KR20160060834A - 식물 추출물을 포함하는 케피어 그레인 배지 조성물 및 그 배지 조성물에 의한 발효 배양물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 - Google Patents

식물 추출물을 포함하는 케피어 그레인 배지 조성물 및 그 배지 조성물에 의한 발효 배양물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 추출물을 포함하는 케피어 그레인 배지 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 케피어 그레인의 발효 배양물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 케피어 그레인의 발효 배양물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물로서, 피부 주름 개선, 피부 미백, 항산화, 항염증 및 항비만 효과를 가지는 조성물에 관한 것이다.

Description

식물 추출물을 포함하는 케피어 그레인 배지 조성물 및 그 배지 조성물에 의한 발효 배양물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물{Compositions for culture media of Kefir grain comprising plant extract and compositions for improving skin conditions comprising fermented products using the same}
본 발명은 식물 추출물을 포함하는 케피어 그레인의 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용하여 케피어 그레인의 발효 배양물을 제조하는 방법, 및 상기 조성물 및 방법에 의하여 제조된 발효 배양물을 포함하는 주름 개선, 피부 미백, 항산화, 항염증 및 항비만을 위한 조성물에 관한 것이다.
피부는 내부와 외부환경 사이의 일차적 장벽기능으로 단열, 체온조절, 감각기능 등을 통해 외부로부터 신체를 보호하는 기본적인 역할 외에 미적 기준으로 평가되기도 한다. 나이가 들어감에 따라 피부는 얇고 쉽게 상처받기 쉽게 변하며 자가 치유력 또한 감퇴하게 된다. 피부노화는 연령증가 등의 내적 요인 뿐 아니라, 자외선이나 각종 자극 등의 외적 환경요인으로부터의 영향도 크게 받아, 피부가 거칠어지고, 주름, 기미, 반점, 기타 트러블을 일으키는 일이 많다. 그러므로 피부노화를 줄이기 위해 다양한 피부활성화성분에 대한 검토가 이루어지고 있으며 많은 연구들이 진행되고 있다.
케피어(Kefir)는 코카서스 산간 지방에서 유래한 발효유의 일종으로, 티벳지방 승려들이 건강을 위해 음용하던 것이 대중화된 음료이다. 케피어의 구성영양소로는 단백질 및 다당류가 포함되어 있고 비타민 A, 비타민 B1, 비타민B2, 비타민B6, 비타민D, 비타민K2, 엽산, 니코틴산 및 칼슘, 철분, 요오드 등을 고루 포함하고 있다. 이러한 케피어는 유산균과 효모 복합체인 케피어 그레인으로 불리우는 균종(케피어 과립균이라고도 한다)을 개시제로 하여 우유를 발효시켜 얻어진 요구르트상의 음료이다. 상기 케피어 그레인을 구성하는 유산균은 대부분 젖산균으로 Lactobacillus hordei, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus casei, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc citreum 등으로 구성되어 있으며, 아세트산균으로 Acetobacter fabarum, Acetobacter orientalis 등이 분리되었고, 효모로는 Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kefyr, Lachancea fermentati, Hanseniaospora valbyensis, Zygotorulaspora florentina 등이 함유되어 있다.
이와 같이, 케피어 그레인에 의하여 발효된 음료인 케피어는 인체에 유익한 유산균을 포함하고 있어 장활동을 원활히 하여 변비를 억제하고 위장장애를 개선하는데 도움이 되며 면역체계의 강화에 효능이 있다고 알려져 있다. 또한 항암효과, 항알러지효과 (Int J Oncol, 2914, 45;2117-2127, Br J Nutr, 2014, 112;390-397, J Dairy Res, 2010, 77;129-136) 등이 보고되고 있다.
케피어와 관련한 특허로는 항알러지, 항염증 및 항천식 활성을 갖는 케피어분말 (국내특허 제10685285호), 케피어로부터 새로운 유산균 동정(국내특허 제0663785호), 케피어 유(乳)발효산물의 피부외용제 조성물(국내특허 제0992101호), 녹차함유 유발효 염증억제산물(국내특허 제0871837호), 케피어를 이용한 인삼발효 농축액(국내특허 제1407607호) 등이 있다.
그러나 이들 특허들을 포함한 종래의 연구들은 모두 케피어 그 자체를 이용하거나 케피어로부터 새로운 균을 동정하는 정도에 그칠 뿐이며, 본 발명에서와 같이 천연식물을 이용한 케피어 그레인의 발효 배양물에 대하여 연구가 이루어지고 있지 않은 실정이다. 더욱이 기존의 케피어 그레인 발효 배양물보다 주름개선효과, 미백효과, 항염효과, 항산화 효과 및 항비만 효과가 더 우수하고 안전성이 높아 피부 부작용이 없는 천연식물의 발효 배양물에 대하여는 전혀 개발이 이루어져 있지 않다.
이에 본 발명자들은 천연 식물을 이용한 케피어 그레인의 발효 배양물이 기존의 발효 배양물에 비하여 생리 활성 물질의 증진을 나타내어 상기와 같은 주름개선효과, 미백효과, 항염효과, 항산화 효과 및 항비만 효과를 얻을 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 식물 추출물 및 쌀을 주요 성분으로 함유된 케피어 그레인의 배양을 위한 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 케피어 그레인의 배지 조성물에 케피어 그레인을 접종하여 얻어지는 케피어 그레인의 발효 배양물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법에 의하여 제조된 케피어 그레인의 발효 배양물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 케피어 그레인의 발효 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 또는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 케피어 그레인의 발효 배양물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 케피어 그레인의 발효 배양물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 케피어 그레인의 발효 배양물을 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 식물 추출물, 탈지분유 및 쌀 분말을 포함하는 케피어 그레인의 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 케피어 그레인(Kefir grain)은 케피어(Kefir)의 제조 과정에서 사용되는 발효원으로서 효모와 유산균의 복합 균종을 말한다. 에 의해 발효을 말한다. 상기 케피어 그레인에 포함되는 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 라칸세아(Lachancea) 속, 한세니아오스포라(Hanseniasospora) 속, 지고토루라스포라(Zygotorulaspora) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 토룰라(Torula) 속, 캔디다(Candida) 속 등에 속하는 효모 중의 하나 이상이며, 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 등에 속하는 유산균 중의 하나 이상이다.
상기 케피어 그레인은 케피어의 제조 과정에서 효모와 유산균의 발효시 생성되는 수용성 다당인 케퍼란(kefiran)에 의해 둘러싸여져서 알갱이(grain) 형태를 그 자체로서 이용하거나, 상업적으로 판매되는 상품 또는 상술한 효모 및 유산균의 혼합균을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 식물은 유채, 동백, 녹차, 감귤 및 백년초로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상 선택되는 식물로서, 하기 서술된 본 발명에 따른 케피어 그레인의 발효 배양물 제조 방법에 의하여 제조된 케피어 그레인의 발효 배양물의 피부 주름 개선 및 피부 미백 등의 피부 상태 개선 효과, 항산화 효과, 항염증 효과, 및 항비만 효과를 증진하여 나타낼 수 있는 물질이다.
상기 유채(Brassica napus)는 십자화과의 두해살이풀로, 아시아, 유럽, 뉴질랜드 등 세계적으로 널리 분포하고 있다. 국내에서는 주로 제주도 및 남해안 지역에서 식용 및 약용을 위해 재배되었으며, 벌꿀을 위한 밀원식물로 재배되기도 한다. 유채의 어린줄기와 잎은 운대라 하여 토혈, 산혈, 수종 등에 효과가 있다고 알려져 있다. 유채의 씨는 운대자라 하여 기름을 짜서 이용하며, 행혈, 파기, 소종, 산결의 효능이 있다고 알려져 있다.
상기 동백나무(Common Camellia)는 차나무과에 속하는 상록교목으로, 원산지는 아시아 지역이다. 동백나무는 약 200여종이 분포하고 있으며, 우리나라에는 제주도 및 남부지방의 산과 들에 분포되어 있다. 동백은 원예자원으로 이용되어 왔고, 예로부터 목재는 공예의 재료로, 줄기는 고급숯의 원료로, 종실은 민간에서 식용유와 화장유, 등잔기름 등으로 이용해 왔다. 동백꽃은 간경(肝經), 폐경(肺經)에 작용하며 혈연(血熱)을 내리고 출혈을 멈추며 어혈(瘀血)을 없애고 부종을 내린다고 알려져 있다.
상기 차나무(Camellia sinensis)는 상록관엽수로서 중국이 원산으로 아시아 지역에서 주로 재배하고 있다. 차나무는 한방에서 잎을 다엽(茶葉), 열매를 다자(茶子), 뿌리를 다수근(茶樹根)이라 하며, 피와 머리를 맑게 하고, 심장의 열을 내리며, 눈이 맑아지고, 목마름을 없애며, 해독 및 항염작용을 한다고 알려져 있다.
상기 감귤나무(Citrus unshiu)는 운향과의 상록교목으로 우리나라에서는 제주도에 자생하며, 일본, 중국, 중남미, 흑해 등지에 분포되어 있는 것으로 알려져 있다. 감귤나무 과실은 히스페리딘 (hisperidin), 나린진 (naringin), 나리루틴 (narirutin), 리모시트린 (limocitrin), 펙틴 (pectin), 아스코르빈산 (ascorbic acid), 베타크립토산틴 (beta-cryptoxanthin), 쿠마린 (courin) 등의 생리활성물질을 함유하고 있어, 민간에서 감귤과실 추출물은 비만, 기침, 가래 및 피로회복 등에 사용되어 왔다.
백년초(Opunitia humifusa)는 선인장과에 속하는 선인장의 한 부류로 멕시코가 원산지이며, 제주도 지방기념물로 지정되어 보호되고 있는 부채선인장속의 한 종류로 북제주 해안가를 중심으로 자생하고 있다. 전초를 관상용으로 기르기도 하고 식이성 섬유, 칼슘, 철분 등 무기질 성분이 풍부하여 기관지 질환의 예방 및 치료, 변비, 피부미용, 당뇨, 면역력 증진 등의 효능을 가지고 있다. 민간에서는 해열진정, 기관지 천식, 소화불량, 변비, 가슴통증, 혈액순환개선 및 비염 등에 사용되어 왔다.
본 발명에 있어서, 상기 식물 추출물은 유채, 동백, 녹차, 감귤 및 백년초로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상 선택되는 식물의 전초, 잎, 뿌리, 줄기, 꽃 등을 통상의 방법에 의하여 추출한 물질을 말한다. 또한, 상기 추출물은 통상의 방법에 의하여 상기 식물로부터 추출한 추출액뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 말한다.
본 발명에서 식물 추출물은 물 또는 유기 용매를 사용하여 추출할 수 있는데, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.
여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 크로마토그래피)에 의한 분리 과정을 추가로 포함할 수 있다. 여액을 건조하는 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.
본 발명의 상기 식물 추출물은 케피어 그레인의 영양원으로서 제공되며, 케피어 그레인에 의해 하기에서 상술하는 피부 상태 개선, 항산화, 항염증 및 항비만과 관련된 생리 활성 물질이 추출물 내 성분이 분해됨으로써 생성되거나 생리 활성 물질의 농도가 증가하게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 탈지분유는 포유동물 유(乳)로부터 지방 성분의 함량을 감소 또는 지방 성분을 제거한 유(乳)로서, 탈지분유 100g 당 지방이 0 내지 2g, 바람직하게는 1g이 함유된 유(乳)이다.
본 발명에 있어서, 상기 쌀 분말은 건조된 쌀을 분쇄하여 가루로 만든 것으로, 분말의 크기는 작으면 작을수록 좋으나 제조 시의 경제성 등을 고려하여 300메쉬 이하, 바람직하게는 100 내지 300메쉬, 보다 바람직하게는 100 내지 200메쉬의 크기이다.
본 발명에 사용되는 쌀의 종류는 제한되지 않으며, 상기 쌀 추출물은 통상의 추출 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 상술한 식물 추출물의 추출 방법을 적용할 수도 있다.
본 발명의 배지 조성물에 포함되는 쌀은 케피어 그레인의 영양원으로서 종래 배지의 성분으로 사용되거나 사용이 권장된 글루코스, 덱스트린, 말토오스 등의 탄소원과 효모 추출물, 펩톤, 육추출물(beef extract) 등의 질소원 등을 대체하는 효과를 가진다. 또한, 상기 쌀은 케피어 그레인에 의하여 분해되면서 쌀에 포함된 비타민 E, 감마오리자놀 등의 생리 활성 물질이 생성되거나 그 농도가 증가되어 하기 서술하는 피부 상태 개선, 항산화, 항염증 및 항비만 등의 효과를 증진시키는 효과를 가진다.
본 발명에 있어서, 상기 식물 추출물, 탈지분유 및 쌀은 0.5 내지 4.0: 0.1 내지 10.0: 0.3 내지 10.0의 중량비, 바람직하게는 0.5 내지 3.0: 0.1 내지 5: 0.3 내지 5의 중량비, 보다 바람직하게는 1 ~ 2: 0.1 내지 3: 0.3 내지 3중량비로 함유되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 케피어 그레인 배지 조성물은 상술한 식물 추출물, 탈지분유 및 쌀 이외에 통상의 효모 및 유산균의 배양을 위한 배지 성분, 예를 들어, 글루코스, 덱스트린, 말토오스, 펩톤, 육추출물, 효모 추출물, 트립톤 등을 추가로 포함할 수 있다. 이들 배지 성분을 추가로 포함하는 경우 그 함량은 본 발명에 따른 배지 조성물의 전체 중량에서 2중량%를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 이는 본 발명의 배지 조성물은 케피어 그레인의 발효에 의한 생리 활성 물질의 향상을 위한 것으로 상기 배지 성분이 추가로 포함되는 경우 과다 발효로 인한 생리 활성 물질의 과분해 등으로 인해 생리 활성 물질에 의한 효과가 감소할 우려가 있기 때문이다.
한편, 본 발명의 케피어 그레인 배지 조성물은 상술한 성분들을 물, 정제수 또는 멸균수에 용해하여 사용할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 생리 활성 물질의 생성 및 함량을 증가시켜 하기의 피부 상태 개선, 항산화, 항염증 및 항비만 등의 효과를 가지는 케피어 그레인의 발효 배양물을 제조하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 케피어 그레인 발효 배양물 제조 방법은 상술한 케피어 그레인 배지 조성물에 케피어 그레인을 접종하고 교반하면서 32 내지 37℃에서 10 내지 36시간 동안 발효하는 1차 고온 교반 발효 단계; 상기 제1차 고온 교반 발효 단계에서 발효된 발효물을 20 내지 28℃에서 5 내지 36시간 동안 정치상태로 발효하는 2차 저온 정치 발효 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 케피어 그레인 발효 배양물 제조 방법은 상기 2차 저온 정치 발효 단계에서 발효된 발효물에서 케피어 그레인의 균체를 제거한 후 4 내지 15℃에서 240 내지 360시간 동안 정치상태로 발효시키는 3차 장기 정치 숙성 단계를 추가로 더 포함한다.
이하, 도 1을 참조하여 본 발명에 따른 케피어 그레인의 발효 배양물 제조 방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
먼저, 1차 고온 교반 발효 단계로서, 본 발명에서 상술한 케피어 그레인 배지 조성물에 케피어 그레인을 접종하고 발효하는 단계이다.
상기 1차 고온 교반 발효 단계에 의하여 단시간 내 케피어 그레인의 균체량을 증가시켜 이후 발효 시간을 감소시킬 수 있다.
상기 케피어 그레인의 접종은 본 발명에 따른 케피어 그레인 배지 조성물에 함유된 식물 추출물의 함량과 동일한 양의 케피어 그레인을 접종한다. 보다 구체적으로는, 본 발명에 따른 케피어 그레인 배지 조성물의 전체 함량 중 0.5 내지 2.0중량%, 바람직하게는 1 내지 2.0중량%의 함량으로 케피어 그레인을 접종한다.
상기 발효는 32 내지 37℃에서 10 내지 36시간 동안, 바람직하게는 12 내지 20시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 발효는 교반과 함께 이루어지는 것이 바람직하다. 여기서, 교반은 50 내지 300rpm의 교반 속도, 바람직하게는 50 내지 200rpm의 교반 속도, 보다 바람직하게는 80 내지 120rpm의 교반 속도로 이루어진다.
또한, 상기 발효 시 통기 조건은 0.5 내지 2.0 vvm, 바람직하게는 0.5 내지 1.5vvm 인 것이 바람직하다.
상술한 조건에서 케피어 그레인의 균체량을 현저히 증가시킬 수 있다.
또한, 상기 발효 시 배지 조성물의 pH를 4.5 내지 6.0, 바람직하게는 pH 5 내지 6으로 보정하는 것이 바람직하다. 이러한 pH의 보정은 추출물 종류에 따라 초산 등의 산성 용액 또는 암모니아수 등의 염기성 용액을 첨가함으로써 이루어질 수 있다.
상술한 pH의 보정에 의하여 케피어 그레인에 포함된 유산균의 배양 부산물인 유산 등에 의하여 초기 케피어 그레인의 균체 성장에서 효모 등의 세포벽이 파괴되는 현상을 감소시키고, 케피어 그레인의 균체량을 극대화할 수 있다.
다음으로, 2차 저온 정치 발효 단계로서, 상기 1차 고온 교반 발효 단계에서 발효된 발효물을 정치상태에서 발효하는 단계이다.
상기 2차 저온 정치 발효 단계는 1차 고온 교반 발효 단계와 달리 발효 조건이 20 내지 28℃, 바람직하게는 26 내지 28℃이며, 5 내지 36시간, 바람직하게는 5 내지 20시간, 보다 바람직하게는 5 내지 10시간이며, 교반이 아닌 정치 상태이며, 통기 조건이 0 내지 0.3vvm, 바람직하게는 0 내지 0.1vvm의 혐기 조건이다.
이러한 조건의 2차 저온 정치 발효 단계는 혐기성 발효로 인한 추가적인 발효 배양물의 생성과 더불어 1차 고온 교반 발효 단계에서의 급격한 기질 고갈 및 균체 가수분해를 통한 기질저해 현상으로 인한 발효 배양액의 유효성분 생성 저하를 방지하기 위함이다.
한편, 상기 2차 저온 정치 발효 단계에서는 케피어 그레인에 포함된 유산균에 의한 유산 생성이 감소된 상태이며 효모의 활성도가 높은 시기이므로 1차 고온 교반 발효 단계와 달리 pH의 보정없이 pH 3.3 내지 4.0에서 케피어 그레인을 배양하며, 상기 조건에서 효모로부터 기인한 유효성분의 함량이 가장 높을 것으로 예상된다.
상기한 1차 및 2차 발효에 의하여 제조된 케피어 그레인의 발효 배양물은 대조군 및 1차 발효에 의하여 제조된 발효 배양물에 비하여 피부 상태 개선, 항산화, 항염증 및 항비만을 위한 유효성분이 증가하므로, 이들을 위한 용도로서 본 발명의 상기 케피어 그레인의 발효 배양물을 유용하게 사용할 수 있다.
한편, 상기한 1차 및 2차 발효에 의하여 제조된 케피어 그레인의 발효 배양물은 피부 상태 개선, 항산화, 항염증 및 항비만에 2차 발효까지 수행된 케피어 그레인의 발효 배양물에 비하여 현저히 더 우수한 피부 상태 개선, 항산화, 항염증 및 항비만 효과를 가지게 된다.
따라서, 본 발명의 상술한 2차 저온 정치 발효 단계 이후에 추가적으로 상기 2차 저온 정치 발효 단계에서 발효된 발효물에서 케피어 그레인의 균체를 제거하고 정치상태에서 발효하는 단계인 3차 장기 정치 숙성 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 3차 장기 정치 숙성 단계는 상기 2차 저온 정치 발효 단계에서 발효된 발효물에서 케피어 그레인의 균체를 제거한 후 3 내지 15℃, 바람직하게는 3 내지 10℃, 보다 바람직하게는 3 내지 5℃에서 240 내지 360시간, 바람직하게는 300 내지 350시간 동안 정치상태로 숙성 및 발효시키는 단계이다.
또한, 상기 3차 장기 정치 숙성 단계의 케피어 그레인의 균체 제거는 멸균필터 등을 이용하여 케피어 그레인의 총균체량 중 70 내지 100%, 바람직하게는 70 내지 95%, 보다 바람직하게는 80 내지 95%를 제거한다. 이러한 케피어 그레인의 균체 제거에 의하여 하기와 같은 장점을 가질 수 있다.
상기 3차 장기 정치 숙성 단계는 2차 저온 정치 발효 단계에서까지 이루어진 발효에 의하여 기질이 소모됨에 따라 케피어 그레인의 사멸기에 해당하므로, 그 3차 장기 정치 숙성 단계에 의하여 케피어 그레인에서 기인한 가수분해된 효소들의 효소간 대사회로의 간섭을 최소화하는 효과가 있으며, 장기간 숙성 배양을 통하여 배지 조성물 중 잔여 기질(탄수화물, 당류, 단백질, 지방 등)을 완전히 대사하여 유효 성분인 생리활성물질의 생산량을 증대할 수 있다.
한편, 상기 2차 저온 단기 정치 배양 단계 또는 3차 장기 정치 숙성 단계 이후에 필요에 따라 선택적으로 제균 필터에 의한 케피어 그레인의 제거 및/또는 방부 처리 공정을 추가할 수 있다. 이러한 공정은 본 발명의 기술분야에 속하는 통상의 방법에 의하여 이루어질 수 있으며, 상기 공정에 의하여 본 발명에 따른 발효 배양 조성물을 미생물에 의한 오염 없이 더 안전하게 조성물의 성분으로 사용할 수 있게 된다.
상기한 방법에 의하여 제조된 본 발명에 따른 케피어 그레인의 발효 배양물은 본 명세서의 실시예에서 기재된 바와 같이 피부 상태 개선, 항산화, 항염증 및 항비만을 위한 유효성분이 발효 전에 비하여 현저히 증가하여 피부 상태 개선, 항산화, 항염증 및 항비만 등의 효과를 현저히 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 케피어 그레인의 발효 배양물 제조 방법에 의하여 제조된 케피어 그레인의 발효 배양물을 본 발명의 다른 하나의 양태로서 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 케피어 그레인의 발효 배양물을 포함하는 피부 상태 개선, 항산화, 항염증 및/또는 항비만을 위한 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 피부 상태 개선은 피부 상태의 모든 형태의 호전 및 양호화를 의미하며, 바람직하게는 피부의 주름 개선 및 피부 미백 개선을 의미한다.
상기 피부의 주름 개선은 피부세포의 노화나 사멸 또는 외적인 압력에 의하여 피부에 생기는 스크래치, 잔주름, 굵은 주름 등을 감소시키거나 예방 또는 제거하는 것을 의미한다.
상기 피부 미백 개선은 멜라닌 색소의 침착으로 야기되는 피부의 흑화를 방지하여 피부 트러블을 감소시키거나 예방 또는 제거하는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명의 상기 케피어 그레인의 발효 배양물을 포함하는 조성물은 피부 세포의 콜라겐 생합성능을 증가시키는 등의 효과를 가지므로 피부의 주름 개선 용도로서 유용하다.
또한, 본 발명의 상기 케피어 그레인의 발효 배양물을 포함하는 조성물은 피부 세포의 멜라닌 생성 억제능을 증가시키는 등의 효과를 가지므로 피부의 미백 용도로서 유용하다.
본 발명의 상기 케피어 그레인의 발효 배양물을 포함하는 조성물은 다양한 자극 및 원인으로 인해 발생하는 활성산소(ROS)로 인한 산화적 손상으로부터 세포 등을 보호하는 항산화 효과를 가지고 있음이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 조성물은 산화 스트레스를 억제 또는 제거하여 예방 또는 치료할 수 있는 다양한 질환, 질병 또는 이상 상태에 적용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 항산화-관련 질환은, 아테롬성 동맥경화증, 관상동맥질환, 심장동맥 재협착, 재관류 손상, 파키슨병 또는 알츠하이머 질환과 같은 신경변성 질환, 뇌졸중, 암, 노화, 심혈관 질환, 골다공증, 중추신경계 장애, 말초혈관 질환 및 호흡곤란을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 항산화용 조성물은 노화의 예방 또는 치료에 이용된다.
또한, 본 발명의 상기 케피어 그레인의 발효 배양물을 포함하는 조성물은 일반적으로 염증반응에서 통증에 주요한 작용을 하는 COX-2에 작용하는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 조성물은 염증반응을 억제하여 예방 또는 치료될 수 있는 다양한 질환, 질병 또는 이상 상태에 적용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 염증 관련 질환은, 예를 들어, 수포성 유천포창, 반흔성유천포창, 원판성 낭창, 홍반성 루푸스, 건선, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 알러지 및 아토피를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 염증억제용 조성물은, 바람직하게는, 아토피의 예방 또는 치료에 이용된다.
이외에도 본 발명의 상기 케피어 그레인의 발효 배양물을 포함하는 조성물은 에너지 불균형에 의하여 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)인 비만(obesity)의 예방 및 치료 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성물은 항비만 조성물로서 사용된다.
본 발명에서 사용된 용어, "예방"이란 조성물의 투여로 상술한 피부 주름, 피부 흑화, 산화 스트레스, 염증, 비만 등의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용된 용어, "개선" 또는 "치료"란 조성물의 투여로 상술한 피부 주름, 피부 흑화, 산화 스트레스, 염증, 비만 등이 감소하거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 상기에서 "투여"는 개체의 경구 또는 비경구를 통한 개체 내 흡수 또는 섭취를 말한다. 또한, 상기 개체는 피부 주름, 피부 흑화, 산화 스트레스, 염증, 비만 또는 이의 직, 간접적 원인에 의해 유발된 질환을 가지고 있으며, 본 발명의 상기 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유동물을 의미한다.
상기 케피어 그레인의 발효 배양물은 본 발명의 상기 피부 상태 개선, 항산화, 항염증 및/또는 항비만을 위한 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.0001 내지 15.0중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 10중량%, 보다 더 바람직하게는 0.001 내지 5중량%로 포함된다.
한편, 본 발명의 상기 케피어 그레인의 발효 배양물을 포함하는 피부 상태 개선, 항산화, 항염증 및/또는 항비만을 위한 조성물은 피부 상태 개선용, 피부 미백용, 항산화용, 항염증용, 항비만용의 약제학적 조성물, 화장료 조성물, 또는 식품 조성물로서 이용 가능하다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 이용되는 경우에는, 상술한 피부상태개선, 항산화, 항염증, 및/또는 항비만용 조성물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 종류 및 이의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강 및 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 특정 추출물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 특정 추출물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 성인에게 1일에 0.1 내지 1000mg/kg, 바람직하게는 10 내지 100mg/kg의 용량을, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 치료 목적에 따라 약제학 분야에서 통상적인 제제로 제형화될 수 있는데, 예를 들어, 정제, 캅셀제, 산제, 과립, 현탁제, 유제, 시럽제, 유탁제, 경고제, 연고제, 스프레이제, 오일제, 겔제, 주정제, 틴크제, 욕제, 리니먼트제, 로션제, 패취제, 패드제, 크림제 등으로 제형화될 수 있다. 또한, 환부에 직접 도포하는 국소투여를 목적으로 하는 피부 외용제로서 바람직하게 사용될 수 있는데, 이 경우 연고제, 로션제, 스프레이제, 젤 등의 형태가 바람직하다. 이들 피부외용제는 또한 치료 부위에 직접 적용될 수 있는 지지 기재(support base) 또는 매트릭스 등에 포함될 수 있으며, 지지기재의 예는 거즈 또는 붕대를 포함한다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 이용되는 경우에는, 상술한 피부상태개선, 항산화, 항염증, 및/또는 항비만용 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함한다. 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림 등으로 제형화될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있는데, 예를 들어 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 이용되는 경우에는, 피부상태개선, 항산화, 항염증, 및/또는 항비만용 조성물 이외에 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물은 포도당 및 과당 등의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 및 올리고당 등의 디사카라이드, 덱스트린 및 사이클로덱스트린 등의 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제는 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 이러한 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강식품이 건강음료일 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 100㎖ 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.4g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03g이다.
상기 건강식품은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강식품 100중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 케피어 그레인 발효 배양물은 천연물로부터 유래하여 독성 및 부작용이 거의 없고, 피부 누적 자극 시험에서도 이미 안전성이 검증되었기 때문에 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있으므로 상기한 바와 같은 약제학적 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
본 발명에 의하여 종래 배양 방법에 따른 발효 배양물보다 식물 추출물 및 쌀에 함유된 주요 생리활성 물질의 생성 및 효능을 증가시킬 수 있는 케피어 그레인의 배지 조성물 및 발효 배양물을 제공할 수 있으며, 그에 따른 향상된 주름 개선 효과, 피부 미백 효과, 항염 효과, 항산화 효과, 및 항비만 효과를 나타내고, 세포 독성 및 피부 부작용이 없으므로, 화장료, 식품 및 약품으로서 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 케피어 그레인의 발효 배양물 제조 방법을 도시한 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 케피어 그레인의 발효 배양물의 콜라겐(타입 I 콜라겐) 생합성 촉진 효과를 나타내는 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 케피어 그레인의 발효 배양물의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 케피어 그레인의 발효 배양물의 항염증 효과를 나타내는 그림이다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 더욱 상세히 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 한정되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 케피어 그레인 배양배지 제조
케피어 그레인의 배양을 배지를 제조하기 위하여 탈지분유 0.3% (탈지분유 조성 100g 당 탄수화물 52g, 당류 47g, 단백질 35g, 지방 1g, 포화지방 0.5g, 콜레스테롤 20mg, 나트륨 600mg, 칼슘 1100mg) (w/v) (서울우유), 식물추출물 2.0% (w/v), 쌀 1%, 글루코스 1%를 준비하고, 이를 정제수 95.7%(w/w)에 혼합한 후 교반하여 용해시켰다.
상기에서 식물추출물은 유채, 동백, 녹차, 감귤, 백년초의 전초 1kg 각각 채취하여 이물질 및 불순물이 완전히 제거되도록 깨끗이 세척한 다음, 각각 20 내지 35℃에서 음건한 다음, 분쇄하여 입자의 크기가 1mm 이하가 되도록 하였다. 그 다음 상기 분쇄된 각 식물 분말 1kg을 70% 에탄올 10L에 침지하여 24시간 동안 초음파 추출하였다. 그 후 수득한 추출액을 여과지(Advantes, No.2)에 여과하고, 감압농축하여 각각의 식물 추출물을 제조하였다.
상기 쌀은 도정된 쌀을 구입하여 정제수에 3회 세척 후 건조한 다음, 분쇄하여 고운 분말형태가 되도록 하였다. 그 후 분말 형태의 쌀 분쇄물을 배양배지에 첨가하여 사용하였다.
실시예 2: 케피어 그레인의 식물추출물 발효배양법
상기 실시예 1에서 제조된 케피어 그레인 배양 배지 조건을 기준으로 주름개선, 미백, 항염, 항산화 및 항비만효과를 향상시키는 최적의 배양 조건을 확립하기 위해 조건별 발효 공정을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 케피어 그레인 배양 배지에 케피어 그레인을 2% (w/v)로 접종하고, 35℃의 온도에서 17시간 동안 150rpm의 교반속도로 1차 고온 단기 교반 배양하였다. 이때 통기조건은 1vvm이었으며, pH는 첨가되는 추출물 종류에 따라 초산 또는 암모니아수로 조절하여 pH 5.5 조건으로 배양하였다.
다음으로, 2차 저온 단기 정치 배양으로 1차 고온 단기 교반 배양을 한 배양물을 25℃의 온도에서 7시간 동안 정치하면서 배양하였다. 이때 통기조건은 혐기조건으로 0~0.1vvm이었고 pH는 4.0조건에서 배양하였다.
2차 배양이 완료된 후 멸균된 메쉬필터를 사용하여 케피어 그레인을 멸균하였다. 이후 3차 초저온 장기 정치 배양으로 4℃의 온도에서 336시간 동안 혐기조건으로 0~0.1vvm으로 정치하면서 배양하였으며 pH는 4.0 조건에서 배양하였다. 3차 배양이 완료된 후 제균 필터로 멸균한 후 방부 처리를 하여 케피어 그레인의 식물 추출물 발효 배양물을 제조하였다.
실시예 3: 케피어 그레인 천연식물 발효 배양물의 피부누적 자극도
상기 실시예 2에서 제조한 각 발효 배양물을 사용하여 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적첩포를 시행하는 것에 의하여 플로레틴 술폰산염이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다.
첩포방법은 핀 챔버(Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였다. 챔버에 상기 각 피부 외용제를 15ul씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 아래의 공식을 이용하여 점수화 하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
[실험식 1]
평균반응도=[[반응지수×반응도/총피검자수×최고점수(4점)]×100]÷검사회수 (9회)
이 때, 반응도에서 ±는 1점, +는 2점, ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정하였다.
시험물질 반응이 나타난 피검자 수 평균반응도
1주 2주 3주
1차 2차 3차 4차 5차 6차 7차 8차 9차
동백 대조군 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.09
시험군 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.00
유채 대조군 - - - - - - - - - - - 1 - - - - - - - - - - - - - - - 0.09
시험군 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.00
녹차 대조군 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.00
시험군 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 - - - 0.09
감귤 대조군 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.00
시험군 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.00
백년초 대조군 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.00
시험군 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.00
피검인원 30 30 30 30 30 30 30 30 30
상기 표 1에서 동백 발효배양 대조군의 경우, ±, +, ++에 해당하는 사람의 수가 각각 1명, 0명, 0명이었고, 유채 발효배양 대조군의 경우 0명, 0명, 1명이었고, 녹차 발효배양 시험군의 경우, 0명, 0명, 1명이었다. 그 외 나머지는 반응이 나타나지 않았으며, 상기 기재된 식에 따라 계산하면 평균 반응도가 3 이하가 되어 안전한 조성물로 판단되었다.
상기 표 1에 기재된 바와 같이, 각각의 식물 추출 발효배양물은 대조군을 포함해서 뚜렷한 누적자극 양상을 나타내지 않았으며 인체 피부에 안전한 물질로 판정되었다.
실시예 4: 케피어 그레인 천연식물 발효 배양물의 주름개선 효과
주름개선효과는 콜라겐 생합성능을 측정하여 효과를 비교하였다. 사람의 섬유아세포를 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 24 well-plate에 3×105/well의 세포를 접종시키고 5% 농도의 CO2 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 각 well의 배지를 교환하고 농도별로 각각의 식물추출물 케피어 그레인 발효 전과 후의 배양액을 처리하였다. 아무것도 처리하지 않은 조건을 음성대조군으로 TGF-beta (10ng/ml)를 처리한 조건을 양성대조군으로 각각의 효과를 비교하였다. 각각의 시료를 처리하고 24시간 후 세포배양액을 수집하여 콜라겐 측정 키트 (Procollagen Type I C-peptide EIA kit, 다카라, 교토, 일본)를 이용하여 콜라겐 합성량을 측정한 결과를 하기 도 2에 나타내었다.
실험결과, 케피어 그레인 식물추출물 발효배양액을 처리한 시험군에서 발효전 배양액과 식물추출물을 처리하지 않은 발효배양액과 비교하여 보다 월등한 콜라겐 합성능을 나타내었으며, 처리농도가 증가할수록 콜라겐의 합성 정도가 높아져 농도 의존적인 경향이 관찰되었다.
실시예 5: 케피어 그레인 천연식물 발효 배양물의 미백효과
멜라닌 생성 억제효과를 알아보기 위하여, B16 세포(B16 melanoma cell)를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
B16 세포를 10%의 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 6 well-plate에 1×105/well로 접종한 후, 세포가 웰 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 5% CO2 및 37℃ 하에서 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 멜라닌세포자극호르몬(MSH) 및 시료를 적당농도로 희석된 배지에 교체한 후, 3일간 5% CO2 및 37℃ 하에서 배양하였다. 케피어 그레인 식물추출 발효배양액은 발효 전과 후 각각을 1, 10, 100ppm 농도로 처리하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphated buffer salinee)로 세척한 후, 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 혈구계를 이용하여 세포수를 측정한 다음, 10,000 내지 13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 펠렛(pellet)을 얻었다. 얻어진 세포 펠렛을 60℃에서 건조시킨 후에 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100 ㎕를 넣어 60℃ 항온조에서 세포내 멜라닌을 얻었다. 이 액을 가지고 microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 일정 수당 멜라닌 양을 구하였다. 그 결과를 하기 도 3에 나타내었다.
실험결과, 케피어 그레인 식물추출물 발효배양액을 처리한 시험군에서 발효전 배양액과 식물추출물을 처리하지 않은 발효배양액과 비교하여 월등한 멜라닌 생성 억제능을 나타내었으며, 알부틴과 유사한 멜라닌 생성억제능을 나타내었다.
실시예 6: 케피어 그레인 천연식물 발효 배양물의 항산화 효과
수퍼옥사이드 디스뮤타아제(Superoxide dismutase, SOD)는 수퍼 옥사이드 음이온(Superoxide anion)를 H2O2와 O2로 전환시키는 항산화효소로 알려져 있다. 이 실험은 잔틴 옥시다아제(Xanthine oxidase)에 의해 발생한 수퍼 옥사이드 음이온이 시험에 사용된 시료에 의해 제거된 비율을 관찰함으로써, 시료의 항산화능을 평가하는 방법이다. 실험은 Dojindo(일본)에서 구입한 키트(SOD Assay Kit-WST)를 사용하여 실시하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라 실험하였다. 간략하게 효과는 시료에 의한 수퍼옥사이드 음이온 제거율을 관찰함으로써, 항산화기능의 유무를 판단하였다. 실험 결과는 표 2에 나타내었다.
발효유무조건 수퍼 옥사이드 음이온 제거율 (%)
유채 발효 동백 발효 녹차 발효 감귤 발효 백년초 발효
1 ppm 10 ppm 100 ppm 1 ppm 10 ppm 100 ppm 1 ppm 10 ppm 100 ppm 1 ppm 10 ppm 100 ppm 1 ppm 10 ppm 100 ppm
발효전 2 3 2 3 2 3 4 3 2 3 1 3 1 2 1
1차
발효		 4 8 20 5 9 19 5 8 18 4 9 20 3 8 19
2차
발효		 6 10 25 6 12 26 6 11 24 7 10 28 5 11 27
3차
발효		 7 15 38 8 18 40 8 16 39 8 17 41 6 16 38
실험결과, 케피어 그레인 식물추출물 발효배양액은 농도의존적으로 항산화효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.
실시예 7: 케피어 그레인 천연식물 발효 배양물의 항염 효과
염증반응에 동반해서 그 발현정도가 높아지는 COX-2(cyclooxygenase-2)생성에 케피어 그레인 천연식물 발효 배양액이 효과가 있는지를 살펴보기 위해, 면역대식세포(macrophage)인 RAW264.7 세포를 이용하여 하기와 같은 실험을 진행하였다. RAW264.7 세포를 12-well plate에 24시간동안 배양 후 COX-2 luciferase vector를 형질주입(transfection)시킨 후 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 케피어 그레인 천연식물 발효배양액을 농도별로 전처리후 LPS(Lipopolysaccharide) 200ng/ml를 처리하여 COX-2 생성을 유도하였다. 그 후, 케피어 그레인 천연식물 발효배양액에 의해 저해된 COX-2 생성정도를 luciferase 형광발현정도를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
실험결과, 케피어 그레인 식물추출물 발효배양액은 발효전 배양액과 식물추출물을 처리하지 않은 발효배양액과 비교하여 월등한 항염증효과를 나타내었으며, 농도의존적으로 항염증 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 케피어 그레인 천연추출 발효 배양물의 비만예방 및 억제효과
생후 7주된 ICR계 수컷 마우스(챨스리버, 일본)를 1주일 동안 예비사육하고 1군 7마리로 실험에 사용하였다. 동물은 온도 23±1℃, 습도 55±5%, 조명시간 12시간/일(day)로 설정된 항온항실에서 사육하고, 사료에 라보MR(일본농산공업 제조)을 사용하며 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
케피어 그레인 천연식물 발효 배양액은 0.1%와 1%가 되도록 리포좀제형(레시틴 5%에 녹인 것)으로 제조하였다. 각 시료 용액은 마우스 10 g당 0.1 ml 투여되도록 농도를 조정하여 투여량을 1.5 g/kg 과 1 g/kg으로 하였다. 또한, 대조군은 5% 레시틴 에멀젼으로 하였다. 마우스는 투여하기 전날부터 절식(絶食) 상태로 하여 다음 날 강제로 단회(單回) 투여하였다. 시험기간은 2주일로 하고 체중 및 일반증상을 측정 및 관찰하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
처리
조건		 일수 체중 (g)
무처리군 5 25.3 25.7 25.9 24.8 25.5 25.6 26.1 25.4 25.3 24.8
10 31.2 32.8 31.8 32.4 32.1 31.5 31.7 31.4 32.4 31.3
15 35.8 36.2 36.4 36.1 35.5 36.3 36 35.6 35.7 36.2
처리
조건		 일수 유채 발효 동백 발효 녹차 발효 감귤 발효 백년초 발효
0.1% 1% 0.1% 1% 0.1% 1% 0.1% 1% 0.1% 1%
발효전 5 24.7 24.1 25.2 24.8 24.6 25.3 25.6 24.6 24.3 24.8
10 29.2 30.5 29.1 29.4 30.6 29.6 30.8 29.7 31.1 29.9
15 34.5 34.3 34.2 35 34.3 34.7 35.1 34.5 34.9 34.1
1차발효 5 24.6 24.2 24.6 24.6 24.8 25.1 25.8 24.7 24.5 24.9
10 29.1 30.2 29.0 29.1 30.2 29.5 30.5 29.8 30.8 29.5
15 34.3 34.1 34.0 34.7 34.1 34.4 34.9 34.1 34.5 33.8
2차발효 5 24.4 24.1 24.6 24.5 24.7 24.8 25.2 24.8 24.2 24.5
10 28.8 28.5 29.0 31.9 29.2 29.2 29.0 29.1 29.3 28.9
15 34.0 33.7 33.7 33.4 33.6 33.3 33.1 33.8 33.4 33.6
3차발효 5 24.3 24.1 24.5 24.9 24.6 24.6 24.2 24.7 25.2 24.3
10 28.4 27.9 28.6 28.4 27.9 28.1 27.2 28.3 28.6 27.8
15 33.1 32.4 32.1 31.8 32.6 31.3 31.4 32.8 32.5 32.2
실험결과, 케피어 그레인 식물추출물 발효배양액은 발효전 배양액을 투여한 조건과 무처리군에 비하여 발효가 진행됨에 따라 상대적으로 높은 비만억제 효과를 나타내었으며 투여 농도가 높아질수록 그 효능이 증가됨을 관찰할 수 있었다.
상기한 바와 같이, 1차, 2차, 3차 발효의 과정을 거칠수록 본 발명에 따른 식물 추출물을 포함하는 배지로부터 케피어 그레인의 발효 배양물은 피부 주름 개선, 피부 미백, 항산화, 항염증 및 항비만에 대한 효능이 향상되었음을 알 수 있었다. 특히, 본 발명의 실시예에서는 구체적으로 기술하지는 않았지만, 1차 및 2차 배양법을 통해서도 공정 시간 대비 천연추출물 보다 높은(1.5배~10배) 효능과 향상된 유효성분 함량을 얻을 수 있었다.

Claims (12)

  1. (a) 유채, 동백, 녹차, 감귤 및 백년초로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상 선택되는 식물의 추출물; (b) 탈지분유; 및 (c) 쌀 분말을 포함하는 케피어 그레인 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 식물 추출물, (b) 탈지분유, 및 (c) 쌀 분말은 0.5 내지 2: 0.3 내지 10: 0.3 ~ 10의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 케피어 그레인 배지 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항의 케피어 그레인 배지 조성물에 케피어 그레인을 접종하고 교반하면서 32 내지 37℃에서 10 내지 36시간 동안 발효하는 1차 고온 교반 발효 단계; 및
    상기 제1차 고온 교반 발효 단계에서 발효된 발효물을 20 내지 28℃에서 5 내지 36시간 동안 정치상태로 발효하는 2차 저온 정치 발효 단계;를 포함하는 케피어 그레인의 발효 배양물 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 2차 저온 정치 발효 단계에서 발효된 발효물에서 케피어 그레인의 균체를 제거한 4 내지 15℃에서 240 내지 360시간 동안 정치상태로 발효시키는 3차 장기 정치 숙성 단계;를 추가로 더 포함하는 케피어 그레인의 발효 배양물 제조 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 1차 고온 교반 발효 단계의 케피어 그레인은 배지 조성물에 함유된 식물 추출물의 함량과 동일한 양으로 접종하는 것을 특징으로 하는 케피어 그레인의 발효 배양물 제조 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 1차 고온 교반 발효 단계는 50 내지 300rpm의 교반 속도, 0.5 내지 2.0 vvm 및 pH 4.5 내지 6.0의 조건으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 케피어 그레인의 발효 배양물 제조 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 2차 저온 정치 발효 단계는 0 내지 0.3vvm의 통기 조건으로 이루어지며, 상기 제3차 장기 정치 숙성 발효 단계는 0.5 내지 2.0 vvm의 통기 조건으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 케피어 그레인의 발효 배양물 제조 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 케피어 그레인의 균체 제거는 케피어 그레인의 총균체량 중 70 내지 100%를 제거하는 것을 특징으로 하는 케피어 그레인의 발효 배양물 제조 방법.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 케피어 그레인의 발효 배양물.
  10. 제9항의 케피어 그레인의 발효 배양물을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 개선용, 피부 미백용, 항산화용 또는 항염증용 화장료 조성물.
  11. 제9항의 케피어 그레인의 발효 배양물을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 개선용, 피부 미백용, 항산화용, 항염증용 또는 항비만용 약제학적 조성물.
  12. 제9항의 케피어 그레인의 발효 배양물을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 개선용, 피부 미백용, 항산화용, 항염증용 또는 항비만용 식품 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107897367A (zh) * 2017-10-20 2018-04-13 蚌埠学院 一种富含花青素的低脂红心火龙果酸奶及其制备方法
WO2022086025A1 (ko) * 2020-10-20 2022-04-28 강승찬 식물 발효액을 이용한 식물 발효물 제조방법
KR20230033314A (ko) * 2021-09-01 2023-03-08 (주)제이뷰티 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물

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