소정값보다 높은 제1 파장 범위를 포함하고, 제2 여기 빔(1405b)은 제2 여기 빔(1405b)의 강도, 파워, 또는 에너지가 제2 소정값보다 높은 제2 파장 범위를 포함한다. 여기빔들(1405a, 1405b)의 특성 파장은 해당 파장범위의 중심 파장 또는 해당 파장 범위에서 최대 전자기 강도, 파워, 및 에너지의 파장일 수 있다. 여기 빔들(1405) 중 적어도 하나의 중심 파장은 해당 파장 범위의 평균 파장일 수 있다. 각 여기 빔(1405)(예를 들어, 여기 빔들(1405a, 1405b)에 대해, 소정 값은 해당 최대 강도, 파워, 또는 에너지의 20% 미만; 해당 최대 강도, 파워, 또는 에너지의 10% 미만; 해당 최대 강도, 파워, 또는 에너지의 5% 미만; 또는 해당 최대 강도, 파워, 또는 에너지의 1% 미만일 수 있다. 소정 값들은 모든 여기 빔들(1405)(예를 들어, 두 여기 빔들(1405a, 1405b))에 대해 동일하거나, 서로 다를 수 있다. 일부 실시예들에서, 제1 및 제2 여기 빔들(1405a, 1405b)의 파장 범위들은 중첩하지 않는 반면, 다른 실시예에서 파장 범위들의 적어도 하나는 다른 하나와 적어도 부분적으로 중첩한다. 일부 실시예들에서, 제1 및 제2 중심 파장들은 적어도 20 나노미터 떨어져 있다. 일부 실시예들에서, 제1 및 제2 파장 범위들의 적어도 하나는 적어도 20 나노미터 또는 적어도 30 나노미터의 값을 갖는다.
여기 광학계(1410)는 여기 빔들(1405a, 1405b)을 하나 이상의 생물학적 시료들에 직접 비추도록 구성된다. 해당하는 경우, 여기 빔들(1405a, 1405b)에 대한 본원에서의 언급은 두개 초과의 여기 빔들(1405)을 포함하는 실시예에 적용될 수 있다. 예를 들어, 여기 소스(1402)는 적어도 5개 또는 6개 여기 빔들(1405)을 출력하도록 구성될 수 있다. 여기 빔들(1405a, 1405b)은 동시에 생성 또는 공급될 수 있고, 시간적으로 분리될 수 있고/있거나 공간적으로 분리될 수 있다(예를 들어, 여기 빔(1405a)은 하나의 반응 공간(308)으로 향하고, 여기 빔(1405b)은 다른 반응 공간(308)으로 향할 수 있다). 여기 빔들(1405)은, 예를 들어, 다른 파장을 갖는 것을 특징으로 하는, 색이 다른 개별 복사 소스(1425)를 순차적으로 턴온 및 턴오프함으로써 또는 단일 복사 소스(1425) 정면에 다른 칼라 필터들을 순차적으로 배치함으로써 순차적으로 생성될 수 있다. 대안적으로, 여기 빔들(1405a, 1405b)은 동시에, 예를 들어, 다중 파장 대역 필터, 빔 스플리터, 또는 거울을 사용하여, 또는 다른 두 색의 발광 다이오드(LEDs)와 같은 다른 개별 복사 소스(1425)를 함께 결합하여 동시에 생성될 수 있다. 일부 실시예들에서, 여기 소스(1402)는 둘 보다 많은 여기 빔들(1405)을 생성하고, 여기 광학계(1410)는 각 여기 빔을 하나 이상의 생물학적 시료(114)로 향하게 한다.
도 8 내지 9를 참조하면, 복사 소스 (1425)의 스펙트럼 분포는 예를 들어, 각 qPCR 검정 사이클 동안, 모든 여기 채널에 대한 수용가능한 또는 소정의 데이터 처리량을 동시에 유지하면서, 비자명한 방식으로 선택되어 다른 색깔 또는 여기 채널을 갖는 최소한 5개의 여기광(1405)이 하나의 공통 빔 스플리터(1420)와 함께 사용될 수 있게 한다. 본원에서 사용된 것처럼, 용어 "여기 채널"은 여기 소스(예를 들어, 여기 소스(1402)))에 의해 제공되어 하나 이상의 생물학적 시료들을 조사(illuminate)하도록 구성된 몇 개의 분명한 전자기 파장 대역 각각을 의미한다. 본원에서 사용된 것처럼, 용어 "발광 채널"은 전자기 복사가 광 센서 또는 검출기 (예를 들어, 광 센서 (1408)) 상으로의 통과하도록 하는 몇 개의 분명한 발광 파장 대역의 각각을 의미한다.
도 8은 세가지 다른 복사 소스들의 파장 스펙트럼에 대한 관련 에너지를 나타낸다. 파선은 가시광 스텍트럼의 청색 파장 범위 내에서 비교적 낮은 에너지 레벨을 갖고 약 670 나노미터의 피크까지 에너지를 증가시키는 것을 특징으로 하는 할로겐등(여기에서는 '소스 1'로 지칭)의 스펙트럼이다. 파선-점선 스펙트럼은 상용 LED 광 소스(여기에서는 '소스 2'로 지칭)의 스펙트럼으로, 450 나노미터 주변에서 피크 에너지를 갖고 약 530 나노미터 내지 약 580 나노미터에서 보다 낮은 피크를 가지며, 이후 가시광선 스펙트럼의 적색 파장 범위로 서서히 에너지가 감소한다. 실선은 본 발명의 실시예에 따른 다른 LED 광 소스 (여기에서는 '소스 3'으로지칭)의 스펙트럼(예를 들어, 여기광(402)의 예시적인 스펙트럼)이다. 도 9는 도 8에 도시된 세 소스 각각의 다양한 스펙트럼에 대한 통합 에너지를 나타내는 것으로, 각 스펙트럼은 qPCR 분야에 사용된 전형적인 여기 필터의 스펙트럼이다. 파장 범위 및 여기 필터 지정은 다음의 표 1과 같다.
도 9에 사용된 여기 필터의 스펙트럼 대역폭
여기 필터 채널 파장 범위(나노미터)
X1 455-485
X2 510-530
X3 540-560
X4 570.5-589.5
X5 630.5-649.5
X6 650-674
qPCR 분야에서, 중요한 성능 파라미터는 다수의 타겟 염료를 포함하는 시료들에 대한 발광 데이터를 얻기 위한 총 시간이다. 예를 들어, 일부 경우에, 5 또는 6개의 염료 또는 필터 채널들(예를 들어, X1-X5 / M1-M5 or XI -X6 / M1-M6, 여기에서 "M"은 해당 X (여기) 채널 번호에 대한 발광 채널 번호를 나타냄)에 대한 발광 데이터를 얻는 것이 바람직하다. 발명자들은 소스 2가 6개의 EX/EM 필터 채널들(예를 들어, 여기 채널들 X1-X6 및 해당 발광 채널들 M1-M6)에 대한 단일 광대역 빔 스플리터를 갖는 시스템에 사용되고, 채널 5 및/또는 채널 6에 대한 데이터를 얻기 위한 시간은 어떤 어플리케이션에서는 수용할 수 없을 정도로 길 수 있다는 것을 발견했다. 이러한 상황을 해결하기 위해, 여기 채널 1 및/또는 2 를 위해 하나 이상의 협대역 다이크로익 빔스플리터를 사용하여 시료(들)에 의해 수신된 여기광량 및 (이 경우, 전체 광 효율이 다이크로익 빔 스플리터를 사용하여 증가되도록) 센서에 의해 수신된 방출 광량을 증가시킬 수 있다. 그러나 이는 도 7에 도시된 바와 같이, 단일 빔 스플리터 배치와 단일 빔 스플리터 구성에 상응하는 장점(예를 들어, 크기, 비용, 및 복잡도 감소)을 얻지 못하게 된다. 소스 3과 같은 광 소스가 단일 빔 스플리터(예를 들어, 50/50 빔 스플리터와 같은 광대역 빔 스플리터)와 결합하여 사용된 더 나은 해법이 발견되었다. 여기 채널들 X1, X5 및/또는 X6에서 상대적인 에너지가 단일 빔 스플리터 실시예와 함께 사용하는데 적절한 여기 소스(402)의 식별에 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 예를 들어, 소스 2 및 소스 3을 사용하여 다음의 표 2에 나타낸 데이터가 도 8 및 9에 나타낸 데이터로부터 도출될 수 있다.
채널 2로 정규화된 각 필터 채널의 LED 강도
비율 소스 2 소스 3
X1/X2 2.02 3.00
X2/X2 1.00 1.00
X3/X2 1.20 0.98
X4/X2 1.09 0.89
X5/X2 0.49 0.90
X6/X2 0.38 0.90
그러한 데이터를 기반으로, 발명자들은 특정 실시예들에서, X1/X2가 2.5 보다 클 때 (예를 들어 3 이상), (예를 들어, 짧은 채널 1의 통합 시간 면에서) 개선된 성능을 얻을 수 있음을 발견했다. 추가적으로 또는 대안적으로, 다른 실시예들에서 X5/X2가 0.7 보다 클 때 (예를 들어 0.9 이상), 및/또는 X6/X2가 0.7 보다 클 때 (예를 들어 0.9 이상) 일 때, (예를 들어, 짧은 채널 1의 통합 시간 면에서) 개선된 성능을 얻을 수 있다.
도 7을 참조하면, 여기 빔들(1405)은 시료를 처리하는 시료 블록(114)을 향해, 예를 들어, 시료 홀더(305)가 있는 경우, 반응 영역(308)을 향해 동작하는 동안 여기 광 경로(1412)를 따라 향한다. 소스 렌즈(1428)는, 존재한다면, 여기 빔들(1405)에 대해, 예를 들어, 여기 소스(1402)로부터 방출된 방사의 큰 부분을 캡쳐하여 향하는 조건을 만족하도록 구성된다. 특정 실시예들에서, 하나 이상의 거울들(1432)(예를 들어, 접이식 거울)이 여기 광경로(1412)를 따라 채용되어, 예를 들어, 광학계(124)를 더 소형으로 만들고/만들거나 소정 패키지 치수를 제공한다. 도 7은 하나의 거울(142)를 도시하지만, 추가적인 거울이, 예를 들어 패키징 설계 제한을 만족하도록, 사용될 수 있다. 하기에서 더 상세하게 논의되는 것처럼, 예를 들어, 여기 빔(1405) 및/또는 하나 이상의 반응 영역에 포함된 생물학적 시료들로부터의 발광을 조정하기 위해, 추가적인 렌즈가 시료 홀더(305) 근처에 배치될 수 있다.
발광 광학계(1415)는 하나 이상의 생물학적 시료들로부터 발광이 광센서(1408)로 향하도록 구성될 수 있다. 적어도 일부 발광은 적어도 하나의 여기 빔(1405)에 반응하여 적어도 일부 생물학적 시료들로부터의 형광 방출을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 적어도 일부 발광은 적어도 일부 생물학적 시료들에 의해 반사, 굴절, 회절, 산란, 또는 편광된 적어도 하나의 여기 빔(1405)으로부터의 복사를 포함한다. 특정 실시예에서, 발광 광학계(1415)는, 예를 들어 반사 또는 산란된 여기 복사가 발광 경로(1417)로 입사되는 것을 차단하는 하나 이상의 발광 필터(1435)를 포함한다. 특정 실시예에서는, 각 여기 필터(1430)에 상응하는 발광 필터(1435)가 있다.
특정 실시예에서, 발광 광학계(1415)는 적어도 일부 생물학적 시료로부터의 발광이 광 센서(1408)로 향하도록 구성된 센서 렌즈(1438)를 포함한다. 광센서(1408)는 단일 센서 소자, 예를 들어, 포토다이오드 검출기 또는 광증배관(photomultiplier tube) 등을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 광 센서(1408)는 센서 또는 픽셀 어레이를 포함하는 어레이 센서를 포함할 수 있다. 어레이 센서(1408)는 하나 이상의 상보형 금속산화 반도체(CMOS), 전하결합 소자(CCD) 센서, 복수의 포토 다이오드 검출기, 복수의 전자증배관 등을 포함할 수 있다. 센서 렌즈(1438)는 하나 이상 복수의 생물학적 시료(114)로부터의 발광에 의해 영상을 형성하도록 구성될 수 있다. 특정 실시예들에서, 광 센서(1408)는 둘 이상의 어레이 센서들(1408)을 포함하고, 예를 들어, 하나 이상 복수의 생물학적 시료(114)로부터의 발광에 의해 둘 이상의 영상이 형성된다. 그러한 실시예들에서, 하나 이상 복수의 생물학적 시료(114)로부터의 발광은 분기되어 하나 이상 복수의 생물학적 시료(114)에 대한 두 개의 신호를 제공할 수 있다. 특정 실시예들에서, 광 센서는 적어도 두 어레이 센서를 포함한다.
빔 스플리터(1420)는 여기 및 발광 경로(1412, 1417)를 따라 배치되어 동작 중에 제1 및 제2 여기 빔들(1405a, 1405b)을 수용하도록 구성된다.
도 7에 도시된 실시예에서, 빔 스플리터(1420)는 여기 빔(15\405)을 전송하도록 그리고 생물학적 시료들(114)로부터의 발광을 반사하도록 구성된다. 또는, 빔 스플리터(1420)는 여기광을 반사하도록 그리고 생물학적 시료들(114)로부터의 발광을 전송하도록 구성된다. 특정 실시예들에서, 빔 스플리터(1420)는 여기 소스(1402)에 의해 제공된 여기 빔들(1405)의 모두 또는 대부분을 동일하게 또는 거의 동일하게 반사하여 반응 영역(308)으로 향하게 하는 (예를 들어, 도시된 실시예에서 여기 빔(1405a, 1405b)) 광대역 빔 스플리터를 포함한다. 예를 들어, 빔 스플리터(1420)는 적어도 100 나노미터의 파장 대역, 적어도 200 나노미터 파장 대역, 또는 전자기 스펙트럼의 가시광 대역에서, 전자기 스펙트럼의 가시광 또는 근적외선 파장 대역, 또는 450 나노미터 내지 680 나노미터의 파장 대역에서 일정하게 또는 거의 일정하게 반사하는 특징을 갖는 광대역 빔 스플리터일 수 있다. 특정 실시예들에서, 빔 스플리터(1420)는 광도축소필터(neutral density filter), 예를 들어, 전자기 스펙트럼의 가시광 파장 대역에서 약 20%, 50%, 또는 80% 반사하는 필터일 수 있다. 특정 실시예에서, 빔 스플리터(1420)는 하나 이상의 선택된 파장 범위에서 투과하거나 반사하는 다이크로익 빔 스플리터, 예를 들어, 여기 빔(1405)의 피크 파장 또는 그 근처의 하나 이상의 파장 중심 대역에 대해 투과하거나 반사하는 다중 광 대역 빔 스플리터이다.
특정 실시예들에서, 빔 스플리터(1420)는 단독으로 또는 단일 빔 덤프(1422)와 결합하여 복수의 여기 빔(1405)(예를 들어, 여기 빔들(1405a, 1405b))의 모두 또는 일부를 수신하는 단일 빔 스플리터이다. 각 여기 빔은 여기 채널로 지칭될 수 있고, 하나 이상의 생물학적 시료(114)에서 단독으로 또는 결합하여 다른 형광 염료 또는 프로브 분자들을 여기시킬 수 있다. 그에 반해, 많은 다른 종래 시스템 및 장비들은, 예를 들어, qPCR 분야에서, 그 시스템 또는 장비의 각 여기 채널 및/또는 각 발광 채널에서 별도의 빔 스플리터 및/또는 빔 덤프를 사용하여 복수의 여기 빔을 공급한다. 그러한 종래의 시스템 및 장비에서, 적어도 일부 여기 채널에서는 보통 색깔로 선택되는 다이크로익 필터가 사용되어 시료에서 수용된 복사 양을 증가시킨다. 각 채널에 대해 다른 빔 스플리터 및/또는 빔 덤프를 사용하는 시스템 및 장비의 단점은 (예를 들어, 여기 및/또는 방출 채널들 사이에서 바뀔 때, 이동하거나 회전되어야 할 질량 증가로 인해) 크기, 비용, 복잡도 및 반응시간이 증가한다는 것이다. 발명자들은 예를 들어, (본원에서 추가로 논의된 것처럼) 여기 소스(1402)의 스펙트럼 분포를 적절하게 선택함으로써, 그리고/또는 광 센서(408)에 의해 수신되는, 빗나가거나 원치 않는 복사양을 감소시키도록 시스템 또는 장비를 구성함으로써 수용가능한 또는 소정의 시스템 또는 장비 성능을 제공하면서, 이 복수의 빔 스플리터 및/또는 빔 덤프를 단일 빔 스플리터(1420) 및/또는 단일 빔 덤프(1422)로 대체할 수 있음을 발견했다. 따라서, 본 발명의 실시예들은 종래의 시스템 및 장비들과 비교하여 감소된 크기, 비용, 복잡도 및 반응시간을 갖는 시스템 및 장비를 제공하는 데 사용될 수 있다.
도 10 내지 11을 참조하면, 특정 실시예에서, 광학계(124)는 렌즈(1440) 및/또는 시료 홀더(305)의 각 반응 영역(308)에 대응하는 복수의 렌즈를 포함할 수 있는 렌즈 어레이(1442)를 추가로 포함할 수 있다. 렌즈(1440)는 적어도 하나의 시료 홀더(305), 반응 영역들(308), 렌즈 어레이(1442), 또는 광 센서(1408)에 대해 텔리센트릭(telecentric) 광학계를 제공하도록 구성될 수 있는 필드 렌즈를 포함할 수 있다. 도 10에 도시된 실시예와 같이, 렌즈(1440)는 프레스넬(Fresnel) 렌즈를 포함할 수 있다.
도 12 내지 도 16을 참조하면, 특정 실시예에서, 광학계(124)는 광센서 회로 보드(1448), (도 12에 도시된 복합렌즈일 수 있는) 센서 렌즈(1438), 내부 렌즈 마운트(1449), 외부 렌즈 마운트(1450), 나사형(threaded) 하우징(1452) 및 초점 기어(1455)를 포함하는 촬영부(1445)를 포함한다. 광 센서 회로보드(1448), 나사형 하우징(1452), 및 센서 렌즈(1438)는 함께 광 센서(1408)를 감싸거나 포함하는 구멍(1458)을 형성할 수 있고, 센서 렌즈(1438)를 통해 들어가지 않는 외부 광이 광 센서(1408)에 영향을 주는 것을 차단하도록 구성될 수 있다. 외부 렌즈 마운트(1450)는 스프링과 같이 탄성이 있는 소자(도시되지 않음)를 통해 초점 기어(1455)의 톱니와 이동하면서 또는 밀면서 맞물릴 수 있는 기어 톱니(1460)를 포함하는 외부면을 포함한다. 특정 실시예에서, 초점 기어(1455)는 도 16에 도시된 플레이트(1465)의 슬롯(1462)을 따라 이동하거나 밀어낸다. 내부 렌즈 마운트(1449)는 나사형 하우징(1452)의 나사부와 맞물리는 나사부(1468)를 포함한다.
내부 렌즈 마운트(1449)는 외부 렌즈 마운트(1450)에 고정되어 장착될 수 있는 반면, 나사형 하우징(1452)은 광 센서 회로 보드(1448)에 고정되어 장착된다. 내부 렌즈 마운트(1449)는 나사형 하우징(1452)에 이동가능하도록 또는 회전가능하도록 장착된다. 따라서, 초점 기어(1455) 및 외부 렌즈 마운트(1450)는 초점 기어(1455)의 회전도 외부 렌즈 마운트(1450)를 회전시키도록 맞물릴 수 있다. 이는 차례로 내부 렌즈 마운트(1449) 및 센서 렌즈(1438)가 내부 렌즈 마운트(1449) 및 나사형 하우징(1452)에서 나사를 통해 센서 렌즈(1438)의 광축을 따라 움직이게 한다. 이러한 방식으로, 센서 렌즈(1438)의 초점은 매우 소형의 광학계(124) 내에 묻힌 센서 렌즈(1438) 또는 그와 결합된 마운트들(1449, 1450)과 직접 맞물리지 않은 채, 조정될 수 있다. 초점 기어(1455)와의 맞물림은 수동으로 또는 자동으로, 예를 들어, 스텝퍼 모터 또는 DC 모터 등과 같은 모터(도시되지 않음)를 사용하여 이뤄질 수 있다.
도 13 및 15 내지 19를 참조하면, 특정 실시예들에서 촬영부(1445)는 잠금 장치 또는 메커니즘(1470)을 추가로 포함한다. 잠금 장치(1470)는 초점 기어의 두 톱니 사이에서 밀려서 맞물릴 수 있는 에지 또는 톱니(1472)를 포함한다(도 17 내지 19 참조). 도 17 및 18에 도시된 바와 같이, 잠금 장치(1470)는 초점 기어(1455)가 자유롭게 회전하여 센서 렌즈(1438)의 초점을 조정하는 제1 위치(도 17) 및 초점 기어(1455)가 제 위치에 고정되어 회전하는 것을 막는 제2 위치(도 18)를 가질 수 있다. 이런 방식으로, 센서 렌즈(1438)의 초점은 나사를 손상시킬 수 있고, 제 위치에 들어간 후 센서 렌즈(1438)의 초점을 다시 맞추는 것을 방해할 수 있는 내부 렌즈 마운트(1449)의 나사(1468)와 직접 닿는 것을 피하면서 고정될 수 있다. 잠금 장치(1470)의 동작은 수동으로 또는 자동화된 방법으로 이루어질 수 있다. 특정 실시예에서, 잠금 매커니즘(1470)은 탄성 소자(도시되지 않음)를 추가로 포함하고, 초점 기어(1455)의 회전은 그 탄성 소자에 의해 생성된진 임계력을 극복하여 이뤄질 수 있다.
도 20을 참조하면, 광학계(124)는 또한 광학 하우징(1477)을 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, 광학계(124)는 복사 차폐물(1475)을 포함하고, 복사 차폐물(1475)은 발광 경로(1417)를 따라 배치된 센서 개구(1478) 및 센서 개구(1478)와 함께 동작하도록 배치된 적어도 하나의 차단 구조물(1480)을 포함하여, 광조사 영역(1482)에서 반사되어 센서 개구(1478)를 통과한 여기 빔들(1405)로부터의 복사만이 광학 하우징(1477)의 적어도 하나의 표면, 또는 그 내부에서 반사되었던 복사가 되게 한다. 즉, 복사 차폐물(1475)은 광조사 영역(1482)에서 반사된 여기 빔들(1405)로부터의 복사가 개구(1478)를 곧바로 통과하는 것을 방지하고 그에 따라 센서 렌즈(1438)를 통과하여 광 검출기(1408)에 도달하는 것을 방지한다. 특정 실시예에서, 광조사 영역(1482)은 복수의 반응 영역(308)에 대응하는 가열 덮개(110)의 모든 개구들(1483)에 의해 규정된 영역을 포함한다.
도 20에 도시된 실시예에서, 차단 구조물(1480)은 선반(1480)을 포함한다. 파선들 또는 광선들(1484a 및 1484b)은 광조사 영역(1482)에서 직접 반사된 광이 센서 개구(1482)를 통과하여 센서 렌즈(1438) 및/또는 광 센서(1408)에 도달하는 것을 방지함에 있어서 차단 구조물(1480)의 유효성을 도시하는 데 사용될 수 있다. 광선(1484a)은 광조사 영역(1482)의 가장자리(edge)에서 나와서 선반(1480)을 지나지만 센서 개구(1478)는 통과하지 않는다. 광선(1484b)은 광조사 영역(1482)의 동일한 가장자리에서 나온 다른 광선으로 선반(1480)에 의해 차단된다. 볼 수 있는 것과 같이, 이 광선은 선반(1480)이 없었더라면 센서 개구(1478)를 통과했을 것이다.
도 20을 계속 참조하면, 특정 실시예에서, 광학계(124)는 광 파이프(1492)의 일단과 광학적으로 결합된 파워 또는 에너지 센서를 포함하는 에너지 또는 파워 감지부를 추가로 포함할 수 있다. 광 파이프(1492)의 반대쪽 단은 여기 빔들(1405)에 의해 조사되도록 구성된다. 광 파이프 단(1493)은 여기 빔들(1405)에 포함된 복사에 의해 직접 또는, 예를 들어 분산면에 의해 산란된 복사에 의해 간접적으로 조사될 수 있다. 특정 실시예에서, 센서(1490)는 여기 소스(1402)로부터의 여기 광 경로(1412) 외부에 위치한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 센서(1490)는 광학 하우징(1477) 외부에 위치하고/하거나 장비 하우징(105) 외부의 원격지에 위치한다. 도 20에 도시된 실시예에서, 광 파이프 단(1493)은 거울(1432) 가까이 또는 인접하여 위치하고, 광 파이프 면이 여기 빔들(1405)을 반사하는 거울(1432)의 표면에 수직하거나 또는 거의 수직하도록 향할 수 있다. 발명자들은 이와 같이 향할 때 광 파이프(1492)에 의해 가로막힌 낮은 에너지 또는 파워 양이 여기 빔들(1405)의 에너지 또는 파워를 모니터링하기 위해 충분하다는 것을 발견했다. 유리하게도, 여기 빔들의 광 경로 외부에 센서(1490)를 위치시킴으로써 더 소형의 광학계(124)가 제공될 수 있다.
특정 실시예들에서, 광 파이프(1492)는 단일 섬유 또는 섬유 다발을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 광(1492)은 유리, 플렉시유리(Plexiglas), 아크릴 등과 같은 물질에 기반한 폴리머 등과 같이 투명하거나 투과성 물질로 만들어진 봉(rod)를 포함할 수 있다.
광학계(124)의 다른 양상은 또한 다음과 같이 설명될 수 있다.
다른 실시예 1에서, 생물학적 분석 장비는: 하나 이상의 생물학적 시료들을 처리하는 복수의 공간적으로 분리된 반응 영역을 포함하는 시료 홀더를 수용하도록 구성되고, 분리된 생물학적 시료들에 대한 폴리머라아제연쇄반응 검정을 수행하는 열 사이클러를 포함하는 베이스; 제1 파장을 특징으로 하는 제1 여기 빔을 생성하도록 구성되고, 제1 파장과 다른 파장의 제2 파장을 특징으로 하는 제2 여기 빔을 생성하도록 구성된 여기 소스; 여기 소스에 반응하여 생물학적 시료들로부터의 발광을 수신하도록 구성된 광 센서; 여기 소스와 시료 홀더 사이에서 여기 광 경로를 따라 배치되고, 여기 빔들이 시료 홀더를 향하게 하도록 배치된 시료 렌즈를 포함하는 여기 광학계; 시료 홀더와 광 센서 사이의 발광 경로를 따라 배치되고, 생물학적 시료들로부터의 발광이 광 센서를 향하도록 구성된 발광 광학계; 여기 광 경로 및 발광 경로 모두를 따라 배치되고, 제1 여기 빔 및 제2 여기 빔을 수신하도록 배치된 빔 스플리터, 시료 렌즈는 빔 스플리터와 베이스 사이의 여기 광 경로를 따라 배치됨; 빔 스플리터로부터의 여기 빔 복사를 수신하고, 여기 빔 복사의 10% 미만을 빔 스플리터로 되반사시키도록 구성된 빔 덤프; 촬영부를 포함하고, 촬영부는: 하부면 및 광 센서 회로보드를 포함하는 그 반대되는 상부면; 렌즈 케이스에 의해 적어도 부분적으로 감싸여지는 센서 렌즈, 하부면은 센서 렌즈면을 포함; 렌즈 케이스와 맞물리는 기어를 포함하고, 센서 렌즈의 초점을 조정하도록 외함(enclosure) 외부에서 접근가능한 초점 조절 메커니즘; 빔 스플리터와 베이스 사이의 여기 광 경로를 따라 배치된 광 조사면, 광 조사면은 사용 중에 광 조사면에 의해 반사된 여기 소스로부터의 복사를 포함하는 반사된 복사를 생성하도록 구성됨; 복사 차폐물을 포함하고, 복사 차폐물은: 빔 스플리터와 센서 렌즈 사이의 발광 경로를 따라 배치된 센서 개구; 및 반사된 복사가 장비의 다른 표면에서도 반사하지 않는 광 센서에 의해 수신되지 않도록 사용 중에 센서 개구와 함께 동작하도록 배치된 차단 구조물; 에너지 또는 파워 감지부를 포함하고, 에너지 또는 파워 감지부는: 광 경로 외부에 위치한 에너지 또는 파워 센서; 빔 스플리터에 인접하여 배치되고, 복사를 빔 스플리터에서 파워 센서로 전달하도록 구성된 광 파이프; 복사를 방출하도록 구성된 위치 소스 및 위치 소스로부터의 복사를 수신하도록 구성된 대응 위치 센서, 위치 소스 및 위치 센서는 광 경로들 중 적어도 하나를 따라 배치된 광 소자의 위치를 나타내는 위치 신호를 생성하도록 구성됨; 위치 소스로부터의 적어도 일부 복사를 차단하도록 구성된 복사 차폐물; 광 경로들을 감싸는 광 외함, 외함은 외함 외부 위치에서 외함 내부 위치까지 와이어 또는 케이블을 통과하도록 구성되어 외함 외부의 차단 광이 외함으로 들어가는 것을 차단하는 스플릿 와이어 그로밋(split wire grommet)을 포함; 외함 외부의 차단 광이 외함으로 들어가는 것을 차단하면서 센서 렌즈가 3차원 조정을 허용하도록 구성된 렌즈 홀 덮개;를 포함하도록 제공되되,여기서 광 센서는 상보형 금속 산화 반도체 센서이다.
다른 실시예 2에서, 청구항 1의 장비가 제공되며, 여기서 차단 구조물은 반사된 복사가 장비의 다른 표면에서도 반사하지 않는 센서 렌즈에 영향을 주지 않도록 사용 중에 센서 개구와 함께 동작하도록 배치된다.
다른 실시예 3에서, 생물학적 분석 장비는: 하나 이상의 생물학적 시료들을 처리하는 복수의 공간적으로 분리된 반응 영역을 포함하는 시료 홀더를 수용하도록 구성된 베이스; 제1 파장을 특징으로 하는 제1 여기 빔 및 제1 파장과 다른 파장의 제2 파장 특징으로 하는 제2 여기 빔을 생성하도록 구성된 여기 소스; 여기 소스에 반응하여 생물학적 시료들로부터의 발광을 수신하도록 구성된 광 센서; 여기 소스 및 시료 홀더 사이의 여기 광 경로를 따라 배치된 여기 광학계; 시료 홀더 및 광 센서 사이의 발광 경로를 따라 배치된 발광 광학계, 발광 광학계는 생물학적 시료들로부터의 발광이 광 센서로 향하도록 구성됨; 촬영부를 포함하고, 촬영부는: 하부면 및 광 센서 회로 보드를 포함하는 그 반대의 상부면; 렌즈 케이스에 의해 적어도 부분적으로 감싸여지는 센서 렌즈, 하부면 센서 렌즈의 표면을 포함; 렌즈 케이스와 맞물리는 기어를 포함하고, 센서 렌즈의 초점을 조정하도록 외함 외부에서 접근가능한 초점조절 메커니즘을 포함하도록 제공된다.
다른 실시예 4에서, 생물학적 분석 장비는: 하나 이상의 생물학적 시료들을 처리하는 복수의 공간적으로 분리된 반응 영역을 포함하는 시료 홀더를 수용하도록 구성된 베이스; 베이스, 시료 홀더 또는 분리된 생물학적 시료들의 적어도 하나의 온도를 제어하도록 구성된 열 제어기; 제1 파장을 특징으로 하는 제1 여기 빔 및 제1 파장과 다른 파장의 제2 파장을 특징으로 하는 제2 여기 빔을 생성하도록 구성된 여기 소스; 여기 소스에 반응하여 생물학적 시료들로부터의 발광을 수신하도록 구성된 광 센서; 여기 소스 및 시료 홀더 사이의 여기 광 경로를 따라 배치된 여기 광학계; 시료 홀더 및 광 센서 사이의 발광 경로를 따라 배치된 발광 광학계, 발광 광학계는 생물학적 시료들로부터의 발광이 광 센서로 향하도록 구성됨; 적어도 일부 생물학적 시료들로부터의 발광을 광 센서로 향하도록 구성된 센서 렌즈; 빔 스플리터와 베이스 사이의 여기 광 경로를 따라 배치된, 광 조사면, 광 조사면은 광 조사면에 의해 반사된 여기 소스로부터의 복사를 포함하는 반사된 복사를 생성하도록 구성됨; 복사 차폐물을 포함하고, 복사 차폐물은: 빔 스플리터와 센서 렌즈 사이의 발광 경로를 따라 배치된 센서 개구; 및 반사된 복사가 장비의 다른 표면에서도 반사하지 않는 광 센서에 의해 수신되지 않도록 사용중에 센서 개구와 함께 동작하도록 배치된 차단 구조물을 포함하도록 제공된다.
다른 실시예 5에서, 생물학적 분석 장비는: 하나 이상의 생물학적 시료들을 처리하는 복수의 공간적으로 분리된 반응 영역을 포함하는 시료 홀더를 수용하도록 구성된 베이스; 제1 파장을 특징으로 하는 제1 여기 빔 및 제1 파장과 다른 제2 파장을 특징으로 하는 제2 여기 빔을 생성하도록 구성된 여기 소스; 여기 소스에 반응하여 생물학적 시료들로부터의 발광을 수신하도록 구성된 광 센서; 여기 소스 및 시료 홀더 사이의 여기 광 경로를 따라 배치된 여기 광학계; 시료 홀더 및 광 센서 사이의 발광 경로를 따라 배치된 발광 광학계, 발광 광학계는 생물학적 시료들로부터의 발광이 광 센서로 향하도록 구성됨; 에너지 또는 파워 감지부를 포함하고, 에너지 또는 파워 감지부는: 광 경로 외부에 위치한 에너지 또는 파워 센서; 및 빔 스플리터에 인접하여 배치되며, 빔 스플리터로부터의 복사를 파워 센서로 전달하도록 구성된 광 파이프를 포함하도록 제공된다.
다른 실시예 6에서, 생물학적 분석 장비는: 하나 이상의 생물학적 시료들을 처리하는 복수의 공간적으로 분리된 반응 영역을 포함하는 시료 홀더를 수용하도록 구성된 베이스; 제1 파장을 특징으로 하는 제1 여기 빔 및 제1 파장과 다른 제2파장을 특징으로 하는 제2 여기 빔을 생성하도록 구성된 여기 소스; 여기 소스에 반응하여 생물학적 시료들로부터의 발광을 수신하도록 구성된 광 센서; 여기 소스 및 시료 홀더 사이의 여기 광 경로를 따라 배치된 여기 광학계; 시료 홀더 및 광 센서 사이의 발광 경로를 따라 배치된 발광 광학계, 발광 광학계는 생물학적 시료들로부터의 발광이 광 센서로 향하도록 구성됨; 복사를 방출하는 위치 소스 및 위치 소스로부터의 복사를 수신하도록 구성된 대응 위치 센서, 위치 소스 및 위치 센서는 광 경로들 중 적어도 하나를 따라 배치된 광 소자의 위치를 나타내는 위치 신호를 생성하도록 구성됨; 위치 소스로부터의 적어도 일부 복사를 차단하도록 구성된 복사 차폐물을 포함하도록 제공된다.
다른 실시예 7에서, 생물학적 분석 장비는: 하나 이상의 생물학적 시료들을 처리하는 복수의 공간적으로 분리된 반응 영역을 포함하는 시료 홀더를 수용하도록 구성된 베이스; 제1 파장을 특징으로 하는 제1 여기 빔 및 제1 파장과 다른 제2파장을 특징으로 하는 제2 여기 빔을 생성하도록 구성된 여기 소스; 여기 소스에 반응하여 생물학적 시료들로부터의 발광을 수신하도록 구성된 광 센서; 여기 소스 및 시료 홀더 사이의 여기 광 경로를 따라 배치된 여기 광학계; 시료 홀더 및 광 센서 사이의 발광 경로를 따라 배치된 발광 광학계, 발광 광학계는 생물학적 시료들로부터의 발광이 광 센서로 향하도록 구성됨; 여기 광 경로 및 발광 경로 모두를 따라 배치되고, 제1 여기 빔 및 제2 여기 빔을 수신하도록 배치된 빔 스플리터. 광 경로들을 감싸는 광 외함, 광 외함은 외함 외부 위치에서 외함 내부 위치까지 와이어 또는 케이블을 통과하도록 구성되어 외함 외부의 차단 광이 외함으로 들어가는 것을 차단하는, 스플릿 와이어 그로밋을 포함; 외함 외부의 차단 광이 외함으로 들어가는 것을 차단하면서 센서 렌즈의 3차원 조정을 허용하도록 구성된 렌즈 홀 덮개를 포함하도록 제공된다.
다른 실시예 8에서, 생물학적 분석 장비는: 하나 이상의 생물학적 시료들을 처리하는 복수의 공간적으로 분리된 반응 영역을 포함하는 시료 홀더를 수용하도록 구성된 베이스; 제1 파장을 특징으로 하는 제1 여기 빔 및 제1 파장과 다른 제2파장을 특징으로 하는 제2 여기 빔을 생성하도록 구성된 여기 소스; 여기 소스에 반응하여 생물학적 시료들로부터의 발광을 수신하도록 구성된 광 센서; 여기 소스 및 시료 홀더 사이의 여기 광 경로를 따라 배치된 여기 광학계; 시료 홀더 및 광 센서 사이의 발광 경로를 따라 배치된 발광 광학계, 발광 광학계는 생물학적 시료들로부터의 발광이 광 센서로 향하도록 구성됨; 여기 광 경로 및 발광 경로 모두를 따라 배치되고, 제1 여기 빔 및 제2 여기 빔을 수신하도록 배치된 빔 스플리터를 포함하도록 제공되되, 여기서 광 센서는 상보형 금속산화 반도체 센서이다.
다른 실시예 9에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 장비는 발광 경로를 따라 배치된 하나 이상의 발광 필터를 추가로 포함한다.
다른 실시예 10에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 발광의 적어도 일부는 적어도 하나의 여기 빔에 반응하여 생물학적 시료들 중 적어도 일부로부터의 형광 방출을 포함한다.
다른 실시예 11에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 발광의 적어도 일부는 적어도 하나의 여기 빔에 반응하여 생물학적 시료들 중 적어도 일부로부터의 형광 방출을 포함한다.
다른 실시예 12에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 발광의 적어도 일부는 적어도 일부 생물학적 시료들에 의해 반사, 굴절, 회절, 산란, 또는 분극된 여기 빔들 중 적어도 하나로부터의 복사를 포함한다.
다른 실시예 13에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130]의 실시예들 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 베이스와 빔 스플리터 사이의 여기 광 경로를 따라 배치된 온도 제어 덮개를 추가로 포함한다.
다른 실시예 14에서, 실시예 [00135]의 장비가 구비되고, 여기서 베이스와 빔 스플리터 사이의 여기 광 경로를 따라 배치된 거울을 추가로 포함한다.
다른 실시예 15에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 베이스와 빔 스플리터 사이의 여기 광 경로를 따라 배치된 거울을 추가로 포함한다.
다른 실시예 16에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 베이스는 시료 홀더 또는 생물학적 시료의 온도를 제어하도록 구성된 시료 블록 어셈블리를 포함한다.
다른 실시예 17에서, 실시예 [00138]의 장비가 구비되고, 여기서 시료 블록 어셈블리는 시료 블록, 펠티에(Peltier) 장치 또는 방열판 중 하나 이상을 포함한다.
다른 실시예 18에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 베이스는 PCR 검정을 수행하도록 구성된 열 사이클러를 포함한다.
다른 실시예 19에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 장비는 시료 홀더를 포함한다.
다른 실시예 20에서, 실시예 [00141]의 장비가 구비되고, 여기서 시료 홀더는 마이크로역가 플레이트, 복수의 웰 또는 쓰루홀을 포함하는 기판, 하나 이상의 채널을 포함하는 기판, 또는 하나 이상의 생물학적 시료들을 포함하는 복수의 비즈 또는 구를 포함하는 챔버 중 하나 이상을 포함한다.
다른 실시예 21에서, 실시예 [00141]의 장비가 구비되고, 여기서 복수의 공간적으로 분리된 반응 영역은 복수의 웰, 기판 내 복수의 쓰루홀, 기판 상의 또는 채널 내 복수의 분명한 위치, 또는 반응 공간 내 복수의 비즈 또는 구 중 하나 이상을 포함한다.
다른 실시예 22에서, 실시예 [00141]의 장비가 구비되고, 여기서 적어도 일부 공간적으로 분리된 반응 영역들은 하나 이상의 생물학적 시료들을 포함한다.
다른 실시예 23에서, 실시예 [00144]의 장비가 구비되고, 여기서 하나 이상의 생물학적 시료들은 적어도 하나의 타겟 핵산 서열, 적어도 하나의 프라이머, 적어도 하나의 버퍼, 적어도 하나의 뉴클레오티드, 적어도 하나의 효소, 적어도 하나의 세제, 적어도 하나의 차단 에이전트, 또는 타겟 또는 참조 핵산 서열 감지에 적합한 적어도 하나의 염료, 마커, 및/또는 프로브 중 하나 이상을 포함한다.
다른 실시예 24에서, 실시예 [00141]의 장비가 구비되고, 여기서 시료 홀더는 마이크로역가 플레이트를 포함하고, 반응 영역들은 적어도 96개 웰, 적어도 384개 웰, 또는 적어도 1536개 웰을 포함한다.
다른 실시예 25에서, 실시예 [00141]의 장비가 구비되고, 여기서 시료 홀더는 제1 표면, 대면하는 제2 표면, 및 표면들에 배치된 복수의 쓰루홀을 포함하도록 구성되고, 복수의 쓰루홀은 하나 이상의 생물학적 시료들을 포함한다.
실시예 26에서, 실시예 [00147]의 장비가 구비되고, 기판은 적어도 3096개 쓰루홀들 또는 적어도 20,000개 쓰루홀을 포함한다.
다른 실시예 27에서, 실시예 [00141]의 장비가 구비되고, 여기서 시료 홀더는 하나 이상의 타겟 분자 또는 분자 시퀀스를 통과시키도록 구성된 모세관 어레이를 포함한다.
다른 실시예 28에서, 실시예 [00141]의 장비가 구비되고, 여기서 시료 홀더는 중합체연쇄반응, 서열 검정, 또는 모세관 전기영동 검정, 블롯 검정 중 적어도 하나를 수행하도록 구성된다.
다른 실시예 29에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 여기 광학계는 여기 빔을 베이스로 향하도록 구성된 시료 렌즈를 포함한다.
다른 실시예 30에서, 실시예 1 또는 실시예 [00151] 중 어느 하나의 장비를 구비하고, 여기서 시료 렌즈는 사용 중에 복수의 공간적으로 분리된 영역으로 확장된 필드 렌즈를 포함한다.
다른 실시예 31에서, 실시예 1 또는 실시예 [00151] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 시료 렌즈는 사용 중에 복수의 공간적으로 분리된 영역으로 확장된 필드 렌즈, 또는 사용 중에 복수의 반응 영역에 각각 배치된 복수의 렌즈 중 적어도 하나를 포함한다.
다른 실시예 32에서, 실시예 1 또는 실시예 [00151] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 시료 렌즈는 복합 렌즈, 만곡 거울, 회절 광 소자, 또는 홀로그래픽 광 소자 중 적어도 하나를 포함한다.
다른 실시예 33에서, 실시예 1의 장비가 구비되고, 여기서 사용 중 시료 렌즈는 적어도 하나의 시료 홀더, 공간적으로 분리된 반응 영역들, 또는 광 센서 중 적어도 하나에 대한 텔리센트릭 광학계를 제공한다.
다른 실시예 34에서, 실시예 [00151]의 장비가 구비되고, 사용 중에 시료 렌즈는 적어도 하나의 시료 홀더, 공간적으로 분리된 반응 영역들, 또는 광 센서 중 적어도 하나에 대한 텔리센트릭 광학계를 제공한다.
다른 실시예 35에서, 실시예 1 또는 실시예 [00151] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 시료 렌즈는 프레스넬(Fresnel) 렌즈를 포함한다.
다른 실시예 36에서, 실시예 1 또는 실시예 [00151] 중 어느 하나의 장비를 구비하고, 여기서 시료 렌즈는 복수의 반응 공간에 대응하는 복수의 렌즈를 포함한다.
다른 실시예 37에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비를 구비하고, 여기서 빔 스플리터는 사용 중에 여기 빔들을 전송하거나 사용 중에 여기 빔들을 반사한다.
다른 실시예 38에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 빔 스플리터는 적어도 100 나노미터의 파장 대역에서 일정한 반사를 하는 특징을 갖는 광대역 빔 스플리터를 포함한다.
다른 실시예 39에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 빔 스플리터는 450 나노미터 내지 680 나노미터의 파장 대역에서 일정하게 반사하는 특징을 갖는다.
다른 실시예 40에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 빔 스플리터는 전자기 스펙트럼의 가시광 파장 대역에서 일정하게 반사하는 특징을 갖는다.
다른 실시예 41에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 빔 스플리터는 광도축소필터를 포함한다.
다른 실시예 42에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 빔 스플리터는 50/50 빔 스플리터를 포함한다.
다른 실시예 43에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 빔 스플리터는 다이크로익 빔 스플리터를 포함한다.
다른 실시예 44에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 빔 스플리터는 다중 파장 대역 빔 스플리터를 포함한다.
다른 실시예 45에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 제1 여기 빔 및 제2 여기 빔은 시간적으로 및/또는 공간적으로 분리된다.
다른 실시예 46에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 제1 여기 빔 및 제2 여기 빔은 동시에 생성된다.
다른 실시예 47에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 여기 광 소스는 적어도 하나의 백열등, 적어도 하나의 가스 방전등, 적어도 하나의 발광 다이오드, 적어도 하나의 유기 발광 다이오드, 적어도 하나의 레이저 중 하나 이상을 포함한다.
다른 실시예 48에서, 실시예 [00169]의 장비가 구비되고, 여기서 적어도 하나의 가스 방전등은 할로겐등, 크세논등, 아르곤등 또는 크립톤등 중 하나 이상을 포함한다.
다른 실시예 49에서, 실시예 [00169]의 장비가 구비되고, 여기서 적어도 하나의 레이저는 다이오드 레이저, 아르곤 레이저, 크세논 레이저, 엑시머 레이저, 솔리드 스테이트 레이저, 헬륨-네온 레이저, 또는 염료 레이저 중 하나 이상을 포함한다.
다른 실시예 50에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 제1 여기 빔은 제1 여기 빔의 강도, 파워 또는 에너지가 제1 소정 값보다 큰 제1파장 범위를 포함하고, 제2 여기 빔은 제2 여기 빔의 강도, 파워 또는 에너지가 제2 소정 값보다 큰 제2 파장 범위를 포함하며, 제1 파장은 (1) 제1 파장 범위의 중심 파장 또는 (2) 제1 파장 범위에서 최대 전자기 강도, 파워 또는 에너지의 파장 중 적어도 하나이고, 제2 파장은 (1) 제2 파장 범위의 중심 파장 또는 (2) 제2 파장 범위에서 최대 전자기 강도, 파워 또는 에너지의 파장 중 적어도 하나이다.
다른 실시예 51에서, 실시예 [00172]의 장비가 구비되고, 여기서 중심 파장들 중 적어도 하나는 해당 파장 범위에 대한 평균 파장이다.
다른 실시예 52에서, 실시예 [00172]의 장비가 구비되고, 여기서 소정 값들 중 적어도 하나는 해당 파장 범위에 대한 해당 최대 강도, 파워, 또는 에너지의 20% 미만이다.
다른 실시예 53에서, 실시예 [00172]의 장비가 구비되고, 여기서 제2 소정값은 제1 소정값과 같다.
다른 실시예 54에서, 실시예 [00172]의 장비가 구비되고, 여기서 제1 파장 범위는 제2 파장 범위와 겹치지 않거나, 제2 파장 범위는 제2 파장 범위와 부분적으로만 겹친다.
다른 실시예 55에서, 실시예 [00172]의 장비가 구비되고, 여기서 제2 파장은 제1 파장과 적어도 20 나노미터 차이가 있다.
다른 실시예 56에서, 실시예 [00172]의 장비가 구비되고, 여기서 제1 및 제1 파장 범위 중 적어도 하나는 적어도 20 나노미터의 값을 갖는다.
다른 실시예 57에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 제 2 파장은 제1 파장과 적어도 20 나노미터 차이가 있다.
다른 실시예 58에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 여기 소스는 광 소스를 포함하고, 제1 및 제2 파장은 전자기 스펙트럼의 가시광 대역 내에 있다.
다른 실시예 59에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 여기광은 적어도 100 나노미터의 대역폭을 갖는 광 소스를 포함한다.
다른 실시예 60에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 여기 소스는 여기 광 경로 안팎으로 이동가능한 복수의 여기 필터를 포함한다.
다른 실시예 61에서, 실시예 [00182]의 장비가 구비되고, 여기서 여기 필터 중 적어도 하나는 적어도 ±10 나노미터의 파장 대역을 갖는다.
다른 실시예 62에서 실시예 [00182]의 장비가 구비되고, 여기서 여기 필터는 적어도 5개의 여기 필터들을 포함한다.
다른 실시예 63에서, 실시예 [00182]의 장비가 구비되고, 여기서 여기 필터들은 SYBR® 염료 또는 프로브, FAMTM 염료 또는 프로브, VIC® 염료 또는 프로브, ROXTM 염료 또는 프로브, 또는 TAMRATM 염료 또는 프로브 중 하나 이상의 형광을 내는데 적합한 복수의 대역통과를 함께 제공하는 복수의 필터를 포함한다.
다른 실시예 64에서, 실시예 [00182]의 장비가 구비되고, 여기서 여기 필터들은 회전형 필터 휠에 장착되어 필터 각각을 여기 빔 경로 안팎으로 이동시킨다.
다른 실시예 65에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 여기 소스는 복수의 개별 여기 소스를 포함한다.
다른 실시예 66에서, 실시예 [00187]의 장비가 구비되고, 여기서 복수의 개별 여기 소스는 개별 여기 소스들의 2차원 어레이를 형성한다.
다른 실시예 67에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 광 센서는 어레이 센서를 포함한다.
다른 실시예 68에서, 실시예 [00189]의 장비가 구비되고, 여기서 어레이 센서는 상보형 금속 산화물 반도체 센서 또는 전하결합소자 센서 중 적어도 하나를 포함한다.
다른 실시예 69에서, 실시예 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 광 센서는 적어도 두 개의 어레이 센서를 포함한다.
다른 실시예 70에서, 실시예들 [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 적어도 일부 생물학적 시료로부터의 발광을 광 센서로 향하도록 구성된 센서 렌즈를 추가로 포함한다.
다른 실시예 71에서, 실시예들, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129], 또는 [00130] 중 어느 하나의 장비가 구비되고, 여기서 광 센서는 상보형 금속 산화물 반도체이다.
다른 실시예 72에서, 실시예 [00127]의 장비가 구비되며, 여기서 차단 구조물은 반사된 복사가 장비의 다른 표면에서도 반사하지 않는 센서 렌즈에 영향을 주지 않도록 사용 중에 센서 개구와 함께 동작하도록 배치된다.
보정 작업 흐름
생물학적 분석 기구의 보정에 있어서의 발전은, 유리하게도, 적절하고 효율적인 설치를 위해, 조작자 오류의 감소, 조작자 입력의 감소, 및 생물학적 분석 기구와 분석 기구의 다양한 부품을 보정하는 데 필요한 시간의 감소를 가능하게 한다.
이와 같이, 본 교시 내용의 다양한 실시예에 따르면, 전문가 지식은, 실패가 확인되면, 통과/실패 상태 및 고장수리 피드백을 제공하는 자동화된 보정 및 타당성 검사(validation) 시스템에 통합될 수 있다. 장비가 보정 프로세스를 통과하지 못하면, 서비스 엔지니어를 부를 수 있다. 본 교시 내용은 설치 및 보정 절차에 필요한 비용 및 시간을 최소화할 수 있다.
전체 보정 작업흐름
생물학적 장비는 보통 정확하고 신뢰할만한 실험용 데이터를 생성할 필요가 있다. 생물학적 장비에 대한 규칙적인 보정과 유지보수는 적절하고 최적의 장비의 동작을 보장하고, 이로써 잠재적인 문제가 드러나기 전에 해결함으로써 사용자 생산성을 최대화하고 비용이 드는 수리를 최소화하며, 결과물의 질을 높힐 수 있다.
본 교시 내용의 다양한 실시예에 따라, 본 명세서에 설명된 보정 방법은 별도로 또는 함께 결합하여 수행될 수 있다. 또한 본원에서 설명된 보정 방법은 제조 후 초기 보정을 위해 또는 초기 설치 및 사용 후 어느 때라도 수행될 수 있다. 본원에서 설명된 보정 방법은 예를 들어, 매주, 매월, 반년마다, 년간, 또는 필요할 때마다 수행될 수 있다.
본 교시 내용에서 설명된 다양한 실시예에 따라, 관심영역(ROI) 보정, 배경 보정, 균일성 보정, 순수 염료 보정, 장비 정규화 등의 보정은 각 판독(reading)에서 형광 신호의 위치 및 강도, 각 형광 신호와 관련된 염료 및 신호 중요도 결정에 사용될 수 있다. 또한, 다양한 실시예에 따라, 자동 염료 수정, 자동 배경 보정, 및 플레이트 감지가 수행되어 감지 및 염료 판독을 더 개선하고, 오차를 판단할 수 있다. 장비의 적절한 성능 검증 또한 알앤에이즈피 검증(RNase P validation)을 사용한 시스템에 의해 자동으로 수행될 수 있다.
도 21은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따라 장비에 대해 수행될 수 있는 예시적인 보정 작업흐름(2100)을 도시한다. 보정 작업흐름(2100)은 예시이며 본원에서 설명된 보정 방법이 별도로 또는 서브세트로서 임의의 결합 및 순서로 수행될 수 있음을 인식해야 한다. 2102 단계에서, ROI 보정이 수행된다. 일반적으로 ROI 보정은 감지자의 시야에서 웰들의 위치를 규정하는 정보를 생성할 것이다. 본 교시 내용은 사용자 상호작용의 최소화 또는 제거를 통해 ROI 보정을 자동화할 수 있다. 다양한 실시예는 히스토그램 분석 및 이진 탐색 패턴을 사용하여 필터당 최적의 노출 시간을 결정하는 방법 및 시스템을 제공함으로써 프로세스를 자동화할 수 있다. 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따라 ROI 보정은 이전 방법보다 더 정확하게 더 적은 오차로 영상에서 웰들을 식별한다. 다양한 실시예에 따라, ROI 보정 방법 및 시스템은 하기에서 추가로 설명된다.
2104 단계에서, 배경 보정이 수행된다. 보통, 검출기는 감지가능한 신호를 방출하는 시료가 없어도 일정한 양의 신호를 판독할 것이다. 시료 신호의 더 정확한 측정을 얻기 위해 판독한 시료 신호에서 배경신호가 감산될 수 있으므로, 이 배경신호를 감안하는 것이 중요할 수 있다. 배경 보정은 물(water) 플레이트를 사용하여 수행됨으로써 모든 필터/웰 결합에 대한 장비 배경신호를 결정할 수 있다. 이 단계는 사용자 상호작용을 최소화 또는 제거하도록 자동화될 수 있다. 정확한 플레이트가 배경 보정에 사용되었는지에 대한 검사를 할 자동화가 제공될 수 있다. 예를 들어, 2104단계는 신호 레벨을 통해, ROI 보정에 사용된 테스트 플레이트를 제거하는 강한 신호와 같은 부정확한 검사 플레이트를 사용할 가능성을 제거할 수 있다. 신호 레벨이 배경의 예상 레벨을 훨씬 초과한다면, 사용자는 적절한 검사 플레이트를 삽입하도록 경고될 수 있다. 또한 이 단계는 신호 레벨이 넓게 퍼졌는지를 확인하여 검사 플레이트 내 하나 이상의 웰들의 결합을 검사할 수 있고, 발견되었다면, 더럽거나 오염된 웰들의 존재 가능성을 나타내는 경고를 발생할 수 있다. 오염된 웰들은 시료 신호레벨에서 감산된 부적절한 배경 신호를 초래할 수 있다.
2106 단계에서, 균일성 보정이 수행된다. 일부 경우에서, 플레이트 형상(뒤틀림, 두께)의 변화는 각 웰에 동일한 양의 형광 염료가 있더라도 강도 판독이 전체 플레이트에서 달라지게 할 수 있다. 균일성 보정은 플레이트 변동에 의한 강도 변화가 수정될 수 있도록 다중 염료 플레이트를 사용하는 장비를 보정할 수 있다. 2106 단계는 자동화되어서 사용자 상호작용을 줄이거나 감소시킬 수 있다. 이 자동화 부분은 잘못된 보정 플레이트 사용을 감지 및 보정 플레이트 내 비어있거나 오염된 웰들을 감지 및 조정하는 것을 포함할 수 있다.
2108 단계에서, 순수 염료 보정이 수행된다. qPCR 장비에 사용된 형광 염료를 보정함으로써 장비 소프트웨어가 염료 표준 물질로부터 수집된 보정 데이터를 사용하도록 하여 장비에 의해 수집된 전체 형광에 대한 각 염료의 개별 기여도를 특징짓고 구별한다. 본 교시 내용의 다양한 실시예에 따라, 시료 채취 후, 장비 소프트웨어는 각 판독에 대한 원시 스펙트럼 신호 형태로 데이터를 수신한다. 소프트웨어는 순수 스펙트럼 보정 데이터와 각 염료가 기여한 원시 스펙트럼을 비교하여 각 반응자리에 사용된 각 형광염료의 기여도를 결정한다. 사용자가 분석 후에 실험을 저장하는 경우에, 기구 소프트웨어는 웰당 각각의 형광 염료의 기여도뿐 아니라 그 실험에 대한 수집된 형광 데이터와 함께 순수 스펙트럼을 저장한다. 방법은 하기에서 더 설명된다. 본 교시 내용의 다양한 실시예에 따라 순수 염료 보정을 사용하면, 더 적은 순수 보정 플레이드들이 사용될 수 있어 사용자 비용을 줄이고, 보정시 에러 소스를 제거한다.
2110 단계에서, 장비 정규화 보정이 수행된다. 흔히 접하는 한 가지 어려움은 다수의 장비에서 실행된 실험의 결과를 연구자들이 용이하게 비교할 수 없다는 것이다. 예를 들어, 광 소스들, 광 소자들 및 형광 검출기들과 같은 부품 파라미터들의 물리적인 변동은, 동일한 생물학적 시료들일 수 있는 것에 대한 분석결과에 변동을 가져올 수 있다. 따라서 부품들의 변동을 감소시키는데 도움을 주는 방법 및 장치들에 대한 요구가 계속 있어왔다.
qPCR에서, 증폭 곡선은 보통 동일한 용액에서 리포터(reporter) 염료의 신호를 수동적인 기준 염료에 대해 정규화하여 결정된다. 이러한 정규화는 "Rn "표시되는 정규화된 형광 값으로서 보고될 수 있다. 전체 신호 레벨이 액체 부피, 또는 전체 조도에 영향을 받을지라도, 수동 기준 정규화는 일관된 Rn 값을 가능하게 한다. 그러나, 리포터 염료와 기준 염료 간의 신호의 비가 변할 경우(예컨대, 조명 스펙트럼에서 장비별 차이), 수동 기준 정규화가 제대로 작용하지 않을 수 있다. 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따르면, 장비 정규화 보정은 Rn 값 조정을 위한 "정규화 인자"를 얻기 위해 염료 혼합물로부터의 형광 판독을 포함하고, 이는 추가 비용이 필요하다.
2112 단계에서, 알엔에이즈 P 검증(RNase P validation)이 수행된다. 검증 검사 수행은 장비가 적절하게 기능하는지를 확인한다. 예를 들어, 알앤에이즈피 검증은 장비가 시료의 다른 두 양을 정확하게 구별하는지를 판단한다. 이전에 알앤에이즈피 검증은 사용자가 장비를 검증하기 위해 통계 계산을 하고 표준 곡선을 사용해 수작업으로 수행됐다. 본 교시 내용에 설명된 다양한 실시예에 따르면, 알앤에이즈피 검증은 표준 곡선을 사용하지 않고 시스템에 의해 자동으로 수행될 수 있다. 알앤에이즈피 검증의 다양한 실시예가 하기에서 더 설명된다.
도 37은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 장비 보정을 위한 시스템(4100)을 도시한다. 시스템(4100)은 ROI 보정기(4102), 순수 염료 보정기(4104), 장비 정규화 보정기(4108), 알앤에이즈피 검증기(4110) 및 디스플레이 엔진/GUI(4106)를 포함한다. ROI 보정기(4102)는 영상에서 반응자리 위치를 결정하도록 구성된다. 순수 염료 보정기(4104)는 형광 염료의 원시 스펙트럼과 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터를 비교하여 각 반응자리에 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하도록 구성된다. 장비 정규화 보정기(4108)는 필터 정규화 인자를 결정하도록 구성된다. 알앤에이즈피 검증기(4110)는 장비가 시료의 다른 두 양을구별할 수 있음을 검증하도록 구성된다. 디스플레이 엔진(4106)은 보정 결과를 디스플레이하도록 구성된다.
본 교시 내용은 실시간 폴리머라아제연쇄반응(RT-PCR) 장비를 참조하여 설명된다. 특히, 본 교시 내용의 실시예는 웰 플레이트의 광 촬영을 채용한 RT-PCR 장비에 구현된다. 그러한 장비는 분석 목적을 위한 복수의 시료 또는 스팟으로부터 신호를 동시에 측정할 수 있고, 보통 보정이 필요하며, 다음의 프로세스들을 포함하지만 그에 한정되지 않는다: ROI(관심영역) 식별, 배경신호 결정, 다중 부품 분석을 위한 균일성 및 순수 염료 스펙트럼 보정. 보정은 또한 예상 결과를 갖는 알려진 시료 플레이트를 사용한 RT-PCR 검증 반응을 포함할 수 있다. 본 교시 내용이 RT-PCR 장비와 관한 예와 함께 설명되었고, 그 원리가 결과의 정확성 및/또는 최적성을 보증하기 위해 보정과 검증이 필요할 수 있는 다른 형태의 실험실 장비에 폭넓게 적용가능함을 당업자는 알 것이다.
관심영역( ROI ) 보정
상술한 바와 같이, 본 교시 내용은 실시간 폴리머라아제연쇄반응(RT-PCR) 장비를 참조하여 설명된다. 특히, 본 교시 내용의 실시예는 웰 플레이트의 광 촬영을 채용한 RT-PCR 장비로 구현된다. 그러한 장비는 분석 목적을 위한 복수의 시료 또는 스팟으로부터 신호를 동시에 측정할 수 있고, 보통 보정이 필요하다. 보정이 필요할 수 있는 프로세스의 예는 ROI 또는 관심 영역의 식별이다.
일반적으로 ROI 보정은 모든 필터에 대응하는 각 셀에서 강한 발광을 하는 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 이는 ROI가 각 필터에 대해 동일하지 않을 수 있기 때문에 유용할 수 있다. 필터들간의 ROI의 차이는 필터들에 약간의 각도 차이 및 다른 필터 스펙트럼 특성에 연유할 수 있다. 따라서 다양한 실시예는 필터당/웰당(PFPR)-ROI 보정을 수행할 수 있다. 이 PFPR-ROI 보정은 각 필터별로 96-웰 플레이트 내 웰들의 위치 결정에 유용하다. ROI 보정은 미국 특허번호 6,518,068 Bl에 기술된 적응적인 마스크 제작 발명과 같은 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
본 교시 내용은 사용자 상호작용의 최소화 또는 제거를 통해 ROI 보정을 자동화할 수 있다. 다양한 실시예는 히스토그램 분석 및 이진 탐색 패턴을 사용하여 필터당 최적의 노출 시간을 결정하는 소프트웨어를 제공함으로써 프로세스를 자동화할 수 있다. 노출 시간은 플레이트 영상을 캡쳐하는데 필요한 시간이다. 다시 이 값은 필터의 스펙트럼 특성에 따라 변동될 수 있다. 일반적으로 ROI 보정은 감지자의 시야에서 웰들의 위치를 규정하는 정보를 생성할 것이다. 이 정보는 다른 필터에 상응하는 글로벌 마스크 또는 다수의 마스크들을 갖는 마스크 파일로 2304에 저장될 수 있다. 상술한 바와 같은 보정 프로세스는 보통 열행 투사(row and column projection) 및 강도 프로파일을 사용한다. 이는 웰 내부의 인공물 및 포화, 웰들, 그리드 회전, 배율 인자 변동 및 광 방사 왜곡에 민감한 ROI 결정을 초래할 수 있다. 따라서 그러한 민감성을 최소화하고 감지된 발광 데이터에서 왜곡과 다른 원치 않는 배경잡음을 제거하기 위해 ROI에 대해 더 강건하게 결정하는 것이 유리할 수 있다.
배경잡음은 다른 원치 않는 신호뿐만 아니라 고유의 시스템 잡음을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 데이터의 일부 배경잡음은, 예를 들어, 먼지입자 또는 긁힘과 같은 기판상의 물리적인 소스에 의한 것일 수 있다. 배경잡음의 다른 물리적인 소스의 예는 시료를 갖고 있거나 감싸는 홀더 또는 케이스이다. 데이터의 다른 배경잡음은 반사 또는 자연 형광과 같은 장비 내 표면으로부터의 자연 복사에 의한 것일 수 있다. 다른 배경잡음은 또한, 예를 들어, 발광 데이터 또는 광 소스를 감지하는 광학계로부터 초래된 것일 수 있다.
생물학적 장비는 수백 내지 수천 개 시료들을 감지할 수 있고, 이 모든 시료들은 1나노리터 미만과 같은 매우 작은 부피를 가질 수 있다. 이처럼, 다른 배경잡음 제거 방법이 단독으로 또는 이 문서에서 설명된 보정 방법과 결합하여 다양한 실시예에 따라 사용되어 시료 공간으로부터의 발광 데이터를 판단 및 분석할 수 있다. 일부 실시예에서, 시료 공간의 위치는 기판 내에서 더 정확하게 결정되기 때문에 더 정확한 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, 디지털 PCR 분석에서 시료 공간 내 반응과 무반응을 더 정확하게 구별할 수 있어 더 정확한 결과를 만들 수 있다. 또한 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따라, 비어있는 웰 또는 쓰루홀은 반응하지 않았던 웰 또는 쓰루홀 내 시료 공간과 구별될 수 있고, 또한 반응했던 웰 또는 쓰루홀 내 시료 공간과 구별될 수 있다.
본원에서 설명된 다양한 실시예에 따르면, 배경잡음 제거는 영상 데이터 분석 및 처리를 포함할 수 있다. 이 방법은 영상 데이터의 강도값을 분석하여 기판 영상에서 제거될 수 있는 배경잡음을 보간하는 것을 포함할 수 있다. 이와 같이, 영상 내 관심영역의 위치도 결정될 수 있다. 배경잡음 제거는 또한 관심영역을 포함하는 것으로 알려진 영상 영역들로부터 데이터를 보간하는 것을 포함할 수 있다. 영상에 대한 배경잡음을 결정한 후, 배경잡음은 영상 데이터에서 감산될 수 있다.
도 22는 본 발명의 일실시예에 따른 예시적인 인실리코(in silico) 방법(2600)을 도시한다. 인실리코 방법(2600)은 생명공학(biotechnology) 프로세스를 위한 서브루틴들을 포함할 수 있는, 컴퓨터로 독출가능한 포맷으로 된 복수의 세트 작업흐름 서브루틴을 포함한다. 도 22는 단지 예시적인 방법이며, 당업자는, 본 개시 내용에 비추어, 실제 서브루틴 수는 적어도 대략 2개의 서브루틴에서 많은 수(예를 들어, 2 내지 10. 2 내지 20, 2 내지 30, 2 내지 n (n은 3 내지 100, 3 내지 1000 등))로 변할 수 있음을 인식할 것이다. 각 세트 서브루틴(310 내지 370)은 컴퓨터로 독출가능한 포맷으로 하나의 단계 또는 작업을 포함할 수 있고, 선택적으로 하나의 단계 또는 작업보다 많이 포함할 수 있으며, 각 단계는 추가적으로 선택형 맞춤형 단계들 또는 작업들을 추가로 포함할 수 있다. 각각의 선택적/사용자 정의 단계 또는 작업은 사용자가 검사, 검토, 설정 또는 사용자 정의할 수 있는 하나 이상의 선택적 파라미터(옵션)를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 인실리코 방법은 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 이용하여 각각의 선택적/사용자 정의 단계에 대한 적어도 하나의 파라미터를 선택하는 생명공학 프로세스의 각각의 선택적/사용자 정의 단계에 대해 사용자가 적어도 하나의 파라미터 각각을 선택하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 작업흐름의 각 서브루틴 단계와 파라미터는 사용자가 보고, 선택적으로 편집할 수 있게 한다. 생물정보학 프로그램은 보통 이 파라미터들 및/또는 단계들 일부를 사용자로부터 숨기고, 이로써 특히 인실리코로 설계된 실험 결과가 사용자의 예상 결과가 아닐 때 사용자는 좌절하고 무능함을 느끼게 한다.
도 22에 도시된 본 개시 내용의 예시적인 인실리코 방법은 (도 2에 도시된 것과 같은) 컴퓨터 시스템에서 적어도 하나의 방법 파일을 생성하여 실행(수행)될 수 있고, 그 방법 파일은: 맞춤형 단계들(A, B, C)의 복수의 서브루틴(10, 20, 30..)에 대한 컴퓨터로 독출가능한 명령어들을 포함하고, 각 단계는 보여지고, 선택되고, 바뀌고, 또는 입력될 수 있는 하나 이상의 파라미터들을 가질 수 있는 단계; 및 컴퓨터 시스템에 의해 컴퓨터 독출 가능가능한 명령어들을 포함하는 적어도 하나의 방법 파일을 실행하여 적어도 하나의 생명공학 제품을 얻는 단계를 포함하는 인실리코 생명공학 프로세스를 수행하는 단계를 포함한다.
일부 실시예들에서, 적어도 하나의 맞춤형/선택형 파라미터는 디폴트 파라미터로부터 선택되고, 디폴트 파라미터는 (저장, 데이터베이스 등과 같은) 컴퓨터 시스템 부품에 저장된다.
도 22를 참조하면, ROI 위치 계산에서 제1 단계는 2610 단계의 형광 임계치로부터 초기 ROI 중심을 추정하는 것이다. 복수의 생물학적 시료를 포함하도록 구성된 시료 플레이트가 구비되어 PCR 프로세스를 통해 생물학적 시료를 분석할 수 있는 분석 장비로 삽입된다. 각 생물학적 시료는 시료 웰에 담겨, 광 소스에 의해 여기될 수 있으며, 그 여기에 반응하여 형광 검출기에 의해 감지될 수 있는 소정 파장의 형광을 낼 수 있다. 도 7에 대해 위에서 제시된 것처럼, 광 소스(1402)는 레이저, LED, 또는 컴퓨터 시스템(200)에 의해 감지될 스펙트럼 종(species)과 상호작용하는 스펙트럼을 방출할 수 있는 다른 유형의 여기 소스일 수 있다. 추가적으로, 생물학적 시료는 FAM, SYBR Green, VIC, JOE, TAMRA, NED, CY-3, Texas Red, CY-5, ROX (수동적인 기준) 또는 감지될 수 있는 신호를 방출하는 임의의 다른 형광 색소와 같은 스펙트럼으로 구별가능한 염료 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
생물학적 시료를 여기시키기 전에, ROI 결정을 위한 시작점 제공을 위해 입력 파라미터 및 알고리즘 파라미터가 설정된다. 입력 파라미터는 웰 크기, 웰 중심간 거리, 밀리미터당 광학 픽셀들 및 플레이트 레이아웃을 포함할 수 있다. 플레이트 레이아웃은 웰들의 전체 수와 시료 웰들의 구성을 포함할 수 있다. 자주 사용되는 구성은 복수의 행과 복수의 열을 포함하는 사각 어레이일 수 있다. 그러나 당업자는 그 구성이 사용되고 있는 장비에 적합한 임의의 형상일 수 있음을 이해할 것이다. 또한 웰들의 전체 수는 변할 수 있다. 당업자는 단일 시료 플레이트 또는 시료 포함 구조에서 하나의 웰부터 수천 개의 웰들까지 총괄하는 구성에 친숙할 것이다. ROI 감지 알고리즘 파라미터들은 웰 크기, 웰 중심간 거리 및 최소 원형성(circularity)에 대한 수용가능한 범위를 설정할 수 있다. 원형성은 계산된 값이고, 면적에 대한 둘레의 비일 수 있다.
입력 파라미터 및 알고리즘 파라미터가 결정되면, 복수의 시료가 적절한 광 소스로부터의 에너지로 여기되고, 시료 플레이트의 각 시료 웰로부터 방출된 형광에 대한 영상이 수집된다. 시료 플레이트의 형광 영상들은 더 분석되어 입력 파라미터 및 알고리즘 파라미터들을 기반으로 ROI 후보를 선택한다. 파라미터들을 만족시키는 ROI 후보들이 추가 분석을 위해 저장되고, 각 웰의 크기와 원형도가 2620단계에서 결정된다. 파라미터들을 만족시키지 않는 ROI 후보들은 형광을 내지 않았던 위치를 따라 페기될 수 있다. 유지된 ROI 후보들은 웰간 간격 파라미터 및 웰간 간격에 대한 허용된 범위 파라미터를 기반으로 ROI간 거리를 결정하도록 더 평가된다. 웰간 파라미터를 기반으로 서로 매우 가까운 중심들을 갖는 ROI들은 동일한 시료 웰로 고려될 수 있고, 최상의 원형도를 갖는 것이 그 웰에 대한 ROI로 선택된다. 모든 ROI 후보가 결정되면, 2630단계에서 평균 웰 크기가 계산되고, 평균이 각 웰 ROI에 할당되며, 초기 추정된 ROI들이 저장된다.
예상 웰 위치는 플레이트 레이아웃 파라미터를 기반으로 결정된 그리드 패턴으로 배열된다. 이 파라미터는 각 웰이 플레이트 레이아웃 파라미터를 기반으로 예상 XY 그리드 좌표 세트를 갖는 웰의 개수, 열의 개수 및 행을 개수를 포함할 수 있다. 이제 초기 추정된 ROI에 대해 추가 분석이 시작되어 각 초기 ROI의 위치를 더 잘 규정할 수 있고, 이 추가 분석은 글로벌 그리딩으로 지칭될 수 있다. 글로벌 그리딩의 제1 단계는 초기 추정된 ROI의 중심을 분석하여 인접 ROI를 찾는 것이다. 이는 ROI들 사이의 중심간 거리를 플레이트 레이아웃을 기반으로 한 그리드 좌표와 비교하여 결정될 수 있다. 그런 다음, XY 그리드 좌표가 ROI들간의 공간적 관계를 기반으로 초기 추정된 ROI 각각에 대해 결정될 수 있다.
ROI 위치의 정밀함을 개선하기 위해, 중심간 ROI 좌표를 플레이트 레이아웃의 그리드 좌표와 결부시키는 것이 유리할 것이다. 이는 매핑 함수를 결정 및 적용하여 달성될 수 있다. 매핑 함수는 2차원 2차 다항식 쌍이다. 이 함수는 X (또는 Y) 그리드 위치를 X (또는 Y) 방향의 ROI 중심 위치로 매핑하도록 계산된다. 매핑 함수가 결정되면, 매핑 함수는 예상 그리드 좌표에 적용되어 두 가지 이점을 줄 수 있다. 첫째, ROI 중심 위치의 정밀함이 개선될 수 있고, 둘째, 초기 ROI를 발견하는 동안 놓친 ROI를 복원할 수 있다.
ROI의 추가 조정은 광학적 성능에 추가 이익을 줄 수 있다. 발명자들은 ROI 크기와 광학계의 신호대 잡음비(SNR) 사이에 관계가 있음을 발견했다. 당업자는 전기 시스템 및 광학계의 SNR을 계산하는 몇몇 수학식이 있음을 알 것이다. SNR은 예를 들어 다음의 수학식 1의 특징을 가질 수 있다.
SNR =
Figure 112017084989730-pct00001
여기서, SNR = 신호 대 잡음비
Sdye plate = 염료 영상으로부터 ROI들 내 모든 픽셀 강도의 합
SBG = 배경 영상으로부터 ROI들 내 모든 픽셀 강도의 합
Sdye = 염료 영상으로부터의 ROI들 내 모든 픽셀 강도의 합
N= 하나의 ROI 내 픽셀들의 수
offset = 카메라 오프셋
G = 카메라 이득
δ2R,y = 판독 잡음
실험은 6개의 필터 쌍을 포함한 광학계를 사용하여 수행되었다. 각 필터 쌍은 여기 필터(Xn) 및 발광 필터(Mn)를 포함했다. 각 필터는 PCR 프로세스와 호환성이 있도록 구성된 염료의 여기 주파수 및 발광 주파수에 상응하는 협대역 파장에 민감했다. 또한 ROI는 본 문서에 제시된 교시 내용에 따라 최적화되었다. 신호대 잡음에 대한 ROI 크기의 효과를 알아보기 위해, 6개 필터 쌍을 사용하여 96-웰 시료 플레이트로부터 형광이 감지되었다. 각 ROI의 반경은 한 픽셀씩 증가하여 확장되었다. 수학식 1은 6개 필터 각각 및 각 픽셀 증가에 대한 SNR 계산에 사용되었다. 실험결과는 표 3에 도시된다.
SNR X1M1 X2M2 X3M3 X4M4 X5M5 X6M6
△R=0 1709.5 2502.7 1840.3 1613.8 1632.4 475.5
△R=1 1808.2 2642.0 1942.7 1706.3 1709.2 496.8
△R=2 1826.6 2677.8 1964.2 1722.7 1718.8 491.2
△R=3 1818.7 2678.7 1958.4 1714.4 1708.2 479.0
△R=4 1802.5 2667.3 1943.1 1697.6 1690.8 464.7
볼드체 입력은 6개 필터쌍 중 가장 높은 SNR을 나타내고, 두 픽셀 반경 확장은 6개 필터 쌍 모두에 대해 대략 6%의 SNR 개선을 제공한다.
도 23은 96개 웰(2710)을 갖는 시료 플레이트의 영상을 나타낸이다. 웰들(2710) 각각은 형광 영상을 생성했다. 본 문서의 교시 내용을 적용한 후, ROI는 최적화되었고, 청색 원들은 각 웰 위치에 대한 ROI를 나타낸다.
순수 염료 보정
상술한 바와 같이, 작업자가 의도하는 목적을 위해 생물학적 분석 시스템을 더 빠르고 효율적으로 사용할 수 있도록 생물학적 분석 시스템의 설치와 셋업을 단순화하는 요구가 증가하고 있다. 이러한 요구는, 예를 들어, 생물학적 분석 장비 및 관련 부품 보정에서 명백하다. 예시적인 보정은, 예를 들어, qPCR 시스템과 같은 생물학적 분석 시스템에서 형광 감지에 사용된 형광 염료의 보정이다.
qPCR 장비에 사용된 형광 염료의 보정은 장비 소프트웨어가 염료 표준 물질로부터 수집된 보정 데이터를 사용하는 것을 허용하여 장비에 의해 수집된 전체 형광에 대한 각 염료의 개별적인 기여도를 특징짓고 구별한다. 시료 채취 후, 장비 소프트웨어는 각 판독에 대해 원시 스펙트럼 신호 형태로 데이터를 수신한다. 소프트웨어는 순수 스펙트럼 보정 데이터와 각 염료가 기여한 원시 스펙트럼을 비교하여 각 반응 자리에 사용된 각 형광염료의 기여도를 결정한다. 사용자가 분석 후 실험을 저장할 때, 장비 소프트웨어는 웰당 각 형광염료의 기여도뿐만 아니라 그 실험에 대해 수집된 형광 데이터와 함께 순수 스펙트럼을 저장한다.
qPCR 장비에서 염료 보정 산물은, 예를 들어, 각 반응 자리에 있어서 각 염료 표준의 형광 특징을 나타내는 스펙트럼 프로파일들의 모음이다. 각 프로파일은, 예를 들어, 보정 플레이트 또는 어레이 카드와 같은 시료 홀더의 웰과 같은 반응 자리로부터 수집된 형광에 상응하는 스펙트럼 세트를 구성한다. 각 염료 보정에 이어, 장비 소프트웨어는 각 반응 자리에서 각 염료에 대한 스펙트럼 프로파일을 "추출한다" . 소프트웨어는 각 프로파일에 대한 결과 데이터를 형광 대 필터 그래프에 도시한다. 소프트웨어가 염료 보정 데이터를 추출하면, 전체 보정 플레이트 또는 어레이 카드에 대한 수집 스펙트럼의 견지에서 각 웰에 의해 생성된 형광 신호를 평가한다. 염료 스펙트럼은 일반적으로 그룹으로서 동일한 필터 내에서 피크가 되고 다른 파장들에서 약간 발산하면 수용할 수 있다.
보정 플레이트와 같은 시료 홀더에 대해 염료 보정을 수행할 때, 반응 자리들(예를 들어, 웰들)은 일반적으로 동일한 염료 농도를 가져 각 플레이트 웰에서 순수 스펙트럼 값 발생을 허용한다. 도 24는 96-웰 보정 플레이트의 각 웰을 점유하는 단일 염료 (이 경우, FAM 염료)를 갖는 보정 플레이트의 영상을 디스플레이한다. 이는 실행 중 각 웰에 의해 생성된 형광 신호를 그 웰에 대해 판독된 순수 스펙트럼과 비교하는 것을 허용한다. 보정 플레이트의 각 웰에 대해 단일 염료를 사용하므로, 그 웰들에 대한 결과 신호는 유사해야 한다. 예를 들어, 개별 웰들 사이의 광학 특성과 여기 에너지의 작은 차이에 의해 스펙트럼 위치와 피크 위치의 변동이 유발될 수 있다. 염료 보정에서 이 변동을 고려하면, 이론적으로 더 정확한 염료 보정을 이뤄진다.
그러나 특히 많은 염료를 보정할 때, 보정 플레이트당 단일 염료의 사용은 시간 집약적이고, 복잡할 수 있다. 형광 염료의 비제한적인 예시는 FAM, VIC, ROX, SYBR, MP, ABY, JUN, NED, TAMRA 및 CY5를 포함한다. 따라서 염료 보정 결과의 동일한 질을 유지하면서 염료 보정 프로세스를 단순화하고 보정에 필요한 시간을 줄일 필요가 있다.
도 25 및 26은 본원에서 설명된 실시예에 따른 형광 염료(들)을 보정하는 예시적인 방법(900)을 도시한 흐름도이다. 방법(2900)의 단계들은 도 2에 도시된 프로세서(204)로 구현될 수 있다. 또한, 프로세서(204)에 의해 방법을 실행하는 명령어들은 메모리(206)에 저장될 수 있다.
도 25를 참조하면, 2902단계에서, 보정 플레이트들은 염료들을 처리용 기판의 반응 자리로 로딩하여 마련된다. 이 경우, 기판은 96-웰 플레이트이지만, 예를 들어, 384 웰 플레이트를 포함한 다른 기판이 사용될 수 있다. 다양한 실시예에서, 기판은 복수의 시료 영역을 갖는 유리 또는 플라스틱 슬라이드일 수 있다. 기판의 일부 예들은, 표준 마이크로역가 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 또는 마이크로 카드와 같은 다중-웰 플레이트, 유리 또는 플라스틱 ?융瓚絹恙? 같이 실질적으로 평평한 지지대, 또는 임의의 다른 유형의 어레이 또는 마이크로 어레이를 포함할 수 있지만 그에 제한되지 않는다. 기판의 다양한 실시예에서 반응 자리는 시료 홀더 기판 표면에 형성되어 규칙적으로 또는 비규칙적으로 패터닝된 웰, 함몰부, 압입부, 융부 및 이들의 결합을 포함할 수 있다. 지금까지, 웰 또는 플레이트에 대한 참조는 단지 예시적인 목적만을 위한 것이고, 어떤 방식으로든 여기에서 사용가능한 반응 자리 또는 시료 홀더를 제한하기 위한 것은 아니다.
보정 플레이트는 도 27a에 도시된 체커보드 패턴으로 마련될 수 있다. 보정 플레이트들(3100, 3120 및 3140)에 도시된 바와 같이, 플레이트 자체는 96 웰-포맷일 수 있다. 보정 플레이트상의 웰들의 개수는, 예를 들어, 보정이 필요한 염료의 개수, 보정 플레이트를 수용하는 시료 블록(114, 도 1참조)의 포맷, 또는 다른 웰 밀도의 영상 플레이트에 대한 장비(예를 들어, PCR 장비(100))의 수용능력에 의존되어 필요에 따라 변동될 수 있다.
염료 분포의 체커보드 패턴은 다수의 염료들이 보정 플레이트별로 보정되는 것을 허용한다. 보정 플레이트당 하나의 염료를 보정하는 것과 반대로, 체커보드 패턴은 사용자가 더 적은 플레이트를 사용하여 염료 세트를 보정하는 것을 허용하여 염료 보정에 필요한 시간 및 처리 단계들을 줄인다.
도 27a에서, 세 개의 플레이트가 10개의 분리된 염료들을 보정하는 데 사용된다. 각 보정 플레이트(3100, 3120, 3140)는 각 웰이 반복된 패턴으로 (염료 제공 웰) 특정 염료가 제공되도록 플레이트의 각 행의 웰들을 따라 염료들을 교번시키는 반복 패턴으로 4개의 다른 염료들을 수용하도록 구성된다. 예를 들어, 플레이트(3100)는 참조번호 3102(FAM), 3104(VIC), 3106(ROX) 및 3108(SYBR)의 웰들에 의해 예시되는 교번하는 웰들에 FAM, VIC, ROX 및 SYBR 염료들을 수용한다; 플레이트(3120)는 참조번호 3122(buffer), 3124 (MP), 3126(ABY) 및 3128(JUN)의 웰들에 의해 예시되는 교번하는 웰들에 버퍼, MP 염료, ABY 염료 및 JUN 염료를 수용한다. 이 실시예에서, 10개의 염료만이 보정되기 때문에, 버퍼들은 플레이트(3120, 3140)에서 보정될 염료를 수용하지 않은 웰들에 대한 필러(filler)로 사용된다.
도 27a 및 27b에서 실시예는 단지 예일 뿐이고, 보정된 전체 염료 수, 플레이트당 염료 수, 및 플레이트 수는, 예를 들어, 사용자의 보정 요구, 플레이트상의 웰 수, 및 보정을 처리하는 장비의 용량을 기반으로 하여 필요에 따라 모두 달라질 수 있음이 주지되어야 한다. 예를 들어, 도 27a에 도시된 실시예에서 12개 염료가 보정된다면, 4개의 염료가 전체 12개 염료에 대해 세 개의 보정 플레이트(3100, 3120, 3140) 각각에서 보정될 수 있기 때문에, 버퍼는 플레이트 (3120, 3140)에서 필요하지 않을 것이다.
또한 플레이트당 염료의 수는, 예를 들어, 플레이트당 최대 염료 수가 보정 플레이트상의 웰 수, 전체 플레이트를 적절하게 모델링하는데 사용된 장비의 능력 (이하 설명 참조) 및 선택된 플레이트로부터 사용가능한 형광 데이터를 얻는 촬영 시스템의 능력을 기반으로 할 때, 둘 이상일 있다. 예를 들어, 도 27a에 도시된 96-웰 플레이트를 사용하는 것보다, 충분히 튼튼한 장비와 관련 촬영 시스템으로 384-웰 보정 플레이트를 사용할 수 있다. 추가 웰 밀도가 제공되면, 플레이트당 더 많은 염료, 예를 들어, 플레이트당 16개 염료를 보정할 수 있고, 여전히 (하기에서 더 상세하게 설명될) 충분한 글로벌 모델을 얻는데 필요한 염료당 동일한 수(예를 들어, 24개)의 데이터 포인트 (즉, 염료 제공 웰들)를 얻을 수 있다. 예를 들어, 384-웰 플레이트를 사용하면, 두 개의 플레이트 및 플레이트당 5개의 염료를 사용하여 10개의 염료가 보정될 수 있다.
시료 홀더 유형 및 반응 자리 유형도 가능한 염료 수에 영향을 줄 수 있다. 상술한 바와 같이, 다른 유형의 시료 홀더 및 반응 자리들이 보정에 사용될 수 있다.
도 25로 돌아가서, 2904 단계에서, 마련된 체커보드 보정 플레이트들이 장비로 로딩된다. 한 번에 장비로 로딩될 수 있는 플레이트 수는 사용된 장비의 능력과 용량에 달렸다. 예를 들어, 96-웰 블록을 갖는 표준 qPCR 열 사이클러는 보정 플레이트를 하나씩만 수용할 것이다. 그러나 다중 블록 열 사이클러는 각각 보정 플레이트를 수용할 수 있는 다중 블록들을 제공할 수 있다. 또한, 보정 플레이트가 사용되지 않는다면, 사용된 시료 블록 포맷(예를 들어, 마이크로 어레이 또는 마이크로 칩 어레이)에 따라, 다수의 시료 홀더들이, 예를 들어, 장비에 맞는 로딩 어셈블리를 사용하여 단일 장비에 수용될 수 있다.
도 25의 2906단계에서, 장비는 관련 광학 촬영 시스템 (예를 들어 도 3 참조)을 사용하여 로딩된 보정 플레이트 또는 플레이트들의 영상들을 직렬로 또는 병렬로 획득한다. 획득된 영상들과 관련 데이터는, 예를 들어, 도 2의 컴퓨팅 시스템(200)의 메모리(206) 또는 저장 장치(210)에 저장될 수 있다. 광학 촬영 시스템은 각 광 채널에서 각 플레이트의 영상들을 획득할 수 있다. 채널들의 수는 촬영 시스템에서 제공된 여기 및 발광 필터들의 수에 의존된다. 예를 들어, 6개의 여기 필터들(X 필터들) 및 6개의 발광 필터들(M 필터들)을 갖는 광 촬영 시스템의 경우, 다음의 필터 결합에 의해 나타난 총 채널 수는 21개이다: XI Ml, X1M2, X1M3, X1M4, X1M5, X1M6, X2M2, X2M3, X2M4, X2M5, X2M6, X3M3, X3M4, X3M5, X3M6, X4M4, X4M5, X4M6, X5M5, X5M6, 및 X6M6. 각 채널에서 획득된 영상 또는 노출 수는 변동될 수 있다. 예를 들어, 촬영 시스템은 채널당 두 개의 영상 또는 노출을 획득할 수 있다. 촬영된 영상 또는 노출 수는 사용자의 요구에 따라 의존되며, 채널당 더 적은 영상 또는 노출 촬영은 영상 또는 노출 획득에 필요한 시간을 감소시킬 수 있지만, 채널당 더 많은 영상 또는 노출 촬영은 더 높은 품질의 데이터 가능성을 제공한다.
도 25의 2908단계에서, 장비는 광학 촬영 시스템 (예를 들어 도 7 참조)에 의해 획득된 영상 또는 노출로부터 수집된 데이터를 사용하여 보정 플레이트상의 각 염료에 대한 피크 채널을 식별한다. 각 반응 자리에 대한 이 피크 채널은 분석된 특정 염료가 그 반응 자리에 대한 최대 형광을 보이는 채널이다. 피크 채널 식별은, 예를 들어, 95% 이상의 반응 자리들이 염료로 점유되었을 때, 이 경우에는 보정하는 동안 5%의 특이치(outlier) 반응 자리만을 허용할 때 일어날 수 있다. 허용가능한 특이치의 백분율은 변동할 수 있다. 그런 다음, 특이치 반응자리는 향후의 계산과 분석에서 폐기될 수 있다. 특이치는, 예를 들어, 잘못된 염료가 로딩될 때, 염료가 부정확한 구성으로 로딩될 때, 부적절한 염료 로딩이 있을 때, 또는 광학 부품이 더러워졌을 때 (예를 들어, 먼지 입자), 일어날 수 있다. 보정 플레이트상의 각 염료에 대한 피크 채널은, 예를 들어, 컴퓨팅 시스템(200)의 프로세서(204)에 의해 메모리(206)에 저장된 데이터를 이용하여 식별될 수 있다. 식별 결과는, 예를 들어, 컴퓨팅 시스템(200)의 메모리(206) 또는 저장 장치(210)에 저장될 수 있다.
또는, 각 반응 자리의 각 필터 결합에 대해 광학 촬영 시스템에 의해 획득된 영상 또는 노출로부터 수집된 형광 데이터는 피크 채널 식별 전에 기술분야에서 알려진 배경 및 균일성 보정 방법을 사용하여 결정된 배경 부품 및 균일성 인자를 사용하여 배경 및 균일성 수정에 의해 수정될 수 있다.
도 25의 2910 단계에서, 장비는 광학 촬영 시스템(예를 들어, 도 7 참조)에 의해 획득된 영상 또는 노출에서 획득된 데이터를 사용하여 모든 염료 제공 웰에 대한 2908 단계의 식별된 피크 채널에 대해 각 채널을 정규화한다. 각 채널은, 예를 들어, 컴퓨팅 시스템(200)의 프로세서(204)에 의해 메모리(206)에 저장된 데이터를 이용하여 식별된 피크 채널에 대해 정규화될 수 있다. 정규화 결과는, 예를 들어, 컴퓨팅 시스템(200)의 메모리(206) 또는 저장 장치(210)에 저장될 수 있다.
모든 염료 제공 웰들은 정규화할 기선(baseline)의 정량분석값(quant)이 주어진다. 일반적으로, 정량분석값이 클수록 감지된 형광도 크다. 따라서 주어진 염료에 대해 식별된 피크 채널은 염료 제공 웰에서 피크 채널 특이치를 제외하고 그 염료에 대해 최대 정량분석값을 가질 것이다. 그 피크 채널 내 정량분석값과 상관없이 그 채널에서 정량분석값을 정규화하기 위해 1로 리셋된다. 그런 다음, 다른 채널에서 동일 염료에 대한 나머지 정량분석값들은 피크 채널에 대한 정량분석값의 리셋값에 따라 조정된다. 예를 들어, 염료 X의 경우, 피크 채널 A가 웰에서 100의 정량분석값을 갖고, 다른 채널 B는 40의 정량분석값을 가졌다면, 정규화 후, 피크 채널 A는 1.0으로 설정되고, 채널 B는 0.4로 설정된다. 이 정규화된 값은 또한 피크 채널에 대한 보정 인자가 상술한 바와 같이 1.0으로 설정됨으로써 보정 인자로 지칭될 수 있다.
도 27a 및 b에서 도시된 실시예에서, 4개의 염료가 96-웰 플레이트의 웰 중에 동일하게 분산되어 있고, 염료 제공 웰의 수는 24일 것이다. 염료 제공 웰들의 수는, 예를 들어, 시료 홀더(예를 들어 보정 플레이트) 상의 반응 자리(예를 들어, 웰)의 수, 시료 홀더 상에 분산된 염료 수와 같이 이전에 논의된 이유에 따라 변동할 수 있다. 예를 들어, 96- 웰 플레이트상에, 3개의 염료가 분산되어 있다면, 염료 제공 웰의 수는 염료당 32개일 것이다. 만일 6개의 염료가 96-웰 플레이트상에 분산되어 있다면, 염료당 16개의 염료 제공 웰들이 될 것이다.
도 26을 참조하면, 2912 단계에서 장비는 염료당 모든 웰에 대한 글로벌 모델링을 수행한다. 시료 홀더 포맷의 모든 웰에 대해 염료를 보정하기 위해, 장비는 특정 염료에 대한 염료 제공 웰들로부터의 데이터를 사용하여 특정 염료가 없는 웰들을 포함해 모든 웰에 대해 모델링한다. 글로벌 모델링은, 예를 들어, 컴퓨팅 시스템(2400)의 프로세서(2404)에 의해 모든 웰에 대해 모델링하기 위해 특정 염료에 대한 염료 제공 웰들로부터의 데이터를 사용하여 모든 웰들에 대해 수행될 수 있다. 그 결과에 의한 모델은, 예를 들어, 메모리(2406) 또는 저장 장치(2410)에 저장될 수 있다. 도 27a를 참조하면, 플레이트(3100)의 24개 웰(3102)에 제공된 FAM 염료의 경우, 그 플레이트의 다른 312개 웰들은 FAM 염료가 제공되지 않을 것이다. 동일한 24개/72개 제공된 분포가 도 27에서 각 염료에 적용될 것이다. 염료가 제공되지 않은 웰들의 수는 염료가 제공된 웰들의 수에 따라 달라지고, 이는 상술한 바와 같이 다양한 원인에 따라 달라진다. 이와 무관하게, 주어진 플레이트에 대해 염료 제공 웰과 염료가 제공되지 않은 웰의 합은 그 플레이트상의 웰의 개수와 동일하다. 도 27b는 도 27a에서 플레이트로 도시된 것과 동일한 구성에서 FAM, VIC, ROX 및 SYBR 염료들을 갖는 4개의 염료 체커보드형 96-웰 보정 플레이트의 영상이다.
다른 실시예에서, 장비는 모든 채널들 또는, 예를 들어, 식별된 피크 채널의 0.01 또는 1%보다 큰 정규화된 값을 갖는 채널들에 대해 글로벌 모델링을 수행한다. 이 임계치보다 낮은 채널들의 경우, 장비는 글로벌 모델링을 수행하는 대신 국부 모델링(도 26의 2922 단계 참조)을 수행할 것이다. 감지된 형광은 보정된 실제 염료의 기여보다는 주로, 예를 들어, 잡음 또는 다른 방해물의 결과이므로, 어떤 채널에서는 그렇게 낮은 레벨에서 글로벌 모델링은 불필요할 수 있다.
글로벌 모델링 알고리즘은 염료 보정에서 특정 염료 제공 웰에 대해 측정된 염료 보정 인자를 기반으로 하여 각 염료에 대해 각 필터 채널에 대한 염료 보정 인자 모델을 도출하도록 기능할 수 있다. 예를 들어, 특정 염료에 대해 24개 웰이 96-웰 체커보드 플레이트상에 제공되면, 글로벌 모델링은 그 24개 웰의 염료 보정 인자를 사용하여 염료가 제공되지 않은 다른 72개 웰을 포함하는 모든 웰들에 대한 보정 인자를 도출하고, 그에 따라 채널당, 염료당 전체 플레이트에 대한 모델을 생성한다.
2차원(2D) 2차 다항식은 염료 보정 인자에 대한 글로벌 모델로 적용될 수 있는 함수의 예이다. 다른 글로벌 모델링 함수는 알려져 있고 여기에서 사용될 수 있다. 비선형 최소 자승 프로그램이 모델링 잔차(모델로부터 계산된 값들과 측정된 염료 보정 인자 사이의 차)를 최소화함으로써 특정 염료가 제공된 웰들에 대해 측정된 염료 보정 인자로부터 2D 2차 다항식 도출에 사용될 수 있다. 레벤버그-마쿼드 신뢰영역(Levenberg- Marquardt Trust region) 알고리즘이 이 프로그램에서 최적화 알고리즘으로 사용될 수 있다. 많은 다른 최적화 알고리즘이 여기에 사용될 수 있고, 다른 예가 도그레그(Dogleg) 방법으로, 그 주요 아이디어는 가우스-뉴턴(Gauss-Newton)과 코시(Cauthy) 방법 모두를 사용하여 비선형 목적함수를 최적화하도록 최적화 단계를 계산하는 것이다. 이 접근법은 신뢰 공간으로 알려진 탐색 공간 서브세트에 대해 모델 함수(보통 2차 함수)를 사용하여 목적 함수를 근사한다. 모델 함수가 참(true) 목적 함수 최소화에 성공했다면, 신뢰 영역은 확장된다. 역으로, 근사가 부실하다면, 영역은 축소되고 모델 함수가 다시 적용된다. 예를 들어, 손실 함수도 높은 잔차(계산된 보정인자와 측정된 보정인자 사이의 최대 차이)의 영향을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 이 높은 잔차는 보통 최적화에 대해 특이치들을 형성한다.
도 26의 2914단계에서, 모든 웰이 주어진 염료 또는 염료들에 대해 모델링된 후, 장비는 적합성(goodness of fit, GOF) 확인을 수행한다. 이는 글로벌 모델링 단계가 충분히 신뢰할 수 있음을 보증할 수 있다. GOF 확인은, 예를 들어, 컴퓨팅 시스템(200)의 프로세서(204)에 의해 수행될 수 있고, 그 결과는, 예를 들어, 메모리(206) 또는 저장 장치(210)에 저장된다. 적합성 측정은 보통 관측 값과 문제의 모델 하에서 기대된 값들 사이의 불일치를 개괄한다. GOF는, 예를 들어, 결정계수(determination R- squared) 및 평균 제곱근 오차(RMSE) 값을 포함한 많은 방식으로 결정될 수 있다. 예를 들어, R-제곱(R-squared)은 모델 적합성에 대해 일부 정보를 주는 통계이다. 회귀분석에서, 결정계수는 회귀선이 실제 데이터 포인트를 얼마나 잘 근사하는지에 대한 통계적 측정이다. 1의 R-제곱은 회귀선이 데이터에 완전하게 적합함을 가리킨다. RMSE는 관측 값과 문제의 모델 하에서 기대된 값들의 차 또는 잔치의 평균 제곱이다. RMSE는 모델의 예측 정확성에 대한 좋은 측정법이다. 0의 RMSE는 모델 하에서 예상된 값들이 정확하게 관측값과 매칭됨을 가리킨다.
도 26의 2916단계에서, 적합성이 좋다면, 장비는 도 26의 2918단계에서 염료 행렬을 출력한다. 예를 들어, 도 9에 도시된 것과 같이, R-제곱 분석에서, 예를 들어, R-제곱 값이 0.85 이상이거나, 또, 예를 들어 RMSE값 0.01 이하이면, 통계적으로 적합성이 좋을 수 있다. 염료 행렬은, 예를 들어, 컴퓨팅 시스템(200)의 프로세서(204)에 의해 마련될 수 있고, 디스플레이(212)로 출력될 수 있다.
도 26의 2920단계에서, 적합성이 나쁘면, 장비는 도 26의 2922 단계에서 국부 모델링을 수행한다. 이 단계는, 예를 들어, GOF 확인에서 계산된 R값이 0.84 보다 적고 RMSE 값이, 예를 들어, 0.01 보다 크다면, 필요해질 수 있다. 국부 모델링은, 예를 들어, 컴퓨팅 시스템(204)의 프로세서(200)에 의해, 염료가 제공된 웰들로부터의 데이터를 사용하여 염료가 제공되지 않은 나머지 웰들을 모델링하기 위해 수행될 수 있다. 그 결과에 의한 모델은, 예를 들어, 메모리(206) 또는 저장 장치(210)에 저장될 수 있다.
국부 모델링 방법은, 예를 들어, 플레이트 상의 동일한 염료에 대해 주위의 염료 제공 웰들로부터의 보정 인자를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 염료에 대해 염료가 제공되지 않은 웰에서 보정 인자 값을 결정하기 위해, 국부 모델은 전체 플레이트로부터 또는 주위 웰의 5x5 국부 윈도우 내에 있는 동일한 염료의 모든 특정 염료 제공 웰들의 중간 값을 취할 수 있다. 그 중간 값은 플레이트에 대한 전체 모델링이 완료될 때까지 결정된다. 그런 다음, 국부 모델링 출력은 글로벌 모델링 출력을 대체할 수 있다.
최종 국부 모델링 결정에서, 염료 행렬은 도 26의 2918 단계에서 장비가 염료 행렬을 출력하기에 충분하다. 이 염료 행렬은 각 보정된 염료의 형광 특징 프로파일로 동작한다. 각 실행 후, 장비 소프트웨어는 각 판독에 대해 원시 스펙트럼 신호 형태로 데이터를 수신한다. 장비는 원시 스펙트럼과 염료 행렬의 순수 스펙트럼 보정 데이터를 비교하여 각 반응에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정한다. 장비는 염료 기준들(즉, 염료 행렬)로부터 수집된 보정 데이터를 사용하여 장비에 의해 수집된 전체 형광에서 각 염료의 개별 기여도를 특징짓고 구별한다.
장비 정규화 보정
현재, 30,000개로 추정된 인간 유전자의 게놈을 포함한 게놈 분석이 기초 및 응용 생화학 및 약학 연구의 주요 초점이다. 그러한 분석은 진단학, 의학 및 다양한 종류의 장애에 대한 치료법 개발에 도움을 줄 수 있다. 그러나 보통 인간 게놈의 복잡성 및 유전자의 상호 연관 기능들은 이 작업을 어렵게 한다. 흔히 직면하는 어려움은 연구자들이 다수의 장비들에서 수행된 실험 결과를 쉽게 비교할 수 없다는 것이다. 예를 들어, 광 소스들, 광 소자들 및 형광 검출기들과 같은 부품 파라미터들의 물리적인 변동은, 동일한 생물학적 시료들일 수 있는 것에 대한 분석결과에 변동을 가져올 수 있다. 따라서 부품들의 변동을 감소시키는데 도움을 주는 방법 및 장치들에 대한 요구가 계속 있어왔다.
qPCR에서, 증폭 곡선은 보통 동일한 용액에서 리포터 염료의 신호를 수동적인 기준 염료에 대해 정규화하여 결정된다. 리포터 염료들의 예는 FAM, SYBR Green, VIC, JOE, TAMRA, NED CY-3, Texas Red, CY-5를 포함할 수 있지만, 그에 한정되지 않는다. 수동적인 기준의 예는 ROX일 수 있지만 그에 한정되지 않는다. 이 정규화는 "Rn"으로 레이블된 정규화된 형광값들로 보고될 수 있다. 수동적인 기준 정규화는 전체 신호 레벨이 액체 부피 또는 전체 광조사 강도에 의해 영향을 받더라도 Rn 값들이 일관되게 한다. 그러나 조사 스펙트럼 내 장비간 차이로부터와 같이, 리포터 염료 및 기준 염료 사이의 신호 비가 변동하면 수동적인 기준 정규화는 적절하게 동작할 수 없다. 이를 조정하기 위해, 수동 기준에 대한 리포터 비를 정규화하도록 정규화 용액이 제조될 수 있다. 그러한 정규화 용액의 예는 FAM과 ROX의 50:50 혼합물이고, 이는 "FAM/ROX" 정규화 용액으로 지칭될 수 있다.
본원에서 설명된 다양한 실시예에 따르면, 장비 정규화 보정은 Rn 값을 조정하기 위한 "정규화 인자"를 얻기 위해, 염료 혼합물로부터의 형광 판독을 포함한 이러한 현재의 장비 정규화 방법은 추가 비용이 필요하다. 보통, 이를 위해 정규화 용액 및 정규화 플레이트의 제조가 필요하고, 추가 보정을 실행하기 위한 시간이 필요할 수 있다. 또한 이 방법은 표준 쌍체(paired) 필터 세트로 보정된 염료 혼합물에 대해서만 작용을 한다. 쌍체 필터 세트는 여기 필터 및 발광 필터의 결합일 수 있다. 당업자는 추가 염료를 다른 정규화 용액 및 보정에 추가할 필요가 있음을 이해할 것이다.
정규화 용액을 생성하는 제조프로세스 또한 염료의 반응 변동에 기여한다. 절대 형광 표준의 부족으로 염료 농도 제어가 어려울 수 있음이 발견되었다. 이 오차와 변동을 최소화하기 위해, 제조프로세스에서부터 용액의 염료 비를 바람직한 혼합의 +/- 15% 이내 또는 바람직한 혼합의 +/- 10% 이내를 목표로 하는 것이 유리할 수 있다. 보통 제조프로세스는 단순히 염료를 50:50 혼합물로 혼합하도록 충분히 잘 제어되지 않고, 따라서 형광계를 사용하여 염료 혼합물을 조정하는 것이 필요하다.
상술한 수용가능한 백분율 변동은 염료 혼합물 변동과 Ct들 사이의 관계를 살펴서 결정되어 왔다. Ct는 "역치 사이클(threshold cycle)"의 공통 축약형이다. 정량 PCR(qPCR)은 시료에 존재하는 타겟 서열 또는 유전자의 양을 결정하는 방법이다. PCR 동안, 생물학적 시료는 일련의 35 내지 40 회의 온도 사이클을 겪는다. 한 사이클은 다수의 온도를 갖는다. 각 온도 사이클에서, 타겟 서열 양은 이론적으로 두 배가 되고, 여기에서 제시되지 않은 많은 인자들에 의해 의존된다. 타겟 서열은 형광 염료를 포함하기 때문에, 타겟 서열 양이 증가, 즉, 35 내지 40 회의 온도 사이클 동안 증폭하면서, 시료 용액은 각 열 사이클마다 더 밝은 형광을 낸다. 형광 검출기에 의한 측정에 필요한 형광 양은 보통 "역치"로 지칭되며, 형광이 감지된 사이클 번호는 "역치 사이클" 또는 Ct로 지칭된다. 따라서 증폭이 얼마나 효율적인지를 안다면, 원시 시료 내 타겟 서열 양이 결정될 수 있다.
상술한 허용 백분율 변동은 또한 장비에서 Ct 시프트의 표준편차와 관련될 수 있다. 염료 혼합물 내 +/- 15% 변동은 2 표준편차일 수 있는 0.2 Ct의 표준편차를 가져올 수 있다.
상술한 바와 같이, 다수의 장비로부터 실험결과들을 신뢰할 수 있게 비교하는 능력이 요구되며, 장비간 변동성은 자주 이슈가 된다. 이 변동성은 두 소스로부터 나올 수 있다: 예를 들어, 램프 및 필터와 같은 장비 내 부품들의 변동 및, 예를 들어, 램프 및 필터의 노화와 같은 시간에 대한 변동성. 다수의 장비들로부터 나온 실험 결과가 신뢰할 만하게, 쉽게, 그리고 저렴하게 비교될 수 있는 프로세스를 구현하는 것이 유리할 수 있다. 본원에서 발견된 교시 내용은 그러한 프로세스를 개시한다.
광학계에서 시료의 형광신호 양은 몇몇 인자들에 의존될 수 있다. 일부 인자들은 형광 파장, 그 형광 파장에서의 검출기 효율, 발광 필터의 효율, 여기 필터의 효율 및 염료 효율을 포함할 수 있지만, 그에 한정되지 않는다. 본 교시 내용은 장비들의 물리적인 광소자들이 정규화될 수 있다면, 장비간 변동성이 최소화될 수 있음을 제시한다.
일실시예에서, 정규화 인자들은 염료 혼합물보다는 순수 염료 스펙트럼으로부터 도출될 수 있다. 순수 염료는 농도가 정확할 필요가 없고, 하나의 형광 성분만 있기 때문에 염료 혼합물보다 제조하기 쉽다. 이 개념은 10개의 순수 염료를 사용하는 장비에서 두 필터 세트를 정규화하고 그 결과를 염료 혼합물을 사용하여 얻어진 정규화와 비교하여 검사될 수 있었다. 정규화는 각 여기 필터 및 발광 필터에 대한 수정 인자를 결정하여 구현되었다. 결과로 나온 수정 인자들은 염료 결합을 정규화하는데 사용될 수 있고, 다른 장비로부터도 나올 수 있다.
다른 실시예에서, 위에서 교시된 정규화는 다양한 유형으로 다수의 장비에 적용되었다. 8개의 염료 혼합물 용액들과 10개의 순수 염료 용액들이 생성되었다. 각 용액은 세 개 웰 플레이트들의 8개 웰들로 피펫팅(pipetting)된다. 잠재적인 공간 상호간섭(spatial crosstalk)은 매 다른 웰로 피페팅하여 최소화되었다. 사용된 염료 혼합물은 도 28a에 도시되고, 사용된 순수 염료는 도 28b에 도시된다. 또한 사용된 장비는 6개의 필터 세트를 포함했다. 도 28b는 각 순순 염료에 대해 메인 광 채널용 필터 쌍을 식별한다. 여기 필터는 "X"로 표시되었고, 발광 필터는 "M"으로 표시되었다.
정규화 프로세스의 유효성을 정량화하려는 노력으로, 정규화 전후에 염료 비가 측정되었다. 도 29는 17개의 검사된 장비에 대한 평균 비로부터 염료 혼합물의 백분율 편차를 도시한다. 장비는 X축에 표시되고 백분율 편차는 Y축에 표시된다. 당업자는 장비에 대한 편차가 보통 이전에 논의된 바람직한 +/-15% 보다 큰 것을 알 것이다. 따라서 이 데이터는 본 교시 내용과 같은 개선된 정규화 프로세스에 대한 필요성을 나타낸다.
본 교시 내용은 총 17개 장비에 적용되었다. 정규화 방법은 각 염료 비가 아닌 각 개별 필터에 대한 보정 인자를 결정한다. 장비가 6개의 여기 필터와 6개의 발광 필터를 구비하기 때문에 12개의 인자들이 결정되었다. 프로세스는 도 32 및 흐름도(3600)에 도시되었다. 3605단계에서, 보정 스펙트럼은 다수의 필터 결합에 걸쳐 다수의 염료들에 대해 생성되었다. 정규화된 장비들의 경우, 10개의 순수 염료 및 21개의 필터 결합이 있었다. 3610단계에서, 스펙트럼이 정규화되었고, 따라서 최대 신호가 1이다. 3615단계에서, 염료 스펙트럼은 다수의 웰들에 걸쳐 평균이 구해졌다. 이 평균화는 염료당 하나의 스펙트럼을 만드는 결과를 가져올 것이다. 집합적으로, 염료 스펙트럼은 염료 및 필터 결합을 포함하는 염료 행렬 "M"으로 지칭될 수 있다. 이때, 기준 장비가 식별된다. 기준 장비는 검사 장비가 그에 대해 정규화될 장비 또는 장비 그룹이 될 것이다. 검사 장비에 사용된 동일한 염료 스펙트럼 세트가 기준 장비(들)로부터 얻어질 수 있다. 일부 실시예들에서, 기준은 장비 그룹일 수 있다. 그러한 실시예에서 각 염료에 대한 스펙트럼은 그룹에 걸쳐 평균이 구해질 수 있다. 이 단계는 흐름도 3600의 3620 단계에 나타나있다. 일례로서, 기준 스펙트럼은 매트릭스 "Mref"로 지칭될 수 있다.
3625 단계에서, 12개 필터 각각은 처음에 1로 설정된 조정 인자를 갖는다. 바람직한 것은 매트릭스 "M"과 매트릭스 Mref" 사이의 차이가 3630 단계에서 나타낸 것처럼 최소화될 때까지 조정 인자를 0과 1, 바람직하게는 0.04와 1 사이에서 반복적으로 변경하면서 조정 인자와 매트릭스 "M"을 곱하는 것이다. 3635 단계에서, 각 필터 쌍에 대한 수정 인자가 계산된다. 각 필터 쌍에 대한 수정 인자는 발광 필터 인자와 여기 필터 인자의 곱이다. 메인 채널 필터 쌍은 도 28b에 도시된다. 각 필터 쌍에 대한 수정 인자가 결정되면, 각 필터 쌍 인자는 형광 염료 스펙트럼용뿐만 아니라 검사 장비용 형광 데이터와 곱해질 수 있다. 그 후 수정된 순수 염료 스펙트럼은 3645 단계에서 나타낸 것처럼 최대값 1로 다시 정규화된다. 3650 단계에서 프로세스 최종 단계는 다중 부품 데이터를 생성하는 것이다. 당업자는 형광 데이터와 염료 행렬의 의사 역행렬(pseudo-inverse)의 곱이 될 멀티콤포넌팅(multicomponenting) 절차를 이해할 것이다. 다중 부품 값들은 이미 정규화되고, 데이터는 필터 레벨에서 정규화되었기 때문에 염료에 특정된 수정을 할 필요가 없다.
정규화 완료시, 염료 혼합물의 평균비로부터의 % 편차가 17개 장비 모두에 걸쳐 계산되었다. 그 결과가 도 30에 도시되었다. 이 결과들은 정규화 이전 도 29의 데이터에 비해 상당히 개선되었다. 정규화된 데이터의 근접 뷰가 도 31에 도시되었고, 여기에서 정규화 이후 편차는 이전에 제시된 목표치 +/-15% 보다 상당히 낮은 +/-8% 로 감소되었다.
알앤에이즈피 검증
상술한 바와 같이, 특히 새로 설치한 후, 또는 수 회 사용한 후에 장비가 적절하게 동작하는지를 검증하는 것이 중요하다. 이와 같이, 사용자는 실험 결과 및 분석이 정확하고 신뢰할 만한 지를 확인할 수 있다. 이전에 타당성 검정(validation assay)은 사용자에 의해 장비에서 실행되었고 사용자는 장비를 검증하기 위해 타당성 검정(verification assay)으로부터의 증폭 데이터에 대해 수작업으로 데이터 분석을 수행했다. 데이터 분석이 사용자에 의해 수작업으로 수행되었기 때문에 검증 프로세스는 오차가 발생하기 쉽고 시간이 걸렸다.
본 교시 내용의 다양한 실시예에 따르면, 자동화된 검증 방법 및 시스템이 제공된다. 타당성 검증의 일례가 알앤에이즈피 검정이다. 그러나, 본원에서 사용된 것처럼, 타당성 검정은 기지의 신뢰할 만한 특성을 갖는 임의의 검정일 수 있고, 장비 검증에 사용될 수 있다.
설치 후 또는 수회 사용 후, 장비가 적절하게 동작하고 있음을 검증하는 것이 중요하다. 보통 사용자는 장비를 검증하기 위해 알앤에이즈피와 같은 기지의 검정을 수작업으로 실행할 것이다. 알앤에이즈피 유전자는 알앤에이즈피 효소의 RNA 모이어티(moiety)를 인코딩하는 단일 사본(copy) 유전자이다. 그것의 기지의 특징과 특성 때문에 종종 타당성 검증으로 사용된다.
검증 플레이트는 시료의 게놈 사본들의 감지 및 정량화에 필요한 시약과 함께 프리로?壅홱?. 예를 들어, 알앤에이즈피 검증 플레이트에서 각 웰은 PCR 마스터 혼합, 알앤에이즈피 프라이머, FAM™ 염료 레이블된 프로브, 및 알려진 인간 게놈 DNA 템플릿 농도를 포함한다.
종래의 알앤에이즈피 검정 예에서, 표준 곡선은 복제 표준 세트(1,250, 2,500, 5,000, 10,000 및 20,000개 사본)로부터 얻어진 Ct (사이클 역치) 값으로부터 생성된다. 다음으로, 표준 곡선은 두 세트의 알려지지 않은 템플릿(5,000 및 10,000개 복제 모집단)에 대한 사본 수 결정에 사용된다. 장비는 단일 웰에서 연속 시료 채취에 대한 99.7% 신뢰도 수준을 갖는 5,000 및 10,000개 게놈 동등물을 구별하는 능력을 보일 수 있다면 입증된다.
설치를 통과하기 위해, 장비는 단일 웰에서 연속 시료 채취에 대한 99.7% 신뢰도 수준을 갖는 5,000 및 10,000개 게놈 동등물을 구별하는 능력을 실증해야 한다.
다양한 실시예에 따라, 본 교시 내용은 전문가 지식을, 통과/실패 상태 및 실패가 확인되면 고장수리 피드백을 제공하는 자동화된 보정 및 타당성 검사 시스템에 통합할 수 있다. 장비가 타당성 검사 프로세스에 실패했다면, 예를 들어, 사용자는 서비스 엔지니어가 호출될 수 있음을 알 것이다. 본 교시 내용은 설치 및 보정 절차에 필요한 비용 및 시간을 최소화할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따르면, 타탕성 분석의 목표는 동일한 시료의 두 양이 장비에 의해 충분히 구별가능하다는 것이다. 이런 식으로, 장비 성능이 검증될 수 있다.
본 교시 내용의 다양한 실시예에 따르면, 자동화된 검증 방법 및 시스템이 제공된다. 타당성 검정의 사이클 역치값(Ct)이 시스템에 의해 분석 및 비교되어 장비가 충분히 시료의 두 양을 구별할 수 있는지를 판단한다. 타당성 검증의 일례가 알앤에이즈피 검정이다. 이 예에서, 시스템은 5000 및 10000개 게놈 사본의 알앤에이즈피 시료들에 대해 생성된 Ct 값들을 결정하여 5000 및 10000개 게놈 사본으로부터 얻은 데이터가 충분히 구별가능한지를 판단한다. 충분히 구별가능하다는 것은, 본원에서 설명된 실시예에 따라, 증폭 데이터가 두 양과 최소한 3 표준편차(3σ) (~99.7%) 만큼 분리됨을 의미한다. 이 예에서, 두 양은 5000 및 10000개 게놈 사본이다. 다양한 실시예에 따른 방법은 도 33 및 34를 참조하여 하기에서 설명된다.
도 33은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 장비 검증의 예시적인 방법을 도시한다. 일반적으로, 3702 단계의 시작단계에서 타당성 검정 플레이트로부터 증폭 데이터를 수신하여 복수의 증폭 곡선을 생성하고, 각각은 플레이트상의 웰에 상응한다.
플레이트는 복수의 웰을 포함한다. 일부 예에서 플레이트는 96개 웰을 포함한다. 다른 예에서 플레이트는 384개 웰을 포함한다. 플레이트 내 웰들의 일부는 제1 양의 시료를 포함하고, 웰들의 다른 부분은 제2 양의 시료를 포함한다. 제1 양과 제2 양은 다르다. 본원에서 설명된 다양한 실시예에서 제2 양은 제1 양보다 많다. 일부 실시예에서 제2 양은 제1 양과 1.5배 차이가 있을 수 있다. 다른 실시예에서 제2 양은 제1 양과 2배 차이가 있을 수 있다. 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따르면, 제2 양은 제1 양보다 임의의 배수로 차이가 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 양은 웰 당 5000개 게놈 사본일 수 있고, 제2 양은 웰 당 10000개 게놈 사본일 수 있다.
도 33을 다시 참조하면, 3704 단계에서, 복수의 형광 역치가 복수의 생성된 증폭 곡선을 기반으로 결정된다. 복수의 증폭 곡선의 지수 영역들이 비교되어 지수 영역이 속하는 형광 값 범위가 결정된다. 예를 들어, 복수의 증폭 곡선의 지수 영역 하부의 가장 낮은 형광 값으로부터 지수 영역 상부의 가장 큰 형광 값까지의 형광값 범위가 결정된다. 형광 값 범위는 복수의 증폭 곡선의 자동화된 분석에 사용되어 본 교시 내용의 실시예에 따른 장비를 검증한다.
도 35를 참조하면, 복수의 증폭곡선, 형광 값 범위의 결정 및 해당 사이클 역치가 도시된다. 복수의 형광 곡선 각각은 곡선의 지수 영역을 포함한다. 축(3902)은 형광 값을 나타낸다. 축(3904)는 사이클 수를 도시한다. 형광 범위(3906)는 복수의 지수 영역 중 결정된 지수영역 하부의 가장 낮은 형광 값으로부터 복수의 지수 영역 중 결정된 지수영역 상부의 가장 높은 형광 값까지의 범위를 나타낸이다. 다양한 실시예에 따르면, 형광 값의 범위는 소정 값에 의해 똑같이 나뉘어 시스템에 의해 자동화된 분석을 위한 형광 값 세트를 생성한다. 일례에서, 형광 값들(3906)의 범위는 100으로 나뉘어 형광 역치를 위해 100개의 형광 값들을 결정한다. 일부 실시예에서, 상부 5개의 형광 값들 및 하부 5개의 값들은 폐기되어 분석은 90개의 형광 역치를 갖고 진행된다.
도 33을 다시 참조하면, 3706 단계에서, 형광 값 세트의 각 형광 값에 대해 시료의 제1 양을 포함하는 웰들로부터 생성된 복수의 증폭 곡선 각각에 대해 사이클 역치(Ct)가 결정된다. 유시하게, 형광 값 세트의 각 형광 값에 대해 시료의 제2 양을 포함하는 웰들로부터 생성된 복수의 증폭 곡선 각각에 대해 사이클 역치(Ct)가 결정된다
3708 단계에서, 세트의 각 형광 값에 대해 제1 및 제2 양에 대한 Ct 값들을 사용하여, 제1 및 제2 양이 충분히 구별가능한지를 결정한다. 다양한 실시예에 따라, 충분히 구별가능하다는 것은 수학식 (1)을 사용하여 세트의 형광 값들 중 적어도 하나에 대한 양(positive)의 결과를 생성함을 의미한다.
Figure 112017084989730-pct00002
(1)
수학식 1은 제1 및 제2 양이 충분히 구별가능한지를 판단하고, 본원에서 설명된 실시예들에 따라 quant2는 quant1보다 크다. 충분히 구별가능하다는 것은 적어도 3 표준편차 (3σ) (-99.7%) 가 제1 및 제2 양의 Ct 값들을 분리함을 의미한다. 양들이 충분히 구별가능하다는 것이 발견되면, 장비가 검증되었음을 사용자에게 알려준다. 그 알림은 사용자에게 디스플레이 화면으로 보일 수 있다.
도 34는 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 장비를 검증하는 다른 예시적인 실시예를 도시한다. 3802 단계에서, 증폭 데이터는 검증 플레이트 웰에 포함된 복수의 시료로부터 얻어진다. 검증 플레이트 내 웰들의 일부는 제1 양의 시료를 포함한다. 검증 플레이트 내 웰들의 다른 일부는 제2 양의 시료를 포함한다. 제1 양과 제2 양은 다르다. 본원에서 설명된 다양한 실시예에서 제2 양은 제1 양보다 많다. 일부 실시예에서 제2 양은 제1 양과 1.5배 차이가 있을 수 있다. 다른 실시예에서 제2 양은 제1 양과 2배 차이가 있을 수 있다. 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따르면, 제2 양은 제1 양보다 임의의 배수로 차이가 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 양은 웰 당 5000개 게놈 사본일 수 있고, 제2 양은 웰 당 10000개 게놈 사본일 수 있다.
3804 단계에서, 제1 형광 값 세트는 복수의 생성된 증폭 곡선을 기반으로 결정된다. 복수의 증폭 곡선의 지수 영역들이 비교되어 지수 영역이 속하는 형광 값 범위가 결정된다. 예를 들어, 복수의 증폭 곡선의 지수 영역 하부의 가장 낮은 형광 값으로부터 지수 영역 상부의 가장 큰 형광 값까지의 형광값 범위가 결정된다. 형광 값 범위는 복수의 증폭 곡선의 자동화된 분석에 사용되어 본 교시 내용의 실시예에 따른 장비를 검증한다.
다양한 실시예에 따르면, 형광 값의 범위는 소정 값에 의해 똑같이 나뉘어 시스템에 의해 자동화된 분석을 위한 형광 값 세트를 생성한다. 일례에서, 형광 값들(3906)의 범위는 100으로 나뉘어 형광 역치를 위해 100개의 형광 값들을 결정한다. 일부 실시예에서, 상부 5개의 형광 값들 및 하부 5개의 값들은 폐기되어 분석은 90개의 형광 역치 세트를 갖고 진행된다.
3806 단계에서, 세트의 각 형광 역치에 대해, 제1 양에 상응하는 증폭 곡선들에 대한 제1 Ct 값 세트가 결정된다. 유사하게, 세트의 각 형광 역치에 대해, 제1 양에 상응하는 증폭 곡선들에 대한 제2 Ct 값 세트가 결정된다. 이는 세트 내 모든 형광 역치에 대해 반복된다.
일부 실시예에서, 추가 계산이 수행되기 전에, 소정 수의 특이치 Ct 값들이 각 Ct 값 세트에서 제거된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 96-웰 플레이트가 사용되면, 6개의 특이치들이 각 Ct 값 세트로부터 제거된다. 특이치는 Ct 값 세트의 중간 값으로부터 가장 멀리 있는 Ct 값이다. 다른 예에서, 364 웰 플레이트가 사용되면, 10개의 특이치들이 각 Ct 값 세트로부터 제거된다. 특이치가 제거된 후, 각 세트의 잔여 Ct 값들이 이 방법의 나머지 단계들에 사용된다.
3808 단계에서, 각 Ct 값 세트에 대해 중간 값이 계산된다. 즉, 3804 단계에서 결정된 각 형광 역치 세트에 대해 제1 Ct 중간 값은 제1 양 증폭 곡선에 대해 계산되고, 제2 Ct 중간 값은 제2 양 증폭 곡선에 대해 계산된다.
3808 단계와 유사하게, 3810 단계에서 각 Ct 값 세트의 3 표준편차가 계산된다. 즉, 3804 단계에서 결정된 각 형광 역치 세트에 대해 제1 3 표준편차가 제1 증폭 곡선에 대해 계산되고, 제2 3 표준 편차가 제2 증폭 곡선에 대해 계산된다.
제1 양 및 제2 양의 Ct 값들이 충분히 구별가능한 지를 판단하기 위해, 각 다양한 실시예에 따라 형광 값에서 Ct 값들이 비교된다. 다양한 실시예에 따라, 수학식 1이 비교에 사용된다.
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(1)
본원에서 설명된 실시예들에 따라 수학식 2는 제1 및 제2 양이 충분히 구별가능한지를 판단하고, 여기서 quant2는 quant1보다 크다. 충분히 구별가능하다는 것은 적어도 3 표준편차 (3σ) (-99.7%)가 제1 및 제2 양의 Ct 값들을 분리함을 의미한다.
3814 단계에서, 세트의 모든 형광 역치에 대한 수학식 2의 결과가 비교되어 최대 값이 결정된다. 3816 단계에서 최대 값이 양수이면, 장비는 제1 및 제2 양을 충분히 구별할 수 있고, 장비가 검증되었음을 사용자에게 알린다. 3818 단계에서 최대 값이 음수이면, 장비는 제1 및 제2 양을 충분히 구별할 수 없고, 장비 검증이 실패했음을 사용자에게 알린다.
도 36은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 장비 검증을 위해 시스템(400)을 도시한다. 시스템(4000)은 PCR 장비 인터페이스(4002), Ct 데이터베이스(4004), 디스플레이 엔진/GUI(4006), Ct 계산기(4008) 및 검증기(4010)를 포함한다.
PCR 장비 인터페이스(4002)는 PCR 장비로부터 증폭 데이터를 수신하여 증폭 곡선을 생성한다. 상술한 바와 같이, PCR 장비는 검증 플레이트에 포함된 시료들을 증폭한다. 검증 플레이트는 제1 양의 시료를 포함하는 일부 웰들과 제2 양의 시료를 포함하는 다른 일부 웰들을 포함한다. 시료 증폭으로 생성된 형광 데이터가 PCR 장비 인터페이스(4002)에 의해 수신된다.
도 33 및 34를 각각 참조하여 1704 및 1804 단계에서 형광 역치 세트가 결정된 후, Ct 계산기(4006)는 제1 및 제2 양의 시료들로부터 각각 생성된 증폭 곡선에 상응하는 제1 및 제2 Ct 값 세트를 계산한다. 제1 및 제2 Ct 값 세트는 형광 역치 세트에서 각 형광 역치에 대해 계산된다. 복수의 Ct 값 세트는 Ct 데이터베이스(4004)에 저장된다.
검증기(4010)는 도 33의 3708 단계 및 도 34의 3810 및 3812 단계에서 설명된 바와 같이 제1 및 제2 양들이 충분히 구별가능한지를 판단한다.
디스플레이 엔진/GUI는 사용자에게 복수의 증폭 곡선을 디스플레이한다. 또한, 검증기(4010)는 제1 및 제2 양이 충분히 구별가능한지를 판단한 후, 디스플레이 엔진/GUI(4006)는 사용자에게 검증 또는 검증 실패 알림을 디스플레이한다.
자동 염료 수정
본 교시 내용의 다양한 실시예에 따르면, 자동 염료 수정 방법은 다중 부품 데이터의 실시간 스펙트럼 보정 수행에 사용될 수 있다. 자동 염료 수정은 실시간 또는 증폭 데이터가 수집되고 2차 분석이 수행된 후 수행될 수 있다. 자동 염료 수정 알고리즘에서, 다중 부품 상관 매트릭스가 생성된다. 다양한 실시예에 따라, 자동 염료 수정 알고리즘은 다중 부품 상관 매트릭스 내 비대각(off-diagonal) 요소들이 최소화되도록 염료 행렬의 요소들을 조정한다. 이와 같이, Ct 오차 결정이 최소화된다.
자동 배경 수정
본 교시 내용의 다양한 실시예에 따라, 배경 보정 플레이트 필요성을 줄이고, 배경 수정의 전체 효과를 개선하기 위해 자동 배경 보정이 수행될 수 있다.
장비 사용시 일어나는 블록 내 물리적인 오염물(미립자 또는 화공약품)은 오염으로 영향을 받은 분석 웰들의 어떤 스펙트럼 부품들을 인위적으로 부풀려서 시스템의 분석 결과에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 재 보정은 이 문제를 해결할 수 있다. 그러나 요구된 보정들 사이의 구간을 연장하기 위해 배경 보정 후 배경 변경을 자동으로 계산/보상하는 방법이 설명된다. 자동 배경 보정을 달성하기 위해 비어있는/점유되지 않은 블록을 사용하는 방법이 수행된다. 소모품들을 위한 효과적인 신호 블리드 쓰루(bleed-through)가 알려져 있고(경험적으로 결정), 효과적인 배경 보정 슬로프(slope) 및 오프셋이 효과적인 신호 블리드-쓰루를 해결하는 척도 인자(scaling factors)를 사용하여 근사될 수 있다.
플레이트 감지
본원에서 설명된 다양한 실시예에 따르면, 플레이트 감지 방법은 장비에서 플레이트 배치 오차를 식별하기 위해 수행될 수 있다.
장비를 사용하는 동안, 광학계는 이동의 (아이들(idle) 구간 동안) 상한 또는 (동작 중) 하한에 위치한다. 이동 한계들 사이의 중간 위치에서 광학기기의 위치를 판독하는 능력은 하드웨어로 설계되지 않았다; 이처럼, 플레이트 또는 튜브가 존재하는지 없는지를 판단하는 것은 모터 위치 값에 의존할 수 없다 (여기서 광학기기 위치의 차이는 튜브 또는 플레이트에 존재하는 추가 소재 두께에 의해 야기될 것이다). 시스템 내 감지 카메라는 (함몰 스위치 또는 위치 센서와 같은) 플레이트 또는 튜브 감지용 추가 부품이 필요없이 시료 감지에 사용된다. 그러나 블록 영역 내 작은 일부만이 개별 및 분리된 웰 렌즈 어레이 (어레이 내 각 렌즈는 단 하나의 웰로부터의 광을 집중시켜 수집한다)를 사용해 캡쳐되기 때문에, 종래의 전체 블록 영역을 캡쳐하는 소모적인 평면 '사진'은 영상 처리용으로 획득될 수 없다. 각 웰로부터 집중된 광만이 수집되어 순환 휘도 스팟으로 나타나기 때문에, 감지된 영상에는 공간적 또는 동적 범위가 없다. 그러나 광학기기가 용기의 밀폐기 또는 뚜껑으로의 집중을 허용하는 중간 위치로 이동될 경우, 이 초점 스팟은 (시스템에 의해 수집된 정상 신호인 형광과 대비된) 반사 영상으로 캡쳐되어 플레이트/튜브 감지에 사용될 수 있다. 초점 스팟은 웰보다 더 작을 것이고, 이는 캡쳐된 영상에서 (관심영역(ROI)으로 알려진) 웰 크기에 대해 상대적으로 작고 밝은 영역으로 나타날 것이다. 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따라, 초점 스팟은 밝은 픽셀을 만들고, 모든 다른 영역들은 더 어두운 픽셀을 만드는 것을 이해한다면, 픽셀 레벨 정보에 대한 수치 해석으로 존재/부재를 판단할 수 있다.
반사 소재를 사용한 장비 정규화
본 교시 내용의 다양한 실시예에 따라, 포토 다이오드와 같은 반사 소재를 사용한 장비 정규화는, 제조 또는 설치 후 초기 보정이 이루어진 다음, 장비를 자동 보정하는데 사용될 수 있다.
다양한 실시예에 따라, 안정된 반사 소재가 대조 소재(control)로 제조되는 동안 측정된다. 반사 소재는 가열 덮게 상부에 위치할 수 있다. 이어서, 안정된 반사 소재가 모든 채널에서 측정되어 임의의 변화 또는 가변성을 감지할 수 있다. 임의의 변화 또는 가변성은 상술한 바와 같이 여기 광 변화를 재정규화하기 위한 장비 정규화 보정 방법에서 색상 균형 인자 조정에 사용될 수 있다.
열 블록 트레이
상술되고 도 1에 도시된 바와 같이, 열 사이클러 시스템(100)은 시료 덮개(114), 가열/냉각 소자들(116), 및 열 교환기(118)를 포함할 수 있다.
생물학적 시료를 분석하는 장비는 보통 연구자가 수작업으로 또는 자동으로 생물학적 시료를 분석 장비의 시료 로딩 영역에 배치하는 능력을 제공한다. 일부 실시예에서, 덮개가 들어올려지고 생물학적 시료를 포함할 수 있는 용기가 장비의 시료 로딩 영역 내로 배치될 수 있다. 다른 실시예에서, 문이 열려 생물학적 시료를 포함할 수 있는 용기가 장비의 시료 로딩 영역으로 삽입될 수 있다.
다른 실시예에서, 서랍 또는 트레이가 장비 밖으로 밀려나와서 생물학적 시료를 포함할 수 있는 용기가 장비의 시료 로딩 영역으로 삽입되도록 할 수 있는 데, 서랍이 닫히면서 용기가 장비 내로 삽입된다. 다른 실시예에서, 생물학적 시료를 포함할 수 있는 용기가, 예를 들어, 스프링, 자물쇠, 핸들 및 레버를 사용하여 장비 내로 삽입될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 장비의 시료 로딩 영역으로의 접근이 자동화된다. 이는 보통 로봇이 높은 처리량(high throughput) 환경에서 사용된 장비에 대해 이뤄질 수 있다. 덮개, 문 및 서랍은 모터의 사용으로 자동화될 수 있다. 자동화 실시예들은 또한 연구자가 생물학적 시료를 분석용 장치로 로딩하는 것을 지원하는 사용자 친화적인 장비에서 발견될 수 있다. 자동화는 생물학적 시료 로딩을 지원하는 운동을 제공하도록 프로그램된 컴퓨터 시스템과 장비를 인터페이스하여 제어될 수 있다.
상술한 도 5는 개방 또는 노출된 위치에서 이동형 서랍 또는 트레이(160)를 갖는 열 사이클러 시스템(100)의 실시예를 도시했다. 도 38은 본원에서 제공된 시료 블록 어셈블리를 갖는 자동화된 서랍 또는 트레이에 대한 실시예를 도시한 것이다. 하기에서 논의되는 것처럼, 시료 블록 어셈블리는 시료 블록의 온도 제어에 기여하는 부품들을 포함할 수 있다. 시료 블록(114)은 생물학적 시료 용기를 보유하는데 사용될 수 있다. 시료 블록(114)은 또한 생물학적 시료의 온도 변화에 영향을 주는 가열과 냉각을 제공할 수 있다. PCR로 알려진 폴리머라아제연쇄반응 수행시, 분석하는 동안 생물학적 시료의 온도를 변화시키는 것은 이 기술분야에 알려져 있다. 전자기기(128)는 와이어 및 커넥터 시스템을 통해, 예를 들어, 시료 블록의 온도를 제어하기 위해 시료 블록과 인터페이스될 수 있다. 도 38의 어셈블리는 분석 장비를 구성하는 몇몇 어셈블리들 중 하나일 수 있다. 장비 내 추가 어셈블리들은 전원, 광 여기 제품, 광 방출 제품, 데이터 통신 제품 및 사용자 인터페이스를 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 상술한 어셈블리들 모두는 또한 컴퓨터와 인터페이스되어 데이터 수집 및 장비의 타이밍을 제어할 수 있다.
도 39는 블록 어셈블리(114) 및 전자기기(128)가 제거된 도 38의 어셈블리를 도시한다. 도 39는 사용자에게 시료 로딩 영역, 예를 들어, 장비의 블록 어셈블리(114)로의 접근을 제공할 수 있는 자동화된 시스템의 일례를 도시한다. 도 39는 모터(500), 커플링(505), 슬라이드(510) 및 블록 서포트(515)를 도시한다. 그러한 구성에서, 블록 서포트(515)는 이 기술분야에서 알려진 다수의 잠금장치에 의해 기계적으로 슬라이드(510)에 연결될 수 있다. 잠금장치의 일부 예는 블록 서포트(515)를 슬라이드(510)에 단단히 채우는데 적합한 나사, 볼트, 리베트, 및 임의의 다른 잠금장치일 수 있으나, 그에 한정되지 않는다. 블록 서포트(515)는 슬라이드(510)에 단단히 채워져서, 블록 서포트는 화살표(520)로 나타낸 방향으로 이동할 수 있다. 블록 서포트가 이동할 수 있는 용이함은, 예를 들어, 테플론(도시되지 않음)과 같은 베어링 또는 매끄러운 표면을 사용하여 이루어질 수 있다. 도 39는 모터(500)를 추가로 보여준다. 모터(500)는 몇 가지 예를 들면, DC 모터, AC 모터, 또는 스텝퍼 모터와 같이 이 기술분야에서 얼려진 임의의 적합한 모터일 수 있다. 어느 경우든, 모터(500)는 모터 축의 회전 운동을 제공하는 상술한 전자기기와 인터페이스될 수 있다. 모터(500)는 또한 필요한다면 모터의 방향과 속력을 정밀하게 제어하도록 프로그램된 컴퓨터 시스템과 인터페이스될 수 있다. 이전에 제시된 바와 같이, 모터(500)는 화살표(520)로 도시된 선형 운동으로 변환될 수 있는 회전 운동을 제공한다. 회전 운동에서 선형 운동으로의 변환은 연결기(coupling, 505) 및 하나 이상의 엄지 나사(도시되지 않음)를 통해 달성될 수 있다. 따라서 그러한 구성은 제어된 방식으로 블록 서포트의 자동화된 운동을 제공할 수 있다. 연결기(505)는 추가로 모터(500)와 엄지 나사(도시되지 않음)간 정렬 불량에 대한 보상을 제공할 수 있다.
도 40으로 이동하면, 어셈블리의 측면도가 도시된다. 시료 블록(114), 모터(500) 및 연결기(505)를 볼 수 있다. 추가적으로 베어링(530)도 도시되어 있다. 이전에 제시된 것처럼, 베어링(530)은 블록 어셈블리의 매끄러운 병진운동 제공을 지원할 수 있다. 베어링(530)의 크기와 유형은 베어링이 서포트해야 할 부하에 의존된다. 베어링(530)에 대한 상세한 내용은 이후에 제시될 것이다.
당업자는 보통 자동화된 시스템이 운동 제어기로 위치를 피드백하는 일부 유형을 포함함을 이해할 것이다. 피드백은 제어되고 있는 시스템에 따라 미세하거나, 거칠거나 또는 그 둘의 결합일 수 있다. 예를 들어, 스텝퍼 모터는 모터가 이동하는 스텝의 크기와 수를 기반으로 정확한 포지셔닝을 제공할 수 있다. 스텝퍼 시스템의 경우, 컴퓨터는 회전하면서 또는 선형으로 이동하는 장치의 위치를 결정하는 스텝을 카운트하도록 프로그램되어 있다. 도 41a는 이전에 제시됐던 블록 어셈블리(114) 및 전자기기(128)의 평면도를 도시한다. 이전에 논의된 것과 같이, 블록 어셈블리(114) 및 전자기기(128)는 도 39의 레일(510)에 묶이고 도 39의 모터(500)와 결합되어 도 41a의 화살표(570)에 따른 운동을 제공한다. 화살표(570)는 장비 "안"과 "밖"으로 블록 어셈블리(114) 및 전자기기(128)의 운동을 나타내는데 사용된다. 도 41에 도시된 바와 같이, 어셈블리는 내부에 있다고 하고, 영역(560)에 의해 증명되며, 그것의 클로즈업은 하기에서 설명되는 것처럼 도 41b에 도시된다.
도 41b는 두 개의 광 센서(575, 580)를 도시한다. 광 센서는 계속해서 적외선광을 방출하고 갭을 가로질러 적외선광을 감지한다. 갭의 일측면은 방출기이고 다른 측면은 수신기이다. 파워가 장치에 인가되는 한, 방출기는 끊임없이 적외선광을 방출하고, 수신기는 그 광을 계속해서 감지한다. 불투명한 물체가 갭에 삽입되면, 방출기는 계속해서 적외선 광을 방출하지만 광은 수신기로의 도달이 차단된다. 광의 수신과 미수신간의 차이는 그 차이를 감지하도록 프로그램된 컴퓨터에 의해 감지 및 식별된다. 그 결과, 컴퓨터는 광이 차단되었는지 차단되지 않았는지를 감지할 수 있다. 자동화된 시스템은 이동하는 물체에 연결된 불투명한 물체를 장착 또는 구비하여 이동하는 물체가 광 스위치의 위치에 있는지 여부 및 모터(500)가 턴 오프될 것을 감지하는데 이 효과를 사용할 수 있다.
도 41b를 참조하면, 탭(540)은 윤곽선으로 볼 수 있다. 탭(540)은 또한 도 40에서 볼 수 있고, 통풍관(550)의 불투명 탭이다. 도시된 것처럼, 탭(540)은 광 스위치(575)의 갭 내에 위치하고, 그처럼 블록 어셈블리와 전자기기의 "인(in)" 위치를 나타낸다. 당업자는 전기 부품이 동작에 실패할 수 있음을 이해할 것이다. 실패한 "인" 스위치는 "인" 조건을 감지할 수 없을 것이고, 모터(500)는 턴 오프 되지 않을 것이다. 어셈블리에 대한 손상을 방지하기 위해, 슬라이드(510)의 후방에 강제 중지기(585)가 구비된다. 이는 도 41c에 도시된다.
도 41b는 또한 광 스위치(580)을 도시하고, 어셈블리가 언제 계속해서 "아웃(out)" 인지를 감지하도록 구성될 수 있다. 광 스위치(580)는 갭을 가로질러 적외선 광을 방출 및 감지한다는 점에서 광 스위치(575)에 대해 상술한 바와 같이 동작한다. 만일 불투명한 물체가 갭에 삽입되면, 프로그램된 컴퓨터는 광 경로가 차단되었는지 여부를 감지할 수 있다. "아웃" 조건의 경우, 탭(59)이 도 41c에 도시된 것처럼 레일(510) 뒤에 구비된다.
도 42a는 "아웃" 위치에 있는 어셈블리를 도시한다. 이는 모터(500), 결합기(505) 및 엄지 나사(594)가 가시적이기 때문에 분명하다. 도 41a의 "인" 위치에서 이 부품들은 가시적이지 않다. 감지된 "아웃" 위치가 영역(592)에 보이고, 클로즈 업이 도 42b에 도시된다. 도 42b는 이전에 논의된 "인" 광 스위치(575)를 나타낸다. 또한 불투명 탭(590)이 윤곽으로 보이고, 레일(510)에 부착되며, 광 스위치(580)의 갭에 위치한다. 상술한 바와 같이 프로그램된 컴퓨터가 탭(59)이 갭 내에 있는지 여부를 감지하고, 따라서 어셉블리가 언제 계속해서 "아웃" 인지를 "안다"
열 블록
상술되고 도 1에 도시된 바와 같이, 열 사이클러 시스템(100)은 시료 블록덮개(114), 가열/냉각 소자들(116), 및 열 교환기(118)를 포함할 수 있다. 이 소자들은 함께 시료 블록 어셈블리로 지칭될 수 있다. 도 43은 본원에서 설명된 다양한 실시예에 따른 시료 블록 어셈블리(600)의 실시예를 도시한다. 어셈블리(600)는 시료 블록(또는 다수의 블록들)(605), 열전자 냉각기(TEC)(또는 다수의 TEC들)(610) 및 관련 프레임(630), 및 방열판(615)를 포함할 수 있다. 프레임(630)은 TEC들(610)을 수용하여 블록(605) 및 방열판(615)와 정렬하도록 설계된다.
시료 블록(605)은 단일의 일원화된 블록일 수 있고, 도 43은 함께 시료 블록(605)을 형성하는 다수의 블록들과, 밀봉재(620)가 다수의 블록들 및 블록(605) 하부의 인터페이스 포일(foil, 625) 사이의 갭에 끼워진 것을 도시한다. 다시 블록(605)의 설계(단일 대 다수의 블록들)에 따라, 포일(625)은 블록(605)과 실질적으로 동일한 치수를 갖는 단일 포일이거나, 각각 다수의 블록 설계의 개별 블록들과 실질적으로 동일한 치수를 갖는 다수의 포일들일 수 있다. 유사하게 포일(625)은 사용된 TEC들의 개수와 치수들을 모방할 수 있다. 포일(625)은, 예를 들어, 알루미늄으로 만들어질 수 있다.
블록(605)은 고정되거나, 예를 들어 방열판(615)와 같은 블록 어셈블리의 다른 부품에 조임쇠로 고정된다. 대안적으로, 블록(605)은 부유할 수 있다. 부유 블록(605)은 나사 및/또는 다른 부착물에 의해 속박되거나 전체적으로 속박될 수 없다. 부유 블록(605)은 구비된 평평한 표면 또는 표면들에 장착되어 블록(605)이 블록 어셈블리의 다른 부품들과 실질적으로 정렬되게 할 수 있다. 그러나 부유 블록(605)은 모든 측면에서 좌우로 이동할 수 있다. 일반적으로 그런 운동은 제한되어 블록(605)이, 예를 들어, 가열 덮개, 방열판 및/또는 TEC들과 어긋나는 것을 방지할 것이다. 어셈블리는, 예를 들어, 측면 운동을 제한하는 지지대를 제공할 수 있다. 운동은 모든 측면에서, 예를 들어, 1mm로 제한될 수 있다. 그러한 제한된 측면 운동을 허용함으로써, 상술한 슬라이드 레일의 자동화된 인/아웃 운동에 의해, 부유 블록은 블록이 가질 수 있는 누적 공차와 어긋남 및 열 덮개에 적응하여 적응할 수 있다.
도 43의 어셈블리(600)는 또한 블록(605)의 장축 길이를 따라 위치한 조임쇠(635)를 포함하여 TEC들(610)을 블록(605)에 고정한다. 부유 히터(640) 또한 어셈블리(600)에 구비되어 블록(605)의 외주 턱을 따라 위치하고, 그 턱은 블록상의 웰들의 베이스와 가장 가까운 블록의 하부에 있다. 히터(640)는, 예를 들어, 한 면이 알루미늄 포일로 코팅된 캡톤(kapton) 히터일 수 있고, 더 중앙에 위치한 웰들에 비해 외주 웰들 주변의 찬 온도를 상쇄하는데 사용될 수 있다.
제2인터페이스 포일(645)는 TEC들(610)과 방열판(615) 사이에 구비될 수 있다. 포일(645)의 치수는 포일(625)처럼, 사용된 TEC들의 개수와 치수들 모방할 수 있다. 또한 TEC들(610)의 전체 표면적과 같은 단일 포일 조각일 수 있다. 포일(645)은, 예를 들어, 알루미늄으로 만들어질 수 있다.
밀봉재(650)은 방열판(615)의 상부면상에 구비될 수 있다. 이 밀봉재는, 예를 들어, 시료 블록(605)의 외주를 둘러싼 액체받이와 인터페이스될 수 있다. 시료 블록과 방열판 사이에 있는 밀봉재는 수분이 밀봉된 챔버에 들어가서 TEC 기능을 손상시키는 것을 방지한다.
가열 덮개
상술되고 도 1에 도시된 바와 같이, 열 사이클러 시스템(100)은 가열 덮개(110)를 포함할 수 있다.
많은 PCR 장비에서, 시료 튜브 또는 마이크로디터 플레이트가 열 블록 어셈블리상의 시료 웰들로 삽입될 수 있다. PCR 프로세스를 수행하기 위해, 열 블록 어셈블리의 온도는 PCR 프로토콜 파일에서 사용자에 의해 특정된 소정 온도 및 회수에 따라 순환된다. 순환은 컴퓨팅 시스템 및 관련 전자기기에 의해 제어될 수 있다. 열 블록 어셈블리가 온도를 변화시킴에 따라, 이상적으로는 다양한 튜브 또는 플레이트 내 시료들이 유사한 온도 변화를 겪는다. 그러나 열 블록으로부터 시료까지의 열 전달 효율 및 시료 반응 효율에도 영향을 주는 다양한 요소들이 있을 수 있다. 다양한 인자의 예는 시료 튜브가 열 블록 어셈블리상의 시료 웰과 얼마나 잘 접촉하는지 및 동일한 튜브 또는 플레이트 내에서 시료가 가열 및 냉각되면서 얼마나 많은 응축과 증발이 일어나는지를 포함한다. 최소한 이런 이유로, 장비는 보통 시료 튜브 또는 플레이트와 접촉하거나 그 위에 위치할 수 있는 가열 덮개를 포함한다. 제시된 바와 같은 가열 덮개는 튜브 또는 플레이트에 하향력을 제공하여 열 블록 어셈블리와 시료간 열 접촉을 개선할 수 있고, 또한 튜브 또는 플레이트 상부에 열을 가하여 응축과 증발을 최소화할 수 있다.
그러한 가열 덮개의 예가 도 44a에 도시된다. 가열 덮개 어셈블리(700)가 본 교시 내용에 따라 도시된다. 하부 플레이트(720)는 시료 튜브 또는 플레이들의 상부면과 체결될 수 있는 표면을 구비한다. 일실시예에서, 하부 플레이트(720)는 평평하고 연속된 체결면을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 하부 플레이트(720)은 함몰부를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 함몰부는 쓰루홀 개구일 수 있다. 쓰루홀 개구는 시료 물관(vessel)에 포함된 시료에 대한 광 감지를 허용하는 일부 장비에 유리하다. 다른 실시예에서 쓰루홀 개구의 수는 96개 개구일 수 있다. 다른 실시예에서, 개구 수는 384개 일 수 있다. 다른 실시예에서, 쓰루홀 개구 수는 시료 물관의 수와 동일할 수 있다. 상술한 바와 같이, 가열 덮개의 한 가지 이점은 시료 물관 상부에 충분한 열을 공급하여 시료의 응축과 증발을 최소화하는 것이다. 그러한 하부 플레이트(720)는 가열될 수 있다. 도 44a에서 하부 플레이트(720)의 가열은 히터(715)에 의해 공급될 수 있다. 히터(715)는 해당 기술분야에서 알려진 여러 유형일 수 있다. 히터(715)는, 예를 들어, 가황(vulcanization), 감압 접착제, 에폭시 및 접착 테이프와 같은, 해당 기술분야에서 알려진 여러 기술에 의해 접착될 수 있다. 히터(715)는 프로그램된 컴퓨터에 의해 제어되어 증발 및 증발을 막는데 필요한 양의 열을 제공할 수 있다. 일부 실시예에서, 히터(715)는 95?C까지 가열될 수 있다. 다른 실시예에서, 히터(715)는 95?C 에서 105?C 사이까지 가열될 수 있다. 다른 실시예에서, 히터(715)는 105?C 보다 높이 가열될 수 있다.
가열 덮개 어셈블리(700)는 상부 플레이트(725)를 포함한다. 상부 플레이트(725)는 상부면 내 함몰부를 갖는 것으로 도시된다. 함몰부는 이전에 논의된 하부 플레이트(720)의 함몰부와 정렬될 수 있다. 일 실시예에서, 상부 플레이트(725) 내 함몰부는 쓰루홀 개구일 수 있다. 다른 실시예에서, 쓰루홀 개구는 시료 웰들에 포함된 시료의 광 감지를 가능하게 한다. 다른 실시예에서 쓰루홀 개구의 수는 96개 개구다. 다른 실시예에서, 개구 수는 384개일 수 있다. 다른 실시예에서, 쓰루홀 개구 수는 시료 물관의 수와 동일할 수 있다. 다른 실시예에서, 함몰부는 쓰루홀 개구는 원형일 수 있다. 다른 실시예에서, 함몰부는 쓰루홀 개구는 사각형일 수 있다. 다른 실시예에서, 함몰부는 쓰루홀 개구는 정사각형일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 정사각형 개구는 96 웰 및 384 웰 포맷의 시료들로의 광 접근을 제공할 수 있다. 도 44b는 정사각형 개구들이 열 블록 어셈블리 내 96 시료 웰들과 어떻게 정렬할 수 있는지를 도시한다. 각 정사각형 개구는 하나의 시료 웰과 정렬한 것으로 도시되었다. 도 44c는 정사각형 개구들이 열 블록 어셈블리 내 384 시료 웰들과 어떻게 정렬할 수 있는지를 도시한다. 각 정사각형 개구는 4 개의 시료 웰과 정렬한 것으로 도시되었다. 그러한 구성은 다수의 장비들에 대한 가열 덮개 부품의 가용성을 증가시킬 수 있고, 각 콤포턴트의 비용을 감소시킬 수 있다.
가열 덮개(700)의 제2기능은 시료 물관의 상부에 하향력을 공급해서 시료 물관을 시료 웰들과 단단하게 맞물리게 하여 시료 웰과 시료들 사이의 열 저항을 최소화하는 것이다. 필요한 힘의 양은 시료 물관 형성에 사용된 재료 또는 재료들의 유형에 의존될 수 있다. 일실시예에서 힘의 양은 90파운드일 수 있다. 다른 실시예에서 힘은 90파운드 및 150 파운드 사이일 수 있다. 또 다른 실시예에서 힘은 150 파운드보다 클 수 있다. 덮개(700)는 시료 물관과 맞물리도록 수직으로 이동하여 필요한 힘을 제공할 수 있다. 덮개(700)는 캡(cam), 레버, 피스톤, 솔레노이드 또는 모터를 사용하여 이동될 수 있다. 당업자는 이 소자들이 필요한 운동을 제공할 수 있는 유일한 매커니즘이 아니며 이동을 제공할 수 있는 어떠한 매커니즘도 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 그러한 매커니즘의 하나가 도 45에 도시된다.
도 45의 도시는 가열 덮개(700)를 시료 물관들을 맞물리게 하지 않는 위치와 시료 물관들을 맞물리게 하는 위치 사이로 옮기는 자동화 시스템(800)을 도시한다. 시스템(800)은 모터(815), 벨트(810), 도르래(806), 도르래들(830) 및 엄지 나사(820)를 포함할 수 있다. 제2엄지 나사(도시되지 않음)가 또한 포함되고, 이때 도르래(805)는 엄지 나사(820)와 유사한 위치에 있다. 각 엄지 나사 및 관련 도르래는 가열 덮개(700)의 각 측면에 위치한다. 시스템(800)은 변경되어 적용에 필요한 속도와 힘을 제공할 수 있다. 당업자는 모터의 크기, 도르래 비 및 엄지나사의 사양 모두가, 공급될 수 있는 잠재적인 힘의 결정에 기여함을 알 것이다. 따라서 도 45에 설명된 시스템은 시료 물관 상부에 150 파운드의 힘을 제공하도록 설계될 수 있다. 그러한 힘은 시스템을 통해 시료 물관에 집중되어 배분될 필요가 있다. 힘의 배분은 두 개의 엄지 나사 주변에 위치한 베어링(825)을 포함하여 지원될 수 있다. 시료 블록 어셈블리에 적용된 힘은 또한 그 힘의 도 39에 도시된 레일(510)로의 전달을 지원하는 지지 꺽쇠(도시되지 않음)를 통해 배분될 수 있다. 따라서 레일(510)은 도 38의 블록(114) 및 전자기기(128)의 매끄러운 운동을 위태롭게 하지 않고 그 힘을 지원해야할 것이다.
도 44a를 다시 참조하면, 광 센서(710)가 도시된다. 광 센서는 계속해서 적외선광을 방출하고 갭을 가로질러 적외선광을 감지한다. 갭의 일측면은 방출기이고 다른 측면은 수신기이다. 파워가 장치에 인가되는 한, 방출기는 꾸준히 적외선광을 방출하고, 수신기는 그 광을 계속해서 감지한다. 불투명한 물체가 갭에 삽입되면, 방출기는 계속해서 적외선 광을 방출하지만 광은 수신기로의 도달이 차단된다. 광의 수신과 미수신간의 차이는 그 차이를 감지하도록 프로그램된 컴퓨터에 의해 감지 및 식별된다. 그 결과, 컴퓨터는 광이 차단되었는지 차단되지 않았는지를 감지할 수 있다. 자동화된 시스템은 이동하는 물체에 연결된 불투명한 물체를 장착 또는 구비하여 이동하는 물체가 광 스위치의 위치에 있는지 여부 및 모터(500)가 턴 오프될 것을 감지하는데 이 효과를 사용할 수 있다.
상술한 바와 같이, 가열 덮개(700) 및 시스템(800)은 함께 적어도 150 파운드의 힘을 시료 물관 상부에 공급할 수 있다. 또한 시료 물관의 치수와 상관없이 그 힘이 꾸준히 전달될 수 있다면 유리할 것이다. 스프링 어셈블리(730) 및 광 스위치(710)가 포함되어 모든 시료 물관에 원하는 힘을 제공한다. 스프링 어셈블리는 시스템에 대한 원하는 힘에 반응하도록 설계될 수 있다. 스프링 어셈블리(730)는 또한 광 스위치(710)의 갭에 위치한 불투명 탭(735)을 포함한다. 덮개(700)가 낮춰져서 시료 물관과 맞물리면, 덮개(700)가 낮아질 때 인가된 힘이 증가한다. 힘이 증가하면서 스프링 어셈블리(730)이 반응하여 상향으로 이동한다. 원하는 힘이 인가되면, 스프링 어셈블리(730)는 탭(735)이 광 스위치(710)의 광 경로를 차단하는데 충분하도록 상향으로 움직일 것이다. 차단된 광 경로는 상술한 바와 같이 프로그램된 컴퓨터에 의해 감지될 수 있고, 모터(815)가 턴오프될 수 있다.
본 교시 내용에서 개시된 것처럼 자동화 특징을 갖는 장비에서, 가열 덮개가 들어올려지기 전에 시료 블록이 개방된 것을 방지하는 것이 유리하다. 이 시나리오에 반하는 보호가 도 45에 도시된 것처럼 광 스위치(835) 및 불투명 탭(840)에 의해 제공된다. 광 스위치(835)는 고정된 위치에서 서포트(845)를 커버하도록 장착될 수 있다. 불투명 탭(840)은 덮개(700)상에 위치하여 광 스위치(835)의 갭과 정렬될 수 있다. PCR 완료시, 가열 덮개 및 불투명 탭(840)은 불투명 탭(840)이 광 스위치(835)의 갭에 들어갈 때까지 들어올려질 수 있다. 불투명 탭(840)은 광 스위치(835)의 광경로를 차단하는데 충분하도록 들어올려지만, 프로그램된 컴퓨터는 완전하게 들어올려진 덮개 위치를 감지할 수 있고 모터(815)는 차단될 수 있다.
제1실시예에서, 복수의 시료를 수용하도록 구성된 시료 홀더, 시료 홀더를 수용하도록 구성된 시료 블록을 포함하는 시료 블록 어셈블리; 일련의 온도를 통해 복수의 시료를 순환시키도록 구성된 제어 시스템; 및 시료 블록 어셈블리를 폐쇄 위치에서 개방 위치로 가역적으로 밀어서 복수의 시료 홀더에 대한 사용자 접근을 허용하도록 구성된 트레이를 포함하는 생물학적 분석 시스템이 제공된다.
제2실시예에서, 제1실시예의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 트레이는 자동화된 시스템이다.
제3실시예에서, 제2실시예의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 트레이는 시료 블록 어셈블리를 가역적으로 밀도록 구성된 슬라이드 어셈블리를 포함한다.
제4실시예에서, 제3실시예의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 슬라이드 어셈블리는 단일 피스의 돌출부이다.
제5실시예에서, 선행 실시예들의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 트레이는 자동화된 트레이가 언제 규정된 닫힌 위치와 규정된 열린 위치에 도달했는지를 판단하도록 구성된 위치 센서를 추가로 포함한다.
제6실시예에서, 제5실시예의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 위치 센서는 광 센서이다.
제7실시예에서, 제5 및 제6실시예중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 위치 센서는 광 스위치이다.
제8실시예에서, 제5 및 제7실시예중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 가열 덮개를 추가로 포함하며, 위치 센서는, 시료 블록이 가열 덮개와 정렬되도록 언제 자동화된 트레이가 규정된 폐쇄 위치에 도달하였는 지를 판단하도록 구성된다.
제9실시예에서, 제6 및 제7실시예중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 트레이 또는 시료 블록 어셈블리는 방출된 광을 위치 센서로부터 차단하도록 구성된 탭을 추가로 포함한다.
제10실시예에서, 복수의 블록 웰을 가지는 시료 블록을 포함하고, 시료 블록은 시료 홀더를 수용하도록 구성되며, 시료 홀더는 복수의 시료를 수용하도록 구성되는 블록 어셈블리; 일련의 온도를 통해 복수의 시료를 순환시키도록 구성된 제어 시스템; 복수의 시료에 여기광을 전달하고 복수의 시료 각각으로부터 방출된 형광 레벨을 감지하도록 구성된 광학계; 및 시료 홀더의 상부면과 체결되는 체결면을 갖는 하부 플레이트를 포함하며, 체결면은 복수의 하부 플레이트 개구를 갖고, 각각은 복수의 웰중 관련된 하나와 정렬되어 여기 광을 블록 웰들에게로 통과시키는 것을 허용하는 가열 덮개; 히터; 및 복수의 상부 플레이트 개구를 갖는 상부 플레이트를 포함하는 생물학적 분석 시스템이 제공된다.
제11실시예에서, 제10실시예의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 시료 블록은 96개 웰을 갖는다.
제12실시예에서, 제10실시예의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 시료 블록은 384개 웰을 갖는다.
제13실시예에서, 제10실시예의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 시료 블록은 96개 하부 플레이트 개구를 갖는다.
제14실시예에서, 제10실시예의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 하부 플레이트는 384개 하부 플레이트 개구를 갖는다.
제15실시예에서, 제10 내지 제14실시예 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 상부 플레이트 개구 수는 시료 블록 웰들의 개수와 동일하다.
제16실시예에서, 제10 내지 제14실시예 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 방출광이 선택된 시료 블록 웰 포맷들 중 어느 하나로 통과되는 것을 허용하도록 구성된 상부 플레이트 개구들을 갖는 단일 상부 플레이트가 제공된다.
제17실시예에서, 제16실시예의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 시료 블록 웰 포맷은 96 웰 포맷 또는 384 웰 포맷이다.
제18실시예에서, 제10 내지 제17실시예 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 가열 덮개는 언제 가열 덮개가 시료 홀더의 상부면에 규정된 압력을 가하는 지를 감지하도록 구성된 위치 센서를 추가로 포함한다.
제19실시예에서, 제18실시예의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 시료 홀더의 상부면은 시료 홀더에 제공된 복수의 시료 웰의 상부면이다.
제20실시예에서, 제18 내지 제19실시예중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 위치 센서는 광 센서이다.
제21실시예에 있어서, 제18 내지 제19실시예중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 상기 가열 덮개는 스프링 어셈블리를 추가로 포함하고, 상기 스프링 어셈블리는 탭을 포함하며, 스프링 어셈블리는 가열 덮개가 시료 홀더 상으로 하향 이동할 때 시료 홀더의 상부면과 맞물리도록 구성되고, 탭은 방출된 광을 위치 센서로부터 차단하여 가열 덮개의 하향 이동을 중지시키도록 구성된다.
제22실시예에서, 복수의 시스템 모듈을 포함하고, 모듈들은 검출기 모듈; 발광 모듈; 여기 모듈; 및 기본 모듈을 포함하며, 복수의 시스템 모듈은 가역적으로 연결되어 제1 생물학적 분석 장치 유형을 형성하도록 구성된 생물학적 분석 시스템이 제공된다.
제23실시예에서, 제22실시예의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 시스템은 대면 플레이트를 추가로 포함한다.
제24실시예에서, 제22 내지 23실시예 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 적어도 하나의 모듈은 제2 생물학적 분석 장치 유형용 모듈이다.
제25실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 검출기 모듈은 발광 센서를 포함한다.
제26실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 검출기 모듈은 발광 검출기를 포함한다.
제27실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 발광 모듈은 카메라를 포함한다.
제28실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 발광 모듈은 발광 필터 휠을 포함한다.
제29실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 여기 모듈은 여기 소스를 포함한다.
제30실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 여기 모듈은 여기 필터 휠을 포함한다.
제31실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 여기 모듈은 빔 스플리터를 포함한다.
제32실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 여기 모듈은 접이식 거울을 포함한다.
제33실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 기본 모듈은 시료 블록을 포함한다.
제34실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 기본 모듈은 가열 및 냉각 소자를 포함한다.
제35실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 기본 모듈은 빔 스플리터를 포함한다.
제36실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 기본 모듈은 접이식 거울을 포함한다.
제37실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 기본 모듈은 가열 덮개를 포함한다.
제38실시예에서 제22 내지 24 실시예들 중 어느 하나의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 기본 모듈은 방열판을 포함한다.
제40실시예에서, 복수의 반응자리를 갖는 시료 홀더를 수용하도록 구성된 시료 블록을 포함하는 블록 어셈블리를 포함하는 장비; 복수의 반응 자리로부터 형광 방출을 촬영할 수 있는 광학계; 장비를 보정하고, 영상에서 반응자리 위치를 결정하도록 구성된 관심영역(ROI) 보정기를 포함하는 보정 시스템; 형광 염료의 원시 스펙트럼을 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교하여 각 반응자리에 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하도록 구성된 순수 염료 보정기; 필터 정규화 인자를 결정하도록 구성된 장비 정규화 보정기; 시료의 두 다른 양을 구별할 수 있는 장비를 검증하도록 구성된 알앤에이즈피 검증기; 및 보정 결과를 디스플레이하도록 구성된 디스플레이 엔진을 포함하는 생물학적 분석 시스템이 제공된다.
제41실시예에서, 제40실시예의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, ROI 보정기는 각 시료 웰로부터 형광 역치로부터 초기 관심영역(ROI)을 추정하고; 각 ROI의 중심 위치를 추정하고; 각 ROI의 크기를 추정하고; 복수의 반응자리들로부터 ROI의 평균 크기를 결정하고; 글로벌 그리딩 모델을 도출하고; 글로벌 그리딩 모델을 ROI에 적용하도록 구성되며, 글로벌 그리딩 모델의 적용은 ROI 중심 위치의 정밀도를 개선하고; 손실된 ROI를 복원하고; 및 ROI의 반경을 조정하고, 그 조정은 광학계의 신호대 잡음비를 개선한다.
제42실시예에서, 제40 내지 41실시예 중 어느 한 생물학적 분석 시스템이 제공되고, ROI 보정기는 다음 그룹: 복수의 반응자리 내 염료 포화도, 그리드 회전, 확대 인자 변동, 및 광 복사 왜곡 중 적어도 하나를 최소화하여 반응자리 결정 오차를 개선한다.
제43실시예에서, 제40 내지 42실시예 중 어느 한 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 순수 염료 보정기는 하나 이상의 채널에서 장비에 로딩된 시료 홀더를 촬영, 시료 홀더는 복수의 반응자리 및 하나 이상의 염료 유형을 포함하고, 각 염료는 하나 이상의 반응자리를 점유; 시료 홀더 상의 각 염료에 대한 피크 채널을 식별하도록 구성; 각 염료에 대한 피크 채널에 대해 각 채널을 정규화하고; 및 염료 기준 값 세트를 포함하는 염료 행렬을 생성하도록 구성된다.
제44실시예에서, 제43실시예의 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 보정기는 4 개의 다른 시료 홀더를 촬영하기 위해 시료 홀더를 4회 촬영하도록 구성된다.
제45실시예에서, 제40 내지 44실시예 중 어느 한 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 광학계는 복수의 여기 필터 및 복수의 발광 필터를 포함하고, 장비 정규화 보정기는 여기 필터 및 발광 필터 각각에 대해 제1수정 인자를 결정하도록 구성되고; 필터 쌍에 대해 제2수정 인자를 계산하며, 각 필터 쌍은 하나의 여기 필터와 하나의 발광 필터를 포함하고; 및 제2수정 인자를 필터 데이터에 적용하도록 구성된다.
제46실시예에서, 제40 내지 45실시예 중 어느 한 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 필터 정규화 인자는 장비로부터의 데이터가 제2장비로부터의 데이터와 비교되는 것을 허용한다.
제47실시예에서, 제40 내지 46실시예 중 어느 한 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 알앤에이즈피 검증기는 검증 플레이트로부터 증폭 데이터를 수신하여 복수의 증폭 곡선을 생성하도록 구성되고, 검증 플레이트는 제1 및 제2 양의 시료를 포함하고, 각 증폭 곡선을 지수 영역을 포함하며; 복수의 증폭 곡선의 지수 영역을 기반으로 형광 역치 세트를 결정하고; 그 세트의 각 형광 역치에 대해 제1양의 시료들로부터 생성된 증폭 곡선들의 제1사이클 역치(Ct)값 세트 및 제2양의 시료들로부터 생성된 증폭 곡선들의 제2사이클 역치(Ct)값 세트를 결정하고; 제1 및 제2 양이 복수의 형광 역치 각각에서 Ct 값들을 기반으로 충분히 구별가능한 지를 계산하도록 구성된다.
제48실시예에서, 제40 내지 47실시예 중 어느 한 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 알앤에이즈피 검증기는 장비의 검증 또는 실패 알림을 디스플레이 엔진에 디스플레이하도록 더 구성된다.
제49실시예에서, 제40 내지 48실시예 중 어느 한 생물학적 분석 시스템이 제공되고, 다중 부품 데이터의 실시간 스펙트럼 보정을 수행하도록 구성된 자동 염료 수정기; 플레이트 로딩 오차가 있는지 여부를 판단하도록 구성된 플레이트 검출기; 배경 변화를 보상하도록 구성된 자동 배경 보정기; 및 반사 소재를 사용하여 형광 방출에서 임의의 변화 또는 변동성을 감지하도록 구성된 장비 정규화기를 추가로 포함한다.

Claims (20)

  1. 생물학적 분석 시스템에 있어서,
    복수의 시료를 수용하도록 구성된 시료 홀더를 수용하도록 구성된 시료 블록을 포함하는 시료 블록 어셈블리;
    일련의 온도를 통해 상기 복수의 시료를 순환시키도록 구성된 제어 시스템; 및
    슬라이드 어셈블리를 포함하고, 상기 시료 블록 어셈블리를 폐쇄 위치에서 개방 위치로의 개방 방향 및 상기 개방 위치에서 상기 폐쇄 위치로의 폐쇄 방향으로 가역적으로 밀어서 복수의 상기 시료 홀더에 대한 사용자 접근을 허용하도록 구성된 자동화된 트레이를 포함하고,
    상기 자동화된 트레이는 상기 시료 블록 어셈블리 및 상기 시료의 상기 온도를 제어하는 전자기기를 운반하고, 상기 전자기기는 상기 개방 방향에서 상기 시료 블록 어셈블리 뒤에 위치하는 생물학적 분석 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 트레이는 언제 상기 자동화된 트레이가 규정된 폐쇄 위치와 규정된 개방 위치에 도달하였는지를 판단하도록 구성된 위치 센서를 추가로 포함하는 생물학적 분석 시스템.
  3. 제2항에 있어서, 상기 위치 센서는 광 센서인 생물학적 분석 시스템.
  4. 제3항에 있어서, 상기 위치 센서는 광 스위치인 생물학적 분석 시스템.
  5. 제2항에 있어서, 가열 덮개를 추가로 포함하는 상기 위치 센서는 상기 시료 블록이 상기 가열 덮개와 정렬되도록 언제 상기 자동화된 트레이가 규정된 폐쇄 위치에 도달하였는지를 판단하도록 구성되는 생물학적 분석 시스템.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레이 또는 시료 분석 어셈블리는 방출된 광을 상기 위치 센서로부터 차단하도록 구성된 탭을 추가로 포함하는 생물학적 분석 시스템.
  7. 생물학적 분석 시스템에 있어서,
    복수의 블록 웰을 가지며 시료 홀더를 수용하도록 구성된 시료 블록을 포함하는 블록 어셈블리;
    여기광을 상기 블록 웰로 전달하도록 구성된 광학계;
    가열 덮개; 및
    자동화된 트레이를 포함하되,
    상기 가열 덮개는:
    상기 시료 홀더의 상부면과 체결되는 체결면을 갖는 하부 플레이트로서, 상기 체결면은 각각이 상기 복수의 블록 웰 중 하나와 정렬되어 여기광을 상기 블록 웰로 통과시키는 복수의 하부 플레이트 개구를 갖는 하부 플레이트;
    히터; 및
    복수의 상부 플레이트 개구를 갖는 상부 플레이트를 포함하고,
    상기 자동화된 트레이는 슬라이드 어셈블리를 포함하고, 상기 블록 어셈블리를 폐쇄 위치에서 개방 위치로의 개방 방향 및 상기 개방 위치에서 상기 폐쇄 위치로의 폐쇄 방향으로 가역적으로 밀어서 복수의 상기 시료 홀더에 대한 사용자 접근을 허용하도록 구성되고,
    상기 자동화된 트레이는 상기 블록 어셈블리 및 시료의 온도를 제어하는 전자기기를 운반하고, 상기 전자기기는 상기 개방 방향에서 상기 블록 어셈블리 뒤에 위치하는
    생물학적 분석 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 상기 가열 덮개는 언제 상기 가열 덮개가 상기 시료 홀더의 상부면에 규정된 압력을 제공하였는지를 감지하도록 구성된 위치 센서를 더 포함하는 생물학적 분석 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 상기 위치 센서는 광 센서인 생물학적 분석 시스템.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 가열 덮개는 스프링 어셈블리를 추가로 포함하고, 상기 스프링 어셈블리는 탭을 포함하며, 상기 스프링 어셈블리는 상기 가열 덮개가 상기 시료 홀더 상으로 하향 이동할 때 상기 시료 홀더의 상부면과 맞물리도록 구성되며, 상기 탭은 방출된 광을 상기 위치 센서로부터 차단하여 상기 가열 덮개의 하향 이동을 중지시키도록 구성되는 생물학적 분석 시스템.
  11. 생물학적 분석 시스템에 있어서,
    복수의 시스템 모듈을 포함하고,
    상기 모듈은:
    검출기 모듈;
    발광 모듈;
    여기 모듈; 및
    기본 모듈을 포함하며,
    상기 복수의 시스템 모듈은 가역적으로 연결되어 제1 생물학적 분석 장치 유형을 형성하도록 구성되고,
    상기 기본 모듈은:
    복수의 시료를 수용하도록 구성된 시료 홀더를 수용하도록 구성된 시료 블록을 포함하는 시료 블록 어셈블리; 및
    슬라이드 어셈블리를 포함하고, 상기 시료 블록 어셈블리를 폐쇄 위치에서 개방 위치로의 개방 방향 및 상기 개방 위치에서 상기 폐쇄 위치로의 폐쇄 방향으로 가역적으로 밀어서 복수의 상기 시료 홀더에 대한 사용자 접근을 허용하도록 구성된 자동화된 트레이를 포함하고,
    상기 자동화된 트레이는 상기 시료 블록 어셈블리 및 상기 시료의 온도를 제어하는 전자기기를 운반하고, 상기 전자기기는 상기 개방 방향에서 상기 시료 블록 어셈블리 뒤에 위치하는 생물학적 분석 시스템.
  12. 제11항에 있어서 상기 모듈 중 적어도 하나는 제2 생물학적 분석 장치 유형용 모듈인 생물학적 분석 시스템.
  13. 제11항에 있어서, 상기 검출기 모듈은 발광 센서를 포함하는 생물학적 분석 시스템.
  14. 제11항에 있어서, 상기 검출기 모듈은 발광 검출기를 포함하는 생물학적 분석 시스템.
  15. 제11항에 있어서, 상기 여기 모듈은 여기 소스를 포함하는 생물학적 분석 시스템.
  16. 제11항에 있어서, 상기 여기 모듈은 접이식 거울을 포함하는 생물학적 분석 시스템.
  17. 삭제
  18. 제11항에 있어서, 상기 기본 모듈은 접이식 거울을 포함하는 생물학적 분석 시스템.
  19. 제11항에 있어서, 상기 기본 모듈은 가열 덮개를 포함하는 생물학적 분석 시스템.
  20. 제11항에 있어서, 상기 기본 모듈은 제어 시스템을 포함하는 생물학적 분석 시스템.
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