JP2024511393A - Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたｌ－シトルリンの生産方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたＬ－シトルリンの生産方法に関し、前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子によって発現するタンパク質の活性が弱化または不活性化することにより、副産物の生成を阻害し、Ｌ－シトルリンを高収率および高濃度で生産することができる。
Description
本発明は、Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたＬ－シトルリンの生産方法に関する。
Ｌ－シトルリン（Ｌ－Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）は非必須アミノ酸の一つで、シトルリンにはアンモニア代謝促進や血管拡張による血流改善、血圧低下、神経伝達、免疫力増進、活性酸素消去などの有用な作用があるという点が知られている。このようなシトルリンは、アルギニンの生合成過程で中間生産物として合成される。微生物におけるアルギニンの生合成は、線状段階と環状段階の互いに異なる２つの経路を通して、Ｌ－グルタメート（Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ）から８回の酵素段階を経て行われる。線状段階において、Ｌ－アルギニンは、Ｌ－グルタメートからＮ－アセチルグルタメート（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、Ｎ－アセチルオルニチン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、オルニチン（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）、そしてアルギニノスクシネート（ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を経て合成される。
Ｌ－シトルリンの生産は、一般的に細菌や酵母のような微生物を用いた発酵によって生産され、自然状態で得られた野生型菌株やそのＬ－シトルリン生産能が向上するように変形された変異株を用いることができる。最近は、Ｌ－シトルリンの生産効率を改善させるために、Ｌ－アミノ酸およびその他の有用物質の生産に多く用いられる大腸菌、コリネバクテリウムなどの微生物を対象に遺伝子組換え技術を適用して、優れたＬ－シトルリン生産能を有する多様な組換え菌株または変異株およびこれを用いたＬ－シトルリンの生産方法が開発されている。韓国登録特許第１０－１１０２２６３号および第１０－１０５３４２９号によれば、Ｌ－シトルリンの生産に関連する酵素、転写因子などタンパク質の活性または発現を強化または弱化することにより、Ｌ－シトルリン生産能が向上することを確認した。したがって、Ｌ－シトルリンの生産経路に作用する酵素を含む多様なタンパク質の活性または発現調節によりＬ－シトルリンの生産量も調節可能であると期待することができる。
Ｌ－シトルリンの生産は、一般的に細菌や酵母のような微生物を用いた発酵によって生産され、自然状態で得られた野生型菌株やそのＬ－シトルリン生産能が向上するように変形された変異株を用いることができる。最近は、Ｌ－シトルリンの生産効率を改善させるために、Ｌ－アミノ酸およびその他の有用物質の生産に多く用いられる大腸菌、コリネバクテリウムなどの微生物を対象に遺伝子組換え技術を適用して、優れたＬ－シトルリン生産能を有する多様な組換え菌株または変異株およびこれを用いたＬ－シトルリンの生産方法が開発されている。韓国登録特許第１０－１１０２２６３号および第１０－１０５３４２９号によれば、Ｌ－シトルリンの生産に関連する酵素、転写因子などタンパク質の活性または発現を強化または弱化することにより、Ｌ－シトルリン生産能が向上することを確認した。したがって、Ｌ－シトルリンの生産経路に作用する酵素を含む多様なタンパク質の活性または発現調節によりＬ－シトルリンの生産量も調節可能であると期待することができる。
本発明は、Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記変異株を用いたＬ－シトルリンの生産方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株を用いてＬ－シトルリン生産能が向上した新しい変異株を開発するために研究したところ、Ｌ－シトルリン生合成経路で副産物として生産される６－アセチルオルニチンの生成に関与する酵素を暗号化するＮＣｇｌ２６５７遺伝子に変異を導入したり、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子を除去する場合、その酵素の活性が弱化または不活性化して６－アセチルオルニチンの生産量が著しく減少するだけでなく、Ｌ－シトルリンの生産量が増加することを確認することにより、本発明を完成した。
本発明の一態様は、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子によって発現するタンパク質の活性が弱化または不活性化した、Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を提供する。
本発明で使用された「ＮＣｇｌ２６５７遺伝子」は、Ｌ－シトルリン生合成経路でアセチル－ＣｏＡとホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質としてアセチルオルニチンの前駆体であるアセチルホスフェート（ａｃｅｔｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を生成する酵素（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を暗号化する遺伝子を意味する。
本発明の一具体例によれば、前記ＮＣｇｌ２６５７遺伝子は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株に由来するものであってもよい。具体的には、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・クルディラクティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デザーティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・スラナリーエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｒａｎａｒｅｅａｅ）、コリネバクテリウム・ルブリカンティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｂｒｉｃａｎｔｉｓ）、コリネバクテリウム・ドサネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｏｓａｎｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ウテレキー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｔｅｒｅｑｕｉ）、コリネバクテリウム・スタチオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウム・パケンセ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｃａｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ヒュミレデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、コリネバクテリウム・マリヌム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・スフェニスコルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｈｅｎｉｓｃｏｒｕｍ）、コリネバクテリウム・フレイブルゲンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｉｂｕｒｇｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・カニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｉｓ）、コリネバクテリウム・アムモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・レナレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｎａｌｅ）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・カスピウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｐｉｕｍ）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）、コリネバクテリウム・シュードペラルギ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃａｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｐｅｌａｒｇｉ）またはコリネバクテリウム・フラベッセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよいし、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、前記ＮＣｇｌ２６５７遺伝子は、配列番号１の塩基配列で表されるものであってもよい。
本発明で使用された「活性が弱化」は、オブジェクトの遺伝子の発現量が本来の発現量より減少することを意味する。このような活性の弱化は、遺伝子を暗号化するヌクレオチド置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせによりタンパク質自体の活性が本来微生物が持っているタンパク質の活性に比べて減少した場合と、これを暗号化する遺伝子の発現阻害または翻訳阻害などで細胞内で全体的な酵素活性の程度が野生型菌株または変形前の菌株に比べて低い場合、これらの組み合わせも含む。
本発明で使用された「不活性化」は、酵素、転写因子、輸送タンパク質などタンパク質を暗号化する遺伝子の発現が野生型菌株または変形前の菌株に比べて全く発現しない場合であったり、発現してもその活性がない場合を意味する。
本発明の一具体例によれば、前記ＮＣｇｌ２６５７遺伝子によって発現するタンパク質の活性の弱化または不活性化は、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子の全部または一部が挿入、置換、欠失、またはこれらの組み合わせによるものであってもよい。
本発明で使用された「一部」は、塩基配列またはポリヌクレオチド配列の全部ではないことを意味し、１～３００個、好ましくは１～１００個、より好ましくは１～５０個であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、前記ＮＣｇｌ２６５７遺伝子によって発現するタンパク質の活性の弱化または不活性化は、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子の開始コドンに変異を誘発するものであってもよい。
より具体的には、前記ＮＣｇｌ２６５７遺伝子の開始コドン変異は、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子の開始コドンＡＴＧを他のコドン、例えば、ＴＴＧ、ＧＴＧに置換するものであってもよい。
本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のＮＣｇｌ２６５７遺伝子を暗号化する配列番号１の塩基配列において開始コドンをＡＴＧからＴＴＧに置換してＮＣｇｌ２６５７遺伝子の新しい開始コドンを有するコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を取得した。このようなコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、配列番号２の塩基配列で暗号化されたＮＣｇｌ２６５７遺伝子を含むものであってもよい。
また、本発明の一具体例によれば、前記ＮＣｇｌ２６５７遺伝子によって発現するタンパク質の活性の弱化または不活性化は、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子を除去または欠損するものであってもよい。
本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のＮＣｇｌ２６５７遺伝子を欠損させて野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株またはシトルリンが過剰生産されるようにすでに開発されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株に比べて、副産物のアセチルオルニチンの生産が著しく減少するだけでなく、Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を取得した。
本発明で使用された「生産能が向上した」は、親菌株に比べてＬ－シトルリンの生産性が増加したことを意味する。前記親菌株は、変異の対象になる野生型または変異株を意味し、直接変異の対象になったり、組換えられたベクターなどで形質転換される対象を含む。本発明において、親菌株は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株または野生型から変異した菌株であってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記親菌株は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２であってもよい。
本発明の一実施例によれば、前記Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子の開始コドンに変異を導入したり、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子を除去することにより、親菌株に比べて増加したＬ－シトルリン生産能を示し、特に、親菌株またはすでに開発されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株に比べて、Ｌ－シトルリンの濃度が５％以上、具体的には５～５０％、さらに具体的には１０～３０％増加し、この時、副産物として生産される６－アセチルオルニチンが２０％以上、具体的には２０～１００％、さらに具体的には３０～１００％減少した。
本発明の一具体例によるコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、親菌株においてＮＣｇｌ２６５７遺伝子の開始コドンが変異した変異体を含む組換えベクター、またはＮＣｇｌ２６５７遺伝子を欠損する組換えベクターにより実現できる。
本発明で使用された「変異体」は、Ｌ－シトルリンの生合成に関与するＮＣｇｌ２６５７遺伝子の開始コドンがＡＴＧからＴＴＧに置換された遺伝子変異体を意味する。
本発明で使用された「ベクター」は、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）必須の調節要素を含む遺伝子製造物を意味する。ここで、「作動可能に連結された」は、発現が必要な遺伝子とその調節配列が互いに機能的に結合して遺伝子の発現を可能にする方式で連結されたことを意味し、「調節要素」は、転写を行うためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位を暗号化する配列、および転写および解読の終結を調節する配列を含む。このようなベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明で使用された「組換えベクター」は、好適な宿主細胞内に形質転換された後、宿主細胞のゲノムに関係なく複製可能であったり、ゲノムそのものに縫い込まれる。この時、前記「好適な宿主細胞」は、ベクターが複製可能なものであって、複製が開始される特定の塩基配列である複製起点を含むことができる。
本発明で使用された「形質転換」は、遺伝子を宿主細胞内に導入して宿主細胞内で発現させることができるようにすることであり、形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現できれば、宿主細胞の染色体内挿入または染色体外に位置しているものでも制限なく含まれる。本発明の一具体例によれば、形質転換させる方法は、核酸を細胞内に導入するいずれの方法も含まれ、宿主細胞に応じて当分野にて公知のように好適な標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、および酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが用いられるが、これに限定されない。本発明の一実施例によれば、形質転換方法として、電気穿孔方法（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５２，５４１－５４５，１９９９）を用いることができる。
前記宿主細胞は、生体内または試験管内で本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドで形質感染、形質転換、または感染した細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞、組換え細胞または組換え微生物である。
また、本発明による組換えベクターは、選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を含むことができるが、前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された形質転換体（宿主細胞）を選別するためのものであって、前記選択マーカーが処理された培地で選択マーカーを発現する細胞のみ生存できるため、形質転換された細胞の選別が可能である。前記選択マーカーは、代表例として、カナマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコールなどがあるが、これらに限定されるものではない。
本発明の形質転換用組換えベクター内に挿入された遺伝子は、相同性組換え交差によってコリネバクテリウム属菌株、大腸菌などの微生物のような宿主細胞内に置換される。
本発明の一具体例によれば、前記宿主細胞は、コリネバクテリウム属菌株であってもよいし、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株であってもよい。
また、本発明の他の態様は、ａ）前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株を培地で培養するステップと、ｂ）前記変異株または変異株が培養された培地からＬ－シトルリンを回収するステップとを含むＬ－シトルリンの生産方法を提供する。
前記培養は、当業界にて知られた適切な培地と培養条件によって行われてもよいし、通常の技術者であれば、培地および培養条件を容易に調整して使用可能である。具体的には、前記培地は、液体培地であってもよいが、これに限定されるものではない。培養方法は、例えば、回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加式培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはこれらの組み合わせ培養を含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、前記培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならず、通常の技術者によって適宜変形可能である。コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は、公知の文献（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）を参照することができるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、培地に多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含むことができる。使用可能な炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的にまたは混合物として使用できるが、これに限定されるものではない。使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆麦および尿素、または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別的にまたは混合物として使用できるが、これに限定されるものではない。使用可能なリンの供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム－含有塩が含まれてもよいし、これに限定されるものではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含むことができ、これに限定されるものではない。その他、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質が含まれてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が使用できる。前記培地または個別成分は、培養過程で培養液に適切な方式によって回分式または連続式で添加されるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加して培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。追加的に、培養液の好気状態を維持するために、培養液中に酸素または酸素－含有気体（例、空気）を注入することができる。培養液の温度は、通常、２０℃～４５℃、例えば、２５℃～４０℃であってもよい。培養期間は、有用物質が所望の生産量で得られるまで継続可能であり、例えば、１０～１６０時間であってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記培養された変異株および変異株が培養された培地からＬ－シトルリンを回収するステップは、培養方法に応じて当該分野にて公知の好適な方法を用いて培地から生産されたＬ－シトルリンを収集または回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、アンモニウムスルフェート沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性およびサイズ排除）などの方法を用いることができるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、Ｌ－シトルリンを回収するステップは、培養培地を低速遠心分離してバイオマスを除去し、得られた上澄液をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができる。
本発明の一具体例によれば、前記Ｌ－シトルリンを回収するステップは、Ｌ－シトルリンを精製する工程を含むことができる。
本発明によるコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子によって発現するタンパク質の活性が弱化または不活性化することにより、副産物の生成を阻害し、Ｌ－シトルリンを高収率および高濃度で生産することができる。
以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、このような説明は本発明の理解のために例として提示されたものに過ぎず、本発明の範囲がこのような例示的な説明によって制限されるのではない。
実施例１．コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の製造
ＮＣｇｌ２６５７遺伝子によって発現するタンパク質の活性が弱化したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を製造するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２およびＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ（ＨＩＴ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓＴＭ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＲＨ６１８）を使用した。
ＮＣｇｌ２６５７遺伝子によって発現するタンパク質の活性が弱化したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を製造するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２およびＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ（ＨＩＴ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓＴＭ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＲＨ６１８）を使用した。
前記コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２は、蒸留水１Ｌにグルコース５ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ウレア（ｕｒｅａ）１．０ｇ、ポリペプトン１０．０ｇおよび牛肉（ｂｅｅｆ）抽出物５．０ｇの組成のＣＭ－ｂｒｏｔｈ培地（ｐＨ６．８）で３０℃の温度で培養した。
前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａは、蒸留水１Ｌにトリプトン１０．０ｇ、ＮａＣｌ１０．０ｇおよび酵母抽出物５．０ｇの組成のＬＢ培地上で３７℃の温度で培養した。
抗生剤カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）はシグマ（Ｓｉｇｍａ）社の製品を使用し、ＤＮＡシーケンシング分析はマクロジェン（株）に依頼して分析した。
１－１．組換えベクターの作製
Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から染色体ＤＮＡを抽出した後、これを鋳型としてプライマー１および２とプライマー３および４の組み合わせによりそれぞれＰＣＲを行った。これにより得られたＰＣＲ産物を、再度プライマー１および４の組み合わせを用いてクロスオーバー（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）ＰＣＲで増幅した後、組換えベクターｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ位置に挿入した。これをベクターｐＫ１９ｍｓ／ＮＣｇｌ２６５７（Ａ１Ｔ）と名付けた。前記ベクターを作製するのに下記表１のプライマーを使用した。
Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から染色体ＤＮＡを抽出した後、これを鋳型としてプライマー１および２とプライマー３および４の組み合わせによりそれぞれＰＣＲを行った。これにより得られたＰＣＲ産物を、再度プライマー１および４の組み合わせを用いてクロスオーバー（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）ＰＣＲで増幅した後、組換えベクターｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ位置に挿入した。これをベクターｐＫ１９ｍｓ／ＮＣｇｌ２６５７（Ａ１Ｔ）と名付けた。前記ベクターを作製するのに下記表１のプライマーを使用した。
以上のプライマーを用いて、以下の条件下でＰＣＲを行った。Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＴＰ６００、ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．、日本）を用いて、それぞれのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）１００μＭが添加された反応液に、オリゴヌクレオチド１ｐＭ、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡ１０ｎｇを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ、日本）１ユニットの存在下で２５～３０周期（ｃｙｃｌｅ）を行った。ＰＣＲを行う条件は、（ｉ）変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）ステップ：９４℃で３０秒、（ｉｉ）結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）ステップ：５８℃で３０秒、および（ｉｉｉ）拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ステップ：７２℃で１～２分（１ｋｂあたり２分の重合時間付与）の条件で実施した。
このように製造された遺伝子断片を、ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇを用いて、ｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢベクターにクローニングした。前記ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａに形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ－寒天プレート上に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。最終的に形成されるコロニーを分離して挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）が正確にベクターに存在するかを確認した後、このベクターを分離してコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の組換えに使用した。
前記方法で共通して行われた過程として、当該遺伝子の増幅は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからＰＣＲ方法で増幅して、戦略によってｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ方法によりｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢベクターに挿入して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａから選別した。この時、増幅された遺伝子をｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢベクターに挿入するために、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、日本）および制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ（ＮＥＢ、米国）が供給されたバッファーおよびプロトコルによって使用した。
１－２．変異株の製造
前記ｐＫ１９ｍｓ／ＮＣｇｌ２６５７（Ａ１Ｔ）ベクターを用いてコリネバクテリウム・グルタミカム変異株のＣＴ２菌株を製造した。
前記ｐＫ１９ｍｓ／ＮＣｇｌ２６５７（Ａ１Ｔ）ベクターを用いてコリネバクテリウム・グルタミカム変異株のＣＴ２菌株を製造した。
前記ベクターの最終濃度が１μｇ／μｌ以上となるように用意して、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法（文献［Ｔａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ１２３（１９９４）３４３－３４７］参照）を用いて１次組換えを誘導した。この時、電気穿孔した菌株を２ＹＴ－Ｋｍ固体培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１６ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、寒天１．５％およびカナマイシン３０μｇ／ｍｌ含有）に塗抹した。３０℃で２日間培養してコロニーを得た。１次相同組換えが誘導されたコロニーのうち、前記表１のプライマー１および４を用いて前記１－１と同一の条件でＰＣＲ増幅が確認されたコロニーを１次組換え株として選別し、２ＹＴ液体培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１６ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／ＬおよびＮａＣｌ５ｇ／Ｌ含有）で１２時間培養後、２ＹＴ－１０％ ｓｕｃｒｏｓｅ固体培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１６ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、寒天１．５％およびｓｕｃｒｏｓｅ１００ｇ／Ｌ含有）に塗抹して、２次相同組換えを誘導して抗生剤マーカーを除去した。カナマイシンに抵抗性がなく、１０％ｓｕｃｒｏｓｅ培地で生育可能な菌株を最終的に選別した後、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子の開始コドンに変異が導入されたかを塩基配列分析により確認した（文献［Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ１４５（１９９４）６９－７３］参照）。最終的に変異ＮＣｇｌ２６５７遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＣＴ２）を取得した。
実施例２．コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の製造
ＮＣｇｌ２６５７遺伝子が欠損したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を製造するために、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２およびＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａを使用した。
ＮＣｇｌ２６５７遺伝子が欠損したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を製造するために、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２およびＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａを使用した。
前記コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａおよび抗生剤は、実施例１で使用されたものと同一である。
２－１．ベクターの作製
プライマー１および２の代わりにプライマー５および６を用い、プライマー３および４の代わりにプライマー７および８を用いたことを除けば、実施例１と同様の方法でベクターを作製した。作製されたベクターをｐＫ１９ｍｓ／△ＮＣｇｌ２６５７と名付け、これを作製するのに下記表２のプライマーを用いた。
プライマー１および２の代わりにプライマー５および６を用い、プライマー３および４の代わりにプライマー７および８を用いたことを除けば、実施例１と同様の方法でベクターを作製した。作製されたベクターをｐＫ１９ｍｓ／△ＮＣｇｌ２６５７と名付け、これを作製するのに下記表２のプライマーを用いた。
２－２．変異株の製造
ｐＫ１９ｍｓ／ＮＣｇｌ２６５７（Ａ１Ｔ）ベクターの代わりにｐＫ１９ｍｓ／βベクターを用いたことを除けば、実施例１と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミカム変異株のＣＴ３菌株を製造した。カナマイシンに抵抗性がなく、１０％ｓｕｃｒｏｓｅ培地で生育可能な菌株を最終的に選別した後、前記表２のプライマー５および８を用いて実施例１と同一の条件でＰＣＲを行って、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子が除去されたかを最終的に確認し、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子が欠損した菌株をＣＴ３と名付けた。
ｐＫ１９ｍｓ／ＮＣｇｌ２６５７（Ａ１Ｔ）ベクターの代わりにｐＫ１９ｍｓ／βベクターを用いたことを除けば、実施例１と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミカム変異株のＣＴ３菌株を製造した。カナマイシンに抵抗性がなく、１０％ｓｕｃｒｏｓｅ培地で生育可能な菌株を最終的に選別した後、前記表２のプライマー５および８を用いて実施例１と同一の条件でＰＣＲを行って、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子が除去されたかを最終的に確認し、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子が欠損した菌株をＣＴ３と名付けた。
比較例１．コリネバクテリウム・グルタミカム変異株
シトルリンが過剰生産されるように、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼおよびカルバモイルリン酸合成酵素の活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（韓国特許出願第１０－２０１９－０１５１３２１号参照、以下、「ＣＴ１」という）を使用した。
シトルリンが過剰生産されるように、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼおよびカルバモイルリン酸合成酵素の活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（韓国特許出願第１０－２０１９－０１５１３２１号参照、以下、「ＣＴ１」という）を使用した。
ＣＴ１菌株は、親菌株として使用されたコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べてＬ－シトルリン生産量および発酵収率が増加したことが確認された。
実験例１．変異株のＬ－シトルリンの生産性の確認
実施例１および２で製造されたＮＣｇｌ２６５７遺伝子変異株（ＣＴ２およびＣＴ３菌株）と比較例１のＣＴ１菌株との間のＬ－シトルリンの生産性を比較した。
実施例１および２で製造されたＮＣｇｌ２６５７遺伝子変異株（ＣＴ２およびＣＴ３菌株）と比較例１のＣＴ１菌株との間のＬ－シトルリンの生産性を比較した。
各菌株をシトルリン種培地に接種して３０℃で１０時間培養後、培養液２５０ｍＬを５Ｌ培養器の培地に接種した。初期培地に含まれている糖をすべて使い切ると、追加培地を投入した。本実験で使用された培地の組成は、下記表３の通りである。培養終了後、培養液を蒸留水で１００倍希釈し、０．４５ｕｍのフィルタで濾過した後、カラム（ＤｉｏｎｅｘＩｏｎＰａｃＴＭ ＣＳ１２Ａ）と紫外線検出器（１９５ｍｍ）とが装着された高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、菌株で生産された培養液中のＬ－シトルリンと副産物の６－アセチルオルニチンの濃度を測定し、その結果を下記表４に示した。
前記表４に示しているように、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子が暗号化する酵素の活性が弱化したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＣＴ２およびＮＣｇｌ２６５７遺伝子が欠損したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＣＴ３は、すでに開発された変異株ＣＴ１に比べて、副産物の６－アセチルオルニチンの生産がそれぞれ約６９％、９９％減少し、Ｌ－シトルリンの生産性がそれぞれ約１７．８％、１２．２％増加したことが確認された。このような結果を通して、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子によって発現するタンパク質の活性が弱化または不活性化することにより、副産物の生成が著しく減少するだけでなく、菌株のＬ－シトルリン生産能が向上してＬ－シトルリンを高純度で生産できることが分かった。
以上、本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は上述した説明ではなく特許請求の範囲に示されており、それと同等範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれていると解釈されなければならない。
Claims (4)
- ＮＣｇｌ２６５７遺伝子によって発現するタンパク質の活性が弱化または不活性化した、Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株。
- 前記ＮＣｇｌ２６５７遺伝子は、配列番号１の塩基配列で表されるものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株。
- 前記ＮＣｇｌ２６５７遺伝子によって発現するタンパク質の活性の弱化または不活性化は、ＮＣｇｌ２６５７遺伝子の全部または一部が挿入、置換または欠失したものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株。
- ａ）請求項１に記載の変異株を培地で培養するステップと、
ｂ）前記変異株または変異株が培養された培地からＬ－シトルリンを回収するステップとを含むＬ－シトルリンの生産方法。
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