BR112016002614B1 - Imunocitoquina e composição farmacêutica - Google Patents

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Eric Tartour
David Bechard
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Cytune Pharma
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Université Paris Cité
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Abstract

IMUNOCITOQUINA, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção refere-se a uma imunocitoquina que compreende (a) um conjugado e (b) um anticorpo imunomodulador ou seu fragmento ligado direta ou indiretamente por meio de covalência ao mencionado conjugado, em que o mencionado conjugado compreende (i) um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da interleucina 15 ou seus derivados e um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15R(Alfa) ou seus derivados; e seus usos.

Description

[0001] O presente pedido de patente internacional reivindica a prioridade do pedido de patente europeu EP 13003963.9 depositado em oito de agosto de 2013, que é incorporado ao presente como referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção refere-se a novas “imunocitoquinas”, denominadas no presente moduloquinas, e seu uso como remédio, particularmente para o tratamento de câncer, por meio da ativação de linfócitos infiltrantes em tumores (TILs).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] O sistema imunológico dos vertebrados requer diversas interações moleculares e celulares para atingir reações imunológicas ideais contra tumores.
[0004] Atualmente, a imunidade antitumores de hospedeiros é principalmente afetada por TILs (GALON et al, Science, vol. 313, págs. 19601964, 2006). De fato, diversas linhas de evidência indicaram que TILs estão sujeitos à regulagem inibidora por células de tumores.
[0005] A fim de “reativar” os mencionados TILs, foram idealizados diversos alvos e estratégias. Essas estratégias são baseadas (i) na inibição de receptores imunossupressores de TILs (por exemplo, CTL-A4, PD-1, BTLA, LAG3 HAVCR2, ADORA2A ou KIRs inibidores) para promover a ativação imunológica evitando sinais de regulagem para baixo; ou (ii) no estímulo de receptores coestimulantes de TIL (por exemplo, CD40, 4-1BB, OX-40 ou proteína relativa a TNFR induzida por glucococorticoides (GITR)), para promover a ativação de células T e/ou NK.
[0006] Embora as mencionadas terapias já tenham fornecido alguns resultados promissores, aparentemente a eficiência dessas estratégias é limitada. Na maior parte do tempo, apenas um pequeno percentual de coortes exibe reação de TILs restaurada.
[0007] A fim de obter eficiência reforçada, idealiza-se agora a combinação dessas estratégias com outras drogas ou modulador.
[0008] Os inventores tentam, portanto, combinar essas estratégias com um anticorpo anti-PD1 com o modulador descrito no pedido de patente WO 2007/046006.
[0009] Os resultados demonstraram que essa combinação não foi capaz de restaurar uma parte significativa (ou seja, cerca de 20%) de TILs isolados de pacientes com carcinoma das células renais (RCC).
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[00010] Os inventores também tentaram agora outra combinação na qual o mesmo modulador foi fundido ao mesmo anticorpo, fornecendo um novo tipo de imunocitoquinas que eles denominaram "moduloquinas". Surpreendentemente e em comparação com a combinação anterior, essa combinação forneceu forte reativação de TILs, em que a reativação foi observada para a maior parte dos TILs, ou seja, cerca de 80%.
[00011] Esta forte sinergia permite idealizar novas terapias.
[00012] Consequentemente, a presente invenção refere-se a uma imunocitoquina que compreende: a. um conjugado; e b. um anticorpo imunomodulador ou seu fragmento, ligado direta ou indiretamente por meio de covalência ao mencionado conjugado; em que o mencionado conjugado compreende: i. um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de interleucina 15 ou seus derivados; e ii. um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα ou seus derivados.
[00013] Em segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico que codifica uma imunocitoquina conforme descrito acima.
[00014] Em terceiro aspecto, a presente invenção fornece um vetor que compreende um ácido nucleico conforme descrito acima.
[00015] Em quarto aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira geneticamente elaborada com o polinucleotídeo ou com o vetor descrito anteriormente. A presente invenção também se refere a um método de produção de células hospedeiras geneticamente elaboradas que expressam uma imunocitoquina de acordo com a presente invenção, em que o mencionado método compreende as etapas de: (i) introdução in vitro ou ex vivo de um ácido nucleico ou vetor conforme descrito acima em uma célula hospedeira; (ii) cultivo in vitro ou ex vivo da célula hospedeira recombinante geneticamente elaborada obtida; e (iii) opcionalmente, seleção das células que expressam e/ou secretam a mencionada imunocitoquina.
[00016] Em uma realização preferida, a mencionada célula hospedeira geneticamente elaborada é uma célula de animal e, preferencialmente, uma célula de CHO.
[00017] Em quinto aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende a imunocitoquina conforme descrito acima, um ácido nucleico que a codifica ou um vetor de ácido nucleico que compreende o mencionado ácido nucleico, eventualmente associado a um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00018] Em uma realização preferida, a mencionada composição compreende um agente terapêutico adicional, que é preferencialmente um agente anticâncer.
[00019] Em sexto aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica conforme descrito anteriormente para o tratamento de câncer em pacientes.
[00020] Em sétimo aspecto, a presente invenção refere-se aos produtos que contêm: iii. imunocitoquina conforme descrito acima, sequência de ácidos nucleicos que a codifica ou vetor que compreende essa sequência de ácidos nucleicos; e iv. agente terapêutico, preferencialmente agente anticâncer; na forma de preparação combinada para uso simultâneo, separado ou sequencial para o tratamento de câncer em pacientes.
[00021] Em oitavo aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de câncer em pacientes que compreende a etapa de administração ao mencionado paciente de composição farmacêutica conforme descrito anteriormente.
[00022] Em aspecto final, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de câncer que compreende a etapa de administração simultânea, separada ou sequencial a pacientes dele necessitados de quantidade terapeuticamente eficaz de: v. imunocitoquina conforme descrito acima, sequência de ácidos nucleicos que a codifica ou vetor que compreende essa sequência de ácidos nucleicos; e vi. agente terapêutico, preferencialmente agente anticâncer.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00023] A Figura 1 exibe a expressão de PD-1, Tim-3 e IL-15Rα em TILs do paciente A (A) e no paciente B (B).
[00024] A Figura 2 exibe a reativação de linfócitos infiltrados em tumores (TILs) induzidos por anticorpo anti-PD1 (HBAT), por meio de RLI, por uma combinação de RLI e HBAT (RLI + HBAT) ou pela moduloquina de acordo com a presente invenção (HBAT - RLI).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00025] O termo “imunocitoquina” designa uma molécula que compreende um anticorpo ou seus fragmentos ligados direta ou indiretamente por meio de covalência a uma citoquina ou seus derivados. O mencionado anticorpo e a mencionada citoquina podem ser ligados por um peptídeo ligante.
[00026] Conjugado da imunocitoquina de acordo com a presente invenção.
[00027] A expressão “interleucina 15”, no seu significado geral na técnica, designa uma citoquina com similaridade estrutural a IL-2 (Grabstein et al, Science, vol. 264 (5161), págs. 965-968, 1994). Esta citoquina também é conhecida como IL-15, IL15 ou MGC9721. Esta citoquina e IL-2 compartilham muitas atividades biológicas e concluiu-se que elas ligam subunidades receptoras de hematopoietina comuns. Elas podem, portanto, competir pelo mesmo receptor, regulando negativamente a atividade umas das outras. Concluiu-se que IL-15 regula a ativação e proliferação de células T e matadoras naturais e demonstrou-se que a quantidade de células de memória CD8+ é controlada por equilíbrio entre essa citoquina e IL2. A atividade de IL-15 pode ser medida por meio de determinação da indução da sua proliferação sobre a linhagem celular kit225 (Hori et al, Blood, vol. 70 (4), págs. 1069-72, 1987), conforme descrito nos Exemplos.
[00028] A mencionada IL-15 ou seus derivados possuem pelo menos 10% da atividade de interleucina 15 humana sobre a indução da proliferação da linhagem celular kit225, preferencialmente pelo menos 25% e, de maior preferência, pelo menos 50%.
[00029] A mencionada interleucina 15 é uma interleucina 15 de mamífero, preferencialmente uma interleucina 15 de primatas e, de maior preferência, uma interleucina 15 humana.
[00030] Interleucina 15 de mamífero pode ser identificada simplesmente pelos técnicos no assunto. Como exemplo, pode-se mencionar interleucina 15 de Sus scrofa (Número de acesso ABF82250), de Rattus norvegicus (Número de acesso NP_037261), de Mus musculus (Número de acesso NP_032383), de Bos taurus (Número de acesso NP_776515), de Oryctolagus cuniculus (Número de acesso NP_001075685), de Ovies aries (Número de acesso NP_001009734), de Felis catus (Número de acesso NP_001009207), de Macaca fascicularis (Número de acesso BAA19149), de Homo sapiens (Número de acesso NP_000576), de Macaca mulatta (Número de acesso NP_001038196), de Cavia porcellus (Número de acesso NP_001166300) ou de Chlorocebus sabaeus (Número de acesso ACI289).
[00031] Da forma utilizada no presente, a expressão “interleucina 15 de mamífero” designa a sequência de consenso SEQ ID N° 1.
[00032] Interleucina 15 de primata pode ser identificada simplesmente pelos técnicos no assunto. Como exemplo, pode-se mencionar interleucina 15 de Sus scrofa (Número de acesso ABF82250), de Oryctolagus cuniculus (Número de acesso NP_001075685), de Macaca fascicularis (Número de acesso BAA19149), de Homo sapiens (Número de acesso NP_000576), de Macaca mulatta (Número de acesso NP_001038196) ou de Chlorocebus sabaeus (Número de acesso ACI289).
[00033] Da forma utilizada no presente, a expressão “interleucina 15 de primata” designa a sequência de consenso SEQ ID N° 2.
[00034] Interleucina 15 humana pode ser identificada simplesmente pelos técnicos no assunto e designa a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 3.
[00035] Da forma utilizada no presente, a expressão “derivados de interleucina 15” designa uma sequência de aminoácidos que possui percentual de identidade de pelo menos 92,5% (ou seja, correspondente a cerca de dez substituições de aminoácidos) com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 e SEQ ID N° 3, preferencialmente pelo menos 96% (ou seja, correspondente a cerca de cinco substituições de aminoácidos) e, de maior preferência, pelo menos 98,5% (ou seja, correspondente a cerca de duas substituições de aminoácidos) ou pelo menos 99% (ou seja, correspondente a cerca de uma substituição de aminoácido). Esses derivados podem ser identificados simplesmente pelos técnicos no assunto em vista do seu conhecimento pessoal e do ensinamento do presente pedido de patente. Como exemplo desses derivados, pode-se mencionar os descritos no Pedido de Patente Internacional PCT WO 2009/135031. Também se compreenderá que aminoácidos naturais podem ser substituídos por aminoácidos quimicamente modificados. Tipicamente, esses aminoácidos quimicamente modificados aumentam a meia vida do polipeptídeo.
[00036] Da forma utilizada no presente, “percentual de identidade” entre duas sequências de aminoácidos indica o percentual de aminoácidos idênticos, entre as duas sequências a serem comparadas, obtido com o melhor alinhamento das mencionadas sequências, em que esse percentual é puramente estatístico e as diferenças entre essas duas sequências são espalhadas aleatoriamente sobre as sequências de aminoácidos. Da forma utilizada no presente, “melhor alinhamento” ou “alinhamento ideal” indica o alinhamento para o qual o percentual de identidade determinado (vide abaixo) é o mais alto. A comparação de sequências entre duas sequências de aminoácidos é normalmente realizada por meio de comparação dessas sequências que foram alinhadas anteriormente segundo o melhor alinhamento; essa comparação é realizada sobre segmentos de comparação, a fim de identificar e comparar as regiões locais de similaridade. O melhor alinhamento de sequências para efetuar comparação pode ser realizado, além de forma manual, utilizando o algoritmo de homologia local desenvolvido por Smith e Waterman (Ad. App. Math., vol. 2, pág. 482, 1981), utilizando o algoritmo de homologia global desenvolvido por Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol., vol. 48, pág. 443, 1970), utilizando o método de similaridades desenvolvido por Pearson e Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 85, pág. 2444, 1988), utilizando software de computador que emprega esses algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA no pacote de software da Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, Estados Unidos), utilizando os algoritmos de alinhamento múltiplo MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, pág. 1792, 2004) ou utilizando CLUSTAL (Goujon et al, Nucleic Acids Research, vol. 38, W695-9, 2010). Para obter o melhor alinhamento local, pode- se utilizar preferencialmente o software BLAST com a matriz BLOSUM 62. O percentual de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinado por meio de comparação dessas duas sequências idealmente alinhadas, em que a sequência de aminoácidos é capaz de englobar adições ou exclusões com relação à sequência de referência, a fim de obter alinhamento ideal entre essas duas sequências. O percentual de identidade é calculado por meio de determinação da quantidade de posições idênticas entre essas duas sequências, divisão desse número pelo número total de posições comparadas e multiplicação do resultado obtido por 100 para obter o percentual de identidade entre essas duas sequências.
[00037] Preferencialmente, os derivados de interleucina 15 são agonista ou superagonista de IL-15. Os técnicos no assunto podem identificar simplesmente um agonista ou superagonista de IL-15. Como exemplo de agonista ou superagonista de IL-15, pode-se mencionar os descritos no Pedido de Patente Internacional WO 2005/085282 ou em Zhu et al (J. Immunol., vol. 183 (6), pág. 3598-607 (2009).
[00038] Ainda preferencialmente, o mencionado agonista ou superagonista de IL-15 é selecionado a partir do grupo que compreende/consiste em L45D, L45E, S51D, L52D, N72D, N72E, N72A, N72S, N72Y e N72P (com referência à sequência de IL-15 humano, SEQ ID N° 3).
[00039] Da forma utilizada no presente, a expressão “domínio sushi de IL-15Rα” possui seu significado geral na técnica e designa um domínio que se inicia no primeiro resíduo de cisteína (C1) após o peptídeo de sinal de IL- 15Rα e termina no quarto resíduo de cisteína (C4) após o mencionado peptídeo de sinal. O mencionado domínio sushi correspondente a uma parte da região extracelular de IL-15Rα é necessário para sua ligação a IL-15 (Wei et al, J. Immunol., vol. 167 (1), págs. 277-282, 2001).
[00040] O mencionado domínio sushi de IL-15Rα ou seus derivados possui pelo menos 10% da atividade de ligação do domínio sushi de IL-15Rα humano a interleucina 15 humana, preferencialmente pelo menos 25% e, de maior preferência, pelo menos 50%. A mencionada atividade de ligação pode ser determinada simplesmente por meio do método descrito em Wei et al (op. cit., 2001).
[00041] O mencionado domínio sushi de IL-15Rα é o domíno de sushi de IL-15Rα de mamífero, preferencialmente o domínio sushi de IL-15Rα de primata e, de maior preferência, o domínio sushi de IL-15Rα humana.
[00042] O domínio sushi de IL-15Rα de mamífero pode ser simplesmente identificado pelos técnicos no assunto. Como exemplo, pode-se mencionar o domínio sushi de IL-15Rα de Rattus norvegicus (Número de acesso XP_002728555), de Mus musculus (Número de acesso EDL08026), de Bos taurus (Número de acesso XP_002692113), de Oryctolagus cuniculus (Número de acesso XP_002723298), de Macaca fascicularis (Número de acesso ACI42785), de Macaca nemestrina (Número de acesso ACI42783), de Homo sapiens (Número de acesso Q13261.1), de Macaca mulatta (Número de acesso NP_001166315), Pongo abelii (Número de acesso XP_002820541), Cercocebus torquatus (Número de acesso ACI42784), Callithrix jacchus (Número de acesso XP_002750073) ou de Cavia porcellus (Número de acesso NP_001166314).
[00043] Da forma utilizada no presente, a expressão “domínio sushi de IL-15Rα de mamífero” designa a sequência de consenso SEQ ID N° 4.
[00044] Preferencialmente, o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα de mamífero designa a sequência de consenso de SEQ ID N° 5.
[00045] O domínio sushi de IL-15Rα de primata pode ser identificado simplesmente pelos técnicos no assunto. Como exemplo, pode-se mencionar domínios de sushi de IL-15Rα de Oryctolagus cuniculus, Macaca fascicularis, Macaca nemestrina, Homo sapiens, Macaca mulatta, Pongo abelii, Cercocebus torquatus ou Callithrix jacchus.
[00046] Da forma utilizada no presente, a expressão “domínio sushi de IL-15Rα de primata” designa a sequência de consenso SEQ ID N° 6.
[00047] Preferencialmente, o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα de primata designa a sequência de consenso de SEQ ID N° 7.
[00048] O domínio sushi de IL-15Rα humana pode ser identificado simplesmente pelos técnicos de sangue e refere-se à sequência de aminoácidos SEQ ID N° 8.
[00049] Preferencialmente, o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα humana designa SEQ ID N° 9.
[00050] Da forma utilizada no presente, a expressão “derivados do domínio sushi de IL-15Rα” designa uma sequência de aminoácidos que possui percentual de identidade de pelo menos 92% (ou seja, correspondente a cerca de cinco substituições de aminoácidos) com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8 e SEQ ID N° 9, preferencialmente pelo menos 96% (ou seja, correspondente a cerca de duas substituições de aminoácidos) e, de maior preferência, pelo menos 98% (ou seja, correspondente a cerca de uma substituição de aminoácido). Esses derivados compreendem os quatro resíduos de cisteína do domínio sushi de L-15Rα e podem ser identificados simplesmente pelos técnicos no assunto em vista do seu conhecimento pessoal e do ensinamento do presente pedido de patente. Também se compreenderá que aminoácidos naturais podem ser substituídos por aminoácidos quimicamente modificados. Tipicamente, esses aminoácidos quimicamente modificados aumentam a meia vida do polipeptídeo.
[00051] Segundo uma realização preferida, o conjugado compreende (ii) um polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos dos domínios de sushi e de articulação de IL-15Rα ou seus derivados.
[00052] O domínio de articulação de IL-15Rα é definido como a sequência de aminoácidos que começa no primeiro resíduo amino após o domínio sushi e termina no último resíduo de aminoácido antes do primeiro local potencial de glicosilação. Em IL-15Rα humana, a sequência de aminoácidos da região de articulação consiste dos quatorze aminoácidos que estão localizados após o domínio sushi dessa IL-15Ralfa, em posição C-terminal com relação ao mencionado domínio sushi, ou seja, a mencionada região de articulação de IL- 15Ralfa começa no primeiro aminoácido depois do mencionado resíduo de cisteína (C4) e termina no décimo-quarto aminoácido (contando na orientação padrão “do terminal N para o terminal C”).
[00053] Os mencionados domínios de sushi e de articulação de IL- 15Rα são os domínios de sushi e de articulação de IL-15Rα de mamífero, preferencialmente os domínios de sushi e de articulação de IL-15Rα de primata e, de maior preferência, os domínios de sushi e de articulação de IL-15Rα humana.
[00054] A sequência de aminoácidos dos domínios de sushi e de articulação de IL-15Rα de mamífero pode ser identificada simplesmente pelos técnicos no assunto. Da forma utilizada no presente, a expressão “domínios de sushi e de articulação de IL-15Rα de mamífero” designa a sequência de consenso SEQ ID N° 10.
[00055] A sequência de aminoácidos dos domínios de sushi e de articulação de IL-15Rα de primata pode ser identificada simplesmente pelos técnicos no assunto. Da forma utilizada no presente, a expressão “domínios de sushi e de articulação de IL-15Rα de primata” designa a sequência de consenso SEQ ID N° 11.
[00056] A sequência de aminoácidos dos domínios de sushi e de articulação de IL-15Rα humana pode ser identificada simplesmente pelos técnicos no assunto. Da forma utilizada no presente, a expressão “domínios de sushi e de articulação de IL-15Rα humana” designa a sequência de consenso SEQ ID N° 12.
[00057] Da forma utilizada no presente, a expressão “derivados dos domínios de sushi e de articulação de IL-15Rα” designa uma sequência de aminoácidos que possui percentual de identidade de pelo menos 93% (ou seja, correspondente a cerca de cinco substituições de aminoácidos) com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11 e SEQ ID N° 12, preferencialmente pelo menos 97% (ou seja, correspondente a cerca de duas substituições de aminoácidos) e, de maior preferência, pelo menos 98% (ou seja, correspondente a cerca de uma substituição de aminoácido). Esses derivados compreendem os quatro resíduos de cisteína do domínio sushi de L-15Rα e podem ser identificados simplesmente pelos técnicos no assunto em vista do seu conhecimento geral e do ensinamento do presente pedido de patente. Também se compreenderá que aminoácidos naturais podem ser substituídos por aminoácidos quimicamente modificados. Tipicamente, esses aminoácidos quimicamente modificados aumentam a meia vida do polipeptídeo.
[00058] Os dois polipeptídeos (i) e (ii) do conjugado podem ser ligados de forma não covalente tal como no complexo descrito na Patente US 8.124.084 B2. O mencionado conjugado ou complexo pode ser obtido simplesmente por meio do fornecimento de quantidade apropriada do polipeptídeo (i), fornecendo quantidade apropriada do polipeptídeo (ii), misturando os dois polipeptídeos sob condições iônicas e de pH apropriadas por período suficiente para permitir a formação de complexo (ou seja, conjugado) e concentrando ou purificando opcionalmente o mencionado complexo. Os polipeptídeos do complexo (ou seja, conjugado) podem ser formados, por exemplo, utilizando um sintetizador de peptídeos de acordo com métodos padrão; expressando cada polipeptídeo separadamente em uma célula ou extrato celular, isolando e purificando o polipeptídeo em seguida. Opcionalmente, o complexo de polipeptídeos terapêutico de acordo com a presente invenção pode ser formado por meio da expressão dos dois polipeptídeos (i) e (ii) na mesma célula ou extrato celular, isolando e purificando os complexos, utilizando, por exemplo, métodos cromatográficos, tais como cromatografia de afinidade com anticorpos para a porção de linfoquinas, a porção receptora de linfoquinas ou para o complexo.
[00059] Os dois polipeptídeos (i) e (ii) do conjugado podem também ser ligados covalentemente utilizando agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais ou em uma proteína de fusão.
[00060] Agentes de acoplamento de proteínas são bem conhecidos dos técnicos no assunto tais como métodos que os utilizam e incluem, por exemplo, (2-piridilditio)propionato de N-succinimidila (SPDP), (N- maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidila, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como HCL adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tais como suberato de dissucinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bisazido (tais como bis(p- azidobenzoil)hexanodiamina, derivados de bisdiazônio (tais como bis(p- diazoniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tais como 2,6-di-isocianato de tolieno e compostos de flúor bisativos (tais como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno).
[00061] A expressão “proteína de fusão” designa uma proteína criada por meio da ligação de dois ou mais genes que originalmente codificaram proteínas separadas. Ela também é conhecida como proteína quimérica. Tradução desse gene de fusão resulta em um polipeptídeo isolado com propriedades funcionais derivadas de cada uma das proteínas originais. Proteínas de fusão recombinantes são criadas artificialmente por meio de tecnologia de DNA recombinante para uso em pesquisa biológica ou produtos terapêuticos. Proteína de fusão recombinante é uma proteína criada por meio de engenharia genética de um gene de fusão. Isso tipicamente envolve a remoção do códon de parada de uma sequência de cDNA que codifica a primeira proteína e anexação em seguida da sequência de cDNA da segunda proteína em quadro por meio de ligação ou PCR de extensão de sobreposição. Aquela sequência de DNA será expressa em seguida por uma célula na forma de proteína isolada. A proteína pode ser elaborada para incluir a sequência completa das duas proteínas originais ou apenas uma parte de cada uma.
[00062] Em uma realização preferida, o conjugado é uma proteína de fusão.
[00063] A sequência de aminoácidos de interleucina 15 ou seus derivados pode estar em posição C-terminal ou N-terminal com relação à sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα ou seus derivados. Preferencialmente, a sequência de aminoácidos de interleucina 15 ou seus derivados pode estar em posição C-terminal com relação à sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα ou seus derivados.
[00064] A sequência de aminoácidos de interleucina 15 ou seus derivados e a sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα ou seus derivados pode ser separada por uma primeira sequência de aminoácidos “ligante”. A mencionada primeira sequência de aminoácidos “ligante” pode ter comprimento suficiente para garantir que a proteína de fusão forme estruturas secundárias e terciárias adequadas.
[00065] O comprimento da primeira sequência de aminoácidos ligantes pode variar sem afetar significativamente a atividade biológica da proteína de fusão. Tipicamente, a primeira sequência de aminoácidos ligantes compreende pelo menos um, mas menos de trinta aminoácidos, tais como um ligante de 2-30 aminoácidos, preferencialmente de 10-30 aminoácidos, de maior preferência de 15-30 aminoácidos, de preferência ainda maior de 15-25 aminoácidos e, de preferência superior, de 18-22 aminoácidos.
[00066] Sequências de aminoácidos ligantes preferidas são as que permitem que o conjugado adote conformação adequada (ou seja, conformação que permite atividade de transdução de sinal adequada por meio do processo de sinalização de IL-15Rbeta/gama).
[00067] As primeiras sequências de aminoácidos ligantes mais adequadas (1) adotarão conformação estendida flexível, (2) não exibirão propensão de desenvolver estrutura secundária ordenada que poderia interagir com os domínios funcionais de proteínas de fusão e (3) terão caráter hidrofóbico ou carregado mínimo que poderá promover a interação com os domínios de proteína funcionais.
[00068] Preferencialmente, a primeira sequência de aminoácidos ligante compreende aminoácidos quase neutros selecionados a partir do grupo que compreende Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L) e Gln (Q), de preferência superior do grupo que compreende Gly (G), Asn (N) e Ser (S).
[00069] Exemplos de sequências ligantes são descritas nas Patentes Norte-Americanas n° 5.073.627 e 5.108.910.
[00070] Ligantes flexíveis ilustrativos que são mais particularmente apropriados para a presente invenção incluem os codificados pelas sequências de SEQ ID N° 13 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ), SEQ ID N° 14 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSGG) ou SEQ ID N° 15 (SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ).
[00071] Preferencialmente, o conjugado possui a sequência SEQ ID N° 18 ou SEQ ID N° 19.
[00072] Anticorpo da imunocitoquina de acordo com a presente invenção.
[00073] O termo “anticorpo” designa uma molécula de imunoglobulina correspondente a um tetrâmero que compreende quatro cadeias de polipeptídeos, duas cadeias pesadas (H) idênticas (cerca de 50-70 kDa quando com comprimento total) e duas cadeias leves (L) idênticas (cerca de 25 kDa quando com comprimento total) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cadeias leves são classificadas como capa e lambda. Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon e definem o isótipo de anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Cada cadeia pesada é composta de uma região variável de cadeia pesada N-terminal (abreviada no presente como HCVR) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é composta de três domínios (CH1, CH2 e CH3) para IgG, IgD e IgA; e quatro domínios (CH1, CH2, CH3 e CH4) para IgM e IgE. Cada cadeia leve é composta de uma região variável de cadeia leve N-terminal (abreviada no presente LCVR) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é composta de um domínio, CL. As regiões HCVR e LCVR podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada HCVR e LCVR é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas de terminal amino para terminal carbóxi na ordem a seguir: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A cessão de aminoácidos para cada domínio é de acordo com convenções bem conhecidas. A capacidade funcional do anticorpo de ligar-se a um antígeno específico depende das regiões variáveis de cada par de cadeia leve e cadeia pesada e é determinada, em grande parte, pelas CDRs.
[00074] O termo “anticorpo”, da forma utilizada no presente, designa intrinsecamente um anticorpo monoclonal. Um anticorpo monoclonal pode ser um anticorpo humano, anticorpo quimérico e/ou anticorpo humanizado.
[00075] Convenientemente, o termo anticorpo designa IgG, tal como IgG1, IgG2 (IgG2a ou IgG2b), IgG3 e IgG4. Preferencialmente, o termo anticorpo designa IgG1 ou IgG2 e, de maior preferência, IgG2a.
[00076] “Anticorpo quimérico” indica um anticorpo que é composto de regiões variáveis de uma imunoglobulina murina e regiões constantes de uma imunoglobulina humana. Esta alteração consiste simplesmente da substituição da região constante de um anticorpo humano com a região constante murina, de forma a resultar em quimera humana/murina que pode ter imunogenicidade suficientemente baixa para que seja aceitável para uso farmacêutico. Diversos métodos de produção desses anticorpos quiméricos já foram relatados e fazem parte do conhecimento geral do técnico no assunto (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 5.225.539).
[00077] “Anticorpo humanizado” indica anticorpo que é composto, total ou parcialmente, de sequências de aminoácidos derivadas de uma linha de germens de anticorpos humanos por meio de alteração da sequência de um anticorpo que possui regiões de determinação da complementaridade (CDR) não humanas. Esta humanização da região variável do anticorpo e, eventualmente, da CDR é realizada por meio de métodos que são atualmente bem conhecidos na técnica. Como exemplo, o Pedido de Patente Britânico GB 2188638A e a Patente Norte-Americana n° 5.585.089 descrevem processos nos quais são produzidos anticorpos recombinantes em que a única porção do anticorpo que é substituída é a região de determinação da complementaridade ou “CDR”. O método de enxerto de CDR foi utilizado para gerar anticorpos que consistem em CDRs murinas e regiões constantes e de cadeia principal de região variável humana (vide, por exemplo, Riechmann et al, Nature, vol. 332, págs. 323-327, 1988). Esses anticorpos retêm as regiões constantes humanas que são necessárias para a função efetora dependente de Fc, mas é muito menos provável que evoquem reação imunológica contra o anticorpo. Como exemplo, as regiões de cadeia principal das regiões variáveis são substituídas pelas regiões de cadeia principal humanas correspondentes que deixam CDR não humana substancialmente intacta ou mesmo substituindo-se a CDR por sequências derivadas de um genoma humano. Anticorpos totalmente humanos são produzidos em camundongos geneticamente modificados cujos sistemas imunológicos foram alterados para corresponder a sistemas imunológicos humanos. Conforme mencionado acima, é suficiente para uso nos métodos de acordo com a presente invenção o emprego de um fragmento imunologicamente específico do anticorpo, incluindo fragmentos que representam formas de fita simples.
[00078] Anticorpo humanizado designa novamente um anticorpo que compreende uma cadeia principal humana, pelo menos uma CDR de um anticorpo não humano e no qual qualquer região constante presente é substancialmente idêntica a uma região constante de imunoglobulina humana, ou seja, pelo menos cerca de 85 ou 90%, preferencialmente pelo menos 95% idêntica. Portanto, todas as partes de anticorpos humanizados, exceto possivelmente as CDRs, são substancialmente idênticas a partes correspondentes de uma ou mais sequências de imunoglobulina humana nativas. Uma imunoglobulina humanizada, por exemplo, tipicamente não englobaria um anticorpo de região constante humana/região variável de camundongo quimérico. Como exemplo, o projeto de imunoglobulinas humanizadas pode ser conduzido como segue: quando um aminoácido encontra-se sob a categoria a seguir, o aminoácido de cadeia principal de imunoglobulina humana a ser utilizada (imunoglobulina receptora) é substituído por um aminoácido de cadeia principal de uma imunoglobulina não humana que fornece CDR (imunoglobulina doadora): (a) o aminoácido na região de cadeia principal humana da imunoglobulina receptora é incomum para imunoglobulina humana naquela posição, enquanto o aminoácido correspondente na imunoglobulina doadora é típico para imunoglobulina humana naquela posição; (b) a posição do aminoácido é imediatamente adjacente a uma das CDRs; ou (c) qualquer átomo de cadeia lateral de um aminoácido de cadeia principal encontra- se dentro de cerca de 5-6 ângstroms (centro a centro) de qualquer átomo de um aminoácido de CDR em um modelo de imunoglobulina tridimensional (Queen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol.88, pág. 2869, 1991). Quando cada um dos aminoácidos na região de cadeia principal humana da imunoglobulina receptora e um aminoácido correspondente na imunoglobulina doadora forem incomuns para imunoglobulina humana naquela posição, esse aminoácido é substituído por um aminoácido típico para imunoglobulina humana naquela posição.
[00079] A expressão “fragmento de anticorpo”, da forma utilizada no presente, designa fragmento de anticorpo capaz de reagir com o mesmo antígeno que o seu anticorpo correspondente. Esses fragmentos podem ser identificados simplesmente pelos técnicos no assunto e compreendem, por exemplo, fragmento Fab (por exemplo, por meio de digestão de papaína), fragmento Fab' (por exemplo, por meio de digestão de pepsina e redução parcial), fragmento F(ab')2 (por exemplo, por meio de digestão de pepsina), Facb (por exemplo, por meio de digestão de plasmina), Fd (por exemplo, por meio de digestão de pepsina, redução parcial e reagregação) e também fragmento scFv (Fv de fita simples; por exemplo, por meio de métodos de biologia molecular) são englobados pela presente invenção.
[00080] Esses fragmentos podem ser produzidos por meio de divisão enzimática, métodos sintéticos ou recombinantes, conforme conhecido na técnica e/ou conforme descrito no presente. Anticorpos podem também ser produzidos em uma série de formas truncadas utilizando genes de anticorpos nos quais um ou mais códons de parada foram introduzidos acima no fluxo do local de parada natural. Um gene de combinação que codifica uma parte de cadeia pesada F(ab’)2, por exemplo, pode ser projetado para incluir sequências de DNA que codificam o domínio CH1 e/ou região de articulação da cadeia pesada. As diversas porções de anticorpos podem ser quimicamente unidas entre si por meio de métodos convencionais ou podem ser preparadas na forma de proteína contígua utilizando métodos de engenharia genética.
[00081] Preferencialmente, o mencionado fragmento de anticorpo é um fragmento de scFv.
[00082] A expressão “anticorpo imunomodulador”, da forma utilizada no presente, designa um anticorpo que age por meio de: 1. inibição de um receptor imunossupressivo tal como CTL-A4, PD-1, BTLA, LAG3 HAVCR2, ADORA2A ou KIRs inibidores, seja por meio de ligação desse receptor ou seu ligante, de forma a promover a ativação imunológica evitando sinais de regulagem para baixo; ou 2. estímulo de receptor coestimulante tal como CD40, CD137, CD134 ou TNFRSF18 (GITR), de forma a promover a ativação de células T e/ou NK.
[00083] Em uma primeira realização preferida, o anticorpo imunomodulador inibe um receptor imunossupressivo. Como exemplo de anticorpos imunomoduladores que inibem receptores imunossupressivos, pode- se mencionar antagonistas CTL-A4, KIRs inibidores, BTLA, LAG3 HAVCR2, ADORA2A e PD-1 e, de preferência ainda maior, antagonistas de PD-1 selecionados a partir de anticorpos anti-PD1 e anti-PD-L1.
[00084] CTL-A4 (antígeno associado a linfócitos citotóxicos, também denominado CD 152) foi descoberto em 1987 (Brunet et al, Nature, vol. 328, págs. 267-270, 1987). O papel de CTL-A4 é principalmente a inibição da ativação de células T, o que foi demonstrado em camundongos com deficiência de CTL-A4 que sofrem de linfoproliferação massiva (Chambers et al, Immunity, vol. 7, págs. 8855-8959, 1997). Demonstrou-se agora que o bloqueio de CTL-A4 amplifica reações de células T in vitro (Walunas et al, Immunity, vol. 1, págs. 405413, 1994) e in vivo (Kearney, J. Immunol., vol. 155, págs. 1032-1036, 1995) e também aumenta a imunidade antitumores (Leach, Science, vol. 271, págs. 1734-1736, 1996). Como exemplo de anticorpos correspondentes a antagonistas de CTL-A4, pode-se mencionar ipilimumab (também denominado MDX-010 e 10D1, disponíveis por meio da Medarex e comercializados como YERVOY® pela Bristol-Myers Squibb Company) descrito em WO 01/14424, ticilimumab (também conhecido como 11.2.1 e CP-675.206) descrito em WO 00/37504 e também os anticorpos CTL-A4 descritos nos pedidos de patente internacionais WO 98/42752, WO 01/14424, WO 2004/035607 e WO 2012/120125, em EP 1212422 e EP 1262193, nas Patentes Norte-Americanas n° US 5.811.097, US 5.855.887, US 5.977.318, US 6.051.227, US 6.207.156, US 6.682.736, US 6.984.720, US 7.109.003 e US 7.132.281, que são incorporadas ao presente como referência.
[00085] Morte celular programada 1 também conhecida como PD- 1 (também denominada PDCD1 ou CD279) é uma glicoproteína de membrana do tipo I com cerca de 55 kD. PD-1 é receptor da família genética coestimulante de CD28, que é expressa moderadamente sobre células T, B e NK nativas e regulada para cima por meio de sinalização de receptores de células T/B sobre linfócitos, monócitos e células mieloides. PD-1 possui dois ligantes conhecidos com perfis de expressão distintos, PD-L1 (B7-H1), que é amplamente expresso (ou seja, sobre linfócitos nativos sobre células B e T ativadas, monócitos e células dendríticas) e PD-L2 (B7-DC), cuja expressão é restrita - ou seja, sobre células dendríticas ativadas, macrófagos e monócitos e sobre células endoteliais vasculares. Em diversos modelos de tumor singeneico murino, o bloqueio de PD- 1 ou PD-L1 inibiu significativamente o crescimento de tumores ou induziu a regressão completa. PD-1 é, portanto, reconhecido como participante importante na regulagem imunológica e na manutenção da tolerância periférica. Como exemplo de anticorpos correspondentes a antagonistas de PD-1, pode-se mencionar nivolumab (também conhecido como BMS-936558 ou MDX1106; anticorpo anti-PD-1, Bristol-Myers Squibb) é descrito em WO 2006/121168, Merck 3745 (também conhecido como MK-3475 ou SCH-900475, é um anticorpo anti-PD-1) é descrito em WO 2009/114335, CT-011 (também conhecido como hBAT ou hBAT-1, anticorpo anti-PD-1) é descrito em WO2009/101611, lambrolizumab é descrito em WO 2008/156712, AMP514 que é descrito em WO 2010/027423, WO 2010/027827, WO 2010/027828 e WO 2010/098788, bem como os anticorpos descritos nos pedidos de patente internacionais WO 2004/056875, WO 2006/056875, WO 2008/083174, WO 2010/029434, WO 2010/0929435, WO 2010/036959, WO 2010/089411, WO 2011/110604, WO 2012/135408 e WO 2012/145493. O mencionado antagonista de PD-1 pode corresponder a um anticorpo anti-PD-L1 tal como MDX-1105 (também conhecido como BMS-936559, anticorpo anti-PD-L1) descrito em WO 2007/005874 ou YW 243.55.S70 (também conhecido como MPDL3280A ou RG7446; anticorpo anti- PD-L1) descrito em WO 2010/077634, que são incorporados ao presente como referência.
[00086] Receptores similares a imunoglobulina de células matadoras (KIRs) são uma família de proteínas da superfície celular encontradas sobre células importantes do sistema imunológico denominadas células matadoras naturais (NK). Eles regulam a função de morte dessas células por meio de interação com moléculas MHC classe I, que são expressas sobre todos os tipos de células. Esta interação permite que elas detectem células infectadas com vírus ou células de tumores que possuem baixo nível característico de MHC Classe I sobre a sua superfície. KIRs, em sua maioria, são inibidores, o que significa que o seu reconhecimento de MHC suprime a atividade citotóxica da sua célula NK. Somente uma quantidade limitada de KIRs possui a capacidade de ativar a célula.
[00087] KIRs inibidores possuem uma longa cauda citoplasmática que contém motivo inibidor com base em tirosina imunorreceptora (ITIM), que realiza transdução de sinais inibidores para a célula NK mediante engajamento dos seus ligantes de MHC classe I. Os KIRs inibidores conhecidos incluem membros das subfamílias de KIR2DL e KIR3DL, que compreendem KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2 e KIR3DL3. Como exemplo de anticorpos correspondentes a antagonistas de KIRs inibidores, pode-se mencionar o anticorpo 1-7F9 descrito em WO 2006/003179, que é incorporada ao presente como referência.
[00088] BTLA (atenuador de linfócitos B e T), também conhecido como CD272, é induzido durante a ativação de células T e permanece expresso sobre células Th1, mas não células Th2. BTLA exibe inibição de células T por meio de interação com fator de necrose tumorosa (receptor), membro 14 (TNFRSF14), também conhecido como mediador de entrada de vírus da herpes (HVEM), TR2, ATAR, HVEA, CD270 e LIGHTR. TNFRSF14 foi identificado como mediador celular de entrada do vírus simplex da herpes (HSV). Descobriu-se que a região citoplasmática desse receptor se liga a diversos membros da família TRAF, que podem mediar os processos de transdução de sinal que ativam a reação imunológica. Por fim, os complexos de BTLA/HVEM regulam negativamente reações imunológicas de células T. Como exemplo de antagonista de BTLA/HVEM, pode-se mencionar os anticorpos descritos em WO 2008/076560, WO 2010/106051 e WO 2011/014438.
[00089] LAG3 (gene de ativação de linfócitos 3, também conhecido como CD223) pertence à superfamília de imunoglobulina (Ig) e contém quatro domínios similares a Ig extracelulares. Como exemplo de antagonistas de LAG3, pode-se mencionar os anticorpos descritos em WO 2010/019570.
[00090] HAVCR2 (receptor celular do vírus da hepatite A 2, também conhecido como Tim-3, KIM-3, TIMD3, Tim-3 e TIMD-3) é uma proteína da superfície celular específica de Th1 pertencente à superfamília de imunoglobulinas. HAVCR2 regula a ativação de macrófagos e inibe reações auto e aloimunes mediadas por Th1, de forma a promover a tolerância imunológica. Como exemplo de antagonistas de HAVCR2, pode-se mencionar os anticorpos descritos em WO 2013/006490A.
[00091] ADORA2A (receptor de adenosina A2A, também conhecido como A2aR e RDC8; ou ADORA2) pertence à superfamília de receptores acoplados a proteína de ligação de nucleotídeo guanina (proteína G) (GPCR), que é subdividida em classes e subtipos. Esta proteína desempenha papel importante em muitas funções biológicas, tais como circulação e ritmo cardíaco, fluxo sanguíneo renal e cerebral, função imunológica, regulagem da dor e sono. Ela foi relacionada a condições patofisiológicas tais como doenças inflamatórias e distúrbios neurodegenerativos.
[00092] Em segunda realização preferida, o anticorpo imunomodulador estimula um receptor coestimulante.
[00093] Como exemplo de anticorpos imunomoduladores que estimulam receptores coestimulantes, pode-se mencionar agonistas de CD40, CD137, CD134 e TNFRSF18.
[00094] CD40 é membro da superfamília de receptores de TNF encontrada sobre APC, que é necessário para a sua ativação. Concluiu-se que esse receptor é essencial na mediação de ampla variedade de reações imunológicas e inflamatórias, incluindo alteração de classe de imunoglobulina dependente de células T e desenvolvimento de células B de memória.
[00095] Como exemplo de anticorpos correspondentes a agonistas de CD40, pode-se mencionar os descritos em WO 03/040170, WO 2005/063981, WO 2005/063289 e WO 2012/041635, que são incorporadas ao presente como referência.
[00096] CD137 é membro da família de receptores de fator de necrose tumorosa (TNF). Seus nomes alternativos são membro da superfamília de receptores de fatores de necrose tumorosa 9 (TNFRSF9), 4-1BB e induzido pela ativação de linfócitos (ILA). CD137 pode ser expresso por células T ativadas, mas, em sua maior parte, sobre células T CD8 que sobre CD4. Além disso, a expressão de CD137 é encontrada sobre células dendríticas, células dendríticas foliculares, células matadoras naturais, granulócitos e células de paredes de vasos sanguíneos em locais de inflamação. A atividade mais bem caracterizada de CD137 é sua atividade coestimulante para células T ativadas. A retícula de CD137 aumenta a proliferação de células T, sobrevivência de secreção de IL-2 e a atividade citolítica. Além disso, ela pode aumentar a atividade imunológica para eliminar tumores em camundongos.
[00097] Como exemplo de anticorpos correspondentes a agonistas de CD137, pode-se mencionar urelumab (também conhecido como BMS- 663513) e os anticorpos descritos em WO 03/040170, WO 2004/010947, WO 2005/035584, WO 2006/126835 e WO 2012/145183, que são incorporadas ao presente como referência.
[00098] CD134, também conhecido como OX40, é um membro da superfamília de receptores TNFR. OX40 é uma molécula coestimulante, cuja expressão de OX40 é dependente da ativação completa da célula T. OX40 ligase a receptores sobre células T, que evitam a sua secagem e aumentam em seguida a produção de citoquinas. OX40 possui papel fundamental na manutenção de reação imunológica além dos primeiros dias e a seguir em uma reação de memória devido à sua capacidade de aumentar a sobrevivência.
[00099] Como exemplo de anticorpos correspondentes a agonistas de CD134, pode-se mencionar os anticorpos descritos em WO 2009/079335, WO 2012/027328, WO 2013/038191 e WO 2013/028231, que são incorporadas ao presente como referência.
[000100] O membro da superfamília de receptores de fator de necrose tumorosa 18 (TNFRSF18), também conhecido como receptor de família de TNFR indutível por ativação (AITR) ou proteína relativa a TNFR induzida por glucocorticoide (GITR) é membro da superfamília de receptores de fatores de necrose tumorosa (TNF-R). Esta proteína é uma molécula receptora da superfície que se demonstrou estar envolvida na inibição da atividade supressora de células reguladoras T e extensão da sobrevivência de células efetoras T.
[000101] Como exemplo de anticorpos correspondentes a agonistas de TNFRSF18, pode-se mencionar os anticorpos descritos em WO 2006/105021 e em WO 2011/028683.
[000102] O conjugado e seu fragmento ou anticorpo podem ser ligados covalentemente utilizando agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais ou em uma proteína de fusão.
[000103] Métodos de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais são bem conhecidos pelos técnicos no assunto e foram descritos anteriormente. Como exemplo, os técnicos no assunto podem utilizar o método descrito em Till et al (Proc. Natl. Acad. U. S. A., vol. 86 (6), págs. 1987-91, 1989).
[000104] Em uma realização preferida, a imunocitoquina é uma proteína de fusão.
[000105] Em outra realização preferida, a imunocitoquina é um complexo, preferencialmente um complexo que compreende um conjugado entre os polipeptídeos (i) e (ii), em que o polipeptídeo (i) ou (ii) é fundido a um anticorpo ou seu fragmento.
[000106] O polipeptídeo (i), o polipeptídeo (ii) ou conjugado podem encontrar-se em posição C-terminal ou N-terminal com relação à sequência de aminoácidos do anticorpo ou seu fragmento.
[000107] Preferencialmente, o conjugado é uma proteína de fusão e a sequência de aminoácidos do conjugado encontra-se em posição C-terminal com relação à sequência de aminoácidos do anticorpo ou seu fragmento, de preferência superior em posição C-terminal com relação à sequência de aminoácidos de pelo menos uma região constante de cadeia pesada do anticorpo ou seu fragmento.
[000108] A sequência de aminoácidos do conjugado e a sequência de aminoácidos do anticorpo ou seu fragmento pode ou não ser separada por uma segunda sequência de aminoácidos “ligante”.
[000109] Em uma realização específica, a imunocitoquina de acordo com a presente invenção é uma proteína de fusão em que o conjugado e o anticorpo ou seu fragmento não são separados por nenhum ligante.
[000110] Com relação à primeira sequência de aminoácidos ligante, a mencionada segunda sequência de aminoácidos “ligante” pode ter comprimento suficiente para garantir que a proteína de fusão forme estruturas secundárias e terciárias adequadas.
[000111] O comprimento da primeira sequência de aminoácidos ligante pode variar sem afetar significativamente a atividade biológica da proteína de fusão. Tipicamente, a primeira sequência de aminoácidos ligante compreende pelo menos um, mas menos de trinta aminoácidos, tais como um ligante de 2-30 aminoácidos, preferencialmente de 10-30 aminoácidos, de maior preferência de 15-30 aminoácidos e, de preferência superior, de 15-25 aminoácidos.
[000112] Com relação à primeira sequência de aminoácidos ligante, as segundas sequências de aminoácidos ligantes mais adequadas (1) adotarão conformação estendida flexível, (2) não exibirão propensão de desenvolver estrutura secundária ordenada que poderá interagir com os domínios funcionais de proteínas de fusão e (3) terão características hidrofóbicas ou carregadas mínimas que poderão promover a interação com os domínios de proteína funcionais.
[000113] Preferencialmente, a segunda sequência de aminoácidos ligante compreende aminoácidos quase neutros selecionados a partir do grupo que compreende Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L) e Gln (Q), de preferência superior a partir do grupo que compreende Gly (G), Asn (N) e Ser (S).
[000114] Como exemplo de segunda sequência de aminoácidos ligante que é apropriada para a presente invenção, pode-se mencionar a sequência SEQ ID N° 16 (SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG) ou SEQ ID N° 17 (AAGGGSGGGSGGGGSGGGGSAA).
[000115] Ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras recombinantes.
[000116] Em segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico que codifica uma imunocitoquina conforme descrito acima, preferencialmente uma imunocitoquina correspondente a uma proteína de fusão.
[000117] O mencionado ácido nucleico corresponde a RNA ou DNA, preferencialmente DNA.
[000118] Segundo uma realização preferida, o ácido nucleico que codifica a imunocitoquina de acordo com a presente invenção é ligado operativamente a uma sequência de expressão genética, que dirige a expressão do ácido nucleico em uma célula procariótica ou eucariótica, preferencialmente em uma célula eucariótica. A “sequência de expressão genética” é qualquer sequência de nucleotídeos reguladora, tal como uma sequência promotora ou combinação de promotor e amplificador, que facilita a transcrição e tradução eficiente do ácido nucleico de imunicitoquina ao qual é operativamente ligado. A sequência de expressão genética pode ser, por exemplo, um promotor viral ou de mamíferos, tal como um promotor constitutivo ou indutível.
[000119] Promotores de mamíferos constitutivos incluem, mas sem limitações, os promotores dos genes a seguir: fosforibosil transferase de hipoxantina (HPTR), adenosino desaminase, piruvato quinase, promotor de beta-actina, promotor de creatino quinase muscular, promotor do fator de alongamento humano e outros promotores constitutivos. Exemplos de promotores virais que funcionam constitutivamente em células eucarióticas incluem, por exemplo, promotores do vírus dos símios (por exemplo, SV40), vírus de papiloma, adenovírus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), citomegalovírus (CMV), vírus sarcoma de Rous (RSV), vírus da hepatite B (HBV), as repetições de terminal longo (LTR) e vírus de leucemia de Moloney e outros retrovírus e o promotor de timidino quinase de vírus simplex da herpes. Outros promotores constitutivos são conhecidos dos técnicos comuns no assunto.
[000120] Os promotores úteis como sequências de expressão genética de acordo com a presente invenção também incluem promotores indutíveis. Promotores indutíveis são expressos na presença de agentes indutores. Metalotiona em promotor, por exemplo, é induzida para promover a transcrição e a tradução na presença de certos íons metálicos. Outros promotores indutíveis são conhecidos dos técnicos comuns no assunto.
[000121] Geralmente, a sequência de expressão genética deverá incluir, conforme o necessário, sequências sem transcrição 5’ e sem tradução 5’ envolvidas com o início da transcrição e tradução, respectivamente, tais como caixa TATA, sequência de tamponamento, sequência de CAAT e similares. Especialmente, essas sequências sem transcrição 5’ incluirão uma região promotora que inclui uma sequência promotora para controle de transcrição do ácido nucleico unido operacionalmente. As sequências de expressão genética incluem opcionalmente sequências aprimoradoras ou sequências ativadoras acima no fluxo conforme o desejado. Da forma utilizada no presente, afirma-se que a sequência de ácidos nucleicos que codifica a imunocitoquina de acordo com a presente invenção e a sequência de expressão genética são “ligadas operacionalmente” quando ligadas covalentemente de forma a colocar a expressão ou transcrição e/ou tradução da imunocitoquina de acordo com a presente invenção sob a influência ou controle da sequência de expressão genética.
[000122] Afirma-se que duas sequências de DNA são ligadas operacionalmente se a indução de um promotor na sequência de expressão genética 5’ resultar na transcrição da imunocitoquina de acordo com a presente invenção e caso a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA (1) não resulte na introdução de mutação de troca de quadros; (2) não interfira com a capacidade da região promotora de dirigir a transcrição da imunocitoquina de acordo com a presente invenção; ou (3) não interfira com a capacidade do transcrito de RNA correspondente de ser traduzido em uma proteína. Portanto, uma sequência de expressão genética seria ligada operativamente a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a imunocitoquina de acordo com a presente invenção se a sequência de expressão genética fosse capaz de realizar transcrição daquela sequência de ácidos nucleicos, de tal forma que o transcrito resultante seja traduzido no polipeptídeo desejado.
[000123] Convenientemente, a mencionada sequência de ácidos nucleicos compreende um intron, pois as moléculas pré-mRNA frequentemente demonstraram aumento do rendimento de produção de moléculas recombinantes. Qualquer sequência de intron pode ser utilizada e pode-se mencionar, por exemplo, as descritas em Zago et al (Biotechnol. Appl. Biochem., vol. 52 (Parte 3), págs. 191-8, 2009) e em Campos-da-Paz et al (Mol. Biotechnol., vol. 39 (2), págs. 155-8, 2008).
[000124] A codificação de ácidos nucleicos para a imunocitoquina de acordo com a presente invenção pode ser fornecida somente in vivo ou em associação com um vetor.
[000125] Em terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende um ácido nucleico conforme descrito acima.
[000126] No seu sentido mais amplo, “vetor” é qualquer veículo capaz de facilitar a transferência do ácido nucleico que codifica a imunocitoquina de acordo com a presente invenção para as células. Preferencialmente, o vetor transporta o ácido nucleico para células com degradação reduzida com relação à extensão de degradação que resultaria na ausência do vetor. Geralmente, os vetores úteis na presente invenção incluem, mas sem limitações, plasmídeos, cosmídeos, fagomídeos, epissomos, cromossomos artificiais, vírus e outros veículos derivados de fontes virais ou bacterianas que tenham sido manipuladas por meio da inserção ou incorporação das sequências de ácidos nucleicos de imunocitoquinas.
[000127] Vetores de plasmídeo são um tipo preferido de vetor, foram extensamente descritos na técnica e são bem conhecidos dos técnicos no assunto. Vide, por exemplo, Sanbrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Exemplos não limitadores de plasmídeos incluem pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 e pBlueScript, e outros plasmídeos são bem conhecidos dos técnicos comuns no assunto. Além disso, plasmídeos podem ser projetados especificamente utilizando enzimas de restrição e reações de ligação para remover e adicionar fragmentos específicos de DNA.
[000128] Preferencialmente, o vetor de ácido nucleico pode incluir marcadores selecionáveis que são ativos em células de mamíferos e bactérias.
[000129] Em quarto aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira geneticamente elaborada com o ácido nucleico ou com o vetor descrito anteriormente.
[000130] Da forma utilizada no presente, a expressão “célula hospedeira geneticamente elaborada” designa células hospedeiras que tenham sofrido transdução, transformação ou transfecção com o ácido nucleico ou com o vetor descrito anteriormente.
[000131] Como exemplos representativos de células hospedeiras apropriadas, pode-se mencionar células bacterianas, tais como E. coli, células fúngicas como levedura, células de insetos tais como Sf9, células de animais tais como CHO ou COS, células vegetais etc. A seleção de hospedeiros apropriados é considerada dentro do escopo dos técnicos no assunto a partir dos ensinamentos do presente.
[000132] Preferencialmente, a célula hospedeira geneticamente elaborada é uma célula animal e, de preferência superior, uma célula CHO-S (Invitrogen, cat. n° 11619-012).
[000133] Células de ovário de hamster chinês (CHO) são frequentemente utilizadas na indústria biofarmacêutica para fabricação de produtos biológicos tais como proteínas recombinantes, anticorpos, pepticorpos e ligantes receptores. Uma das razões pelas quais as células de CHO são frequentemente utilizadas é o fato de que essas células possuem extenso registro de segurança para a elaboração de produtos biológicos. Esta é considerada uma linhagem celular bem caracterizada e, como resultado, o teste de segurança necessário pode ser menos rigoroso em alguns aspectos (tais como segurança retroviral) que o necessário para outros tipos de células. A produção de interleucina 15, entretanto, é muito difícil, especialmente nesta célula.
[000134] A introdução do ácido nucleico ou do vetor descrito anteriormente na célula hospedeira pode ser realizada por meio de métodos bem conhecidos dos técnicos no assunto, tais como transfecção de fosfato de cálcio; transfecção mediada por DEAE-Dextran ou eletroporação.
[000135] A presente invenção também se refere a um método de produção de células hospedeiras geneticamente elaboradas que expressam uma imunocitoquina de acordo com a presente invenção, em que o mencionado método compreende as etapas de: (i) introdução in vitro ou ex vivo de um ácido nucleico ou vetor conforme descrito acima em uma célula hospedeira; (ii) cultivo in vitro ou ex vivo da célula hospedeira recombinante geneticamente elaborada obtida; e (iii) opcionalmente, seleção das células que expressam e/ou secretam a mencionada imunocitoquina. Essas células hospedeiras recombinantes podem ser utilizadas para a produção de imunocitoquinas de acordo com a presente invenção.
[000136] Composição farmacêutica que compreende a imunocitoquina de acordo com a presente invenção.
[000137] Um objeto adicional da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende a imunocitoquina conforme descrito acima, um ácido nucleico que o codifica ou um vetor que compreende o mencionado ácido nucleico, eventualmente associado a um veículo farmaceuticamente aceitável.
[000138] A expressão “farmaceuticamente aceitável” designa composições e entidades moleculares que são fisiologicamente toleráveis e tipicamente não produzem reações alérgicas ou indesejáveis similares, tais como perturbações gástricas, vertigens e similares quando administradas a seres humanas. Preferencialmente, conforme utilizado no presente, a expressão “farmaceuticamente aceitável” indica aprovável por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou relacionado na Farmacopeia dos Estados Unidos ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, mais especificamente em seres humanos.
[000139] O termo “veículo” designa solvente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o composto é administrado. Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo de origem animal, vegetal, sintética ou de petróleo, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares.
[000140] A composição farmacêutica compreende “quantidade eficaz” da imunocitoquina de acordo com a presente invenção, em que essa quantidade eficaz é suficiente para inibir o crescimento de células de câncer, preferencialmente suficiente para induzir a regressão do crescimento de tumores. As doses empregadas para administração podem ser adaptadas em função de diversos parâmetros, particularmente em função do modo de administração empregado, da patologia relevante ou, alternativamente, da duração desejada do tratamento. Naturalmente, a forma da composição farmacêutica, a via de administração, a dosagem e o regime naturalmente dependem da condição a ser tratada, da severidade da doença, da idade, peso e sexo do paciente etc. As faixas de doses eficazes fornecidas abaixo não se destinam a limitar a presente invenção e representam faixas de dosagem preferidas. A dose preferida pode, entretanto, ser dirigida ao paciente individual, como é compreendido e pode ser determinado pelos técnicos no assunto, sem experimentação indevida.
[000141] Em vista da notável eficiência da imunocitoquina de acordo com a presente invenção, os técnicos podem planejar o uso de doses muito pequenas para o tratamento de pacientes. Como exemplo não limitador, a imunocitoquina de acordo com a presente invenção pode ser administrada por meio de injeção em dose compreendida entre 50 mg/kg e 5 μg/kg de paciente, preferencialmente em dose compreendida entre 10 mg/kg e 100 μg/kg e, de preferência superior, em dose compreendida entre 2,5 mg/kg e 500 μg/kg.
[000142] Como exemplo, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser formuladas para administrações tópicas, orais, intranasais, intraoculares, intravenosas, intramusculares, intratumorais ou subcutâneas e similares. Preferencialmente, a composição farmacêutica contém veículos que são farmaceuticamente aceitáveis para uma formulação destinada a injeção. Estas podem ser particularmente soluções isotônicas, estéreis, salinas (fosfato monossódico ou dissódico, cloreto de sódio, potássio, cálcio ou magnésio e similares ou misturas desses sais) ou composições secas, especialmente secas por congelamento, que, mediante adição, dependendo do caso, de água esterilizada ou solução salina fisiológica, permitem a constituição de soluções injetáveis. Veículos farmacêuticos apropriados são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences de E. W. Martin.
[000143] A imunocitoquina de acordo com a presente invenção, ácidos nucleicos que a codificam ou vetores de ácidos nucleicos podem ser solubilizados em tampão ou água ou incorporados em emulsões, microemulsões, hidrogéis (tais como hidrogéis com base em copolímeros tribloco de PLGA-PEG-PLGA), em microesferas, nanoesferas, micropartículas, nanopartículas (por exemplo, ácido (póli)láctico coglicólico), micropartículas (por exemplo, ácido poliláctico (PLA); ácido (póli)láctico coglicólico) (PLGA); microesferas de poliglutamato, nanoesferas, micropartículas ou nanopartículas), em lipossomos ou outras formulações galênicas. Em todos os casos, a formulação deve ser estéril e fluida até o ponto de capacidade aceitável de injeção por seringa. Ela deve ser estável sob condições de fabricação e armazenagem e preservada contra a ação de contaminação de microorganismos, tai como bactérias e fungos.
[000144] Soluções dos compostos ativos como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água adequadamente misturada com tensoativo, tal como hidroxipropilcelulose.
[000145] Dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, suas misturas e em óleos. Sob condições normais de uso e armazenagem, essas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de micro-organismos.
[000146] As imunocitoquinas de acordo com a presente invenção podem ser formuladas em uma composição em forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácidos (formados com os grupos amino livres da proteína) que são formados com ácidos inorgânicos, tais como ácidos clorídricos ou fosfóricos, ou com ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares. Sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e similares.
[000147] O veículo pode também ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido e similares), suas misturas apropriadas e óleos vegetais. As imunocitoquinas de acordo com a presente invenção podem também ser modificadas, por exemplo, por meio de pegilação, de forma a aumentar a sua biodisponibilidade. Quando a imunocitoquina de acordo com a presente invenção possuir forma de ácido nucleico, o veículo pode também ser um vetor tal como vírus (por exemplo, MVA, rAAV, lentivírus etc.).
[000148] A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, utilizando um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e utilizando tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser causada por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, tais como parabens, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, tais como açúcares ou cloreto de sódio.
[000149] Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser causada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio, gelatina, polióis e formulações covalentes e não covalentes ampliadoras da meia vida.
[000150] Existem diversas causas de degradação ou instabilidade de peptídeos, incluindo hidrólise e desnaturação. A interação hidrofóbica pode causar aglomeração de moléculas entre si (ou seja, agregação). Podem ser adicionados estabilizantes para reduzir ou evitar esses problemas.
[000151] Estabilizantes incluem ciclodextrina e seus derivados (vide a Patente Norte-Americana n° 5.730.969). Conservantes apropriados tais como sacarose, manitol, sorbitol, tre-halose, dextran e glicerina podem também ser adicionados para estabilizar a formulação final. Pode-se adicionar à formulação um estabilizante selecionado a partir de tensoativos iônicos e não iônicos, D-glicose, D-galactose, D-xilose, ácido D-galacturônico, tre-halose, dextrans, hidroxietil amidos e suas misturas. A adição de sal de metal alcalino ou cloreto de magnésio pode estabilizar um peptídeo. O peptídeo pode também ser estabilizado por meio de contato com um sacarídeo selecionado a partir do grupo que consiste em dextran, condroitina, ácido sulfúrico, amido, glicogene, dextrina e sal de ácido algínico. Outros açúcares que podem ser adicionados incluem monossacarídeos, dissacarídeos, álcoois de açúcar e suas misturas (por exemplo, glicose, manose, galactose, frutose, sacarose, maltose, lactose, manitol e xilitol). Polióis podem estabilizar um peptídeo e são miscíveis em água ou hidrossolúveis. Polióis apropriados podem ser póli-hidróxi álcoois, monossacarídeos e dissacarídeos, incluindo manitol, glicerol, etileno glicol, propileno glicol, trimetil glicol, vinil pirrolidona, glicose, frutose, arabinose, manose, maltose, sacarose e seus polímeros. Vários excipientes podem também estabilizar peptídeos, incluindo albumina de soro, aminoácidos, heparina, ácidos graxos e fosfolipídios, tensoativos, metais, polióis, agentes redutores, agentes quelantes metálicos, polivinil pirrolidona, gelatina hidrolisada e sulfato de amônio.
[000152] A promessa de terapia de citoquina é realmente derivada da identificação dessas citoquinas inovadoras, mas, ainda mais fundamentalmente, o campo beneficia-se muito da quantidade sempre crescente de dados pré-clínicos que demonstram convincentemente efeitos biológicos inovadores e/ou sinérgicos, que podem ser atingidos por meio do uso de diversas combinações de citoquinas com capacidades estimulantes da imunicidade complementares. Potenciais combinações de agente ativo terapêutico com imunocitoquinas com base em RLI incluem, por exemplo, agentes quimioterapêuticos, agentes antiangiogênicos ou agentes imunomoduladores.
[000153] Em uma realização preferida, a composição de acordo com a presente invenção pode compreender um agente ativo terapêutico adicional, como agentes quimioterapêuticos, agentes antiangiogênicos ou agentes imunomoduladores.
[000154] Para agentes quimioterapêuticos, demonstrou-se que seus efeitos terapêuticos poderão ser mediados, em parte, pelo efeito indireto sobre as reações imunológicas, seja por meio de indução da morte de células imunogênicas, equilíbrio dos ambientes imunossupressivos, redução de volume do tumor grande primário e, em seguida, possibilitando o ataque imune em seguida ou induzindo linfopenia transitória seguida por linfoproliferação homeostática. Muito deles são conhecidos pelos técnicos no assunto e, como exemplo de agente quimioterapêutico que pode ser combinado com a imunocitoquina de acordo com a presente invenção, pode-se citar fludarabina, gencitabina, capecitabina, metotrexato, taxol, taxotere, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiureia, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureias, complexos de platina tais como cisplatina, carboplatina e oxaliplatina, mitomicina, dacarbazina, procarbizina, etoposida, teniposida, campatecinas, bleomicina, doxorubicina, idarubicina, daunorubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, L-asparaginase, doxorubicina, epimbicina, 5-fluorouracil, taxanos tais como docetaxel e paclitaxel, leucovorina, levamisol, irinotecan, estramustina, etoposida, mostardas de nitrogênio, BCNU, nitrosoureias tais como carmustina e lomustina, vinca alcaloides tais como vimblastina, vincristina e vinorelbina, mesilato de imatimib, hexametilmelamina, topotecan, inibidores da quinase, inibidores da fosfatase, inibidores da ATPase, tirfostinas, inibidores da protease, inibidores hermibicina A, genisteína, erbstatina e lavendustina A.
[000155] Para agentes antiangiogênicos, demonstrou-se que eles possuem efeitos não dirigidos sobre o sistema imunológico e poderão possibilitar em seguida as reações imunológicas de tumores. Como exemplo de agente antiangiogênico que pode ser combinado com a imunocitoquina de acordo com a presente invenção, pode-se mencionar drogas dirigidas ao receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR) por meio da sua tirosino quinase, tal como sorafenib, sunitinib e pazopanib ou o alvo mamífero de rapamicina (mTOR), tal como tensirolimus e everolimus.
[000156] Para agentes imunomoduladores que podem ser combinados com a imunocitoquina de acordo com a presente invenção, pode-se mencionar citoquinas (IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21, GM-CSF, G-CSF, IFNα,...), quemoquinas/citoquinas antiangiogênicas (IP10, Mig, SDF-1, RANTES,...), agonistas de TLR e anticorpos imunorreguladores (anti-CTLA4, anti-PD1, anti-TGFb, agonista anti-CD40,...).
USOS E MÉTODOS TERAPÊUTICOS
[000157] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica conforme descrito anteriormente para o tratamento de câncer em pacientes, preferencialmente de uma composição farmacêutica que compreende uma imunocitoquina conforme descrito anteriormente.
[000158] Da forma utilizada no presente, o termo “paciente” indica mamífero tal como roedor, felino, canino ou primata, de preferência superior ser humano.
[000159] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se aos produtos que contêm: i. imunocitoquina conforme descrito acima, sequência de ácidos nucleicos que a codifica ou vetor que compreende essa sequência de ácidos nucleicos; e ii. agente terapêutico, preferencialmente agente anticâncer; na forma de preparação combinada para uso simultâneo, separado ou sequencial para o tratamento de câncer em pacientes.
[000160] Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de câncer em pacientes que compreende a etapa de administração ao mencionado paciente de composição farmacêutica conforme descrito anteriormente.
[000161] Em aspecto final, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de câncer que compreende a etapa de administração simultânea, separada ou sequencial a pacientes dele necessitados de quantidade terapeuticamente eficaz de: i. imunocitoquina conforme descrito acima, sequência de ácidos nucleicos que a codifica ou vetor que compreende essa sequência de ácidos nucleicos; e ii. agente terapêutico, preferencialmente agente anticâncer.
[000162] No contexto da presente invenção, o termo “tratamento”, da forma utilizada no presente, indica reversão, alívio, inibição do progresso ou evitar o distúrbio ou condição ao qual se aplica esse termo ou um ou mais sintomas desse distúrbio ou condição. A expressão “tratamento de câncer”, da forma utilizada no presente, indica a inibição do crescimento de células cancerosas. Preferencialmente, esse tratamento também leva à regressão do crescimento de tumores, ou seja, à redução do tamanho de tumores mensuráveis. De preferência superior, esse tratamento leva à completa regressão do tumor.
[000163] Preferencialmente, o mencionado câncer é carcinoma ou câncer do pulmão.
[000164] De preferência superior, a expressão “tratamento de câncer” indica “tratamento de câncer por meio da ativação de linfócitos infiltrados em tumores”.
[000165] Consequentemente, o câncer corresponde preferencialmente a câncer vascularizado.
[000166] De maior preferência, o mencionado câncer possui população de TIL anérgica, em que o mencionado câncer corresponde a câncer avançado tal como carcinoma das células renais (RCC).
[000167] A presente invenção é descrita a seguir com mais detalhes com referência a sequências de aminoácidos, sequências de ácidos nucleicos e exemplos. Não se pretende, entretanto, limitação da presente invenção pelos detalhes dos exemplos. A presente invenção refere-se a qualquer realização que compreende detalhes que não são explicitamente mencionados nos exemplos do presente, mas que os técnicos no assunto encontram sem esforços indevidos.
EXEMPLOS 1. MODULOQUINAS COM BASE EM RLI CONSTRUÇÃO DE IMUNOCITOQUINAS RLI ANTI-PD-1 (HBAT)
[000168] Plasmídeo de expressão que codifica a cadeia leve anti-PD- 1 (correspondente a um dentre CT-01 1 (hBAT ou hBAT-1). As sequências de cadeia pesada IgG quimérica do anticorpo foram projetadas para fusão em terminal 3’ com ou sem um ligante de 22 aminoácidos (SEQ ID N° 16) a IL15 (SEQ ID N° 3, em que o aminoácido na posição 93 é K). Essas sequências de nucleotídeos foram sintetizadas e clonadas em plasmídeos pcDNA3.1 pela Geneart. A sequência completa de cadeias leves e pesadas do anticorpo anti-PD-1 foi descrita no pedido de patente internacional WO 2009/101611.
PREPARAÇÃO DE DNA DE PLASMÍDEO E REAGENTE DE TRANSFECÇÃO.
[000169] PEI linear de 40 kDa foi obtido da Polyscience. Foi preparada uma solução padrão de 1 mg/ml por meio de dissolução do PEI em água com aquecimento, neutralização por NaOH e esterilização por meio de filtragem através de um filtro de 0,22 μm. A solução padrão foi parcelada e armazenada a -20 °C.
[000170] DNA de plasmídeos para transfecções foi purificado utilizando os kits de purificação de plasmídeos seguindo o protocolo do fabricante (Macherey-Nagel) e esterilização por meio de filtragem através de um filtro de 0,22 μm.
PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DAS IMUNOCITOQUINAS 1. T RANSFECÇÃO TRANSITÓRIA EM SUSPENSÃO
[000171] Células de CHO-S mantidas rotineiramente (Invitrogen) foram semeadas em densidade de 1 x 106 células/ml em meio PowerCHO2 (Lonza) e cultivadas por uma noite a 37 °C em um incubador de agitação (100 rpm) com CO2 a 5%. Para transfecção, as células foram diluídas em seguida a 2 x 106 células/ml em meio CD-CHO (Invitrogen). Os complexos de transfecção foram preparados em 10% do volume de cultivo utilizando 150 mM de NaCl. DNA de construções de expressão (2,5 mg/l de volume de cultivo, utilizando razão 1:2 entre plasmídeo que codifica cadeia pesada e plasmídeo que codifica cadeia leve) foi misturado com PEI diluído em NaCl (10 mg/l de volume de cultivo final) e incubado por dez minutos à temperatura ambiente antes da adição ao cultivo. Células foram cultivadas em um incubador de agitação (130 rpm) a 37 °C por cinco horas antes de dobrar o volume de cultivo com meio PowerCHO2. Sobrenadantes foram coletados cinco dias após a transfecção.
2. T RANSFECÇÃO ESTÁVEL SOBRE CÉLULAS ADERENTES
[000172] Células CHO-K1 (ATCC n° CCL-61) foram cultivadas em DMEM suplementado com L-glutamina, 10% de FCS e penicilina (100 unidades/ml)/estreptomicina (100 μg/ml) e transfectadas com cada vetor utilizando reagente lipofectamina 2000 (Invitrogen), conforme recomendado pelo fabricante. Clones foram selecionados por meio de diluição de limite com meio contendo geneticina e higromicina (0,5 mg/ml) ou blasticina e higromicina (5 μg/ml e 100 μg/ml) para o ICK acetilado por anti-GD20 e ICK anti-CD20, respectivamente. Sobrenadante de cultivo de cada clone foi testado para determinar a produção de proteínas bifuncionais por meio de ELISA. Para a produção de ICK, clones selecionados foram amplificados em meio DMEM a 25% e meio AIM a 75% (Invitrogen). Células foram mantidas em 100% de AIM e o sobrenadante foi coletado e substituído a cada dois dias, por dez dias.
3. PURIFICAÇÃO DE SOBRENADANTES
[000173] Sobrenadantes coletados foram centrifugados a 3000 rpm por vinte minutos a 4 °C, equilibrados sob pH 7,8 com NaOH e filtrados através de um filtro de 0,22 μm. Os meios condicionados foram purificados por meio de cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de proteína A (GE) de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas purificadas foram concentradas com unidades de 50 kDa de Amicon (Millipore). Durante esta etapa, o tampão de eluição foi substituído por PBS. As proteínas purificadas foram finalmente testadas por meio de ELISA e medição da absorção a 280 nm. A pureza foi avaliada por meio de eletroforese.
4. DETECÇÃO DA PORÇÃO DE IMUNOGLOBULINA POR MEIO DE ELISA
[000174] Placas de microtítulos com fundo plano Maxisorp (Nunc) foram revestidas com 100 μl de anticorpo anti-humano de cabra (UP892370, Interchim) diluídos em PBS a 1,5 μg/ml por uma hora a 4 °C. A placa foi bloqueada em seguida com 200 μl de tampão de bloqueio (1% BSA + 0,1% TWEEN 20 em PBS) por uma hora a 37 °C. A placa foi lavada em seguida por três vezes com tampão de lavagem (0,1% TWEEN 20 em PBS) e a amostra diluída em tampão de bloqueio foi adicionada e incubada por trinta minutos a 37 °C (100 μl). Após três lavagens, IgG1 anti-humano de cabra conjugado a peroxidase (109-036-003, Jackson) diluído a 1:10000 foi adicionado e incubado por trinta minutos a 37 °C. Utilizou-se substrato TMB (Interchim) para determinar os níveis de proteína e as placas foram lidas a 450 nm. Utilizou-se rituximab purificado (Roche) para gerar uma curva padrão sobre placa.
5. DETECÇÃO DA PORÇÃO DE CITOQUINA POR MEIO DE ELISA
[000175] Placas de microtítulos com fundo plano Maxisorp (Nunc) foram revestidas com 100 μl do B-E29 anti-IL15 (Diaclone) diluídos em tampão de carbonato a 2 μg/ml por dezesseis horas a 4 °C. A placa foi bloqueada em seguida com 200 μl de tampão de bloqueio (1% BSA em PBS) por uma hora a 37 °C. A placa foi lavada em seguida por três vezes com tampão de lavagem (0,05% Tween 20 em PBS). Amostra diluída em TBS+0,05% BSA foi adicionada e incubada por 1h30min a 37 °C (100 μl). Após três lavagens, anticorpo anti-IL15 biotinilado BAM 247 (R&D System) diluído a 200 ng/ml foi adicionado e incubado por 1h30min a 37 °C. A placa foi lavada por três vezes e adicionou-se estreptavidina conjugada a peroxidase em diluição 1:1000. Utilizou-se substrato TMB (Interchim) para determinar os níveis de proteína e as placas foram lidas a 450 nm. Utilizou-se IL-15 (Peprotech) para gerar curva padrão sobre a placa.
FENÓTIPOS DE TILS
[000176] Linfócitos infiltrados em tumores (TILs) foram obtidos de biópsias ou tecidos nefrectômicos derivados de dois pacientes com carcinoma das células renais após digestão de DNAse e colagenase. Esses TILs foram, em sua maioria, anérgicos, permitindo a progressão de tumores.
[000177] O fenótipo desses TILs com relação a PD-1, Tim-3 e IL- 15Rα foi determinado por meio de imunofluorescência.
[000178] A Figura 1 exibe o fenótipo obtido para o paciente A (Fig. 1A) e para o paciente B (Fig. 1B).
ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DAS IMUNOCITOQUINAS
[000179] A ligação específica da moduloquina RLI anti-PD-1 foi determinada por meio de citometria de fluxo. A capacidade da moduloquina de ligar receptor de IL-15 sobre células efetoras foi testada sobre Kit225. Moduloquina revestida sobre células dirigidas foi revelada com mAb IgG anti- humano de cabra conjugado a PE (PN IM0550, Beckman Coulter) ou com um anticorpo anti-IL15 de camundongo biotinilado (BAM247, R&D System) acoplado a PE-estreptavidina (Sigma-Aldrich). Células dirigidas (1 x 105) foram incubadas com cada ICK por uma hora a 4 °C, lavadas e incubadas em seguida com conjugado de PE por uma hora a 4 °C. Células lavadas foram finalmente analisadas em Facscalibur (Becton Dickinson).
[000180] Os resultados demonstraram que a moduloquina liga-se ao receptor IL-15 e também a PD-1.
ATIVIDADE DE PROLIFERAÇÃO DAS IMUNOCITOQUINAS
[000181] A atividade de proliferação mediada por interleucina 15 da moduloquina obtida foi testada e comparada com RLI. As reações proliferativas de células Kit 225 e 32Dβ e ICK foram medidas por meio da incorporação de [3H] timidina. As células foram mantidas em meio de cultivo por três dias, lavadas duas vezes e mantidas sem recursos em meio sem citoquina por 24 horas ou 4 h para Kit 225 e 32Dβ, respectivamente. Elas foram semeadas em seguida em placas com múltiplas cavidades a 104 células/cavidade em 100 μl e cultivadas por 48 horas em meio suplementado com concentração crescente de amostra. rIL-15 e RLI humano foram utilizados como calibrador. Células foram pulsadas por dezesseis horas com 0,5 μCi/cavidade de [3H] timidina, colhidas sobre filtros de fibra de vidro e foi medida a radioatividade associada a células. Os resultados confirmaram que a atividade de proliferação da moduloquina foi comparável com a de RLI.
FORTE REATIVAÇÃO DE TILs PELA MODULOQUINA RLI
[000182] Linfócitos infiltrados em tumores (TILs) foram obtidos de biópsias ou tecidos nefrectômicos derivados de 25 pacientes com carcinoma das células renais após digestão de DNAse e colagenase. Esses TILs foram, em sua maioria, anérgicos, permitindo a progressão de tumores.
[000183] A reativação de TILs dos 25 pacientes foi testada por meio de incubação dos mencionados TILs na ausência ou na presença da mesma molaridade para cada paciente de RLI, HBAT (CT011 = anticorpo anti- PD1), HBAT-RLI (moduloquina) ou a combinação de HBAT e RLI. RLI foi utilizado a 1 μg/ml para os pacientes 1-8 e, em seguida a 300 ng/ml para os pacientes 9-25.
[000184] Os sobrenadantes foram coletados em 48 horas após o estímulo e a reativação foi determinada por meio de medição por ELISA da concentração de IFNY no sobrenadante.
[000185] Os dados brutos dos 25 TILs derivados de pacientes com carcinoma das células renais são apresentados na Tabela 1, exceto pelos TILs não estimulados, que sempre secretaram menos de 20 pg/ml de IFNY.TABELA 1 COMBINAÇÃO
[000186] A Figura 2 exibe IFNY médio e mediano produzido a partir de TIL ativado com RLI, HBAT, HBAT-RLI e HBAT+RLI (* p < 0,05).
[000187] Os resultados demonstram que quase nenhuma ativação de TIL foi obtida com o anticorpo anti-PD-1 isoladamente. Alguma ativação de TIL foi obtida com RLI isolado ou em combinação com o anticorpo anti-PD1. Agora e surpreendentemente, foi obtida ativação forte e geral em comparação com RLI e também RLI+HBAT com a imunocitoquina de acordo com a presente invenção (Tabela 1 e Figura 2).
[000188] Esses resultados permitem a idealização de novas terapias.
AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA MODULOQUINA NO MODELO DE TUMOR EXPERIMENTAL DE CARCINOMA CT26
[000189] CT26 é uma linhagem de células de carcinoma de camundongo do cólon não diferenciadas induzidas por n-nitroso-n-metiluretano- (nnmu).
[000190] Camundongos BALB/C serão injetados por via subcutânea sobre o flanco direito com células de tumor CT26 (2,105/camundongo).
[000191] No dia 9, quando os tumores atingiram 20-30 mm2, diferentes grupos de camundongos são tratados com 16 ou 32 μg/camundongo do anti-PD1-RLI de moduloquina isolado em comparação com concentrações equimolares do anti-PD1 isoladamente, RLI isoladamente (1004-14p) e da combinação entre anti-PD1 e RLI ou PBS no grupo controle.
[000192] A moduloquina ou RLI isolado são injetados a partir do dia 9 duas vezes por semana por quatro semanas. O anticorpo anti-PD1 isolado é injetado a partir do dia 9 e, em seguida, uma vez por semana por quatro semanas. No grupo de combinação, o anticorpo anti-PD1 é injetado a partir do dia 9 e, em seguida, uma vez por semana por quatro semanas e RLI a partir do dia 15 e, em seguida, duas vezes por semana por três semanas. Os tumores são medidos três vezes por semana com compasso e a área do tumor foi calculada conforme segue: comprimento x largura. Os camundongos são sacrificados quando o tamanho do tumor atingiu 300 mm2 ou sofreram úlcera. Serão determinados o crescimento do tumor primário, sobrevivência e, eventualmente, regressão. Grupos controle receberam dose correspondente de isótipo de anticorpo ou conjugado de anticorpo e RLI irrelevante (anti-HER2-RLI).
[000193] Camundongos BALB/C foram injetados por via subcutânea sobre o flanco direito com células de tumor CT26 (2x105/camundongo). No dia 9, quando os tumores atingiram 20-30 mm2, os camundongos foram tratados por via intraperitoneal com 16 ou 32 μg/camundongo do anti-PD-L1 -RLI de moduloquina isolado em comparação com concentrações equimolares do anti-PD-L1 (clone 10 F.9G2, BIO-XCELL) isoladamente, RLI isoladamente (1004-14p) e da combinação entre anti-PD-L1 (clone 10 F.9G2, BIO-XCELL) e RLI ou PBS no grupo controle.
[000194] A moduloquina ou RLI isolado são injetados a partir do dia 9 duas vezes por semana por quatro semanas. O anticorpo anti-PD1 isolado é injetado a partir do dia 9 e, em seguida, uma vez por semana por quatro semanas. No grupo de combinação, o anticorpo anti-PD1 é injetado a partir do dia 9 e, em seguida, uma vez por semana por quatro semanas e RLI a partir do dia 15 e, em seguida, duas vezes por semana por três semanas. Os tumores são medidos três vezes por semana com compasso e a área de tumor foi calculada conforme segue: comprimento x largura. Os camundongos são sacrificados quando o tamanho do tumor atingiu 300 mm2 ou quando sofreram ulceração. Serão determinados o crescimento do tumor primário, sobrevivência e eventualmente regressão. Grupos controle receberam dose correspondente de isótipo de anticorpo ou conjugado de anticorpo e RLI irrelevante (anti-HER2-RLI).
AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA MODULOQUINA NO MODELO DE TUMOR EXPERIMENTAL DE TC-1 DO PULMÃO
[000195] A linhagem de células de tumor TC-1 foi derivada de células epiteliais do pulmão primárias de camundongos C57B1/6. As células foram imortalizadas com o vetor de retrovírus anfotrópico lxsn16e6e7 e transformadas em seguida com o plasmídeo pvejb que expressa o oncogene c-ha-ras humano ativado. As células são positivas para a expressão de HPV-16 E7.
[000196] Camundongos C57B1/6 serão injetados por via subcutânea sobre o flanco direito com células de tumor TC-1 (1x105/camundongo). No dia 9, quando os tumores atingiram 20-50 mm2, diferentes grupos de camundongos são tratados com 16 ou 32 μg/camundongo do anti-PD1-RLI de moduloquina isolado em comparação com concentrações equimolares do anti-PD1 isoladamente, RLI isoladamente (1004-14p) e da combinação entre anti-PD1 e RLI ou PBS no grupo controle. A moduloquina ou RLI isolado são injetados a partir do dia 9 duas vezes por semana por quatro semanas. O anticorpo anti-PD1 isolado é injetado a partir do dia 9 e, em seguida, uma vez por semana por quatro semanas. No grupo de combinação, o anticorpo anti-PD1 é injetado a partir do dia 9 e, em seguida, uma vez por semana por quatro semanas e RLI a partir do dia 15 e, em seguida, duas vezes por semana por três semanas. Os tumores são medidos três vezes por semana com compasso e a área de tumor foi calculada conforme segue: comprimento x largura. Os camundongos são sacrificados quando o tamanho do tumor atingiu 300 mm2 ou quando sofreram ulceração. São determinados o crescimento do tumor primário, sobrevivência e eventualmente regressão.
AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA MODULOQUINA NO MODELO DE TUMOR EXPERIMENTAL DE B16F10 DE MELANOMA METASTÁTICO
[000197] Tumores B16F10 são implantados por meio da injeção de 3x104 células B16F10 no flanco de camundongos C57BL/6, i. d. no dia 0. Após manutenção das células de tumor em enxerto, a terapia é iniciada no dia 4. A moduloquina anti-PD-L1-RLI é injetada por via intraperitoneal a 16 ou 32 μg/camundongo em comparação com concentrações equimolares do anti-PD-L1 isolado (clone 10F.9G2, BIO-XCELL), RLI isolado (1004-14p), a combinação entre anti-PD-L1 (clone 10F.9G2, BIO-XCELL) e RLI ou PBS no grupo controle.
[000198] A moduloquina, o mAb anti-PD-L1, RLI ou a combinação de mAb anti-PD-L1 + RLI são injetados a partir do dia 4 duas vezes por semana por quatro semanas. Os tumores são medidos três vezes por semana com compasso e a área de tumor foi calculada conforme segue: comprimento x largura. Os camundongos são sacrificados quando o tamanho do tumor atingiu 300 mm2 ou quando sofreram ulceração. Serão determinados o crescimento do tumor primário, sobrevivência e eventualmente regressão. Grupos controle receberam dose correspondente de isótipo de anticorpo ou conjugado de anticorpo e RLI irrelevante (anti-HER2-RLI).
AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA MODULOQUINA NO MODELO DE TUMOR EXPERIMENTAL MB49 DE CÂNCER DA BEXIGA AVANÇADO
[000199] A linhagem de células de tumor MB49 origina-se de tumor induzido por carcinogene com origem epitelial na bexiga de camundongos machos C57BL/6. 106 células de câncer da bexiga MB49 foram injetadas por via subcutânea na derme superior nas costas de camundongos C57BL/6. O tratamento é iniciado no dia 6 após a inoculação de tumor que corresponde a quando os tumores se tornam claramente visíveis e palpáveis em tamanho de « 15 mm2. As moduloquinas anti-PD- 1-RLI e anti-PD-L1 são injetadas por via intraperitoneal a 16 ou 32 μg/camundongo em comparação com concentrações equimolares do anti-PD1 isolado, anti-PD-L1 isolado (clone 10 F.9G2, Bio-XCell), RLI isolado (1004-14p), combinação entre anti- PD1 ou anti-PD-L1 (clone 10 F.9G2, Bio-XCell) com RLI ou PBS no grupo controle.
[000200] As moduloquinas, o mAb anti-PD-1, o mAb anti-PD-L1 (clone 10 F.9G2, Bio-XCell), RLI e a combinação de mAb anti-PD-1 ou anti-PD-L1 (clone 10 F.9G2, Bio-XCell) + RLI são injetados a partir do dia 6 duas vezes por semana por quatro semanas. Os tumores são medidos três vezes por semana com compasso e a área de tumor foi calculada conforme segue: comprimento x largura. Os camundongos são sacrificados quando o tamanho do tumor atingiu 300 mm2 ou quando sofreram ulceração. Serão determinados o crescimento do tumor primário, sobrevivência e eventualmente regressão. Grupos controle receberam dose correspondente de isótipo de anticorpo ou conjugado de anticorpo e RLI irrelevante (anti-HER2-RLI).
AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA MODULOQUINA NO MODELO DE TUMOR EXPERIMENTAL 4T1 DE CÂNCER DE MAMA
[000201] Camundongos BALB/c foram inoculados com 5 x 104 células de câncer de mama 4T1 na glândula mamária no dia 0. O tratamento é iniciado no dia 6 após a inoculação de tumor que corresponde a quando os tumores se tornam claramente visíveis e palpáveis em tamanho de « 15-20 mm2. As moduloquinas anti- PD-1-RLI e anti-PD-L1 são injetadas por via intraperitoneal a 16 ou 32 μg/camundongo em comparação com concentrações equimolares do anti-PD1 isolado, anti-PD-L1 isolado (clone 10 F.9G2, Bio-XCell), RLI isolado (1004-14p), combinação entre anti-PD1 ou anti-PD-L1 (clone 10 F.9G2, Bio-XCell) com RLI ou PBS no grupo controle.
[000202] As moduloquinas, o mAb anti-PD-1, o mAb anti-PD-L1 (clone 10 F.9G2, Bio-XCell), RLI e a combinação de mAb anti-PD-1 ou anti-PD- L1 (clone 10 F.9G2, Bio-XCell) + RLI são injetados a partir do dia 10 duas vezes por semana por quatro semanas. Grupos controle receberam dose correspondente de isótipo de anticorpo ou conjugado de anticorpo e RLI irrelevante (anti-HER2-RLI). Os tumores são medidos três vezes por semana com compasso e a área de tumor foi calculada conforme segue: comprimento x largura. Os camundongos foram sacrificados no dia 27. Nódulos metastáticos do pulmão são contados sob um microscópio binocular.
AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA MODULOQUINA NO MODELO DE TUMOR EXPERIMENTAL ID8 DE CÂNCER DO OVÁRIO
[000203] A linhagem de células de carcinoma do ovário ID8-VEGF foi desenvolvida anteriormente a partir de uma linhagem de células de adenocarcinoma seroso papilar epitelial do ovário de camundongo. Camundongos C57BL/6 foram implantados por via subcutânea sobre o flanco direito com 5x106 células de tumor ID8. O tratamento é iniciado no dia 10 após a inoculação de tumor que corresponde a quando os tumores se tornam claramente visíveis e palpáveis em tamanho de « 15-20 mm2. As moduloquinas anti-PD-1-RLI e anti-PD-L1 são injetadas por via intraperitoneal a 16 ou 32 μg/camundongo em comparação com concentrações equimolares do anti-PD1 isolado, anti-PD-L1 isolado (clone 10 F.9G2, Bio-XCell), RLI isolado (1004-14p), combinação entre anti-PD1 ou anti-PD-L1 (clone 10 F.9G2, Bio-XCell) com RLI ou PBS no grupo controle.
[000204] As moduloquinas, o mAb anti-PD-1, o mAb anti-PD-L1 (clone 10 F.9G2, Bio-XCell), RLI e a combinação de mAb anti-PD-1 ou anti-PD- L1 (clone 10 F.9G2, Bio-XCell) + RLI são injetados a partir do dia 10 duas vezes por semana por quatro semanas. Grupos controle receberam dose correspondente de isótipo de anticorpo ou conjugado de anticorpo e RLI irrelevante (anti-HER2-RLI). Os tumores são medidos três vezes por semana com compasso e a área de tumor foi calculada conforme segue: comprimento x largura. Os camundongos são sacrificados quando o tamanho do tumor atingiu 300 mm2 ou quando sofreram ulceração.
AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA MODULOQUINA NO MODELO DE TUMOR EXPERIMENTAL RM-1 DE CÂNCER DA PRÓSTATA
[000205] Fêmeas de camundongos C57BL/6 são inoculadas por via subcutânea com 2x105 células de câncer da próstata murinho RM-1. O tratamento é iniciado no dia 3 após a inoculação de tumor que corresponde a quando os tumores se tornam claramente visíveis e palpáveis em tamanho de « 15-20 mm2. As moduloquinas anti-PD-1-RLI e anti-PD-L1 são injetadas por via intraperitoneal a 16 ou 32 μg/camundongo em comparação com concentrações equimolares do anti-PD1 isolado, anti-PD-L1 isolado (clone 10 F.9G2, Bio-XCell), RLI isolado (1004-14p), combinação entre anti-PD1 ou anti-PD-L1 (clone 10 F.9G2, Bio-XCell) com RLI ou PBS no grupo controle.
[000206] As moduloquinas, o mAb anti-PD-1, o mAb anti-PD-L1 (clone 10 F.9G2, Bio-XCell), RLI e a combinação de mAb anti-PD-1 ou anti-PD- L1 (clone 10 F.9G2, Bio-XCell) + RLI são injetados a partir do dia 3 duas vezes por semana por quatro semanas. Grupos controle receberam dose correspondente de isótipo de anticorpo ou conjugado de anticorpo e RLI irrelevante (anti-HER2-RLI). Os tumores são medidos três vezes por semana com compasso e a área de tumor foi calculada conforme segue: comprimento x largura. Os camundongos foram sacrificados quando o tamanho do tumor atingiu 300 mm2 ou quando sofreram ulceração.

Claims (6)

1. IMUNOCITOQUINA, caracterizada por compreender: (a) um conjugado; e (b) um anticorpo imunomodulador ou seu fragmento ligado direto ou indiretamente por meio de covalência ao mencionado conjugado; em que o mencionado conjugado compreende: (i) um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da interleucina-15 de acordo com SEQ ID NO: 3; e (j) ) um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos do domínio sushi do IL-15Rα de acordo com SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, em que o anticorpo imunomodulador ou seu fragmento é um antagonista de PD-1.
2. IMUNOCITOQUINA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo mencionado anticorpo imunomodulador que inibe um receptor imunossupressivo ser selecionado a partir de antagonistas de PD-1, preferencialmente nivolumab, Merck 3745 ou CT-01 1 (também conhecido como hBAT).
3. IMUNOCITOQUINA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada por: (a) os polipeptídeos (i) e (ii) do conjugado serem ligados covalentemente em uma proteína de fusão; e (b) mencionado conjugado e o anticorpo ou seu fragmento serem ligados covalentemente em uma proteína de fusão.
4. IMUNOCITOQUINA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo mencionado conjugado compreender a sequência de aminoácidos da interleucina 15 em posição C-terminal com relação à sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα, em que a sequência de aminoácidos do conjugado ser em uma posição C-terminal com relação à sequência de aminoácidos do anticorpo ou seu fragmento.
5. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender a imunocitoquina, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, opcionalmente associado a um veículo farmaceuticamente aceitável.
6. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela mencionada composição farmacêutica ser para o tratamento de câncer em pacientes, preferencialmente um câncer avançado tal como carcinoma de células renais (RCC).
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