KR102283628B1 - 바이러스 감염 관련 유전자 불활성에 의해 방향족 아미노산 생산능력이 향상된 균주 - Google Patents
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Abstract
바이러스 감염 관련 유전자인 dcrB, intS, 및 yecE 중 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 방향족 아미노산 생산능이 향상된 변이 균주가 개시된다.
Description
본 발명은 바이러스 감염 관련 유전자 불활성에 의해 방향족 아미노산 생산능력이 향상된 균주에 관한 것이다.
방향족 아미노산, 특히 L-트립토판과 L-페닐알라닌은 사료용 아미노산의 핵심품목으로서 전 세계에서 연간 3000억 달러 규모의 시장을 형성하고 있는 고부가가치 산업이다.
방향족 아미노산은 재조합 균주를 이용해 생산하고 있으며, 이의 생산량을 늘리기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 코리스미산(Chorismate)은 방향족 아미노산 생합성 경로에서 필요한 전구체로서, 이를 생산하기 위해서는 PEP(phosphoenolpyruvate), E4P(erythrose-4-phosphate), 부기질인 PRPP(phosphoribosyl pyrophosphate), 세린(Serine), 글루타민(Glutamine) 등이 필요하다. 따라서, 기존에는 L-트립토판 생산능력을 향상시키기 위해 E4P, PEP, 또는 PRPP의 생합성 경로를 강화하기 위한 연구가 진행되었다.
한편, 균주에 의한 아미노산 생산에서 바이러스의 오염으로 인해 아미노산 생산이 감소할 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 등록특허 10-1608734에는 NfrA, NfrB 파지 수용체의 발현을 억제함으로써 쓰레오닌 또는 트립토판의 생산성을 향상시키는 기술이 개시되어 있다. 그러나 바이러스 감염과 관련된 단백질의 활성을 억제하더라도 바이러스 감염과 무관하게 아미노산 생산성이 오히려 감소하거나, 아미노산 종류에 따라 생산량의 변화가 다르게 나타나는 등 예기치 않은 결과를 얻을 수 있으므로 보다 많은 연구가 필요한 실정이다.
일 구체예에 따르면, 바이러스 감염 관련 유전자의 발현을 억제시킴으로써 방향족 아미노산의 생산능력이 향상된 균주를 제공한다.
일 양상은 바이러스 감염 관련 유전자인 dcrB, intS, 및 yecE 중 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 방향족 아미노산 생산능이 향상된 변이 균주를 제공한다.
상기 dcrB 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 intS 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 yecE 유전자는 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
dcrB 유전자는 dcrA, btuB와 함께 파지 C1(pharge C1)의 부착에 관여하는 단백질을 발현한다. intS 유전자는 KpLE1 프로파지(KplE1 prophage, CPS-53)의 용균주기(lytic cycle) 및 용원주기(lysogenic cycle)에 관여하는 integrase 단백질을 발현한다. yecE 유전자는 프로파지 φ297(prophage φ297)의 용원주기시 삽입되는 위치이다.
본 발명자는 바이러스의 균주 감염과 관련된 여러 유전자들의 발현을 억제함으로써 아미노산 생산성을 향상시킬 수 있는지 연구하던 중, dcrB, intS, 및 yecE 유전자 중 어느 하나의 발현을 억제함으로서 특정 아미노산 생산성을 향상시킬 수 있음을 발견하였다.
dcrB 및 intS 유전자는 이로부터 생산되는 바이러스 감염 관련 단백질의 활성을 약화 또는 불활성화시킴으로서 방향족 아미노산 생산성이 향상될 수 있다. yecE 유전자는 바이러스 유전자의 삽입 위치로서, yecE 유전자 자리가 제거됨으로써 방향족 아미노산 생산능이 향상될 수 있다. 다만 본 명세서의 실시예에 따르면 이러한 방향족 아미노산 생산 증가는 단순히 바이러스 감염 억제에 의한 것일 뿐만 아니라, dcrB, intS, 또는 yecE의 발현 억제가 방향족 아미노산 생산을 촉진한 결과일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "활성이 약화"는 객체인 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 감소되는 것을 의미한다. 이러한 활성의 약화는 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "불활성화"는 효소 등 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미하며, 또한 유전자 자체가 제거된 경우도 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현이 증가"는 객체인 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 증가되는 것을 의미한다. 변이 전 균주에 발현을 증가시키고자 하는 유전자가 존재하지 않는 경우에는 하나 이상의 유전자를 상기 균주의 염색체에 도입하여 발현을 증가시킬 수 있고, 변이 전 균주에 발현을 증가시키고자 하는 유전자가 존재하는 경우에는 하나 이상의 유전자를 상기 균주에 추가로 도입하거나 기존 유전자의 발현량이 증가하도록 유전공학적으로 조작할 수 있다.
본 발명에서, 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성이 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 방향족 아미노산은 L-티로신(L-tyrosine), L-트립토판(L-tryptophan, 및 L-페닐알라닌(L-phenylalanine)일 수 있고, 바람직하게는 L-트립토판일 수 있다.
본 발명자는 바이러스 감염 관련 유전자들의 발현을 조절하고 아미노산 발현량의 변화를 관찰하던 중, dcrB, intS, 및 yecE 유전자 중에서 어느 하나의 발현을 억제하면 아미노산 중 일부 아미노산의 생산량은 감소하는 반면, 방향족 아미노산의 생산량이 특이적으로 증가할 수 있다는 점을 확인하였다.
일 구체예에 따르면, 상기 변이 균주는 dcrB, intS, 및 yecE 중 적어도 하나의 유전자 전부 또는 일부가 삽입, 치환, 또는 결실된 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 변이 균주는 에스케리키아(Escherichia)속 균주일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 에스케리키아 속 균주는 대장균(Escherichia coli)일 수 있고, 예를 들면 KFCC11660P 및 KCCM10016 기탁 균주일 수 있다.
다른 양상에 따르면, 상기 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 배양된 균주 및 배양 배지에서 방향족 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 방향족 아미노산의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 이용되는 균주는 당업계에 공지된 배양 방법을 통해 배양될 수 있다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다.
배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가 될 수 있다.
배양물의 온도는 27 내지 40℃, 바람직하게는 30 내지 37℃일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
방향족 아미노산을 회수하는 단계는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 회수할 수 있으며, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 방향족 아미노산은 L-트립토판, L-페닐알라닌, 및 L-트리신일 수 있고, 바람직하게는 L-트립토판일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 균주의 바이러스 감염 관련 유전자인 dcrB, intS, 및 yecE 중 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 방향족 아미노산의 생산량을 증가시킬 수 있다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1-1: dcrB 유전자가 결실된 균주 제작
모균주(수탁번호: KFCC11660P)에 원스텝 불활성화 방법(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6;97(12):6640-5)을 이용하여 dcrB 유전자가 불활성화된 변이 균주를 제작하였다.
KFCC11660P 균주 및 KCCM10016 균주는 대장균(Escherichia coli) 균주로서, 제 4 단편의 상동재조합을 위해 Red recombinase 플라스미드인 pKD46(GenBank 접근번호 AY048746)를 도입하고, pCP20 도입 전에는 pKD46을 제거한다.
dcrB 유전자 및 항생제 유전자가 포함된 DNA 단편을 상동재조합시켜 dcrB 유전자를 결실시키고, 다시 재조합된 DNA 단편으로부터 항생제 내성 유전자를 제거하는 과정을 거침으로써 dcrB 유전자를 불활성화시켰다. 구체적인 과정은 다음과 같다.
(1) 제 1 단편 제작
하기 표 1에서의 dcrB 유전자 일부 서열과 pKD13 플라스미드 일부 서열을 가지는 dcrB_PF, dcrB_PR 프라이머 쌍과 pKD13 플라스미드(Genbank 접근번호 AY048744)를 이용하여 PCR 반응(총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 1.4kb 의 증폭된 제 1 단편을 얻었다. 제 1 단편은 pKD13 플라스미드에서 유래한 카나마이신 내성 유전자를 포함하고 있다.
(2) 제 2 단편 제작
dcrB 유전자의 앞쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655의 지노믹(genomic) DNA를 주형으로 하고 표 1의 프라이머 dcrB_HF1 및 dcrB_HR1를 이용하여 PCR (총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 0.3 kb 증폭된 제 2 단편을 얻었다.
(3) 제 3 단편 제작
또한 dcrB 유전자의 뒤쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655의 지노믹 DNA를 주형으로 하여 표 1의 프라이머 dcrB_HF2와 dcrB_HR2를 이용하여 PCR 반응(총부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30 사이클 이후 72℃분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 0.3 kb 의 증폭된 제 3 단편을 얻었다.
(4) 제 4 단편 제작
위 실험에서 증폭된 각각의 제 1 단편, 제 2 단편, 및 제 3 단편은 증폭시 프라이머의 상보적 서열로 인하여 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 이 단편들을 프라이머를 제외하고 총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃ 2분 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃ 에서 10분 조건으로 PCR을 수행하여 약 2 kb 크기를 가지는 하나의 증폭된 제 4 단편을 얻었다. 제 4 단편은 dcrB 유전자 일부와 kanamycin 항생제 저항 유전자를 포함하고 있으며, 구체적으로 dcrB 유전자의 5' 방향의 일부 단편, kanamycin 항생제 저항 유전자, 그리고 dcrB 유전자의 3' 방향의 일부 단편으로 구성되어 있다.
(5) 제 4 단편 주입 및 dcrB 결실
Red recombinase 플라스미드인 pKD46(GenBank 접근번호 AY048746)을 포함하고 있는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주인 KFCC11660P 균주에 각각 획득한 제 4 단편을 전기천공법(electroporation)으로 주입하였다. 제 4 단편은 람다 레드 재조합 시스템(Lambda Red recombination)에 의해 dcrB와 상동재조합으로 교체됨으로써 dcrB가 결실된다.
이후 카나마이신(kanamycin) 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 dcrB 유전자의 결실 여부를 확인하였다. 반응은 표 1의 dcrB_CF 및 dcrB_CR 프라이머를 이용하여 총 부피 20 ㎕, 95℃ 5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 3분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분 조건으로 PCR을 수행하였다. 원래 dcrB 유전자가 있을 경우 생성되는 약 1.4 kb(결실 전)이 생성되는 것과 비교하여 염색체 내에 단편이 삽입된 경우 길이가 더 증가한 약 2.2 kb(항생제 유전자 포함)가 생성됨을 확인하였다.
(6) 항생제 저항 유전자 제거 및 선별
dcrB 유전자 결실이 확인된 균주로부터 항생제 내성 표식 유전자를 제거하기 위해 pCP20 플라스미드를 도입하여 FLP 재조합을 유도하였다. 이후 항생제 첨가 혹은 무첨가 LB 평판배지에서 dcrB 결실 균주를 배양하여 항생제 내성 표식 유전자가 제거된 것을 확인하였다.
실시예 1-2: dcrB 결실 균주의 배양 및 방향족 아미노산 생산량 평가
상기 실시예 1-1의 방법으로 제작된 대장균 KFCC11660PΔdcrB 및 KFCC11660P을 하기 표 2의 아미노산 생산용 배지에서 배양하였다.
배양은 하기 표 2와 같은 조성의 아미노산 생산용 배지가 10 mL이 담긴 플라스크에 상기 KFCC11660PΔdcrB, KFCC11660P 균주를 각각 부피를 기준으로 1%씩 접종하여 37℃에서 200 rpm으로 70시간 동안 진탕 배양하고, 그로부터 수득한 L-아미노산의 농도를 비교하였다.
상기 실험 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이 dcrB 유전자를 불활성화 시킨 경우 트립토판, 페닐알라닌, 티로신의 생산량이 증가하였고, 특히 트립토판의 생산량 증가가 월등함을 확인하였다.
실시예 2-1: intS 유전자가 결실된 균주 제작
상기 실시예 1-1와 동일한 방법으로 intS 유전자가 결실된 균주를 제작하였다. intS 유전자 결실 균주 제작에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 4에 기재되어 있다.
카나마이신(kanamycin) 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 intS 유전자의 결실 여부를 확인한 결과, 원래 intS 유전자가 있을 경우 생성되는 약 1.9 kb(결실 전)이 생성되는 것과 비교하여 염색체 내에 단편이 삽입된 경우 길이가 더 증가한 약 2.1 kb(항생제 유전자 포함)가 생성됨을 확인하였다.
실시예 2-2: intS 결실 균주의 배양 및 방향족 아미노산 생산량 평가
상기 실시예 2-1의 방법으로 제작된 대장균 KFCC11660PΔintS 및 KFCC11660P을 아미노산 생산용 배지에서 배양하였다. 배양방법 및 배지는 상기 실시예 1-2의 배양방법과 동일하였다.
상기 실험 결과, 하기 표 5에 나타난 바와 같이 intS 유전자를 불활성화 시킨 경우 트립토판, 페닐알라닌, 티로신의 생산량이 증가하였고, 특히 트립토판의 생산량 증가가 월등함을 확인하였다.
실시예 3-1: yecE 유전자가 결실된 균주 제작
상기 실시예 1-1와 동일한 방법으로 yecE 유전자가 결실된 균주를 제작하였다. yecE 유전자 결실 균주 제작에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 6에 기재되어 있다.
카나마이신(kanamycin) 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 intS 유전자의 결실 여부를 확인한 결과, 원래 intS 유전자가 있을 경우 생성되는 약 1.6 kb(결실 전)이 생성되는 것과 비교하여 염색체 내에 단편이 삽입된 경우 길이가 더 증가한 약 2.1 kb(항생제 유전자 포함)가 생성됨을 확인하였다.
실시예 3-2: yecE 결실 균주의 배양 및 방향족 아미노산 생산량 평가
상기 실시예 3-1의 방법으로 제작된 대장균 KFCC11660PΔyecE 및 KFCC11660P을 아미노산 생산용 배지에서 배양하였다. 배양방법 및 배지는 상기 실시예 1-2의 배양방법과 동일하였다.
상기 실험 결과, 하기 표 7에 나타난 바와 같이 yecE 유전자를 불활성화 시킨 경우 트립토판, 페닐알라닌, 티로신의 생산량이 증가하였고, 특히 트립토판의 생산량 증가가 월등함을 확인하였다.
실시예 4: dcrB 결실 균주의 배양 및 히스티딘 생산량 평가
상기 실시예 1-1, 실시예 2-1, 실시예 3-1의 방법으로 제작된 대장균 KFCC11660PΔdcrB, KFCC11660PΔintS, KFCC11660PΔyecE 및 KFCC11660P을 상기 실시예 1-2의 방법으로 배양하고 히스티딘의 생산량을 측정하여 하기 표 8에 나타내었다.
| 균주 | L-히스티딘 (상대량) |
| KFCC11660P | 1 |
| KFCC11660PΔdcrB | 0.8921 |
| KFCC11660PΔintS | 0.9572 |
| KFCC11660PΔyecE | 0.9243 |
상기 표 3, 표 5, 및 표7과 상기 표 8을 비교하면, dcrB, intS, 또는 yecE를 결실시킨 균주는 방향족 아미노산인 트립토판, 페닐알라닌, 트리신의 생산량이 증가한 반면, 히스티딘의 생산량은 다소 감소하거나 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과는 dcrB, intS, 또는 yecE 결실에 따른 아미노산 생산량 증가효과가 아미노산에 따라 달라질 수 있는 점, 그리고 단순히 바이러스 감염 억제에 의해 방향족 아미노산의 생산량이 상승한 것이 아니라는 점을 시사한다.
<110> Daesang Corporation
<120> Strain with Improved Aromatic Amino Acid Production Capacity by
Inactivation of Gene Related Virus Infection
<130> PN190275
<160> 27
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 558
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dcrB "G7767-MONOMER" 3609955..3610512 Escherichia coli K-12
substr. MG1655
<400> 1
atgcgcaatc tggttaaata tgtcggaatt ggcctgctgg ttatggggct tgcggcctgt 60
gatgataaag acactaacgc tacggcgcag ggttcggtcg cggaaagtaa cgctaccggg 120
aatcccgtca acctgcttga tggcaagtta agtttctcgc tgccagcgga tatgaccgac 180
cagagcggta agctgggaac gcaggccaat aacatgcatg tctggtccga cgccaccggg 240
cagaaagcag tcatcgtcat catgggcgat gatccgaaag aagatctggc ggtgctggcg 300
aagcgtctgg aagatcagca acgtagccgc gatccgcagc tgcaagtggt aaccaataaa 360
gccattgagc tgaaaggtca caaaatgcag cagttagaca gtattatctc cgcgaaaggc 420
cagacggcgt actcttccgt tattctgggt aacgtgggta atcaactgct gaccatgcaa 480
attacgctgc ccgctgacga tcagcaaaaa gcgcagacca ccgcagaaaa catcattaat 540
acgctggtta ttcagtaa 558
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dcrB_HF1
<400> 2
tccacactgt tcggtaacgt 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dcrB_HR1
<400> 3
tgacttcttc ctttcgataa acggcc 26
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dcrB_PF
<400> 4
ttatcgaaag gaagaagtca gtgtaggctg gagctgcttc 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dcrB_PR
<400> 5
ccgcctcatc atcttaaaac ctgtcaaaca tgagaattaa 40
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dcrB_HF2
<400> 6
gttttaagat gatgaggcgg cc 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dcrB_HR2
<400> 7
tggcgaaaat cggcgtctta 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dcrB_CF
<400> 8
acttcaacct gtttgtcgcc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dcrB_CR
<400> 9
ttagctgtgc gtttgtcggt 20
<210> 10
<211> 1158
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> intS "G7218-MONOMER" 2466545..2467702 Escherichia coli K-12
substr. MG1655
<400> 10
atgctcaccg ttaagcagat tgaagcagca aagccgaaag aaaaaccata ccgccttctc 60
gatggtaatg gcctgtacct ttatgtccct gtgtcaggga aaaaggtatg gcagcttcgc 120
tacaagattg acggtaagga gaaaatcctg accgtcggaa aatatccgct tatgactttg 180
caggaggcaa gggataaagc atggactgcg aggaaagaca tctcggttgg catcgatcct 240
gtaaaggcga aaaaggcttc gtctaacaac aattccttta gtgcgattta caaggaatgg 300
tacgagcaca agaagcaagt atggtcagta gggtatgcaa ctgaacttgc caaaatgttt 360
gacgacgaca ttttacctat cattggcggc cttgaaattc aggatattga gccgatgcaa 420
ctgctggaag taatccgcag gtttgaagat cgcggtgcaa tggaacgagc caacaaagca 480
cgcagaagat gcggcgaggt tttccgttac gctattgtca ccggaagggc taaatataac 540
ccggcacctg accttgctga cgccatgaag ggataccgca agaagaactt cccgtttctt 600
cctgcagacc agatcccggc attcaacaaa gcactggcaa cattttcagg aagtatcgta 660
tcgctcattg cgaccaaagt tttacgctac acagccctaa gaacgaaaga gcttcgttcc 720
atgctatgga agaacgtcga ttttgaaaat aggattatca ccatcgacgc cagtgtgatg 780
aaaggacgca aaattcatgt ggttcctatg tcagaccagg tagttgaact tctcactacg 840
ctaagctcca tcaccaaacc agtctcagag tttgtttttg ccgggcgcaa cgataagaag 900
aagccaatct gcgagaacgc ggtactgctt gtgatcaaac aaatcggcta tgagggtctg 960
gaaagcggtc acggattcag gcatgaattc agcacgatta tgaacgagca cgaatggcct 1020
gctgacgcta ttgaagtgca actggcacat gcaaacggcg gatctgtgcg tgggatttac 1080
aaccatgctc agtatctcga taaacgcaga gaaatgatgc aatggtgggc ggactggctt 1140
gatgagaagg tggagtga 1158
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> intS_HF1
<400> 11
gtttaagcaa tcgagcggca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> intS_HR1
<400> 12
gggtaaaaat ccggtgggta 20
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> intS_PF
<400> 13
tacccaccgg atttttaccc gtgtaggctg gagctgcttc 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> intS_PR
<400> 14
tcgatagttg ttaaggtcgc ctgtcaaaca tgagaattaa 40
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> intS_HF2
<400> 15
gcgaccttaa caactatcga 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> intS_HR2
<400> 16
tcgcgaagaa gctaaagctc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> intS_CF
<400> 17
cgtaaagcag aagcacgcca 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> intS_CR
<400> 18
tagcactcag tgtccccatg 20
<210> 19
<211> 819
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yecE "EG12379-MONOMER" 1951395..1952213 Escherichia coli K-12
substr. MG1655
<400> 19
atgatttaca tcggtctacc gcaatggtcg catcctaaat gggtgcggtt ggggatcacc 60
agccttgaag agtatgcccg ccactttaac tgcgtggagg gcaacaccac gctttacgcc 120
ctgccgaaac ccgaggttgt cctgcgctgg cgtgagcaga ccacagatga cttccgcttc 180
tgttttaagt ttccggcgac catttcgcat caggcagcat tacggcattg cgatgattta 240
gtgactgaat ttttgacccg catgtcaccg ttggctccgc gcattgggca atactggctg 300
caactgcctg ccacattcgg cccacgggag ctgcctgcgc tttggcattt tctcgattct 360
cttcctggcg aatttaatta tggcgtggaa gtccgccatc cacagttttt cgccaaagga 420
gaagaggaac aaacgcttaa tcgcggttta catcagcgcg gcgttaatcg ggtgatttta 480
gacagccgcc cggttcatgc agcacgtcca cacagtgaag ctattcgcga cgctcaacga 540
aaaaaaccta aagttccggt acatgctgta ctgacggcga caaatccgct gatccgtttt 600
atcggtagtg atgatatgac gcaaaaccgg gaattatttc aggtctggtt acaaaaatta 660
gcgcagtggc atcagaccac tacgccttat ctttttttac atacgccaga cattgcccag 720
gcaccggaac tggtacatac cctgtgggaa gacttacgta aaacgcttcc agagatcgga 780
gcagttccgg ctattccaca gcaatcttct cttttctga 819
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yecE_HF1
<400> 20
atcctgctgc attaggtgca 20
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yecE_HR1
<400> 21
tcataacgcg ttgaggatct cttc 24
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yecE_PF
<400> 22
agatcctcaa cgcgttatga gtgtaggctg gagctgcttc 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yecE_PR
<400> 23
gtctatgata ggtggcaaat ctgtcaaaca tgagaattaa 40
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yecE_HF2
<400> 24
atttgccacc tatcatagac aggtgcc 27
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yecE_HR2
<400> 25
gcggaacaga cggtgatgaa 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yecE_CF
<400> 26
tggtctgccg attacgctga 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yecE_CR
<400> 27
aagattcgcc agcaccatca 20
Claims (8)
- 바이러스 감염 관련 유전자인 dcrB, intS, 및 yecE 중 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 L-트립토판, L-페닐알라닌, 및 L-티로신 중 적어도 하나의 생산능이 향상된 대장균 변이 균주.
- 제 1 항에 있어서,
상기 dcrB 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고,
상기 intS 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것이고,
상기 yecE 유전자는 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 것인,
변이 균주. - 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 변이 균주는 dcrB, intS, 및 yecE 중 적어도 하나의 유전자 전부 또는 일부가 삽입, 치환, 또는 결실된 것인,
변이 균주. - 제1항의 변이 균주를 포함하는 L-트립토판, L-페닐알라닌, 및 L-티로신 중 적어도 하나의 아미노산을 생산하기 위한 조성물.
- 삭제
- dcrB, intS, 및 yecE 중 적어도 하나의 유전자를 불활성화킨 대장균 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 배양된 변이 균주 및 배양 배지에서 L-트립토판, L-페닐알라닌, 및 L-티로신 중 적어도 하나를 회수하는 단계를 포함하는,
방향족 아미노산의 제조 방법.
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190138236A KR102283628B1 (ko) | 2019-10-31 | 2019-10-31 | 바이러스 감염 관련 유전자 불활성에 의해 방향족 아미노산 생산능력이 향상된 균주 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190138236A KR102283628B1 (ko) | 2019-10-31 | 2019-10-31 | 바이러스 감염 관련 유전자 불활성에 의해 방향족 아미노산 생산능력이 향상된 균주 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210052112A KR20210052112A (ko) | 2021-05-10 |
| KR102283628B1 true KR102283628B1 (ko) | 2021-08-02 |
Family
ID=75917960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020190138236A KR102283628B1 (ko) | 2019-10-31 | 2019-10-31 | 바이러스 감염 관련 유전자 불활성에 의해 방향족 아미노산 생산능력이 향상된 균주 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102283628B1 (ko) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101608734B1 (ko) * | 2014-03-21 | 2016-04-04 | 씨제이제일제당 주식회사 | L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 l-아미노산을 생산하는 방법 |
| KR101830002B1 (ko) | 2016-10-11 | 2018-02-19 | 대상 주식회사 | 부기질의 공급 강화를 통한 l-트립토판이 과발현되는 균주 및 이를 이용하는 l-트립토판의 제조 방법 |
-
2019
- 2019-10-31 KR KR1020190138236A patent/KR102283628B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20210052112A (ko) | 2021-05-10 |
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|---|---|---|---|
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| GRNT | Written decision to grant |