KR101751967B1

KR101751967B1 - 부산물의 생성이 감소된 이소루이신 생산능 변이 균주

Info

Publication number: KR101751967B1
Application number: KR1020150151352A
Authority: KR
Inventors: 김현영; 이선희; 박진완; 김현호; 오재영
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2015-10-29
Filing date: 2015-10-29
Publication date: 2017-06-30
Also published as: KR20170051616A

Abstract

본 발명은 이소루이신 생산능 변이 균주, 이의 제조방법 및 이소루이신 생산방법을 제공한다. 본 발명의 이소루이신 생산능 변이 균주는 야생형 균주와 비교하여 노르발린(norvaline)은 전혀 생성하지 않고 발린 및 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid)과 같은 부산물의 생성은 현저히 감소하여 이소루이신의 생산이 증가된 효과를 갖는다. 또한, 본 발명은 부산물의 생산능을 감소시킴으로써 이소루이신을 높은 순도로 정제할 수 있을 뿐 만 아니라 이소루이신의 회수율을 향상시켜 이소루이신의 제조 원가를 크게 낮출 수 있다.

Description

부산물의 생성이 감소된 이소루이신 생산능 변이 균주{Mutant Strain with improved isoleucine production having reduced by-product}

본 발명은 부산물의 생성이 감소된 이소루이신 생산능 변이 균주에 관한 것이다.

L-이소루이신은 동물 사료, 인간의 식품 첨가물 및 의약 분야에 사용되는 상업적으로 의미있는 산물이다. 상기 이유로 인하여 L-이소루이신의 생성능을 향상시키는 것은 산업적인 의미로 보았을 때 중요하다.

L-이소루이신은 분지쇄 아미노산인 L-발린, L-루신과 주요 생합성 경로를 공유한다. 특히 L-이소루이신과 L-발린은 화학적인 구조와 등전점, 그리고 용해도 등의 화학적인 특성이 매우 유사하기 때문에 L-이소루이신으로의 단일 아미노산을 고순도로 생산하기 위해서 많은 공정 단계 및 비용이 요구되고, 따라서 높은 수율로 회수하는데 어려움이 있다. 이소루이신의 제조 비용을 낮추기 위해서는 이소루이신과 함께 생산되는 주요 부산물인 발린 및 아미노부티릭산의 함량이 낮은 균주를 개발하는 것이 중요하다.

노르발린, 발린, 아미노부티릭산과 같은 부산물은 L-이소루이신과 생합성 경로를 공유하고 있어, 일반적으로 이소루이신의 수율을 증가시키면 부산물의 생성도 증가된다. 이러한 부산물은 목적 아미노산인 L-이소루이신과 구조 및 특성이 유사하여 목적 아미노산의 생성 후 정제에 어려움이 있다. 이에, 부산물의 생성을 최대한 감소시키거나 차단하면서 L-이소루이신의 생성능은 증가된 균주의 개발이 요구된다.

L-이소루이신 생산 균주를 개발하기 위한 방법은 종래 기술로부터 여러 가지가 있었다. 가장 일반적인 아미노산 생산 균주 개발법으로는 돌연변이법을 이용한 중간대사산물 또는 최종산물에 대한 내성주 선별법, 염색체 변이를 통한 목적 산물 생산 조절 유전자의 활성 결실/또는 강화 등이 있다. 즉 돌연변이법 이용으로는 이소루이신 생합성 과정의 주요 중간대사 산물인 쓰레오닌 및 이소루이신의 유사 구조체에 대한 내성을 가지는 변이주를 선별하는 방법이 적용될 수 있다.

그러나 상기 언급한 돌연변이법 등의 일반적인 아미노산 균주 개발 방법을 이소루이신 생산 균주에 적용할 경우 이소루이신과 주요 생합성 과정을 공유하고, 유사한 방법으로 세포 외에 배출되는 부산물의 생산에도 영향을 미칠 수 있는 가능성이 존재한다.

따라서 이소루이신의 회수 수율을 높여 제조비용을 낮추기 위해서 이소루이신 생산능을 가지는 동시에 주요 부산물을 낮은 함량으로 생산하는 균주를 개발하는 새로운 균주 개발 방법이 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 부산물의 생성이 감소되어 이소루이신(isoleucine)을 효율적으로 생산할 수 있는 박테리아 균주를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 이소루이신 생산능 박테리아 균주의 3-이소프로필말레이트 탈수소효소(3-isopropylmalate dehydrogenase)을 불활성화시키고, α-이소프로필말레이트 합성효소(α-isopropylmalate synthase)를 과발현시킴으로써 정제가 어려운 노르발린(norvaline) 및 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid)과 같은 부산물의 생성이 현저히 감소하고 이소루이신의 생산이 증가될 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 이소루이신 생산능 변이 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 이소루이신 생산능 변이 균주의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 이소루이신 생산방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 불활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소(3-isopropylmalate dehydrogenase)를 포함하며 노르발린(norvaline) 을 생성하지 않는 이소루이신(isoleucine) 생산능 변이 균주을 제공한다.

본 발명자들은 부산물의 생성이 감소되어 이소루이신(isoleucine)을 효율적으로 생산할 수 있는 박테리아 균주를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 이소루이신 생산능 박테리아 균주의 3-이소프로필말레이트 탈수소효소(3-isopropylmalate dehydrogenase)을 불활성화시키고, α-이소프로필말레이트 합성효소(α-isopropylmalate synthase)를 과발현시킴으로써 노르발린(norvaline), 발린, α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid)과 같은 부산물의 생성이 현저히 감소하고 이소루이신의 생산이 증가될 수 있음을 규명하였다.

본 발명에서 이소루이신 생산능 변이 균주를 표현하면서 사용하는 용어 “불활성화”는 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드를 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합에 의하여 단백질의 발현을 억제시키는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 불활성화는 leuB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합에 의한 불활성화이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 불활성화는 leuB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 완전 또는 부분 결실에 의한 2-이소프로필말레이트 탈수소효소의 불활성화이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 불활성화는 leuB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 부분 결실에 의한 3-이소프로필말레이트 탈수소효소의 불활성화이다.

불활성화 대상이 되는 3-이소프로필말레이트 탈수소효소는 다양한 균주에서 발견되고 동정되었다. 하기의 실시예에서는 서열목록 제1서열의 이스케리치아 콜라이의 3-이소프로필말레이트 탈수소효소가 예시되어 있으나, 이외에도 다양한 3-이소프로필말레이트 탈수소효소가 본 발명에 포함된다.

본 발명의 변이 균주는 야생형(wild type) 또는 활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 균주를 모균주로 하여 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 불활성화 시킨 균주이며, 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 발현하거나 3-이소프로필말레이트 탈수소효소의 효소 활성을 포함하고 있는 균주라면 모균주로 제한 없이 이용이 가능하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 이소루이신 생산능 변이 균주는 에스케리치아(Escherichia) 속 균주이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 이소루이신 생산능 변이 균주는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii)(Escherichia hermannii) 또는 에스케리치아 불네리스 (Escherichia vulneris) 균주이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 이소루이신 생산능 변이 균주는 에스케리치아 콜라이이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 에스케리치아 콜라이는 에스케리치아 콜라이 KCTC11602BP이다.

본 발명의 주요한 특징 중 하나는 본 발명의 이소루이신 생산능 변이 균주는 노르발린(norvaline)을 전혀 생성하지 않는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 불활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 변이 균주에 있어 상기 이소루이신 생산능 변이 균주는 노르발린을 생산하지 않는다. 야생형 또는 활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 균주는 발효 산물로 노르발린을 0.001 내지 0.100 중량% 생산하는데 반해, 본 발명의 불활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 변이 균주는 노르발린을 전혀 생산하지 않는다.

상기 노르발린은 이소루이신과 구조 및 특성이 유사하여 이소루이신의 정제에 어려움이 있다. 본 발명은 균주 변이를 통해 노르발린의 생성을 차단시킴으로써, 이소루이신의 정제에 소요되는 시간 및 비용을 절약하는 이점을 갖는다.

본 발명의 이소루이신 생산능 변이 균주는 노르발린 및 α-아미노부티릭산, 발린과 같은 부산물의 생성은 감소 또는 차단 시키면서 목적하는 이소루이신의 생성은 증가시킨다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 불활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 변이 균주에 있어 이소루이신 생산능 변이 균주는 야생형 또는 활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 균주와 비교하여 이소루이신의 생산능이 3-30%, 5-30%, 7-30%, 7-25%, 7-23% 또는 7-20% 증가된 균주이다.

본 발명의 주요한 특징 중 다른 하나는, 본 발명의 불활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 변이 균주는 발효 부산물을 생성을 감소시키기 위해 추가적으로 α-이소프로필말레이트 합성효소(α-isopropylmalate synthase)가 과발현된다,

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 α-이소프로필말레이트 합성효소는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 불활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소 및 과발현 α-이소프로필말레이트 합성효소를 포함하는 변이 균주는 야생형 또는 활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소 및 야생형 α-이소프로필말레이트 합성효소를 포함하는 이소루이신 생산능 균주와 비교하여 이소루이신의 생산능이 30-60%, 32-60%, 34-60%, 34-58%, 34-56% 또는 34-54% 증가된 균주이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 불활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소 및 과발현 α-이소프로필말레이트 합성효소를 포함하는 변이 균주는 야생형 또는 활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소 및 야생형 α-이소프로필말레이트 합성효소를 포함하는 이소루이신 생산능 균주와 비교하여 발린(valine) 및 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid)의 생산능이 30-70%, 33-70%, 36-70%, 39-70%, 39-67%, 39-66% 또는 39-63% 감소된 균주이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 불활성화 시키는 단계를 포함하는 노르발린을 생성하지 않는 이소루이신 생산능 변이 균주의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 α-이소프로필말레이트 합성효소를 과발현 시키는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명은 야생형 또는 활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 균주를 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 불활성화 시키는 것이 가능하다.

이소루이신 생합성에 관련된 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 암호화 하는 유전자 leuB를 염색체상에서 결실시키기 위하여 원스텝 불활성화 방법(one step inactivation: Warner et al., PNAS, 6:6640-6645)을 이용한다. 또한, 이소루이신 생합성에 관련된 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 암호화 하는 유전자 leuB를 염색체상에서 결실시키고 α-이소프로필말레이트 합성효소를 암호화 하는 유전자 leuA를 염색체 상에 도입하기 위하여 원스텝 불활성화 방법(one step inactivation: Warner et al., PNAS, 6:6640-6645)을 이용한다.

본 발명에서 야생형 또는 활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 균주에 형질전환 시키는 단계는 공지된 방법을 통하여 실시될 수 있다. 예컨대, 전기 천공 방법(van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545, 1999) 등에 의해 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 형질전환이 되지 않은 야생형 또는 활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 균주로부터 형질 전환된 변이 균주를 분리 및 수득하는 단계를 포함한다.

상기 본 발명에서 형질전환이 되지 않은 이소루이신 생산능 균주 균주로부터 형질전환된 변이 균주를 분리 및 수득하는 단계를 실시하는데 있어서 선택 표지된 벡터를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 이용하는 벡터는 플라스미드 또는 파지(phage)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 이용하는 선택 표지는 당업계에서 통상적으로 이용되는 카나마이신, 앰피실린 같은 항생제 내성 유전자와 고초균 유래 SacB 유전자의 산물인 레반슈크라제(levansucrase)를 포함한다.

본 발명의 제조방법은 상술한 불활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 변이 균주와 동일한 균주를 제조하는 방법이며, 불활성화의 대상이 되는 단백질(3-이소프로필말레이트 탈수소효소) 및 관련 유전자(leuB)를 공통으로 하기 때문에, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 이소루이신 생산능 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 이소루이신 생산방법을 제공한다.

본 발명은 이소루이신 생산능 균주 및 변이 균주의 전배양 또는 종배양 하는데 있어서 공지된 배양 방법을 통해 배양할 수 있다.

본 발명에 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있으며, 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다.

배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.

본 발명은 상기 불활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 변이 균주와 동일한 균주 및 균주제조 방법을 이용하여 이소루이신을 생산하는 방법이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 이소루이신(isoleucine) 생산능 변이 균주, 이의 제조방법 및 이소루이신 생산방법을 제공한다.

(b) 본 발명의 이소루이신 생산능 변이 균주는 야생형 균주와 비교하여 노르발린(norvaline)은 전혀 생성하지 않으며, 발린 및 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid)과 같은 부산물의 생성이 현저히 감소하여 이소루이신의 생산이 증가된 효과를 갖는다.

(c) 본 발명은 부산물의 생산능을 감소시킴으로써 이소루이신을 높은 순도로 정제할 수 있을 뿐 만 아니라 이소루이신의 회수율을 향상시켜 이소루이신의 제조 원가를 크게 낮출 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: leuB -결실 균주의 제조

leuB 유전자를 원스텝 불활성화 방법[one step inactivation ; Warner et al., PNAS, 6:6640-6645(2000)]에 의해 결실시키고, 항생제 내성부여 유전자를 제거하였다. 결실하고자 하는 leuB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 1 서열과 같다.

3-이소프로필말레이트 탈수소효소(isopropylmalate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자인 leuB-결실 균주를 제작하기 위해서 다음과 같이 실험을 수행하였다. 하기 표 1에서의 leuB 유전자 일부서열과 pKD13 플라스미드 일부 서열을 가지는 leuB_PF, leuB_PR 프라이머 쌍과 pKD13 플라스미드(Genbank 접근번호 AY048744)를 이용하여 PCR 반응(총 부피 50 ㎕, 95℃에서 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 1.6kb 의 증폭된 단편(1)을 얻었다.

프라이머	염기서열 (5’-3’)
leuB_HF1	CAGCCATTACGATGTAGGCG
leuB_HR1	CAATGTCTGCACGCAGCGG
leuB_PF	CCGCTGCGTGCAGACATTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
leuB_PR	AGTGATCATTGCGCACTCGTCCTGTCAAACATGAGAATTAA
leuB_HF2	GACGAGTGCGCAATGATCACT
leuB_HR2	CGCATCATCGGCATCCAGG
leuB-CF	GCTGGATGCCGTGCGCA
leuB_CR	GCCACGGGCTAAATCCCC

leuB-결실 균주를 제조하기 위하여 leuB 유전자의 앞쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655의 지노믹(genomic) DNA를 주형으로 하여 표 1의 프라이머 leuB_HF1 및 leuB_HR1를 이용하여 PCR (총 부피 50 ㎕, 95℃5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 260 bp 증폭된 단편(2)을 얻었다.

또한 leuB 유전자의 뒤쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655의 지노믹 DNA를 주형으로 하여 표 1의 프라이머 leuB_HF2 와 leuB_HR2를 이용하여 PCR 반응(총부피 50 ㎕, 95℃5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30 사이클 이후 72℃ 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 190 bp의 증폭된 단편(3)을 얻었다.

위 실험에서 증폭된 각각의 단편(1), (2) 및 (3)은 증폭시 프라이머의 상보적 서열로 인하여 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 이 단편들을 프라이머를 제외하고 총 부피 50 ㎕, 95℃ 5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃ 2분 30초, 총 30사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분 조건으로 PCR을 수행하여 약 2 kb 크기를 가지는 하나의 증폭된 단편을 얻었다.

이렇게 획득한 DNA 단편을 pKD46(GenBank 접근번호 AY048746)을 포함하고 있는 에스케리치아 콜라이 DS44(Escherichia coli, DS44 ; KCTC 11602BP) 균주에 전기천공법(electrophoration)을 실시하였다. 이후 카나마이신(kanamycin) 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 leuB 유전자의 결실 여부를 확인하였다. 반응은 표 1의 leuB_CF 및 leuB_CR 프라이머를 이용하여 총 부피 20 ㎕, 95℃5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분 30초, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분 조건으로 수행하였다. 염색체 내에 단편이 삽입된 경우 원래 leuB 유전자가 있을 경우 생성되는 0.949 kb와 비교하여 약 2.2 kb가 생성됨을 확인하였다. leuB 유전자 결실이 확인된 균주를 이용하여 항생제 내성 표식 유전자를 제거하는 과정을 수행하기 위해 pCP20 플라스미드를 도입하여 FLP 재조합을 유도하였다. 이후 항생제 첨가 혹은 무첨가 LB 평판배지에서 leuB 결실 균주를 배양하여 항생제 내성 표식 유전자가 제거된 것을 확인하였다.

실시예 2: leuB -결실 균주의 이소루이신 및 부산물 생산량 평가

실시예 1에서 제조한 leuB-결실 균주의 이소루이신 및 부산물의 생성량을 확인하기 위하여 모주인 에스케리치아 콜라이 DS44(Escherichia coli, DS44; KCTC 11602BP) 및 leuB 결실 균주인 DS44△leuB 의 이소루이신 및 부산물 생성량을 비교하였다.

상기 균주를 표 2의 배지조성으로 5 L 발효조에서 배양하였다.

성분	농도	추가배지농도
포도당	8%	55%
옥수수침지액	2%	-
황산암모늄	2%	0.1 %
인산	1.5 %	0.1 %
푸마르산	0.1%	-
글루탐산나트륨	0.7%	-
구연산 나트륨	0.1 %	-
콜린-HCl	0.1%	-
피리독신-HCl	10 ppm	-
티아민-HCl	5 ppm	-
니코틴산	5 ppm	-
비오틴	5 ppm	-
염화칼슘	5 ppm	-
염화코발트	5 ppm	-
황산철	20 ppm	-
황산망간	5 ppm	-
황산아연	5 ppm	-
황산구리	5 ppm	-
L-루이신	0.08%	-
수산화나트륨	1 %	-

상기 배지 조건으로 최초 배지 2 L 및 추가 배지 610 ㎖를 첨가하여 온도 31℃ 교반속도 600 rpm, 통기량 1.0 vvm의 물리적 조건으로 배양하였다. 그 결과 표 3에서와 같이 부산물인 노르발린이 전혀 생성되지 않는 것을 확인하였다.

균주명	이소루이신(%)	발린(%)	V/I 비율 (%)	α-아미노부티릭산(%)	AB/I 비율(%)	노르발린(%)	NV/I 비율 (%)
DS44	2.21	0.31	14	0.122	5.5	0.048	2.17
DS44△leuB	2.54	0.33	13	0.110	4.3	0	0

(V/I : 전체 이소루이신 중 발린의 비율, AB/I : 전체 이소루이신 중 α-아미노부티릭산의 비율, NV/I : 전체 이소루이신 중 노르발린의 비율)

실시예 3: leuA 유전자가 도입된 변이주 제조

실시예 2의 결과를 바탕으로 leuB 유전자 파쇄와 동시에 leuA 유전자를 강화하여 부산물로의 탄소흐름을 억제하여 발린과 α-아미노부티릭산을 감소하기 위하여 leuB 파쇄와 동시에 leuA 유전자 도입을 원스텝 불활성화 방법(one step inactivation Warner et al., PNAS, 6:6640-6645(2000))을 통해 수행하였다. 실시예 1에서와 마찬가지로 leuB 파쇄와 동시에 leuA 도입 후, 항생제 내성 부여 유전자를 제거하였다. 도입하고자 하는 leuA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 2 서열과 같다.

3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자인 leuB를 결실시킴과 동시에 α-이소프로필말레이트 합성효소(isopropylmalate synthase)를 코딩하는 leuA 유전자를 도입하기 위해서 다음과 같이 실험을 수행하였다. 하기 표 4 에서의 leuB 유전자 일부서열과 pKD13 플라스미드 일부 서열을 가지는 leuB_PF, pKD13 일부서열과 leuA 프로모터 일부 서열을 가지는 leuB_PR2 쌍과 pKD13 플라스미드(Genbank 접근번호 AY048744)를 이용하여 PCR 반응(총 부피 50 ㎕, 95℃5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 1.6kb의 증폭된 단편(1)을 얻었다.

프라이머	염기서열 (5’-3’)
leuB_PF	CCGCTGCGTGCAGACATTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
leuB_PR2	GCGATTTTTTTTGATATTGATTTCTGTCAAACATGAGAATTAA
leuA_pro_F	AAATCAATATCAAAAAAAATCGC
leuA_pro_R	TAAATCAGCTCCAGATGAATGCG
leuA_F	ATTCATCTGGAGCTGATTTAATGAGCCAGCAAGTCATTAT
leuA_R	AGTGATCATTGCGCACTCGTCTCACACGGTTTCCTTGTTGTTTTC
leuB_HF1	CAGCCATTACGATGTAGGCG
leuB_HR1	CAATGTCTGCACGCAGCGG
leuB_HF2	GACGAGTGCGCAATGATCACT
leuB_HR2	CGCATCATCGGCATCCAGG
leuB-CF	GCTGGATGCCGTGCGCA
leuB_CR	GCCACGGGCTAAATCCCC

leuA 유전자의 도입 균주를 제조하기 위하여 먼저 leuA 유전자의 프로모터 서열을 증폭하기 위하여 대장균 MG1655 균주의 지노믹 DNA를 주형으로 하여 표 4의 프라이머 leuA_Pro_F 및 leuA_Pro_R 를 이용하여 PCR 반응(총 부피 50 ㎕, 95℃5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 310 bp의 증폭된 단편(2)을 얻었다.

다음으로 leuA 유전자 단편을 얻기 위해 DS44 균주의 지노믹 DNA를 주형으로 하여 표 4의 leuA 프로모터 일부 서열과 leuA 유전자 일부 서열을 가지는 프라이머leuA_F 및 leuA 일부 서열과 leuB 일부 서열을 가지는 leuA_R 를 이용하여 PCR 반응(총 부피 50 ㎕, 95℃5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 1.6 kb의 증폭된 단편(3)을 얻었다.

leuB 유전자의 앞쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655의 지노믹 DNA를 주형으로 하여 표 1의 프라이머 leuB_HF1 및 leuB_HR1를 이용하여 PCR 반응(총 부피 50 ㎕, 95℃5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 260 bp 증폭된 단편(4)을 얻었다.

또한 leuB 유전자의 뒤쪽 단편을 얻기 위해 대장균 MG1655 균주의 지노믹 DNA를 주형으로 하여 표 1의 프라이머 leuB_HF2 와 leuB_HR2를 이용하여 PCR 반응(총 부피 50 ㎕, 95℃5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 약 190 bp의 증폭된 단편(5)을 얻었다.

위 실험에서 증폭된 각각의 단편(1), (2), (3), (4) 및 (5)는 증폭 시 프라이머의 상보적 서열로 인하여 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 이 단편 중 단편단편(1), (2) 및 (3)을 프라이머를 제외하고 총 부피 50 ㎕, 95℃5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분 조건으로 PCR을 수행하여 약 3.5kb 크기를 가지는 하나의 증폭된 단편(6)을 얻었다. 이렇게 증폭된 하나의 단편(6)을 나머지 단편(4) 및 (5)와 프라이머를 제외하고 총 부피 50 ㎕, 95℃5분 1 사이클 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 4분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분 조건으로 PCR을 수행하여 약 4kb 크기를 가지는 하나의 증폭된 단편을 얻었다.

이렇게 획득한 DNA 단편을 pKD46(GeneBank No. AY048746)을 포함하고 있는 에스케리치아 콜라이 DS44(Escherichia coli, DS44; KCTC 11602BP) 세포에 전기천공법으로 도입하였다. 이후 카나마이신 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 leuB 유전자의 결실 및 leuA 유전자의 도입여부를 확인하였다. 반응은 표 4의 leuB_CF 및 leuB_CR 프라이머를 이용하여 총 부피 20 ㎕, 95℃5분 1사이클 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 10초, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분 조건으로 수행하였다. 염색체 내에 단편이 삽입된 경우 원래 leuB 유전자가 있을 경우 생성되는 0.949 kb 와 비교하여 약 4.1 kb가 생성됨을 확인하였다. leuB 유전자 결실됨과 동시에 leuA 유전자 도입이 확인된 균주를 이용하여 항생제 내성 표식 유전자를 제거하는 과정을 수행하기 위해 pCP20 플라스미드를 도입하여 FLP 재조합을 유도하였다. 이후 항생제 첨가 혹은 무첨가 LB 평판배지에서 leuB 결실 및 leuA 도입 균주를 배양하여 항생제 내성 표식 유전자가 제거된 것을 확인 하였다.

실시예 4: leuB -결실 및 leuA -도입 균주의 이소루이신 및 부산물 생산량 평가

실시예 3에서 얻어진 leuB 유전자 결실 및 leuA 유전자 도입 균주의 이소루이신 및 부산물의 생성량을 확인하기 위하여 모주인 에스케리치아 콜라이 DS44(Escherichia coli, DS44; KCTC 11602BP)와 leuB 결실 및 leuA 도입 균주인 DS44△leuB::leuA의 이소루이신 및 부산물 생성량을 비교하였다.

상기 균주를 실시예 2와 동일한 배지 조성 및 배양조건을 이용하여 배양하였다.

균주명	이소루이신(%)	발린(%)	V/I 비율 (%)	α-아미노부티릭산(%)	AB/I 비율(%)	노르발린(%)	NV/I 비율 (%)
DS44	2.17	0.29	13.5	0.126	5.4	0.054	2.50
DS44△leuB::leuA	3.14	0.14	4.4	0.063	2.0	0	0

(V/I : 전체 이소루이신 중 발린의 비율, AB/I : 전체 이소루이신 중 α-아미노부티릭산의 비율, NV/I : 전체이소루이신 중 노르발린의 비율)

표 5의 결과와 같이 본 발명에 의해 모균주에 비해 V/I 비율 약 67% 감소, AB/I 비율은 약 50% 감소하였으며 노르발린은 전혀 검출되지 않는 것을 확인 할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> DAESANG CORPORATION <120> Mutant Strain with improved isoleucine production having reduced by-product <130> PN150475 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1092 <212> DNA <213> E.coli MG1655 leuB <400> 1 atgtcgaaga attaccatat tgccgtattg ccgggggacg gtattggtcc ggaagtgatg 60 acccaggcgc tgaaagtgct ggatgccgtg cgcaaccgct ttgcgatgcg catcaccacc 120 agccattacg atgtaggcgg cgcagccatt gataaccacg ggcaaccact gccgcctgcg 180 acggttgaag gttgtgagca agccgatgcc gtgctgtttg gctcggtagg cggcccgaag 240 tgggaacatt taccaccaga ccagcaacca gaacgcggcg cgctgctgcc tctgcgtaag 300 cacttcaaat tattcagcaa cctgcgcccg gcaaaactgt atcaggggct ggaagcattc 360 tgtccgctgc gtgcagacat tgccgcaaac ggcttcgaca tcctgtgtgt gcgcgaactg 420 accggcggca tctatttcgg tcagccaaaa ggccgcgaag gtagcggaca atatgaaaaa 480 gcctttgata ccgaggtgta tcaccgtttt gagatcgaac gtatcgcccg catcgcgttt 540 gaatctgctc gcaagcgtcg ccacaaagtg acgtcgatcg ataaagccaa cgtgctgcaa 600 tcctctattt tatggcggga gatcgttaac gagatcgcca cggaataccc ggatgtcgaa 660 ctggcgcata tgtacatcga caacgccacc atgcagctga ttaaagatcc atcacagttt 720 gacgttctgc tgtgctccaa cctgtttggc gacattctgt ctgacgagtg cgcaatgatc 780 actggctcga tggggatgtt gccttccgcc agcctgaacg agcaaggttt tggactgtat 840 gaaccggcgg gcggctcggc accagatatc gcaggcaaaa acatcgccaa cccgattgca 900 caaatccttt cgctggcact gctgctgcgt tacagcctgg atgccgatga tgcggcttgc 960 gccattgaac gcgccattaa ccgcgcatta gaagaaggca ttcgcaccgg ggatttagcc 1020 cgtggcgctg ccgccgttag taccgatgaa atgggcgata tcattgcccg ctatgtagca 1080 gaaggggtgt aa 1092 <210> 2 <211> 1572 <212> DNA <213> E.coli MG1655 leuA <400> 2 atgagccagc aagtcattat tttcgatacc acattgcgcg acggtgaaca ggcgttacag 60 gcaagcttga gtgtgaaaga aaaactgcaa attgcgctgg cccttgagcg tatgggtgtt 120 gacgtgatgg aagtcggttt ccccgtctct tcgccgggcg attttgaatc ggtgcaaacc 180 atcgcccgcc aggttaaaaa cagccgcgta tgtgcgttag ctcgctgcgt ggaaaaagat 240 atcgacgtgg cggccgaatc cctgaaagtc gccgaagcct tccgtattca tacctttatt 300 gccacttcgc caatgcacat cgccaccaag ctgcgcagca cgctggacga ggtgatcgaa 360 cgcgctatct atatggtgaa acgcgcccgt aattacaccg atgatgttga attttcttgc 420 gaagatgccg ggcgtacacc cattgccgat ctggcgcgag tggtcgaagc ggcgattaat 480 gccggtgcca ccaccatcaa cattccggac accgtgggct acaccatgcc gtttgagttc 540 gccggaatca tcagcggcct gtatgaacgc gtgcctaaca tcgacaaagc cattatctcc 600 gtacataccc acgacgattt gggcctggcg gtcggaaact cactggcggc ggtacatgcc 660 ggtgcacgcc aggtggaagg cgcaatgaac gggatcggcg agcgtgccgg aaactgttcc 720 ctggaagaag tcatcatggc gatcaaagtt cgtaaggata ttctcaacgt ccacaccgcc 780 attaatcacc aggagatatg gcgcaccagc cagttagtta gccagatttg taatatgccg 840 atcccggcaa acaaagccat tgttggcagc ggcgcattcg cacactcctc cggtatacac 900 caggatggcg tgctgaaaaa ccgcgaaaac tacgaaatca tgacaccaga atctattggt 960 ctgaaccaaa tccagctgaa tctgacctct cgttcggggc gtgcggcggt gaaacatcgc 1020 atggatgaga tggggtataa agaaagtgaa tataatttag acaatttgta cgatgctttc 1080 ctgaagctgg cggacaaaaa aggtcaggtg tttgattacg atctggaggc gctggccttc 1140 atcggtaagc agcaagaaga gccggagcat ttccgtctgg attacttcag cgtgcagtct 1200 ggctctaacg atatcgccac cgccgccgtc aaactggcct gtggcgaaga agtcaaagca 1260 gaagccgcca acggtaacgg tccggtcgat gccgtctatc aggcaattaa ccgcatcact 1320 gaatataacg tcgaactggt gaaatacagc ctgaccgcca aaggccacgg taaagatgcg 1380 ctgggtcagg tggatatcgt cgctaactac aacggtcgcc gcttccacgg cgtcggcctg 1440 gctaccgata ttgtcgagtc atctgccaaa gccatggtgc acgttctgaa caatatctgg 1500 cgtgccgcag aagtcgaaaa agagttgcaa cgcaaagctc aacacaacga aaacaacaag 1560 gaaaccgtgt ga 1572

Claims

불활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소(3-isopropylmalate dehydrogenase)를 포함하며 노르발린(norvaline)은 생성하지 않고, α-이소프로필말레이트 합성효소(α-isopropylmalate synthase)가 과발현된, 이소루이신(isoleucine) 생산능 에스케리치아 속 (Escherichia genus) 변이 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 3-이소프로필말레이트 탈수소효소의 불활성화는 leuB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합에 의한 불활성화인 것을 특징으로 하는 변이 균주.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 헤라니(Escherichia hermannii) 또는 에스케리치아 불네리스 (Escherichia vulneris) 균주인 것을 특징으로 하는 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 불활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 변이 균주는 야생형 또는 활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 포함하는 이소루이신 생산능 균주와 비교하여 이소루이신의 생산능이 3-30% 증가된 균주 것을 특징으로 하는 변이 균주.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 α-이소프로필말레이트 합성효소는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 변이 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 변이 균주는 야생형 또는 활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소 및 야생형 α-이소프로필말레이트 합성효소를 포함하는 이소루이신 생산능 균주와 비교하여 이소루이신의 생산능이 30-60% 증가된 균주 것을 특징으로 하는 변이 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 변이 균주는 야생형 또는 활성화 3-이소프로필말레이트 탈수소효소 및 야생형 α-이소프로필말레이트 합성효소를 포함하는 이소루이신 생산능 균주와 비교하여 발린(valine) 및 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid)의 생산능이 30-70% 감소된 균주 것을 특징으로 하는 변이 균주.
3-이소프로필말레이트 탈수소효소(3-isopropylmalate dehydrogenase)를 불활성화 시키는 단계; 및 α-이소프로필말레이트 합성효소를 과발현 시키는 단계;를 포함하는 노르발린(norvaline)을 생성하지 않는 이소루이신(isoleucine) 생산능 에스케리치아 속 (Escherichia genus) 변이 균주의 제조방법.
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