KR102364523B1 - Ｉｌ―１５ 및 ｉｌ―１５ｒ 알파 스시 도메인 기반 모듈로카인 - Google Patents

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데이비드 베샤르
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Abstract

본 발명은 (a) 컨쥬게이트, 및 (b) 상기 컨쥬게이트에 직접 또는 간접적으로 공유결합되어 있는 면역조절 항체 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 컨쥬게이트는 (i) 인터루킨 15 또는 이의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 IL-15Rα 또는 이의 유도체의 스시 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 이뮤노사이토카인; 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

ＩＬ―１５ 및 ＩＬ―１５Ｒ 알파 스시 도메인 기반 모듈로카인{IL-15 and IL-15R aplha sushi domain based modulokines}
본 국제 특허 출원은 2013년 8월 8일자로 출원된 유럽 특허 출원 EP13003963.9의 우선권을 청구하며, 여기에 문헌이 원용된다.
본 발명은 여기에서는 모듈로카인으로 불리는 신규한 "이뮤노사이토카인 (immunocytokines)" 및 의약, 특히 TILs (tumor-infiltrating lymphocytes)를 활성화하여 암을 치료하는 의약으로서 그들의 용도에 관한 것이다.
척추동물의 면역 시스템은 종양에 대한 최적의 면역 반응을 얻기 위해 다양한 분자 및 세포 간 상호작용을 필요로 한다.
현재, 숙주 항-종양 면역은 주로 TILs에 의해 영향을 받는다 (GALON et al., Science, vol.313, p: 1960-1964, 2006). 사실, TILs가 종양세포에 의한 억제성 조절을 받고 있음을 암시하는 많은 증거가 있어왔다.
상기 TILs를 "재활성화" 하기 위해, 많은 전략과 표적이 예상되었다. 이들 전략은
i) 하향조절 신호를 억제하여 면역 활성화를 촉진하기 위한 TILs 면역억제 수용체 (예를 들어, CTL-A4, PD-1, BTLA, LAG3 HAVCR2, ADORA2A 또는 억제성 KIRs)의 억제, 또는
ii) T 세포 및/또는 NK 세포 활성화를 촉진하기 위한 TIL 보조-자극 수용체 (예를 들어, CD40, 4-1BB, OX-40 또는 glucocorticoid-induced TNFR-related protein (GITR))의 촉진 중 어느 하나에 기반을 두고 있다.
상기 전략들이 이미 어떤 유망한 결과들을 제공한 바 있으나, 이들 전략의 효율은 제한적인 것 같다. 대부분, 몇 퍼센트의 집단에서만 회복된 TILs 반응을 보여줄 뿐이다.
증강된 효율을 얻기 위해, 지금 이들 전략과 다른 약물 또는 조절인자의 조합이 예상된다.
따라서, 본 발명자들은 이들 전략과 특허출원 WO 2007/046006에 개시된 조절인자와 더불어 항-PD1 항체를 조합하고자 하였다.
이 조합은 유의적인 부분, 즉, 신세포암종 (Renal Cell Carcinoma, RCC) 환자에서 분리된 TILs의 약 20%를 회복할 수 없다는 결과를 보여주었다.
지금, 본 발명자들은 또한 같은 조절인자를 같은 항체에 융합한 새로운 타입의 이뮤노사이토카인, 소위 "모듈로카인"을 제공하는 다른 조합을 시도하였다. 놀랍게도, 이전 조합과 비교하여 이 조합은 강한 TILs 재활성화를 제공하였으며, 상기 재활성화는 대부분의 TILs 즉, 약 80%에서 관찰되었다.
이러한 강한 시너지는 새로운 치료법을 예상할 수 있도록 한다.
결과적으로, 본 발명은
A) 컨쥬게이트, 및
B) 상기 컨쥬게이트에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 면역조절 항체 또는 이의 단편을 포함하는 이뮤노사이토카인에 관한 것이다.
여기서, 상기 컨쥬게이트는
i) 인터루킨 15 또는 이의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및
ii) IL-15Rα 또는 이의 유도체의 스시 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
두 번째 양상에서, 본 발명은 상기에 기재된 이뮤노사이토카인을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.
세 번째 양상에서, 본 발명은 상기에 기재된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
네 번째 양상에서, 본 발명은 앞서 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터로 유전자 변형된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 이뮤노사이토카인을 발현하는 유전자 변형된 숙주 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 i) 숙주 세포에 상기에 기재된 핵산 또는 벡터를 인 비트로 또는 엑스 비보 도입하는 단계, ii) 획득된 유전자 변형된 재조합 숙주 세포를 인 비트로 또는 엑스 비보 배양하는 단계, 및 iii) 선택적으로, 상기 이뮤노사이토카인을 발현 및/또는 분비하는 세포를 선별하는 단계를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 유전자 변형된 숙주 세포는 동물 세포, 및 바람직하게는 CHO 세포이다.
다섯 번째 양상에서, 본 발명은 상기에 기재된 이뮤노사이토카인, 이의 인코딩 핵산, 또는 상기 핵산을 포함하는 핵산 벡터를 포함하고, 최종적으로 약학적으로 허용 가능한 담체와 결합되는 약학 조성물을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 추가적인 치료제, 바람직하게는 항암제를 포함한다.
여섯 번째 양상에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하기 위한 앞서 기재된 약학 조성물에 관한 것이다.
일곱 번째 양상에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하기 위한 동시, 개별, 또는 순차적 이용을 위한 복합 제제로서,
i) 상기에 기재된 이뮤노사이토카인, 그것을 코딩하는 핵산 서열, 또는 그러한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 및
ii) 치료제, 바람직하게는 항암제를 포함하는 산물에 관한 것이다.
여덟 번째 양상에서, 본 발명은 앞서 기재된 약학 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
마지막 양상에서, 본 발명은
(i) 상기에 기재된 이뮤노사이토카인, 그것을 코딩하는 핵산 서열, 또는 그러한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 및
(ii) 치료제, 바람직하게는 항암제의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에 동시적, 개별적 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 환자 A (A) 및 환자 B (B) 유래의 TILs에서 PD-1, Tim-3 및 IL-15Rα의 발현을 보여준다.
도 2는 항-PD1 항체 (HBAT), RLI, RLI 및 HBAT의 혼합(RLI + HBAT), 또는 본 발명의 모듈로카인(HBAT - RLI)에 의해 유도된 TILs의 재활성화를 보여준다.
용어 "이뮤노사이토카인"은 사이토카인 또는 이의 유도체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 분자를 의미한다. 상기 항체 및 상기 사이토카인은 링커 펩타이드에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 이뮤노사이토카인의 컨쥬게이트
용어 "인터루킨 15"는 종래의 일반적인 의미로, IL-2와 구조적으로 유사한 사이토카인을 의미한다 (GRABSTEIN et al, Science, vol.264(5161), p:965-968, 1994). 이 사이토카인은 또한 IL-15, IL 15 또는 MGC9721로 알려져 있다. 이 사이토카인과 IL-2는 많은 생물학적 활성들을 공유하며, 그들은 공통의 헤마토포이에틴 수용체 서브유닛과 결합하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서, 그들은 같은 수용체에 대해 경쟁하여 서로의 활성을 부정적으로 조절할 것이다. IL-15는 T 세포 및 자연살해세포 활성화 및 증식을 조절하고, CD8+ 메모리 세포의 수는 이 사이토카인과 IL-2 간의 균형에 의해 조절되는 것으로 보인다고 입증되었다. IL-15 활성은 실시예에 기재된 바와 같이, kit225 세포주에서 이의 증식 유도를 측정하여 평가될 수 있다 (HORI et al, Blood, vol.70(4), p: 1069-72, 1987).
상기 IL-15 또는 이의 유도체는 kit225 세포주의 증식 유도 시 인간의 인터루킨 15의 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 50%를 가진다.
상기 인터루킨 15는 포유동물의 인터루킨-15, 바람직하게는 영장류의 인터루킨-15, 및 더욱 바람직하게는 인간의 인터루킨-15이다.
포유동물의 인터루킨 15는 당업자에 의해 간단히 확인될 수 있다. 예시로서, 돼지 (Sus scrofa)(Accession number ABF82250), 시궁쥐 (Rattus norvegicus)(Accession number NP 037261), 생쥐 (Mus musculus)(Accession number NP 032383), 소 (Bos Taurus)(Accession number NP_776515), 집토끼 (Oryctolagus cuniculus)(Accession number NP_001075685), 양 (Ovies aries)(Accession number NP 001009734), 고양이 (Felis catus)(Accession number NP_001009207), 필리핀원숭이 (Macaca fascicularis)(Accession number BAA 19149), 인간 (Homo sapiens)(Accession number NP_000576), 붉은털원숭이 (Macaca Mulatta)(Accession number NP_001038196), 기니피그 (Cavia porcellus)(Accession number NP_001 166300), 또는 사바나원숭이 (Chlorocebus sabaeus)(Accession number ACI289) 유래의 인터루킨-15를 예로 들 수 있다.
여기에 사용된, 용어 "포유동물의 인터루킨 15"는 공통서열 SEQ ID NO: 1을 의미한다.
영장류의 인터루킨 15는 당업자에 의해 간단히 확인될 수 있다. 예시로서, 돼지 (Sus scrofa)(Accession number ABF82250), 집토끼 (Oryctolagus cuniculus)(Accession number NP_001075685), 필리핀원숭이 (Macaca fascicularis)(Accession number BAA 19149), 인간 (Homo sapiens)(Accession number NP_000576), 붉은털원숭이 (Macaca Mulatta)(Accession number NP_001038196), 또는 사바나원숭이 (Chlorocebus sabaeus)(Accession number ACI289) 유래의 인터루킨-15를 예로 들 수 있다.
여기에 사용된, 용어 "영장류의 인터루킨 15"는 공통서열 SEQ ID NO: 2를 의미한다.
인간의 인터루킨 15는 당업자에 의해 간단히 확인될 수 있으며, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 3을 의미한다.
여기에 사용된, 용어 "인터루킨 15 유도체"는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 92.5% (즉, 약 10개의 아미노산 치환에 해당), 바람직하게는 적어도 96% (즉, 약 5개의 아미노산 치환에 해당), 및 더욱 바람직하게는 적어도 98.5% (즉, 약 2개의 아미노산 치환에 해당) 또는 적어도 99% (즉, 약 1개의 아미노산 치환에 해당)의 유사도 (percentage of identity)를 갖는 아미노산을 의미한다. 그러한 유도체는 그것의 개인적 지식 및 본 특허 출원의 기술의 관점에서 당업자에 의해 간단히 확인될 수 있다. 그러한 유도체의 예시로서, 국제 특허 출원 WO 2009/135031에 기재된 것을 예로 들 수 있다. 또한, 천연 아미노산은 화학적으로 변형된 아미노산에 의해 대체될 수 있을 것으로 이해될 것이다. 일반적으로, 그러한 화학적으로 변형된 아미노산은 폴리펩타이드의 반감기를 증가시킨다.
여기에 사용된, 2개의 아미노산 서열 간의 "유사도"는 상기 서열들의 최상의 배열로 얻은 비교되는 2개의 서열 간 동일한 아미노산의 비율을 의미하고, 이 비율은 순수하게 통계적이며 이들 2개의 서열 간의 차이는 아미노산 서열들 내에 무작위로 퍼져있다. 여기에 사용된, "최상의 배열" 또는 "최적의 배열"은 측정된 유사도 (아래를 볼 것)가 가장 높은 배열을 의미한다. 2개의 아미노산 서열 간의 서열 비교는 보통 최상의 배열을 따라 미리 배열되어 있는 이들 서열들을 비교하여 실현된다; 이 비교는 유사성이 있는 국소 영역을 확인하고 비교하기 위해 비교 단편 (segment)에서 실현된다. 비교를 수행하기 위한 최상의 서열 배열은 수작업 외에 SMITH 및 WATERMAN에 의해 개발된 국소 상동성 알고리즘 (Ad. App . Math., vol.2, p:482, 1981), NEDDLEMAN 및 WUNSCH에 의해 개발된 전체 상동성 알고리즘 (J. Mol . Biol., vol.48, p:443, 1970), PEARSON 및 LIPMAN에 의해 개발된 유사성의 방법 (Proc. Natl . Acd . Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), 그러한 알고리즘을 이용한 컴퓨터 소프트웨어 (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA in the Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), MUSCLE 복수 배열 알고리즘 (Edgar, Robert C, Nucleic Acids Research, vol. 32, p: 1792, 2004 ), 또는 CLUSTAL (GOUJON et al, Nucleic acids research, vol.38, W695-9, 2010)을 이용하여 실현될 수 있다. 최상의 국소 배열을 얻기 위해, 바람직하게는 BLOSUM 62 matrix를 포함하는 BLAST 소프트웨어를 이용할 수 있다. 2개의 아미노산 서열 간의 유사도는 최적으로 배열된 이들 2개의 서열을 비교하여 측정되며, 아미노산 서열들은 이들 2개의 서열 간 최상의 배열을 얻기 위해 참고 서열과 비교하여 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 유사도는 이들 2개의 서열 간에 동일한 위치의 개수를 측정하고, 이 개수를 비교된 위치의 전체 개수로 나누고, 여기에 100을 곱하여 이들 2개의 서열 간의 유사도를 얻는다.
바람직하게는, 인터루킨 15 유도체는 IL-15 아고니스트 (agonist) 또는 슈퍼아고니스트 (superagonist)이다. 당업자는 IL-15-아고니스트 또는 -슈퍼아고니스트를 간단히 확인할 수 있다. IL-15-아고니스트 또는 -슈퍼아고니스트의 예시로서, 국제 특허 출원 WO 2005/085282 또는 ZHU 등 (J. Immunol , vol.l83(6), p:3598-607, 2009)에 개시된 것을 예로 들 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 IL-15 아고니스트 또는 슈퍼아고니스트는 L45D, L45E, S51D, L52D, N72D, N72E, N72A, N72S, N72Y 및 N72P (인간 IL-15, SEQ ID NO: 3의 서열과 관련됨)로 이루어진/포함하는 군에서 선택된다.
여기에 사용된 용어 "IL-15Rα의 스시 도메인"은 종래기술에서의 그것의 일반적인 의미를 가지며, IL-15Rα의 시그널 펩타이드 이후 첫 번째 시스테인 잔기 (C1)에서 시작하고, 상기 시그널 펩타이드 이후 네 번째 시스테인 잔기 (C4)에서 끝나는 도메인을 의미한다. IL-15Rα의 세포외 영역의 부분에 해당하는 상기 스시 도메인은 IL-15와의 결합에 필수적이다 (WEI et al, J. Immunol, vol.167(1), p:277-282, 2001).
IL-15Rα 또는 이의 유도체의 상기 스시 도메인은 인간 인터루킨-15와 인간 IL-15Rα의 스시 도메인의 결합 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25% 및 더욱 바람직하게는 적어도 50%를 갖는다. 상기 결합 활성은 WEI 등 (상기 기재, 2001)에 개시된 방법에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
상기 IL-15Rα의 스시 도메인은 포유동물의 IL-15Rα의 스시 도메인, 바람직하게는 영장류의 IL-15Rα의 스시 도메인 및 더욱 바람직하게는 인간의 IL-15Rα의 스시 도메인이다.
포유동물의 IL-15Rα의 스시 도메인은 당업자에 의해 간단히 확인될 수 있다. 예시로서, 시궁쥐 (Rattus norvegicus)(Accession number XP 002728555), 생쥐 (Mus musculus)(Accession number EDL08026), 소 (Bos Taurus)(Accession number XP 0026921 13), 집토끼 (Oryctolagus cuniculus)(Accession number XP_002723298), 필리핀원숭이 (Macaca fascicularis)(Accession number ACI42785), 돼지꼬리원숭이 (Macaca nemestrina)(Accession number ACI42783), 인간 (Homo sapiens)(Accession number Q13261.1), 붉은털원숭이 (Macaca Mulatta)(Accession number NP_001 166315), 오랑우탄 (Pongo abelii)(Accession number XP_002820541), 수티망가베이 (Cercocebus torquatus)(Accession number ACI42784), 마모셋원숭이 (Callithrix jacchus)(Accession number XP_002750073), 또는 기니피그 (Cavia porcellus)(Accession number NP_001166314) 유래의 IL-15Rα의 스시 도메인을 예로 들 수 있다.
여기에 사용된, 용어 "포유동물의 IL-15Rα의 스시 도메인"은 공통서열 SEQ ID NO: 4를 의미한다.
바람직하게는, 포유동물의 IL-15Rα의 스시 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 공통서열 SEQ ID NO: 5를 의미한다.
영장류의 IL-15Rα의 스시 도메인은 당업자에 의해 간단히 확인될 수 있다. 예시로서, 집토끼 (Oryctolagus cuniculus), 필리핀원숭이 (Macaca fascicularis), 돼지꼬리원숭이 (Macaca nemestrina), 인간 (Homo sapiens), 붉은털원숭이 (Macaca Mulatta), 오랑우탄 (Pongo abelii), 수티망가베이 (Cercocebus torquatus), 또는 마모셋원숭이 (Callithrix jacchus) 유래의 IL-15Rα의 스시 도메인을 예로 들 수 있다.
여기에 사용된, 용어 "영장류의 IL-15Rα의 스시 도메인"은 공통서열 SEQ ID NO: 6을 의미한다.
바람직하게는, 영장류의 IL-15Rα의 스시 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 공통서열 SEQ ID NO: 7을 의미한다.
인간의 IL-15Rα의 스시 도메인은 당업자에 의해 간단히 확인될 수 있으며, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 8을 의미한다.
바람직하게는, 인간의 IL-15Rα의 스시 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9를 의미한다.
여기에 사용된, 용어 "IL-15Rα의 스시 도메인의 유도체"는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 9로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 92%(즉, 약 5개의 아미노산 치환에 해당), 바람직하게는 적어도 96%(즉, 약 2개의 아미노산 치환에 해당), 및 더욱 바람직하게는 적어도 98%(즉, 약 1개의 아미노산 치환에 해당)의 유사도를 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 그러한 유도체는 IL-15Rα의 스시 도메인의 4개의 시스테인 잔기들을 포함하며, 그/그녀의 개인적 지식 및 본 특허 출원의 기술의 관점에서 당업자에 의해 간단히 확인될 수 있다. 또한, 천연 아미노산은 화학적으로 변형된 아미노산에 의해 대체될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일반적으로, 그러한 화학적으로 변형된 아미노산은 폴리펩타이드의 반감기를 증가시킬 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 컨쥬게이트는 IL-15Rα 또는 이의 유도체의 스시 및 힌지 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 (ii) 폴리펩타이드를 포함한다.
IL-15Rα 힌지 도메인은 스시 도메인 이후 첫 번째 아미노산 잔기에서 시작하고 글리코실화의 첫 번째 잠재적 부위 전 마지막 아미노산 잔기에서 끝나는 아미노산 서열로 정의된다. 인간의 IL-15Rα에서, 힌지 영역의 아미노산 서열은 상기 스시 도메인에 상대적인 C-말단 위치에서 IL-15Rα의 스시 도메인 이후에 위치한 14개의 아미노산으로 구성된다. 즉, 상기 IL-15Rα 힌지 영역은 상기 시스테인 잔기 (C4) 이후 첫 번째 아미노산에서 시작하고, 14번째 아미노산 (보통 "N-말단에서 C-말단" 방향으로 계수함)에서 끝난다.
상기 IL-15Rα의 상기 스시 및 힌지 도메인은 포유동물의 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인, 바람직하게는, 영장류의 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인, 및 더욱 바람직하게는, 인간 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인이다.
포유동물의 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인의 아미노산 서열은 당업자에 의해 간단히 확인될 수 있다. 여기에 사용된, 용어 "포유동물의 IL-15의 스시 및 힌지 도메인"은 공통서열 SEQ ID NO: 10을 의미한다.
영장류의 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인의 아미노산 서열은 당업자에 의해 간단히 확인될 수 있다. 여기에 사용된, 용어 "영장류의 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인"은 공통서열 SEQ ID NO: 11을 의미한다.
인간의 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인의 아미노산 서열은 당업자에 의해 간단히 확인될 수 있다. 여기에 사용된, 용어 "인간의 IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인"은 공통서열 SEQ ID NO:12를 의미한다.
여기에 사용된, 용어 "IL-15Rα의 스시 및 힌지 도메인의 유도체"는 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 93%(즉, 약 5개의 아미노산 치환에 해당), 바람직하게는 적어도 97%(약 2개의 아미노산 치환에 해당), 및 더욱 바람직하게는 적어도 98%(약 1개의 아미노산 치환에 해당)의 유사도를 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 그러한 유도체는 IL-15Rα의 스시 도메인의 4개의 시스테인 잔기를 포함하고, 그것의 일반적인 지식 및 본 특허 출원의 기술의 관점에서 당업자에 의해 간단히 확인될 수 있다. 또한, 천연 아미노산은 화학적으로 변형된 아미노산으로 대체될 수 있을 것으로 이해될 것이다. 일반적으로, 그러한 화학적으로 변형된 아미노산은 폴리펩타이드 반감기를 증가시킬 수 있다.
컨쥬게이트의 폴리펩타이드 i) 및 ii) 둘 다 미국특허 제8,124,084 B2호에 개시된 복합체에서와 같이 비-공유적으로 연결될 것이다. 상기 컨쥬게이트 또는 복합체는 적당한 함량의 폴리펩타이드 i)를 제공하고, 적당한 함량의 폴리펩타이드 ii)를 제공하며, 복합체 (즉, 컨쥬게이트) 형성을 허용하기에 충분한 기간에 적당한 pH 및 이온 조건하에서 두 폴리펩타이드를 혼합하고, 및 선택적으로, 상기 복합체를 농축 또는 정제하여 간단히 얻을 수 있다. 복합체 (즉, 컨쥬게이트)의 폴리펩타이드는 예를 들어, 표준 방법들에 따라 펩타이드 합성기를 이용하거나; 세포 또는 세포 추출물에서 별도로 각 폴리펩타이드를 발현하고 나서 폴리펩타이드를 분리 및 정제하여 형성될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 치료적 폴리펩타이드 복합체는 같은 세포 또는 세포 추출물에서 폴리펩타이드 i) 및 ii) 둘 다를 발현하고, 예를 들어, 림포카인 부분, 림포카인 수용체 부분 또는 복합체에 대한 항체를 이용한 어피니티 크로마토그래피 같은 크로마토그래피 기술을 이용하여 복합체를 분리 및 정제하여 형성될 수 있다.
또한, 컨쥬게이트의 폴리펩타이드 i) 및 ii) 둘 다 이기능 (bifunctional) 단백질 커플링제를 이용하여 공유적으로 연결되거나, 융합 단백질로 존재할 것이다.
이기능 단백질 커플링제는 그들을 이용하는 방법들처럼 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, N-석시니미딜 (2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (N-succinimidyl (2-pyridyldithio) propionate (SPDP)), 석시니미딜 (N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트 (succinimidyl (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate), 이미노티올란 (iminothiolane (IT)), 이미도에스테르 (imidoester)의 이기능 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피디데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디석시니미딜 수버레이트 (disuccinimidyl suberate)), 알데히드 (예를 들어, 글루타알데히드 (glutaraldehyde)), 비스-아지도 화합물 (bis-azido compounds)(예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민 (bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine)), 비스-디아조니움 유도체 (bis-diazonium derivatives)(예를 들어, 비스-(p-디아조니움벤조일)-에틸렌디아민 (bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine)), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트 (tolyene 2,6-diisocyanate)) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (bis-active fluorine compounds)(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 (l,5-difluoro-2,4- dinitrobenzene))을 포함한다.
용어 "융합 단백질"은 원래 개별 단백질을 코딩하는 둘 이상의 유전자들의 접합 (joining)을 통해 생기는 단백질을 의미한다. 또한, 키메릭 단백질로 알려져 있다. 이 융합 유전자의 번역을 통해 오리지널 단백질 각각에서 유래하는 기능적인 특성들을 갖는 싱글 폴리펩타이드가 생긴다. 재조합 융합 단백질은 생물학적 연구 또는 치료학에서 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 인위적으로 생성된다. 재조합 융합 단백질은 융합 유전자의 유전자 공학을 통해 생기는 단백질이다. 이는 일반적으로 첫 번째 단백질을 코딩하는 cDNA 서열로부터 종결 코돈을 제거하고 나서, 라이게이션 또는 오버랩 연장 PCR을 통해 프레임에 두 번째 단백질의 cDNA 서열을 부가하는 것을 포함한다. 그리고 나서, 그 DNA 서열은 싱글 단백질로서 세포에서 발현될 것이다. 단백질은 오리지널 단백질 둘 다 또는 둘 중 하나의 부분의 전체 서열을 포함하도록 변형될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 컨쥬게이트는 융합 단백질이다.
인터루킨 15 또는 이의 유도체의 아미노산 서열은 IL-15Rα 또는 이의 유도체의 스시 도메인의 아미노산 서열에 해당하는 C-말단 또는 N-말단 위치에서 존재할 수 있다. 바람직하게는, 인터루킨 15 또는 이의 유도체의 아미노산 서열은 IL-15Rα 또는 이의 유도체의 스시 도메인의 아미노산 서열에 해당하는 C-말단에 존재한다.
인터루킨 15 또는 이의 유도체의 아미노산 서열 및 IL-15Rα 또는 이의 유도체의 스시 도메인의 아미노산 서열은 제1 "링커" 아미노산 서열에 의해 분리될 것이다. 상기 제1 "링커" 아미노산 서열은 융합 단백질이 적당한 2차 및 3차 구조를 형성할 수 있을 정도로 충분히 길 것이다.
제1 링커 아미노산 서열의 길이는 융합 단백질의 생물학적 활성에 유의적으로 영향을 주지 않는 정도로 다양할 것이다. 일반적으로, 제1 링커 아미노산 서열은 적어도 하나를 포함하나, 30개 아미노산 미만, 즉, 2-30개의 아미노산으로 된 링커, 바람직하게는 10-30개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 15-30개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 15-25개의 아미노산, 가장 바람직하게는 18-22개의 아미노산이다.
바람직한 링커 아미노산 서열은 컨쥬게이트가 적당한 입체구조 (conformation)(즉, IL-15R 베타/감마 신호전달경로를 통한 적당한 신호전달활성이 가능한 입체구조)를 취할 수 있도록 하는 것이다.
가장 적당한 제1 링커 아미노산 서열은 (1) 유연한 연장된 입체구조를 취하거나, (2) 융합 단백질의 기능성 도메인과 상호작용할 수 있는 잘 배열된 2차 구조를 전개하는 경향을 나타내지 않거나, (3) 기능성 단백질 도메인과 상호작용을 촉진할 수 있는 최소 소수성 또는 하전된 특성을 가질 것이다.
바람직하게는, 제1 링커 아미노산 서열은 Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L) 및 Gin (Q)를 포함하는 군에서, 가장 바람직하게는 Gly (G), Asn (N) 및 Ser (S)를 포함하는 군에서 선택된 거의 중성의 아미노산을 포함한다.
링커 서열의 예시는 미국 특허 제5,073,627호 및 제5,108,910호에 기재되어 있다.
보다 상세하게는 본 발명에 적당한 예시적인 유연한 링커는 SEQ ID NO: 13 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ), SEQ ID NO: 14 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSGG) 또는 SEQ ID NO: 15 (SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ)의 서열에 의해 코딩되는 것을 포함한다.
바람직하게는, 컨쥬게이트는 SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 19의 서열을 갖는다.
본 발명의 이뮤노사이토카인의 항체
용어 "항체"는 4개의 폴리펩타이드 체인, 이황화 결합에 의해 서로 연결된 2개의 동일한 중쇄 (H)(전체 길이일 때 약 50-70 kDa) 및 2개의 동일한 경쇄 (L)(전체 길이일 때 약 25 kDa)를 포함하는 테트라머에 해당하는 이뮤노글로불린 분자를 의미한다. 경쇄는 카파 및 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 타우, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 각각 항체의 아이소타입, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE으로 정의한다. 각 중쇄는 N-말단 중쇄 가변 영역 (여기에서, HCVR로 줄여 쓴다) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 IgG, IgD 및 IgA에 대해 3개의 도메인 (CH1, CH2 및 CH3); 및 IgM 및 IgE에 대해 4개의 도메인 (CH1, CH2, CH3 및 CH4)으로 이루어진다. 각 경쇄는 N-말단 경쇄 가변 영역 (여기에서, LCVR로 줄여 쓴다) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 이루어진다. HCVR 및 LCVR 영역은 훨씬 더 보존된 영역, 일명 골격 부위 (framework regions, FR) 사이에 배치되어 있는 과변이 (hypervariability)의 영역, 일명 상보성 결정 부위 (complementarity determining regions, CDRs)로 추가로 세분화될 수 있다. 각 HCVR 및 LCVR는 3개의 CDRs 및 4개의 FRs로 구성되며, 다음의 순서, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된다. 각 도메인에 대한 아미노산의 배치는 잘 알려진 관습에 따른다. 특정 항원과 결합하는 항체의 기능성은 각 경쇄/중쇄의 가변 영역에 달려 있으며, CDRs에 의해 주로 결정된다.
여기에 사용된, 용어 "항체"는 단일클론 항체 그 자체를 의미한다. 단일클론 항체는 인간 항체, 키메릭 항체 및/또는 인간화 항체일 수 있다.
유리하게는, 용어 항체는 IgG, 예를 들어, IgGl, IgG2 (IgG2a 또는 IgG2b), IgG3 및 IgG4를 의미한다. 바람직하게는, 용어 항체는 IgGl 또는 IgG2 및 더욱 바람직하게는 IgG2a이다.
"키메릭 항체"는 쥐의 이뮤노글로불린의 가변 영역 및 인간의 이뮤노글로불린의 불변 영역으로 구성된 항체를 의미한다. 이러한 변경은 단순히 인간 항체의 불변 영역을 쥐의 불변 영역으로 치환하여 구성하므로 약학적 용도에 적합하도록 충분히 낮은 면역원성을 갖는 인간/쥐 키메라를 생산케 한다. 그러한 키메릭 항체를 생산하는 많은 방법이 지금도 보고되고 있어, 당업자의 일반적인 지식의 일부를 형성한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,225,539호를 볼 것).
"인간화 항체"는 비-인간 상보적 결정 부위 (CDR)를 갖는 항체의 서열을 바꾸어 인간 항체 생식세포에서 유래된 아미노산 서열의 부분 또는 전체로 구성된다. 항체의 가변 영역 및 최종적으로 CDR의 인간화는 현재 종래기술로 잘 알려져 있는 기술에 의해 제조된다. 예를 들어, 영국 특허 출원 GB 2188638A 및 미국 특허 제5,585,089호는 치환된 항체의 유일한 부분이 상보성 결정 부위, 또는 "CDR"이 되도록 재조합 항체를 생산하는 공정을 개시하고 있다. CDR 그래프팅 기술은 쥐의 CDRs 및 인간의 가변 영역 골격 및 불변 영역으로 구성된 항체를 생산하는데 사용되어 왔다 (예를 들어, RIECHMANN et al, Nature, vol.332, p: 323-327, 1988를 볼 것). 이들 항체들은 Fc 의존적인 효과기 기능에 필수적인 인간의 불변 영역을 보유하고 있으나, 항체에 대한 면역 반응을 훨씬 덜 유발하는 것 같다. 예를 들어, 가변 영역의 골격 부위가 비-인간의 CDR을 실질적으로 그대로 두고 해당 인간의 골격 부위에 의해 치환되거나, 심지어 인간의 게놈 유래의 서열로 CDR이 치환된다. 적어도 인간 항체는 인간의 면역 시스템에 대응하기 위해 바뀐 면역 시스템을 갖는 유전적으로 변형된 마우스에서 생산된다. 상기에서 언급된 바와 같이, 골격 제시 단일 체인 형태를 포함하는 항체의 면역학적 특이 골격을 사용하기 위해 본 발명의 방법들을 충분히 사용할 수 있다.
인간화 항체는 인간의 골격, 비-인간 항체 유래의 적어도 하나의 CDR 및 인간 이뮤노글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일한, 즉 적어도 약 85% 또는 90%, 바람직하게는 적어도 95% 동일한 임의의 불변 영역을 포함하는 항체를 의미한다. 그리하여, 아마도 CDR을 제외한 인간화 항체의 모든 부분들은 인간의 네이티브 이뮤노글로불린 서열의 하나 이상의 해당 부분들에 실질적으로 동일하다. 예를 들어, 인간화 이뮤노글로불린은 일반적으로 키메릭 마우스 가변 영역/인간 불변 영역 항체를 포함하지 않을 것이다. 예를 들어, 인간화 이뮤노글로불린의 설계는 다음과 같이 수행될 것이다: 아미노산이 다음의 카테고리 하에서 포함될 때, 사용된 인간 이뮤노글로불린의 골격 아미노산 (어셉터 이뮤노글로불린)은 CDR-제공하는 비-인간 이뮤노글로불린 (도너 이뮤노글로불린) 유래의 골격 아미노산으로 치환된다: (a) 어셉터 이뮤노글로불린의 인간 골격 영역에서 아미노산은 그 위치에서 인간 이뮤노글로불린에 대해 특이적이지만, 도너 이뮤노글로불린에서 해당 아미노산은 그 위치에서 인간 이뮤노글로불린에 대해 특이적이다; (b) 아미노산의 위치는 CDRs 중 하나에 밀착하여 근접해 있다; 또는 (c) 골격 아미노산의 임의의 사이드 체인 원자는 3차원 이뮤노글로불린 모델 (QUEEN et al, Proc . Natl . Acad . Sci. USA, vol.88, p:2869, 1991)에서 CDR 아미노산의 임의의 원자의 약 5-6 암스트롱(중심-대-중심) 내에 있다. 어셉터 이뮤노글로불린의 인간의 골격 부위에서 아미노산과 도너 이뮤노글로불린에서 해당 아미노산 각각은 그 위치에서 인간 이뮤노글로불린에 대해 특이적일 때, 그러한 아미노산은 그 위치에서 인간 이뮤노글로불린에 대해 특이적인 아미노산에 의해 치환된다.
여기에 사용된 용어 "항체 단편"은 이의 항체 카운터파트 보다는 같은 항원과 반응할 수 있는 항체 단편을 의미한다. 그러한 단편은 당업자에 의해 간단히 확인될 수 있고, 예를 들어, Fab 단편 (예컨대, 파페인 분해에 의해), Fab ' 단편 (예컨대, 펩신 분해 및 부분 환원에 의해), F(ab')2 단편 (예컨대, 펩신 분해에 의해), Facb (예컨대, 플라스민 분해에 의해), Fd (예컨대, 펩신 분해, 부분 환원 및 재응집에 의해) 및 본 발명에 의해 포함된 scFv(단일 체인 Fv; 예컨대, 분자 생물학 기술에 의해) 단편을 포함한다.
그러한 단편은 종래기술 및/또는 여기에 기재된 효소적 절단, 합성 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다. 또한, 항체들은 하나 이상의 종결 코돈이 천연 종결 부위의 업스트림에 도입된 항체 유전자들을 이용하여 다양한 끝이 절단된 형태 (truncated forms)로 생산될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 중쇄 부분을 코딩하는 결합 유전자는 중쇄의 CH1 도메인 및/또는 힌지 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 항체들의 다양한 부분들은 전통적인 기술들에 의해 화학적으로 서로 결합되거나, 유전공학적 기술을 이용한 연속 단백질 (contiguous protein)로 제조될 수 있다.
바람직하게는, 상기 항체 단편은 scFv 단편이다.
여기에 사용된, 용어 "면역조절 항체"는
1) 면역억제 수용체, 예를 들어, CTL-A4, PD-1, BTLA, LAG3 HAVCR2, ADORA2A, 또는 억제성 KIRs를 이 수용체 또는 이의 리간드와 결합하여 억제함으로써 하향조절 신호를 억제하여 면역 활성화를 촉진하거나,
2) 보조-자극 수용체, 예를 들어, CD40, CD 137, CD 134 또는 TNFRSF18 (GITR)를 촉진하여, T 세포 및/또는 NK 세포 활성화를 촉진하는 어느 하나로 작용하는 항체를 의미한다.
첫 번째 바람직한 구체예에서, 면역조절 항체는 면역억제 수용체를 억제한다. 면역억제 수용체를 억제하는 면역조절 항체의 예시로, CTL-A4, 억제성 KIRs, BTLA, LAG3 HAVCR2, ADORA2A 및 PD-1 안타고니스트, 및 더 바람직하게는 항-PD1 및 항-PD-L1 항체 중 선택된 PD-1 안타고니스트를 예로 들 수 있다.
CTL-A4 (세포독성 림프구 관련된 항원, 또한 CD152로 명시됨)는 1987년에 발견되었다 (BRUNET et al, Nature, vol.328, p:267-270, 1987). CTL-A4의 역할은 우선 T 세포 활성화를 억제하고, 이는 대량 림프구증식 (massive lymphoproliferation)를 겪는 CTL-A4 결핍 마우스에서 나타난다 (CHAMBERS et al, Immunity, vol.7, p:8855-8959, 1997). 현재, CTL-A4의 차단은 인 비트로 (WALUNAS et al, Immunity, vol.1, p:405-413, 1994) 및 인 비보 (KEARNEY, J. Immunol , vol.155, p: 1032- 1036, 1995)에서 T 세포 반응을 향상시키고, 항종양 면역을 증가시킴을 보여준 바 있다 (LEACH, Science, vol.271, p: 1734- 1736, 1996). CTL-A4 안타고니스트에 해당하는 항체의 예시로, WO 01/14424에 개시된 이필리무맙 (ipilimumab)(또한, MDX-010 및 10D1로 언급되고, MEDAREX로부터 이용할 수 있으며, BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY에서 YERVOY™ 로 판매된다), WO 00/37504에 개시된 티실리무맙 (ticilimumab)(또한, 1 1.2.1 및 CP-675,206로 알려져 있다) 및 또한 문헌이 원용된 국제 특허 출원 WO 98/42752, WO 01/14424, WO 2004/035607 및 WO 2012/120125, EP 1212422 및 EP 1262193, US 5,811,097, US 5,855,887, US 5,977,318, US 6,051,227, US 6,207,156, US 6,682,736, US 6,984,720, US 7,109,003 및 US 7,132,281에 개시된 CTL-A4 항체들을 예로 들 수 있다.
또한, PD-1 (또한, PDCD1 또는 CD279로 언급된다)으로 알려져 있는 programmed cell death 1은 ~ 55 kD 타입 I 막 당단백질이다. PD-1은 나이브 T, B 및 NK 세포에서 적당히 발현되며, 림프구, 단핵구 및 골수세포에서 T/B 세포 수용체 신호전달에 의해 상향-조절되어 있는 CD28 보조자극 유전자 패밀리의 수용체이다. PD-1은 다른 발현 프로파일을 갖는 2개의 알려진 리간드, PD-L1 (B7-H1) 및 PD-L2 (B7-DC)를 가지고 있다. PD-L1 (B7-H1)는 나이브 림프구, 활성화된 B 및 T 세포, 단핵구 및 수지상세포에서 널리 발현되나, PD-L2 (B7-DC)의 발현은 활성화된 수지상세포, 대식세포 및 단핵구 및 혈관내피세포로 한정된다. 몇몇 쥐 이형 종양 모델 (syngeneic tumor model)에서, PD-1 또는 PD-L1 어느 쪽의 차단은 유의적으로 종양 생장을 억제하거나 완전 퇴화를 유도하였다. 따라서, PD-1은 면역 조절 및 말초관용의 유지에 중요한 역할을 담당하는 것으로 인식된다. PD-1 안타고니스트에 해당하는 항체들의 예시로, WO 2006/121168에 개시되어 있는 니볼루맙 (nivolumab)(또한 BMS-936558 또는 MDX1 106; 항-PD-1 항체, BRISTOL-MYERS SQUIBB로 알려져 있다), WO 2009/114335에 개시되어 있는 Merck 3745 (또한, 항-PD-1 항체인 MK-3475 또는 SCH-900475로 알려져 있다), WO 2009/101611에 개시된 CT-011 (또한, hBAT 또는 hBAT-1, 항-PD-1 항체로 알려져 있다), WO 2008/156712에 개시된 람브롤리주맙 (lambrolizumab), WO 2010/027423, WO 2010/027827, WO 2010/027828 및 WO 2010/098788에 개시된 AMP514 및 또한 국제 특허 출원 WO 2004/056875, WO 2006/056875, WO 2008/083174, WO 2010/029434, WO 2010/029435, WO 2010/036959, WO 2010/089411, WO 2011/110604, WO 2012/135408 및 WO 2012/145493에 개시된 항체들을 예로 들 수 있다. 상기 PD-1 안타고니스트는 문헌이 원용된 WO 2007/005874에 개시된 MDX-1 105 (또한, BMS-936559, 항-PD-Ll 항체로 알려져 있다), 또는 WO 2010/077634에 개시된 YW243.55.S70 (또한, MPDL3280A 또는 RG7446; 항-PD-Ll 항체로 알려져 있다) 같은 항-PD-L1 항체에 해당할 것이다.
Killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIRs)는 자연살해세포로 불리는 면역 시스템의 중요한 세포에서 발견되는 세포 표면 단백질의 패밀리이다. 그들은 모든 세포 타입에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자와 상호작용하여 이들 세포의 살해 기능을 조절한다. 이 상호작용은 그들로 하여금 그들의 표면에서 클래스 I MHC의 특징적인 낮은 수준을 갖는 바이러스 감염된 세포 또는 종양세포를 탐지하도록 한다. 대부분의 KIRs는 억제성이며, MHC의 인식은 그들의 NK 세포의 세포독성 활성을 억제함을 의미한다. 단지 제한된 수의 KIRs이 세포를 활성화하는 능력을 가지고 있다.
억제성 KIRs는 그들의 MHC 클래스 I 리간드의 관여 시 NK 세포에 억제 신호를 전달하는 Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif (ITIM)를 포함하는 긴 세포질성 꼬리를 가지고 있다. 알려진 억제성 KIRs는 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B,KIR3DL1, KIR3DL2 및 KIR3DL3를 포함하는 KIR2DL 및 KIR3DL 서브패밀리의 구성원을 포함한다. 억제성 KIRs 안타고니스트에 해당하는 항체들의 예시로, 문헌이 원용된 WO 2006/003179에 개시된 항체 1-7F9를 예로 들 수 있다.
CD272로 알려진 BTLA (B- and T-lymphocyte attenuator)는 T 세포의 활성화 동안 유도되고, Th1 세포에서 발현된 채 남아 있으나, Th2 세포에서는 그렇지 않다. BTLA는 tumor necrosis factor (receptor), herpes virus entry mediator (HVEM)로 알려져 있는 member 14 (TNFRSF14), TR2; ATAR; HVEA; CD270; LIGHTR과의 상호작용에 의한 T-세포 억제를 나타낸다. NFRSF14는 허피스 심플렉스 바이러스 (HSV) 엔트리의 세포성 매개체로 확인되었다. 이 수용체의 세포질 영역은 면역 반응을 활성화하는 신호전달경로를 매개하는 몇몇 TRAF 패밀리 구성원과 결합하는 것으로 밝혀져 있다. 마지막으로, BTLA/HVEM 복합체는 T-세포 면역 반응을 부정적으로 조절한다. BTLA/HVEM 안타고니스트의 예시로, WO 2008/076560, WO 2010/106051 및 WO 2011/014438에 개시된 항체들을 예로 들 수 있다.
LAG3 (Lymphocyte-activation gene 3, 또한 CD223로 알려져 있다)는 이뮤노글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리에 속하며, 4개의 세포외 Ig-유사 도메인을 포함한다. LAG3 안타고니스트의 예시로, WO 2010/019570에 개시된 항체들을 예로 들 수 있다.
HAVCR2 (Hepatitis A virus cellular receptor 2, 또한 Tim-3, KIM-3; TIMD3; Tim-3; 및 TIMD-3로 알려져 있다)는 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 Th1-특이 세포 표면 단백질이다. HAVCR2는 대식세포 활성화를 조절하고 Th1-매개 자가- 및 동종-면역 반응을 억제하여 면역 관용을 촉진한다. HAVCR2 안타고니스트의 예시로, WO 2013/006490A에 개시된 항체들을 예로 들 수 있다.
ADORA2A (adenosine A2A receptor, 또한, A2aR, RDC8; 또는 ADORA2로 알려져 있다)는 클래스 및 서브타입으로 세분화되는 guanine nucleotide-binding protein (G protein)-coupled receptor (GPCR) 슈퍼패밀리에 속한다. 이 단백질은 많은 생물학적 기능, 예컨대, 심장리듬 및 순환, 뇌 및 신장 혈류, 면역 기능, 통증 조절 및 수면에서 중요한 역할을 담당한다. 병리적인 상태, 예컨대, 염증 질환 및 신경퇴행적 장애에 관련되어 있다.
두 번째 바람직한 구체예에서, 면역조절 항체는 보조-자극 수용체를 자극한다.
보조-자극 수용체를 자극하는 면역조절 항체들의 예시로, CD40, CD137, CD134 및 TNFRSF18 아고니스트를 예로 들 수 있다.
CD40은 그들의 활성화에 필요한 APC에서 발견되는 TNF-수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이 수용체는 T-세포 의존적 이뮤노글로불린 클래스 스위칭 및 메모리 B 세포 전개를 포함하는 광범위한 다양한 면역 및 염증 반응을 매개하는데 필수적인 것으로 밝혀졌다.
CD40 아고니스트에 해당하는 항체들의 예시로, 문헌이 원용된 WO 03/040170, WO 2005/063981, WO 2005/063289 및 WO 2012/041635에 개시된 것들을 예로 들 수 있다.
CD137은 tumor necrosis factor (TNF) 수용체 패밀리의 구성원이다. 이의 다른 이름은 tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 (TNFRSF9), 4-1BB이고, 림프구 활성화(ILA)에 의해 유도된다. CD137은 활성화된 T 세포에 의해 발현될 수 있으나, CD4T 세포에서 보다는 CD8T 세포에서 더 큰 정도로 발현될 수 있다. 또한, CD137 발현은 수지상세포, 여포 수지상세포, 자연살해세포, 염증 부위에 있는 혈관벽의 과립구 및 세포에서 발견된다. CD137의 가장 특징적인 활성은 활성화된 T 세포를 위한 그것의 보조자극 활성이다. CD137의 가교결합은 T 세포 증식, IL-2 분비 생존 및 세포용해 활성을 향상시킨다. 추가로, 마우스에서 종양을 제거하는 면역 활성을 향상시킬 수 있다.
CD137 아고니스트에 해당하는 항체들의 예시로, 우레루맙 (urelumab (또한, BMS-663513로 알려져 있다), 문헌이 원용된 WO 03/040170, WO 2004/010947, WO 2005/035584, WO 2006/126835 및 WO 2012/145183에 개시된 항체들을 예로 들 수 있다.
OX40로 알려져 있는 CD134는 수용체들의 TNFR-슈퍼패밀리의 구성원이다. OX40은 OX40의 발현이 T 세포의 전적인 활성화에 의존적인 보조자극 분자이다. OX40은 T-세포에 있는 수용체에 결합하여 그들이 사멸되지 않도록 하고, 이어서 사이토카인 생산을 증가시킨다. OX40은 생존을 높일 수 있는 능력으로 인해 첫 며칠이 지나고 메모리 반응으로 진행하도록 면역 반응을 유지하는데 중요한 역할을 가지고 있다.
CD134 아고니스트에 해당하는 항체들의 예시로, 문헌이 원용된 WO 2009/079335, WO 2012/027328, WO 2013/038191 및 WO 2013/028231에 개시된 항체들을 예로 들 수 있다.
activation-inducible TNFR family receptor (AITR) 또는 glucocorticoid-induced TNFR-related protein (GITR)로 알려져 있는 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 (TNFRSF18)는 종양 괴사 인자 수용체 (TNF-R) 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이 단백질은 T-조절 세포의 억제 활성을 억제하고 T-효과기 세포의 생존을 연장하는데 관련되는 것으로 밝혀진 표면 수용체 분자이다.
TNFRSF18 아고니스트에 해당하는 항체들의 예시로, WO 2006/105021 및 WO 2011/028683에 개시된 항체들을 예로 들 수 있다.
컨쥬게이트 및 항체 또는 이의 단편 둘 다 이기능 단백질 커플링제를 이용하여 공유적으로 연결되거나, 융합 단백질일 수 있다.
이기능 단백질 커플링제 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 앞서 개시된 바 있다. 예를 들어, 당업자는 TILL 등 (Proc . Natl . Acad. U.S.A., vol.86(6), p: 1987-91, 1989)에 개시된 방법을 이용할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 이뮤노사이토카인은 융합 단백질이다.
다른 바람직한 구체예에서, 이뮤노사이토카인은 복합체, 바람직하게는 폴리펩타이드 i) 및 ii) 간의 컨쥬게이트를 포함하는 복합체, 여기서, 상기 폴리펩타이드 i) 또는 ii)는 항체 또는 이의 단편에 융합되어 있다.
폴리펩타이드 i), 폴리펩타이드 ii) 또는 컨쥬게이트는 항체 또는 이의 단편의 아미노산 서열과 비교하여 C-말단 또는 N-말단에서 존재할 수 있다.
바람직하게는, 컨쥬게이트는 융합 단백질이며, 컨쥬게이트의 아미노산 서열은 항체 또는 이의 단편의 아미노산 서열과 비교하여 C-말단 위치에 있으며, 가장 바람직하게는, 항체 또는 이의 단편의 중쇄 불변 영역의 적어도 하나의 아미노산 서열과 비교하여 C-말단에 있다.
컨쥬게이트의 아미노산 서열과 항체 또는 이의 단편의 아미노산 서열은 분리되어 있거나, 제2 "링커" 아미노산 서열에 의해 그렇지 않을 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 이뮤노사이토카인은 융합 단백질, 여기서 컨쥬게이트 및 항체 또는 이의 단편은 임의의 링커에 의해 분리되어 있지 않다.
제1 링커 아미노산 서열에 관하여, 상기 제2 "링커" 아미노산 서열은 융합 단백질이 적당한 2차 및 3차 구조를 형성하기에 충분한 길이일 것이다.
제1 링커 아미노산 서열의 길이는 융합 단백질의 생물학적 활성에 유의적으로 영향을 주지 않은 채로 다양할 것이다. 전형적으로, 제1 링커 아미노산 서열은 적어도 하나를 포함하나, 30개 아미노산 미만, 즉, 2-30개의 아미노산을 갖는 링커, 바람직하게는 10-30개의 아미노산, 보다 바람직하게는 15-30개의 아미노산, 가장 바람직하게는 1-25개의 아미노산을 포함한다.
제1 링커 아미노산 서열에 관하여, 가장 적당한 제2 링커 아미노산 서열은 (1) 유연한 연장된 입체구조를 취하고, (2) 융합 단백질의 기능성 도메인과 상호작용할 수 있는 잘 배열된 2차 구조를 전개하는 경향을 나타내지 않고, (3) 기능성 단백질 도메인과 상호작용을 촉진할 수 있는 최소 소수성 또는 하전된 특성을 가질 것이다.
바람직하게는, 제2 링커 아미노산 서열은 Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L) 및 Gin (Q)를 포함하는 군에서 선택된, 가장 바람직하게는 Gly (G), Asn (N) 및 Ser (S)를 포함하는 군에서 선택된 거의 중성의 아미노산을 포함한다.
본 발명에 적당한 제2 링커 아미노산 서열의 예시로, SEQ ID NO: 16 (SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG) 또는 SEQ ID NO: 17 (AAGGGSGGGSGGGGSGGGGSAA) 서열을 예로 들 수 있다.
핵산, 벡터 및 재조합 숙주 세포
두 번째 양상에서, 본 발명은 상기 기재된 이뮤노사이토카인, 바람직하게는 융합 단백질에 해당하는 이뮤노사이토카인을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.
상기 핵산은 RNA 또는 DNA, 바람직하게는 DNA에 해당한다.
바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 이뮤노사이토카인을 인코딩하는 핵산은 유전자 발현 서열에 작동 가능하게 연결되어 있어, 원핵세포 또는 진핵세포, 바람직하게는 진핵세포에서 핵산의 발현을 유도한다. "유전자 발현 서열"은 임의의 조절성 뉴클레오타이드 서열, 예컨대, 프로모터 서열 또는 프로모터-인핸서 조합이며, 작동 가능하게 연결되어 이뮤노사이토카인 핵산의 효과적인 전사 및 번역을 촉진한다. 유전자 발현 서열은, 예를 들어, 포유동물 또는 바이러스 프로모터, 예컨대, 항시성 또는 유도성 프로모터일 것이다.
포유동물의 항시성 프로모터는 다음의 유전자에 대한 프로모터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPTR)), 아데노신 디아미나아제 (adenosine deaminase), 피루베이트 키나아제 (pyruvate kinase), 베타-액틴 프로모터 (beta-actin promoter), 근육 크레아틴 키나아제 프로모터 (muscle creatine kinase promoter), 인간 신장 인자 프로모터 (human elongation factor promoter) 및 다른 항시성 프로모터. 진핵세포에서 구성 요소로서 기능을 수행하는 예시적인 바이러스 프로모터는, 예를 들어, 원숭이 바이러스 (즉, SV40), 파필로마 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 사이토메갈로 바이러스 (CMV), 라우스 육종 바이러스 (RSV), B형 간염 바이러스 (HBV), 말로니 류케미아 바이러스 및 다른 레트로바이러스의 long terminal repeats (LTR) 유래의 프로모터 및 허피스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나아제 프로모터를 포함한다. 다른 항시성 프로모터들은 당업자에게 알려져 있다.
또한, 본 발명의 유전자 발현 서열로 유용한 프로모터는 유도성 프로모터들을 포함한다. 유도성 프로모터들은 유도제의 존재에서 발현된다. 예를 들어, 프로모터 내 메탈로티온 (metallothione)은 특정한 금속 이온의 존재에서 전사 및 번역을 촉진하기 위해 유도된다. 다른 유도성 프로모터들은 당업자에게 알려져 있다.
일반적으로, 유전자 발현 서열은 필수적으로, 전사 및 번역의 개시에 관련된 각각 5' 비-전사 및 5' 비-번역 서열, 예컨대, TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함한다. 특히, 그러한 5' 비-전사 서열은 작동 가능하게 연결된 핵산의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 유전자 발현 서열은 설계될 때 인핸서 서열 또는 업스트림 활성인자 서열을 선택적으로 포함한다. 여기에 사용된, 본 발명의 이뮤노사이토카인을 인코딩하는 핵산 서열과 유전자 발현 서열은 유전자 발현 서열의 영향 또는 조절 하에서 본 발명의 이뮤노사이토카인 코딩 서열의 발현 또는 전사 및/또는 번역을 배치하기 위한 그러한 방식으로 상기 "작동 가능하게 연결된다"라고 한다.
2개의 DNA 서열은 만약 5' 유전자 발현 서열에서 프로모터의 유도를 통해 본 발명의 이뮤노사이토카인의 전사가 일어나고, 2개의 DNA 서열 간의 연관의 근원이 (1) 프레임-시프트 돌연변이의 도입, (2) 본 발명의 이뮤노사이토카인의 전사를 유도하는 프로모터 영역의 능력을 방해, 또는 (3) 단백질로 번역되도록 하는 해당 RNA 전사체의 능력을 방해하지 않는다면 작동 가능하게 연결된다고 한다. 그리하여, 만약 유전자 발현 서열이 핵산 서열의 전사에 영향을 줄 수 있고, 결과적으로 생긴 전사체가 설계된 폴리펩타이드로 번역된다면 유전자 발현 서열은 본 발명의 이뮤노사이토카인을 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 것이다.
유리하게는, pre-mRNA 분자는 보통 재조합 분자의 생산 수율을 개선하는 것으로 입증되어 있어 상기 핵산 서열은 인트론을 포함한다. 인트론의 임의의 서열이 사용될 것이며, 예컨대, ZAGO 등 (Biotechnol . Appl . Biochem., vol.52(Pt 3), p: 191-8, 2009) 및 CAMPOS-DA-PAZ 등 (Mol . Biotechnol., vol.39(2), p: 155-8, 2008)에서 개시된 것들을 예로 들 수 있다.
본 발명의 이뮤노사이토카인을 코딩하는 핵산은 인 비보에서 스스로 또는 벡터에 결합되어 전달될 것이다.
세 번째 양상에서, 본 발명은 상기 기재된 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
넓은 의미에서, "벡터"는 본 발명의 이뮤노사이토카인을 코딩하는 핵산의 세포로의 전달을 촉진할 수 있는 임의의 비히클이다. 바람직하게는, 벡터는 벡터가 없을 때 생길 수 있는 분해 정도에 비해 감소된 분해로 세포에 핵산을 전달한다. 일반적으로, 본 발명에 유용한 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 에피좀, 인공 염색체, 바이러스, 이뮤노사이토카인 핵산 서열의 삽입 또는 결합에 의해 조작된 바이러스 또는 박테리아 공급원 유래 다른 비히클을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
플라스미드 벡터는 벡터의 바람직한 형태이며, 종래기술에 널리 기재되어 있고, 당업자에게 잘 알려져 있다. SANBROOK 등, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989를 볼 것. 플라스미드의 비제한적 예시로, pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 및 pBlueScript를 포함하며, 다른 플라스미드들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 추가로, 플라스미드는 DNA의 특정 단편들을 제거 및 부가하기 위해 제한효소 및 라이게이션 반응을 이용하여 설계되는 관습을 따를 것이다.
바람직하게는, 핵산 벡터는 박테리아 및 포유동물 세포 둘 다에서 활성이 있는 선별 마커를 포함할 수 있다.
네 번째 양상에서, 본 발명은 앞서 개시된 핵산 또는 벡터로 유전자 변형된 숙주 세포에 관한 것이다.
여기에 사용된, 용어 "유전자 변형된 숙주 세포"는 앞서 개시된 핵산 또는 벡터가 형질도입, 형질전환, 또는 형질주입된 숙주 세포에 관한 것이다.
적당한 숙주 세포의 대표 예시로, 대장균 (E. coli) 등의 박테리아 세포, 효모 등의 곰팡이 세포, Sf9 등의 곤충 세포, CHO 또는 COS 등의 동물 세포, 식물 세포 등을 예로 들 수 있다. 적당한 숙주의 선택은 여기에서 알려주는 기술에 숙련된 자들의 범위 내에 있는 것으로 생각된다.
바람직하게는, 유전자 변형된 숙주 세포는 동물 세포이며, 가장 바람직하게는 CHO-S 세포 (INVITROGEN, cat N°11619-012)이다.
Chinese hamster ovary (CHO) 세포는 재조합 단백질, 항체, 펩티바디 및 수용체 리간드 등의 생물학적 제조를 위한 바이오약품 산업에서 빈번하게 이용된다. CHO 세포가 종종 사용된 이유 중 하나는 이들 세포가 생물학적 생산을 위한 광범위한 안전성 추적 기록을 가지고 있다는 것이다. 이는 잘-특성규명된 세포주인 것으로 간주되며, 결과적으로, 요구되는 안전성 시험이 다른 세포 타입에서 요구되는 것보다 어떤 측면 (예컨대, 레트로바이러스 안전성)에서 덜 엄격할 것이다. 그럼에도, 인터루킨 15의 생산은 이 세포에서 특히 매우 어렵다.
앞서 개시된 핵산 또는 벡터의 숙주 세포로의 도입은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예컨대, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션; DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 또는 일렉트로포레이션에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이뮤노사이토카인을 발현하는 유전자 변형된 숙주 세포의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 상기 기재된 핵산 또는 벡터를 숙주 세포로 인 비트로 또는 엑스 비보 도입하는 단계, (ii) 획득된 유전자 변형된 재조합 숙주 세포를 인 비트로 또는 엑스 비보 배양하는 단계, 및 (iii) 선택적으로, 상기 이뮤노사이토카인을 발현 및/또는 분비하는 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 그러한, 재조합 숙주 세포는 본 발명의 이뮤노사이토카인의 생산에 사용될 수 있다.
본 발명의 이뮤노사이토카인을 포함하는 약학 조성물
본 발명의 다른 목적은 상기 기재된 이뮤노사이토카인, 이의 인코딩 핵산, 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함하고, 최종적으로 약학적으로 허용 가능한 담체와 결합되는 약학 조성물에 관한 것이다.
표현 "약학적으로 허용 가능한"은 생리학적으로 견딜만하고, 일반적으로 인간에게 투여될 때 알러지 또는 유사한 바람직하지 못한 반응, 예를 들어, 위장 전도 (gastric upset), 현기증 등을 야기하지 않는 물질 (molecular entities) 또는 조성물을 의미한다. 바람직하게는, 여기에 사용된, 표현 "약학적으로 허용 가능한"은 동물 및 더 바람직하게는 인간에서 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 감독 기관에 의해 승인받을 수 있거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 공인된 약전에 나열되어 있음을 의미한다.
용어 "담체"는 용매, 아쥬번트, 부형제, 또는 화합물이 투여되는 비히클을 의미한다. 그러한 약학적 담체는 멸균액, 예를 들어, 물과 석유, 동물, 식물 또는 합성 오리진의 오일, 예를 들어, 땅콩오일, 콩기름, 미네랄 오일, 참기름 등을 포함하는 오일일 수 있다.
약학 조성물은 본 발명의 이뮤노사이토카인의 "유효량"을 포함한다. 상기 유효량은 암세포의 생장을 억제하기에 충분하고, 바람직하게는 종양 생장의 억제를 유도하기에 충분하다. 투여량은 다양한 파라미터의 함수, 특히 사용된 투여 방식, 관련 병리학, 또는 양자택일로 처치의 바람직한 기간의 함수에 따라 변경될 수 있다. 물론, 약학 조성물의 제형, 투여 경로, 투약량 및 섭생은 당연히 처치 조건, 질환의 심각도, 나이, 체중 및 대상체의 성별 등에 달려 있다. 유효 용량의 범위는 본 발명에 제한되어서는 안되나, 바람직한 용량의 범위를 제시한다. 그러나, 바람직한 용량은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 이해되거나 결정될 수 있어 각 대상체에 맞출 수 있다.
본 발명의 이뮤노사이토카인의 현저한 효율 면에서, 당업자는 대상체를 치료하기 위한 매우 소량의 용량을 이용하는 것으로 계획할 수 있다. 비제한적 예시로, 본 발명의 이뮤노사이토카인은 50 mg/kg 내지 5 ㎍/kg, 바람직하게는 10 mg/kg 내지 100 ㎍/kg, 및 가장 바람직하게는, 2.5 mg/kg 내지 500 ㎍/kg를 포함하는 용량으로 주사 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 국소, 구강, 비강, 안구 내, 정맥 내, 근육 내, 종양 내 또는 피하 투여 등을 위해 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 약학 조성물은 주사될 수 있는 제형에 약학적으로 허용 가능한 비히클을 포함한다. 이들은 특히 주사 용액의 조성을 허용하는 등장, 살균, 식염 용액 (모노소듐 또는 다이소듐 포스페이트, 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등 또는 그러한 염의 혼합), 또는 건조, 특히 추가 시 경우에 따라 살균수 또는 생리 식염의 동결-건조된 조성물일 것이다. 적당한 약학적 담체는 E.W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 에 기재되어 있다.
본 발명의 이뮤노사이토카인, 이의 코딩 핵산 또는 핵산 벡터는 버퍼 또는 물 또는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 하이드로겔 (예를 들어, PLGA-PEG-PLGA 트리블록 공중합체 기반 하이드로겔), 마이크로스피어, 나노스피어, 미세입자, 나노입자 (예를 들어, 폴리(락틱-코-글리콜릭 애시드)(poly(lactic-co-glycolic acid)) 미세입자 (예를 들어, poly lactic acid(PLA); poly (lactide-co-glycolic acid)(PLGA); polyglutamate 마이크로스피어, 나노스피어, 미세입자 또는 나노입자), 리포좀, 또는 다른 생약 제형에 결합되어 용해될 것이다. 모든 경우에서, 제형은 살균되어야 하며, 허용 가능한 주사 가능성 (syringability)의 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하며, 박테리아 및 곰팡이 등의 미생물의 오염 영향에 반하여 보존되어야 한다.
유리 염기 또는 약학적으로 허용 가능한 염으로서 활성 화합물의 용액은 계면활성제, 예컨대 하이드록시프로필셀룰로오스와 적절히 혼합된 물에서 제조될 수 있다.
분산은 또한 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 보통 조건하에서, 이들 제조는 미생물의 생장을 예방하기 위한 방부제를 포함한다.
본 발명에 따른 이뮤노사이토카인은 중성 또는 염 형태로 조성물에 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 예를 들어, 염산 또는 인산 등의 무기산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등의 그러한 유기산으로 형성되는 산 부가염 (단백질의 유리 아미노기로 구성됨)을 포함한다. 유리 카르복실기로 구성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어, 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화철 및 그러한 유기 염기, 예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다.
담체는 또한 용매 또는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적당한 혼합 및 식물성 오일을 포함하는 분산 매체일 수 있다. 본 발명의 이뮤노사이토카인은 또한 생물학적 적용도 (biodisponibility)를 증가시키기 위해 예를 들어 페길화에 의해 변형될 것이다. 본 발명의 이뮤노사이토카인이 핵산 형태를 가질 때, 담체는 또한 바이러스 (예를 들어, MVA, rAAV, 렌티바이러스 등) 등의 벡터일 수 있다.
적당한 유동성은 예를 들어, 레시틴 등의 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우에서 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 억제는 다양한 항균 및 항곰팡이제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에서, 등장제 (isotonic agent), 예를 들어, 당 또는 소듐 클로라이드가 바람직할 것이다.
주사 조성물의 장기 흡수는 흡수 지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴, 폴리올 및 반감기 향상 공유 및 비공유 제형의 조성물로 사용하여 달성될 수 있다.
가수분해 및 변성을 포함하여 펩타이드 불안정성 또는 분해의 수많은 원인이 있다. 소수성 상호작용은 분자들이 함께 엉기는 것 (즉, 응집)을 유발할 것이다. 안정제는 그러한 문제를 줄이거나 예방하기 위해 첨가될 것이다.
안정제는 사이클로덱스트린 및 이의 유도체 (미국 특허 제5,730,969호를 볼 것)를 포함한다. 적당한 방부제, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 트레할로스, 덱스트란 및 글리세린이 또한 최종 제형을 안정시키기 위해 부가될 수 있다. 이온 및 비이온성 계면활성제, D-글루코스, D-갈락토스, D-자일로스, D-갈락튜론산, 트레할로스, 덱스트란, 하이드록시에틸 전분 및 이의 혼합으로부터 선택된 안정제가 상기 제형에 부가될 것이다. 알칼리 금속염 또는 마그네슘 클로라이드의 부가는 펩타이드를 안정시킬 것이다. 펩타이드는 또한 덱스트란, 콘드로이틴 황산, 전분, 글리코겐, 덱스트린 및 알긴산 염으로 구성된 그룹에서 선택된 당류와 접촉하여 안정화될 것이다. 부가될 수 있는 다른 당으로 단당류, 이당류, 당알코올 및 이의 혼합 (예를 들어, 글루코스, 만노스, 갈락토스, 프룩토스, 수크로스, 말토스, 락토스, 만니톨, 자일리톨)을 포함한다. 폴리올은 펩타이드를 안정시킬 것이며, 물과 섞일 수 있거나, 물에 녹을 수 있다. 적당한 폴리올로 만니톨, 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리메틸 글리콜, 비닐 피롤리돈, 글루코스, 프룩토스, 아라비노스, 만노스, 말토스, 수크로스 및 이의 중합체를 포함하는 폴리하이드록시 알코올, 단당류 및 이당류일 것이다. 다양한 부형제 역시 혈청 알부민, 아미노산, 헤파린, 지방산 및 인지질, 계면활성제, 금속, 폴리올, 환원제, 금속 킬레이팅제, 폴리비닐 피롤리돈, 가수분해된 젤라틴 및 암모늄 설페이트를 포함하여, 펩타이드를 안정화할 것이다.
사이토카인 치료법의 전망은 사실은 이들 신규한 사이토카인의 동정에서 기인하였으나, 좀 더 본질적으로, 이 분야는 상보적 면역-자극 능력을 갖는 사이토카인의 몇몇 조합의 이용을 통해 달성되는 시너지 및/또는 새로운 생물학적 효과를 납득이가도록 입증하는 끝없이 펼쳐지는 전임상 데이터의 양에서 크게 이익을 얻고 있다. RLI-기반 이뮤노사이토카인과 병용할 수 있는 잠재적 치료 활성화제는 예를 들어, 화학요법제, 항혈관생성제, 또는 면역조절제를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 치료적 활성화제, 예컨대, 화학요법제, 항혈관생성제, 또는 면역조절제를 추가로 포함할 것이다.
화학요법제의 경우, 그들의 치료적 효과는 면역 반응에 대한 간접 효과에 의해 면역성 세포 사멸의 유도, 면역억제 환경의 균형을 유지, 원발성 거대 종양의 제거 후 면역 공격을 촉진, 또는 일시적인 림프구 감소증 유도 후 항상성의 림프계 증식에 의해 어느 쪽이든 일부 매개될 수 있음이 입증되어 있다. 그들 대부분은 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 이뮤노사이토카인과 병용할 수 있는 화학요법제의 예시로, 플루다라빈, 젬시타빈, 카페시타빈, 메토트렉세이트, 탁솔, 탁소테레, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 하이드록시우레아, 시타라빈, 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드, 니트로소우레아스, 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴 같은 플라티눔 복합체, 마이토마이신, 다카르바진, 프로카비진, 에토포사이드, 테니포사이드, 캄파테신, 블레오마이신, 독소루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 플리카마이신, 마이토탄트론, L-아스파라기나세, 독소루비신, 에핌비슴, 5-플루오로우라실, 도세탁셀 및 파클리탁셀 같은 탁산, 루코보린, 레바미솔, 이리노테칸, 에스트라머스틴, 에토포사이드, 니트로겐 머스타드, BCNU, 카머스팀 및 로머스틴 같은 니트로소우레아, 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈 같은 빈카 알칼로이드, 이마팀 메실레이트, 헥사메틸넬아민, 토포테칸, 키나아제 저해제, 포스파타아제 저해제, ATPase 저해제, 타이르포스틴 (tyrphostin), 프로테아제 저해제, 저해제 허비마이심 A, 제니스테인, 엡스타틴 (erbstatin) 및 라벤더스틴 A를 예로 들 수 있다.
항혈관생성제의 경우, 면역계에 대해 타겟 이탈 (off-target) 효과를 가지며, 그리고 나서, 종양 면역 반응을 촉진할 수 있음이 입증되어 있다. 본 발명의 이뮤노사이토카인과 병용될 수 있는 항혈관생성제의 예시로, 티로신 키나아제에 의한 vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)를 타겟으로 하는 약물, 예를 들어, 소라페닙, 서니티닙 및 파조파닙, 또는 템시롤리무스 및 에베롤리무스 같은 라파마이신의 포유동물 타겟 (mTOR)을 예로 들 수 있다.
본 발명의 이뮤노사이토카인과 병용될 수 있는 면역조절제의 경우, 사이토카인 (IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, IL18, IL-21, GM-CSF, G-CSF, IFNα,...), 케모카인/항혈관생성 사이토카인 (IP 10, Mig, SDF-1, RANTES,...), TLR 아고니스트드 및 면역조절 항체 (항-CTLA4, 항-PDl, 항-TGFb, 아고니스트 항-CD40,...)를 예로 들 수 있다.
치료 방법 및 용도
추가 양상에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하기 위한 앞서 개시된 약학 조성물, 바람직하게는 앞서 개시된 이뮤노사이토카인을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
여기에 사용된, 용어 "대상체"는 포유동물, 예를 들어, 설치류, 고양잇과, 개, 또는 영장류, 및 가장 바람직하게는 인간을 의미한다.
다른 양상에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하기 위한 동시, 개별, 또는 순차적 이용을 위한 복합 제제로서,
(i) 상기 개시된 이뮤노사이토카인, 그것을 코딩하는 핵산 서열, 또는 그러한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 및
(ii) 치료제, 바람직하게는 항암제를 포함하는 산물에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 앞서 개시된 약학 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
마지막 양상에서, 본 발명은
(i) 상기 개시된 이뮤노사이토카인, 그것을 코딩하는 핵산 서열, 또는 그러한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 및
(ii) 치료제, 바람직하게는 항암제를 약학적으로 유효한 함량으로 그것을 필요로 하는 대상체에 동시적, 개별적 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다..
본 발명의 문맥에서, 여기에 사용된, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 그러한 용어가 적용되는 장애 또는 질병, 또는 그러한 장애 또는 질병의 하나 이상의 증상을 예방하거나, 그것의 진행을 역전, 완화, 억제하는 것을 의미한다. 여기에 사용된 표현 "암을 치료하는"는 암세포 생장의 억제를 의미한다. 바람직하게는, 그러한 치료는 또한 종양 생장의 퇴화, 즉, 측정 가능한 종양 크기의 감소로 이어진다. 가장 바람직하게는, 그러한 치료는 종양의 완전한 퇴화로 이어진다.
바람직하게는, 상기 암은 암종, 즉, 폐암이다.
가장 바람직하게는, 표현 "암을 치료하는"는 "TILs를 활성화하여 암을 치료하는"을 의미한다.
따라서, 암은 바람직하게는 혈관성 암에 해당한다.
더 바람직하게는, 상기 암은 면역 결핍 TIL 집단을 갖는 암이고, 상기 암은 신세포암 (Renal Cell Carcinoma, RCC) 등의 진행성 암에 해당한다.
하기에서, 본 발명은 아미노산 서열, 핵산 서열 및 예시들을 참조하여 보다 구체적으로 기재되어 있다. 그러나, 구체적인 예시들에 의해 본 발명이 한정되어서는 안된다. 오히려, 본 발명은 여기에 예시로 명시적으로 언급되지 않은 것을 구체적으로 포함하는 임의의 구체예를 포함하나, 당업자는 과도한 노력 없이 찾을 수 있다.
실시예
1) RLI 기반 모듈로카인
항-PD-1 ( hBAT ) RLI 이뮤노사이토카인의 구축
항-PD-1 경쇄 (CT-01 1 (hBAT 또는 hBAT-1) 중 하나에 해당)를 인코딩하는 발현 플라스미드. 항체의 키메릭 IgG 중쇄 서열은 22개의 아미노산의 링커 (SEQ ID NO: 16)가 있거나 없이 IL15 (SEQ ID NO: 3, 여기서, 93번 위치의 아미노산은 K이다)에 3'-말단에서 융합되도록 설계하였다. 이들 뉴클레오타이드 서열을 합성하고, GENEART의 pcDNA3.1 플라스미드에 클로닝하였다. 항-PD-1 항체의 경쇄 및 중쇄의 전체 서열은 국제 특허 출원 WO 2009/101611에 개시되어 있다.
플라스미드 DNA 제조 및 트랜스펙션 시약
40kDa 선형 PEI는 POLYSCIENCE에서 얻었다. 1 mg/mL의 스톡 용액은 PEI를 물에 녹여 가열하고, NaOH로 중화시키며, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과 후 살균하여 제조하였다. 스톡 용액은 앨리쿼트로 나누고 -20 ℃에서 저장하였다.
트랜스펙션을 위한 플라스미드 DNA는 플라스미드 정제 키트를 사용하여 제조업체의 설명서 (MACHEREY-NAGEL)에 따라 정제하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과 후 살균하였다.
이뮤노사이토카인의 생산 및 정제
1-현탁액에서 일시적인 트랜스펙션:
일상적으로 유지되는 CHO-S (INVITROGEN) 세포를 PowerCH02 배지 (LONZA)에서 1×106 cells/mL의 밀도로 씨딩하고, 5 % C02의 진탕 배양기 (100 rpm)에서 37℃에서 오버나이트 동안 배양하였다. 그리고 나서, 트랜스펙션을 위해, 세포를 CD-CHO 배지 (INVITROGEN)에서 2×106 cells/mL로 희석하였다. 트랜스펙션 복합체는 150 mM의 NaCl을 이용하여 10%의 배양 부피로 제조하였다. 발현 산물 DNA (중쇄 코딩 플라스미드 대 경쇄 코딩 플라스미드의 비율을 1:2로 하여 2.5 mg/L의 배양 부피)를 NaCl에서 희석된 PEI (10 mg/L의 최종 배양 부피)와 혼합하고, 배양에 부가하기 전에 실온에서 10분 동안 인큐베이션 하였다. PowerCH02 배지로 배양 부피를 두 배로 하기 전에 세포를 37 ℃에서 진탕 배양기 (130 rpm)에서 5시간 동안 배양하였다. 포스트-트랜스펙션 5일에 상등액을 수집하였다.
2-부착세포에서 안정한 트랜스펙션
CHO-K1 세포 (ATCC n°CCL-61)를 1-글루타민, 10% FCS 및 페니실린 (100 units/mL)/스트렙토마이신 (100 ㎍/mL)이 첨가된 DMEM에서 자라게 하였고, 리포펙타민 2000 시약 (INVITROGEN)을 사용하여 제조업체에서 권하는 대로 각 벡터로 트랜스펙션 시켰다. 항-GD20-아세틸화된 ICK 및 항-CD20 ICK에 대해 각각 제네티신 및 하이그로마이신 (0.5 mg/mL) 또는 블라스티신 및 하이그로마이신 (5 ㎍/mL 및 100 ㎍/mL)을 포함하는 배지로 제한 희석하여 클론을 선별하였다. 각 클론의 배양 상등액은 ELISA에 의해 이기능 단백질 생산에 대해 분석하였다. ICK의 생산을 위해, 선별된 클론을 25 % DMEM 배지 및 75% AIM 배지 (INVITROGEN)에서 증폭시켰다. 그리고 나서, 세포를 100 %의 AIM에서 유지하고, 상등액을 수집하며, 2일 마다 10일 동안 교체하였다.
3-상등액 정제:
수집된 상등액을 4 ℃에서 300 rpm으로 20분 동안 원심분리하고, pH7.8의 NaOH에서 평형시키며, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 컨디션드 배지는 단백질 A 컬럼 (GE)을 이용한 어피니티 크로마토그래피에 의해 제조업체의 설명서에 따라 정제하였다. 정제된 단백질은 50 kDa AMICON units (MILLIPORE)으로 농축하였다. 이 단계 동안, 용출 버퍼는 PBS로 교체하였다. 정제된 단백질은 마지막으로 ELISA에서 분석하였고, 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. 순도는 전기영동에 의해 평가하였다.
4-ELISA에 의한 이뮤노글로불린 모이어티의 검출
맥시솝 플랫 바텀 마이크로타이터 플레이트 (Maxisorp flat bottom microtiter plate (NUNC))를 PBS에서 1.5 ㎍/mL로 희석된 100 ㎕의 염소 항-인간 항체 (UP892370, INTERCHIM)로 4℃에서 시간 동안 코팅하였다. 그리고 나서, 200 ㎕의 블록킹 버퍼 (PBS 내 1% BSA + 0.1% TWEEN 20)로 37 ℃에서 1시간 동안 플레이트를 블록킹하였다. 그리고 나서, 세척 버퍼 (PBS 내 0.1% TWEEN 20)로 플레이트를 3회 세척하고, 블록킹 버퍼에서 희석된 샘플을 부가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션 하였다 (100 ㎕). 3회 세척 후, 1:10000으로 희석된 페록시다아제가 결합된 염소 항-인간 IgGl (109-036-003, JACKSON)를 부가하고, 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. TMB 기질 (INTERCHIM)을 사용하여 단백질 수준을 측정하고, 플레이트는 450 nm에서 해석하였다. 플레이트에서 표준 곡선을 그리는데 정제된 리툭시맙 (ROCHE)을 사용하였다.
5-ELISA에 의한 사이토카인 모이어티의 검출
맥시솝 플랫 바텀 마이크로타이터 플레이트 (NUNC)를 카보네이트 버퍼에서 2 ㎍/mL로 희석된 100 ㎕의 항-IL 15 B-E29 (DIACLONE)로 4 ℃에서 16시간 동안 코팅하였다. 그리고 나서, 200 ㎕의 블록킹 버퍼 (PBS 내 1% BSA)로 37 ℃에서 1시간 동안 플레이트를 블록킹하였다. 그리고 나서, 세척 버퍼 (PBS 내 0.05% Tween 20)로 플레이트를 3회 세척하였다. TBS+0.05% BSA에서 희석된 샘플을 부가하고, 37 ℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션 하였다 (100 ㎕). 3회 세척 후, 200 ng/mL로 희석된 바이오틴이 결합된 항-IL 15 항체 BAM 247 (R&D SYSTEM)를 부가하고, 37 ℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션 하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 페록시다아제가 결합된 스트렙타비딘을 1:1000 희석하여 부가하였다. TMB 기질 (INTERCHIM)을 사용하여 단백질 수준을 측정하고, 플레이트는 450 nm에서 해석하였다. 플레이트에서 표준 곡선을 그리는데 IL-15 (PEPROTECH)을 사용하였다.
TILs의 표현형
TILs는 2명의 신장암 환자에서 유래된 생검 또는 신장절제 조직에서 DNAse 및 콜라게나아제 소화 후 얻었다. 이들 TILs는 종양 진행을 일반적으로 무력화할 수 있다.
PD-1, Tim-3 및 IL-15Rα과 비교하여 이들 TILs의 표현형은 면역형광에 의해 측정되었다.
도 1은 환자 A (도 1A) 및 환자 B (도 1B)에 대해 획득된 표현형을 보여준다.
이뮤노사이토카인의 결합 활성
항-PD-1 RLI 모듈로카인의 특이 결합은 플로우 사이토메트리에 의해 평가되었다. 효과기 세포에서 IL-15 수용체와 결합하는 모듈로카인의 능력은 Kit225에서 시험되었다. 타겟 세포에 코팅된 모듈로카인은 PE-결합된 염소 항-인간 IgG mAb (PN IM0550, BECKMAN COULTER), 또는 PE-streptavidin (SIGMA- ALDRICH)에 결합된 바이오틴이 결합된 마우스 항-IL15 항체 (BAM247, R&D SYSTEM)에 의해 보였다. 타겟 세포 (1×105)를 각 ICK와 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고 나서, PE-컨쥬게이트와 4 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 세척된 세포는 마지막으로 FACSCALIBUR (BECTON DICKINSON)에서 분석하였다.
이 결과는 모듈로카인이 IL-15 수용체 및 또한 PD-1에 결합함을 보여준다.
이뮤노사이토카인의 증식 활성
획득된 모듈로카인의 IL-15 매개된 증식 활성을 시험하고, RLI와 비교하였다. Kit225 및 ICK에 대한 32Dβ 세포의 증식 반응은 [3H] 티미딘 결합에 의해 측정되었다. 세포는 배양 배지에서 3일 동안 유지되고, 2회 세척하고, Kit 225 및 32Dβ에 대해 각각 24시간 또는 4시간 동안 배지에서 사이토카인 없이 굶주리게 하였다. 그리고 나서, 멀티웰 플레이트에서 100 ㎕ 내에 1×104 cells/well로 세포를 씨딩하고, 샘플의 농도를 높이면서 첨가한 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 인간 rIL-15 및 RLI는 구경 측정기로서 이용하였다. 세포에 0.5 μCi/well의 [3H] 티미딘을 16시간 동안 펄스하고, 글라스 파이버 필터로 수집하고, 세포-결합된 방사능을 측정하였다. 결과는 모듈로카인의 증식 활성이 RLI의 것에 필적할만한 것으로 확인되었다.
RLI 모듈로카인에 의한 강한 TILs 재활성화
TILs는 25명의 신장암 환자에서 유래된 생검 또는 신장절제 조직에서 DNAse 및 콜라게나아제 소화 후 얻었다. 이들 TILs는 종양 진행을 일반적으로 무력화할 수 있다.
25명의 환자로부터 TILs 재활성화는 각 환자에서 같은 몰 농도의 RLI, HBAT (CT011 = 항-PD 1 항체), HBAT-RLI (모듈로카인), 또는 HBAT 및 RLI의 혼합의 존재 또는 부재 하에서 상기 TILs를 인큐베이션하여 시험하였다. RLI는 환자 1 내지 8번에 대해서는 1 ㎍/mL로 사용하였고, 그리고 나서, 환자 9 내지 25번에 대해서는 300 ng/mL로 사용하였다.
자극 후 48시간에 상등액을 수집하고, ELISA에서 상등액 내 IFNγ의 농도를 측정하여 재활성화를 측정하였다.
항상 20 pg/mL 미만의 IFNγ를 분비하는 자극을 받지 않은 TILs를 제외하고 신장암 환자 유래의 25개의 TIL로부터 얻은 로우 데이터는 표 1에 나타내었다.
조합
Figure 112016019570542-pct00001
도 2는 RLI, HBAT, HBAT-RLI 및 HBAT+RLI에 의해 활성화된 TIL로부터 생산된 IFNγ의 평균 및 중앙값을 보여준다 (* p < 0.05).
항-PD-1 항체 단독 처리에서는 거의 TILs 활성화가 얻어지지 않았다. 어떤 TIL 활성화는 RLI 단독 또는 항-PD1 항체와의 혼합에서 얻었다. 지금, 놀랍게도, RLI 및 또한 RLI+HBAT와 비교하여 강하고 일반적인 활성화는 본 발명의 이뮤노사이토카인에 의해 얻었다 (표 1 및 도 2).
이들 결과는 새로운 치료법을 예상할 수 있도록 한다.
암종 CT26 실험 종양 모델에서 모듈로카인의 효능 평가
CT26은 n-니트로소-n-메틸우레탄 (nnmu)-유도된 미분화 마우스 대장암 세포주이다.
BALB/C 마우스의 오른쪽 옆구리에 CT26 종양 세포 (2×105/mouse)가 피하주사될 것이다.
9일에, 종양이 20-30 mm2에 도달할 때, 같은 몰 농도의 항-PD1 단독, RLI 단독 (1004-14p), 항-PD1 및 RLI의 혼합 또는 대조군으로 PBS와 비교하여, 다른 그룹의 마우스에 16 또는 32 ㎍/mouse의 모듈로카인 항-PD1-RLI를 단독 처리하였다.
모듈로카인 또는 RLI 단독을 9일에 1주에 2회씩 4주 동안 주사하였다. 항-PD1 항체 단독은 9일에 주사하고 나서, 4주 동안 1주에 1회씩 주사하였다. 혼합 그룹에서, 항-PD1 항체는 9일에 주사하고 나서 4주 동안 1주에 1회씩 주사하고, RLI는 15일에 주사하고 나서 3주 동안 1주에 2회씩 주사하였다. 종양은 칼리퍼를 사용하여 주당 3회 측정하였고, 종양 면적은 다음과 같이 계산하였다: 길이×너비. 마우스는 종양 크기가 300 mm2에 도달하거나 궤양화 되었을 때 희생시켰다. 원발성 종양 생장, 생존 및 최종적으로 퇴화가 평가될 것이다. 대조군은 항체 이소타입 또는 관련이 없는 RLI-항체 컨쥬게이트 (항-HER2- RLI)의 해당 투여량을 받았다.
BALB/C 마우스의 오른쪽 옆구리에 CT26 종양 세포 (2×105/mouse)를 피하주사하였다. 9일에, 종양이 20-30 mm2에 도달하였을 때, 같은 몰 농도의 항-PD-Ll (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL) 단독, RLI 단독 (1004-14p), 항-PD-Ll (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL) 및 RLI의 혼합 또는 대조군으로 PBS와 비교하여, 마우스에 16 또는 32 ㎍/mouse의 모듈로카인 항-PD-L1-RLI를 단독 복강투여하였다.
모듈로카인 또는 RLI 단독은 9일에 1주에 2회씩 4주 동안 주사하였다. 항-PD1 항체 단독은 9일에 주사하고 나서 1주에 1회씩 4주 동안 주사하였다. 혼합 그룹에서, 항-PD1 항체는 9일에 주사하고 나서 1주에 1회씩 4주 동안 주사하고, RLI는 15일에 주사하고 나서 1주에 2회씩 3주 동안 주사하였다. 종양은 칼리퍼로 주당 3회 측정하였고, 종양 면적은 다음과 같이 계산하였다: 길이×너비. 마우스는 종양 크기가 300 mm2에 도달하거나 궤양화되었을 때 희생시켰다. 원발성 종양 생장, 생존 및 최종적으로 퇴화가 평가될 것이다. 대조군은 항체 아이소타입 또는 관련이 없는 RLI-항체 컨쥬게이트 (항-HER2-RLI)의 해당 투여량을 받았다.
폐 tc -1 실험 종양 모델에서 모듈로카인의 효능 평가
종양세포주, TC-1은 C57B1/6 마우스의 원발성 폐 상피세포에서 유래되었다. 세포는 암포트로픽 레트로바이러스 벡터 Ixsnl 6e6e7에 의해 불멸화되고, 이어서 활성화된 인간 c-ha-ras 종양 유전자를 발현하는 pvejb 플라스미드를 사용하여 형질전환되었다. 세포는 HPV-16 E7의 발현에 양성이다.
C57B1/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 TC-1 종양 세포 (1×105/mouse)를 피하주사하였다. 9일에, 종양이 20-50 mm2에 도달할 때, 같은 몰 농도의 항-PD1 단독, RLI 단독 (1004-14p), 항-PDI 및 RLI의 혼합 또는 대조군으로 PBS와 비교하여, 다른 그룹의 마우스에 16 또는 32 ㎍/mouse의 모듈로카인 항-PD1-RLI을 단독 투여하였다. 모듈로카인 또는 RLI 단독은 9일에 1주에 2회씩 4주 동안 주사하였다. 항-PD1 항체 단독은 9일에 주사하고 나서, 1주에 1회씩 4주 동안 주사하였다. 혼합 그룹에서, 항-PD1 항체는 9일에 주사하고 나서 1주에 1회씩 4주 동안 주사하고, RLI는 15일에 주사하고 나서 1주에 2회씩 3주 동안 주사하였다. 종양은 칼리퍼를 사용하여 주당 3회 측정하고, 종양 면적은 다음과 같이 계산하였다: 길이×너비. 마우스는 종양 크기가 300 mm2에 도달하거나 궤양화되었을 때 희생시켰다. 원발성 종양 생장, 생존 및 최종적으로 퇴화를 평가한다.
전이성 흑색종 B16F10 실험 종양 모델에서 모듈로카인의 효능 평가
B16F10 종양은 0일에 C57BL/6 마우스의 옆구리에 3×104 B16F10 세포의 i.d. 주사에 의해 이식된다. 종양 세포가 이식되도록 한 후 4일에 치료법을 개시하였다. 같은 몰 농도의 항-PD-L1 단독 (클론 10 F.9G2, BIO- XCELL), RLI 단독 (1004-14p), 항-PD-L1 (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL) 및 RLI의 혼합 또는 대조군으로 PBS와 비교하여, 항-PD-L1-RLI 모듈로카인을 16 또는 32 ㎍/mouse로 i.p. 주사하였다.
모듈로카인, 항-PD-L1 mAb, RLI 또는 항-PD-L1 mAb+RLI의 혼합은 4일에 1주에 2회씩 4주 동안 주사되었다. 종양을 칼리퍼를 사용하여 주당 3회 측정하고, 종양 면역은 다음과 같이 계산하였다: 길이×너비. 마우스는 300 mm2에 도달하거나 궤양화되었을 때 희생시켰다. 원발성 종양 생장, 생존 및 최종적으로 퇴화가 평가될 것이다. 대조군은 해당 투여량의 항체 아이소타입 또는 관련이 없는 RLI-항체 컨쥬게이트 (항-HER2-RLI)를 받았다.
진행성 방광암 MB49 실험 종양 모델에서 모듈로카인의 효능 평가
MB49 종양세포주는 C57BL/6 수컷 마우스에서 유래된 방광 상피 오리진의 발암물질에 의해 유도된 종양으로부터 기원한다. 1×106의 MB49 방광암 세포를 C57BL/6 마우스의 등에서 상부 진피에 s.c. 주사하였다. 종양이 명백하게 보이고, ~ 15 mm2의 크기로 감지될 때 상응하는 종양 접종 후 6일에 치료를 개시한다. 같은 몰 농도의 항-PD1 단독, 항-PD-L1 단독 (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL), RLI 단독 (1004-14p), 항-PD1 또는 항-PD-L1 (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL)과 RLI의 혼합 또는 대조군으로 PBS와 비교하여, 항-PD-l-RLI 및 항-PD-Ll 모듈로카인은 16 또는 32 ㎍/mouse로 i.p. 주사되었다.
모듈로카인, 항-PD-1 mAb, 항-PD-L1 mAb (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL), RLI 및 항-PD-1 mAb 또는 항-PD-L1 (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL) + RLI의 혼합을 6일에 1주에 2회씩 4주 동안 주사하였다. 종양은 칼리퍼를 사용하여 주당 3회 측정하였고, 종양 면적은 다음과 같이 계산하였다: 길이×너비. 마우스는 300 mm2에 도달하거나 궤양화되었을 때 희생시켰다. 원발성 종양 생장, 생존 및 최종적으로 퇴화가 평가될 것이다. 대조군은 해당 투여량의 항체 아이소타입 또는 관련이 없는 RLI-항체 컨쥬게이트 (항-HER2-RLI)를 받았다.
유방암 4T1 실험 종양 모델에서 모듈로카인의 효능 평가
0일에 5×104의 4T1 유방암 세포를 BALB/c 마우스의 유선에 접종하였다. 종양이 명백하게 보이고, ~ 15-20 mm2의 크기로 감지될 때 상응하는 종양 접종 후 10일에 치료를 개시한다. 같은 몰 농도의 항-PD1 단독, 항-PD-L1 단독 (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL), RLI 단독 (1004-14p), 항-PD1 또는 항-PD-L1 (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL)과 RLI의 혼합 또는 대조군으로 PBS와 비교하여, 항-PD-l-RLI 및 항-PD-Ll 모듈로카인은 16 또는 32 ㎍/mouse로 i.p. 주사되었다. 종양은 칼리퍼를 사용하여 주당 3회 측정하였고, 종양 면적은 다음과 같이 계산하였다: 길이×너비. 마우스는 300 mm2에 도달하거나 궤양화되었을 때 희생시켰다. 원발성 종양 생장, 생존 및 최종적으로 퇴화가 평가될 것이다. 대조군은 해당 투여량의 항체 아이소타입 또는 관련이 없는 RLI-항체 컨쥬게이트 (항-HER2-RLI)를 받았다.
모듈로카인, 항-PD-1 mAb, 항-PD-L1 mAb (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL), RLI 및 항-PD-1 mAb 또는 항-PD-L1 (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL) + RLI의 혼합을 10일에 1주에 2회씩 4주 동안 주사하였다. 대조군은 해당 투여량의 항체 아이소타입 또는 관련이 없는 RLI-항체 컨쥬게이트 (항-HER2-RLI)를 받았다. 종양은 칼리퍼를 사용하여 주당 3회 측정하였고, 종양 면적은 다음과 같이 계산하였다: 길이×너비. 마우스는 27일에 희생시켰다. 폐 전이성 소절은 쌍안 현미경 하에서 계수하였다.
난소암 ID8 실험 종양 모델에서 모듈로카인의 효능 평가
ID8-VEGF 난소 암종 세포주는 마우스 난소 상피 혈청 유두상 선암 세포주로부터 이미 개발되었다. C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 어느 하나의 5×106의 ID8 종양 세포를 피하 이식하였다. 종양이 명백하게 보이고, ~ 15-20 mm2의 크기로 감지될 때 상응하는 종양 접종 후 10일에 치료를 개시한다. 같은 몰 농도의 항-PD1 단독, 항-PD-L1 단독 (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL), RLI 단독 (1004-14p), 항-PD1 또는 항-PD-L1 (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL)과 RLI의 혼합 또는 대조군으로 PBS와 비교하여, 항-PD-l-RLI 및 항-PD-Ll 모듈로카인은 16 또는 32 ㎍/mouse로 i.p. 주사되었다.
모듈로카인, 항-PD-1 mAb, 항-PD-L1 mAb (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL), RLI 및 항-PD-1 mAb 또는 항-PD-L1 (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL) + RLI의 혼합을 10일에 1주에 2회씩 4주 동안 주사하였다. 대조군은 해당 투여량의 항체 아이소타입 또는 관련이 없는 RLI-항체 컨쥬게이트 (항-HER2-RLI)를 받았다. 종양은 칼리퍼를 사용하여 주당 3회 측정하였고, 종양 면적은 다음과 같이 계산하였다: 길이×너비. 마우스는 300 mm2에 도달하거나 궤양화되었을 때 희생시켰다.
전립선암 RM -1 실험 종양 모델에서 모듈로카인의 효능 평가
C57BL/6 암컷 마우스에 2×105의 RM-1 쥐 전립선암 세포를 s.c. 접종하였다. 종양이 명백하게 보이고, ~ 15-20 mm2의 크기로 감지될 때 상응하는 종양 접종 후 10일에 치료를 개시한다. 같은 몰 농도의 항-PD1 단독, 항-PD-L1 단독 (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL), RLI 단독 (1004-14p), 항-PD1 또는 항-PD-L1 (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL)과 RLI의 혼합 또는 대조군으로 PBS와 비교하여, 항-PD-l-RLI 및 항-PD-Ll 모듈로카인은 16 또는 32 ㎍/mouse로 i.p. 주사되었다.
모듈로카인, 항-PD-1 mAb, 항-PD-L1 mAb (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL), RLI 및 항-PD-1 mAb 또는 항-PD-L1 (클론 10 F.9G2, BIO-XCELL) + RLI의 혼합을 3일에 1주에 2회씩 4주 동안 주사하였다. 대조군은 해당 투여량의 항체 아이소타입 또는 관련이 없는 RLI-항체 컨쥬게이트 (항-HER2-RLI)를 받았다. 종양은 칼리퍼를 사용하여 주당 3회 측정하였고, 종양 면적은 다음과 같이 계산하였다: 길이×너비. 마우스는 300 mm2에 도달하거나 궤양화되었을 때 희생시켰다.
<110> CYTUNE PHARMA UNIVERSITE PARIS DESCARTES ASSITANCE PUBLIQUE-HO-PITAUX DE PARIS <120> IL-15 and IL-15R aplha sushi domain based modulokines <130> I16O10C0006P/DE <150> EP 13003963.9 <151> 2013-08-08 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mammalian interleukin 15 consensus sequence <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> X=N,S,T or I <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X= V, H, I, Q or E <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X= N, Y, F or D <220> <221> UNSURE <222> (6) <223> X= I or R <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X= S, N, L, Y, K or R <220> <221> UNSURE <222> (10) <223> X= K, E, R or Q <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> X= K, T or R <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> X= E, D or Q <220> <221> UNSURE <222> (14) <223> X= D, H, S or N <220> <221> UNSURE <222> (16) <223> X= I or T <220> <221> UNSURE <222> (17) <223> X=Q, R or K <220> <221> UNSURE <222> (18) <223> X= S or F <220> <221> UNSURE <222> (19) <223> X= M, I or L <220> <221> UNSURE <222> (21) <223> X= I, V or M <220> <221> UNSURE <222> (23) <223> X=A or T <220> <221> UNSURE <222> (28) <223> X=E or D <220> <221> UNSURE <222> (30) <223> X= D or G <220> <221> UNSURE <222> (31) <223> X= V, F, A or I <220> <221> UNSURE <222> (34) <223> X= S, N or R <220> <221> UNSURE <222> (37) <223> X= V or I <220> <221> UNSURE <222> (39) <223> X= A or T <220> <221> UNSURE <222> (41) <223> X= K, Q or N <220> <221> UNSURE <222> (48) <223> X= Q, G, R, H or E <220> <221> UNSURE <222> (51) <223> X= S or L <220> <221> UNSURE <222> (52) <223> X= L, Q or H <220> <221> UNSURE <222> (54) <223> X= S, F or Y <220> <221> UNSURE <222> (55) <223> X= G, K, S, N or R <220> <221> UNSURE <222> (56) <223> X= D, H, S or N <220> <221> UNSURE <222> (57) <223> X= A, H, M, E, G, S or T <220> <221> UNSURE <222> (58) <223> X= S, V, P, T, N or D <220> <221> UNSURE <222> (59) <223> X= I or L <220> <221> UNSURE <222> (60) <223> X= H, S, K, N, Y or E <220> <221> UNSURE <222> (61) <223> X= D or E <220> <221> UNSURE <222> (62) <223> X= T, I or A <220> <221> UNSURE <222> (63) <223> X= V or I <220> <221> UNSURE <222> (64) <223> X= E, T, Q, R or K <220> <221> UNSURE <222> (66) <223> X= L or V <220> <221> UNSURE <222> (67) <223> X= I, T or L <220> <221> UNSURE <222> (68) <223> X=I, M, F, Y or L <220> <221> UNSURE <222> (72) <223> X= N, T, R, D or S <220> <221> UNSURE <222> (73) <223> X= S, N, R, T or I <220> <221> UNSURE <222> (75) <223> X= S or N <220> <221> UNSURE <222> (76) <223> X= S or A <220> <221> UNSURE <222> (77) <223> X= N, I or K <220> <221> UNSURE <222> (78) <223> X= G, E or K <220> <221> UNSURE <222> (79) <223> X= N, Y, D or T <220> <221> UNSURE <222> (80) <223> X= V, K or I <220> <221> UNSURE <222> (81) <223> X= T, A or I <220> <221> UNSURE <222> (83) <223> X= S, L or T <220> <221> UNSURE <222> (87) <223> X= E or V <220> <221> UNSURE <222> (93) <223> X= E or K <220> <221> UNSURE <222> (94) <223> X= K or R <220> <221> UNSURE <222> (95) <223> X= N, T or S <220> <221> UNSURE <222> (96) <223> X= I or F <220> <221> UNSURE <222> (97) <223> X= K, N, A, or T <220> <221> UNSURE <222> (101) <223> X= Q, K or E <220> <221> UNSURE <222> (104) <223> X= V, I or K <220> <221> UNSURE <222> (105) <223> X= H or R <220> <221> UNSURE <222> (112) <223> X= N or Y <220> <221> UNSURE <222> (113) <223> X= T, S, P, L or A <220> <221> UNSURE <222> (114) <223> X= S or P <400> 1 Xaa Trp Xaa Xaa Val Xaa Xaa Asp Leu Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Leu Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa His Xaa Asp Xaa Thr Leu Tyr Thr Xaa Ser Xaa Xaa His 20 25 30 Pro Xaa Cys Lys Xaa Thr Xaa Met Xaa Cys Phe Leu Leu Glu Leu Xaa 35 40 45 Val Ile Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Asn Xaa Xaa Xaa Leu Ala Asn Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Glu Xaa Gly Cys Lys Xaa Cys Glu Glu Leu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Glu Phe Leu Xaa Ser Phe Xaa Xaa Ile Val Gln Met Phe Ile Xaa 100 105 110 Xaa Xaa <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primate uinterleukin 15 consensus sequence <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> X = N or I <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> X = N or D <220> <221> UNSURE <222> (10) <223> X = K or R <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> X = K or R <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> X = E or Q <220> <221> UNSURE <222> (16) <223> X = I or T <220> <221> UNSURE <222> (19) <223> X = M or I <220> <221> UNSURE <222> (30) <223> X = D or G <220> <221> UNSURE <222> (31) <223> X = V or I <220> <221> UNSURE <222> (34) <223> X = S or R <220> <221> UNSURE <222> (52) <223> X = L or H <220> <221> UNSURE <222> (55) <223> X = G or N <220> <221> UNSURE <222> (56) <223> X = D or N <220> <221> UNSURE <222> (57) <223> X = A or T <220> <221> UNSURE <222> (58) <223> X = S, N or D <220> <221> UNSURE <222> (60) <223> X = H or N <220> <221> UNSURE <222> (63) <223> X = V or I <220> <221> UNSURE <222> (67) <223> X = I or L <220> <221> UNSURE <222> (72) <223> X = N or R <220> <221> UNSURE <222> (73) <223> X =S or I <220> <221> UNSURE <222> (76) <223> X =S or A <220> <221> UNSURE <222> (79) <223> X =N or T <220> <221> UNSURE <222> (80) <223> X =V or I <220> <221> UNSURE <222> (93) <223> X =E or K <220> <221> UNSURE <222> (112) <223> X = N or Y <220> <221> UNSURE <222> (113) <223> X = T or A <400> 2 Xaa Trp Val Xaa Val Ile Ser Asp Leu Xaa Xaa Ile Xaa Asp Leu Xaa 1 5 10 15 Gln Ser Xaa His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Xaa Xaa His 20 25 30 Pro Xaa Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Xaa Glu Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Asp Thr Xaa Glu 50 55 60 Asn Leu Xaa Ile Leu Ala Asn Xaa Xaa Leu Ser Xaa Asn Gly Xaa Xaa 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Xaa Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Xaa 100 105 110 Xaa Ser <210> 3 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Xaa Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 4 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mammalian sushi domain consensus sequence <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X= P or A <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> X= M or V <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X= V or I <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> X= W, R or Q <220> <221> UNSURE <222> (16) <223> X= S or N <220> <221> UNSURE <222> (19) <223> X= L or V <220> <221> UNSURE <222> (20) <223> X= Y, H or N <220> <221> UNSURE <222> (26) <223> X= I or V <220> <221> UNSURE <222> (39) <223> X= S or T <220> <221> UNSURE <222> (41) <223> X=T or I <220> <221> UNSURE <222> (45) <223> X=T or I <220> <221> UNSURE <222> (45) <223> X= L or I <220> <221> UNSURE <222> (48) <223> X= A or N <220> <221> UNSURE <222> (51) <223> X= V or A <220> <221> UNSURE <222> (53) <223> X= H or Y <400> 4 Cys Pro Xaa Pro Xaa Ser Xaa Glu His Ala Asp Ile Xaa Val Lys Xaa 1 5 10 15 Tyr Ser Xaa Xaa Ser Arg Glu Arg Tyr Xaa Cys Asn Ser Gly Phe Lys 20 25 30 Arg Lys Ala Gly Thr Ser Xaa Leu Xaa Glu Cys Val Xaa Asn Lys Xaa 35 40 45 Thr Asn Xaa Ala Xaa Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 50 55 60 <210> 5 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enlarged mammalian sushi domain consensus sequence <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> X= T, V or I <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> X= P or A <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X= M or V <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> X= V or I <220> <221> UNSURE <222> (15) <223> X= W, R or Q <220> <221> UNSURE <222> (18) <223> X= S or N <220> <221> UNSURE <222> (21) <223> X=L or V <220> <221> UNSURE <222> (22) <223> X=Y, H or N <220> <221> UNSURE <222> (28) <223> X= I or V <220> <221> UNSURE <222> (41) <223> X= S or T <220> <221> UNSURE <222> (43) <223> X= T or I <220> <221> UNSURE <222> (47) <223> X= L or I <220> <221> UNSURE <222> (50) <223> X= A or N <220> <221> UNSURE <222> (53) <223> X= V or A <220> <221> UNSURE <222> (55) <223> X= H or Y <400> 5 Xaa Thr Cys Pro Xaa Pro Xaa Ser Xaa Glu His Ala Asp Ile Xaa Val 1 5 10 15 Lys Xaa Tyr Ser Xaa Xaa Ser Arg Glu Arg Tyr Xaa Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Xaa Leu Xaa Glu Cys Val Xaa Asn 35 40 45 Lys Xaa Thr Asn Xaa Ala Xaa Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 <210> 6 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primate sushi domain consensus sequence <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X= P or A <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> X= M or V <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> X= W, R or Q <220> <221> UNSURE <222> (20) <223> X= Y or H <220> <221> UNSURE <222> (26) <223> X= I or V <220> <221> UNSURE <222> (51) <223> X= V or A <220> <221> UNSURE <222> (53) <223> X= V or A <400> 6 Cys Pro Xaa Pro Xaa Ser Val Glu His Ala Asp Ile Xaa Val Lys Ser 1 5 10 15 Tyr Ser Leu Xaa Ser Arg Glu Arg Tyr Xaa Cys Asn Ser Gly Phe Lys 20 25 30 Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala 35 40 45 Thr Asn Xaa Ala Xaa Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 50 55 60 <210> 7 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enlarged primate sushi domain consensus sequence <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> X= V or I <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> X= P or A <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X= M or V <220> <221> UNSURE <222> (15) <223> X= W, R or Q <220> <221> UNSURE <222> (22) <223> X= Y or H <220> <221> UNSURE <222> (28) <223> X= I or V <220> <221> UNSURE <222> (53) <223> X=V or A <220> <221> UNSURE <222> (55) <223> X=H or Y <400> 7 Xaa Thr Cys Pro Xaa Pro Xaa Ser Val Glu His Ala Asp Ile Xaa Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Xaa Ser Arg Glu Arg Tyr Xaa Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Xaa Ala Xaa Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 50 55 60 <210> 8 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser 1 5 10 15 Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys 20 25 30 Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala 35 40 45 Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 50 55 60 <210> 9 <211> 64 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 <210> 10 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mammalian sushi and domains consensus sequence <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> X= T, V or I <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> X= P or A <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X= M or V <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> X= V or I <220> <221> UNSURE <222> (15) <223> X= W, R or Q <220> <221> UNSURE <222> (18) <223> X= S or N <220> <221> UNSURE <222> (21) <223> X= L or V <220> <221> UNSURE <222> (22) <223> X= Y, H or N <220> <221> UNSURE <222> (28) <223> X= I or V <220> <221> UNSURE <222> (41) <223> X= S or T <220> <221> UNSURE <222> (43) <223> X= T or I <220> <221> UNSURE <222> (47) <223> X= L or I <220> <221> UNSURE <222> (50) <223> X=A or N <220> <221> UNSURE <222> (53) <223> X= V or A <220> <221> UNSURE <222> (55) <223> X= H or Y <220> <221> UNSURE <222> (68) <223> X=A, S or L <220> <221> UNSURE <222> (70) <223> X= V, A, S or T <220> <221> UNSURE <222> (71) <223> X= H or R <220> <221> UNSURE <222> (72) <223> X= Q or H <220> <221> UNSURE <222> (73) <223> X= R, S or K <220> <221> UNSURE <222> (75) <223> X= A, V or P <220> <221> UNSURE <222> (76) <223> X= P or S <220> <221> UNSURE <222> (77) <223> X= P or T <400> 10 Xaa Thr Cys Pro Xaa Pro Xaa Ser Xaa Glu His Ala Asp Ile Xaa Val 1 5 10 15 Lys Xaa Tyr Ser Xaa Xaa Ser Arg Glu Arg Tyr Xaa Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Xaa Leu Xaa Glu Cys Val Xaa Asn 35 40 45 Lys Xaa Thr Asn Xaa Ala Xaa Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa 65 70 75 <210> 11 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primate sushi and domains consensus sequence <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> X= V or I <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> X= P or A <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> X= M or V <220> <221> UNSURE <222> (15) <223> X= W, R or Q <220> <221> UNSURE <222> (22) <223> X= Y or H <220> <221> UNSURE <222> (28) <223> X= I or V <220> <221> UNSURE <222> (53) <223> X= V or A <220> <221> UNSURE <222> (55) <223> X= H or Y <220> <221> UNSURE <222> (68) <223> X= A, S or L <220> <221> UNSURE <222> (70) <223> X= V, A or T <220> <221> UNSURE <222> (71) <223> X= H or R <220> <221> UNSURE <222> (75) <223> X= A or V <400> 11 Xaa Thr Cys Pro Xaa Pro Xaa Ser Val Glu His Ala Asp Ile Xaa Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Xaa Ser Arg Glu Arg Tyr Xaa Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Xaa Ala Xaa Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Xaa Leu Xaa Xaa Gln Arg Pro Xaa Pro Pro 65 70 75 <210> 12 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro 65 70 75 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptidic linker <400> 13 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gln 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptidic linker <400> 14 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly 20 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptidic linker <400> 15 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Gln 20 <210> 16 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptidic linker <400> 16 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly 20 <210> 17 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptidic linker <400> 17 Ala Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Ala Ala 20 <210> 18 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RLI1 <400> 18 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Gly Gly 65 70 75 80 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 85 90 95 Gln Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 100 105 110 Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 115 120 125 His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 130 135 140 Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 145 150 155 160 Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 165 170 175 Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 180 185 190 Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 195 200 205 Asn Thr Ser 210 <210> 19 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RLI2 <400> 19 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Gly Gly 65 70 75 80 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 100 105 110 Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 115 120 125 His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 130 135 140 Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 145 150 155 160 Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 165 170 175 Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 180 185 190 Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 195 200 205 Asn Thr Ser 210

Claims (16)

  1. a) 컨쥬게이트, 및
    b) 상기 컨쥬게이트에 직접 또는 간접적으로 공유결합되어 있는 면역조절 항체 또는 이의 단편을 포함하고,
    상기 컨쥬게이트는
    (i) kit225 세포주에서 증식 유도 시 인간 IL-15의 활성의 적어도 10%를 갖는 인터루킨 15 또는 이의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및
    (ii) 인간 인터루킨-15와 인간 IL-15Rα의 스시 도메인의 결합 활성의 적어도 10%를 갖는 IL-15Rα 또는 이의 유도체의 스시 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하며,
    상기 면역조절 항체 또는 이의 단편은 PD-1 안타고니스트이고, 면역억제 수용체를 억제하는 것인, 이뮤노사이토카인.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 면역조절 항체는 항 PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체인, 이뮤노사이토카인.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 면역조절 항체는 니볼루맙 (nivolumab), Merck 3745, CT-011 (hBAT), 람브롤리주맙 (lambrolizumab), AMP514 및 MDX-1 105 또는 RG7446인, 이뮤노사이토카인.
  4. 제1항에 있어서,
    a) 컨쥬게이트의 폴리펩타이드 i) 및 ii)는 융합 단백질로서 공유결합되어 있고; 및
    b) 상기 컨쥬게이트 및 항체 또는 이의 단편은 융합 단백질로서 공유결합되어 있는, 이뮤노사이토카인.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 인터루킨 15는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는, 이뮤노사이토카인.
  6. 제1항에 있어서,
    IL-15Rα의 스시 도메인은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는, 이뮤노사이토카인.
  7. 제1항에 있어서,
    IL-15Rα 또는 이의 유도체의 스시 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (ii)는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖는, 이뮤노사이토카인.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 컨쥬게이트는 IL-15Rα 또는 이의 유도체의 스시 도메인의 아미노산 서열과 비교하여 C-말단 위치에서 인터루킨 15 또는 이의 유도체의 아미노산 서열을 포함하고, 및 컨쥬게이트의 상기 아미노산 서열은 항체 또는 이의 단편의 아미노산 서열과 비교하여 C-말단 위치에 존재하는, 이뮤노사이토카인.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 이뮤노사이토카인을 인코딩하는 핵산.
  10. 제9항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  11. 제9항의 핵산으로 유전자 변형된 숙주세포.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 숙주세포는 CHO 세포인, 숙주 세포.
  13. 제1항에 따른 이뮤노사이토카인을 포함하고, 최종적으로 약학적으로 허용 가능한 담체와 결합되는 암 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 암은 암종(carcinoma)인, 약학 조성물.
  15. 삭제
  16. 삭제
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