WO2022230214A1 - 光学測定装置 - Google Patents

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WO2022230214A1
WO2022230214A1 PCT/JP2021/026432 JP2021026432W WO2022230214A1 WO 2022230214 A1 WO2022230214 A1 WO 2022230214A1 JP 2021026432 W JP2021026432 W JP 2021026432W WO 2022230214 A1 WO2022230214 A1 WO 2022230214A1
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WO
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light
sample
optical
optical path
measuring device
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Application number
PCT/JP2021/026432
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English (en)
French (fr)
Inventor
幸三 須下
伸治 村島
Original Assignee
バイオニクス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to an optical measurement device that can be used as a real-time PCR device or the like.
  • the amount of amplified nucleic acid can be measured when performing the PCR method (polymerase chain reaction), which is used as a standard method for qualitative analysis and quantitative analysis of a trace amount of target nucleic acid.
  • PCR method polymerase chain reaction
  • a real-time PCR device continuously performs an amplification cycle consisting of heat denaturation, primer annealing, and polymerase extension reaction, and monitors in real time the amplified product obtained by amplifying a target nucleic acid such as DNA hundreds of thousands of times. By doing so, qualitative and quantitative analysis of the target nucleic acid is performed.
  • a target nucleic acid such as DNA hundreds of thousands of times.
  • the degree of amplification of the amplification product can be detected in real time as a fluorescence signal.
  • a fluorescence signal associated with an amplification product is generally obtained by a technique using a fluorescent reporter dye (fluorochrome) called an intercalator or a fluorescently labeled probe.
  • fluorescent reporter dyes are configured to increase or decrease fluorescence emission as a function of the amount of amplification product using phenomena such as fluorescence energy transfer.
  • fluorescent reporter dyes have specific excitation wavelengths and fluorescence wavelengths
  • real-time PCR devices using such fluorescent reporter dyes are usually designed so that the fluorescent reporter dyes are fixedly selected for one device. ing.
  • a real-time PCR device is used, for example, in a clinical setting, there is a situation where there is no choice but to use an urgently available fluorescent reporter dye.
  • fluorescent reporter dyes There is a desire to be able to use a variety of fluorescent reporter dyes.
  • optical measurement devices such as real-time PCR devices are required to detect optical signals with high sensitivity in order to obtain accurate results even with a small amount of sample.
  • the present invention has been made based on the above circumstances, and is capable of measuring light with a simple configuration and high sensitivity, and capable of selectively measuring light of various wavelengths. It is an object of the present invention to provide an optical measuring device capable of
  • the optical measurement apparatus of the present invention includes a sample section in which a sample container containing a sample is arranged; a light source for causing light to enter the sample section; An optical measuring device having a light receiving element that receives light emitted from the sample unit, By having a light shielding wall formed with a diaphragm hole for passing light corresponding to the optical path on the optical path from the light source to the sample and/or the optical path from the sample to the optical element, It solves the above problems.
  • the light shielding wall is provided with aperture holes for passing light corresponding to the optical path on the optical path from the light source to the sample and/or on the optical path from the sample to the optical element. , the light other than the light to be measured is blocked and the light reaches the light receiving element in a condensed state. Therefore, even if the size of the entire device is to be reduced, it is possible to simply provide an aperture hole. Measurement of the desired light from the sample portion can be performed with high sensitivity.
  • the light-shielding wall as a heat insulating wall so as to surround the sample, optical elements such as a light source and a light receiving element can be arranged outside the heat insulating wall. Deterioration and measurement errors due to temperature changes of the element can be suppressed.
  • the optical measurement apparatus having the container holder formed with the window hole corresponding to the optical path of the light source and the optical element of the present invention, the light incident on the sample container held by the container holder and the light emitted from the sample container Because the light is more focused, the measurement of the desired light from the sample site can be made with greater sensitivity. In addition, since unnecessary incident light and outgoing light can be regulated by the container holder, it is possible to accommodate a large number of sample containers in a small accommodation space. and the ease of temperature control of the sample can be improved.
  • the contact area between the container holder and the sample container can be increased. Management can be done more quickly and precisely.
  • the optical measurement apparatus provided with a plurality of light sources of the present invention
  • light of a desired wavelength can be selected from light of various wavelengths as the incident light to be incident on the sample section.
  • Various analysis methods and measurement methods can be applied to the optical measurement device, and as a result, the versatility of the optical measurement device can be improved.
  • the plurality of light sources are two full-color LED chips and a yellow-green LED chip, it becomes possible to select incident light from an extremely wide wavelength range, and a high degree of freedom can be obtained in selecting the wavelength of incident light.
  • the versatility of the optical measurement device can be further improved.
  • the incident light incident on the sample and the emitted light emitted from the sample are measured at wavelengths Since the region can be regulated, a high degree of freedom can be obtained in selecting the wavelengths of the incident light and the emitted light, and the versatility of the optical measuring device can be further improved.
  • the filters corresponding to a plurality of sample parts can be attached or detached collectively. Therefore, it is possible to easily change the setting of the wavelengths of the incident light and the emitted light, and it is possible to improve the operability of the optical measuring apparatus. In addition, it is possible to prevent mistakes due to misidentification, such as different types of filters to be arranged for each of the plurality of sample parts.
  • the optical measurement device used as the real-time PCR device of the present invention basically, even if the amount of the sample is very small, it is possible to measure the fluorescence of the desired wavelength emitted from the sample with high sensitivity.
  • Various fluorescent reporter dyes can be used to hybridize to a sample (target nucleic acid) amplified by real-time PCR by making it possible to easily change the setting of the wavelengths of incident light and emitted light. can.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the optical measuring device of FIG. 1 taken along the line AA;
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the optical measuring device of FIG. 1 taken along the line BB.
  • 3 is a longitudinal sectional view showing an enlarged vicinity C of a sample section and a light shielding wall of the optical measurement device of FIG. 2;
  • FIG. 4 is a cross-sectional view showing an enlarged sample portion and the vicinity D of the light shielding wall of the optical measurement device of FIG. 3 ;
  • FIG. 2 is a perspective view schematically showing the vicinity of a sample section and a light shielding wall of the optical measurement device of FIG. 1; It is a front view showing an example of the configuration of the filter unit of the optical measurement device according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is an exploded perspective view showing an example of the configuration of an optical measuring device according to a second embodiment of the present invention; 9 is an enlarged view of the vicinity E of the optical system of the optical measurement device of FIG. 8.
  • FIG. 9 is an enlarged view of the vicinity F of the light shielding wall of the optical measurement device of FIG. 8.
  • FIG. 9 is an enlarged view of the vicinity G of the optical path forming unit of the optical measurement device of FIG. 8.
  • FIG. 9 is a perspective view of a finned container holder member of the optical measurement device of FIG. 8;
  • FIG. 9 is a perspective view of an optical path forming unit of the optical measurement device of FIG. 8;
  • FIG. 9 is a longitudinal sectional view including a light guide of the optical measuring device of FIG. 8;
  • FIG. 9 is a cross-sectional view including a light guide of the optical measuring device of FIG. 8; It is a cross-sectional view explaining the modification of the optical measuring device based on the 2nd Embodiment of this invention.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view illustrating another modification of the optical measuring device according to the second embodiment of the present invention;
  • FIG. 11 is a cross-sectional view illustrating still another modification of the optical measuring device according to the second embodiment of the present invention;
  • the optical measurement apparatus of the present invention is used, for example, to measure fluorescence or reflected light from a sample to perform qualitative analysis or quantitative analysis of target substances in the sample.
  • the target substance is, for example, a target nucleic acid obtained by amplification by PCR (polymerase chain reaction), and may be E. coli, protein, dye, or the like.
  • PCR polymerase chain reaction
  • An embodiment in which the optical measurement device of the present invention is configured as a real-time PCR device will be described below.
  • a real-time PCR apparatus 100 measures fluorescence emitted from a fluorescent reporter dye (fluorochrome) labeled with a sample containing a target nucleic acid and amplified by real-time PCR.
  • the real-time PCR apparatus 100 includes a sample section 110 in which a sample container W containing a sample is arranged, two light sources 121 for causing excitation light to enter the sample section 110, 122 and an optical system 120 having a light-receiving element 125 that receives fluorescence excited by the excitation light incident on the sample portion 110, and a light shielding aperture formed with an aperture for passing light in the optical path of the optical system 120.
  • the sample section 110 and the optical system 120 are in one-to-one correspondence, and a plurality of sets of the sample section 110 and the optical system 120 are provided (in this embodiment, two rows). 16 pairs), provided.
  • a plurality of sample parts 110 and a plurality of optical systems 120 corresponding thereto are regularly arranged in a sample placement region R provided in the upper part of the device main body 101 of the real-time PCR device 100, and in the lower part of the device main body 101,
  • a heating means (not shown) for adjusting the temperature of the sample contained in the sample container W, and a cooling means 140 having a heat sink 141 and a cooling fan 142 for rapidly cooling the heated sample container W by circulating cooling air.
  • the heating means known temperature control means generally used in conventional thermal cyclers for PCR can be used.
  • the real-time PCR apparatus 100 is provided with a lid member capable of closing the sample placement region R together with the frame 103 and the top surface 102 (not shown), which will be described later.
  • the optical system 120 emits incident light incident on the sample section 110 , and has two types of light sources, a first light source 121 and a second light source 122 .
  • the first light source 121 is composed of a full-color LED chip having a red LED element, a green LED element and a blue LED element
  • the second light source 122 is a yellow-green LED chip composed of a yellow-green LED element or a green LED composed of a green LED element. Consists of chips.
  • One of the first and second light sources 121 and 122 can be used alone, or both can be used in combination.
  • the light receiving element 125 receives light emitted from the sample section 110.
  • the light receiving element 125 may be a photodiode or a photomultiplier tube (PMT: photomultiplier) that converts specific light into current. Elements capable of conversion can be used. With such a light receiving element 125, the fluorescence generated from the fluorescent reporter dye in the sample container W can be detected as a fluorescence signal.
  • the optical system 120 may optionally include a dichroic mirror, a condenser lens, a stray light absorbing member, and the like. The optical system 120 is arranged on the opposite side of the sample section 110 via a light shielding wall 130 which will be described later. there is
  • the sample container W holds a sample (a target nucleic acid sample, a fluorescent reporter dye, a reagent necessary for the progress of the reaction, etc.) inside and also serves as a reaction field, does not affect the predetermined reaction, and A container that allows the excitation light to reach the inside of the sample container W and that does not deform even when heated by a heating means is preferably used.
  • a lidded polypropylene tube generally used for PCR can be used as the sample container W.
  • a plurality (eight) of the sample containers W are arranged in parallel at the same pitch to form an eight series. In the real-time PCR apparatus 100 of the present embodiment, 8 series of sample containers W can be inserted into each of the sample parts 110 arranged in parallel in two rows and correspondingly in two rows.
  • the sample unit 110 is provided with a bottomed cylindrical container holder 111 that holds the sample container W.
  • the container holder 111 only needs to have at least a cylindrical portion, and is not limited to a cylindrical shape with a bottom. good.
  • the container holders 111 are formed in each of the sample parts 110 arranged in two rows. It is built into the real-time PCR apparatus 100 as one vessel holder member 115 with fins while being housed in a frame 103 to be described later.
  • the inner peripheral surface of the container holder 111 has a shape along the portion to be held on the outer periphery of the sample container W, and specifically, it is formed in a tapered shape in which the diameter becomes smaller toward the bottom (downward in FIG. 5).
  • the sample container W can be inserted from above to below.
  • the container holder 111 corresponding to an optical path L1 from the first light source 121 to the sample section 110, an optical path L2 from the second light source 122 to the sample section 110, and an optical path L3 from the sample section 110 to the light receiving element 125,
  • One window hole 112 is formed to pass the light of these optical paths L1, L2 and L3.
  • the optical paths L1, L2, and L3 are straight optical paths, so the window hole 112 is formed at a position facing the first and second light sources 121 and 122 and the light receiving element 125. .
  • the window holes of the container holder 111 may be formed independently of each other so as to correspond to each of the three optical paths L1, L2, L3.
  • the container holder 111 is brought into contact with the sample container W up to a predetermined height along the entire circumference except for the window hole 112 .
  • the container holder 111 may be made of a heat insulating material, or may be made of a metal having a high heat transfer coefficient.
  • the window hole 112 may have any shape as long as it does not block the passage of the light in the optical paths L1, L2, and L3. Shape.
  • the light shielding wall 130 is a plate-shaped one, and includes a series of sample units 110 (a series of sample units 110) that hold a series of sample containers W and a series of optical systems 120 (a series of sample units 110) that correspond to them. optical system 120).
  • a total of two light shielding walls 130 are provided for each of the series of sample parts 110 in the upper row (upper row in FIG. 2) and the series of sample parts 110 in the lower row (lower row in FIG. 2). They are vertically installed in parallel on a horizontal top surface 102 that is the upper surface of the apparatus main body 101 .
  • the light shielding wall 130 includes an optical path L1 from the first light source 121 to the sample section 110, an optical path L2 from the second light source 122 to the sample section 110, and an optical path L3 from the sample section 110 to the light receiving element 125.
  • three diaphragm holes 131, 132, and 133 for passing light are provided independently of each other corresponding to the optical paths L1, L2, and L3, respectively.
  • Three aperture holes 131 , 132 , 133 are provided corresponding to each optical system 120 .
  • a side wall 137 is provided in which both ends are made of the same material and connected to each other. are arranged so as to surround the sample placement region R.
  • the series of optical systems 120 are mounted on a common circuit board 129 (see FIG. 5). That is, on the top surface 102 of the apparatus main body 101, the container holder member 115 with fins is accommodated in the frame 103 so that all the sample parts 110 are arranged inside the frame 103, and outside the frame 103 A circuit board 129 is arranged along the light shielding wall 130 so that the light shielding wall 130 is interposed between the corresponding sample section 110 and the optical system 120 .
  • the light-shielding wall 130 and the side walls 137, that is, the frame 103 can be made of a light-absorbing material. Examples of light-absorbing materials include materials containing black powder such as carbon black and carbon nanotubes.
  • the frame 103 can be made of a heat insulating material.
  • a single shade plate 116 is placed on the container holder member 115 with fins in the upper part of the frame 103 with spacers (not shown) interposed therebetween so as to form an appropriate distance from the container holder 111 .
  • holding holes 117 are formed at positions corresponding to the respective container holders 111 so that the sample containers W can be inserted and held.
  • the shade plate 116 can be made of, for example, a light-absorbing or heat-insulating material.
  • the optical path length is, for example, 5.0 to 7.0 mm.
  • An example of the shape of aperture holes 131 and 132 corresponding to light sources 121 and 122 of light shielding wall 130 is an elliptical shape with a width of 0.6 mm and a length of 0.3 mm. It is an ellipse with a length of .8 mm and a length of 0.6 mm.
  • a spectral filter 155 that limits the wavelength band of fluorescence emitted from the sample section 110 is detachably provided on the optical path L3 from the sample section 110 to the light receiving element 125 .
  • one filter unit 150 incorporating a plurality (eight) of spectral filters 155 corresponding to each of a series of sample parts 110 holding a series of sample containers W is integrated with the series of sample parts 110.
  • the light shielding wall 130 and the filter unit 150 are preferably provided very close to each other.
  • the filter unit 150 is detachable from the top surface 102, and when attached, does not require a separate fixing tool such as a fixing screw. can be done. Note that FIG. 7 shows the filter unit 150 viewed from the direction viewed from the sample section 110 when attached.
  • the three passage holes 151, 152, 153 through which the light passes corresponding to the respective optical paths L1, L2, L3 correspond to the three aperture holes 131, 132, 133 of the light blocking wall 130, respectively, and are independent of each other. are provided.
  • the three passage holes 151, 152, 153 are provided corresponding to the respective optical systems 120, and have sizes and shapes corresponding to the three aperture holes 131, 132, 133 of the light shielding wall 130, respectively. , specifically of the same size and shape.
  • the filter unit 150 includes not only a spectral filter 155 that limits the wavelength band of fluorescence emitted from the sample part 110, but also a filter that limits the wavelength band of light emitted from the first light source 121 and the second light source 122. may be further provided.
  • a spectral filter 155 is provided to limit the wavelength band of fluorescence emitted from the sample section 110 so as to block the passage hole 153 related to the optical path L3, and the other optical paths L1 and L2
  • the through holes 151 and 152 are not provided with filters and are left as through holes.
  • the filter unit 150 does not need to be mounted if it is not necessary to limit the wavelength band of light related to measurement, and all of the through holes 151, 152, and 153 are not provided with filters and are left as they are through holes. You can wear it in any condition.
  • the real-time PCR apparatus 100 is further provided with a control unit that selects a program for measurement based on the type of fluorescent reporter dye to be used, and an arithmetic processing unit that performs arithmetic processing on the fluorescence signal detected by the light receiving element 125.
  • a control unit that selects a program for measurement based on the type of fluorescent reporter dye to be used
  • an arithmetic processing unit that performs arithmetic processing on the fluorescence signal detected by the light receiving element 125.
  • the real-time PCR apparatus 100 may be configured to perform arithmetic processing and program selection according to signals from external equipment.
  • the control unit Based on the type of fluorescent reporter dye added to the sample container W, the control unit adjusts the wavelength of the excitation light emitted from the light sources 121 and 122 in the optical system 120 and the wavelength of the fluorescence received by the light receiving element 125. properly selected.
  • the wavelength of the excitation light emitted from the light sources 121 and 122 can be controlled by controlling the operation such as changing the output, and by using a band-pass filter that limits the spectral width in the filter unit 150 as an excitation filter. can be selected. Further, by selecting the wavelength band to be restricted by the spectral filter 155 based on the type of the fluorescent reporter dye, the wavelength of fluorescence received by the light receiving element 125 can be appropriately selected.
  • applicable fluorescent reporter dyes include, for example, 6-carboxyfluorescein (FAM (registered trademark)), 6-carboxy-X-rhodamine (ROX (registered trademark)), cyanine system dyes (Cy5) and 4,7,2',4',5',7'-hexachloro-6-carboxyfluorescein (HEX (registered trademark)); These may be used individually by 1 type, and can also be used in mixture of 2 or more types.
  • FAM 6-carboxyfluorescein
  • ROX registered trademark
  • cyanine system dyes Cy5
  • HEX 4,7,2',4',5',7'-hexachloro-6-carboxyfluorescein
  • real-time PCR is performed as follows. That is, a plurality of sample containers W (maximum number of samples: 16) containing necessary samples such as target nucleic acids and fluorescent reporter dyes are inserted into the container holders 111 of the respective sample units 110, and the temperature is adjusted according to the type of sample. After setting the control, nucleic acid amplification is started, and the fluorescence obtained by the excitation light according to the program selected by the control unit is continuously measured, and the amount of amplified nucleic acid of the target nucleic acid is detected. . Depending on the fluorescent reporter dye used, the time required for real-time PCR is about 30 to 60 minutes.
  • Measurement of fluorescence in the real-time PCR device 100 is performed as follows. That is, as shown in FIG. 6, the excitation light of the wavelength selected from the light sources 121 and 122 is horizontally emitted forward, along the optical path L1 and/or the aperture holes 131 and 132 of the light shielding wall 130 and along the optical path L2.
  • the sample in the sample container W received in the container holder 111 is irradiated while being squeezed by the window hole 112 of the container holder 111 .
  • the excitation light applied to the sample in the sample container W excites the fluorescent reporter dye and emits fluorescence. Furthermore, while the wavelength band is restricted by the spectral filter 155 of the filter unit 150 as necessary, it reaches the light receiving element 125 and the fluorescence is detected as a fluorescence signal.
  • FIGS. 8 to 15 are explanatory diagrams showing an example of the configuration of the optical measuring device according to the second embodiment of the invention.
  • the real-time PCR device 200 according to the second embodiment is provided with an optical path forming unit 250 instead of the filter unit 150 in the real-time PCR device 100 according to the first embodiment, and the shape of the window hole 212 of the container holder 211 is They are different and have the same configuration except that the number and shape of aperture holes in the light shielding wall 230 are different.
  • the same components as those of the real-time PCR apparatus 100 according to the first embodiment are numbered in the 200s instead of in the 100s in FIGS.
  • 271 is a bottom plate and 272 is a fastening member.
  • the light shielding wall 230 includes an optical path L4 from the first light source 221 to the sample section 210 and an optical path L5 from the second light source 222 to the sample section 210.
  • One diaphragm hole 232 for passing such light is provided independently of each other.
  • the two aperture holes 231 and 232 are provided corresponding to the respective optical systems 220, respectively. Further, as shown in FIG.
  • a protruding portion 234 is formed on the inner side of the light shielding wall 230 of the frame 203 so as to protrude inward so as to prevent stray light between the optical paths of the adjacent sample portions 210 . . 11 and 15, the optical path forming unit 250 includes an optical path L4 from the first light source 221 to the sample section 210, an optical path L5 from the second light source 222 to the sample section 210, and On the optical path L6 from the sample section 210 to the light receiving element 225, there are one passage hole 251 for passing light corresponding to the optical paths L4 and L5, and one passage hole 252 for passing light corresponding to the optical path L6.
  • the container holder 211 has an optical path L4 from the first light source 221 to the sample section 210, an optical path L5 from the second light source 222 to the sample section 210, and a light receiving element from the sample section 210.
  • one window hole 212 is formed to pass the light of these optical paths L4, L5, L6.
  • the optical paths L4 and L5 are linear optical paths
  • the optical path L6 is a reflective optical path using the ride guide 260.
  • the window hole 212 faces the first and second light sources 221 and 222 and is continuously open to face the light incident surface 261 of the light guide 260 related to the optical path L6.
  • the window hole 212 is specifically formed to open in an angular direction of about 90 to 120°.
  • the optical path forming unit 250 includes a semi-cylindrical portion 257 that opens inwardly (front left in FIG. 13) covering the window hole 212 on the outer periphery of the container holder 211 so as to partially accommodate the sample container W. , and an optical path forming portion 258 extending outward from the semi-cylindrical portion 257 (backward right direction in FIG. 13) so as to be continuous with the semi-cylindrical portion 257 and approach the inside of the light shielding wall 230 .
  • a light guide 260 that guides the light emitted from the sample section 210 to the light receiving element 225 is fitted inside the passage hole 252 of the optical path forming unit 250 .
  • the semi-cylindrical portion 257 is provided with an opening 259 for introducing the incident light of the light along the optical path L6 into the light guide 260 .
  • the light guide 260 has a structure in which surfaces other than the light incident surface 261 and the light incident surface 262 are totally reflected.
  • the optical path forming unit 250 is accommodated in the frame 203 together with the container holders 211 of the container holder members 215 with fins accommodated in the semi-cylindrical portions 257 of the optical path forming unit 250. 229 is screwed and fixed by a screw 273 from the outside.
  • the light guide 260 fitted inside the passage hole 252 of the optical path forming unit 250 faces the window hole 212 of the container holder 211 through the opening 259 of the semi-cylindrical portion 257.
  • the light incident surface 262 faces the diaphragm hole 232 of the light shielding wall 230 corresponding to the light receiving element 225 .
  • Various filters can be installed inside the passage holes 251 and 252 of the optical path forming unit 250, as shown in FIGS. Specifically, for the optical path L4 from the first light source 221 to the sample section 210 and the optical path L5 from the second light source 222 to the sample section 210, the wavelength band of the light emitted from the light sources 221 and 222 is set to A spectroscopic filter 255 can be installed to limit and pass only the excitation light of a desired wavelength. A filter 256 can be installed. If there is no need to limit the wavelength band of light for measurement, it is not necessary to install the spectral filters 255 and 256 inside the passage holes 251 and 252 of the optical path forming unit 250 .
  • spectral filters 255 and 256 can be freely set.
  • a spectral filter 255 for excitation light is installed on the side of the light blocking wall 230 in the passage holes 251 for the optical paths L4 and L5 of the optical path forming unit 250, and the passage hole 252 for the optical path L6 is installed.
  • a configuration in which a spectral filter 256 relating to fluorescence is installed on the inner light shielding wall 230 side can be employed. Further, for example, as shown in FIG.
  • a spectral filter 255 related to the excitation light is installed on the side of the light blocking wall 230 in the passage holes 251 related to the optical paths L4 and L5 of the optical path forming unit 250, and a transmission hole related to the optical path L6 is installed.
  • a configuration in which a spectral filter 256 relating to fluorescence is installed in an aperture 259 in 252 can also be used.
  • the spectral filter 255 is not installed in the passage hole 251 associated with the optical paths L4 and L5 of the optical path forming unit 250, and the fluorescent light is emitted from the light shielding wall 230 side in the passage hole 252 associated with the optical path L6.
  • a spectral filter 256 relating to is installed.
  • the spectral filters 255 and 256 can be incorporated in the optical path forming unit 250 in advance, and the optical path forming unit 250 is detachable. , 256 can be attached or detached collectively, and the setting of the wavelengths of incident light and emitted light can be easily changed.
  • Measurement of fluorescence in the real-time PCR device 200 as described above is performed as follows. That is, as shown in FIG. 15, the excitation light of the wavelength selected from the light sources 221 and 222 is emitted forward in the horizontal direction, and along the optical path L4 and/or the optical path L5, the aperture hole 231 of the light shielding wall 230 and the container holder. The sample in the sample container W received in the container holder 211 is irradiated while being narrowed by the window hole 212 of 211 .
  • the excitation light applied to the sample in the sample container W excites the fluorescent reporter dye to emit fluorescence, and the light emitted from the window hole 212 of the container holder 211 enters the light incident surface 261 of the light guide 260, The light is guided along the light guide 260 while being reflected along the optical path L6, and is emitted from the light incident surface 262. Ultimately, the fluorescence is detected as a fluorescence signal.
  • the optical measurement device of the present invention is not limited only to real-time PCR devices, but also includes FISH method (fluorescent in situ hybridization), PCR method, LCR method (ligase chain reaction), SD method (strand displacement), competitive hybridization.
  • FISH method fluorescent in situ hybridization
  • PCR method PCR method
  • LCR method ligase chain reaction
  • SD method strand displacement
  • competitive hybridization a method for detecting the amount of amplified nucleic acids using various fluorescent reporter dyes, such as competitive hybridization, and furthermore, an apparatus for irradiating a sample with light and detecting the emitted light with high sensitivity. If so, it can also be applied to a device that measures reflected light, for example.

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Abstract

本発明は、簡単な構成で高い感度で光の測定を行うことができ、また、各種の波長の光を選択的に測定することができる光学測定装置を提供することを課題とする。　本発明の光学測定装置は、試料が収容された試料容器Ｗが配置される試料部と、前記試料部に光を入射させる光源と、前記試料部から出射される光を受光する受光素子とを有する光学測定装置であって、前記光源から前記試料部に至る光路、および／または、前記試料部から前記光学素子に至る光路上に、前記光路に対応して光を通過させる絞り孔が形成された遮光壁を有することを特徴とする。

Description

光学測定装置
　本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置等として用いることができる光学測定装置に関する。
　光学測定装置の或る種のものとして、例えば、微量の標的核酸の定性分析および定量分析の標準的手法として用いられるＰＣＲ法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；ポリメラーゼ連鎖反応）を実施する際に増幅核酸量を同時に検出する、いわゆるリアルタイムＰＣＲを行うリアルタイムＰＣＲ装置がある。
　リアルタイムＰＣＲ装置では、熱変性、プライマーとのアニーリング、およびポリメラーゼ伸長反応という増幅サイクルを連続的に行い、ＤＮＡ等の標的核酸を数十万倍にも増幅させて得られた増幅産物をリアルタイムでモニタリングすることで、標的核酸の定性分析および定量分析を行う。そして、標的核酸の増幅反応が進行する際に励起光を照射することで、増幅産物の増幅の程度を蛍光信号としてリアルタイムに検出することができる。増幅産物に係る蛍光信号は、一般的にインターカレーターまたは蛍光標識プローブという蛍光レポーター色素（蛍光色素）を用いる手法によって得られる。これらの蛍光レポーター色素は、蛍光エネルギー転移などの現象を利用して増幅産物の量に相関して蛍光発光が増減するよう構成されている。
特表２００２－５０５０７１号公報
　各種の蛍光レポーター色素は固有の励起波長および蛍光波長を有するので、このような蛍光レポーター色素を用いるリアルタイムＰＣＲ装置においては、通常、一の装置に固定的に蛍光レポーター色素が選択されるよう設計されている。一方、リアルタイムＰＣＲ装置を例えば臨床現場で用いる場合には、緊急的に入手可能な蛍光レポーター色素を用いざるを得ない場面もあり、このような事態を想定して一のリアルタイムＰＣＲ装置に対して各種の蛍光レポーター色素を使用可能にしたいという要請がある。
　また、装置全体の小型化を図るために、リアルタイムＰＣＲ装置などの光学測定装置においては、少量の試料でも精確な結果を得るために高い感度で光信号を検出することが求められている。
　本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであって、簡単な構成で高い感度で光の測定を行うことができ、また、各種の波長の光を選択的に測定することができる光学測定装置を提供することを目的とする。
　本発明の光学測定装置は、試料が収容された試料容器が配置される試料部と、
　前記試料部に光を入射させる光源と、
　前記試料部から出射される光を受光する受光素子とを有する光学測定装置であって、
　前記光源から前記試料部に至る光路、および／または、前記試料部から前記光学素子に至る光路上に、前記光路に対応して光を通過させる絞り孔が形成された遮光壁を有することにより、上記課題を解決するものである。
　本発明の光学測定装置によれば、光源から試料部に至る光路、および／または、試料部から光学素子に至る光路上に、光路に対応して光を通過させる絞り孔が形成された遮光壁を有することにより、測定すべき光以外の光が遮断されて光が絞られた状態で受光素子に至るので、装置全体の小型化が図られた場合にも絞り孔を設けるという簡単な構成で試料部からの所期の光の測定を高い感度で行うことができる。また、遮光壁を断熱壁として試料部を囲う状態に設ける構成とすることによって、断熱壁の外方に光源および受光素子などの光学素子を配置することができ、試料を加熱する場合にも光学素子の温度変化による劣化や測定誤差を抑止することができる。
　本発明の光源および光学素子に係る光路に対応した窓孔が形成された容器ホルダーを有する光学測定装置によれば、容器ホルダーに保持された試料容器に入射される光や試料容器から出射される光がさらに絞られるので、試料部からの所期の光の測定をより高い感度で行うことができる。また、容器ホルダーによって不要な入射光および出射光を規制することができるので、小さな収容空間に多数の試料容器を収容することが可能となり、装置全体の小型化および軽量化を図って持ち運びが容易になるとともに試料の温度管理のし易さを向上させることができる。さらに、容器ホルダーが窓孔以外の全周にわたって所定の高さまで試料容器と密着して保持する構成とすることによって、容器ホルダーと試料容器との接触面積を増大させることができるので、試料の温度管理をより迅速にかつ精密に行うことができる。
　本発明の複数の光源が設けられた光学測定装置によれば、試料部に入射させる入射光として各種の波長の光から所期の波長の光を選択することができるので、各種の試料に対して各種の分析法や測定法を適用することができ、その結果、光学測定装置の汎用性を向上させることができる。特に、複数の光源がフルカラーＬＥＤチップおよび黄緑色ＬＥＤチップの２つである場合には、極めて広い波長範囲から入射光を選択することが可能となり、入射光の波長の選択に高い自由度が得られて光学測定装置の汎用性をより向上させることができる。
　本発明の光源および光学素子に係る光路上に光の波長帯域を制限するフィルターを着脱可能に備える光学測定装置によれば、試料部に入射させる入射光や試料部から出射される出射光を波長域の規制されたものとすることができるので、入射光や出射光の波長の選択に高い自由度が得られて光学測定装置の汎用性をさらに向上させることができる。
　本発明の複数の試料部の各々に対応するフィルターが組み込まれたフィルターユニットを着脱可能に備える光学測定装置によれば、複数の試料部に対応するフィルターを一括して装着または脱離することができるので、入射光や出射光の波長の設定を容易に変更することができ、光学測定装置の取扱い性を向上させることができる。また、複数の試料部の各々に対して配置すべきフィルターの種類を互いに異なるものとするなどの誤認によるミスを生じ難くすることができる。
　本発明のリアルタイムＰＣＲ装置として用いられる光学測定装置によれば、基本的に、微量の試料であっても試料から出射された所期の波長の蛍光を高い感度で測定することができ、さらに、入射光や出射光の波長の設定を容易に変更することができる構成とすることによって、リアルタイムＰＣＲによって増幅された試料（標的核酸）にハイブリダイゼーションさせる蛍光レポーター色素として各種のものを使用することができる。
本発明の第１の実施形態に係る光学測定装置の構成の一例を示す側面図である。 図１の光学測定装置のＡ－Ａ線断面図である。 図１の光学測定装置のＢ－Ｂ線断面図である。 図２の光学測定装置の試料部および遮光壁の付近Ｃを拡大して示す縦断面図である。 図３の光学測定装置の試料部および遮光壁の付近Ｄを拡大して示す横断面図である。 図１の光学測定装置の試料部および遮光壁の付近を模式的に示す斜視図である。 本発明の第１の実施形態に係る光学測定装置のフィルターユニットの構成の一例を示す正面図である。 本発明の第２の実施形態に係る光学測定装置の構成の一例を示す分解斜視図である。 図８の光学測定装置の光学系の付近Ｅの拡大図である。 図８の光学測定装置の遮光壁の付近Ｆの拡大図である。 図８の光学測定装置の光路形成ユニットの付近Ｇの拡大図である。 図８の光学測定装置のフィン付き容器ホルダー部材の斜視図である。 図８の光学測定装置の光路形成ユニットの斜視図である。 図８の光学測定装置のライトガイドを含む縦断面図である。 図８の光学測定装置のライトガイドを含む横断面図である。 本発明の第２の実施形態に係る光学測定装置の変形例を説明する横断面図である。 本発明の第２の実施形態に係る光学測定装置の別の変形例を説明する横断面図である。 本発明の第２の実施形態に係る光学測定装置のさらに別の変形例を説明する横断面図である。
　本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明の光学測定装置は、例えば試料からの蛍光や反射光を測定して試料中の標的物質の定性分析や定量分析を行うためなどに用いられるものである。標的物質は、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって増幅されて得られ標的核酸であり、大腸菌、タンパク質、色素などであってもよい。
　以下に、本発明の光学測定装置がリアルタイムＰＣＲ装置として構成された実施形態について説明する。
〔第１の実施形態〕
　第１の実施形態に係るリアルタイムＰＣＲ装置１００は、試料が標的核酸を含み、リアルタイムＰＣＲによって増幅された標的核酸に標識される蛍光レポーター色素（蛍光色素）から放出される蛍光を測定するものである。
　このリアルタイムＰＣＲ装置１００は、図１～図６に示されるように、試料が収容された試料容器Ｗが配置される試料部１１０と、試料部１１０に励起光を入射させる２種の光源１２１，１２２およびこの試料部１１０に入射された励起光によって励起されて得られる蛍光を受光する受光素子１２５を有する光学系１２０と、光学系１２０に係る光路において光を通過させる絞り孔が形成された遮光壁１３０とを有する。
　本実施形態に係るリアルタイムＰＣＲ装置１００においては、試料部１１０および光学系１２０は、互いに一対一に対応しており、この試料部１１０および光学系１２０の組が複数（本実施形態においては２列１６組）、備えられている。
　複数の試料部１１０およびこれに対応する複数の光学系１２０は、リアルタイムＰＣＲ装置１００の装置本体１０１の上部に設けられた試料配置領域Ｒに規則的に配置され、装置本体１０１の下部には、試料容器Ｗ内に収容された試料の温度調整をする加熱手段（図示せず）と、加熱された試料容器Ｗを循環冷却風によって急速に冷却するヒートシンク１４１および冷却用ファン１４２を有する冷却手段１４０とが備えられている。加熱手段としては、従来のＰＣＲ用サーマルサイクラーに一般的に使用される公知の温度調節手段を使用することができる。
　また、リアルタイムＰＣＲ装置１００には、図示されていないが、後述する枠体１０３および天面１０２とともに試料配置領域Ｒを閉塞可能な蓋部材が備えられている。
　光学系１２０は、試料部１１０に入射させる入射光を出射させるものであって、第１の光源１２１および第２の光源１２２の２種を有する。第１の光源１２１は赤色ＬＥＤ素子、緑色ＬＥＤ素子及び青色ＬＥＤ素子を有するフルカラーＬＥＤチップよりなり、第２の光源１２２は、黄緑色ＬＥＤ素子からなる黄緑色ＬＥＤチップまたは緑色ＬＥＤ素子からなる緑色ＬＥＤチップよりなる。第１および第２の光源１２１，１２２は、一方を単独で用いることもでき、両方を組み合わせて用いることもできる。
　受光素子１２５は、試料部１１０から出射される出射光を受光するものであって、受光素子１２５としては、フォトダイオードや光電子増倍管（ＰＭＴ：フォトマルチプライヤー）といった、特定の光を電流に変換できる素子を使用することができる。このような受光素子１２５によって、試料容器Ｗ内の蛍光レポーター色素から生じた蛍光を蛍光信号として検出することができる。
　光学系１２０には、光源１２１，１２２および受光素子１２５の他に、任意に、ダイクロイックミラーや集光レンズ、迷光吸収部材などが備えられていてもよい。
　光学系１２０は、後述の遮光壁１３０を介して試料部１１０に対して反対側に配置されており、すなわち、光源１２１、１２２と受光素子１２５とが、遮光壁１３０の同一側に配置されている。
　試料容器Ｗは、内部に試料（標的核酸サンプルや蛍光レポーター色素、反応の進行のために必要な試薬等）を保持するとともに反応場も兼ねており、所定の反応に影響を与えず、かつ、試料容器Ｗ内部に励起光を到達させることができ、さらに、加熱手段によって加熱された場合であっても変形を生じない容器が好ましく使用される。例えば、試料容器Ｗとしては、ＰＣＲ用途に使用される一般的な蓋付きのポリプロピレン製のチューブを使用することができる。
　試料容器Ｗは、その複数（８つ）が同じピッチで並列に配置された８連のものとして構成されている。本実施形態のリアルタイムＰＣＲ装置１００においては、８連の試料容器Ｗが平行に２列、対応して２列に配置された試料部１１０の各々に挿入可能とされている。
　試料部１１０には、試料容器Ｗを保持する有底筒状の容器ホルダー１１１が備えられている。容器ホルダー１１１は、少なくとも筒状部を有していればよく、有底筒状のものに限定されず、試料容器Ｗの側周面のみに接触して保持する筒状のものであってもよい。容器ホルダー１１１は、２列に配置された試料部１１０の各々に形成され、全ての容器ホルダー１１１が試料容器Ｗの挿入方向と垂直な水平方向に伸びる板状フィン１１３に一体的に連続して形成されており、１つのフィン付き容器ホルダー部材１１５として、後述する枠体１０３内に収容された状態でリアルタイムＰＣＲ装置１００に組み込まれている。
　容器ホルダー１１１の内周面は、試料容器Ｗの外周における被保持部分に沿った形状とされ、具体的には、底部（図５において下方）に向かって小径となるテーパ状に形成されており、試料容器Ｗが上方から下方に挿入可能とされている。容器ホルダー１１１には、第１の光源１２１から試料部１１０に至る光路Ｌ１、第２の光源１２２から試料部１１０に至る光路Ｌ２および試料部１１０から受光素子１２５に至る光路Ｌ３に対応して、これらの光路Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３の光を通過させる１つの窓孔１１２が形成されている。本実施形態に係るリアルタイムＰＣＲ装置１００においては、光路Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が直線光路なので、窓孔１１２は第１および第２の光源１２１，１２２並びに受光素子１２５と対向する位置に形成されている。容器ホルダー１１１の窓孔は、３つの光路Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３のそれぞれに対応するよう、互いに独立して形成されていてもよい。
　容器ホルダー１１１は、窓孔１１２以外の全周が所定の高さまで試料容器Ｗと接触する状態とされている。また、容器ホルダー１１１は、断熱材からなるものであってもよく、熱伝達率の高い金属製のものであってもよい。
　窓孔１１２は、光路Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３の光の通過を阻害しない形状であればよく、本実施形態においては横（外周に沿った長さ）が２．０ｍｍ、縦が１．５ｍｍの楕円形である。
　遮光壁１３０は、板状のものであって、一連の試料容器Ｗが保持される一列に並んだ試料部１１０（一連の試料部１１０）とこれらに対応する一列に並んだ光学系１２０（一連の光学系１２０）との間に介在されるように配置される。本実施形態においては、上列（図２において上列）の一連の試料部１１０および下列（図２において下列）の一連の試料部１１０のそれぞれに対して、合計２枚の遮光壁１３０が互いに平行に、装置本体１０１の上面である水平な天面１０２に垂設されている。そして、遮光壁１３０には、第１の光源１２１から試料部１１０に至る光路Ｌ１、第２の光源１２２から試料部１１０に至る光路Ｌ２、および、試料部１１０から受光素子１２５に至る光路Ｌ３上に、光路Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３のそれぞれに対応して光を通過させる３つの絞り孔１３１，１３２，１３３が互いに独立して設けられている。３つの絞り孔１３１，１３２，１３３は、各光学系１２０に対応してそれぞれ設けられている。
　本実施形態においては、２枚の遮光壁１３０に加えてこれらの両端同士が同じ材質の材料によって連続する側壁１３７が設けられ、全体として矩形筒状の枠体１０３とされて、この枠体１０３が、試料配置領域Ｒを囲うよう配置されている。また、一連の光学系１２０は、共通の回路基板１２９（図５参照）に実装されている。すなわち、装置本体１０１の天面１０２上において、枠体１０３内にフィン付き容器ホルダー部材１１５が収容されてすべての試料部１１０が枠体１０３の内側に配置されるとともに、枠体１０３の外側において遮光壁１３０に沿って回路基板１２９が配置され、これにより、対応する試料部１１０と光学系１２０との間に、遮光壁１３０が介在される状態とされている。、
　遮光壁１３０および側壁１３７、すなわち枠体１０３は、光吸収性を有する材料より形成することができる。光吸収性を有する材料は、例えばカーボンブラックやカーボンナノチューブなどの黒色の粉末を含有する材料が挙げられる。また、枠体１０３は断熱材からなるものとすることができる。
　枠体１０３内の上部には、フィン付き容器ホルダー部材１１５上に容器ホルダー１１１との間に適宜の距離が形成されるようスペーサ（図示せず）を介して、１枚のシェードプレート１１６が配置されており、シェードプレート１１６には、各容器ホルダー１１１と対応する位置に、試料容器Ｗを挿入して保持可能な保持孔１１７が各々形成されている。シェードプレート１１６は、例えば光吸収性や断熱性を有する材料より形成することができる。
　第１の光源１２１に係る光路Ｌ１の光軸に沿った光路長、第２の光源１２２に係る光路Ｌ２の光軸に沿った光路長、および受光素子１２５に係る光路Ｌ３の光軸に沿った光路長は、いずれも例えば５．０～７．０ｍｍである。
　また、遮光壁１３０の光源１２１，１２２に対応する絞り孔１３１，１３２の形状の一例は、横が０．６ｍｍ、縦が０．３ｍｍの楕円形、遮光壁１３０の絞り孔１３１は横が０．８ｍｍ、縦が０．６ｍｍの楕円形である。
　試料部１１０から受光素子１２５に至る光路Ｌ３上には、図７に示すように、試料部１１０から出射される蛍光の波長帯域を制限する分光フィルター１５５が着脱可能に設けられている。具体的には、一連の試料容器Ｗが保持される一連の試料部１１０の各々に対応する複数（８つ）の分光フィルター１５５が組み込まれた１つのフィルターユニット１５０が、一連の試料部１１０と遮光壁１３０との間における天面１０２に凹んだ状態に形成されたフィルターユニット装着用凹部１５８に上方から挿入することによって遮光壁１３０と平行に垂立するように装着される。遮光壁１３０とフィルターユニット１５０とは、ごく近接して設けられることが好ましい。フィルターユニット１５０は、天面１０２に対して着脱可能とされており、装着時には、固定ねじ等の別途の固定具を要さず、フィルターユニット装着用凹部１５８に差し込むのみで装着状態を維持することができる。なお、図７は、装着されたときに試料部１１０から視認される方向から見たフィルターユニット１５０を示している。
　フィルターユニット１５０には、第１の光源１２１から試料部１１０に至る光路Ｌ１、第２の光源１２２から試料部１１０に至る光路Ｌ２、および、試料部１１０から受光素子１２５に至る光路Ｌ３上に、光路Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３のそれぞれに対応して光を通過させる３つの通過孔１５１，１５２，１５３が、遮光壁１３０の３つの絞り孔１３１，１３２，１３３にそれぞれ対応する状態で、互いに独立して設けられている。３つの通過孔１５１，１５２，１５３は、各光学系１２０に対応してそれぞれ設けられるとともに、その大きさは、遮光壁１３０の３つの絞り孔１３１，１３２，１３３にそれぞれ対応した大きさおよび形状、具体的には同じ大きさおよび形状とされる。
　フィルターユニット１５０には、試料部１１０から出射される蛍光の波長帯域を制限する分光フィルター１５５のみではなく、第１の光源１２１や第２の光源１２２から出射される光の波長帯域を制限するフィルターがさらに設けられていてもよい。本実施形態に係るリアルタイムＰＣＲ装置１００においては、光路Ｌ３に係る通過孔１５３を塞ぐよう試料部１１０から出射される蛍光の波長帯域を制限する分光フィルター１５５が設けられ、その他の光路Ｌ１，Ｌ２に係る通過孔１５１，１５２にはフィルターは設けられずに貫通孔のままとされている。なお、フィルターユニット１５０は、測定に係る光の波長帯域を制限する必要がなければ装着する必要はなく、また、通過孔１５１，１５２，１５３のすべてにフィルターが設けられずに貫通孔のままの状態で装着していてもよい。
　リアルタイムＰＣＲ装置１００には、さらに、用いる蛍光レポーター色素の種類に基づいて測定に係るプログラムを選択する制御部や、受光素子１２５によって検出された蛍光信号の演算処理が行われる演算処理部が設けられていてもよい。或いは、リアルタイムＰＣＲ装置１００は、外部機器からの信号に従って、演算処理やプログラムの選択が行われるよう構成されたものであってもよい。
　制御部においては、試料容器Ｗに添加される蛍光レポーター色素の種類に基づいて、光学系１２０における光源１２１，１２２から出射される励起光の波長と、受光素子１２５において受光される蛍光の波長が適切に選択される。光源１２１，１２２においては、第１の光源１２１を構成するフルカラーＬＥＤチップにおける各色のＬＥＤ素子および第２の光源１２２を構成する黄緑色ＬＥＤチップを構成する黄緑色ＬＥＤ素子ごとに点灯／消灯を選択することや出力を変更することなどの動作制御、さらにはフィルターユニット１５０においてスペクトル幅を限定するバンドパスフィルターなどを励起用フィルターとして用いることによって、光源１２１，１２２から出射される励起光の波長を選択することができる。また、当該蛍光レポーター色素の種類に基づいて、分光フィルター１５５の制限する波長帯域を選択することにより、受光素子１２５において受光する蛍光の波長が適切に選択される。
　本実施形態に係るリアルタイムＰＣＲ装置１００において、適用可能な蛍光レポーター色素としては、例えば、６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ（登録商標））、６－ｃａｒｂｏｘｙ－Ｘ－ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＲＯＸ（登録商標））、Ｃｙａｎｉｎｅ系色素（Ｃｙ５）および４，７，２’，４’，５’，７’－ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ－６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＨＥＸ（登録商標））等が挙げられる。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いることもできる。
　以上のようなリアルタイムＰＣＲ装置１００においては、次のようにリアルタイムＰＣＲが実行される。すなわち、標的核酸や蛍光レポーター色素等の必要な試料が収容された試料容器Ｗの複数（最大試料数１６）を、各々の試料部１１０の容器ホルダー１１１に挿入し、試料の種類に応じて温度制御の設定を行ってから核酸増幅を開始させ、そして、制御部によって選択されたプログラムに従った励起光によって得られる蛍光について継続的に測定が行われ、標的核酸の増幅核酸量が検出される。用いる蛍光レポーター色素によっても異なるが、リアルタイムＰＣＲに要する時間は３０～６０分間程度である。
　リアルタイムＰＣＲ装置１００における蛍光の測定は、次のように行われる。すなわち、図６に示すように、光源１２１，１２２から選択された波長の励起光が前方に水平方向に出射し、光路Ｌ１および／または光路Ｌ２に沿って遮光壁１３０の絞り孔１３１，１３２および容器ホルダー１１１の窓孔１１２によって絞られながら、容器ホルダー１１１に受容された試料容器Ｗ内の試料に照射される。試料容器Ｗ内の試料に照射された励起光によって蛍光レポーター色素が励起されて蛍光が放出され、光路Ｌ３に沿って容器ホルダー１１１の窓孔１１２および遮光壁１３０の絞り孔１３３によって絞られながら、さらに必要に応じてフィルターユニット１５０の分光フィルター１５５によってその波長帯域が制限されながら、受光素子１２５に至り、その蛍光が蛍光信号として検出される。
〔第２の実施形態〕
　図８～図１５は、本発明の第２の実施形態に係る光学測定装置の構成の一例を示す説明図である。
　第２の実施形態に係るリアルタイムＰＣＲ装置２００は、第１の実施形態に係るリアルタイムＰＣＲ装置１００において、フィルターユニット１５０の代わりに光路形成ユニット２５０が設けられ、容器ホルダー２１１の窓孔２１２の形状が異なり、さらに遮光壁２３０の絞り孔の数や形状が異なることの他は、同様の構成を有するものである。図８～図１５において、第１の実施形態に係るリアルタイムＰＣＲ装置１００と同じ構成部材には、図１～図７において１００番台とされた符号を２００番台として付番してある。なお、図８において、２７１は底板であり、２７２は留め部材である。
　図１０に示されるように、遮光壁２３０には、第１の光源２２１から試料部２１０に至る光路Ｌ４、および、第２の光源２２２から試料部２１０に至る光路Ｌ５を含む光路上に、この光路に対応して光路Ｌ４に係る光および光路Ｌ５に係る光を通過させる１つの絞り孔２３１と、試料部２１０から受光素子２２５に至る光路Ｌ６上に、この光路Ｌ６に対応して光路Ｌ６に係る光を通過させる１つの絞り孔２３２とが、互いに独立して設けられている。２つの絞り孔２３１，２３２は、各光学系２２０に対応して各々設けられている。また、図１５に示されるように、枠体２０３の遮光壁２３０の内側には、隣接する試料部２１０に係る光路間の迷光を防ぐ状態に突出部２３４が内方に突出して形成されている。
　また、図１１および図１５に示されるように、光路形成ユニット２５０には、第１の光源２２１から試料部２１０に至る光路Ｌ４、第２の光源２２２から試料部２１０に至る光路Ｌ５、および、試料部２１０から受光素子２２５に至る光路Ｌ６上に、光路Ｌ４および光路Ｌ５に対応して光を通過させる１つの通過孔２５１と、光路Ｌ６に対応して光を通過させる１つの通過孔２５２が、遮光壁２３０の２つの絞り孔２３１，２３２にそれぞれ対応する状態で、互いに独立して設けられている。これらの通過孔２５１，２５２は、各光学系２２０に対応して各々設けられている。通過孔２５１，２５２の大きさは、遮光壁２３０の２つの絞り孔２３１，２３２にそれぞれ対応した大きさおよび形状とされる。
　さらに、図１２に示されるように、容器ホルダー２１１には、第１の光源２２１から試料部２１０に至る光路Ｌ４、第２の光源２２２から試料部２１０に至る光路Ｌ５および試料部２１０から受光素子２２５に至る光路Ｌ６に対応して、これらの光路Ｌ４，Ｌ５，Ｌ６の光を通過させる１つの窓孔２１２が形成されている。第２の実施形態に係るリアルタイムＰＣＲ装置２００においては、図１５に示されるように、光路Ｌ４，Ｌ５が直線光路であって、光路Ｌ６がライドガイド２６０を用いた可反射光路とされているので、窓孔２１２は第１および第２の光源２２１，２２２と対向するとともに、光路Ｌ６に係るライトガイド２６０の光入射面２６１と対向するよう連続的に開いている。窓孔２１２は、具体的には９０～１２０°程度の角度方向に開放されるよう形成されている。
　光路形成ユニット２５０は、図１３に示されるように、試料容器Ｗを半収容可能に容器ホルダー２１１の外周に窓孔２１２を覆う内方（図１３において左手前方向）に開く半筒状部２５７と、半筒状部２５７に連続して遮光壁２３０の内側に接近するようこの半筒状部２５７から外方（図１３において右奥方向）に伸びる光路形成部２５８とを有する。光路形成ユニット２５０の通過孔２５２内部には、試料部２１０から出射された光を受光素子２２５に導光するライトガイド２６０が嵌め込まれている。半筒状部２５７には、光路Ｌ６に係る光の入射光をライトガイド２６０に導入するための開口２５９が設けられている。ライトガイド２６０は、光入射面２６１および光入射面２６２以外の面は、全反射する構造を有する。
　光路形成ユニット２５０は、フィン付き容器ホルダー部材２１５の各々の容器ホルダー２１１が当該光路形成ユニット２５０の各半筒状部２５７内に収容された状態で、ともに枠体２０３内に収容され、回路基板２２９の外方からスクリューねじ２７３によってねじ止めされて固定される。これにより、光路形成ユニット２５０の通過孔２５２内部に嵌め込まれたライトガイド２６０が、その光入射面２６１が半筒状部２５７の開口２５９を介して容器ホルダー２１１の窓孔２１２に対向するとともに、光入射面２６２が受光素子２２５に対応する遮光壁２３０の絞り孔２３２と対向する状態とされる。
　光路形成ユニット２５０の通過孔２５１，２５２の内部には、図１６～図１８に示すように、各種のフィルターを設置することができる。具体的には、第１の光源２２１から試料部２１０に至る光路Ｌ４および第２の光源２２２から試料部２１０に至る光路Ｌ５に対しては、光源２２１，２２２から出射される光の波長帯域を制限して所期の波長の励起光のみを通過させる分光フィルター２５５を設置することができ、また、試料部２１０から受光素子２２５に至る光路Ｌ６に対しては、蛍光の波長帯域を制限する分光フィルター２５６を設置することができる。なお、測定に係る光の波長帯域を制限する必要がなければ、光路形成ユニット２５０の通過孔２５１，２５２の内部に分光フィルター２５５，２５６を設置する必要はない。
　これらの分光フィルター２５５，２５６の設置位置は、自由に設定することができる。例えば、図１６に示されるように、光路形成ユニット２５０の光路Ｌ４，Ｌ５に係る通過孔２５１内の遮光壁２３０側に励起光に係る分光フィルター２５５を設置するとともに、光路Ｌ６に係る通過孔２５２内の遮光壁２３０側に蛍光に係る分光フィルター２５６を設置した構成とすることができる。また例えば、図１７に示されるように、光路形成ユニット２５０の光路Ｌ４，Ｌ５に係る通過孔２５１内の遮光壁２３０側に励起光に係る分光フィルター２５５を設置するとともに、光路Ｌ６に係る通過孔２５２内の開口２５９に蛍光に係る分光フィルター２５６を設置した構成とすることもできる。さらに例えば、図１８に示されるように、光路形成ユニット２５０の光路Ｌ４，Ｌ５に係る通過孔２５１には分光フィルター２５５を設置せず、光路Ｌ６に係る通過孔２５２内の遮光壁２３０側に蛍光に係る分光フィルター２５６を設置した構成とすることもできる。
　分光フィルター２５５，２５６は、予め光路形成ユニット２５０に組み込むことができ、光路形成ユニット２５０が着脱可能であるので、光路形成ユニット２５０の装着または脱離により、複数の試料部２１０に対応するフィルター２５５，２５６を一括して装着または脱離することができて入射光や出射光の波長の設定を容易に変更することができる。
　以上のようなリアルタイムＰＣＲ装置２００における蛍光の測定は、次のように行われる。すなわち、図１５に示すように、光源２２１，２２２から選択された波長の励起光が前方に水平方向に出射し、光路Ｌ４および／または光路Ｌ５に沿って遮光壁２３０の絞り孔２３１および容器ホルダー２１１の窓孔２１２によって絞られながら、容器ホルダー２１１に受容された試料容器Ｗ内の試料に照射される。試料容器Ｗ内の試料に照射された励起光によって蛍光レポーター色素が励起されて蛍光が放出され、容器ホルダー２１１の窓孔２１２から出射された光がライトガイド２６０の光入射面２６１に入射し、光路Ｌ６に沿ってライトガイド２６０内を反射されながら導光されて光入射面２６２から出射し、光入射面２６２から出射された光が遮光壁２３０の絞り孔２３２によって絞られながら受光素子２２５に至り、その蛍光が蛍光信号として検出される。
　以上、本発明の実施形態を詳述したが、本発明は上記第１の実施形態および第２の実施形態に限定されるものではなく、請求の範囲に記載された本発明を逸脱することなく種々の設計変更を行なうことが可能である。
　例えば、本発明の光学測定装置は、リアルタムＰＣＲ装置のみに限定されず、ＦＩＳＨ方法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法（ｌｉｇａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤ方法（Ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、競合的ハイブリダイゼーション方法（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）などの各種の蛍光レポーター色素を用いる増幅核酸量の検出方法を行う装置に適用することができ、さらに、試料に光を照射して出射される光を高い感度で検出する装置であれば、例えば反射光を測定する装置にも適用することができる。
１００，２００　リアルタイムＰＣＲ装置
１０１　装置本体
１０２，２０２　天面
１０３，２０３　枠体
１１０，２１０　試料部
１１１，２１１　容器ホルダー
１１２，２１２　窓孔
１１３，２１３　板状フィン
１１５，２１５　フィン付き容器ホルダー部材
１１６，２１６　シェードプレート
１１７，２１７　保持孔
１２０，２２０　光学系
１２１，１２２，２２１，２２２　光源
１２５，２２５　受光素子
１２９，２２９　回路基板
１３０，２３０　遮光壁
１３１，１３２，１３３，２３１，２３２　絞り孔
２３４　突出部
１３７，２３７　側壁
１４０　冷却手段
１４１　ヒートシンク
１４２　冷却用ファン
１５０　フィルターユニット
１５１，１５２，１５３，２５１，２５２　通過孔
１５５，２５５，２５６　分光フィルター
１５８　フィルターユニット装着用凹部
２５０　光路形成ユニット
２５７　半筒状部
２５８　光路形成部
２５９　開口
２６０　ライトガイド
２６１　光入射面
２６２　光出射面
２７１　底板
２７２　留め部材
２７３　スクリューねじ
Ｒ　試料配置領域
Ｗ　試料容器
 
 

Claims (8)

  1. 　試料が収容された試料容器が配置される試料部と、
    　前記試料部に光を入射させる光源と、
    　前記試料部から出射される光を受光する受光素子とを有する光学測定装置であって、
    　前記光源から前記試料部に至る光路、および／または、前記試料部から前記光学素子に至る光路上に、前記光路に対応して光を通過させる絞り孔が形成された遮光壁を有することを特徴とする光学測定装置。
  2. 　前記試料容器を保持する筒状の容器ホルダーを有し、
    　前記容器ホルダーには、前記光源に係る前記光路、および／または、前記光学素子に係る前記光路に対応して光を通過させる窓孔が形成されていることを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。
  3. 　前記光源が複数設けられ、
    　複数の前記光源が、赤色ＬＥＤ素子、緑色ＬＥＤ素子及び青色ＬＥＤ素子を有するフルカラーＬＥＤチップ、および、黄緑色ＬＥＤチップの２つを少なくとも含むことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の光学測定装置。
  4. 　前記光源が複数設けられ、
    　前記絞り孔が、複数の前記光源および前記受光素子に係る前記光路ごとに独立して設けられていることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の光学測定装置。
  5. 　前記光源に係る前記光路、および／または、前記光学素子に係る前記光路上に、光の波長帯域を制限するフィルターを着脱可能に備えることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の光学測定装置。
  6. 　前記試料部が複数設けられ、
    　複数の前記試料部の各々に対応する前記フィルターの複数が組み込まれたフィルターユニットを着脱可能に備えることを特徴とする請求項５に記載の光学測定装置。
  7. 　前記受光素子がフォトダイオードであることを特徴とする請求項１乃至請求項６のいずれかに記載の光学測定装置。
  8. 　前記試料が標的核酸を含み、リアルタイムＰＣＲによって増幅された標的核酸に標識される蛍光色素からの蛍光を測定するリアルタイムＰＣＲ装置であることを特徴とすることを特徴とする請求項１乃至請求項７のいずれかに記載の光学測定装置。
     
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