CN110478474B - 免疫调节剂、疫苗、细胞及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开免疫调节剂、疫苗、细胞及应用。本发明的免疫调节剂包含(a)能够与其受体结合的IL‑15或其编码核酸；(b)IL‑15受体alpha或其编码核酸；和(c)含TGF beta受体3蛋白胞外结构域的多肽或其编码核酸。本发明的免疫调节剂一方面能够与TGF‑beta结合，解除TGF‑beta对T细胞功能和DC细胞的抗原呈递的抑制作用；另一方面，IL‑15‑IL‑15Ra能够调节T细胞和NK细胞的活化和增殖，还能促进DC细胞致敏T细胞的能力，诱导出更强的抗肿瘤的特异T细胞应答，表现出比传统的DC疫苗更强的抗肿瘤效果。

Description

免疫调节剂、疫苗、细胞及应用

技术领域

本发明涉及医药制品，具体涉及免疫调节剂、疫苗、细胞和提高淋巴细胞群中TNF-a+和/或IFN-r+细胞的比例的方法。

背景技术

机体的免疫反应首先是由抗原递呈细胞(APC)捕获抗原，经过加工和处理后将抗原信息递呈给淋巴细胞，继而引发一系列的特异性免疫应答。树突状细胞(DC)是目前认为的功能最强的APC，其最大的特点是能够刺激初始型T细胞的增殖和活化，是启动、调控并维持特异性免疫应答的中心环节。在机体抗肿瘤免疫中，由T细胞介导的细胞免疫发挥着重要作用。

研究发现，肿瘤患者存在DC数量减少及功能缺陷的特点，肿瘤组织及其周围浸润DC的数量、功能与肿瘤的发生、发展、转移、预后有着密切的关系。DC密集浸润的肿瘤分化程度高，预后较好；而DC轻度浸润的肿瘤常伴有分化程度低和恶性进展。肿瘤细胞具有较高水平的Fas表达，能诱导FasL表达的淋巴细胞凋亡，并能分泌TGF-β、IL-10等免疫抑制性细胞因子，导致抗原提呈能力下降，从而逃避免疫攻击。

近年来，已经清楚了免疫***确实识别肿瘤抗原，但是尽管存在肿瘤抗原，T细胞却保持静止状态。对此有观点认为：患者体内的抗原呈递细胞，不能正确识别肿瘤抗原，将之呈递给T淋巴细胞，引起肿瘤特异的免疫应答。近年来，如何增加抗原呈递细胞的数量，提高抗原呈递细胞，特别是DC细胞摄取、转运、呈递抗原、刺激T细胞的能力，是目前肿瘤免疫研究中的一个重点。

转化生长因子-β(TGF-β)是一种多功能的细胞因子，可以影响细胞的生长、分化、凋亡等。此外，TGF-β还有重要的免疫调节作用。TGF-β可以有效的抑制T细胞功能和DC细胞的抗原呈递能力。最近的研究已经阐明了TGF-β在上调浆细胞样DC免疫调节酶吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达中的直接作用，并导致长期的T细胞耐受。通过催化必需氨基酸色氨酸的降解，IDO抑制效应T细胞的活性和促进Treg分化和活化。

转化生长因子-β(TGF-β)通过结合转化生长因子-β受体(TGFBR)复合物而进行信号转导。根据分子结构和功能特征的不同，TGFBR家族包括I型受体(TGFBR1)、II型受体(TGFBR2)和III型受体(TGFBR3)。TGFBR1/2均属于跨膜型受体丝氨酸/苏氨酸激酶家族，胞内均含有丝氨酸/苏氨酸激酶区。转化生长因子-β与TGFBR1/2异源二聚体结合后，活化下游信号分子，进而激活信号传导。TGFBR3胞内段不含有激酶活性区，不直接参与信号传导，主要是调节TGF-β与信号受体的结合，又被称为协同受体。

近年来，DC肿瘤疫苗在肿瘤的预防和治疗中方面展现了较好的应用前景。DC相关疫苗在***癌中的研究较为深入。如Sipuleucel-T直接将***癌酸性磷酸酶抗原转染DC激发机体产生特异性的抗肿瘤反应。IMPACT研究显示，尽管客观有效率评价显示治疗效果有限(<5％),Sipuleucel-T组的中位生存时间(25.8个月)要高于对照组(21.7个月)4.1个月。2010年4月，美国FDA批准Sipuleucel-T用于治疗无症状或症状轻微的转移性去势治疗无效的难治性***癌(CRPC)。

在胶质瘤中，负载自体肿瘤裂解物的DC疫苗DC-VAX-L尚在进行III期临床试验中。有电穿孔法将自体肾脏肿瘤的RNA和CD40L mRNA电转到DC的肿瘤疫苗，与靶向药物舒尼替尼联用的报道，目前也在临床试验中。近期的研究发现，DC疫苗能显著延长患者生存期。

目前有大量的使用负载了抗原的DC疫苗***的报道，从目前报道的数据来看，DC疫苗似乎代表了一种用于改善的肿瘤免疫治疗的新的非常有潜力的方法。然而，单独的DC疫苗的使用通常不能导致所期待的免疫治疗效果的改善，不能得到令人满意的临床效果。目前的临床实验表明，DC治疗性疫苗的应答率很少超过15％，总体应答率偏低。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明在深入研究后发现了一种可协同增强或提高疫苗的免疫力的免疫调节剂。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种免疫调节剂，所述免疫调节剂包含(a)-(c)三种成分：

(a)能够与其受体结合的IL-15或其编码核酸；

(b)IL-15受体alpha或其编码核酸；和

(c)含TGF beta受体3蛋白胞外结构域的多肽或其编码核酸。

在某些实施方案中，所述(a)为IL-15的编码核酸，其具有SEQ ID NO:1所示的序列。

在某些实施方案中，所述(b)为IL-15受体alpha的编码核酸，其具有SEQ ID NO:2所示的序列。

在某些实施方案中，所述(a)和(b)通过化学键连接形成一个分子。

在某些实施方案中，所述(c)成分的多肽进一步包括免疫球蛋白的Fc片段。

在某些实施方案中，所述(c)为多肽的编码核酸，其具有SEQ ID NO:3所示的序列。

本发明的第二方面，提供一种疫苗，其包含至少一种抗原或其编码核酸，和第一方面的免疫调节剂。

在某些实施方案中，所述抗原为肿瘤抗原或病原体抗原。

本发明的第三方面，提供一种细胞，其包含(a’)IL-15的编码核酸、(b’)IL-15受体alpha的编码核酸和(c’)含TGF beta受体3蛋白胞外结构域的多肽的编码核酸。

本发明的第四方面，提供一种提高淋巴细胞群中TNF-a+和/或IFN-r+细胞的比例的方法，其包括使第一方面的免疫调节剂或第二方面的疫苗作用于所述淋巴细胞群的步骤。

本发明的免疫调节剂一方面能够与TGF-beta结合，解除TGF-beta对T细胞功能和DC细胞的抗原呈递的抑制作用；另一方面，IL-15-IL-15Ra能够调节T细胞和NK细胞的活化和增殖，还能促进DC细胞致敏T细胞的能力，诱导出更强的抗肿瘤的特异T细胞应答，表现出比传统的DC疫苗更强的抗肿瘤效果。

本发明的免疫调节剂成分之间协同作用，大大增强疫苗的免疫力，可以提供免于病原体感染的保护性免疫，特别是可用于增强预防和/或者治疗多种肿瘤的效果。

附图说明

图1CD8阳性T细胞应答结果。每组柱中从左向右侧依次为CD8IFN-r+，CD8IFN-r+TNF-a+，CD8TNF-a+。

图2CD4阳性T细胞应答结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

本发明中，术语“抗原”指可以被免疫***识别，并能够通过形成抗体或/和抗原特异性T细胞而引起抗原特异的免疫应答的物质。一般地，抗原可以是包含至少一个抗原表位并且可以被主要组织相容性复合体(MHC)呈递到T细胞表面的蛋白或者多肽。在本发明中，抗原可以是mRNA翻译的产物，也可以是DNA转录翻译后的产物。

本发明中，术语“核酸”包括脱氧核糖核酸(即DNA)和核糖核酸(即RNA)。在RNA的情况下，为了防止RNA的不稳定性和多种途径的降解，根据已知的RNA多种天然降解途径，可以对核酸分子进行多种优化。例如，末端结构对mRNA的稳定是至关重要的。比如，在天然存在的mRNA的5’端，存在有修饰的鸟苷核苷酸，称之为5’帽子结构，并且3’端有一段长约200～300个碱基的腺苷核苷酸(即多聚A尾巴)结构，5’和3’端的UTR序列，比如人的beta-球蛋白的UTR序列。

[免疫调节剂]

本发明的第一方面，提供免疫调节剂，其至少包含(a)-(c)三种成分：

(a)IL-15或其编码核酸；

(b)IL-15受体alpha或其编码核酸；和

(c)含TGF beta受体3蛋白胞外结构域的多肽或其编码核酸。

本发明中，(a)、(b)和(c)三种成分的比例不特别限定，一般情况下，(a)和(b)成分的摩尔比为0.9-1.1:1，优选1:1。另外，一般情况下，(a)和(c)成分的摩尔比为0.5-1.5:1，优选0.6-1.4:1，更优选1:1。

成分(a)

本发明的成分(a)为IL-15或其编码核酸，其中，IL-15是指一种与IL-2结构类似的细胞因子，广泛表达在各种细胞和组织中，如单核细胞、巨噬细胞、DC细胞、纤维细胞等。IL-15通过与IL-15受体α结合，激活下游的JAK1，JAK3，导致下游STAT3和STAT5的磷酸化和信号通路的激活，诱导BCL2、MAP激酶通路、Lck和syk的磷酸化，导致细胞的增殖和成熟。

本发明的IL-15能够调节T细胞和NK细胞的活化和增殖，能够维持在缺乏抗原刺激下记忆性T细胞的存活。在啮齿类动物的淋巴细胞中，IL-15通过诱导BCL2L1/BCL-x(L)而抑制凋亡。同样地，在人体内也发现Il-15通过诱导BCL2和/或Bcl-xL抑制T淋巴细胞的凋亡。

本发明的IL-15包括具有全长氨基酸序列的蛋白质或其编码核酸，还包括能够与其受体结合的IL-15的截短片段或其编码核酸。即，本发明的IL-15至少包含有与受体结合的氨基酸的序列。在某些实施方案中，本发明的成分(a)为具有SEQ ID NO:1所示序列的核酸。

成分(b)

本发明的成分(b)为IL-15受体alpha或其编码核酸。如上所述，本发明的IL-15受体α与其IL-15相互结合才能激活下游的JAK1，JAK3，导致下游STAT3和STAT5的磷酸化和信号通路的激活，诱导BCL2、MAP激酶通路、Lck和syk的磷酸化，导致细胞的增殖和成熟。因此，本发明中的IL-15受体alpha至少包含与IL-15结合的氨基酸序列。本发明中的IL-15受体alpha还包括含全长氨基酸序列的IL-15受体alpha。在某些实施方案中，本发明的IL-15受体alpha为具有SEQ ID NO:2所示序列的核酸，或由其编码的蛋白。

成分(c)

本发明的成分(c)含TGF beta受体3蛋白胞外结构域的多肽或其编码核酸。成分(c)用于抑制TGF-β信号传递途径。

已知TGF beta受体3(或III型转化因子-β受体，TGFBR3)是典型的TGF-β信号传递途径的共同受体，参与介导SMAD依赖的和SMAD非依赖的下游信号途径。研究发现在许多肿瘤的早期阶段，比如乳腺癌中，TGFBR3的表达水平与患者癌旁正常组织比有明显的下调。有数据显示，在一些肿瘤模型中，TGFBR3抑制细胞的迁移和侵袭，表明TGFBR3具有抑制肿瘤进展和转移的功能。

本发明中，为了延长融合蛋白的半衰期和提高稳定性，优选地成分(c)为含TGFbeta受体3蛋白胞外结构域和免疫球蛋白的Fc片段的多肽。为了降低肾清除率，优选使用较长的Fc片段以增大分子体积。但另一方面，如果分子体积过大，则可能影响可溶性A和B片段的活性。因此，Fc片段的长度或大小影响本发明目的实现。对于本发明而言，Fc片段的长度一般为100-300AA，优选150-300AA。优选地，Fc片段至少具有SEQ ID NO:5所示的序列。更优选地，Fc片段具有SEQ ID NO:6所示的序列。还优选地，Fc片段的序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明的Fc片段可包含免疫球蛋白中天然存在的片段，还可包括通过已知的基因工程手段对天然存在的Fc片段进行改造，以获得更优性能的突变型Fc片段。例如，Fc段包含“YTE”3个突变的片段，即252、254和256位的蛋氨酸(Met，M)、丝氨酸(Ser，S)和苏氨酸(Thr，T)分别被酪氨酸(Tyr，Y)、T和谷氨酸(Glu，E)替换，由此获得半衰期更长的融合蛋白。再例如，通过对Fc片段的二硫键的基因工程改造和修饰，可以使Fc融合蛋白聚集成多聚体的复合物，由此获得稳定性更优的融合蛋白。在某些实施方案中，本发明的Fc片段为由包含SEQID NO:4所示的核酸编码。

在某些实施方案中，成分(c)为包含SEQ ID NO:3所示序列的核酸，或由其编码的蛋白。

虽然上面分别说明了成分(a)、(b)和(c)，但本领域技术人员已知只要三种成分能够协同增强免疫，但不限定三种成分的存在形式。例如，在三种成分为核酸的情况下，成分(a)、成分(b)和成分(c)可以三种不同的核酸分子形式存在，还可以是任意两种以上核酸形成一个分子的形式存在。此时同一分子的核酸可同时编码两种以上单独存在的蛋白。作为示例性实例，可通过使相临的两个基因之间连接例如核糖体进入位点(IRES)来实现。可选地，还可以通过使相临的两个基因之间连接编码自剪切多肽序列的核酸序列来实现。例如，本发明的核酸可为同时编码IL-15和IL-15Ra两种蛋白的核酸。

[疫苗]

本发明的第二方面，提供一种疫苗，其能够提供一种或多种抗原(优选免疫原)用于预防或者治疗患者的至少一种病况或症状。本发明的疫苗包含至少一种抗原或其编码核酸，和本发明第一方面所述的免疫调节剂。

本发明的疫苗中抗原包含至少一个抗原表位，编码抗原的核酸可以是DNA或者RNA。疫苗还可包括表达该抗原的细胞，如DC细胞或者PBMC细胞。抗原或者免疫原可以源自于任何适于接种的物质。

本发明的疫苗可以是任何类型的疫苗，其实例包括但不限于肿瘤疫苗、传染病疫苗。本发明优选使用肿瘤疫苗作为疫苗。

在某些实施方案中，本发明的疫苗包含编码抗原的核酸。本发明的核酸可以是一个，也可以是多个。每个核酸可编码至少一种抗原开放阅读框。

在一个实施方案中，抗原核酸分子编码细菌、病毒、真菌、或者其他病原体的具有免疫原性的肽段。其中病原体包括但不限于人的肝炎病毒包括HAV、HBV、HCV、巨细胞病毒CMV、人免疫缺陷病毒HIV、EB病毒、登革热病毒、人***瘤病毒(HPV)、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型(HTLV-1)、流行性感冒、牛白血病病毒(BLV)、百日咳、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、天花、带状疱疹、炭疽、破伤风、轮状病毒、狂犬病毒、禽痘、脑膜炎球菌、炭疽、脑炎、肺炎球菌、链球菌、葡萄球菌、奈瑟氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、利什曼虫、呼吸道合胞病毒、副流感、腺病毒、水痘、黄病毒、结核分枝杆菌和疟疾等。

在一个实施方案中，抗原核酸分子编码肿瘤抗原。在该情形中，肿瘤抗原可以表达于肿瘤细胞的表面、细胞质或者细胞核等位置。肿瘤抗原也可以选自与正常细胞相比在肿瘤细胞中过表达的蛋白。肿瘤抗原可以进一步分为肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异抗原(TSA)。TAA是一类在肿瘤细胞和正常细胞都存在的抗原分子，其实例包括：胚胎性蛋白、糖蛋白抗原，鳞状细胞抗原等。TAA并非肿瘤细胞所特有，正常细胞也可以微量合成，而在肿瘤细胞增殖时高度表达。TSA指仅表达在肿瘤细胞表面而不存在于正常细胞的新抗原。这类抗原可存在于不同个体同一组织类型的肿瘤中，如人恶性黑色素瘤基因编码的黑色素瘤特异性抗原，可存在于不同个体的黑色素瘤细胞，但正常的黑色素细胞不表达。TSA也可以为不同组织学类型的肿瘤所共有，如突变的Ras基因产物可常见于肺癌、消化道肿瘤等，但由于其氨基酸序列与正常的原癌基因Ras的表达产物不一致，可以被机体的免疫***识别，激发机体的免疫反应。通常，这类由突变产生的抗原，称之为新抗原(neoantigen)。这些抗原都能够被细胞毒性T淋巴细胞所识别，并且呈递该抗原的细胞可以被T淋巴细胞所杀伤。

在某些实施方案中，本发明的疫苗包含作为多肽的抗原。本发明的抗原优选肿瘤抗原，其可选自由下述组成的组中的至少一种：TDO2、MAGEC1、HMOX1、WT1、LY6H、AIM2、IDO1、CHI3L1、IL13RA2、LCK、GFAP、KIF20A、CNTN2、MUC16、PEG10、TNC、SOX11、IGF2BP3、S100A8、AKAP4、TTK、CHI3L2、PTHLH、CDC45、PMEL、TOP2A、PTTG1、NRCAM、HMMR、MUC4、LY6K、SOX10、FOSL1、PRAME、FOLR1、BIRC5、KIF2C、ITGAV、ART4、PROM1、CT83、S100A9、PPIB、S100A12、STAT1、EPCAM、ROR1、MLANA、KAAG1、KLK3、NT5E、PTPRZ1、SPAG4、MET、RGS1、CSPG4、PDCD1LG2、MUC1、CD274、PSCA、WDHD1、FABP7、PLIN2、PTGER2、HAVCR2、TPD52、ABCC3、TSSK6、ERBB2、CCDC110、TERT、CTAG2、SEC61G、ADORA2A、AURKB、ACPP、EPHX1、PTGS1、EZH2、PTGS2、PLK4、DDX43、PA2G4、PAX8、IDH1、SFMBT1、EPHA2、NAPSA、LPGAT1、NUF2、SPAG5、STAT3、MELK、ST8SIA1、EBAG9、KIFC3、CEACAM5、RPL19、SYCP2、DSE、ANKRD30A、TRAPPC1、RGS5、MGAT5、KRT19、B3GALNT1、CAGE1、AGER、ACRBP、LAG3、NELFA、RAB38、CCND1、SART1、UBE2V1、SLAMF7、KCNMA1、MUM1、HSPH1、GUCY1A3、AKAP13、SQSTM1、BCAN、CCNB1、TP53、SUGT1、AURKA、RAN、LY6D、NLGN4X、SART3、PRKDC、FOXP3、HBEGF、PIK3R1、SLC1A3、PCNA、KIF1C、BSG、ATP2A3、SPAG9、RPSA、NFYC、LRRC8A、IQGAP1、LY6E、TRIOBP、ART1、BAGE、BIRC7、CA9、CCDC54、DCT、IDO2、MAGED4、SOX2、SYCP1、TYR、5T4、BAGE2、BORIS、CALR3、CSAG2、CSH1、CTAG1A、CTAG1B、CTAGE1、E6、FMR1NB、GAGE1、GAGE2A、GAGE3、GAGE4、GAGE5、GAGE6、GAGE7、GAGE8、GRDX、HNPRL、IGHD、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA12、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEB1、MAGEB2、MAGEC2、PAGE4、PAP、SAGE1、SPANXB1、SPO11、SSX1、SSX2、SSX4、Brachyury/TFT、TTR、TYRP1、VSIR、XAGE1B、XAGE1E、ENAH、AKR1B10、GPC3、AFP、FLVCR1、FGF19、PSPH、ABL2、CCT3、SMYD3、TMEM106C、ZNF260、EPCAM、ICK、PHF20L1、ANXA3、ZNF623、CASK、FAM122B、IRS1、OTUD6B、TMEM68、VASH2、FGF3、TERF1、TSHZ2、TTC13和UTP14A。

此外，肿瘤抗原还可以包括肿瘤患者个体特异的、由肿瘤细胞中基因突变产生的新抗原。该突变的基因可以是细胞内的任何一个基因，其表达产物可以表达在细胞表面，也可以表达在细胞内部。

本发明的疫苗可以通过本领域已知的方法进行施用。优选地，通过体内递送到宿主细胞。在一个实施方案中，由病毒载体如腺病毒(AdV)、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒等将核酸分子向有需要的受试者引入本发明的药物组合物。此外，也可以由脂质体纳米颗粒转染进入到宿主细胞进而向受试者引入本发明的药物组合物。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以以电穿孔的方法导入到受试者自身DC细胞中，以DC细胞为载体导入受试者体内。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以以电穿孔的方法导入到受试者自体PBMC细胞或者是异体来源的PBMC细胞中，以自体PBMC细胞或者是异体来源的PBMC细胞为载体导入受试者体内。

[细胞]

本发明的第三方面，提供一种细胞。本发明的细胞含有(a’)IL-15的编码核酸、(b’)IL-15受体alpha的编码核酸和(c)含TGF beta受体3蛋白胞外结构域的多肽的编码核酸，并且这些核酸能够在细胞内进行表达和/或翻译，从而能够产生相应的蛋白。

在某些实施方案中，本发明的细胞能够在胞内组成性表达相应的蛋白。即，细胞不断的产生作为免疫调节剂的蛋白。在某些实施方案中，本发明的细胞瞬时性表达作为免疫调节剂的蛋白，或者细胞内的核酸处于静止状态，当需要时，例如受到调控后，细胞内的核酸进行表达并开始产生相应的蛋白。本发明的蛋白可表达于细胞内也可分泌于细胞外。

本发明的细胞类型不特别限定，一般为免疫相关的细胞，其实例包括但不限于PBMC细胞和DC细胞。本发明的细胞可以是上述两种细胞中的一种，也可以是两种细胞的混合群体。

[提高淋巴细胞群中TNF-a+和/或IFN-r+细胞的比例的方法]

本发明的第四方面，提供提高淋巴细胞群中TNF-a+和/或IFN-r+细胞的比例的方法，其包括使本发明的免疫调节剂或疫苗作用于淋巴细胞群的步骤。

本发明的淋巴细胞是免疫调节剂或疫苗作用的靶细胞，其包括体外培养的细胞或受试者体内的细胞。与淋巴细胞的作用可通过多种方式进行。在免疫调节剂或疫苗包含蛋白情况下，可通过使蛋白直接与淋巴细胞接触而作用于淋巴细胞。在免疫调节剂或疫苗包含核酸的情况下，可通过使核酸表达为相应的蛋白，而后使得到的蛋白与淋巴细胞接触。例如，使核酸首先在表达细胞内表达，然后使表达细胞与作为靶细胞的淋巴细胞接触。此处的表达细胞包括PBMC细胞和/或DC细胞。

实施例1

本实施例为制备编码抗原以及免疫检验点抑制剂的DNA和mRNA

1.制备DNA和mRNA构建体

分别构建用于体外致敏的人肿瘤抗原GPC3的编码的DNA序列、用于编码IL-15、IL-15Ra以及TGFBR3mRNA的DNA序列，并且用于后续的体外转录反应。在编码序列之后，是一段多聚腺苷片段来制备构建体。IL-15的编码核酸序列如SEQ ID NO:1所示，IL-15Ra的编码核酸序列如SEQ ID NO:2所示，TGFBR3的编码核酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.体外转录

将步骤1制备的相应的DNA质粒，首先使用speI内切酶将质粒线性化，以线性化的质粒为模板，使用T7RNA聚合酶体外转录制备mRNA。然后用氯化锂沉淀法纯化制备的mRNA。

实施例2

本实施例研究免疫调节剂对T细胞应答的影响

1.DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取健康人静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5％CO₂培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL的IL-4)，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基，其配方如下：1600U/mL GM-CSF和1000U/mL IL-4，TNF-a(5ng/ml),IL-1β(5ng/ml),IL-6(150ng/ml)和prostaglandin E2(PGE2)(1ug/ml)，重悬细胞后，加入到培养瓶中，培养8～18个小时，诱导DC细胞成熟。

2.免疫抑制剂组合物转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶DCs/ml。按照每10⁶DC细胞转染10ugmRNA的比例，混合DC细胞和抗原mRNA与不同的融合蛋白(IL-15、IL-15Ra以及TGFBR3-Fc)mRNA组合，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中。电转后的细胞，用无细胞因子的1640培养基中重悬，调整细胞密度到2×10⁵DCs/ml，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养6小时。本实验中，使用的mRNA组合如下所述：

不加任何mRNA的对照

只加编码GPC3或者AKR1B10抗原的mRNA

编码抗原的mRNA与IL-15/IL-15Ra的mRNA

编码抗原的mRNA与TGFBR3-Fc的mRNA

编码抗原的mRNA与IL-15/IL-15Ra+TGFBR3-Fc的mRNA

3.将复苏过夜的外周血单核细胞(PBMC)以2×10⁶/ml的浓度接种到96孔板中，每个孔接种100ul细胞，进行T淋巴细胞的激活。测试分组情况为：不加DC细胞的PBMC对照组，分别用上一步骤中所述五个分组的DC细胞与PBMC细胞共培养的组；根据分组情况在不同孔中加入负载有相应mRNA的DC细胞，PBMC:DC＝10:1；将细胞于37℃培养10～12天。

4.在共培养的10～12天，进行胞内细胞因子检测。

4.1在收集细胞前5-8h，将培养的T细胞混匀，调整细胞密度到2×10⁶/ml,按照每个孔100ul的体积分别种到96孔板中，于37℃培养箱中孵育。阳性对照为PMA(50ng/ml)+ionomycin(1ug/ml)，阴性对照仅含悬浮细胞。

4.2准备负载抗原的DC细胞作为靶细胞。复苏已经制备的负载抗原的冻存的DC细胞，并用台盼蓝染色计数细胞，用含IL-7及IL-2细胞因子的RPMI完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为2×10⁵/ml，每孔加入100μl细胞。

4.3在细胞培养液中加入终浓度为2μM monensin或3μg/ml BrefeldinA，充分混匀；(Monensin和Brefeldin A作为蛋白运输的阻断剂，在细胞液中的时间不应超过12h)，4-6小时后，进行胞内染色检测。

5.取出细胞，将细胞转移到相应的流式管中，以荧光标记的CD3、CD4、CD8抗体染色细胞后，固定并通透细胞，以荧光标记的TNF-a和IFN-r抗体进行胞内染色。

6.用流式细胞仪检测淋巴细胞中TNF-a+和IFN-r+细胞的比例。

如图1和图2所示，转染了本发明免疫增强剂的组，其致敏CD8阳性T细胞能力最强，引起的GPC3抗原特异的细胞应答比单独使用TGFBR3、IL-15/IL-15Ra或者仅仅使用GPC3抗原的组均要强。

只使用GPC3抗原致敏DC细胞，在体外致敏T细胞，经过12天培养后，有0.66％的CD8阳性T细胞为IFN-r阳性；1.53％的CD4阳性T细胞表现为IFN-r阳性；而转染了免疫增强剂与GPC3抗原的组，有2.75％的CD8阳性T细胞为IFN-r阳性；1.42％的CD4阳性T细胞表现为IFN-r阳性，而且有1.2％的CD8T细胞为IFN-r和TNF-a双阳性，该类型细胞在只转染了GPC3抗原的组中，仅为1.4％，在转染了抗原与IL-15/IL-15Ra或者抗原与TGFBR3的组中，仅分别为0.51％和0.1％。

如图2所示，在CD4阳性细胞中，本发明的免疫增强剂也能够显著增加TNF-a阳性细胞的比例。只转染了GPC3抗原的组，TNF-a阳性细胞比例为0.97％，在转染了抗原与IL-15/IL-15Ra或者抗原与TGFBR3的组中，TNF-a阳性细胞比例略有提高，分别为1.12％和1.16％，而在加了本发明的免疫增强剂后，TNF-a阳性细胞比例为2.19％，为对照组的2.26倍。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

序列表

<110> 启辰生生物科技（珠海）有限公司

<120> 免疫调节剂、疫苗、细胞及应用

<130> BH1900069-1

<141> 2019-08-20

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 489

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120

gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180

gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240

cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300

gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360

agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420

gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480

acttcttga 489

<210> 2

<211> 804

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggctccta ggagagccag agggtgtagg acactgggac tgccagctct gctgctgctg 60

ctgctgctga gacctccagc tacaagggga atcacctgcc ctcctcctat gagcgtggag 120

cacgccgaca tttgggtgaa gagctacagc ctgtacagcc gggagcgcta catttgcaac 180

agcggcttca agaggaaggc cggaacaagc tctctcaccg agtgcgtgct gaacaaggcc 240

accaacgtgg cccattggac aacccctagc ctgaagtgca tcagggaccc agcactggtg 300

caccagagac cagctcctcc tagcacagtg accacagccg gagtgacacc tcagccagaa 360

agcctgagcc ctagcggaaa agaaccagcc gcctctagcc ccagcagcaa taataccgcc 420

gccacaacag ccgctattgt gccaggaagc cagctgatgc ctagcaagag ccctagcacc 480

ggcacaacag agatcagcag ccacgagagc agccacggaa cacctagcca gaccacagcc 540

aagaattggg agctgaccgc cagcgccagc caccagcctc caggagtgta ccctcaggga 600

cacagcgata ccaccgtggc catctctacc agcacagtgc tgctgtgcgg actgtcagct 660

gtgtccctgc tggcttgcta cctgaagagc agacagaccc ctcctctggc cagcgtggaa 720

atggaggcta tggaggccct gccagtgact tggggaacct ctagcagaga cgaggacctg 780

gagaattgca gccaccacct gtag 804

<210> 3

<211> 2637

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

atgaccagcc actacgtgat cgccatcttc gccctgatga gcagctgtct ggccacagca 60

ggaccagagc caggcgccct gtgtgaactc agcccagtgt ccgcttctca tccagtgcag 120

gccctgatgg agagcttcac agtgctgagc ggctgcgcca gcagaggcac aacaggactg 180

cctcaggagg tgcacgtgct gaacctgaga accgcaggac agggaccagg acagctgcag 240

agggaagtga ccctgcacct gaaccccatc agcagcgtgc acatccacca caagagcgtg 300

gtgttcctgc tgaacagccc tcacccactg gtctggcacc tgaagaccga gagactggct 360

acaggcgtgt ccagactgtt cctggtgtcc gaaggcagcg tggtgcagtt tagcagcgct 420

aacttcagcc tgaccgccga aaccgaggag agaaacttcc cccacggcaa cgagcacctg 480

ctgaattggg ccaggaagga gtacggagcc gtgaccagct tcaccgagct gaagatcgcc 540

cggaacatct acatcaaggt cggcgaggac caggtgttcc cacccaagtg caacatcggc 600

aagaacttcc tgagcctgaa ctacctggcc gagtatctgc agcctaaagc cgcagagggc 660

tgcgtgatgt ctagccagcc ccagaacgag gaggtgcaca tcatcgagct gatcaccccc 720

aacagcaacc cctacagcgc cttccaggtg gacatcacca tcgacatccg gcctagccag 780

gaggatctgg aggtcgtgaa gaacctgatc ctgatcctca agtgcaagaa gagcgtgaat 840

tgggtcatca agagcttcga cgtgaagggc agcctgaaga tcatcgcccc caacagcatc 900

ggctttggca aagagagcga gcggagcatg accatgacca agagcatccg ggacgacatc 960

ccctctacac agggcaacct cgtcaagtgg gcactggata acggctacag ccctatcacc 1020

agctacacca tggccccagt ggccaacaga ttccacctgc ggctggagaa caacgccgaa 1080

gagatgggcg acgaggaagt gcacaccatc cctcccgagc tgagaatcct gctggacccc 1140

ggcgccctgc cagctctgca gaatcctcct attagaggcg gcgagggaca gaacggagga 1200

ctgcctttcc ctttccccga catcagcagg agagtgtgga acgaggaggg cgaagacgga 1260

ctgcctagac ctaaggaccc cgtgatccct agcatccagc tgttcccagg cctgagagag 1320

ccagaggaag tgcagggaag cgtggacatc gctctgagcg tcaagtgcga caacgagaag 1380

atgatcgtgg ccgtggagaa ggacagcttc caggctagcg gatacagcgg aatggacgtg 1440

accctgctgg accctacttg caaggccaag atgaacggca cccacttcgt gctggagtcc 1500

cccctgaacg gttgcggcac aagacctagg tggagcgctc tggacggagt ggtgtactac 1560

aactccatcg tgatccaggt gcccgctctg ggagattcta gcggttggcc agacggctac 1620

gaggatctgg agagcggaga caacggcttc ccaggcgata tggacgaggg agacgcttct 1680

ctgttcacca ggcccgagat cgtggtgttc aattgcagcc tgcagcaggt ccgcaaccct 1740

tctagcttcc aggagcagcc tcacggcaac atcaccttca acatggagct gtacaacacc 1800

gacctgttcc tggtgccatc acagggagtg ttcagcgtgc ccgagaacgg acacgtgtac 1860

gtggaggtgt ccgtgaccaa ggcagaacag gagctgggct tcgccatcca gacttgcttc 1920

atcagcccct acagcaacga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1980

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 2040

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 2100

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 2160

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 2220

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 2280

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 2340

accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 2400

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 2460

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 2520

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2580

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 2637

<210> 4

<211> 651

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360

ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 6

<211> 232

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

Claims (6)

1.一种免疫调节剂，其特征在于，所述免疫调节剂包含(a)-(c)三种成分：

(a) 序列如SEQ ID NO:1所示的核酸或由其编码得到的IL-15；

(b) 序列如SEQ ID NO:2所示的核酸或由其编码得到的IL-15受体alpha；和

(c) 序列如SEQ ID NO :3所示的核酸或由其编码得到的含TGF beta 受体3蛋白胞外结构域的多肽。

2.根据权利要求1所述的免疫调节剂，其特征在于，所述(a)和(b)通过化学键连接形成一个分子。

3.一种疫苗，其特征在于，包含至少一种抗原或其编码核酸，和根据权利要求1或2所述的免疫调节剂。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述抗原为肿瘤抗原或病原体抗原。

5.一种细胞，其特征在于，包含(a’) IL-15的编码核酸、(b’) IL-15受体alpha的编码核酸和(c’)含TGF beta 受体3蛋白胞外结构域的多肽的编码核酸；其中，所述(a’)的序列如SEQ ID NO:1所示，所述(b’)的序列如SEQ ID NO:2所示，(c’)的序列如SEQ ID NO :3所示。

6.根据权利要求1或2所述的免疫调节剂在制备用于提高淋巴细胞群中TNF-a+和/或IFN-r+细胞的比例的药物中的用途。

Images