KR101233666B1

KR101233666B1 - 박테리아 변이 균주를 이용한 이소루신 생산

Info

Publication number: KR101233666B1
Application number: KR1020100095526A
Authority: KR
Inventors: 정혜민; 박세조; 김석수
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2013-02-15
Also published as: KR20120033807A

Abstract

본 발명은 이소루신 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 이소로이신 생산능을 갖는 박테리아에서 ilvB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드를 불활성화시킴으로써 이소로이신의 생산능은 증가시킴과 동시에 발린의 생산은 효과적으로 감소시킬 수 있는 균주이다. 본 발명은 기존의 배양 온도 보다 높은 온도에서 배양을 하여도 이소로이신 생산능을 유지하면서 낮은 발린 생성량을 나타내므로, 본 발명의 균주를 이용하여 이소로이신을 제조할 경우 박테리아 배양시 투입되는 냉각수 등의 원재료비를 절약할 수 있는 장점을 가진다. 또한, 본 발명은 박테리아에서의 부산물인 발린의 생산능을 감소시킴으로써 이소루신을 높은 순도로 정제할 수 있을 뿐 만 아니라 이소루신의 회수율을 향상시켜 이로루신의 제조 원가를 크게 낮출 수 있다.

Description

박테리아 변이 균주를 이용한 이소루신 생산{Production of Isoleucine Using Mutant Bacteria}

본 발명은 이소루신 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주에 관한 것이다.

아미노산 L-이소루신은 동물 사료, 인간의 식품 첨가물 및 의약 분야에 사용되는 상업적으로 의미있는 산물이다. 상기 이유로 인하여 L-이소루신의 제조 방법을 향상시키는 것은 산업적인 의미로 보았을 때 중요하다.

L-이소루신은 분지쇄 아미노산인 L-발린, L-루신과 주요 생합성 경로를 공유한다. 특히 L-이소루신과 L-발린은 화학적인 구조와 등전점, 그리고 용해도 등의 화학적인 특성이 매우 유사하기 때문에 L-이소루신으로의 단일 아미노산을 고순도로 생산하기 위해서 많은 공정 단계 및 비용이 요구되고, 따라서 높은 수율로 회수하는데 어려움이 있다. 이소루신의 제조 비용을 낮추기 위해서는 이소루신과 함께 생산되는 주요 부산물인 발린의 함량이 낮은 균주를 개발하는 것이 중요하다.

L-이소루신 생산 균주를 개발하기 위한 방법은 종래 기술로부터 여러 가지가 있었다. 가장 일반적인 아미노산 생산 균주 개발법으로는 돌연변이법을 이용한 중간대사산물 또는 최종산물에 대한 내성주 선별법, 염색체 변이를 통한 목적 산물 생산 조절 유전자의 활성 결실/또는 강화 등이 있다. 즉 돌연변이법 이용으로는 이소루신 생합성 과정의 주요 중간대사 산물인 쓰레오닌 및 이소루신의 유사 구조체에 대한 내성을 가지는 변이주를 선별하는 방법이 적용될 수 있다.

그러나 상기 언급한 돌연변이법 등의 일반적인 아미노산 균주 개발 방법을 이소루신 생산 균주에 적용할 경우 이소루신과 주요 생합성 과정을 공유하고, 유사한 방법으로 세포 외에 배출되는 부산물인 발린의 생산에도 영향을 미칠 수 있는 가능성이 존재한다.

따라서 이소루신의 회수 수율을 높여 제조비용을 낮추기 위해서 이소루신 생산능을 가지는 동시에 주요 부산물인 발린을 낮은 함량으로 생산하는 균주를 개발하는 새로운 균주 개발 방법이 요구된다.

본 발명자들은 이소루신을 효율적으로 생산할 수 있는 박테리아 균주를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 이소루신 생산능 박테리아 균주의 아세토히드록시산 씬사아제 Ⅰ(acetohydroxyacid synthase Ⅰ)을 불활성화시킴으로써 이소루신 생산능이 증가될 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 이소루신 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 불활성화 아세토히드록시산 씬사아제 I(acetohydroxyacid synthase I)을 포함하는 이소루신 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주를 제공한다.

본 발명자들은 이소루신을 효율적으로 생산할 수 있는 박테리아 균주를 개발하고자 예의 노력하였으며, 그 결과, 이소루신 생산능 박테리아 균주의 아세토히드록시산 씬사아제 Ⅰ(acetohydroxyacid synthase Ⅰ)을 불활성화시킴으로써 이소루신 생산능이 증가될 수 있음을 규명하였다.

본 발명은 유전자 재조합 기술을 이용하여 이소루신 생산 박테리아 균주의 이소루신(L-Isoleucine; Ile), 발린(L-Valine; Val), 로이신(L-leucine; leu)의 생합성 과정에서 공통적으로 관여하는 AHAS I(acetohydroxyacid synthase I) 중 라지 유닛(large subunit) 인 ilvB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드가 불활성화된 균주이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 ilvB의 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 제조된 균주이다.

본 발명은 이소루신의 생산량은 증가시킴과 동시에 부산물인 발린의 생산량을 획기적으로 감소시킨 박테리아 변이 균주로서, 박테리아 및/또는 박테리아 배양액으로부터 이소루신을 분리 및 정제하는데 있어서 이소루신의 회수율 증가 및 이소루신의 분리 및 정제시 장애가 되는 발린의 생산을 효과적으로 감소시킨 박테리아 변이 균주이다.

본 발명의 명세서에서 박테리아 변이 균주를 표현하면서 사용하는 표현 “발린의 생산능의 감소”는 자연계로부터 이용할 수 있는 야생형 박테리아 균주로부터 생산되는 발린의 생산량보다 감소된 양을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 야생형 박테리아 균주와 비교하여 발린의 생산능이 감소된 균주이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 이소루신 생산량 대비 발린 생산량의 비율이 1-10%인 균주이다.

본 발명의 명세서에서 박테리아 변이 균주를 표현하면서 사용하는 표현 “발린 생산량의 비율”은 박테리아에서 생산하는 이소루신의 단위 중량 또는 부피를 기준으로 생산된 발린의 양을 백분율로 나타낸 비율을 의미한다. 예컨대, 박테리아에서 생산된 이소루신의 양이 100 g이고, 발린의 양이 10 g이라면 이소루신 생산량 대비 발린 생산량의 비율은 10%이다.

본 발명에서 이용하는 균주는 자연계에 존재한 이소루신 생산능을 가지는 박테리아 균주라면 제한없이 이용이 가능하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 균주는 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균주이며, 보다 바람직하게는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii)(Escherichia hermannii) 또는 에스케리치아 불네리스 (Escherichia vulneris)이고, 보다 더 바람직하게는 에스케리치아 콜라이 또는 에스케리치아 블라태이며, 가장 바람직하게는 에스케리치아 콜라이이다.

본 발명은 아세토히드록시산 씬사아제 I(ilvBN), 아세토히드록시산 씬사아제 Ⅱ(ilvGM) 및 아세토히드록시산 씬사아제 Ⅲ(ilvHI) 중 ilvB의 효소활성을 불능화시킴으로써 아세토히드록시산 씬사아제 효소 활성에 있어서 상대적으로 피루베이트(pyruvate)의 친화도를 낮추어 발린(L-Valine; Val)의 생성을 감소시키고, 아세토히드록시산 씬사아제 Ⅱ(ilvGM) 및 아세토히드록시산 씬사아제 Ⅲ(ilvHI)의 활성을 유지시킴으로써 이소루신의 생산능을 유지 및 증가시킨 박테리아 변이 균주이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 활성화 아세토히드록시산 씬사아제 Ⅱ 및 아세토히드록시산 씬사아제 Ⅲ를 포함하는 균주이다.

본 발명은 공지된 박테리아 균주의 배양방법을 통해 배양할 수 있다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다.

배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아세토히드록시산 씬사아제 I(acetohydroxyacid synthase I)를 불활성화시키는 단계를 포함하는 이소루신 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 아세토히드록시산 씬사아제 I(acetohydroxyacid synthase I)를 불활성화시키는 단계는 공지된 방법을 통하여 실시될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 아세토히드록시산 씬사아제 I를 불활성화시키는 단계는 CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 형질전환이 되지 않은 박테리아 균주로부터 형질전환된 박테리아 균주를 분리 및 수득하는 단계를 포함한다.

상기 본 발명에서 형질전환이 되지 않은 박테리아 균주로부터 형질전환된 박테리아 균주를 분리 및 수득하는 단계를 실시하는데 있어서 선택표지된 벡터를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 이용하는 벡터는 플라스미드 또는 파지(phage)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 이용하는 선택표지는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있고, 바람직하게는 비용의 측면을 고려하여 암피실린 또는 카나마이신 내성 유전자가 있다.

본 발명은 상기 불활성화 아세토히드록시산 씬사아제 I(acetohydroxyacid synthase I)을 포함하는 이소루신 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주와 동일한 균주를 제조하는 방법이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 이소루신 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주 및 이의 제조 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 이소로이신 생산능을 갖는 박테리아에서 ilvB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드를 불활성화시킴으로써 이소로이신의 생산능은 증가시킴과 동시에 발린의 생산은 효과적으로 감소시킬 수 있는 균주이다.

(ⅲ) 본 발명은 기존의 배양 온도 보다 높은 온도에서 배양을 하여도 이소로이신 생산능을 유지하면서 낮은 발린 생성량을 나타내므로, 본 발명의 균주를 이용하여 이소로이신을 제조할 경우 박테리아 배양시 투입되는 냉각수 등의 원재료비를 절약할 수 있는 장점을 가진다.

(ⅳ) 또한, 본 발명은 박테리아에서의 부산물인 발린의 생산능을 감소시킴으로써 이소루신을 높은 순도로 정제할 수 있을 뿐 만 아니라 이소루신의 회수율을 향상시켜 이로루신의 제조 원가를 크게 낮출 수 있다.

도 1은 ilvB 유전자의 결실여부를 확인한 PCR 분석 결과를 보여주는 젤 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: ilvB 유전자가 결실된 변이주 제조

ilvB 유전자를 원스탭 불활성화 방법(one step inactivation; Warner et al., PNAS, 6:6640-6645(2000))에 의해 결손시키고, 항생제 내성 부여 표식 유전자를 제거하였다. 결손하고자 하는 ilvB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열과 같다.

아세토히드록시산 씬사아제 I(acetohydroxyacid synthase I; AHAS I)의 라지 유니트(large subunit)를 코딩하는 유전자인 ilvB 결실 균주를 제작하기 위해서 하기 표 1에서의 프라이머 쌍과 pKD13 플라스미드(GenBank 접근번호 AY048744)를 이용하여 PCR 반응(총 반응 부피는 50 ㎕, 94℃에서 1분 1 사이클 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분 30초 총 30 사이클, 그런 다음 72℃에서 2분 및 10℃에서 5분)을 수행하였고, 그 결과 획득한 DNA 단편을 pKD46(GeneBank No.AY048746)을 포함하고 있는 에스케리치아 콜라이 DS44(Escherichia coli, DS44; KCTC 11602BP) 세포에 일렉트로포레이션하였다(one step inactivation; Warner et al., PNAS, 6:6640(2000)). 이후 카나마이신 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 ilvB 유전자의 결실여부를 확인하였다. PCR 반응 시 표 1의 ilvB_CF및 K 프라이머를 이용하여 앞서 기술한 PCR 반응 조건과 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행하였다. k 프라이머가 염색체내 삽입된 파쇄용 DNA에 작용하는 것이므로, 파쇄용 DNA가 삽입된 DS44ΔilvB는 예상대로 1.6kb정도의 산물이 형성되었고, DS44의 경우 파쇄용 DNA가 없으므로 PCR 반응이 일어나지 않아 산물이 형성되지 않았다(참조: 도 1). ilvB 유전자 결실이 확인된 균주를 이용하여 항생제 내성 표식 유전자를 제거하는 과정을 수행하였다. 그 과정으로는 ilvB 유전자 결실 균주에 pCP20 플라스미드를 도입하여 FLP 재조합을 유도하였다. 이후 항생제 첨가 혹은 무첨가된 LB 평판에서 ilvB 유전자 결실 균주를 배양하여 항생제 내성 표식 유전자 제거된 것을 확인하였다.

프라이머	염기서열
ilvB_F	5’-GTTTAAGCACCTCCCGGAAAGTCGGCCCAGAAGAAAAGGACTGGAGC ATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’
ilvB_R	5’- ACGTTGTCATGAGTTGTGTTTTGCATGGCTTATTCCCCCA CCATTTCAGTTGTA GGCTGGAGCTGCTTCG-3’
ilvB_CF	5'-cgcaaactgtgatcgatac-3'
K	5'-cggccacagtcgatgaatcc-3'

실시예 2. 에스케리치아 콜라이 DS44 균주와 ilvB 유전자 결실 균주의 이소루신 및 발린 생산량 평가

상기 실시예 1에서 얻어진 ilvB 유전자 결실 균주의 이소루신 및 발린의 생성량을 확인하기 위하여 모균주인 에스케리치아 콜라이 DS44(Escherichia coli, DS44; KCTC 11602BP)와 ilvB 유전자가 결실된 균주인 DS44ΔilvB의 이소루신 및 발린 생성량을 비교하였다. 상기 두 균주를 표 2의 F-1 배지조성으로 구성된 5 ℓ 발효조에서 이소루신 및 발린의 생성량을 비교하였다.

성분	사입 배지 농도	추가 배지 농도
포도당	80 g/ℓ	550 g/ℓ
옥수수 침지액	20 g/ℓ	-
황산암모늄	20 g/ℓ	1 g/ℓ
인산	15 g/ℓ	1 g/ℓ
푸마르산	1 g/ℓ	-
글루탐산나트륨	7 g/ℓ	-
구연산 나트륨	1 g/ℓ	-
콜린-HCl	1 g/ℓ	-
티아민-HCl	5 ㎎/ℓ	-
피리독신-HCl	10 ㎎/ℓ	-
니코틴산	5 ㎎/ℓ	-
비오틴	5 ㎎/ℓ	-
염화칼슘	5 ㎎/ℓ	-
염화코발트	5 ㎎/ℓ	-
황산철	20 ㎎/ℓ	-
황산망간	5 ㎎/ℓ	-
황산아연	5 ㎎/ℓ	-
황산구리	5 ㎎/ℓ	-
수산화나트륨	10 g/ℓ	-

상기 배지 조건으로 사입 액량 20 ℓ과 추가 액량 342 ㎖으로 수행하였고, 물리적인 배양 조건은 DS44(KTCK 11602BP)는 온도 27℃, 교반속도 500 rpm 및 통기량 1 vvm의 조건으로 배양하였다. 본 발명에서 얻어진 DS44ΔilvB은 온도 조건을 DS44의 배양 조건보다 3℃ 높은 30℃로 하였으며, 기타 교반 속도 및 통기량 부분은 같은 조건으로 배양하였다.

미생물을 이용한 발효 배양에 있어서 배양 온도를 높이게 되는 경우 생육 속도가 빨라지게 된다. 이는 이소루신 생산을 위한 발효 배양에도 똑같이 적용된다. 즉, 이소루신 생산을 위한 발효 배양에 있어서 배양 온도를 높이게 되면 세포 내 피루베이트(pyruvate) 농도가 증가하게 되고, 이는 발린의 생성을 유도하게 된다. 따라서 본 발명에서 얻어진 DS44ΔilvB는 배양 온도를 모균주인 DS44보다 높여서 수행하였고, 그 결과 표 3에서와 같이 높은 온도에서도 V/I 비율이 감소된 것을 알 수 있었다. 친균주 및 ilvB 결실미생물의 이소루신과 발린생성량비교(5L J/F)

균주명	배양시간(hr)	이소루신(%)	발린(%)	V/I 비율(%)
DS44	75	2.05	0.29	14
DS44ΔilvB	53	2.84	0.17	6

표 3의 결과와 같이 발린이 많이 생성될 것으로 알려진 조건에서 DS44ΔilvB 균주는 모균주에 비해 이소루신 생성능이 유지되거나 높아졌으며, 발린 생성능은 감소한 것으로 나타났다. DS44와 DS44ΔilvB 배양 결과의 V/I 비율을 비교하면 모균주 대비 DS44ΔilvB의 V/I 비율이 14%에서 6%로써, 본 발명에 의해 V/I 비율 14% 기준시 V/I 비율이 57% 감소된 것을 확인 할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Daesang Corporation <120> Production of Isoleucine Using Mutant Bacteria <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1689 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atggcaagtt cgggcacaac atcgacgcgt aagcgcttta ccggcgcaga atttatcgtt 60 catttcctgg aacagcaggg cattaagatt gtgacaggca ttccgggcgg ttctatcctg 120 cctgtttacg atgccttaag ccaaagcacg caaatccgcc atattctggc ccgtcatgaa 180 cagggcgcgg gctttatcgc tcagggaatg gcgcgcaccg acggtaaacc ggcggtctgt 240 atggcctgta gcggaccggg tgcgactaac ctggtgaccg ccattgccga tgcgcggctg 300 gactccatcc cgctgatttg catcactggt caggttcccg cctcgatgat cggcaccgac 360 gccttccagg aagtggacac ctacggcatc tctatcccca tcaccaaaca caactatctg 420 gtcagacata tcgaagaact cccgcaggtc atgagcgatg ccttccgcat tgcgcaatca 480 ggccgcccag gcccggtgtg gatagacatt cctaaggatg tgcaaacggc agtttttgag 540 attgaaacac agcccgctat ggcagaaaaa gccgccgccc ccgcctttag cgaagaaagc 600 attcgtgacg cagcggcgat gattaacgct gccaaacgcc cggtgcttta tctgggcggc 660 ggtgtgatca atgcgcccgc acgggtgcgt gaactggcgg agaaagcgca actgcctacc 720 accatgactt taatggcgct gggcatgttg ccaaaagcgc atccgttgtc gctgggtatg 780 ctggggatgc acggcgtgcg cagcaccaac tatattttgc aggaggcgga tttgttgata 840 gtgctcggtg cgcgttttga tgaccgggcg attggcaaaa ccgagcagtt ctgtccgaat 900 gccaaaatca ttcatgtcga tatcgaccgt gcagagctgg gtaaaatcaa gcagccgcac 960 gtggcgattc aggcggatgt tgatgacgtg ctggcgcagt tgatcccgct ggtggaagcg 1020 caaccgcgtg cagagtggca ccagttggta gcggatttgc agcgtgagtt tccgtgtcca 1080 atcccgaaag cgtgcgatcc gttaagccat tacggcctga tcaacgccgt tgccgcctgt 1140 gtcgatgaca atgcaattat caccaccgac gttggtcagc atcagatgtg gaccgcgcaa 1200 gcttatccgc tcaatcgccc acgccagtgg ctgacctccg gtgggctggg cacgatgggt 1260 tttggcctgc ctgcggcgat tggcgctgcg ctggcgaacc cggatcgcaa agtgttgtgt 1320 ttctccggcg acggcagcct gatgatgaat attcaggaga tggcgaccgc cagtgaaaat 1380 cagctggatg tcaaaatcat tctgatgaac aacgaagcgc tggggctggt gcatcagcaa 1440 cagagtctgt tctacgagca aggcgttttt gccgccacct atccgggcaa aatcaacttt 1500 atgcagattg ccgccggatt cggcctcgaa acctgtgatt tgaataacga agccgatccg 1560 caggcttcat tgcaggaaat catcaatcgc cctggcccgg cgctgatcca tgtgcgcatt 1620 gatgccgaag aaaaagttta cccgatggtg ccgccaggtg cggcgaatac tgaaatggtg 1680 ggggaataa 1689

Claims

불활성화 아세토히드록시산 씬사아제 I(acetohydroxyacid synthase I)을 포함하는 이소루신 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주로서, 상기 균주는 ilvB의 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 아세토히드록시산 씬사아제 I이 불활성된 균주인 것을 특징으로 하는 균주.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 야생형 박테리아 균주와 비교하여 발린의 생산능이 감소된 균주인 것을 특징으로 하는 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 이소루신 생산량 대비 발린 생산량의 비율이 1-10%인 것을 특징으로 하는 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 에스케리치아 속 균주인 것을 특징으로 하는 균주.
제 5 항에 있어서, 상기 균주는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii)(Escherichia hermannii) 또는 에스케리치아 불네리스 (Escherichia vulneris) 균주인 것을 특징으로 하는 균주.
삭제
아세토히드록시산 씬사아제 I(acetohydroxyacid synthase I)의 ilvB를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 아세토히드록시산 씬사아제 I을 불활성화시키는 단계를 포함하는 이소루신 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주 제조방법.