BR112017016814B1 - método e sistema para calibrar instrumentos biológicos, e mídia de armazenamento legível por computador não transitória - Google Patents

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Abstract

Em uma modalidade exemplificadora, é fornecido um método para calibração de um instrumento. O instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação. O método inclui a realização de uma calibração da região de interesse (ROI) para determinar as posições do local de reação em uma imagem. O método inclui ainda a realização de uma calibração com corante puro para determinar a contribuição de um corante fluorescente utilizado em cada local de reação comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente. O método inclui ainda a realização de uma calibração de normalização de instrumento para determinar um fator de normalização de filtro. O método inclui a realização de uma validação de RNase P para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades diferentes de amostra.

Description

ESTADO DA TÉCNICA
[001] Em geral, há uma crescente necessidade de simplificar a instalação e configuração de sistemas de análise biológica para que os operadores possam usar sistemas de análise biológica mais rapidamente e eficientemente para os fins previstos.
[002] A instalação e calibração de instrumentação de laboratório pode ser um processo demorado e caro. Em muitos casos, os engenheiros do fornecedor do instrumento devem estar no local para realizar esses processos. Esse custo é geralmente passado para o usuário. Em alguns casos, os usuários experientes podem calibrar com sucesso instrumentos adequados usando procedimentos de múltiplas etapas. Durante essa calibração, os padrões físicos e as placas com poços podem ser usados em combinação com procedimentos manuais. O processamento de calibração manual e a inspeção de dados são propensos a erros e podem depender de medidas ad hoc ou subjetivas. Embora uma etapa de verificação do sistema final possa fornecer resiliência contra a aceitação de calibrações subótimas, a automação oferece melhor objetividade e uniformidade durante essas atividades.
SUMÁRIO
[003] Em uma modalidade exemplificadora, é fornecido um método para calibração de um instrumento. O instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação. O método inclui a realização de uma calibração da região de interesse (ROI) para determinar as posições do local de reação em uma imagem. O método inclui ainda a realização de uma calibração com corante puro para determinar a contribuição de um corante fluorescente utilizado em cada local de reação comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente. O método inclui ainda a realização de uma calibração de normalização de instrumento para determinar um fator de normalização de filtro. O método inclui a realização de uma validação de RNase P para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades diferentes de amostra.
[004] Em uma outra modalidade exemplificadora, é fornecido uma mídia de armazenamento legível por computador codificada com instruções executáveis por processador para calibração de um instrumento. O instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação. As instruções incluem instruções para realização de uma calibração da região de interesse (ROI) para determinar as posições do local de reação em uma imagem. As instruções incluem instruções para a realização de uma calibração com corante puro para determinar a contribuição de um corante fluorescente usado em cada local de reação, comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente. As instruções ainda incluem instruções para realização de uma calibração de normalização de instrumento para determinar um fator de normalização de filtro. As instruções adicionais incluem instruções para realização de uma validação de RNase P para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades diferentes de amostra.
[005] Em outra modalidade exemplificadora, é fornecido um sistema para calibrar um instrumento. O instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação. O sistema compreende um processador e uma memória, codificados com instruções executáveis por processador. As instruções incluem instruções para realização de uma calibração de região de interesse (ROI) para determinar as posições do local de reação em uma imagem e realizar uma calibração com corante puro para determinar a contribuição de um corante fluorescente usado em cada local de reação comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente. As instruções adicionais incluem a realização de uma calibração de normalização de instrumento para determinar um fator de normalização de filtro e realizar uma validação de RNase P para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades diferentes de amostra.
[006] Em outra modalidade exemplificadora, é fornecido um sistema para calibrar um instrumento. O instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação. O sistema inclui um calibrador de ROI configurado para determinar as posições do local de reação em uma imagem. O sistema inclui um calibrador de corante puro configurado para determinar a contribuição de um corante fluorescente usado em cada local de reação, comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente. O sistema inclui ainda um calibrador de normalização de instrumento configurado para determinar um fator de normalização de filtro. O instrumento inclui um validador de RNase P configurado para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades diferentes de amostra. O sistema inclui ainda um mecanismo de exibição configurado para exibir os resultados da calibração.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[007] A FIG. 1 ilustra um fluxo de trabalho de calibração para um instrumento biológico de acordo com várias modalidades aqui descritas.
[008] A FIG. 2 é um diagrama de blocos que ilustra um instrumento de PCR 200 sobre o qual as modalidades dos presentes ensinamentos podem ser implementadas.
[009] A FIG. 3 representa um sistema óptico exemplificador 300 que pode ser usado para imageamento de acordo com as modalidades aqui descritas.
[010] A FIG. 4 ilustra um sistema de computação exemplificador para implementar várias modalidades aqui descritas.
[011] A FIG. 5 ilustra um sistema de rede distribuído exemplificador de acordo com várias modalidades aqui descritas.
[012] A FIG. 6 ilustra uma sequência de etapas usadas na calibração de instrumentos qPCR.
[013] A FIG. 7 ilustra as regiões de interesse para um recipiente de amostra com 96 poços.
[014] A FIG. 8 é uma imagem de uma placa de calibração com corante FAM que ocupa cada poço de uma placa de calibração com 96 poços.
[015] A FIGS. 9 e 10 representam um exemplo de fluxo de trabalho de acordo com uma modalidade da presente divulgação.
[016] A FIG. 11 A ilustra placas de calibração com configurações quadriculadas (checkerboard) de acordo com uma modalidade da presente divulgação.
[017] A FIG. 11 B é uma imagem de uma placa de calibração de 96 poços quadriculada com 4 corantes usando os corantes FAM, VIC, ROX e SYBR na mesma configuração ilustrada pela placa 1100 na FIG. 11 A.
[018] A FIG. 12A ilustra misturas de corante usados em várias modalidades dos presentes ensinamentos.
[019] A FIG. 12B ilustra corantes puros e combinações de filtros de canais principais para várias modalidades dos presentes ensinamentos.
[020] A FIG. 13 ilustra o % de desvio de misturas de corantes antes da normalização de acordo com várias modalidades dos presentes ensinamentos.
[021] A FIG. 14 ilustra o % de desvio das misturas de corante após a normalização de acordo com várias modalidades dos presentes ensinamentos.
[022] A FIG. 15 ilustra uma vista mais próxima da % de desvio das misturas de corantes após a normalização de acordo com várias modalidades dos presentes ensinamentos.
[023] A FIG. 16 é um fluxograma que descreve um processo de normalização de acordo com várias modalidades dos presentes ensinamentos.
[024] A FIG. 17 ilustra um método exemplificador para validar um instrumento de acordo com várias modalidades aqui descritas.
[025] A FIG. 18 ilustra outro método exemplificador para validação de um instrumento de acordo com várias modalidades aqui descritas.
[026] A FIG. 19 ilustra a determinação de uma pluralidade de limites de fluorescência a partir de dados de amplificação de acordo com várias modalidades aqui descritas.
[027] A FIG. 20 ilustra um sistema para validação de um instrumento de acordo com várias modalidades aqui descritas.
[028] A FIG. 21 ilustra um sistema para calibração de um instrumento de acordo com várias modalidades aqui descritas.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[029] Os sistemas exemplificadores para métodos relacionados com as várias modalidades descritas no presente documento incluem os descritos em Pedido de patente de desenho industrial U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LTOIOOO DES), e Pedido de patente provisório U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01011 PRO), e Pedido de patente provisório U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01023 PRO), e Pedido de patente provisório U.S. número___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01025 PRO), e Pedido de patente provisório U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01028 PRO), e Pedido de patente provisório U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01029 PRO), e Pedido de patente provisório U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01032 PRO), e Pedido de patente provisório U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01033 PRO), todos os quais foram depositados em 6 de fevereiro de 2015 e também são aqui incorporados por referência na sua totalidade.
[030] Para fornecer uma compreensão mais completa da presente invenção, a descrição a seguir apresenta vários detalhes específicos, tais como configurações específicas, parâmetros, exemplos e semelhantes. No entanto, deve-se reconhecer que essa descrição não se destina a limitar o escopo da presente invenção, mas pretende fornecer uma melhor descrição das modalidades exemplificadoras.
[031] Os avanços na calibração dos instrumentos de análise biológica permitem vantajosamente reduzir o erro do operador, reduzir a entrada do operador e reduzir o tempo necessário para calibrar um instrumento de análise biológica, e seus vários componentes, para uma instalação adequada e eficiente.
[032] Como tal, de acordo com várias modalidades os presentes ensinamentos podem incorporar conhecimento especializado em um sistema de calibração e de validação automatizado fornecendo feedback quanto a resolução de problemas e estado de aprovação/reprovação quando uma falha é identificada. Se um instrumento falhar no processo de calibração, um engenheiro em serviço pode ser chamado. Os presentes ensinamentos podem minimizar o custo e o tempo necessário para os procedimentos de instalação e calibração.
[033] Deve-se reconhecer que os métodos e sistemas descritos no presente documento podem ser implementados em vários tipos de sistemas, instrumentos e máquinas, tais como sistemas de análises biológicas. Por exemplo, várias modalidades podem ser implementadas em um instrumento, sistema ou máquina que realiza reações em cadeia da polimerase (PCR) em uma pluralidade de amostras. Embora seja geralmente aplicável para reações em cadeia de polimerase quantitativas (qPCR) em que muitas amostras estão sendo processadas, deve ser reconhecido que qualquer método de PCR adequado pode ser usado de acordo com várias modalidades aqui descritas. Os métodos de PCR adequados incluem, mas não se limitam a, PCR digital, PCR específica de alelo, PCR assimétrica, PCR mediada por ligação, PCR multiplexada, PCR aninhada, qPCR, caminhada do genoma e PCR de ponte, por exemplo. Além disso, como usado aqui, a amplificação pode incluir o uso de um termociclador, amplificação isotérmica, convecção térmica, ciclagem térmica mediada por infravermelho ou amplificação dependente de helicase, por exemplo.
FLUXO DE TRABALHO DE CALIBRAÇÃO GERAL
[034] Os instrumentos biológicos são muitas vezes projetados para produzir dados precisos e confiáveis para os experimentos. A calibração e a manutenção regular dos instrumentos biológicos garantem o funcionamento adequado e ótimo do instrumento, o que pode maximizar a produtividade do usuário, minimizar reparos dispendiosos, abordando possíveis problemas antes de se manifestarem e aumentar a qualidade dos resultados.
[035] De acordo com várias modalidades dos presentes ensinamentos, os métodos de calibração descritos neste documento podem ser realizados separadamente ou em qualquer combinação em conjunto. Além disso, os métodos de calibração aqui descritos podem ser realizados após a fabricação para a calibração inicial ou qualquer momento após a instalação inicial e uso. Os métodos de calibração aqui descritos podem ser realizados semanalmente, mensalmente, semestralmente, anualmente ou, conforme necessário, por exemplo.
[036] De acordo com várias modalidades descritas nos presentes ensinamentos, os métodos de calibração, tais como calibração da região de interesse (ROI), calibração de fundo, calibração de uniformidade, calibração com corante puro, normalização de instrumento são usados para determinar a localização e a intensidade de sinais fluorescentes em cada leitura, o corante associado a cada sinal fluorescente e a significância do sinal. Além disso, de acordo com várias modalidades, a correção automática do corante, a calibração automática do fundo e a detecção de placas podem ser realizadas para refinar ainda mais a detecção e leituras de corantes e determinar erros. A validação do desempenho adequado do instrumento também pode ser realizada automaticamente pelo sistema usando a validação de RNase P.
[037] A FIG. 1 ilustra um fluxo de trabalho de calibração exemplificador 100 que pode ser realizado em um instrumento de acordo com várias modalidades aqui descritas. Deve-se reconhecer que o fluxo de trabalho de calibração 100 é um exemplo e que os métodos de calibração aqui descritos podem ser realizados separadamente, ou como um subconjunto, em qualquer combinação e ordem.
[038] Na etapa 102, uma calibração da ROI é realizada. Geralmente a calibração da ROI produzirá informações que definem as posições das poços no campo de visão do detector. Os presentes ensinamentos podem automatizar a calibração da ROI através da minimização ou eliminação da interação do usuário. Várias modalidades podem automatizar o processo, fornecendo métodos e sistemas que determinam o tempo de exposição ideal por filtro usando a análise de histograma e um padrão de busca binário. A calibração da ROI, de acordo com várias modalidades aqui descritas, identifica os poços em uma imagem de forma mais precisa e com menos erros que os métodos anteriores. Os métodos e sistemas de calibração da ROI, de acordo com várias modalidades, são descritos adicionalmente abaixo.
[039] Na etapa 104, um fundo de calibração é realizado. Muitas vezes, um detector irá ler uma certa quantidade de sinal mesmo na ausência de uma amostra que emite um sinal detectável. A contabilização deste sinal de fundo pode ser importante, pois o sinal de fundo pode ser subtraído de uma leitura de sinal de amostra para obter uma medida mais precisa do sinal da amostra. A calibração de fundo pode ser realizada usando uma placa de água para determinar o sinal de fundo do instrumento para cada combinação de filtro/poço. A etapa pode ser automatizada para minimizar ou eliminar a interação do usuário. A automação pode ser fornecida, a qual irá testar se a placa correta foi usada para calibração de fundo. Por exemplo, a etapa 104 pode observar o nível do sinal e eliminar a possibilidade de usar uma placa de teste incorreta, como a placa de teste de emissão de sinal forte usada na calibração da ROI. Se o nível do sinal exceder o nível esperado do fundo, o usuário pode ser alertado para inserir a placa de teste apropriada. Além disso, esta etapa pode testar a contaminação de uma ou mais poços na placa de teste, verificando a ampla divergência dos níveis de sinal e, se assim for verificado, desencadear um aviso que indique a possível existência de poços sujas ou contaminadas. Os poços contaminados podem fazer com que um nível de sinal de fundo inadequado seja subtraído do nível do sinal de amostra.
[040] Na etapa 106, uma calibração de uniformidade é realizada. Em alguns casos, as variações na geometria da placa (urdidura, espessura) podem fazer com que as leituras de intensidade variem em uma placa, apesar da presença de quantidades iguais de corante fluorescente em cada poço. As calibrações de uniformidade podem calibrar o instrumento usando uma placa de múltiplos corantes para que as variações de intensidade devido às variações da placa possam ser corrigidas. A etapa 106 pode ser automatizada e reduzir ou eliminar a interação do usuário. Partes desta automação podem incluir a detecção do uso da placa de calibração errada e a detecção e ajustes para poços vazios ou contaminadas na placa de calibração.
[041] Na etapa 108, uma calibração com corante puro é realizada. A calibração com corantes fluorescentes usados em um instrumento qPCR permite que o software do instrumento use os dados de calibração coletados dos padrões de corantes para caracterizar e distinguir a contribuição individual de cada corante na fluorescência total coletada pelo instrumento. De acordo com várias modalidades dos presentes ensinamentos, após um teste de amostra, o software do instrumento recebe dados na forma de um sinal de espectro bruto para cada leitura. O software determina a contribuição de cada um dos corantes fluorescentes utilizados em cada local de reação, comparando os espectros brutos, contribuídos por cada corante, com os dados de calibração de espectros puros. Quando um usuário salva um experimento após a análise, o software do instrumento armazena os espectros puros juntamente com os dados de fluorescência coletados para esse experimento, bem como a contribuição de cada corante de fluorescência por poço. O método é descrito adicionalmente abaixo. O uso da calibração com corante puro, de acordo com várias modalidades dos presentes ensinamentos, menos placas de calibração pura podem ser usadas, economizando um custo de usuário e eliminando fontes de erros na calibração.
[042] Na etapa 110, uma calibração de normalização do instrumento é realizada. Uma dificuldade comumente enfrentada é a incapacidade dos pesquisadores de comparar facilmente os resultados dos experimentos realizados em múltiplos instrumentos. As variações físicas nos parâmetros de componentes como fontes de luz, elementos ópticos e detectores de fluorescência, por exemplo, podem resultar em variação nos resultados das análises quando são amostras biológicas idênticas. Existe, portanto, uma necessidade contínua de métodos e instrumentos para auxiliar na minimização das variações nos componentes.
[043] Em qPCR, as curvas de amplificação são muitas vezes determinadas através da normalização do sinal do corante repórter para um corante de referência passiva na mesma solução. Essa normalização pode ser relatada como valores de fluorescência normalizados marcados ou "Rn". A normalização de referência passiva permite valores de Rn consistentes, mesmo que o nível geral do sinal seja afetado pelo volume do líquido ou pela intensidade geral da iluminação. A normalização de referência passiva, no entanto, pode não funcionar corretamente se a razão de sinal entre o corante repórter e o corante de referência varia, como as diferenças de instrumento para instrumento no espectro da iluminação. De acordo com as várias modalidades aqui descritas, a calibração da normalização do instrumento inclui ler a fluorescência da mistura de corante para obter um "fator de normalização" para ajustar os valores de Rn, o que requer uma despesa adicional.
[044] Na etapa 112, uma validação de RNase P é realizada. Ao realizar um teste de validação verifica se um instrumento está funcionando corretamente. Por exemplo, a validação de RNase P determina se um instrumento pode distinguir com precisão entre duas quantidades diferentes de amostra. Anteriormente, uma validação de RNase P foi realizada manualmente usando uma curva padrão, com o usuário fazendo os cálculos estatísticos para validar o instrumento. De acordo com várias modalidades descritas nos presentes ensinamentos, a validação de RNase P pode ser realizada automaticamente pelo sistema sem usar uma curva padrão. Várias modalidades de uma validação de RNase P são descritas adicionalmente abaixo.
[045] A FIG. 21 ilustra um sistema para calibração de um instrumento de acordo com várias modalidades aqui descritas. O sistema 2100 inclui o calibrador de ROI 2102, o calibrador de corante puro 2104, o calibrador de normalização do instrumento 2108, o validador de RNase P 2110 e o mecanismo de exibição/GUI 2106. O calibrador de ROI 2102 é configurado para determinar as posições do local de reação em uma imagem. Realizar uma calibração com corante puro para determinar a contribuição de um corante fluorescente usado em cada local de reação comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente; O calibrador de normalização de instrumento 2108 é configurado para determinar um fator de normalização de filtro. O validador de RNase P 2110 é configurado para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades diferentes de amostra. O mecanismo de exibição 2106 é configurado para exibir os resultados da calibração.
[046] Os presentes ensinamentos são descritos com referência aos instrumentos de Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (RT-PCR). Em particular, uma modalidade dos presentes ensinamentos é implementada para os instrumentos de RT-PCR que utilizam imagem óptica de placas com poço. Tais instrumentos podem ser capazes de medir simultaneamente os sinais de uma pluralidade de amostras ou pontos de teste para fins analíticos e muitas vezes requerem calibração, incluindo, mas não se limitando a processos envolvendo: identificação de ROI (Regiões de Interesse), determinação de sinal de fundo, uniformidade e calibração espectral de corante puro para análise de múltiplos componentes. A calibração também pode envolver uma reação de validação de RT- PCR usando uma placa de amostra conhecida com um resultado esperado. Um versado na técnica apreciará que, embora os presentes ensinamentos tenham sido descritos com exemplos relativos aos instrumentos de RT-PCR, seus princípios são amplamente aplicáveis a outras formas de instrumentação de laboratório que podem exigir calibração e verificação para garantir precisão e/ou otimização dos resultados.
INSTRUMENTOS DE PCR
[047] Como mencionado acima, um instrumento que pode ser utilizado de acordo com várias modalidades, mas não se limitando ao mesmo, é um instrumento de reação em cadeia da polimerase (PCR). A FIG.A FIG. 2 é um diagrama de blocos que ilustra um instrumento de PCR 200 sobre o qual as modalidades dos presentes ensinamentos podem ser implementadas. O instrumento de PCR 200 pode incluir uma cobertura aquecida 210 que é colocada sobre uma pluralidade de amostras 212 contidas em um substrato (não mostrado). Em várias modalidades, um substrato pode ser uma lâmina de vidro ou plástico com uma pluralidade de regiões de amostra, cujas regiões de amostra têm uma cobertura entre as regiões de amostra e a cobertura aquecida 210. Alguns exemplos de um substrato podem incluir, mas não se limitam a, uma placa de múltiplos poços, como uma placa de microtitulação padrão de 96 poços, de 384 poços ou uma microplaca, ou um suporte substancialmente plano, como uma lâmina de vidro ou plástico. Os locais de reação em várias modalidades de um substrato podem incluir depressões, endentações, nervuras e combinações dos mesmos, padronizadas em matrizes regulares ou irregulares formadas na superfície do substrato. Várias modalidades de instrumentos de PCR incluem um bloco de amostra 214, elementos para aquecimento e resfriamento 216, um trocador de calor 218, sistema de controle 220 e interface de usuário 222. Várias modalidades de um conjunto de bloco térmico de acordo com os presentes ensinamentos compreendem os componentes 214-218 de o instrumento de PCR 200 da FIG. 2.
[048] O Instrumento de PCR em tempo real 200 tem um sistema óptico 224. Na FIG. 2, um sistema óptico 224 pode ter uma fonte de iluminação (não mostrada) que emite energia eletromagnética, um sensor óptico, detector ou imagem (não mostrado), para receber energia eletromagnética das amostras 212 em um substrato e elementos ópticos 240 usados para guiar a energia eletromagnética de cada amostra de DNA para o imageador. Para as modalidades do instrumento de PCR 200 na FIG. 2 e do instrumento de PCR em tempo real 200 na FIG. 2, o sistema de controle 220 pode ser usado para controlar as funções do sistema de detecção, cobertura aquecida e conjunto de bloco térmico. O sistema de controle 220 pode ser acessível a um usuário final através da interface de usuário 222 do instrumento de PCR 200 na FIG. 2 e do instrumento de PCR em tempo real 200 na FIG. 2. Além disso, um sistema de computação 200, tal como representado na FIG. 2, pode servir para fornecer o controle da função do instrumento de PCR 200 na FIG. 2, bem como da função de interface do usuário. Além disso, o sistema de computação 400 da FIG. 4 pode fornecer funções de processamento de dados, exibição e preparação de relatórios. Todas essas funções de controle dos instrumentos podem ser dedicadas localmente no instrumento de PCR, ou o sistema de computação 400 da FIG. 4 pode fornecer controle remoto de parte ou de todas as funções de controle, análise e de preparação de relatórios, conforme será discutido com mais detalhes posteriormente.
SISTEMA ÓPTICO PARA IMAGEAMENTO
[049] A FIG. 3 representa um sistema óptico exemplificador 300 que pode ser usado para imageamento de acordo com as modalidades aqui descritas. Deve- se reconhecer que o sistema óptico 300 é um sistema óptico exemplificador e um versado na técnica reconheceria que outros sistemas ópticos podem ser usados para capturar imagens de um objeto de interesse. De acordo com várias modalidades, um objeto de interesse pode ser um suporte de amostra tal como, por exemplo, uma placa de calibração como aqui descrito. Um sensor óptico 302 incluído em uma câmara 304, por exemplo, pode representar um objeto de interesse 310. O sensor óptico 302 pode ser um sensor de CCD e a câmara 304 pode ser uma câmara de CCD. Além disso, o sensor óptico inclui uma lente de câmera 306.
[050] Dependendo do objeto de interesse, um filtro de emissão 308 pode ser escolhido para imageamento do objeto de interesse 310 de acordo com várias modalidades. O filtro de emissão 308 pode ser alterado para imagear a emissão fluorescente emitida do objeto de interesse 301 em outras modalidades.
[051] O sistema óptico 300 pode usar uma fonte de luz refletida 312 para imagear o objeto de interesse 310. A luz da fonte de luz 312 pode ser filtrada através de uma esfera 314, um focalizador/desviador 316, e o filtro de excitação 318 antes de ser refletido para o objeto de interesse 310 pelo dispositivo de propagação de feixe 320. O sistema óptico 300 pode também incluir uma lente de campo 322. Dependendo do objeto de interesse, o filtro de excitação 318 pode ser escolhido ou alterado para imagear o objeto de interesse 310 de acordo com várias modalidades.
[052] As seguintes descrições das várias implementações dos presentes ensinamentos foram apresentadas para fins de ilustração e descrição. Não são exaustivas e não limitam os presentes ensinamentos à forma precisa divulgada. Modificações e variações são possíveis à luz dos ensinamentos acima ou podem ser adquiridas a partir da prática dos presentes ensinamentos. Além disso, a implementação descrita inclui software, mas os presentes ensinamentos podem ser implementados como uma combinação de hardware e software ou apenas de hardware. Os presentes ensinamentos podem ser implementados com sistemas de programação orientados a objetos e não orientados a objetos.
SISTEMA DE COMPUTAÇÃO
[053] A FIG. 4 é um diagrama de blocos que ilustra um sistema de computação 400 que pode ser empregado para realizar a funcionalidade de processamento, de acordo com várias modalidades. Os instrumentos para realizar experimentos podem ser conectados ao sistema de computação exemplificador 400. O sistema de computação 400 pode incluir um ou mais processadores, como um processador 404. O processador 404 pode ser implementado usando um mecanismo de processamento de propósito geral ou especial, como, por exemplo, um microprocessador, controlador ou outra lógica de controle. Neste exemplo, o processador 404 está conectado a um barramento 402 ou a outro meio de comunicação.
[054] Além disso, deve ser apreciado que um sistema de computação 400 da FIG. 4 pode ser incorporado em qualquer uma das várias formas, como um computador montado em rack, mainframe, supercomputador, servidor, cliente, um computador desktop, um computador laptop, um tablet, dispositivo de computação portátil (por exemplo, PDA, telefone celular, smartphone, palmtop, etc.), cluster e grid, netbook, sistemas embarcados ou qualquer outro tipo de dispositivo de computação especial ou de propósito geral, conforme seja desejável ou apropriado para um determinado aplicativo ou ambiente. Além disso, um sistema de computação 400 pode incluir um sistema de rede convencional que inclui um ambiente de cliente/servidor e um ou mais servidores de banco de dados, ou integração com a infraestrutura LIS/LIMS. Inúmeros sistemas de rede convencionais, incluindo uma rede de área local (LAN) ou uma rede de área ampla (WAN), e incluindo componentes sem fio e/ou com fio, são conhecidos na técnica. Além disso, os ambientes de cliente/servidor, servidores de banco de dados e redes estão bem documentados na técnica. De acordo com várias modalidades aqui descritas, o sistema de computação 400 pode ser configurado para se conectar a um ou mais servidores em uma rede distribuída. O sistema de computação 400 pode receber informações ou atualizações da rede distribuída. O sistema de computação 400 também pode transmitir informações a serem armazenadas na rede distribuída que podem ser acessadas por outros clientes conectados à rede distribuída.
[055] O sistema de computação 400 pode incluir um barramento 402 ou outro mecanismo de comunicação para comunicar informações, e um processador 404 acoplado com o barramento 402 para o processamento de informações.
[056] O sistema de computação 400 também inclui uma memória 406, que pode ser uma memória de acesso aleatório (RAM) ou outro tipo de memória dinâmica, acoplada ao barramento 402 para armazenar instruções para serem executadas pelo processador 404. A memória 406 também pode ser usada para variáveis de armazenamento temporário ou outras informações intermediárias durante a execução das instruções a serem executadas pelo processador 404. O sistema de computação 400 inclui ainda uma memória somente de leitura (ROM) 408 ou outro dispositivo de armazenamento estático acoplado ao barramento 402 para armazenar informações estáticas e instruções para o processador 404.
[057] O sistema de computação 400 também pode incluir um dispositivo de armazenamento 410, tal como um disco magnético, disco óptico, ou uma unidade de estado sólido (SSD) é fornecida e acoplada ao barramento 402 para armazenar informações e instruções. O dispositivo de armazenamento 410 pode incluir uma unidade de mídia e uma interface de armazenamento removível. Uma unidade de mídia pode incluir uma unidade ou outro mecanismo para suportar a mídia de armazenamento fixa ou removível, como uma unidade de disco rígido, uma unidade de disquete, uma unidade de fita magnética, uma unidade de disco óptico, uma unidade de CD ou DVD (R ou RW), unidade flash ou outra unidade de mídia removível ou fixa. Conforme estes exemplos ilustram, os meios de armazenamento podem incluir uma mídia de armazenamento legível por computador tendo armazenada na mesma software, instruções ou dados de computador específicos.
[058] Em modalidades alternativas, o dispositivo de armazenamento 410 pode incluir outros instrumentos semelhantes para permitir que os programas de computador ou outras instruções ou dados para ser carregado para o sistema de computação 400. Tais instrumentos podem incluir, por exemplo, uma unidade de armazenamento removível e uma interface, tal como um cartucho de programa e uma interface de cartucho, uma memória removível (por exemplo, uma memória flash ou outro módulo de memória removível) e slot de memória e outras unidades e interfaces de armazenamento removíveis que permitem que o software e os dados sejam transferidos do dispositivo de armazenamento 410 para o sistema de computação 400.
[059] O sistema de computação 400 pode também incluir uma interface de comunicações 418. A interface de comunicações 418 pode ser usada para permitir que o software e os dados sejam transferidos entre o sistema de computação 400 e os dispositivos externos. Exemplos de interface de comunicações 418 podem incluir um modem, uma interface de rede (como uma Ethernet ou outro cartão NIC), uma porta de comunicação (como, por exemplo, uma porta USB, uma porta serial RS- 232C), um slot e cartão PCMCIA, Bluetooth, etc. O software e os dados transferidos através da interface de comunicações 418 estão na forma de sinais que podem ser sinais eletrônicos, eletromagnéticos, ópticos ou outros que podem ser recebidos pela interface de comunicações 418. Estes sinais podem ser transmitidos e recebidos pela interface de comunicações 418 através de um canal, como um meio sem fio, com fio ou cabo, fibra óptica ou outro meio de comunicação. Alguns exemplos de um canal incluem uma linha telefônica, um link de telefone celular, um link de RF, uma interface de rede, uma rede de área local ou ampla e outros canais de comunicação.
[060] O sistema de computação 400 pode ser acoplado através do barramento 402 a uma tela 412, tal como um tubo de raios catódicos (CRT) ou tela de cristal líquido (LCD), para exibir informações a um usuário do computador. Um dispositivo de entrada 414, incluindo teclas alfanuméricas e outras, é acoplado ao barramento 402 para comunicar informações e seleções de comando ao processador 404, por exemplo. Um dispositivo de entrada também pode ser uma tela, tal como uma tela de LCD, configurada com capacidade de entrada sensível ao toque (touchscreen). Um outro tipo de dispositivo de entrada do usuário é o controle do cursor 416, tal como um mouse, trackball ou teclas de direcionamento do cursor para comunicar a informação de direção e seleções de comando para um processador 404 e para controlar o movimento do cursor na tela 412. Este dispositivo de entrada tipicamente tem dois graus de liberdade em dois eixos, de um primeiro eixo (por exemplo, x) e de um segundo eixo (por exemplo, y), que permite que o dispositivo especifique as posições em um plano. Um sistema de computação 400 fornece o processamento de dados e fornece um nível de confiança de tais dados. Consistente com certas implementações de modalidades dos presentes ensinamentos, são fornecidos os valores de processamento de dados e de confiança pelo sistema de computação 400, em resposta ao processador 404 executa uma ou mais sequências de uma ou mais instruções contidas na memória 406. Tais instruções podem ser lidas na memória 406 a partir de outro mídia legível por computador, tal como o dispositivo de armazenamento 410. A execução das sequências de instruções contidas na memória 406 obriga o processador 404 a realizar os estados do processo aqui descritos. Alternativamente, os circuitos de hardware podem ser utilizados em lugar de ou em combinação com, instruções de software para implementar modalidades dos presentes ensinamentos. Dessa forma, as implementações de modalidades dos presentes ensinamentos não se limitam a qualquer combinação específica de circuitos de hardware e de software.
[061] O termo "mídia legível por computador" e "produto de programa de computador", como usados aqui se referem geralmente a qualquer meio que é envolvido no fornecimento de uma ou mais sequências ou uma ou mais instruções para o processador 404 para execução. Tais instruções, geralmente referidas como "código de programa de computador" (que podem ser agrupados sob a forma de programas de computador ou outros grupos), quando realizadas, permitem que o sistema de computação 400 realize funções ou características de modalidades da presente invenção. Estas e outras formas de mídia legível por computador não transitória podem assumir muitas formas, incluindo, mas não se limitando a, meios de comunicação não voláteis, meios voláteis e meios de transmissão. Os meios não voláteis incluem, por exemplo, estado sólido, discos ópticos ou magnéticos, tais como o dispositivo de armazenamento 410. Os meios voláteis incluem a memória dinâmica, tal como a memória 406. Os meios de transmissão incluem cabos coaxiais, fio de cobre e as fibras ópticas, incluindo os fios que compõem barramento 402.
[062] As formas comuns de mídia legível por computador incluem, por exemplo, um disquete, um disco flexível, disco rígido, fita magnética ou qualquer outro meio magnético, um CD-ROM, qualquer outro meio óptico, cartões perfurados, fita de papel, qualquer outro meio físico com padrões de orifícios, uma RAM, PROM e EPROM, uma FLASH-EPROM, qualquer outro chip de ou cartucho memória, uma onda portadora, tal como descrito a seguir, ou qualquer outro meio a partir do qual um computador possa ler.
[063] Diversas formas de mídias legíveis por computador podem estar envolvidas na realização de uma ou mais sequências de uma ou mais instruções para o processador 404 para execução. Por exemplo, as instruções podem inicialmente ser realizadas em disco magnético de um computador remoto. O computador remoto pode carregar as instruções em sua memória dinâmica e enviar as instruções através de uma linha telefônica usando um modem. Um modem local para o sistema de computação 400 pode receber os dados na linha telefônica e usar um transmissor de infravermelho para converter os dados para um sinal infravermelho. Um detector de infravermelho acoplado ao barramento 402 pode receber os dados transportados no sinal de infravermelho e colocar os dados no barramento 402. O barramento 402 transporta os dados para a memória 406, a partir da qual processador 404 recupera e executa as instruções. As instruções recebidas pela memória 406 podem, opcionalmente, ser armazenadas no dispositivo de armazenamento 410 quer antes quer após a execução pelo processador 404.
[064] Será observado que, para fins de clareza, a descrição acima descreveu as modalidades da invenção com referência a diferentes unidades e processadores funcionais. No entanto, será evidente que qualquer distribuição adequada de funcionalidade entre as diferentes unidades, processadores ou domínios funcionais pode ser utilizada sem prejudicar a invenção. Por exemplo, a funcionalidade ilustrada para ser realizada por processadores ou controladores separados pode ser realizada pelo mesmo processador ou controlador. Assim, referências a unidades funcionais específicas devem apenas ser vistas como referências a meios adequados para fornecer a funcionalidade descrita, em vez de indicativa de uma lógica ou organização ou estrutura física rigorosa.
SISTEMA DISTRIBUÍDO
[065] Alguns dos elementos de uma configuração típica de rede de Internet 500 são mostrados na FIG. 5, em que inúmeras máquinas de cliente 502, possivelmente em um escritório local remoto, são mostradas conectadas a uma porta de entrada/hub/servidor-túnel/etc. 510, que é conectado por si só à internet 508 através de alguma conexão de Provedor de Serviço de Internet (ISP) 510. Também são mostrados outros possíveis clientes 512 semelhantes conectados à Internet 508 através de uma conexão ISP 514, com estas unidades se comunicando, possivelmente, com um laboratório ou escritório central, por exemplo, através de uma conexão ISP 516 para uma porta/túnel-servidor 518 que está conectada 520 a vários servidores de aplicativos de empresa 522 que poderiam ser conectados através de um outro hub/roteador 526 para vários clientes locais 530. Qualquer um destes servidores 522 pode funcionar como um servidor de desenvolvimento para a análise de controle de conteúdo potencial e soluções de projeto de fornecimento, tal como descrito na presente invenção, tal como mais completamente descrito a seguir.
CALIBRAÇÃO DA REGIÃO DE INTERESSE (ROI)
[066] Conforme apresentado acima, os presentes ensinamentos são descritos com referência aos instrumentos de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR). Em particular, uma modalidade dos presentes ensinamentos é implementada para os instrumentos de RT-PCR que utilizam imagem óptica de placas com poço. Tais instrumentos podem ser capazes de medir simultaneamente os sinais a partir de uma pluralidade de amostras ou pontos de teste para fins analíticos e, muitas vezes, necessitam de calibração. Um exemplo de um processo que pode requerer calibração é a identificação de ROIs ou regiões de interesse.
[067] Em geral, a calibração da ROI pode ser realizada utilizando uma placa com emissões fortes em cada célula correspondendo a todos os filtros. Isto pode ser útil uma vez que a ROI pode não ser idêntica para cada filtro. Diferenças nas ROIs entre os filtros podem ser causadas por ligeiras diferenças angulares nos filtros e outras características espectrais do filtro. Assim, várias modalidades realizam calibração de ROI por filtro/por poço (PFPW). Estas calibrações de ROI-PFPW são úteis para determinar os locais dos poços na placa de 96 poços para cada filtro. A calibração da ROI pode ser realizada utilizando um método tal como nos ensinamentos de Produção de Máscara de Adaptação como descrito na Patente U.S. n° 6.518.068 B1.
[068] Os presentes ensinamentos podem automatizar a calibração da ROI através da minimização ou eliminação da interação do usuário. Várias modalidades podem automatizar o processo através do fornecimento para o software que determina o tempo de exposição ótimo por filtro usando análise de histograma e um padrão de pesquisa binária. O tempo de exposição é a quantidade de tempo necessária para capturar uma imagem da placa. Mais uma vez, este valor pode variar de acordo com as características espectrais de um filtro. Geralmente a calibração da ROI produzirá informações que definem as posições dos poços no campo de visão do detector. Esta informação pode ser armazenada como arquivos de máscara 304 ou com uma máscara global ou várias máscaras correspondentes a diferentes filtros.
[069] Os processos de calibração, tal como o que é descrito acima utilizam frequentemente projeções de linhas e colunas e perfis de intensidade. Isto pode resultar nas determinações da ROI sendo suscetíveis a artefatos e saturação dentro dos poços, rotação da grade, variação dos fatores de ampliação e distorção radial óptica. Como consequência, pode ser vantajoso ter uma determinação mais robusta das ROIs para minimizar tais susceptibilidades e remover as distorções e outros ruídos de fundo indesejáveis nos dados de emissão detectados.
[070] O ruído de fundo pode se referir ao ruído do sistema inerente, bem como a outros sinais indesejáveis. Por exemplo, algum ruído de fundo nos dados pode ser devido a fontes físicas sobre o substrato, tal como as partículas de poeira ou arranhões, por exemplo. Outro exemplo de uma fonte física que pode fornecer o ruído de fundo é um suporte ou caixa que suporta ou envolve a amostra. Outro ruído de fundo nos dados pode ser devido à radiação natural a partir das superfícies do instrumento, tais como reflexão e fluorescência natural. Outro ruído de fundo também pode ser um resultado do sistema óptico que detecta os dados de emissão ou a fonte de luz, por exemplo.
[071] O instrumento biológico pode detectar de várias centenas a vários milhares de amostras, as quais podem ser de um volume muito pequeno, tal como inferior a um nanolitro. Como tal, outros métodos de remoção de ruído de fundo podem ser utilizados em separado ou em combinação com os métodos de calibração descritos neste documento, de acordo com várias modalidades para poder determinar e analisar os dados de emissão a partir dos volumes de amostra. Em algumas modalidades, o local dos volumes de amostras pode ser determinado com mais precisão no interior do substrato para realizar uma análise mais precisa. Por exemplo, na análise de PCR digital, ao ser capaz de distinguir mais precisamente as reações em volumes de amostra versus não reações pode-se produzir resultados mais precisos. Além disso, de acordo com várias modalidades aqui descritas, poços ou orifícios de passagem vazios podem ser distinguidos de volumes de amostras em poços ou orifícios de passagem que não reagiram, os quais também podem ser distinguidos de volumes de amostras em poços ou orifícios de passagem que reagiram.
[072] De acordo com várias modalidades aqui descritas, a remoção do ruído de fundo pode incluir a análise e processamento de dados de imagem. O método pode incluir a análise dos valores de intensidade dos dados de imagem para interpolar o ruído de fundo que pode ser removido a partir da imagem do substrato. Desta forma, as localizações das regiões de interesse dentro da imagem também podem ser determinadas. A remoção de ruído de fundo também pode incluir dados de interpolação das áreas da imagem conhecidas por incluir as regiões de interesse. Após a determinação do ruído de fundo sobre a imagem, o ruído de fundo pode ser subtraído dos dados de imagem.
[073] A FIG. 6 representa um exemplo de método in silico (realizado em computador) 600 de acordo com uma modalidade da presente invenção. O método in silico 600 inclui uma pluralidade de sub-rotinas de fluxo de trabalho de conjunto em um formato legível por computador que pode incluir sub-rotinas de um processo biotecnológico. A FIG 6 é meramente um método exemplificador e o versado na técnica, à luz da presente divulgação, vai perceber que o número real de sub-rotinas pode variar de pelo menos cerca de 2 sub-rotinas para muitas (por exemplo, 2-10, 2-20, 2-30, 2-n (em que n pode ser qualquer número de sub-rotinas de 3-100, 3-1000 e assim por diante)). Cada sub-rotina de conjunto 310-370 pode incluir uma única etapa ou tarefa, ou, opcionalmente, pode incluir mais do que uma etapa ou tarefa, também em um formato legível por computador, e cada etapa pode ainda incluir etapas ou tarefas personalizáveis adicionais opcionais. Cada uma das etapas ou tarefas opcionais/personalizáveis pode ter um ou mais parâmetros opcionais (opções) que podem ser visualizados, analisados, definidos ou personalizados pelo usuário. Em algumas modalidades, um método in silico da invenção inclui a seleção por um usuário de pelo menos um parâmetro de cada para cada etapa opcional/personalizável do processo biotecnológico utilizando uma interface gráfica de usuário (GUI) para selecionar pelo menos um parâmetro para cada etapa opcional/personalizável. Em certas modalidades, cada etapa e todos os parâmetros de sub-rotinas de um fluxo de trabalho estão disponíveis para um usuário visualizar e, opcionalmente, editar. Os programas de bioinformática normalmente escondem alguns desses parâmetros e/ou etapas de usuários, o que causa a frustração e ineficiência do usuário especialmente quando o resultado de um experimento projetado in silico não é o resultado esperado para um usuário.
[074] Um método in silico exemplificador da divulgação ilustrado em geral na FIG. 6 pode ser realizado (executado) através da geração de pelo menos um arquivo de método em um sistema de computação (tal como mostrado na FIG. 4), o arquivo de método compreendendo instruções legíveis por computador para uma pluralidade de sub-rotinas (10, 20, 30.) das etapas de personalização (A, B, C), cada uma das quais podendo ter um ou mais parâmetros que podem ser vistos, selecionados, alterados ou inseridos; e realização do processo biotecnológico in silico compreendendo a realização de pelo menos um arquivo de método que compreende instruções legíveis por computador pelo sistema de computação para obter pelo menos um produto de biotecnologia.
[075] Em algumas modalidades, pelo menos um parâmetro opcional/personalizável é selecionado a partir de um parâmetro padrão, em que o parâmetro padrão é armazenado em um componente do sistema de computação (por exemplo, armazenamento, banco de dados, etc.).
[076] Com referência novamente à FIG. 6, a primeira etapa no cálculo de localizações da ROI é estimar os centros iniciais da ROI do limite de fluorescência na etapa 610. Uma placa de amostra configurada para conter uma pluralidade de amostras biológicas é fornecida e inserida em um instrumento analítico capaz de analisar amostras biológicas através do processo de PCR. Cada amostra biológica é contida em um poço de amostra e pode ser excitada por uma fonte de luz e, em resposta à excitação, pode apresentar fluorescência a um comprimento de onda predeterminado, o qual pode ser detectado por um detector de fluorescência. Como apresentado acima com referência à 2, a fonte de luz 202 pode ser um laser, LED ou outro tipo de fonte de excitação capaz de emitir um espectro que interage com as espécies espectrais a serem detectadas pelo sistema 200. Além disso, as amostras biológicas podem incluir corantes espectralmente distintos, tais como um ou mais dos FAM, SYBR Green, VIC, JOE, TAMRA, NED, CY-3, vermelho Texas, CY-5, ROX (referência passiva) ou quaisquer outros fluorocromos que emitem um sinal capaz de ser detectado.
[077] Antes da excitação, os parâmetros de entrada das amostras biológicas e os parâmetros do algoritmo são definidos para fornecer um ponto de partida para a determinação da ROI. Os parâmetros de entrada podem incluir tamanho do poço, a distância de centro a centro do poço, pixels ópticos por milímetro e o layout da placa. O layout da placa pode incluir o número total de poços e a configuração dos poços de amostra. Uma configuração usada frequentemente pode ser uma matriz retangular compreendendo uma pluralidade de linhas e uma pluralidade de colunas, no entanto, um versado na técnica vai compreender que a configuração pode ser qualquer geometria adequada para o instrumento a ser utilizado. Além disso, o número total de poços pode variar. Um versado na técnica estará familiarizado com as configurações totalizando de 1 poço para milhares de poços em uma única estrutura de placa de amostra ou de contenção da amostra. Os parâmetros do algoritmo de verificação da ROI podem definir faixas aceitáveis para o tamanho do poço, a distância centro-a-centro do poço e circularidade mínima. A circularidade é um valor calculado e pode ser uma razão entre o perímetro e a área.
[078] Uma vez que os parâmetros de entrada e os parâmetros de algoritmo foram determinados, a pluralidade de amostras é excitada com energia proveniente de uma fonte de luz apropriada, e as imagens são coletadas da fluorescência emitida de cada poço de amostra na placa de amostra. As imagens de fluorescência da placa de amostra são ainda analisadas para selecionar os candidatos da ROI, com base nos parâmetros de entrada e nos parâmetros do algoritmo. Os candidatos da ROI que satisfazem os parâmetros são salvos para posterior análise e o tamanho e a circularidade de cada poço são determinados na etapa 620. Os candidatos da ROI que não satisfazem os parâmetros podem ser descartados junto com quaisquer locais que não apresentam fluorescência. Os candidatos da ROI retidos são ainda avaliados para determinar a distância entre as ROI com base no parâmetro de espaçamento de poço para poço e o parâmetro da faixa permitido para o espaçamento de poço para poço. As ROIs que têm centros que se encontram em estreita proximidade uns dos outros com base nos parâmetros de poço para poço podem ser consideradas como sendo o mesmo poço de amostra, e a única com a melhor circularidade é selecionada como a ROI para aquele poço. Uma vez que todos os candidatos da ROI tenham sido determinados, o tamanho médio do poço é calculado, a média é atribuída a cada poço de amostra da ROI na etapa 630 e as ROIs estimadas iniciais são salvas.
[079] Os locais do poço esperados são dispostos em um padrão de grade determinado com base no parâmetro de layout da placa. Este parâmetro pode incluir o número de poços, o número de colunas e o número de linhas em que cada poço tem um conjunto esperado de coordenadas de grade X-Y com base no parâmetro de layout da placa. Uma análise mais aprofundada pode agora ser iniciadas na ROIs estimadas iniciais para melhor definir os locais de cada ROI inicial e pode ser referido como grade global. A primeira etapa na grade global é analisar os centros das ROIs estimadas iniciais para encontrar as ROIs adjacentes. Isso pode ser determinado comparando a distância de centro a centro entre as ROIs para as coordenadas de grade com base no layout da placa. As coordenadas de grade X-Y podem então ser determinadas para cada uma das ROIs iniciais estimadas com base na relação espacial entre as ROIs.
[080] A fim de melhorar a precisão dos locais da ROI seria vantajoso relacionar as coordenadas de ROI de centro a centro para as coordenadas de grade do layout da placa. Isto pode ser realizado determinando e aplicando as funções de mapeamento. As funções de mapeamento são um par de funções polinomiais quadráticas bidimensionais. Estas funções são calculadas para mapear os locais de grade X (ou Y) para os locais de centro da ROI na direção X (ou Y). Uma vez que as funções de mapeamento foram determinadas, elas podem ser aplicadas para as coordenadas de grade esperadas para fornecer dois benefícios. Primeiro a precisão dos locais de centro da ROI pode ser melhorada, e segundo pode ser possível recuperar as ROIs que faltavam durante a constatação da ROI inicial.
[081] Além disso o ajuste das ROIs pode fornecer benefícios adicionais para um desempenho óptico. Os inventores descobriram que há uma relação entre o tamanho da ROI e a razão de sinal para ruído (SNR) do sistema óptico. Um versado na técnica saberia que existem várias equações para calcular a SNR de sistemas elétricos e ópticos. A SNR pode ser caracterizada com a Equação 1 a seguir, por exemplo:
Figure img0001
[082] em que SNR = razão de Sinal para Ruído SPlaca corante = a soma de todas as intensidades de pixels dentro das ROIs a partir das imagens de corante SBG = a soma de todas as intensidades de pixels dentro das ROIs de imagens de fundo Scorante = a soma de todas as intensidades de pixels dentro das ROIs do corante N = o número de pixels dentro de uma ROI deslocamento = o deslocamento da câmara G = ganho da câmera δ2R,y = o ruído de leitura
[083] Um experimento foi conduzido usando um sistema óptico que incluía seis pares de filtros. Cada par de filtros incluiu um filtro de excitação (Xn) e um filtro de emissão (Mn). Cada filtro foi sensível a uma banda estreita de comprimentos de onda que corresponde à frequência de excitação e a frequência de emissão do corante configurado para ser compatível com o processo de PCR. Além disso, as ROIs foram otimizadas de acordo com os ensinamentos apresentados no presente documento. A fim de estudar o efeito do tamanho das ROI na razão de sinal para ruído, a fluorescência foi detectada a partir de uma placa de amostra de 96 poços utilizando 6 pares de filtros. O raio de cada ROI foi estendido em incrementos de 1 pixel. A Equação 1 foi utilizada para calcular a SNR para cada um dos 6 pares de filtros e cada incremento de pixel. Os resultados do experimento são apresentados abaixo na Tabela 1:
Figure img0002
[084] As entradas em negrito identificam a maior SNR para cada um dos 6 pares de filtros, e uma extensão de raio de 2 pixels fornece uma melhoria global da SNR de cerca de 6% entre os 6 pares de filtros.
[085] A FIG. 7 mostra uma imagem de uma placa de amostra com 96 poços 710. Cada um dos poços 710 produziu uma imagem fluorescente. Após a aplicação dos ensinamentos do presente documento, as ROIs foram otimizadas e os círculos azuis identificam a ROI para cada posição do poço.
CALIBRAÇÃO DO CORANTE PURO
[086] Como descrito acima, existe uma necessidade crescente para simplificar a instalação e a configuração dos sistemas de análises biológicas, para que os operadores possam utilizar os sistemas de análises biológicas mais rapidamente e eficientemente para o seu fim pretendido. Esta necessidade é evidente, por exemplo, na calibração de um instrumento de análise biológica e componentes associados. Uma calibração exemplificadora é a calibração de corantes fluorescentes utilizados para a detecção de fluorescência em sistemas de análise biológicos tais como, por exemplo, sistemas de qPCR.
[087] A calibração com corantes fluorescentes usados em um instrumento qPCR permite que o software do instrumento use os dados de calibração coletados dos padrões de corantes para caracterizar e distinguir a contribuição individual de cada corante na fluorescência total coletada pelo instrumento. Depois de um teste de amostra, o software do instrumento recebe dados na forma de um sinal de espectros brutos para cada leitura. O software determina a contribuição de cada um dos corantes fluorescentes usados em cada local de reação, comparando os espectros brutos, contribuídos por cada corante, com os dados de calibração dos espectros puros. Quando um usuário salva um experimento após análise, o software do instrumento armazena o espectro puro, juntamente com os dados de fluorescência coletados para esse experimento, bem como a contribuição de cada corante de fluorescência por poço.
[088] O produto de uma calibração de corante em um instrumento de qPCR, por exemplo, é uma coleção de perfis espectrais que representam a assinatura de fluorescência de cada padrão de corante para cada local de reação. Cada perfil consiste de um conjunto de espectros que correspondem à fluorescência coletada a partir dos locais de reação, tais como os poços, de um suporte de amostra, tal como, por exemplo, uma placa ou matriz de calibração. Após a calibração de cada corante, o software do instrumento "extrai" um perfil espectral para cada corante em cada local de reação. O software traça os dados resultantes para cada um dos perfis em um gráfico de fluorescência em função do filtro. Quando o software extrai os dados de calibração de corante, ele avalia o sinal de fluorescência gerado por cada poço, em termos dos espectros coletivos para toda a placa de calibração ou cartão de matriz. Os espectros de corante são geralmente aceitáveis, se eles formam pico dentro do mesmo filtro que o seu grupo, mas divergem ligeiramente em outros comprimentos de onda.
[089] Ao realizar a calibração do corante em um suporte de amostra, tal como uma placa de calibração, os locais de reação (por exemplo, poços) contêm geralmente concentrações idênticas de corante para permitir a geração de um valor de espectro puro em cada poço da placa. A FIG 8 apresenta uma imagem de uma placa de calibração com um único corante (neste caso, corante FAM), ocupando cada poço de uma placa de calibração de 96 poços. Isto permite a comparação do sinal de fluorescência gerado por cada poço, em um teste de um espectro puro lido para aquele poço. Ao utilizar um único corante para cada poço de uma placa de calibração, os sinais resultantes para os poços devem ser semelhantes. As variações na posição espectral e na posição do pico podem ser causadas, por exemplo, por pequenas diferenças nas propriedades ópticas e energia de excitação entre os poços individuais. Levando em conta essas variações na calibração do corante teoricamente se obtém uma calibração corante mais precisa.
[090] No entanto, o uso de um único corante por placa de calibração pode ser demorado e complicado, em particular quando se calibra numerosos corantes. Exemplos não limitantes de corantes fluorescentes incluem, FAM, VIC, ROX, SYBR, MP, ABY, JUN, NED, TAMRA e CY5. Portanto, existe uma necessidade de simplificar o processo de calibração de corante e reduzir o tempo necessário para a calibração, mantendo a mesma qualidade dos resultados da calibração de corante.
[091] As FIGS. 9 e 10 ilustram um fluxograma que representa um método exemplificador 900 de calibrar corante(s) fluorescente(s) de acordo com as modalidades aqui descritas. As etapas do método 900 podem ser implementadas por um processador 404, como mostrado na FIG. 4. Além disso, as instruções para realizar o método pelo processador 404 podem ser armazenadas na memória 406.
[092] Com referência à FIG. 9, na etapa 902, as placas de calibração são preparadas por corantes de carregamento em locais de reação de um substrato para o processamento. O substrato, neste caso, é uma placa de 96 poços, embora substratos diferentes possam ser utilizados, incluindo, por exemplo, uma placa de 384 poços. Em várias modalidades, o substrato pode ser uma lâmina de vidro ou de plástico com uma pluralidade de regiões de amostra. Alguns exemplos de um substrato podem incluir, mas não se limitam a, uma placa de múltiplos poços, tal como uma placa de microtitulação padrão de 96 poços, uma placa de 384 poços, ou uma microplaca, um suporte substancialmente plano, tal como uma lâmina de vidro ou de plástico, ou qualquer outro tipo de matriz ou de micromatriz. Os locais de reação em várias modalidades de um substrato podem incluir poços, depressões, endentações, sulcos, e combinações dos mesmos, padronizado em matrizes regulares ou irregulares, formadas na superfície do substrato. Até agora, referência aos poços ou placas são apenas para fins exemplificadores e não limitam de qualquer forma o tipo de local de reação ou suporte de amostra aqui utilizável.
[093] As placas de calibração podem ser preparadas em um padrão quadriculado tal como ilustrado na FIG. 11 A. Como ilustrado nas placas de calibração 1100, 1120 e 1140, as placas podem por si próprias ser de um formato de 96 poços, embora o número de poços na placa de calibração possa ser variado conforme necessário, dependendo, por exemplo, do número de corantes necessitando de calibração, do formato do bloco de amostras 314 (ver FIG. 3) que recebe a placa de calibração, ou das capacidades do instrumento (instrumento de PCR 300, por exemplo) para imagear as placas em diferentes densidades de poços.
[094] O padrão quadriculado de distribuição de corante permite que vários corantes sejam calibrados por placa de calibração. Em oposição à calibração de um corante por placa de calibração, o padrão quadriculado permite vantajosamente que um usuário utilize menos placas para calibrar um conjunto de corantes, diminuindo assim o tempo e etapas do processo necessárias para a calibração do corante.
[095] Na modalidade ilustrada nas FIG. 11 A, três placas são usadas para calibrar dez corantes separados. Cada placa de calibração 1100/1120/1140 está configurada para acomodar quatro corantes diferentes em um padrão de repetição de corantes alternados ao longo dos poços em cada linha da placa, de tal modo que cada poço apresenta um corante específico no padrão de repetição (corante apresentado no poço). Por exemplo, a placa 1100 acomoda os corantes FAM, VIC, ROX e SYBR em poços alternadas exemplificadas pelos poços 1102 (FAM), 1104 (VIC), 1106 (ROX) e 1108 (SYBR); a placa 1120 acomoda um tampão, corante MP, corante ABY e corante JUN em poços alternadas exemplificadas pelos poços 1122 (tampão), 1124 (MP), 1126 (ABY) e 1128 (JUN); e a placa 1140 acomoda o corante NED, corante TAMRA, corante CY5 e um tampão em poços alternados exemplificadas pelos poços 1142 (NED), 1144 (TAMRA), 1146 (CY5) e 1148 (tampão). Nesta modalidade, uma vez que apenas dez corantes estão sendo calibrado, os tampões são utilizados nas placas 1120 e 1140 como cargas para poços que não acomodam um corante a ser calibrado.
[096] Deve ser entendido que a modalidade nas FIGS. 11A e 11B é apenas um exemplo, e que o número de corantes totais calibrados, o número de corantes por placa, e o número de placas, podem variar conforme necessário, com base, por exemplo, nas necessidades de calibração de um usuário, no número de poços da placa, e a capacidade de manuseio de calibração do instrumento. Por exemplo, se 12 corantes estiverem sendo calibrados na modalidade ilustrada na FIG. 11 A, um tampão não seria necessário nas placas 1120 e 1140, já que quatro corantes podem ser calibrados em cada uma das três placas de calibração 1100/1120/1140 para um total de 12 corantes.
[097] Além disso, o número de corantes por placa pode ser dois ou mais, com o número máximo de corantes por placa com base, por exemplo, no número de poços na placa de calibração, na capacidade do instrumento usado para modelar apropriadamente uma placa completa (ver abaixo para mais explicações), e na capacidade do sistema de imageamento para obter dados de fluorescência utilizáveis a partir da placa escolhida. Por exemplo, em vez de usar uma placa de 96 poços, tal como ilustrado na FIG. 11 A, pode-se dispor de um instrumento suficientemente robusto e sistema de imageamento associado para ser capaz de usar uma placa de calibração de 384 poços. Com a densidade do poço adicional fornecida, pode-se calibrar mais corantes por placa, por exemplo, 16 corantes por placa, e ainda obter o mesmo número de pontos de dados (ou seja, poços que apresentaram corante) por corante (por exemplo, 24) necessário para obter um modelo global suficiente (discutido em mais detalhes abaixo). Por exemplo, com uma placa de 384 poços, 10 corantes podem ser calibrados usando duas placas e cinco corantes por placa.
[098] Mesmo o tipo de suporte de amostra e tipo de local de reação pode afetar o número de corantes possíveis. Como afirmado acima, podem ser usados outros tipos de suportes de amostra e locais de reação para a calibração.
[099] Voltando à FIG. 9, na etapa 904, as placas de calibração quadriculadas preparadas podem ser carregadas no instrumento. O número de placas carregáveis em um instrumento de uma só vez depende das capacidades e da capacidade do instrumento utilizado. Por exemplo, um termociclador (thermal cycler) padrão qPCR com um bloco de 96 poços só aceitará uma placa de calibração de cada vez. No entanto, termocicladores de múltiplos blocos podem oferecer múltiplos blocos que podem, cada um, receber uma placa de calibração. Além disso, se uma placa de calibração não for usada, de acordo com o formato do suporte de amostra utilizado (por exemplo, uma micromatriz ou matriz de microchip), múltiplos suportes de amostras podem ser recebidos em um único instrumento utilizando, por exemplo, um conjunto de carga que se encaixa no instrumento.
[0100] Na etapa 906 da FIG. 9, o instrumento, utilizando o sistema de imageamento óptico associado (ver, por exemplo, a FIG. 3), adquire imagens da placa de calibração carregada, ou de placas em série ou em paralelo. As imagens adquiridas e os dados associados podem ser armazenados, por exemplo, na memória 406 ou dispositivo de armazenamento 410 do sistema de computação 400 na FIG. 4. O sistema de imageamento óptico pode adquirir imagens de cada uma das placas em cada canal óptico. O número de canais depende do número de filtros de excitação e de emissão fornecidos no sistema de imagem. Por exemplo, para um sistema de imagem óptica tendo 6 filtros de excitação (filtros X) e 6 filtros de emissão (filtros M), o número total de canais é 21, representados pelas seguintes combinações de filtros: XI Ml, X1M2, X1M3, X1M4, X1M5, X1M6, X2M2, X2M3, X2M4, X2M5, X2M6, X3M3, X3M4, X3M5, X3M6, X4M4, X4M5, X4M6, X5M5, X5M6 e X6M6. O número de imagens ou exposições adquiridas em cada canal pode variar. Por exemplo, o sistema de imageamento pode adquirir duas imagens ou exposições por canal. O número de imagens ou exposições tomadas depende das necessidades do usuário, já que ter menos imagens ou exposições por canal pode diminuir o tempo necessário para aquisição de imagens ou exposições, e ter mais imagens ou exposições por canal fornece uma maior probabilidade de dados de qualidade.
[0101] Na etapa 908 da FIG. 9, o instrumento, usando os dados reunidos a partir das imagens ou exposições adquiridas pelo sistema de imageamento óptico (ver, por exemplo, a FIG. 3), identifica o canal de pico para cada corante sobre a placa de calibração. Este canal de pico para cada local de reação é o canal no qual o corante específico analisado mostra a maior fluorescência para o local de reação. A identificação do canal de pico pode ocorrer quando, por exemplo, 95% ou mais locais de reação são ocupados por corante, neste caso permitindo não mais de 5% de locais de reação de valor discrepante durante a calibração. A porcentagem de valores discrepantes permitida pode variar. Os locais de reação de valor discrepante podem então ser descartados de cálculo e análise futura. Os valores discrepantes podem ocorrer, por exemplo, quando os corantes errados são carregados, os corantes são carregados na configuração incorreta, quando há carga indevida de corantes, ou os componentes ópticos se tornam sujos (por exemplo, partículas de poeira). O canal do pico para cada corante sobre a placa de calibração pode ser identificado, por exemplo, pelo processador 404, do sistema de computação 400, utilizando os dados armazenados na memória 406. Os resultados de identificação podem ser armazenados, por exemplo, na memória 406 ou dispositivo de armazenamento 410 do sistema de computação 400.
[0102] Em alternativa, os dados de fluorescência obtidos reunidos a partir das imagens ou exposições adquiridas pelo sistema de imageamento óptico para cada combinação de filtro em cada local de reação podem ser corrigidos pela correção de fundo e de uniformidade antes da identificação do canal de pico, usando o componente de fundo e fatores de uniformidade determinados usando métodos de calibrações de fundo e uniformidade conhecidos na técnica.
[0103] Na etapa 910 da FIG. 9, o instrumento, usando os dados reunidos a partir das imagens ou exposições adquiridas pelo sistema de imageamento óptico (ver, por exemplo, a FIG. 2), normaliza cada canal para o canal de pico identificado da etapa 908 para todos os poços que apresentaram corante. Cada canal pode ser normalizado para o canal de pico identificado, por exemplo, pelo processador 404, do sistema de computação 200, utilizando os dados armazenados na memória 406. Os resultados da normalização podem ser armazenados, por exemplo, na memória 406 ou dispositivo de armazenamento 410 do sistema de computação 400.
[0104] Todos os poços apresentados com corantes são tomados como um valor quantitativo da linha de base a partir do qual se normalizar. Geralmente, quanto maior for o valor quantitativo, maior será a fluorescência detectada. Portanto, o canal de pico identificado para um dado corante teria o maior valor quantitativo para esse corante nos poços que apresentaram corante, exceto os valores discrepantes de canal pico. Independentemente do valor quantitativo do canal de pico, para normalizar, o valor quantitativo no canal é reposto para um valor de um. Os valores quantitativos restantes para o mesmo corante em outros canais são então ajustados de acordo com o valor de reposição de um para o canal de pico. Por exemplo, se for o corante de X, o canal de pico A teve um valor quantitativo de 100 nos poços, e outro canal B teve um valor quantitativo de 40 nos poços, após a normalização, o canal de pico A é definido como 1,0 e o canal B é definida como 0,40. Este valor normalizado, também pode ser referido como um fator de calibração, com o fator de calibração para o canal de pico sendo definido a 1,0 tal como discutido acima.
[0105] Na modalidade ilustrada na FIGS. 11A e B, quando quatro corantes são igualmente dispersos entre os poços de uma placa de 96 poços, o número de poços que apresentaram corante por corante seria 24. O número de poços apresentadas com corantes pode variar por motivos discutidos anteriormente, tais como, por exemplo, o número de locais de reação (por exemplo, poços) sobre o suporte de amostra (por exemplo, placa de calibração), o número de corantes por dispersão no suporte de amostra. Por exemplo, em uma placa de 96 poços, se três corantes são dispersos, o número de poços apresentadas com corantes seria 32 por corante. Se existem seis corantes dispersos na placa de 96 poços, seriam 16 poços apresentadas com corantes por corante.
[0106] Com referência agora à FIG. 10, na etapa 912, o instrumento realiza modelagem global para todos os poços por corante. Para calibrar um corante para todos os poços de um formato de suporte de amostra, o instrumento pode usar os dados dos poços apresentadas com corantes para um corante específico para modelar todos os poços, incluindo os poços sem um corante específico. A modelagem global pode ser realizada, por exemplo, pelo processador 404, do sistema de computação 400, usando os dados dos poços apresentadas com corantes para um corante específico para modelar todos os poços. O modelo resultante pode ser armazenado, por exemplo, na memória 406 ou dispositivo de armazenamento 410. Fazendo referência à FIG. 11A, para o corante FAM presente em 24 poços 1102 da placa 1100, os outros 112 poços na placa seriam de corante FAM não apresentado. A mesma distribuição de 24 apresentados/72 não apresentados seria aplicável a cada corante na FIG. 11 A. O número de poços não apresentadas com corantes depende do número de poços apresentadas com corantes, as quais, como discutido acima, podem depender, de várias razões. Independentemente disso, a soma de poços apresentadas e não apresentadas com corantes para uma dada placa é igual ao número de poços nessa placa. A FIG 11 B é uma imagem de uma placa de calibração de 96 poços quadriculada com 4 corantes usando os corantes FAM, VIC, ROX e SYBR na mesma configuração ilustrada pela placa 1100 na FIG. 11 A.
[0107] Em uma modalidade alternativa, o instrumento realiza a modelagem global para todos os canais ou os canais que têm um valor normalizado, por exemplo, maior do que 0,01, ou 1% do canal de pico identificado. Para esses canais abaixo deste limite, o instrumento poderia realizar uma modelagem local (ver etapa 922 da FIG. 10) em vez de realizar a modelagem global. A modelagem global pode se tornar desnecessária em níveis tão baixos em determinados canais, que a fluorescência detectada é principalmente um resultado de, por exemplo, o ruído ou outro distúrbio, ao invés da contribuição do corante real que está sendo calibrado.
[0108] Um algoritmo de modelagem global pode funcionar em uma calibração de corante para derivar um modelo de fatores de calibração de corante para cada canal de filtro para cada corante com base nos fatores de calibração do corante medidos dos poços apresentadas com corante específico. Por exemplo, se 24 poços são apresentadas na placa quadriculada de 96 poços para um corante específico, a modelagem global utiliza os fatores de calibração de corante destas 24 poços para derivar os fatores de calibração para todos os poços, incluindo os outros 72 poços não apresentadas com corantes e, assim, produzem um modelo para a placa inteira por canal, por corante.
[0109] A função polinomial quadrática bidimensional (2D) é um exemplo de uma função que pode ser aplicada como um modelo global para os fatores de calibração de corante. Outras funções de modelagem globais são conhecidas e podem ser aqui utilizadas. Um solucionador de mínimos quadrados não linear pode ser utilizado para derivar a função polinomial quadrática 2D a partir dos fatores de calibração do corante medidos nos poços apresentadas com corante específico, minimizando os resíduos de modelagem (a diferença entre os valores calculados a partir do modelo e os fatores de calibração de corantes medidos). O algoritmo da região de confiança de Levenberg-Marquardt pode ser usado como o algoritmo de otimização neste solucionador. Embora muitos outros algoritmos de otimização sejam aqui utilizáveis, um outro exemplo é o método de Dogleg, cuja ideia chave é usar ambos os métodos de Gauss-Newton e Cauthy para calcular a etapa de otimização para otimizar o objetivo não linear. Esta abordagem aproxima a função objetiva usando uma função de modelo (frequentemente quadrática) sobre um subconjunto do espaço de busca conhecido como a região de confiança. Se a função de modelo consegue minimizar a verdadeira função objetiva, a região de confiança é expandida. Por outro lado, se a aproximação é fraca, então a região é contraída e a função de modelo é aplicada novamente. Uma função de perda, por exemplo, pode também ser usada para reduzir a influência de altos resíduos (maior diferença entre os fatores de calibração calculados e medidos). Estes altos resíduos geralmente constituem valores discrepantes sobre a otimização.
[0110] Na etapa 914 da FIG. 10, depois de todos os poços serem modelados para um dado corante ou corantes, o instrumento realiza uma verificação de qualidade de ajuste (GOF). Isso pode garantir que a etapa de modelagem global é suficientemente confiável. Uma verificação de GOF pode ser realizada, por exemplo, pelo processador 404 do sistema de computação 400, com os resultados armazenados, por exemplo, na memória 406 ou dispositivo de armazenamento 410. As medidas de qualidade de ajuste tipicamente resumem a discrepância entre os valores observados e os valores esperados sob o modelo em questão. A GOF pode ser determinada de muitas maneiras incluindo, por exemplo, coeficiente de determinação de valores R ao quadrado e de raiz quadrada do erro quadrático médio (RMSE). R ao quadrado, por exemplo, é uma estatística que vai gerar algumas informações sobre a qualidade do ajuste de um modelo. Na regressão, o coeficiente de R ao quadrado da determinação é uma medida estatística de quão bem a linha de regressão se aproxima dos pontos de dados reais. Um R ao quadrado de 1 indica que a linha de regressão se encaixa perfeitamente nos dados. A RMSE é a raiz quadrada da média ao quadrado das diferenças ou resíduos entre os valores observados e os valores esperados sob o modelo em questão. A RMSE é uma boa medida da exatidão de previsão do modelo. A RMSE de 0 indica que os valores esperados sob o modelo são exatamente iguais aos valores observados.
[0111] Na etapa 916 da FIG. 10, se houver um bom ajuste, então o instrumento produz uma matriz de corante, na etapa 918 da FIG. 9. Um bom ajuste estatístico pode ocorrer, em análise de R ao quadrado, por exemplo, quando os valores de R ao quadrado são, por exemplo, maiores que ou iguais a 0,85, ou os valores de RMSE que são, por exemplo, menores que ou iguais a 0,01, tal como o ilustrado na FIG. 10. A matriz de corante pode ser preparada, por exemplo, pelo processador 204 de sistema de computação 200, e transmitida para a tela 212.
[0112] Na etapa 920 da figura 10, se houver um ajuste ruim, então o instrumento realiza uma modelagem local, na etapa 922 da FIG. 10. Isto pode se tornar necessário, por exemplo, se o valor de R calculado para uma verificação de GOF é menor do que 0,85, por exemplo, e os valores de RMSE são maiores do que 0,01, por exemplo. A modelagem local pode ser realizada, por exemplo, pelo processador 404, do sistema de computação 400, usando os dados dos poços apresentadas com corantes para um corante específico para modelar os poços restantes não apresentadas com corantes. O modelo resultante pode ser armazenado, por exemplo, na memória 406 ou dispositivo de armazenamento 410.
[0113] Um método de modelagem local pode incluir, por exemplo, o uso de fatores de calibração a partir dos poços apresentadas com corante circundante para o mesmo corante sobre a placa. Por exemplo, para determinar o valor do fator de calibração em um poço não apresentada com corante para um corante específico, o modelo local pode tomar o valor médio de todos os poços apresentadas com corante específico do mesmo corante que estão dentro de uma janela local de 5x5 dos poços circundantes ou da placa inteira. Esse valor médio é determinado até uma modelagem completa da placa ser concluída. A saída de modelagem local pode então substituir a saída de modelagem global.
[0114] Na conclusão da modelagem local, a matriz de corante é suficiente de modo que o instrumento produz a matriz de corante, na etapa 918 da FIG. 10. Esta matriz de corante serve como um perfil da assinatura de fluorescência de cada corante calibrado. Após cada teste, o instrumento recebe dados sob a forma de um sinal de espectros brutos para cada leitura. O instrumento determina a contribuição dos corantes fluorescentes utilizados em cada reação por comparação dos espectros brutos com os dados de calibração dos espectros puros da matriz de corante. O instrumento usa os dados de calibração obtidos a partir dos padrões de corante (ou seja, da matriz de corante) para caracterizar e distinguir a contribuição individual de cada corante na fluorescência total coletada pelo instrumento.
CALIBRAÇÃO DE NORMALIZAÇÃO DO INSTRUMENTO
[0115] Atualmente, a análise genômica, incluindo a de cerca de 30.000 genes humanos é um importante foco de pesquisa bioquímica e farmacêutica básica e aplicada. Tal análise pode ajudar no desenvolvimento de diagnóstico, medicamentos e terapias para uma ampla variedade de distúrbios. No entanto, a complexidade do genoma humano e as funções inter-relacionadas dos genes muitas vezes tornam esta tarefa difícil. Uma dificuldade comumente enfrentada é a incapacidade dos pesquisadores de comparar facilmente os resultados dos experimentos realizados em múltiplos instrumentos. As variações físicas nos parâmetros de componentes como fontes de luz, elementos ópticos e detectores de fluorescência, por exemplo, podem resultar em variação nos resultados das análises quando são amostras biológicas idênticas. Existe, portanto, uma necessidade contínua de métodos e instrumentos para auxiliar na minimização das variações nos componentes.
[0116] Em qPCR, as curvas de amplificação são muitas vezes determinadas através da normalização do sinal de um corante repórter para um corante de referência passiva na mesma solução. Exemplos de corantes repórteres podem incluir, mas não se limitam a, FAM, SYBR Green, VIC, JOE, TAMRA, NED CY-3, Vermelho Texas, CY-5. Um exemplo de uma referência passiva pode ser, mas não se limita a ROX. Esta normalização pode ser classificada como valores de fluorescência normalizados marcados ou "Rn". A normalização de referência passiva permite valores de Rn consistentes, mesmo que o nível geral do sinal seja afetado pelo volume do líquido ou pela intensidade geral da iluminação. A normalização de referência passiva, no entanto, pode não funcionar corretamente se a razão de sinal entre o corante repórter e o corante de referência varia, como as diferenças de instrumento para instrumento no espectro da iluminação. A fim de ajustar, as soluções de normalização podem ser fabricadas de forma a normalizar a razão de repórter para referência passiva. Um exemplo de uma tal solução de normalização pode ser uma mistura de 50:50 de FAM e ROX, que pode ser referida como uma solução de normalização de "FAM/ROX".
[0117] Este método atual de normalização do instrumento, incluindo a leitura de fluorescência da mistura de corante para obter um "fator de normalização" para ajustar os valores de Rn requer despesa adicional. Tipicamente, ele requer a fabricação de soluções de normalização e placas de normalização, e tempo para realizar as calibrações adicionais. Além disso, este método só funciona para as misturas de corantes que você está calibrando com um conjunto de filtros emparelhados padrões. Um conjunto de filtros emparelhados pode ser uma combinação de um filtro de excitação e de um filtro de emissão. Um versado na técnica compreenderá que a adição de um corante adicional exigiria uma solução de normalização diferente e calibração.
[0118] Os processos de fabricação para produzir as soluções de normalização também contribuem para as variações na resposta dos corantes. Verificou-se que pode ser difícil controlar as concentrações de corante devido à falta de um padrão de fluorescência absoluto. A fim de minimizar estes erros e variações, pode ser vantajoso ter como alvo a razão de corante da solução para dentro de +/-15% da mistura desejada, ou dentro de +/- 10% da mistura desejada a partir do processo de fabricação. O processo de fabricação normalmente não é bem controlado o suficiente para misturar simplesmente uma mistura de 50:50 dos corantes e atender a essas especificações, então uma etapa adicional no processo é necessária para ajustar a mistura de corantes, com um fluorímetro.
[0119] As variações percentuais aceitáveis descritas acima foram determinadas através do estudo da relação entre a variação na mistura de corante e CTS. Um Ct é uma abreviatura comum para um "ciclo limite". A PCR quantitativa (qPCR) pode fornecer um método para determinar a quantidade de uma sequência alvo ou um gene que está presente em uma amostra. Durante a PCR, uma amostra biológica é submetida a uma série de 35 ou 40 ciclos de temperatura. Um ciclo pode ter várias temperaturas. Para cada ciclo de temperatura a quantidade de sequência alvo pode teoricamente dobrar e é dependente de um número de fatores não apresentados aqui. Uma vez que a sequência alvo contém um corante fluorescente, à medida que a quantidade de sequência alvo aumenta, ou seja, é amplificada durante os ciclos de temperatura de 35 ou 40, a solução de amostra apresenta fluorescência mais brilhante e mais brilhante com cada ciclo térmico. A quantidade de fluorescência requerida que deve ser medida por um detector de fluorescência é frequentemente referida como um "limite", e o número do ciclo em que a fluorescência é detectada é referido como o "ciclo limite" ou Ct. Portanto, ao saber quão eficiente é a amplificação e o Ct, a quantidade de sequência alvo na amostra original pode ser determinada.
[0120] A variação percentual tolerada descrita acima também pode estar relacionada com o desvio padrão dos desvios de Ct no instrumento. Foi determinado que uma variação de +/- 15% na mistura corante pode resultar em um desvio padrão de 0,2 Ct, que pode ser de 2 desvios padrão.
[0121] Conforme apresentado acima, a capacidade para comparar de forma confiável os resultados experimentais a partir de vários instrumentos é desejável e a variabilidade de instrumento para instrumento é frequentemente um problema. Esta variabilidade pode resultar de duas fontes; a variabilidade dos componentes dentro dos instrumentos como, por exemplo, de lâmpadas e filtros e a variabilidade ao longo do tempo, como, por exemplo, envelhecimento de lâmpadas e filtro. Seria vantajoso implementar um processo por meio do qual os resultados experimentais a partir de múltiplos instrumentos possam ser comparados de forma confiável, fácil e barata. Os ensinamentos aqui encontrados divulgam um tal processo.
[0122] A quantidade de sinal de fluorescência de uma amostra de um sistema óptico pode ser dependente de vários fatores. Alguns dos fatores podem incluir, mas não se limitam a, o comprimento de onda da luz de fluorescência, a eficiência do detector nesse comprimento de onda da luz de fluorescência, a eficiência do filtro de emissão, a eficiência do filtro de excitação e a eficiência do corante. Os presentes ensinamentos sugerem que a variabilidade de instrumento para instrumento pode ser minimizada se os elementos ópticos físicos dos instrumentos podem ser normalizados.
[0123] Em uma modalidade, os fatores de normalização podem ser derivados a partir de espectros de corante puro em vez de a partir de misturas de corantes. Os corantes puros podem ser mais fáceis de fabricar do que as misturas de corantes, porque as concentrações não têm que ser exatas, e há apenas um componente fluorescente. Este conceito foi testado através da normalização de 2 conjuntos de filtros em um instrumento utilizando 10 corantes puros e comparando os resultados com a normalização obtida a partir do uso de misturas de corantes. A normalização foi implementada pela determinação de um fator de correção para cada filtro de excitação e filtro de emissão. Os fatores de correção resultantes podem ser usados para normalizar qualquer combinação de corantes, mesmo a partir de diferentes instrumentos.
[0124] Em outra modalidade, a normalização ensinada acima foi aplicada a múltiplos instrumentos de vários tipos. Oito soluções de mistura de corantes e 10 soluções de corantes puros foram criadas. Cada solução foi pipetada para 8 poços de três placas de 96 poços. A interferência espacial potencial foi minimizada por pipetagem em todos os outros poços. As misturas de corantes utilizados são mostradas na FIG. 12A e os corantes puros utilizados são mostrados na FIG.12A e os corantes puros utilizados são mostrados na FIG. 4B. Além disso, os instrumentos utilizados incluíram 6 conjuntos de filtros. A FIG 12B identifica ainda os pares de filtros para o canal óptico principal para cada corante puro. O filtro de excitação é representado com um "X" e o filtro de emissão é representado com um "M".
[0125] Em um esforço para quantificar a eficácia do processo de normalização, as razões de corante foram medidas antes e após a normalização. A FIG 13 mostra a porcentagem de desvio das misturas de corantes a partir da razão média para 17 instrumentos testados. Os instrumentos são marcados no eixo X e a porcentagem de desvio é no eixo Y. Um versado na técnica Estes dados, como consequência, demonstram a necessidade de um processo de normalização melhorado, tais como os presentes ensinamentos. Os presentes ensinamentos foram aplicados a todos os 17 instrumentos.
[0126] Os ensinamentos atuais foram aplicados a todos os 17 instrumentos. O método de normalização determina um fator de correção para cada filtro individual, em vez de para cada razão de corante. Uma vez que os instrumentos providos com 6 filtros de excitação e 6 de emissão, 12 fatores foram determinados. O processo é mostrado na FIG. 16 e no fluxograma 1600. Na etapa 1605, os espectros de calibração foram gerados por múltiplos corantes em múltiplas combinações de filtro. Para os instrumentos a serem normalizados, houve 10 corantes puros e 21 combinações de filtro. Na etapa 1610, os espectros foram normalizados de modo que o sinal máximo é 1. Na etapa 1615 os espectros de corante são calculados através de múltiplos poços. Este cálculo irá resultar na produção de um espectro por corante. Coletivamente, os espectros de corante podem ser referidos como uma matriz de corante "M" contendo o corante e combinações de filtros. Neste ponto, um instrumento de referência é identificado. O instrumento de referência seria um instrumento ou grupo de instrumentos em que os instrumentos de teste serão normalizados. O mesmo conjunto de espectros de corante utilizado no instrumento de teste pode ser obtido a partir do(s) instrumento(s) de referência. Em algumas modalidades, a referência pode ser um grupo de instrumentos. Em tal modalidade, os espectros para cada corante podem ser calculados em todo o grupo. Esta etapa está representada no fluxograma 1600 na etapa 1620. Como um exemplo, os espectros de referência podem ser referidos como matriz "Mref'.
[0127] Na etapa 1625 cada um dos filtros 12 tem um fator de ajustamento inicialmente definido como 1. O que é desejado, é multiplicar os fatores de ajuste pela matriz "M" enquanto iterativamente modificando os fatores de ajuste entre 0 e terra, de preferência, entre 0,04 e 1 até que a diferença entre a matriz "M" e a matriz Mref seja minimizada como mostrado na etapa 1630. Na etapa 1635, os fatores de correção de cada par de filtros são calculados. O fator de correção para cada par de filtro é o produto do fator de filtro de emissão vezes o fator de filtro de excitação. Os pares de filtros de canal principais são mostrados na FIG. 4B. Uma vez que os fatores de correção para cada par de filtros foram determinados, cada fator de par de filtros pode então ser multiplicado pelos dados de fluorescência para o instrumento de teste, bem como para os espectros de corante puro. Os espectros de corante puro corrigidos podem, em seguida, ser renormalizados para um valor máximo de 1, como mostrado na etapa 1645. A etapa final do processo na etapa 1650 é a de gerar dados de múltiplos componentes. Um versado na técnica compreenderá o procedimento de múltiplos componentes como sendo o produto dos dados de fluorescência e o pseudo-inverso da matriz de corante. Os valores de múltiplos componentes já estão normalizados por isso não seria necessário fazer correções específicas de corante, uma vez que os dados já foram normalizados ao nível do filtro.
[0128] Após a conclusão da normalização, a % de desvio das misturas de corantes a partir da razão da média foi calculada em todos os 17 instrumentos. Os resultados são mostrados na FIG. 14. Estes resultados são significativamente melhorados em comparação com os dados na FIG. 13 antes da normalização. Uma vista mais próxima dos dados normalizados é mostrada na FIG. 15, em que os desvios após a normalização foram reduzidos para +/- 8%, o que é bem abaixo do alvo de +/- 15%, como apresentado anteriormente.
VALIDAÇÃO DE RNASE P
[0129] Como mencionado acima, é importante validar um instrumento para ter certeza de que ele está funcionando corretamente, especialmente depois de uma nova instalação ou depois de vários usos. Desta forma, um usuário pode ter certeza que os resultados e análises experimentais são precisos e confiáveis. Anteriormente, um ensaio de validação foi realizado no instrumento por um usuário e o usuário realizou manualmente a análise de dados sobre os dados de amplificação a partir do ensaio de verificação para validar o instrumento. Devido a análise dos dados ter sido realizada manualmente pelo usuário, o processo de validação foi mais propenso a erros e demorado.
[0130] De acordo com várias modalidades dos presentes ensinamentos, são fornecidos métodos e sistemas de validação automatizados. Um exemplo de um ensaio de validação é um teste de RNase P. Um exemplo de um ensaio de validação é um ensaio de RNase P. No entanto, como usado aqui, o ensaio de validação pode ser qualquer ensaio que tenha propriedades conhecidas e confiáveis e que possam ser utilizados para validar um instrumento.
[0131] Após a instalação e após vários usos, é importante validar que o instrumento está funcionando corretamente. Depois da instalação e depois de vários usos, é importante validar que o instrumento está funcionando corretamente. O gene RNase P é um gene de cópia única que codifica a porção RNA da enzima RNase P. É frequentemente usado como um ensaio de validação por causa de suas propriedades e características conhecidas.
[0132] Uma placa de validação é pré-carregada com os reagentes necessários para a detecção e quantificação de cópias genômicas de amostra. Por exemplo, em uma placa de validação de RNase P, cada poço contém mistura de PCR mestre, iniciadores de RNase P, sonda marcada com corante FAM™, e uma concentração conhecida de molde de DNA genômico humano.
[0133] Em um exemplo de ensaio de RNAase P tradicional, uma curva padrão é gerada a partir dos valores de Ct (limite de ciclos) obtidos de um conjunto de padrões replicados (cópias 1250, 2500, 5000, 10000 e 20000). A curva padrão é então usada para determinar o número de cópias para dois conjuntos de moldes desconhecidos (populações de replicata 5000 e 10000). O instrumento é validado se ele puder demonstrar a capacidade de distinguir entre 5.000 e 10.000 equivalentes genômicos com um nível de confiança de 99,7% para um teste de amostra subsequente em um único poço.
[0134] Para aprovação da instalação, os instrumentos têm que demonstrar a capacidade de distinguir entre 5.000 e 10.000 equivalentes genômicos com um nível de confiança de 99,7% para um teste de amostra subsequente em um único poço.
[0135] De acordo com várias modalidades, os presentes ensinamentos podem incorporar conhecimento especializado em um sistema de calibração e de validação automatizado fornecendo feedback do estado de aprovação/reprovação e da resolução de problemas quando uma falha é identificada. Se um instrumento falhar o processo de validação, o usuário sabe que um engenheiro em serviço pode ser chamado, por exemplo. Os presentes ensinamentos podem minimizar o custo e o tempo necessário para os procedimentos de instalação e calibração.
[0136] Conforme indicado acima, de acordo com várias modalidades aqui descritas, o objetivo de uma análise de validação é confirmar que as duas quantidades de uma mesma amostra são suficientemente distinguíveis pelo instrumento. Desta forma, o desempenho do instrumento pode ser validado.
[0137] De acordo com várias modalidades dos presentes ensinamentos, é fornecido um método e sistema de validação automatizado. Os valores limite de ciclo (Cts) de um ensaio de validação são analisados e comparados por um sistema para determinar se um instrumento pode distinguir suficientemente duas quantidades de uma amostra. Um exemplo de um ensaio de validação é um teste de RNase P. Um exemplo de um ensaio de validação é o ensaio de RNAase P. Neste exemplo, um sistema determina os valores de Ct gerados para as amostras de RNase P de cópias genômicas de 5000 e 10000 para determinar se os dados a partir das cópias genômicas de 5000 e 10000 são suficientemente distinguíveis. Suficientemente distinguíveis, de acordo com as modalidades aqui descritas, significa, pelo menos, 3 desvios padrão (3o) (-99,7%) se separam dos dados de amplificação das cópias genômicas de 5000 e 10000. O método de acordo com várias modalidades é descrito mais abaixo com referência às FIGS. 17 e 18.
[0138] A FIG. 17 ilustra um método exemplificador para validar um instrumento de acordo com várias modalidades aqui descritas. Em geral, começa-se na etapa 1702 recebendo dados de amplificação a partir de uma placa de ensaio de validação para gerar uma pluralidade de curvas de amplificação, cada uma correspondendo a um poço na placa.
[0139] As placas contêm uma pluralidade de poços. Em alguns exemplos, uma placa contém 96 poços. Em outros exemplos, uma placa contém 384 poços. Uma porção dos poços na placa pode conter uma amostra de uma primeira quantidade e um outra porção dos poços na placa pode conter uma amostra de uma segunda quantidade. A primeira quantidade e a segunda quantidade são diferentes. A segunda quantidade é maior do que a primeira quantidade de várias modalidades aqui descritas. A segunda quantidade pode ser uma diferença de 1,5 vezes da primeira quantidade, em algumas modalidades. Em outras modalidades, a segunda quantidade pode ser uma diferença de 2 vezes da primeira quantidade. De acordo com várias modalidades aqui descritas, a segunda quantidade pode ser qualquer diferença de número de vezes da primeira quantidade. Em algumas modalidades, a primeira quantidade pode ser de 5000 cópias genômicas por poço e a segunda quantidade pode ser de 10000 cópias genômicas por poço.
[0140] Com referência de novo à FIG. 17, na etapa 1704, uma pluralidade delimites de fluorescência é determinada com base na pluralidade de curvas de amplificação geradas. As regiões exponenciais da pluralidade de curvas de amplificação são comparadas para determinar uma faixa de valores de fluorescência quando as regiões exponenciais caem. Por exemplo, a faixa de valores de fluorescência a partir do menor valor da fluorescência de uma parte inferior de uma região exponencial para o maior valor de fluorescência de uma parte superior de uma região exponencial da pluralidade de curvas de amplificação é determinada. A faixa de valores de fluorescência é usada na análise automatizada de uma pluralidade de curvas de amplificação para validar o instrumento de acordo com as modalidades dos presentes ensinamentos.
[0141] Com referência à FIG. 19, uma pluralidade de curvas de amplificação e determinação de uma faixa de valores de fluorescência e limite de ciclo correspondente é ilustrada. Cada uma das pluralidades de curvas de amplificação inclui uma região exponencial da curva. O eixo 1902 indica os valores de fluorescência. O eixo 1904 ilustra números de ciclo. A faixa de fluorescência 1906 mostra a faixa de valores de fluorescência a partir do menor valor de fluorescência de uma parte inferior determinada de uma região exponencial da pluralidade de regiões exponenciais e do maior valor de fluorescência de uma parte superior determinada de uma região exponencial da pluralidade de regiões exponenciais. De acordo com várias modalidades, a faixa de valores de fluorescência é dividida uniformemente por um número predeterminado para gerar um conjunto de valores de fluorescência para análise automatizada pelo sistema. Em um exemplo, a faixa de valores de fluorescência 1906 é dividida por 100 para determinar valores de fluorescência 100 para um conjunto de limites de fluorescência. Em algumas modalidades, os 5 valores de fluorescência da parte superior e os 5 valores de fluorescência da parte inferior são descartados de modo que a análise prossegue com um conjunto de 90 limites de fluorescência.
[0142] Com referência de novo à FIG. 17, na etapa 1706, para cada valor de fluorescência do conjunto de valores de fluorescência, o limite de ciclo (Ct) é determinado para cada pluralidade de curvas de amplificação geradas a partir dos poços que contêm a primeira quantidade da amostra. De modo semelhante, para cada valor de fluorescência do conjunto de valores de fluorescência, o limite de ciclo (Ct) é determinado para cada pluralidade de curvas de amplificação geradas a partir de poços que contêm a segunda quantidade da amostra.
[0143] Na etapa 1708, usando-se os valores de Ct para a primeira e a segunda quantidades para cada um dos valores de fluorescência do conjunto, é determinado se a primeira e a segunda quantidades são suficientemente distinguíveis. Suficientemente distinguíveis, de acordo com várias modalidades, significa que, usando-se a equação (1), se obtém um resultado positivo para, pelo menos, um dos valores de fluorescência do conjunto:
Figure img0003
[0144] A Equação 1 determina se uma primeira e uma segunda quantidade são suficientemente distinguíveis, onde quant2 é maior do que quant1, de acordo com as modalidades aqui descritas. Suficientemente distinguíveis significa que pelo menos 3 desvios padrão (3o) (-99,7%) separam os valores de Ct da primeira e da segunda quantidades. Se se verificar que as quantidades são suficientemente distinguíveis, uma indicação é fornecida ao usuário de que o instrumento está validado.
[0145] A FIG. 18 ilustra outro método exemplificador para validação de um instrumento de acordo com várias modalidades aqui descritas. Na etapa 1802, os dados de amplificação são recebidos a partir de uma pluralidade de amostras compreendidas nos poços de uma placa de validação. Uma porção dos poços na placa de validação contém uma amostra em uma primeira quantidade. Outra porção dos poços da placa de validação contém a amostra em uma segunda quantidade. A primeira quantidade e a segunda quantidade são diferentes. A segunda quantidade pode ser uma diferença de 1,5 vezes da primeira quantidade, em algumas modalidades. Em outras modalidades, a segunda quantidade pode ser uma diferença de 2 vezes da primeira quantidade. De acordo com várias modalidades aqui descritas, a segunda quantidade pode ser qualquer diferença de número de vezes da primeira quantidade. Em algumas modalidades, a primeira quantidade pode ser de 5000 cópias genômicas por poço e a segunda quantidade pode ser de 10000 cópias genômicas por poço.
[0146] Na etapa 1804, um primeiro conjunto de limites de fluorescência é determinado com base na pluralidade de curvas de amplificação geradas. As regiões exponenciais da pluralidade de curvas de amplificação são comparadas para determinar uma faixa de valores de fluorescência quando as regiões exponenciais caem. Por exemplo, a faixa de valores de fluorescência a partir do menor valor da fluorescência de uma parte inferior de uma região exponencial para o maior valor de fluorescência de uma parte superior de uma região exponencial da pluralidade de curvas de amplificação é determinada. A faixa de valores de fluorescência é usada na análise automatizada de uma pluralidade de curvas de amplificação para validar o instrumento de acordo com as modalidades dos presentes ensinamentos.
[0147] De acordo com várias modalidades, a faixa de valores de fluorescência é dividida uniformemente por um número predeterminado para gerar um conjunto de valores de fluorescência para análise automatizada pelo sistema. Em um exemplo, a faixa de valores de fluorescência 1906 é dividida por 100 para determinar valores de fluorescência 100 para um conjunto de limites de fluorescência. Em algumas modalidades, os 5 valores de fluorescência da parte superior e os 5 valores de fluorescência da parte inferior são descartados de modo que a análise prossegue com um conjunto de 90 limites de fluorescência.
[0148] Na etapa 1806, para cada limite de fluorescência do conjunto, um primeiro conjunto de valores de Ct para as curvas de amplificação correspondentes à primeira quantidade é determinado. De modo semelhante, para cada limite de fluorescência do conjunto, um segundo conjunto de valores de Ct para as curvas de amplificação correspondentes à primeira quantidade é determinado. Isto é repetido para cada limite de fluorescência no conjunto.
[0149] Em algumas modalidades, um número predeterminado de valores de Ct discrepantes é removido a partir de cada conjunto de valores de Ct antes cálculos adicionais serem realizados. Por exemplo, em algumas modalidades, se uma placa de 96 poços é usada, 6 valores discrepantes são removidos a partir de cada conjunto de valores de Ct. Um valor discrepante é um valor de Ct mais afastado do valor médio do conjunto de valores de Ct. Em outro exemplo, se uma placa de 364 é usada, 10 de valores discrepantes são removidos a partir de cada conjunto de valores de Ct. Depois dos valores discrepantes serem removidos, os valores de Ct restantes de cada conjunto são utilizados nas etapas restantes do método.
[0150] Na etapa 1808, para cada conjunto de valores de Ct, uma média é calculada. Em outras palavras, uma primeira média de Ct é calculada para a primeira quantidade de curvas de amplificação e uma segunda média de Ct é calculada para a segunda quantidade de curvas de amplificação para cada limite de fluorescência do conjunto determinado na etapa 1804.
[0151] Semelhante à etapa 1808, na etapa 1810, 3 desvios padrão de cada conjunto de valores de Ct são calculados. Em outras palavras, um primeiro de 3 desvios padrão é calculado para a primeira quantidade de curvas de amplificação e um segundo de 3 desvios padrão é calculado para a segunda quantidade das curvas de amplificação para cada limite de fluorescência do conjunto determinado na etapa 1804.
[0152] Para determinar se os valores de Ct da primeira quantidade e da segunda quantidade, ou suficientemente distinguíveis, os valores de Ct em um valor de fluorescência, de acordo com várias modalidades, e os valores de Ct são comparados. De acordo com várias modalidades, a equação (2) é utilizada para a comparação.
Figure img0004
[0153] A Equação 2 determina se uma primeira e uma segunda quantidades são suficientemente distinguíveis, de acordo com as modalidades aqui descritas. Suficientemente distinguíveis significa que pelo menos 3 desvios padrão (3o) (-99,7%) separam os valores de Ct da primeira e da segunda quantidades.
[0154] Na etapa 1814, os resultados da equação (2) para todos os limites de fluorescência do conjunto são comparados para determinar um valor máximo. Se o valor máximo é um número positivo, o instrumento pode distinguir suficientemente entre a primeira e a segunda quantidades e uma indicação de que o instrumento é validado é fornecida ao usuário na etapa 1816. Se o valor máximo é um número negativo, o instrumento pode não distinguir suficientemente entre a primeira e a segunda quantidade e uma indicação de que o instrumento falhou na validação é fornecida ao usuário na etapa 1818. A FIG. 20 ilustra um sistema 2000 para a validação de um instrumento de acordo com várias modalidades aqui descritas. O sistema 2000 inclui interface de instrumento de PCR 2002, banco de dados de Ct 2004, mecanismo de exibição /GUI 2006, calculador de Ct 2008 e validador 2010.
[0155] A interface de instrumento PCR 2002 recebe os dados de amplificação a partir do instrumento de PCR para gerar curvas de amplificação. Como descrito acima, o instrumento de PCR amplifica as amostras contidas na placa de validação. A placa de validação inclui uma porção de poços contendo uma amostra de uma primeira quantidade e a outra porção de poços contendo uma amostra de uma segunda quantidade. Os dados de fluorescência gerados a partir da amplificação das amostras são recebidos pela interface de instrumento de PCR 2002.
[0156] Depois de um conjunto de limites de fluorescência ser determinado tal como nas etapas 1704 e 1804, com referência às FIGS. 17 e 18, respectivamente, o calculador de Ct 2006 calcula um primeiro e segundo conjunto de valores de Ct correspondentes para as curvas de amplificação geradas a partir das amostras da primeira quantidade e da segunda quantidade, respectivamente. Um primeiro e um segundo conjunto de valores de Ct é calculado para cada limite de fluorescência no conjunto delimites de fluorescência. A pluralidade de conjuntos de valores de Ct é armazenada em base de dados de Ct 2004.
[0157] O validador 2010 determina se a primeira e a segunda quantidades são suficientemente distinguíveis como descrito na etapa 1708 na FIG. 17 e nas etapas 1810 e 1812 na FIG. 18.
[0158] O mecanismo de exibição/GUI mostra a pluralidade de curvas de amplificação para o usuário. Além disso, após o validador 2010 determinar se a primeira e a segunda quantidades são suficientemente distinguíveis, o mecanismo de exibição/GUI 2006 mostra uma indicação de validação ou falha de validação para o usuário.
[0159] Além disso, um limite de fluorescência ótimo pode ser determinado. O limite de fluorescência ótimo pode ser determinado por, de acordo com várias modalidades, seleção do valor de Ct que resulta na separação máxima entre
Figure img0005
. Além disso, o limite de fluorescência ótimo pode também ser selecionado com base no valor de Ct que resultou no menor número possível de valores discrepantes determinados. O limite de fluorescência ótimo pode também ser selecionado com base no valor de Ct que resultou na separação máxima entre
Figure img0006
com o menor número de valores discrepantes determinados.
CORREÇÃO AUTOMÁTICA DE CORANTE
[0160] De acordo com várias modalidades dos presentes ensinamentos, métodos de correção automática de corante podem ser usados para realização de uma calibração espectral em tempo real dos dados de múltiplos componentes. A correção automática de corante pode ser realizada em tempo real ou após os dados de amplificação serem coletados e a análise secundária ser realizada. No algoritmo de correção automática de corante, uma matriz de correlação de múltiplos componentes é gerada. De acordo com várias modalidades, um algoritmo de correção automática de corante ajusta os elementos da matriz de corante de modo que os termos fora da diagonal da matriz de correlação de múltiplos componentes são minimizados. Desta maneira, os erros nas determinações de Ct são minimizados.
CALIBRAÇÃO AUTOMÁTICA DE FUNDO
[0161] De acordo com várias modalidades dos presentes ensinamentos, uma calibração automática de fundo pode ser realizada para reduzir a necessidade de uma placa de calibração de fundo e melhorar a eficácia global da correção de fundo.
[0162] Contaminantes físicos no bloco (partículas ou química) que ocorrem durante o uso do instrumento podem impactar negativamente os resultados da análise do sistema inflando artificialmente certos componentes espectrais dos poços analisadas que são impactados pela contaminação. A recalibração pode resolver este problema. No entanto, para prolongar os períodos entre as calibrações requeridas, um método para calcular/compensar automaticamente as mudanças de fundo após a calibração de fundo é descrito. Para realizar a calibração automática de fundo, um método é realizado usando o bloco vazio/desocupado. O sinal de vazamento eficaz para consumíveis é conhecido (determinado empiricamente), e os coeficientes angulares e deslocamentos de calibração de fundo eficazes podem ser aproximados utilizando fatores de escala que tornam o sinal vazamento eficaz.
DETECÇÃO DE PLACA
[0163] De acordo com várias modalidades aqui descritas, os métodos de detecção da placa podem ser realizados para identificar os erros no posicionamento da placa no instrumento.
[0164] Durante o uso do instrumento, os elementos ópticos do sistema são posicionados quer no limite superior (durante os períodos de repouso), ou no limite inferior (durante a operação) do trajeto. A capacidade de leitura da posição dos elementos ópticos em uma localização intermediária entre os limites de trajeto não foi projetada para o hardware; como tal, não se pode confiar no valor de posição do motor para determinar se uma placa ou tubo está presente ou ausente (onde a diferença na posição dos elementos ópticos seria causada pela espessura do material adicionado a partir do tubo ou placa presente). Sem a necessidade de um componente adicional para a placa ou tubo de detecção (tal como um interruptor de depressão ou sensor de posição), a câmara de detecção no sistema é utilizada para a detecção da amostra. No entanto, uma vez que apenas uma pequena porção da região de bloco é capturada por meio do uso de uma matriz de lentes da poço discreta e segregada (cada lente na matriz focaliza e coleta a luz a partir de uma e apenas um poço), uma 'foto' tradicional do plano consumível que captura a região de bloco inteiro não pode ser adquirida para o processamento de imagens. Uma vez que apenas a luz focalizada de cada poço é coletada e manifesta-se como um ponto de brilho circular no detector, não existe qualquer faixa espacial ou dinâmica na imagem detectada. No entanto, se os elementos ópticos são movidos para uma posição intermediária que permite a focalização sobre a vedação ou tampa de um recipiente, este ponto do foco pode ser capturado como uma imagem refletida (em contraste com a fluorescência, que é o sinal normal coletado pelo sistema), e utilizado para a detecção da placa/tubo. O ponto de foco seria menor do que um poço, e isso se manifestaria na imagem capturada como uma pequena região brilhante em relação ao tamanho de um poço (conhecida como a região de investigação, ROI). Compreendendo-se que o ponto de foco pode produzir pixels brilhantes e todas as outras regiões podem produzir pixels mais escuros, uma análise numérica da informação de nível de pixel pode produzir uma determinação da presença/ausência, de acordo com várias modalidades aqui descritas.
NORMALIZAÇÃO DO INSTRUMENTO USANDO UM MATERIAL REFLEXIVO
[0165] De acordo com várias modalidades dos presentes ensinamentos, a normalização do instrumento com o uso de um material reflexivo, tal como um fotodiodo, pode ser usada para calibração automática do instrumento depois de quaisquer calibrações iniciais feitas após a fabricação ou instalação.
[0166] De acordo com várias modalidades, um material reflexivo estável é medido durante a fabricação como um controle. O material reflexivo pode ser colocado por cima da tampa aquecida. Subsequentemente, o material reflexivo estável pode ser medido em todos os canais para detectar quaisquer alterações ou variabilidade. Quaisquer alterações ou variabilidade podem ser utilizadas para ajustar os fatores de equilíbrio de cor, como descrito acima no método de calibração de normalização de instrumento para renormalizar as mudanças na luz de excitação.
EXEMPLOS
[0167] No exemplo 1, um método para calibração de um instrumento é fornecido, em que o instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação compreendendo: realizar uma calibração da região de interesse (ROI) para determinar as posições do local de reação em uma imagem; realizar uma calibração com corante puro para determinar a contribuição de um corante fluorescente utilizado em cada local de reação comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente; realizar uma calibração de normalização do instrumento para determinar um fator de normalização de filtro; e realizar uma validação de RNase P para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades de amostra diferentes.
[0168] No exemplo 2, o exemplo 1 é fornecido, em que a calibração da ROI compreende: estimar a região de interesse (ROI) inicial a partir de limites de fluorescência de cada poço de amostra; estimar os locais de centro de cada ROI; estimar o tamanho de cada ROI; determinar o tamanho médio das ROIs da pluralidade de locais de reação; derivar os modelos de grade globais; aplicar os modelos de grade globais às ROIs, em que a aplicação dos modelos de grade globais melhora a precisão dos locais de centro da ROI; recuperar as ROIs ausentes; e ajustar o raio das ROIs, em que o ajuste melhora a razão de sinal para ruído do sistema óptico.
[0169] No exemplo 3, o exemplo 1 é fornecido, em que a calibração da ROI melhora os erros de determinação do local de reação, minimizando pelo menos um dos seguintes grupos: saturação do corante dentro da pluralidade de locais de reação, rotação da grade, variação dos fatores de ampliação, e distorção radial óptica.
[0170] No exemplo 4, o exemplo 1 é fornecido, em que a calibração do corante puro compreende: imagear um suporte de amostra, carregado para o instrumento, em mais do que um canal, o suporte de amostra compreendendo uma pluralidade de locais de reação e mais do que um tipo de corante, cada corante ocupando mais do que um local de reação; identificar um canal de pico para cada corante sobre o suporte de amostra; normalizar cada canal para o canal de pico para cada corante; e produzir uma matriz de corante compreendendo um conjunto de valores de referência de corantes.
[0171] No exemplo 5, o exemplo 4 é fornecido, em que imageamento do suporte de amostra é realizado quatro vezes para o imageamento de quatro diferentes suportes de amostra.
[0172] No exemplo 6, o exemplo 1 é fornecido, em que o sistema óptico compreende uma pluralidade de filtros de excitação e uma pluralidade de filtros de emissão, e em que a calibração de normalização do instrumento compreende: determinar um primeiro fator de correção para cada um dos filtros de excitação e dos filtros de emissão; calcular um segundo fator de correção para um par de filtros, em que cada par de filtros compreende um filtro de excitação e um filtro de emissão; e aplicar os segundos fatores de correção aos dados de filtro.
[0173] No exemplo 7, o exemplo 1 é fornecido, em que o fator de normalização de filtro permite que os dados do instrumento sejam comparados com os dados de um segundo instrumento.
[0174] No exemplo 8, o exemplo 1 é fornecido, em que a validação de RNase P compreende: receber dados de amplificação a partir de uma placa de validação para gerar uma pluralidade de curvas de amplificação, em que a placa de validação inclui uma amostra de uma primeira quantidade e uma segunda quantidade, e cada curva de amplificação inclui uma região exponencial; determinar um conjunto de limites de fluorescência com base nas regiões exponenciais da pluralidade de curvas de amplificação; determinar, para cada limite de fluorescência do conjunto, um primeiro conjunto de valores de limite de ciclo (Ct) de curvas de amplificação geradas a partir das amostras da primeira quantidade e um segundo conjunto de valores de Ct das curvas de amplificação geradas a partir das amostras da segunda quantidade; e calcular se a primeira e a segunda quantidades são suficientemente distinguíveis com base em valores de Ct em cada uma das pluralidades de limites de fluorescência.
[0175] No exemplo 9, o exemplo 1 é fornecido, em que a validação de RNase P é realizada por um processador conectado ao instrumento.
[0176] No exemplo 10, o exemplo 8, é fornecido, em que a validação de RNase P compreende ainda: exibir uma indicação de validação ou falha do instrumento em uma tela de exibição.
[0177] No exemplo 11, o exemplo 1 é fornecido, compreendendo ainda: realizar uma correção automática de corante para calibração espectral em tempo real dos dados de múltiplos componentes; realizar uma detecção de placa para determinar se existe um erro de carregamento de placa; realizar uma calibração automática do fundo para compensar as alterações de fundo; e realizar a normalização do instrumento com o uso de um material reflexivo para detectar quaisquer alterações ou variabilidade nas emissões fluorescentes.
[0178] No exemplo 12, um método para calibração de um instrumento é fornecido, em que o instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação compreendendo: realizar uma calibração da região de interesse (ROI) para determinar as posições do local de reação em uma imagem; realizar uma calibração com corante puro para determinar a contribuição de um corante fluorescente utilizado em cada local de reação comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente; realizar uma calibração de normalização do instrumento para determinar um fator de normalização de filtro; e realizar uma validação de RNase P para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades de amostra diferentes.
[0179] No exemplo 13, o exemplo 12 é fornecido, em que a calibração da ROI compreende: estimar a região de interesse (ROI) inicial a partir de limites de fluorescência de cada poço de amostra; estimar os locais de centro de cada ROI; estimar o tamanho de cada ROI; determinar o tamanho médio das ROIs da pluralidade de locais de reação; derivar os modelos de grade globais; aplicar os modelos de grade globais às ROIs, em que a aplicação dos modelos de grade globais melhora a precisão dos locais de centro da ROI; recuperar as ROIs ausentes; e ajustar o raio das ROIs, em que o ajuste melhora a razão de sinal para ruído do sistema óptico.
[0180] No exemplo 14, o exemplo 12 é fornecido, em que a calibração da ROI melhora os erros de determinação do local de reação, minimizando pelo menos um dos seguintes grupos: saturação do corante dentro da pluralidade de locais de reação, rotação da grade, variação dos fatores de ampliação, e distorção radial óptica.
[0181] No exemplo 15, o exemplo 12 é fornecido, em que a calibração do corante puro compreende: imagear um suporte de amostra, carregado para o instrumento, em mais do que um canal, o suporte de amostra compreendendo uma pluralidade de locais de reação e mais do que um tipo de corante, cada corante ocupando mais do que um local de reação; identificar um canal de pico para cada corante sobre o suporte de amostra; normalizar cada canal para o canal de pico para cada corante; e produzir uma matriz de corante compreendendo um conjunto de valores de referência de corantes.
[0182] No exemplo 16, o exemplo 15 é fornecido, em que imageamento do suporte de amostra é realizado quatro vezes para o imageamento de quatro diferentes suportes de amostra.
[0183] No exemplo 17, o exemplo 12 é fornecido, em que o sistema óptico compreende uma pluralidade de filtros de excitação e uma pluralidade de filtros de emissão, e em que a calibração de normalização do instrumento compreende: determinar um primeiro fator de correção para cada um dos filtros de excitação e dos filtros de emissão; calcular um segundo fator de correção para um par de filtros, em que cada par de filtros compreende um filtro de excitação e um filtro de emissão; e aplicar os segundos fatores de correção aos dados de filtro.
[0184] No exemplo 18, o exemplo 12 é fornecido, em que o fator de normalização de filtro permite que os dados do instrumento sejam comparados com os dados de um segundo instrumento.
[0185] No exemplo 19, o exemplo 12 é fornecido, em que a validação de RNase P compreende: receber dados de amplificação a partir de uma placa de validação para gerar uma pluralidade de curvas de amplificação, em que a placa de validação inclui uma amostra de uma primeira quantidade e uma segunda quantidade, e cada curva de amplificação inclui uma região exponencial; determinar um conjunto de limites de fluorescência com base nas regiões exponenciais da pluralidade de curvas de amplificação; determinar, para cada limite de fluorescência do conjunto, um primeiro conjunto de valores de limite de ciclo (Ct) de curvas de amplificação geradas a partir das amostras da primeira quantidade e um segundo conjunto de valores de Ct das curvas de amplificação geradas a partir das amostras da segunda quantidade; e calcular se a primeira e a segunda quantidades são suficientemente distinguíveis com base em valores de Ct em cada uma das pluralidades de limites de fluorescência.
[0186] No exemplo 20, o exemplo 12 é fornecido, em que a validação de RNase P é realizada por um processador conectado ao instrumento.
[0187] No exemplo 21, o exemplo 19 é fornecido, em que as instruções para a validação de RNase P compreendem ainda instruções para: exibir uma indicação de validação ou falha do instrumento em uma tela de exibição.
[0188] No exemplo 22, o exemplo 12 é fornecido, compreendendo ainda: realizar uma correção automática de corante para calibração espectral em tempo real dos dados de múltiplos componentes; realizar uma detecção de placa para determinar se existe um erro de carregamento de placa; realizar uma calibração automática do fundo para compensar as alterações de fundo; e realizar a normalização do instrumento com o uso de um material reflexivo para detectar quaisquer alterações ou variabilidade nas emissões fluorescentes.
[0189] No exemplo 23, um método para calibração de um instrumento, em que o instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação é fornecido compreendendo: realizar uma calibração da região de interesse (ROI) para determinar as posições do local de reação em uma imagem; realizar uma calibração com corante puro para determinar a contribuição de um corante fluorescente utilizado em cada local de reação comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente; realizar uma calibração de normalização do instrumento para determinar um fator de normalização de filtro; e realizar uma validação de RNase P para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades de amostra diferentes.
[0190] No exemplo 24, o exemplo 23 é fornecido, em que a calibração da ROI compreende: estimar a região de interesse (ROI) inicial a partir de limites de fluorescência de cada poço de amostra; estimar os locais de centro de cada ROI; estimar o tamanho de cada ROI; determinar o tamanho médio das ROIs da pluralidade de locais de reação; derivar os modelos de grade globais; aplicar os modelos de grade globais às ROIs, em que a aplicação dos modelos de grade globais melhora a precisão dos locais de centro da ROI; recuperar as ROIs ausentes; e ajustar o raio das ROIs, em que o ajuste melhora a razão de sinal para ruído do sistema óptico.
[0191] No exemplo 25, o exemplo 23 é fornecido, em que a calibração da ROI melhora os erros de determinação do local de reação, minimizando pelo menos um dos seguintes grupos: saturação do corante dentro da pluralidade de locais de reação, rotação da grade, variação dos fatores de ampliação, e distorção radial óptica.
[0192] No exemplo 26, o exemplo 23 é fornecido, em que a calibração do corante puro compreende: imagear um suporte de amostra, carregado para o instrumento, em mais do que um canal, o suporte de amostra compreendendo uma pluralidade de locais de reação e mais do que um tipo de corante, cada corante ocupando mais do que um local de reação; identificar um canal de pico para cada corante sobre o suporte de amostra; normalizar cada canal para o canal de pico para cada corante; e produzir uma matriz de corante compreendendo um conjunto de valores de referência de corantes.
[0193] No exemplo 27, o exemplo 26 é fornecido, em que imageamento do suporte de amostra é realizado quatro vezes para o imageamento de quatro diferentes suportes de amostra.
[0194] No exemplo 28, o exemplo 23 é fornecido, em que o sistema óptico compreende uma pluralidade de filtros de excitação e uma pluralidade de filtros de emissão, e em que a calibração de normalização do instrumento compreende: determinar um primeiro fator de correção para cada um dos filtros de excitação e dos filtros de emissão; calcular um segundo fator de correção para um par de filtros, em que cada par de filtros compreende um filtro de excitação e um filtro de emissão; e aplicar os segundos fatores de correção aos dados de filtro.
[0195] No exemplo 29, o exemplo 23 é fornecido, em que o fator de normalização de filtro permite que os dados do instrumento sejam comparados com os dados de um segundo instrumento.
[0196] No exemplo 30, o exemplo 23 é fornecido, em que a validação de RNase P compreende: receber dados de amplificação a partir de uma placa de validação para gerar uma pluralidade de curvas de amplificação, em que a placa de validação inclui uma amostra de uma primeira quantidade e uma segunda quantidade, e cada curva de amplificação inclui uma região exponencial; determinar um conjunto de limites de fluorescência com base nas regiões exponenciais da pluralidade de curvas de amplificação; determinar, para cada limite de fluorescência do conjunto, um primeiro conjunto de valores de limite de ciclo (Ct) de curvas de amplificação geradas a partir das amostras da primeira quantidade e um segundo conjunto de valores de Ct das curvas de amplificação geradas a partir das amostras da segunda quantidade; e calcular se a primeira e a segunda quantidades são suficientemente distinguíveis com base em valores de Ct em cada uma das pluralidades de limites de fluorescência.
[0197] No exemplo 31, o exemplo 23 é fornecido, em que a validação de RNase P é realizada por um processador conectado ao instrumento.
[0198] No exemplo 32, o exemplo 30 é fornecido, em que as instruções para a validação de RNase P compreendem ainda instruções para: exibir uma indicação de validação ou falha do instrumento em uma tela de exibição.
[0199] No exemplo 33, o exemplo 23 é fornecido, compreendendo ainda: realizar uma correção automática de corante para calibração espectral em tempo real dos dados de múltiplos componentes; realizar uma detecção de placa para determinar se existe um erro de carregamento de placa; realizar uma calibração automática do fundo para compensar as alterações de fundo; e realizar a normalização do instrumento com o uso de um material reflexivo para detectar quaisquer alterações ou variabilidade nas emissões fluorescentes.
[0200] No exemplo 34, um sistema para a calibração de um instrumento, em que o instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação, é fornecido, que compreende: um calibrador da região de interesse (ROI) configurado para determinar as posições do local de reação em uma imagem; um calibrador de corante puro configurado para determinar a contribuição de um corante fluorescente utilizado em cada local de reação comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente; um calibrador de normalização de instrumento configurado para determinar um fator de normalização de filtro; um validador de RNase P configurado para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades diferentes de amostra; e um mecanismo de exibição configurado para exibir os resultados da calibração.
[0201] No exemplo 35, o exemplo 34 é fornecido, em que o calibrador da ROI é configurado para: estimar a região de interesse (ROI) inicial a partir delimites de fluorescência de cada poço de amostra; estimar os locais de centro de cada ROI; estimar o tamanho de cada ROI; determinar o tamanho médio das ROIs da pluralidade de locais de reação; derivar os modelos de grade globais; aplicar os modelos de grade globais às ROIs, em que a aplicação dos modelos de grade globais melhora a precisão dos locais de centro da ROI; recuperar as ROIs ausentes; e ajustar o raio das ROIs, em que o ajuste melhora a razão de sinal para ruído do sistema óptico.
[0202] No exemplo 36, o exemplo 34 é fornecido, em que a calibração da ROI melhora os erros de determinação do local de reação, minimizando pelo menos um dos seguintes grupos:: saturação do corante dentro da pluralidade de locais de reação, rotação da grade, variação dos fatores de ampliação, e distorção radial óptica.
[0203] No exemplo 37, o exemplo 34 é fornecido, em que o calibrador de corante puro é configurado para: imagear um suporte de amostra, carregado para o instrumento, em mais do que um canal, o suporte de amostra compreendendo uma pluralidade de locais de reação e mais do que um tipo de corante, cada corante ocupando mais do que um local de reação; identificar um canal de pico para cada corante sobre o suporte de amostra; normalizar cada canal para o canal de pico para cada corante; e produzir uma matriz de corante compreendendo um conjunto de valores de referência de corantes.
[0204] No exemplo 38, o exemplo 37 é fornecido, em que o calibrador é configurado para imagear o suporte de amostra quatro vezes para o imageamento de quatro diferentes suportes de amostra.
[0205] No exemplo 39, o exemplo 34 é fornecido, em que o sistema óptico compreende uma pluralidade de filtros de excitação e uma pluralidade de filtros de emissão, e em que a calibração de normalização do instrumento compreende: determinar um primeiro fator de correção para cada um dos filtros de excitação e dos filtros de emissão; calcular um segundo fator de correção para um par de filtros, em que cada par de filtros compreende um filtro de excitação e um filtro de emissão; e aplicar os segundos fatores de correção aos dados de filtro.
[0206] No exemplo 40, o exemplo 34 é fornecido, em que o fator de normalização de filtro permite que os dados do instrumento sejam comparados com os dados de um segundo instrumento.
[0207] No exemplo 41, o exemplo 34 é fornecido, em que a validação de RNase P compreende: receber dados de amplificação a partir de uma placa de validação para gerar uma pluralidade de curvas de amplificação, em que a placa de validação inclui uma amostra de uma primeira quantidade e uma segunda quantidade, e cada curva de amplificação inclui uma região exponencial; determinar um conjunto de limites de fluorescência com base nas regiões exponenciais da pluralidade de curvas de amplificação; determinar, para cada limite de fluorescência do conjunto, um primeiro conjunto de valores de limite de ciclo (Ct) de curvas de amplificação geradas a partir das amostras da primeira quantidade e um segundo conjunto de valores de Ct das curvas de amplificação geradas a partir das amostras da segunda quantidade; e calcular se a primeira e a segunda quantidades são suficientemente distinguíveis com base em valores de Ct em cada uma das pluralidades de limites de fluorescência.
[0208] No exemplo 42, o exemplo 41 é fornecido, em que o validador de RNase P é ainda configurado para: exibir uma indicação de validação ou falha instrumento no mecanismo de exibição.
[0209] No exemplo 43, o exemplo 34 é fornecido, que compreende ainda: um corretor automático de corante configurado para realizar calibração espectral em tempo real dos dados de múltiplos componentes; um detector de placa configurado para determinar se existe um erro de carregamento de placa; um calibrador automático de fundo configurado para compensar as alterações de fundo; e um instrumento normalizador configurado para utilizar um material reflexivo para detectar quaisquer alterações ou variabilidade nas emissões fluorescentes.
[0210] No exemplo 44, um método para calibração de um instrumento é fornecido, em que o instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação compreendendo: realizar uma calibração da região de interesse (ROI) para determinar as posições do local de reação em uma imagem; realizar uma calibração com corante puro para determinar a contribuição de um corante fluorescente utilizado em cada local de reação comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente; realizar uma calibração de normalização do instrumento para determinar um fator de normalização de filtro; e realizar uma validação de RNase P para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades de amostra diferentes.
[0211] No exemplo 45, um método para calibração de um instrumento é fornecido, em que o instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação compreendendo: realizar uma calibração da região de interesse (ROI) para determinar as posições do local de reação em uma imagem; realizar uma calibração com corante puro para determinar a contribuição de um corante fluorescente utilizado em cada local de reação comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente; realizar uma calibração de normalização do instrumento para determinar um fator de normalização de filtro; e realizar uma validação de RNase P para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades de amostra diferentes.
[0212] No exemplo 46, um método para calibração de um instrumento é fornecido, em que o instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação compreendendo: realizar uma calibração da região de interesse (ROI) para determinar as posições do local de reação em uma imagem; realizar uma calibração com corante puro para determinar a contribuição de um corante fluorescente utilizado em cada local de reação comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente; realizar uma calibração de normalização do instrumento para determinar um fator de normalização de filtro; e realizar uma validação de RNase P para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades de amostra diferentes.
[0213] No exemplo 47, um sistema para a calibração de um instrumento, em que o instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação, é fornecido, que compreende: um calibrador da região de interesse (ROI) configurado para determinar as posições do local de reação em uma imagem; um calibrador de corante puro configurado para determinar a contribuição de um corante fluorescente utilizado em cada local de reação comparando um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente; um calibrador de normalização de instrumento configurado para determinar um fator de normalização de filtro; um validador de RNase P configurado para validar se o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades diferentes de amostra; e um mecanismo de exibição configurado para exibir os resultados da calibração.
[0214] No exemplo 48, o exemplo 45 é fornecido, em que a calibração da ROI compreende: estimar a região de interesse (ROI) inicial a partir de limites de fluorescência de cada poço de amostra; estimar os locais de centro de cada ROI; estimar o tamanho de cada ROI; determinar o tamanho médio das ROIs da pluralidade de locais de reação; derivar os modelos de grade globais; aplicar os modelos de grade globais às ROIs, em que a aplicação dos modelos de grade globais melhora a precisão dos locais de centro da ROI; recuperar as ROIs ausentes; e ajustar o raio das ROIs, em que o ajuste melhora a razão de sinal para ruído do sistema óptico.
[0215] No exemplo alternativo 49, o exemplo 44, 45, 46, 47, ou qualquer exemplo anterior é fornecido, em que a calibração da ROI melhora os erros de determinação do local de reação, minimizando pelo menos um dos seguintes grupos:: saturação do corante dentro da pluralidade de locais de reação, rotação de grade, variação dos fatores de ampliação, e distorção radial óptica.
[0216] No exemplo 50, o exemplo 45 é fornecido, em que a calibração do corante puro compreende: imagear um suporte de amostra, carregado para o instrumento, em mais do que um canal, o suporte de amostra compreendendo uma pluralidade de locais de reação e mais do que um tipo de corante, cada corante ocupando mais do que um local de reação; identificar um canal de pico para cada corante sobre o suporte de amostra; normalizar cada canal para o canal de pico para cada corante; e produzir uma matriz de corante compreendendo um conjunto de valores de referência de corantes.
[0217] No exemplo alternativo 51, o exemplo 44, 45, 46, 47, 50 ou qualquer exemplo anterior é fornecido, em que o imageamento do suporte de amostra é realizado quatro vezes para o imageamento de quatro diferentes suportes de amostra.
[0218] No exemplo 52, o exemplo 45 é fornecido, em que o sistema óptico compreende uma pluralidade de filtros de excitação e uma pluralidade de filtros de emissão, e em que a calibração de normalização do instrumento compreende: determinar um primeiro fator de correção para cada um dos filtros de excitação e dos filtros de emissão; calcular um segundo fator de correção para um par de filtros, em que cada par de filtros compreende um filtro de excitação e um filtro de emissão; e aplicar os segundos fatores de correção aos dados de filtro.
[0219] No exemplo alternativo 53, o exemplo 44, 45, 46, 47, ou qualquer exemplo anterior é fornecido, em que o fator de normalização de filtro permite que os dados do instrumento sejam comparados com os dados de um segundo instrumento.
[0220] No exemplo 54, o exemplo 46 é fornecido, em que a validação de RNase P compreende: receber dados de amplificação a partir de uma placa de validação para gerar uma pluralidade de curvas de amplificação, em que a placa de validação inclui uma amostra de uma primeira quantidade e uma segunda quantidade, e cada curva de amplificação inclui uma região exponencial; determinar um conjunto de limites de fluorescência com base nas regiões exponenciais da pluralidade de curvas de amplificação; determinar, para cada limite de fluorescência do conjunto, um primeiro conjunto de valores de limite de ciclo (Ct) de curvas de amplificação geradas a partir das amostras da primeira quantidade e um segundo conjunto de valores de Ct das curvas de amplificação geradas a partir das amostras da segunda quantidade; e calcular se a primeira e a segunda quantidades são suficientemente distinguíveis com base em valores de Ct em cada uma das pluralidades de limites de fluorescência.
[0221] No exemplo alternativo 55, o exemplo 44, 45, 46, 47, ou qualquer exemplo anterior é fornecido, em que a validação de RNase P é realizada por um processador conectado ao instrumento.
[0222] No exemplo alternativo 56, o exemplo 44, 45, 46, 47, 54 ou qualquer exemplo anterior é fornecido, em que a validação de RNase P compreende ainda: exibir uma indicação de validação ou falha do instrumento em uma tela de exibição.
[0223] No exemplo alternativo 57, o exemplo 44, 45, 46, 47, ou qualquer exemplo anterior é fornecido, compreendendo ainda: realizar uma correção automática de corante para calibração espectral em tempo real dos dados de múltiplos componentes; realizar uma detecção da placa para determinar se existe um erro de carregamento da placa; realizar uma calibração automática do fundo para compensar as alterações de fundo; e realizar a normalização do instrumento com o uso de um material reflexivo para detectar quaisquer alterações ou variabilidade nas emissões fluorescentes.
[0224] Os sistemas exemplificadores para os métodos relacionados com as várias modalidades descritas no presente documento incluem aqueles descritos nos seguintes documentos: • Pedido de patente de desenho industrial U.S. número 29/516.847, depositado em 6 de fevereiro de 2015; e • Pedido de patente de desenho industrial U.S. número 29/516.883; depositado em 6 de fevereiro de 2015; e • Pedido de patente provisório U.S. número 62/112.910, depositado em 6 de fevereiro de 2015; e • Pedido de patente provisório U.S. número 62/113.006, depositado em 6 de fevereiro de 2015; e • Pedido de patente provisório U.S. número 62/113.077, depositado em 6 de fevereiro de 2015; e • Pedido de patente provisório U.S. número 62/113.058, depositado em 6 de fevereiro de 2015; e • Pedido de patente provisório U.S. número 62/112.964, depositado em 6 de fevereiro de 2015; e • Pedido de patente provisório U.S. número 62/113.118, depositado em 6 de fevereiro de 2015; e • Pedido de patente provisório U.S. número 62/113.212, depositado em 6 de fevereiro de 2015; e • Pedido de patente U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01011), depositado em 5 de fevereiro de 2016; e • Pedido de patente U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01023), depositado em 5 de fevereiro de 2016; e • Pedido de patente U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01025), depositado em 5 de fevereiro de 2016; e • Pedido de patente U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01028), depositado em 5 de fevereiro de 2016; e • Pedido de patente U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01029), depositado em 5 de fevereiro de 2016; e • Pedido de patente U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01032), depositado em 5 de fevereiro de 2016; e • Pedido de patente U.S. número ___ (Life Technologies Número do Documento do Procurador LT01033), depositado em 5 de fevereiro de 2016; e todos os quais são também aqui incorporados por referência na sua totalidade.
[0225] Embora várias modalidades tenham sido descritas com relação a determinadas modalidades exemplificadoras, exemplos e aplicações, será evidente para os versados na técnica que várias modificações e alterações podem ser feitas sem distanciamento dos presentes ensinamentos.

Claims (20)

1. Método para calibrar um instrumento, em que o instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: realizar uma calibração da região de interesse (ROI) para determinar posições do local de reação em uma imagem, em que a calibração de ROI minimiza pelo menos um dentre os seguintes grupos de erros de determinação de local de reação: saturação de corante dentro da pluralidade de locais de reação, rotação de grade, variação de fatores de ampliação, e distorção radial óptica; realizar uma calibração de corante puro para determinar a contribuição de um corante fluorescente usado em cada local de reação pela comparação de um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente; realizar uma calibração de normalização do instrumento para determinar um fator de normalização de filtro; e realizar um ensaio de validação para validar que o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades diferentes de amostra.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a calibração da ROI compreende: estimar a região de interesse (ROI) inicial a partir de limites de fluorescência de cada poço de amostra; estimar os locais de centro de cada ROI; estimar o tamanho de cada ROI; determinar o tamanho médio das ROIs a partir da pluralidade de locais de reação; derivar os modelos de grade globais; aplicar os modelos de grade globais às ROIs, em que a aplicação dos modelos de grade globais melhora a precisão dos locais de centro de ROI; recuperar as ROIs ausentes; e ajustar o raio das ROIs, em que o ajuste melhora a razão de sinal para ruído do sistema óptico.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o ensaio de validação compreende um ensaio do gene RNase P.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a calibração de corante puro compreende: imagear um suporte de amostra, carregado para o instrumento, em mais do que um canal, o suporte de amostra compreendendo uma pluralidade de locais de reação e mais do que um tipo de corante, cada corante ocupando mais do que um local de reação; identificar um canal de pico para cada corante sobre o suporte de amostra; normalizar cada canal para o canal de pico para cada corante; e produzir uma matriz de corante compreendendo um conjunto de valores de referência de corante.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o sistema óptico compreende uma pluralidade de filtros de excitação e uma pluralidade de filtros de emissão, e em que a calibração de normalização do instrumento compreende: determinar um primeiro fator de correção para cada um dos filtros de excitação e dos filtros de emissão; calcular um segundo fator de correção para um par de filtros, em que cada par de filtros compreende um filtro de excitação e um filtro de emissão; e aplicar os segundos fatores de correção aos dados de filtro.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o ensaio de validação compreende: receber dados de amplificação a partir de uma placa de validação para gerar uma pluralidade de curvas de amplificação, em que a placa de validação inclui uma amostra de uma primeira quantidade e uma segunda quantidade, e cada curva de amplificação inclui uma região exponencial; determinar um conjunto de limites de fluorescência com base nas regiões exponenciais da pluralidade de curvas de amplificação; determinar, para cada limite de fluorescência do conjunto, um primeiro conjunto de valores limite de ciclo (Ct) de curvas de amplificação geradas a partir das amostras da primeira quantidade e um segundo conjunto de valores de Ct das curvas de amplificação geradas a partir das amostras da segunda quantidade; e calcular se a primeira e a segunda quantidades são suficientemente distinguíveis com base em valores de Ct em cada uma da pluralidade de limites de fluorescência.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda: realizar uma correção automática de corante para calibração espectral em tempo real dos dados de múltiplos componentes; realizar uma detecção de placa para determinar se existe um erro de carregamento de placa; realizar uma calibração automática de fundo para compensar as alterações de fundo; e realizar a normalização de instrumento com o uso de um material reflexivo para detectar quaisquer alterações ou variabilidade nas emissões fluorescentes.
8. Mídia de armazenamento legível por computador não transitória, CARACTERIZADO pelo fato de que é codificada com instruções executáveis por processador para calibrar um instrumento, em que o instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação, as instruções compreendendo instruções para: realizar uma calibração da região de interesse (ROI) para determinar as posições do local de reação em uma imagem, em que a calibração de ROI minimiza pelo menos um dentre os seguintes grupos de erros de determinação de local de reação: saturação de corante dentro da pluralidade de locais de reação, rotação de grade, variação de fatores de ampliação, e distorção radial óptica; realizar uma calibração de corante puro para determinar a contribuição de um corante fluorescente usado em cada local de reação pela comparação de um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente; realizar uma calibração de normalização de instrumento para determinar um fator de normalização de filtro; e realizar um ensaio de validação para validar que o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades diferentes de amostra.
9. Mídia de armazenamento legível por computador não transitória, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que as instruções para a calibração da ROI compreendem instruções para: estimar a região de interesse (ROI) inicial a partir de limites de fluorescência de cada poço de amostra; estimar os locais de centro de cada ROI; estimar o tamanho de cada ROI; determinar o tamanho médio das ROIs a partir da pluralidade de locais de reação; derivar os modelos de grade globais; aplicar os modelos de grade globais às ROIs, em que a aplicação dos modelos de grade globais melhora a precisão dos locais de centro de ROI; recuperar as ROIs ausentes; e ajustar o raio das ROIs, em que o ajuste melhora a razão de sinal para ruído do sistema óptico.
10. Mídia de armazenamento legível por computador não transitória, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o ensaio de validação compreende um ensaio do gene RNase P.
11. Mídia de armazenamento legível por computador não transitória, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que as instruções para a calibração com corante puro compreendem instruções para: imagear um suporte de amostra, carregado para o instrumento, em mais do que um canal, o suporte de amostra compreendendo uma pluralidade de locais de reação e mais do que um tipo de corante, cada corante ocupando mais do que um local de reação; identificar um canal de pico para cada corante sobre o suporte de amostra; normalizar cada canal para o canal de pico para cada corante; e produzir uma matriz de corante compreendendo um conjunto de valores de referência de corante.
12. Mídia de armazenamento legível por computador não transitória, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o sistema óptico compreende uma pluralidade de filtros de excitação e uma pluralidade de filtros de emissão, e em que as instruções para a calibração de normalização de instrumento compreendem instruções para: determinar um primeiro fator de correção para cada um dos filtros de excitação e dos filtros de emissão; calcular um segundo fator de correção para um par de filtros, em que cada par de filtros compreende um filtro de excitação e um filtro de emissão; e aplicar os segundos fatores de correção aos dados de filtro.
13. Mídia de armazenamento legível por computador não transitória, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que as instruções para o ensaio de validação compreendem instruções para: receber dados de amplificação a partir de uma placa de validação para gerar uma pluralidade de curvas de amplificação, em que a placa de validação inclui uma amostra de uma primeira quantidade e uma segunda quantidade, e cada curva de amplificação inclui uma região exponencial; determinar um conjunto de limites de fluorescência com base nas regiões exponenciais da pluralidade de curvas de amplificação; determinar, para cada limite de fluorescência do conjunto, um primeiro conjunto de valores limite de ciclo (Ct) de curvas de amplificação geradas a partir das amostras da primeira quantidade e um segundo conjunto de valores de Ct das curvas de amplificação geradas a partir das amostras da segunda quantidade; e calcular se a primeira e a segunda quantidades são suficientemente distinguíveis com base em valores de Ct em cada uma da pluralidade de limites de fluorescência.
14. Mídia de armazenamento legível por computador não transitória, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda instruções para: realizar uma correção automática de corante para calibração espectral em tempo real dos dados de múltiplos componentes; realizar uma detecção de placa para determinar se existe um erro de carregamento de placa; realizar uma calibração automática de fundo para compensar as alterações de fundo; e realizar a normalização de instrumento com o uso de um material reflexivo para detectar quaisquer alterações ou variabilidade nas emissões fluorescentes.
15. Sistema para calibrar um instrumento, em que o instrumento inclui um sistema óptico capaz de imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de locais de reação, o sistema CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: um calibrador da região de interesse (ROI) configurado para determinar posições de local de reação em uma imagem, em que a calibração de ROI minimiza pelo menos um dentre os seguintes grupos de erros de determinação de local de reação: saturação de corante dentro da pluralidade de locais de reação, rotação de grade, variação de fatores de ampliação, e distorção radial óptica; um calibrador de corante puro configurado para determinar a contribuição de um corante fluorescente usado em cada local de reação pela comparação de um espectro bruto do corante fluorescente com um dado de calibração do espectro puro do corante fluorescente; um calibrador de normalização de instrumento configurado para determinar um fator de normalização de filtro; um validador usando um ensaio conhecido configurado para validar que o instrumento é capaz de distinguir entre duas quantidades diferentes de amostra; e um mecanismo de exibição configurado para exibir os resultados da calibração.
16. Sistema, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o calibrador da ROI é configurado para: estimar a região de interesse (ROI) inicial a partir de limites de fluorescência de cada poço de amostra; estimar os locais de centro de cada ROI; estimar o tamanho de cada ROI; determinar o tamanho médio das ROIs a partir da pluralidade de locais de reação; derivar os modelos de grade globais; aplicar os modelos de grade globais às ROIs, em que a aplicação dos modelos de grade globais melhora a precisão dos locais de centro de ROI; recuperar as ROIs ausentes; e ajustar o raio das ROIs, em que o ajuste melhora a razão de sinal para ruído do sistema óptico.
17. Sistema de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o calibrador de corante puro é configurado para: imagear um suporte de amostra, carregado para o instrumento, em mais do que um canal, o suporte de amostra compreendendo uma pluralidade de locais de reação e mais do que um tipo de corante, cada corante ocupando mais do que um local de reação; identificar um canal de pico para cada corante sobre o suporte de amostra; normalizar cada canal para o canal de pico para cada corante; e produzir uma matriz de corante compreendendo um conjunto de valores de referência de corante.
18. Sistema, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o sistema óptico compreende uma pluralidade de filtros de excitação e uma pluralidade de filtros de emissão, e em que o calibrador de normalização de instrumento é configurado para: determinar um primeiro fator de correção para cada um dos filtros de excitação e dos filtros de emissão; calcular um segundo fator de correção para um par de filtros, em que cada par de filtros compreende um filtro de excitação e um filtro de emissão; e aplicar os segundos fatores de correção aos dados de filtro.
19. Sistema de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o validador é configurado para: receber dados de amplificação a partir de uma placa de validação para gerar uma pluralidade de curvas de amplificação, em que a placa de validação inclui uma amostra de uma primeira quantidade e uma segunda quantidade, e cada curva de amplificação inclui uma região exponencial; determinar um conjunto de limites de fluorescência com base nas regiões exponenciais da pluralidade de curvas de amplificação; determinar, para cada limite de fluorescência do conjunto, um primeiro conjunto de valores limite de ciclo (Ct) de curvas de amplificação geradas a partir das amostras da primeira quantidade e um segundo conjunto de valores de Ct das curvas de amplificação geradas a partir das amostras da segunda quantidade; e calcular se a primeira e a segunda quantidades são suficientemente distinguíveis com base em valores de Ct em cada uma da pluralidade de limites de fluorescência.
20. Sistema, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda: um corretor automático de corante configurado para realizar a calibração espectral em tempo real dos dados de múltiplos componentes; um detector de placa configurado para determinar se existe um erro de carregamento de placa; um calibrador automático de fundo configurado para compensar as alterações de fundo; e um instrumento normalizador configurado para utilizar um material reflexivo para detectar quaisquer alterações ou variabilidade nas emissões fluorescentes.
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