KR102359446B1

KR102359446B1 - 테아플라빈을 포함하는 지방세포 분화 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR102359446B1
Application number: KR1020200029539A
Authority: KR
Inventors: 박필준; 라찬수
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2022-02-09
Also published as: TW202106283A; CN113573695A; JP7488831B2; KR20200125425A; JP2022529570A

Abstract

본 명세서는 테아플라빈, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화촉진용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 지방세포 분화를 촉진하여 피부탄력, 주름개선, 피부 볼륨증가, 피부 재생, 피하지방 감소를 개선하는 효과를 제공한다.

Description

테아플라빈을 포함하는 지방세포 분화 촉진용 조성물{Composition comprising theaflavin for promoting differentiation of adipocyte}

본 명세서는 테아플라빈을 포함하는 지방세포 분화촉진용 조성물에 관하여 기술한다.

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 4월 25일자로 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2019-0048189호에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원 내용 전체가 본 출원에 참조로서 통합된다.

피하지방은 피부의 구조를 지탱하는 주요 피부 기관중 하나이며 내장지방과 달리 나이가 들어감에 따라 점차 그 효력을 잃고 구조체로서의 기능을 상실하는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, 얼굴부위의 피부 꺼짐 현상을 억제 및 보완하기 위하여 다양한 방법으로 항노화를 구현하고자 하였으나, 피하지방을 통한 항노화를 구현하는 방법으로는 에스테틱으로 접근하는 시술 방법을 제외하고는 현재까지 피하지방의 지방분화를 촉진시킬 수 있는 명확한 방법이 부재하였다.

대한민국 등록특허 제10-0856556호 대한민국 등록특허 제10-0916196호

일 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 다양한 녹차유래 폴리페놀 중에서도 쉽게 다른 물질로 변화되어 그 기능을 확신하지 못했던 테아플라빈을 인체유래 피하지방에 처리시 피하지방 특이적으로 지방을 축적시킬 수 있는 효과를 제공하는 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 테아플라빈, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화촉진용 조성물을 제공한다.

일 관점에서, 본 발명은 지방세포 분화를 촉진하여 피부탄력, 주름개선, 피부 볼륨증가, 피부 재생, 피하지방 감소를 개선하는 효과를 제공한다.

도 1은 각 추출물별 HPLC 성분 분석 결과이다: (A) 표준화학물질 (1; 테아플라빈(theaflavin, TF), 2; 테아플라빈-3-갈레이트 (theaflavin-3-gallate, TF3G), 3; 테아플라빈-3'-갈레이트 (theaflavin-3´-gallate, TF3´G), 및 4; 테아플라빈-3,3'-디갈레이트 (theaflavin-3, 3´-digallate, TFDG)), (B) 비발효 녹차 추출물(GT), (C) 테아플라빈 농축 생발효 추출물 (CoF-GT), (D) 녹차 발효 추출물 (F-GT).
도 2는 테아플라빈 농축 생발효 추출물 (CoF-GT), 녹차 발효 추출물 (F-GT), 테아플라빈(TF), 테아플라빈-3,3'-디갈레이트 (TFDG)의 세포 증식 효능 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 테아플라빈 농축 생발효 추출물 (CoF-GT), 녹차 발효 추출물 (F-GT), 테아플라빈(TF), 테아플라빈-3,3'-디갈레이트 (TFDG)의 세포 생존성 (72시간) 효능 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 테아플라빈(TF) 및 테아플라빈-3,3'-디갈레이트 (TFDG)의 피하지방 분화 촉진 효과를 확인한 도이다.
도 5는 테아플라빈 농축 생발효 추출물 (CoF-GT) 및 녹차 발효 추출물 (F-GT)의 피하지방 분화 촉진 효과를 확인한 도이다.
도 6은 테아플라빈(TF), 테아플라빈-3,3'-디갈레이트 (TFDG), 테아플라빈 농축 생발효 추출물 (CoF-GT) 및 녹차 발효 추출물 (F-GT)을 각각 처리한 후 피하지방의 지방 생성량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7는 테아플라빈(TF), 테아플라빈-3,3'-디갈레이트 (TFDG), 테아플라빈 농축 생발효 추출물 (CoF-GT) 및 녹차 발효 추출물 (F-GT)을 각각 처리한 후 유전자 발현 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 테아플라빈(TF), 테아플라빈-3,3'-디갈레이트 (TFDG), 테아플라빈 농축 생발효 추출물 (CoF-GT) 및 녹차 발효 추출물 (F-GT)을 각각 처리한 후 아디포넥틴(Adiponectin) 생성량 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 테아플라빈(TF)의 농도별 세포 증식 효능 (24시간) 및 세포 생존성 (72시간) 효능 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 테아플라빈(TF)의 농도별 지방세포 분화 촉진 효능 분석 결과를 나타낸 도이다.

이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 출원의 실시예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 출원에 개시된 기술은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 출원의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 또한, 설명의 편의를 위하여 구성요소의 일부만을 도시하기도 하였으나, 당업자라면 구성요소의 나머지 부분에 대하여도 용이하게 파악할 수 있을 것이다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 출원의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다.

일 실시예에서, 본 발명은 테아플라빈(Theaflavin), 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공할 수 있다.

본 명세서에서 "이성질체"는 특히 광학 이성질체(optical isomers)(예를 들면, 본래 순수한 거울상 이성질체(essentially pure enantiomers), 본래 순수한 부분 입체 이성질체(essentially pure diastereomers) 또는 이들의 혼합물)뿐만 아니라, 형태 이성질체(conformation isomers)(즉, 하나 이상의 화학 결합의 그 각도만 다른 이성질체), 위치 이성질체(position isomers)(특히, 호변이성체(tautomers)) 또는 기하 이성질체(geometric isomers)(예컨대, 시스-트랜스 이성질체)를 포함한다.

본 명세서에서 "본래 순수(essentially pure)"란, 예컨대 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체와 관련하여 사용한 경우, 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체를 예로 들 수 있는 구체적인 화합물이 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상 또는 약 98% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 99% 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 약 99.5% 이상(w/w) 존재하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능"이란 통상의 의약적 복용량(medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기관의 승인을 받을 수 있거나 승인 받거나, 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전에 기재된 것으로 인지되는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물(parent compound)의 바람직한 약리 활성을 갖는 본 발명의 일측면에 따른 염을 의미한다. 상기 염은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 "수화물(hydrate)"은 물이 결합되어 있는 화합물을 의미하며, 물과 화합물 사이에 화학적인 결합력이 없는 내포 화합물을 포함하는 광범위한 개념이다.

본 명세서에서 "용매화물"은 용질의 분자나 이온과 용매의 분자나 이온 사이에 생긴 고차의 화합물을 의미한다.

다른 일 실시예는 지방세포 분화촉진용 조성물의 제조에 사용하기 위한 상기 테아플라빈, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 용도를 제공할 수 있다. 다른 일 실시예는 상기 테아플라빈, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 이를 필요로 하는 대상에 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 지방세포 분화촉진 방법을 제공할 수 있다. 다른 일 실시예는 포함하는 지방세포 분화촉진용 조성물에 사용하기 위한 유효성분으로서 상기 테아플라빈, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 제공할 수 있다. 또한, 지방세포 분화촉진을 위한 유효성분으로서 상기 테아플라빈, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 비치료적 용도를 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 테아플라빈(Theaflavin), 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함함으로써 인체유래, 예를 들어 얼굴부위의 피하지방 세포에 처리한 경우, 다음과 같은 효능을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 테아플라빈은 수용성으로 쉽게 물에 녹아 다른 제형과 쉽사리 혼합될 수 있으며, 인체유래 피하지방세포에 처리 결과, 농도 무관하게 세포 증식 및 독성에 변화를 일으키지 않는다. 다른 테아플라빈류가 기존 항비만 효능으로 알려진 지방분화 억제 효능을 나타내는데 반해, 본 발명의 유효성분인 테아플라빈은 농도의존적으로 피하지방의 분화를 촉진시킨다. 일 실시예로서 상기 조성물은 지방세포 분화 촉진을 통한 피부 볼륨 증가용일 수 있다. 일 실시예로서 상기 조성물은 지방세포 분화 촉진을 통한 피하지방 감소 억제용일 수 있다.

일 실시예에서 상기 조성물이 포함하는 테아플라빈(Theaflavin), 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 함량은 제한되지 않으나, 예를 들어 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로는 0.01 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 테아플라빈(Theaflavin), 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 1 중량% 이상, 5 중량% 이상, 10 중량% 이상, 15 중량% 이상, 20 중량% 이상, 25 중량% 이상, 30 중량% 이상, 35 중량% 이상, 40 중량% 이상, 45 중량% 이상, 50 중량% 이상, 55 중량% 이상, 60 중량% 이상, 65 중량% 이상, 70 중량% 이상, 75 중량% 이상, 80 중량% 이상, 85 중량% 이상, 90 중량% 이상 또는 95 중량% 이상로 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 테아플라빈(Theaflavin), 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물은 조성물 총 중량에 대하여 100 중량% 이하, 95 중량% 이하, 90 중량% 이하, 85 중량% 이하, 80 중량% 이하, 75 중량% 이하, 70 중량% 이하, 65 중량% 이하, 60 중량% 이하, 55 중량% 이하, 50 중량% 이하, 45 중량% 이하, 40 중량% 이하, 35 중량% 이하, 30 중량% 이하, 25 중량% 이하, 20 중량% 이하, 15 중량% 이하, 10 중량% 이하, 5 중량% 이하, 1 중량% 이하 또는 0.1 중량% 이하로 포함될 수 있다.

일 실시예에서, 상기 테아플라빈, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 조성물내 농도는 0.01 내지 10,000 mg/kg일 수 있으며, 이는 조성물의 투여경로에 따라 달라질 수 있다. 일 실시예에서, 상기 테아플라빈, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 투여량은 0.01 내지 10,000mg/kg/일일 수 있으며, 이는 조성물의 투여경로에 따라 달라질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 테아플라빈, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 농도 또는 1일 투여량은 0.01 mg/kg 이상, 0.1 mg/kg 이상, 0.5 mg/kg 이상, 1 mg/kg 이상, 2 mg/kg 이상, 3 mg/kg 이상, 4 mg/kg 이상, 5 mg/kg 이상, 10 mg/kg 이상, 15 mg/kg 이상, 20 mg/kg 이상, 25 mg/kg 이상, 30 mg/kg 이상, 35 mg/kg 이상, 40 mg/kg 이상, 45 mg/kg 이상, 50 mg/kg 이상, 55 mg/kg 이상, 60 mg/kg 이상, 65 mg/kg 이상, 70 mg/kg 이상, 75 mg/kg 이상, 80 mg/kg 이상, 85 mg/kg 이상, 90 mg/kg 이상, 95 mg/kg 이상, 100 mg/kg 이상, 200 mg/kg 이상, 300 mg/kg 이상, 400 mg/kg 이상, 500 mg/kg 이상, 600 mg/kg 이상, 700 mg/kg 이상, 800 mg/kg 이상, 900 mg/kg 이상, 1,000 mg/kg 이상, 2,000 mg/kg 이상, 3,000 mg/kg 이상, 4,000 mg/kg 이상, 5,000 mg/kg 이상, 6,000 mg/kg 이상, 7,000 mg/kg 이상, 8,000 mg/kg 이상, 9,000 mg/kg 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 테아플라빈, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 농도는 10,000 mg/kg 이하, 9,000 mg/kg 이하, 8,000 mg/kg 이하, 7,000 mg/kg 이하, 6,000 mg/kg 이하, 5,000 mg/kg 이하, 4,000 mg/kg 이하, 3,000 mg/kg 이하, 2,000 mg/kg 이하, 1,000 mg/kg 이하, 900 mg/kg 이하, 800 mg/kg 이하, 700 mg/kg 이하, 600 mg/kg 이하, 500 mg/kg 이하, 400 mg/kg 이하, 300 mg/kg 이하, 200 mg/kg 이하, 100 mg/kg 이하, 95 mg/kg 이하, 90 mg/kg 이하, 85 mg/kg 이하, 80 mg/kg 이하, 75 mg/kg 이하, 70 mg/kg 이하, 65 mg/kg 이하, 60 mg/kg 이하, 55 mg/kg 이하, 50 mg/kg 이하, 45 mg/kg 이하, 40 mg/kg 이하, 35 mg/kg 이하, 30 mg/kg 이하, 25 mg/kg 이하, 20 mg/kg 이하, 15 mg/kg 이하, 10 mg/kg 이하, 5 mg/kg 이하, 1 mg/kg 이하, 0.5 mg/kg 이하 또는 0.1 mg/kg 이하일 수 있다.

구체적으로, 경구 투여시 상기 테아플라빈, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 농도 또는 1일 투여량은 0.01 내지 1,000 mg/kg일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 피부 도포시 상기 테아플라빈, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 농도 또는 1일 투여량은 0.01 내지 3,000 mg/kg일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 피하로 직접 투여시 상기 테아플라빈, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 농도 또는 1일 투여량은 0.01 내지 100 mg/kg일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 실시예에서, 상기 테아플라빈은 발효녹차 추출물에 포함된 것일 수 있다. 즉, 상기 조성물은 테아플라빈을 포함하는 발효녹차 추출물을 포함하는 것일 수 있다.

차는 동백과(Theaceae), 동백속(Camellia)에 속하는 차나무(Camellia sinensis O, Kuntze)의 싹이나 잎을 가공한 것으로서 차 생엽에는 75 내지 80%의 수분과 20 내지 25%의 고형분이 함유되어 있으며, 고형분에는 카테킨, 카페인, 아미노산, 섬유소, 펙틴 등의 유기물과 지질, 수지류, 정유, 비타민, 클로로필 등 다양한 성분이 함유되어 있다. 차는 통상 발효 정도에 따라 발효도가 0%인 비발효차(녹차), 20 내지 60%인 반발효차(백차, 화차, 포종차 및 우롱차) 및 80% 이상인 발효차(홍차)로 크게 분류하고 있다. 전통적인 발효차는 찻잎에 함유된 효소에 의한 발효를 이용하므로 효소 발효차라하며, 효소 발효차인 홍차류는 차엽을 채엽 후 위조과정을 통하여 잎을 부드럽게 하고 향기 생성에 필요한 생화학반응이 일어나도록 유도하고, 유념과정을 통하여 산화효소와 폴리페놀의 반응을 촉진시키며, 발효공정으로 카테킨류의 산화중합을 촉진시킴으로서 테아플라빈류를 생성하고 갈색화를 동반하여 향과 맛이 생성된다. 효소 발효차는 발효가 진행됨에 따라 산화효소에 의해 에피카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트 등 카테킨류의 산화 중합 반응이 일어나 적황색을 띠는 테아플라빈류(theaflavins)를 생성하며 주로 테아플라빈(theaflavin), 테아플라빈-3-갈레이트(theaflavin-3-gallate), 테아플라빈-3'-갈레이트(theaflavin-3'-gallate) 및 테아플라빈-3,3'-디갈레이트(theaflavin-3,3'-digallate) 등 4종이 보고되어 있다. 이들 테아플라빈류는 항산화활성, 항돌연변이 등의 효과 등을 가지는 것으로 알려져 있으며, 산화효소의 작용에 따라 산화 중합물들이 생성되며, 이에 따라 차의 적색도가 증가하고 향과 맛의 차이가 발생하며, 생성물의 체내 생리활성에도 차이가 있다.

본 명세서에서 "발효녹차"는 발효된 상태의 녹차를 의미하는 것으로, 발효의 정도에 따른 차이를 모두 포괄한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 발효녹차 추출물은 테아플라빈, 테아플라빈-3-갈레이트, 테아플라빈-3'-갈레이트 및 테아플라빈-3,3'-디갈레이트를 포함하는 테아플라빈류를 포함하며, 이때 본 발명의 유효성분인 테아플라빈을 상기 테아플라빈류 총 중량에 대하여 30 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 발효녹차 추출물은 (a)녹차 및 쑥갓을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; (b)상기 혼합물을 감압 상태에서 발효 및 건조하는 단계; 및 (c)상기 발효 및 건조된 혼합물을 추출하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 발효녹차를 제조하는 방법의 일 실시예로서 상기 (a)단계는 녹차 및 쑥갓을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계이다.

본 발명에서 녹차는 녹차엽, 녹차줄기 및 녹차뿌리로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으며, 예를 들어 녹차엽을 포함할 수 있다. 또한, 상기 녹차는 효소반응의 촉진을 위하여 생육 중인 녹차를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 쑥갓은 녹차의 발효를 촉진시켜주는 발효첨가 조성물로 사용될 수 있다. 상기 쑥갓에는 폴리페놀산화효소 및 퍼옥시데이즈가 포함되어있어 녹차의 발효를 촉진시켜 줄 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 쑥갓은 분말화된 쑥갓 마쇄물 또는 착즙액 형태로 사용될 수 있다. 상기 분말화는 당 업계에서 공지된 것이라면 특별히 한정하는 것은 아니나, 파쇄기(crusher)에서 1차 분쇄된 분말을 분말기(grinder)에서 1 내지 500㎛ 정도의 미세입자로 재분쇄하여 제조하거나, 또는 1차 분쇄 없이 볼밀(ball mill)이나 해머밀(hammer mill) 등에서 미분말로 제조한 것일 수 있다. 상기 착즙액은 당 업계에서 공지된 것이라면 특별히 한정하지는 않는다.

일 실시예로서 상기 녹차 및 쑥갓은 1:1 내지 99:1의 중량비로 혼합될 수 있으며, 구체적으로는 20:1 내지 5:1의 중량비로 혼합될 수 있으며, 보다 구체적으로는 10:1의 중량비로 혼합될 수 있다. 상기 쑥갓이 녹차의 중량보다 더 많이 포함되면 녹차 발효를 단시간에 수행할 수는 있으나 산화 속도가 빨라져 테아플라빈류의 감소가 발생할 수 있으며, 녹차 및 쑥갓이 99:1의 중량비를 초과하면 녹차에 포함된 효소에 지배되어 테아플라빈류 중 테아플라빈의 함량이 증가하지 않는다.

일 실시예로서, 상기 녹차 및 쑥갓을 혼합하여 혼합된 혼합물은 추가로 증류수, 이온수, 상수, 미네랄을 함유하는 지하수 및 30% 미만의 알코올을 용매로 포함할 수 있다. 상기 용매는 일 실시예로서 녹차 100 중량부에 대하여 50 내지 200 중량부로 포함될 수 있으며, 구체적으로는 80 내지 150 중량부로 포함될 수 있다.

일 실시예에서 상기 (b)단계는 상기 (a)단계에서 제조한 혼합물을 감압 상태에서 발효 및 건조시키는 단계이다. 본 명세서에서 "발효"는 녹차에 자연적으로 존재하는 산화효소의 작용으로 일어나는 것을 의미한다. 상기 감압 상태는 산소와의 접촉이 차단된 상태라 할 수 있으며, 일 실시예로 10 내지 50mmHg의 감압 상태에서 발효 및 건조시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 감압 상태에서 발효는 20 내지 50℃의 온도에서 1 내지 10시간 동안 이루어지며, 보다 구체적으로는 2 내지 5 시간 동안 이루어질 수 있다. 상기 발효 온도가 20℃ 미만이면 발효시간이 길어질 수 있으며, 50℃를 초과하면 효소의 실활속도가 빨라져 불완전한 발효가 진행될 수 있다. 또한, 상기 (b)단계는 발효된 혼합물을 건조하며, 상기 건조는 동결건조일 수 있다. 상기 동결건조는 그 방법을 특별히 한정하지는 않으며, 당 업계에서 공지된 방법으로 이루어질 수 있다.

일 실시예에서 상기 (c)단계는 상기 (b)단계에서 발효 및 건조된 혼합물을 추출하는 단계이다. 상기 추출은 추출 용매를 사용하여 수행되며, 추출 용매는 물 및 탄소수 1 내지 5의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하며, 구체적으로는 물 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 추출 온도 및 추출 시간을 특별히 한정하는 것은 아니나, 예를 들어 추출 온도는 상온 내지 80℃이며, 추출 시간은 1 내지 24시간이다. 기 (c)단계에서 발효 및 건조 혼합물은 다양한 방법을 통해 추출될 수 있으며, 예컨대 열수 추출물 또는 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올 추출물을 이용한 방법일 수 있다.

예를 들어, 제 1 구현예로 상기 발효 및 건조된 혼합물 중량의 10 내지 30배수 정도의 물을 첨가하여 100℃에서 4시간 동안 1차 추출을 하고, 같은 방법으로 4시간 동안 2차 추출한 후, 1차 및 2차 추출액을 합하여 여과한 후, 여과액을 농축기로 농축한다. 상기 농축된 추출액을 분무건조기 또는 진공냉동 동결 건조기를 이용하여 건조시킨다. 제 2 구현예로 70%의 에탄올 추출물 제조방법은 발효 및 건조된 혼합물 중량의 10 내지 30배수 정도의 70% 에탄올을 첨가하여 50 내지 80℃에서 30분 내지 3시간 동안 추출한 후, 여과하여 여과액을 농축기로 농축한다. 상기 농축된 추출액을 분무건조기 또는 진공냉동 동결 건조기를 이용하여 건조시킨다. 제 3 구현예로 95%의 에탄올 추출물 제조방법은 발효 및 건조된 혼합물 중량의 10 내지 30배수 정도의 95% 에탄올을 첨가하여 실온에서 1일 내지 3일 동안 방치(6시간 마다 쉐이킹(shaking) 작업을 반복 실시하여 추출한 후, 같은 방법으로 2회 반복 실시하여 추출액을 얻는다. 상기 1차 및 2차 추출액을 합하여 여과한 후, 여과액을 농축기로 농축한다. 상기 농축된 추출액을 분무건조기 또는 진공냉동 동결 건조기를 이용하여 건조시킨다.

일반적으로 발효녹차 추출물은 발효가 진행됨에 따라 산화효소에 의해 에피카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트 등 카테킨류의 산화 중합 반응이 일어나 적황색을 띠는 테아플라빈류(theaflavins)를 생성하며, 상기 테아플라빈류는 테아플라빈(theaflavin), 테아플라빈-3-갈레이트(theaflavin-3-gallate), 테아플라빈-3'-갈레이트(theaflavin-3'-gallate) 및 테아플라빈-3,3'-디갈레이트(theaflavin-3,3'-digallate)를 포함한다.

상기 일 실시예들에 따른 본 발명의 발효녹차는 테아플라빈류 중 테아플라빈을 다른 테아플라빈류에 대하여 고함량으로 포함하여, 인체 유래 피하지방 세포의 분화를 촉진시켜 높은 지방세포 생성 유도 효능을 나타낸다. 구체적으로, 상기 발효녹차 추출물은 테아플라빈류 총 중량에 대하여 테아플라빈을 30 내지 50 중량% 포함할 수 있다.

일 실시예로서 본 발명에 따른 조성물이 포함하는 상기 발효녹차 추출물의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서 조성물 총 중량 대하여 0.01 내지 99.9 중량%, 구체적으로는 0.1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 상기 함량일 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 바람직하다.

일 실시예에서, 상기 본 발명에 따른 조성물은 화장료 조성물일 수 있다. 상기 화장료 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 경피 투여용일 수 있다. 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 다른 예로서, 필러(filler)와 같은 주사제, 좌제(坐劑), 패치 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

일 실시예로서, 상기 본 발명에 따른 조성물은 상기 유효성분과 더불어 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유하는 것도 무방하며, 본 발명의 유효 성분 이외에 다른 성분을 기타 화장료 조성물의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다. 또한, 일 실시예로서 본 발명의 화장료 조성물은 상기 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료 조성물에 배합되는 다른 성분을 포함할 수 있다. 예컨데, 보습제, 에몰리언트제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함될 수 있는 기타 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 가능하다.

본 발명 실시예들에 따른 조성물은 상기 유효성분을 포함하는 식품 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 유효성분을 포함하는 발효유, 치즈, 요구르트, 주스, 생균제제 및 건강식품 등과 같은 기능성 식품으로 가공될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가제의 형태로 사용될 수 있다. 일 실시예로서, 조성물은 건강 식품용 조성물일 수 있다. 일 실시예로서, 상기 건강 식품용 조성물은 환제, 캅셀제, 정제, 과립제, 캬라멜제 또는 드링크제 등으로 제형화할 수 있다. 다른 일 실시예로서, 액제, 분말, 과립, 정제 또는 티백 등의 형태로 가공될 수도 있다. 상기 조성물은 단순 음용, 주사 투여, 스프레이 방식 또는 스퀴즈 방식 등의 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 본 발명의 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은, 조성물 전체 중량을 기준으로, 0.0001 중량% 내지 99.9 중량%일 수 있다.

본 발명 실시예들에 따른 조성물은 상기 유효성분을 포함하는 약제학적 조성물일 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 약제학적 조성물은 경구 투여제일 수 있으며, 상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있다. 이들 제형은 유효 성분 이외에 계면 활성제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅방법에 의해 제조될 수 있다.

일 실시예로서, 상기 약제학적 조성물은 비경구 투여제일 수 있으며, 상기 비경구 투여제는 직장, 국소, 피하, 경피 투여형 제형일 수 있다. 예를 들어 필러(filler)와 같은 주사제, 점적제, 연고, 스킨, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑), 패치 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 실시예로서 상기 약제학적 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 예를 들어, 상기 투여량은 0.01 내지 10,000mg을 1일 1 내지 3회 분할하여 투여할 수 있으나, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 명세서의 범위를 한정하는 것이 아니다.

이하, 실시예, 비교예 및 시험예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 실시예, 비교예 및 시험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] 테아플라빈 함량이 강화된 CoF-GT(생녹차 공발효) 분획의 생산

생녹차 및　쑥갓 잎을 탈 이온수로 두 번 세척하고 과도한 물을 가볍게 두드려 제거했다. 잎들을 액체 질소에 담근 다음 파쇄하여 -80℃에서 보관했다. CoF-GT는 다음과 같이 제조하였다. CoF-GT는　생녹차 분말 (100g)과 냉동된 생쑥갓　(50mg)의 혼합물을 발효했다. 3 시간　반응 후, 혼합물을 70 % 에틸 알코올 (v/v)로 2 시간 동안 추출하였다. 고형분 및 잔사를　90 메쉬 체에 통과시킨 후 0.22㎛ 필터로(Dow Corning, Corning, NY, USA) 여과했다.　 여과된 샘플을 Hei-VAP 회전 농축증발기 (Heidolph Instruments, Schwabach, Germany)로 증발시킨 다음 FreeZone 동결 건조기 (Labconco, Kansas City, MO, USA)를 사용하여 분말화 했다.

[비교예 1] 통상적으로 발효된 F-GT(녹차 일반 발효) 분획의 생산

F-GT는　생녹차 잎을 탈 이온수로 두 번 세척하고 과도한 물을 가볍게 두드려 제거했다. 잎들을 액체 질소에 담근 다음 파쇄하여 -80℃에서 보관했다. 37.5℃의 열 재킷 z-블레이드 혼합기 (IKA, Staufen im Breisgau, Germany)에서 냉동된　생녹차 분말 (100g)을 발효하여 제조했다. 3 시간　반응 후, 혼합물을 70 % 에틸 알코올 (v/v)로 2 시간 동안 추출하였다. 고형분 및 잔사를　90 메쉬 체에 통과시킨 후 0.22㎛ 필터로(Dow Corning, Corning, NY, USA) 여과했다.　 여과된 샘플을 Hei-VAP 회전 농축증발기 (Heidolph Instruments, Schwabach, Germany)로 증발시킨 다음 FreeZone 동결 건조기 (Labconco, Kansas City, MO, USA)를 사용하여 분말화 했다.

[시험예 1] CoF-GT 및 F-GT 분획의 HPLC 분석

각 샘플 (8 g)을 30 분 초음파 처리 후 100 ml DMSO / 메탄올 / 에탄올 (5:45:50, v/v)의 혼합물에 용해시킨 후 원심 분리한 후 0.45 ㎛ 폴리테트라 플루오로에틸렌(PTFE) 주사기 필터 (Pall Corp., Port Washington, NY, USA)로 여과했다. 82 ml의 시료를 50 ml 샘플 루프에 채우고 광 다이오드 어레이 검출기가 장착된

KTApurifier 10 (GE Healthcare, Stockholm, Sweden)에 주입하여 275와 365 nm에서 분석했다. 정제 분리는 AQ-HG octadecylsilyl 컬럼 (120Å, 10um, 20x250mm, column volume = 78.5ml) (YMC Co., Kyoto, Japan)으로 수행하였다. 순수한 물 (용매 A) 및 아세토 니트릴 (용매 B)로 기울기 용출을 수행하였다. 1회에 8.2 ml의 샘플용액을 주입하고 이동상의 유속은 10 ml/min이었다. 모든 용매는 여과하고, 탈기시키고, 적절한 압력하에 사용되였다. 샘플 주입 후 분획 (110 ml)을 수집하였다. 각 사이클마다 4 개의 분획물을 얻고 10번 사이클에 걸쳐 개별 병에 수집하였다. 매 4 번째 분획을 하나로 모아　Hei-VAP 회전식 증발기 (Heidolph Instruments)에서 용매를 제거하고, 동결 건조하여 분말화한 후, 분석 할 때까지 -20℃에서 저장하였다.

상기 발효차의 테아플라빈 성분검출을 위하여 HPLC(High performance liquid chromatography)를 이용하여 상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 발효녹차 추출물의 테아플라빈(theaflavin, TF), 테아플라빈-3-갈레이트(theaflavin-3-gallate, TF-3G), 테아플라빈-3'-갈레이트(theaflavin-3'-gallate, TF-3'G) 및 테아플라빈-3,3'-디갈레이트(theaflavin-3,3'-digallate, TF-3,3'DG) 함량 분석을 수행하였다. 테아플라빈 표준품은 Wako사에서 구입하였으며, 시료는 50% 에탄올 용매에 용해하여 초음파 추출 후 0.45㎛ PVDF 필터에 여과하여 기기에 주입하였다. 기기는 HPLC(Waters Alliance 2695 system, Waters, USA)를 사용하였으며, 검출파장은 270 nm 영역에서 분석하였다. 컬럼은 Optimapak C18 (150 x 4.6 mm, 5μm)을 사용하여, 0.05% 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid, TFA)와 아세토니트릴(Acetonitrile, ACN) 용매를 사용한 농도구배용매 조성법으로 분석하였으며, 용매의 농도조성비를 하기 표 1에 나타내었다. 모든 분석용매는 HPLC급 시약을 사용하였으며, 데이터 처리는 워터스사의 Empower 3 프로그램을 사용하였다.

그 결과 도 1에 나타난 바와 같이 기존 녹차 발효기법(비교예 1)을 적용한 녹차 발효 추출물(F-GT)의 경우에는 주요 4가지 폴리페놀 성분이 고르게 증가하지만, 공발효 기법을 적용한 테아플라빈 생발효 추출물(CoF-GT, 실시예 1)은 테아플라빈(1)의 함량이 우선적으로 많이 생성되었다.

[시험예 2] 세포 배양과 분화 및 세포 생존성 분석

세포 배양과 분화

인체유래 피하지방 세포(human Subcutaneous Fat cells, hSCF)와 미분화 피하지방세포 배양배지는 ZenBio (Research Triangle Park, NC, USA)에서 구입했다. hSCF는 배양기간 동안 5% CO₂ 배양기에서 배양되었다. 분화를 유도하기 위해 10μg/ml 인슐린, 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 1μm 덱사메타손(dexamethasone), 1μg 트로글리타존(troglitazone) (모두 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입)과 함께 10%의 태아 혈청(PAA, Walkersville, MD, USA)을 함유한 둘베코수정이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; Lonza, Walsvill, MD, MD, USA)에서 21일간 배양되었다. 배지는 격일로 교체되었다.

세포 생존성 분석

hSCF의 생존성은 제조사의 지침에 따라 EZ-Cytox 검사 키트(대일 랩 서비스, 서울, 대한민국)로 측정되었다. 간단히, 7일 동안 배양된 세포는, 약물 처리후 각각 24시간과 72시간 동안 0.1, 0.5, 1, 5 및 10μg/ml의 다양한 농도로 테아플라빈 농축 생발효 추출물 (CoF-GT), 녹차 발효 추출물 (F-GT), 테아플라빈(TF) 및 테아플라빈-3,3'-디갈레이트 (TFDG)을 각각 처리하였다. EZ-Cytox 용액(10μl)을 각 웰에 추가하고, 37℃에서 2시간 배양하였다. 450nm에서의 흡광도는 분광 광도계(Syergenergy H2; BioTek, Winosk, VT, USA)로 측정하였다. 실험은 3회 반복 수행되었고, 데이터는 흡광도 값을 대조군 대비 비교 활성비율(%)으로 나타내었다.

상기 각 처리물질의 hSCFs에 영향력을 보이는 농도를 확인한 결과, 상기 처리 물질 모두 24시간 처리의 증식 효과 실험(도 2)과 72시간 처리의 독성 확인 실험(도 3) 전농도 구간에서 약간의 세포 증식 효과를 제외한 어떠한 독성효과도 없는 안전한 물질임을 확인하였다.

[시험예 3] ORO(Oil Red O) 염색에 의한 트리글리세라이드(Triglyceride, TG) 함량 분석

피하지방세포의 분화 결과는 Oil Red O 염색을 통해 지방 생성을 정성 및 정량적으로 확인하였다.

hSCF은 차가운 인산염 버퍼 식염수(PBS)로 두 번 세척하고 3.7% 포름알데히드(Sigma-Aldrich)로 1시간 동안 고정했다. 고정된 세포는 60% 프로필렌 글리콜(propylene glycol, 시그마-알드리치)로 30분간 세척한 후 Oil Red O (0.7% ORO stock은 60% 프로필렌 글리콜로 희석하여 만들었음)의 용액으로 염색했다. 다시, 세포는 85%의 프로필렌 글리콜로 세 번 세척하고 흐르는 수돗물로 헹구었다. ORO로 염색된 지방소립(lipid droplet, LD)은 IX71 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰 및 사진화하였다. LD를 정량화하기 위해 70% 프로필렌 글리콜(시그마-알드리치)으로 염색된 세포를 세척하고, 이소프로필알코올(isopropyl alcohol)에 4% Nonidet P-40 (시그마-알드리치)을 섞은 용액을 세포에 처리하여 20분간 ORO로 염색된 세포에서 ORO만을 추출하였다. 추출물의 흡광도는 분광 광도계에서 490 nm로 측정하였다.

hSCFs가 지방소립(lipid droplet)을 생성하는 성숙된 지방(mature adipocytes)으로 분화되려면 약 21일의 시간이 필요하다. 따라서 테아플라빈(TF) 및 테아플라빈-3,3'-디갈레이트 (TFDG)을 각각 0.5, 2μg/ml, 테아플라빈 농축 생발효 추출물 (CoF-GT) 및 녹차 발효 추출물 (F-GT)을 각각 1, 5, 10μg/ml로 처리한 배지로 21일간 각각 배양하였다. 그 결과, 본 발명의 일 실시예인 테아플라빈(TF) 및 테아플라빈 농축 생발효 추출물(CoF-GT)의 경우 농도 의존적으로 지방 생성을 증가시킴을 Oil Red O 염색법을 통하여 확인하였고, 이와 대조적으로 TFDG와 F-GT를 처리한 경우, 기존 녹차의 항비만 효과인 지방분해가 일어남을 확인하였다 (도 4). 상기 도 3 및 도 4의 염색된 지방의 양을 정량화 하기 위해, 트리글리세리드(triglyceride, TG)의 양을 측정하여 도 6에 그래프로 표현하였다.

[시험예 4] 실시간 정량 PCR (Realtime quantitative polymerization chain reaction; RT-qPCR)

총 RNA는 제조사의 지시에 따라 트리졸 시약(TRIzol, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 추출했으며, 상보적 DNA (complementary DNA; cDNA)는 역전사 키트(Reverse transcription Kit, Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 합성했다. cDNA는 택맨 프로브(Taqman probe)를 사용하여 7500 패스트 리얼-타임 PCR 시스템(Fast7500 Real-time PCR, Life Technologies)에서 RT-qPCR 증폭의 템플릿으로 사용되었으며, PPARγ (Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma #Hs01115513_m1), 아디포넥틴(adiponectin, ADIPOQ; #Hs00605917_m1) 및 글리세르알데히드(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH; #4352339E)는 대조 유전자로 사용되었다. 데이터는 독립적으로 반복된 세 번의 실험에서 얻었으며, 표본의 값은 GAPDH 수준에 대한 상대적인 수치로 변화되어 제시된다.

지방분화와 관련된 유전자인 PPARγ와 아디포넥틴(Adipoq)의 양을 측정한 결과, 도 7과 같이 상기 시험예 3의 염색결과 및 테아플라빈 양과 유사한 결과를 확인하였다.

[시험예 5] 배지로 용출된 아디포넥틴의 분석

피하지방 분화후 컨디션 확인을 위해, 배지로 용출되는 지방세포 특이적 호르몬(adipocyte cytokine, adipokine) 중 하나인 아디포넥틴(adiponectin) 양의 증가를 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)측정법을 통해 확인하였다.

hSCF에 다양한 농도의 테아플라빈(TF), 테아플라빈-3,3'-디갈레이트 (TFDG), 테아플라빈 농축 생발효 추출물 (CoF-GT) 및 녹차 발효 추출물 (F-GT)을 각각 처리하여 21일간 분화하였다. 배양 배지를 수거해 15분 동안 13,000 rpm에서 원심분리후 이물질을 제거하였다. ELISA(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)는 제조사의 지침에 따라 사용하여 용출된 아디포넥틴의 수준을 측정했다. 그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 지방분화후 배지로 용출되는 지방세포 유래 호르몬(adipokine) 중 하나인, 아디포넥틴이 테아플라빈-3,3'-디갈레이트 (TFDG) 및 녹차 발효 추출물 (F-GT)을 처리한 경우에는 감소하는데 반해, 본 발명의 일 실시예인 테아플라빈(TF) 및 테아플라빈 농축 생발효 추출물 (CoF-GT) 처리시에는 농도가 증가함에 따라 아디포넥틴 양도 증가하엿다. 이는 앞선 시험예 3 및 4의 실험결과와도 일치하는 것이다.

[시험예 6] 테아플라빈(TF)의 농도별 세포 배양과 분화 및 세포 생존성 분석

상기 시험예 2와 동일한 방법에 따라 0.01 내지 100 μg/ml의 테아플라빈(TF)이 hSCFs에 영향력을 보이는 농도를 확인하고, 이를 도 9에 나타내었다. 그 결과, 24시간 처리의 증식 효과 실험과 72시간 처리의 독성 확인 실험 모두 처리된 모든 농도에서 약간의 세포 증식 효과를 제외한 어떠한 독성효과도 없는 안전한 물질임을 확인하였다.

[시험예 7] 테아플라빈(TF)의 농도별 트리글리세라이드(Triglyceride, TG) 증가 효능 분석

상기 시험예 3과 동일한 방법으로 테아플라빈(TF) 0 내지 100 μg/ml에 대하여 농도별 피하지방세포의 분화 효능을 분석하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 테아플라빈(TF)은 50μg/ml까지 농도 의존적으로 지방 분화를 촉진하였으며, 100 μg/ml에서 지방분화능력이 50 μg/ml보다 다소 감소하였다.

본 명세서의 일 실시예에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 명세서를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 유연화장수(스킨로션)

하기 표에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 유연화장수를 제조하였다.

배합 성분	함량 (중량%)
테아플라빈	10
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
피이지-12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 2] 영양화장수(밀크로션)

하기 표에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양화장수를 제조하였다.

배합 성분	함량 (중량%)
테아플라빈	10
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	5.0
스쿠알란	5.0
솔비타세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 3] 마사지 크림

하기 표에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 마사지 크림을 제조하였다.

배합 성분	함량(중량%)
테아플라빈	10
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	45.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
밀납	4.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
세스퀴 올레인산 소르비탄	0.9
바세린	3.0
파라핀	1.5
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 4] 정제

테아플라빈 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

[제형예 5] 캡슐제

테아플라빈 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

[제형예 6] 과립제

테아플라빈 50mg, 무수결정 포도당 250mg 및 전분 550mg을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하였다.

[제형예 7] 드링크제

테아플라빈 50mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 올리고당 25g을 혼합한 후 정제수 300ml를 가하여 각 병에 200ml씩 충진한다. 병에 충진한 후 130℃에서 4~5 초간 살균하여 드링크제를 제조하였다.

[제형예 8] 캬라멜 제형

테아플라빈 50mg, 옥수수 시럽(corn syrup) 1.8g, 탈지우유 0.5g, 대두 레시틴 0.5g, 버터 0.6g, 식물성 경화유 0.4g, 설탕 1.4g, 마가린 0.58g, 및 식염 20mg을 혼합하여 캬라멜 성형 하였다.

[제형예 9] 건강 식품

성분	함량
테아플라빈	100 ㎎
비타민 혼합물
비타민 A 아세테이트	70 ㎍
비타민 E	1.0 ㎎
비타민 B1	0.13 ㎎
비타민 B2	0.15 ㎎
비타민 B6	0.5 ㎎
비타민 B12	0.2 ㎍
비타민 C	10 ㎎
비오틴	10 ㎍
니코틴산아미드	1.7 ㎎
엽산	50 ㎍
판토텐산 칼슘	0.5 ㎎
무기질 혼합물
황산제1철	1.75 ㎎
산화아연	0.82 ㎎
탄산마그네슘	25.3 ㎎
제1인산칼륨	15 ㎎
제2인산칼슘	55 ㎎
구연산칼륨	90 ㎎
탄산칼슘	100 ㎎
염화마그네슘	24.8 ㎎

상기 비타민 및 무기질 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

[제형예 10] 건강 음료

성분	함량
테아플라빈	10 ㎎
구연산	1000 ㎎
올리고당	100 g
매실농축액	2 g
타우린	1 g
정제수	잔량
총 부피	900 ㎖

상기 표와 같이 총 부피 900㎖가 되도록 잔량의 정제수를 첨가하여 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 건강음료 조성물 제조에 사용할 수 있다.

[제형예 11] 주사제

하기 표에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 주사제를 제조하였다.

배합 성분	함량
테아플라빈	10-50 mg
주사용 멸균 증류수	적량
pH 조절제	적량

상기 실시형태들은 본 발명의 설명을 위해 개시되었으며, 상기 설명은 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 따라서, 본 발명의 의미 및 범위를 벗어나지 않는 한, 다양한 수정, 변형, 및 대체가 당해 기술분야의 통상의 기술자에게서 발생될 수 있다.

Claims

테아플라빈, 이의 입체 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화촉진을 통한 피하지방 감소 억제용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 테아플라빈을 포함하는 발효녹차 추출물을 포함하는 것인, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 발효녹차 추출물은 테아플라빈, 테아플라빈-3-갈레이트, 테아플라빈-3'-갈레이트 및 테아플라빈-3,3'-디갈레이트를 포함하는 테아플라빈류를 포함하며, 상기 테아플라빈을 상기 테아플라빈류 총 중량에 대하여 30 내지 50 중량%로 포함하는, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 발효녹차 추출물은
(a)녹차 및 쑥갓을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
(b)상기 혼합물을 감압 상태에서 발효 및 건조하는 단계; 및
(c)상기 발효 및 건조된 혼합물을 추출하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 테아플라빈, 이의 입체 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 조성물내 농도는 0.01 내지 10,000mg/kg인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 테아플라빈, 이의 입체 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 투여량은 0.01 내지 10,000mg/kg/일인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 지방세포 분화 촉진을 통한 피부 볼륨 증가용인, 조성물
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 경피 투여용인 조성물.
테아플라빈, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화촉진을 통한 피하지방 감소 억제용 식품 조성물.
제9항에 있어서, 상기 조성물은 테아플라빈을 포함하는 발효녹차 추출물을 포함하는 것인, 조성물.
제10항에 있어서, 상기 발효녹차 추출물은 테아플라빈, 테아플라빈-3-갈레이트, 테아플라빈-3'-갈레이트 및 테아플라빈-3,3'-디갈레이트를 포함하는 테아플라빈류를 포함하며, 상기 테아플라빈을 상기 테아플라빈류 총 중량에 대하여 30 내지 50 중량%로 포함하는, 조성물.
제10항에 있어서, 상기 발효녹차 추출물은
(a)녹차 및 쑥갓을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
(b)상기 혼합물을 감압 상태에서 발효 및 건조하는 단계; 및
(c)상기 발효 및 건조된 혼합물을 추출하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것인, 조성물.
제9항에 있어서, 상기 테아플라빈, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 조성물내 농도는 0.01 내지 10,000mg/kg인, 조성물.
제9항에 있어서, 상기 테아플라빈, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 투여량은 0.01 내지 10,000mg/kg/일인, 조성물.
제9항에 있어서, 상기 조성물은 지방세포 분화 촉진을 통한 피부 볼륨 증가용인, 조성물.