KR102272637B1 - 올벚나무를 포함하는 항염증용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 올벚나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것으로, 상기 올벚나무 추출물 또는 이의 분획물은 자유 라디칼의 소거활성이 우수함을 확인하였으며, 염증이 유도된 세포에서 NO의 형성을 억제하고, 세포에 대한 독성이 없어 염증을 완화 또는 개선하므로 약학 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물로 이용이 가능하다.

Description

올벚나무를 포함하는 항염증용 조성물{Anti-inflammatory composition comprising Prunus pendula for. ascendens (Makino) Ohwi}
본 발명은 올벚나무 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 항염증용 약학 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.
염증은 생체조직이 손상을 입었을 때 생체 조직의 방어반응의 일종으로 조직의 상해, 반응, 회복의 단계를 거친다. 이는 생체 내 복구체계의 증강 및 손상을 감소시키기 위한 것으로 알려져 있다. 그러나 반복되는 조직의 손상 또는 재생에 의해 염증반응이 지속되면, 염증관련 세포에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)과 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)이 과다 생성되고 그 결과로 영구적인 유전자의 변형이 야기된다. 따라서 염증은 다양한 염증성 질환을 유발하는 원인이다.
이러한 염증질환을 치료하기 위해 일반적으로 스테로이드성 또는 비스테로이드성 항염증제를 사용한다. 대표적인 예로 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs)을 사용하여 염증을 완화시키며, 염증이 심하거나 NSAIDs의 효능이 없으면 스테로이드 제제를 사용하며, 난치성인 경우 면역 억제제나 수술요법을 실시하게 된다. 이 경우 사용되는 NSAIDs는 주로 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase; COX)를 억제하여 염증반응에 관여하는 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생성을 억제함으로써 항염증 작용을 나타내나, 위장 장애, 간 장애, 신기능 장애 등의 부작용을 야기하여 장기간의 사용이 어려운 문제가 있다. NSAIDs에 비해 스테로이드 제제는 환자에게 사용할 수 있는 가장 빠른 방법으로, 항염증 효과가 빠르고 극적으로 나타나는 약물로 알려져 있다. 그러나 널리 알려진 것처럼 스테로이드 제제는 세균 감염에 대한 저항력을 약하게 하고, 당뇨병의 악화, 부신부전증, 정신 기능장애 등을 일으키는 등, 독성이 매우 심각할 뿐만 아니라 치료를 시작하면 중지하기가 어렵기 때문에 사용상 주의를 요하며, 가능 하면 금해야 하는 것으로 알려져 있다. 이처럼 합성 항염증제는 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많다. 따라서 효과가 탁월하면서 비교적 부작용이 적은 항염증제의 개발이 꾸준히 요구되고 있는 실정이다.
특히 효능 및 부작용 측면에서 볼 때, 예로부터 임상적 경험이 풍부하고 안전성 측면에서 탁월한 평가를 받고 있는 천연물 제제가 염증 질환의 예방 및 치료제 개발에 있어 좋은 후보물질이 될 것으로 생각된다.
대한민국 등록특허 제10-1757827호
본 발명의 하나의 목적은 올벚나무(Prunus pendula for. ascendens (Makino) Ohwi) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 올벚나무(Prunus pendula for. ascendens (Makino) Ohwi) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 올벚나무(Prunus pendula for. ascendens (Makino) Ohwi) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 하나의 양태로, 올벚나무(Prunus pendula for. ascendens (Makino) Ohwi) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 “올벚나무(Prunus pendula for. ascendens (Makino) Ohwi)”는 장미과의 낙엽교목의 일종으로, 높이는 10m 정도 이며, 잎은 어긋나고 타원형으로 톱니가 있는 것을 특징으로 한다. 꽂은 담홍색으로 잎보다 먼저 피고, 열매는 핵과로 붉게 익으며 식용한다. 또한 한국의 장산곶, 지리산, 제주도 또는 일본 등지에 분포하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 올벚나무를 건조 및 파쇄하여 분말화한 것을 추출에 적용할 수 있고, 올벚나무의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 이들 모두를 포함할 수 있으며, 구체적으로는 잎을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "추출물"은 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
본 발명에서 추출물의 건조는 채취한 식물로부터 유용한 성분들이 파괴되지 않는 범위에서 공지의 방법으로 진행될 수 있고, 예를 들어 음지에서 자연건조의 방법으로 진행될 수 있다. 또한, 파쇄 또는 분쇄는 이후 추출과정에서 식물의 유용한 성분들이 충분하게 추출될 수 있을 정도로 파쇄 또는 분쇄하여 분말화할 수 있다. 상기 건조와 파쇄 또는 분쇄 공정은 필요에 따라서 순서를 뒤바꿔서 진행하거나 반복하여 실시할 수 있다.
본 발명의 추출에 있어서, 상기 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다.
본 발명에서 올벚나무 추출물은 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있다. 구체적으로 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 수득될 수 있다. 또한, 상기 저급 알코올은 에탄올일 수 있다.
본 발명에서 용어 “분획물”은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 올벚나무 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 올벚나무 추출물을 증류수(물)에 현탁한 후, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 에틸아세테이트, n-헥산 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분획함으로써 수득할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 건조 “G 분쇄된 올벚나무 잎을 70%(v/v) 에탄올에 넣고 상온에서 24시간동안 침출하고, 여과하여 올벚나무 잎 추출물을 증류수에 현탁한 후 헥산을 첨가하여 헥산 분획물을 수득하고, 상기 헥산 분획물을 제외한 남은 수용층에 에틸아세테이트를 추가하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하였으며, 상기 에틸아세테이트 분획물을 제외하고 남은 수용성 성분에 부탄올을 추가하여 부탄올 분획물을 수득하였다. 상기 부탄올 분획물을 제외하고 남은 수용성 성분을 물 분획물로 수득하였다.
본 발명에서 상기 분획물은 n-헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 또는 물 분획물이다.
본 발명의 실시예에서 올벚나무(Prunus pendula for. ascendens (Makino) Ohwi) 잎 에탄올 추출물(Extract, Ext)과 상기 추출물의 n-헥산(n-hexane, Hex), 에틸아세테이트(ethyl acetate, EtOAc), n-부탄올(n-butanol, BuOH), 물(water, H2O) 분획물이 DPPH 자유 라디칼(free radical)을 소거함으로써 항산화 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 올벚나무 추출물 또는 이의 분획물은 항산화 효과를 가진다
또한 본 발명의 다른 실시예에서 올벚나무 추출물 또는 이의 분획물의 항염증 활성을 확인하고자, 염증에 의해 유도되는 NO 형성 억제효과와 세포 생존률을 분석하였다. 분석 결과, 올벚나무 추출물이 37%의 NO 형성 억제 효과를 가짐을 확인하였으며, 에틸아세테이트 분획물이 76.3%의 NO 형성을 억제 효과를 가져 항염효과가 가장 우수하였다. 또한 올벚나무 추출물, n-헥산(n-hexane, Hex) 분획물, 에틸아세테이트(ethyl acetate, EtOAc) 분획물, n-부탄올(n-butanol, BuOH) 분획물, 물(water, H2O) 분획물이 세포독성이 없음을 확인하였다.
또한 올벚나무 추출물에서 NO 형성 억제 효과가 우수한 에틸아세테이트 분획물을 6.25 내지 100 ㎍/㎖ 농도로 처리 후 NO 형성 억제효과와 세포독성을 분석한 결과, 에틸아세테이트 분획물의 농도가 증가함에 따라 NO 형성 억제효과가 증가하였으며, 각 농도에서 모두 세포독성이 없음을 확인하였다. 전염증성 사이토카인인 PGE2 및 IL-1β, IL-6의 발현을 농도 의존적으로 억제함을 확인하였으며, 염증관련 단백질인 iNOS 또는 COX-2의 발현을 농도의존적으로 억제시킴을 확인하였다.
즉, 올벚나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 항염증 효과가 우수함을 확인하였다.
따라서 올벚나무(Prunus pendula for. ascendens (Makino) Ohwi) 추출물 또는 이의 분획물을 항염증 용도의 약학, 식품 또는 화장료 조성물로 이용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외의 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 올벚나무(Prunus pendula for. ascendens (Makino) Ohwi) 추출물 또는 이의 분획물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 99 중량%로, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 항염증을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명은 다른 양태로, 올벚나무(Prunus pendula for. ascendens (Makino) Ohwi) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항염증용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 올벚나무, 추출물, 분획물에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 올벚나무 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 올벚나무 추출물 또는 이의 분획물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용되는 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능성 식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 올벚나무 추출물 또는 이의 분획물은 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태로 올벚나무(Prunus pendula for. ascendens (Makino) Ohwi)의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 올벚나무, 추출물, 분획물에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 다른 양태로, 올벚나무 추출물 또는 이의 분획물에서 항염활성 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 올벚나무로부터 항염 활성 화합물을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 올벚나무, 추출물, 분획물에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 일실시예에서 올벚나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 순상 실리카 겔(silica gel)로 충진한 유리필터(glass filter)를 이용하여 진공 액체크로마토그래피(vacuum liquid chromatography, VLC)를 수행하였다. n-Hex/EtOAc (0~100%), EtOAc/MeOH (0~100%)로 용매 극성을 5%씩 높이는 방법으로 각 300 mL씩 용출하여 총 32개의 fraction을 얻었다(Fr. V1~V32). VLC fration들 중 Fr. V9 (40.6 mg)는 단일 화합물인 우르솔산로 확인되었고, Fr. V23 (836.3 mg)은 Sephadex LH-20 CC를 H2O:MeOH=1:1의 용매조건으로 수행하여 프루나신 (130.6 mg), 메틸 파라-쿠마레이트 (13.6 mg), 캠페롤 (143.9 mg)를 얻었다. Fr. V24 (770.4 mg) 또한 Sephadex LH-20 CC를 H2O:MeOH=1:1의 용매조건으로 용출하여 아스트라갈린 (158.0 mg)를 분리하였다.
상기 분리된 화합물 중 우르솔산, 메틸 파라-쿠마레이트, 캠페롤, 아스트라갈린은 항염 효과가 있다고 보고되어 있다. 따라서 올벚나무 추출물 또는 이의 분획물에서 항염 활성 화합물을 분리할 수 있다.
상기 올벚나무 추출물 또는 이의 분획물에서 항염활성 화합물을 분리하는 단계는 올벚나무 추출물 또는 이의 분획물을 크로마토그래피 상에서 용출 용매의 극성 조건을 달리하며 분리하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로 상기 크로마토그래피는 Sephadex LH-20 또는 진공 액체크로마토그래피일 수 있다.
상기 용출 용매는 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올 및 물으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 항염 활성 화합물을 우르솔산(ursolic acid), 메틸 파라-쿠마레이트(methyl p-coumarate), 캠페롤(kaempferol) 및 아스트라갈린(astragalin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 올벚나무 추출물 또는 이의 분획물이 자유 라디칼의 소거활성이 우수함을 확인하였으며, 염증이 유도된 세포에서 NO의 형성을 억제하고, 세포에 대한 독성이 없음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 조성물은 항염증 용도로 화장품, 식품, 약학 산업에 적용이 가능하다.
도 1은 올벚나무 잎 추출물 및 용매분획물의 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 올벚나무 잎 추출물 및 용매분획물의 항염증 활성을 나타낸 그래프이다
도 3은 올벚나무 잎 에틸아세테이트 분획물의 농도별 항염증 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 올벚나무 잎 에틸아세테이트 분획물의 농도별 PGE2 및 전염증성 사이토카인 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 올벚나무 잎 에틸아세테이트 분획물을 농도별로 처리한 후, iNOS 및 COX-2 단백질 발현을 측정한 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<실시예 1> 올벚나무 추출물의 제조
올벚나무 잎은 제주시 아라동에서 채집하여 사용하였다.
건조 및 분쇄된 올벚나무 잎 640.6g을 70% 에탄올 20 L에 넣고 실온에서 24시간 동안 침출하였다. 여과하여 걸러진 여액을 감압 건조하여 분말형태인 올벚나무 잎 에탄올 추출물을 준비하였다.
<실시예 2> 본 발명의 올벚나무 추출물의 헥산 분획물 제조
실시예 1의 올벚나무 잎 추출물에 극성이 다른 용매인 n-헥산(n-Hex) 분획물, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물, n-부탄올(n-BuOH) 분획물, 물(H2O)을 넣고 순차적으로 분획물을 제조하였다. 먼저, 올벚나무 잎 추출물을 물에 현탁한 후 헥산을 첨가하여 헥산 분획물을 분리하였으며, 이를 감압 건조하여 분말 형태로 제조하였다.
<실시예 3> 본 발명의 올벚나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물 제조
실시예 2에서 헥산 분획물이 분리되고 남은 수용층에 에틸아세테이트를 첨가하여 에틸아세테이트 분획물을 분리하고, 이를 감압 건조하여 분말 형태로 제조하였다.
<실시예 4> 본 발명의 올벚나무 추출물의 부탄올 분획물 제조
실시예 3에서 에틸아세테이트 분획물을 분리하고 남은 수용층에 부탄올을 첨가하여 부탄올 분획물을 분리하고, 이를 감압 건조하여 분말 형태로 제조하였다.
<실시예 5> 본 발명의 올벚나무 추출물의 물 분획물 제조
실시예 4에서 부탄올 분획물을 분리하고 남은 수용층을 물 분획물로 이용하였으며, 이를 감압 건조하여 분말 형태로 제조하였다
<실시예 6> 올벚나무 잎 추출물이 함유된 화장료 조성물의 제조
통상적인 화장료 조성물에 화장료 조성물 전체중량대비 상기의 실시예 3의 화장료 조성물 10 중량% 첨가하여 사용하였다.
<실험예 1> 항산화 활성 측정
실시예 1 내지 실시예 5의 올벚나무 잎 추출물 또는 이의 용매별 분획물의 항산화 활성을 측정하기 위해 자유라디칼(free radical) 소거활성을 측정하였다.
자유라디칼 소거활성은 Blois 방법(Blois, M.s., Nature, 1958, 181:1199-1200)을 응용한 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성 실험을 수행하였다. 이때, DPPH는 0.2mM 농도가 되도록 에탄올에 용해시켜 사용하였다.
구체적으로, 올벚나무 에탄올 추출물 및 이의 n-헥산(n-Hex) 분획물, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물, n-부탄올(n-BuOH) 분획물, 물(H2O) 분획물 시료를 각각 125 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL, 1000 ㎍/mL, 2000 ㎍/mL, 4000 ㎍/mL의 농도별로 희석하여 준비하였다. 이후, 96 well plate에 0.2 mM DPPH 용액 180 ㎕와 상기 희석하여 준비한 각각의 시료용액 20 ㎕를 혼합하여 상온에 10분간 반응시킨 후, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 515 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거율(%) 및 각 시료가 DPPH를 50% 저해할 때의 농도(SC50 ; Scavenging concentration of 50%)를 계산하였다. 각 시료는 3회 반복실험을 실시하여 평균값을 구하였다. 이때 활성을 비교하기 위한 항산화제로는 부틸레이트하이드록시톨루엔(Butylated hydroxytoluene, BHT)를 사용하였다.
분석결과는 도 1 및 표 1과 같다. 올벚나무 잎 추출물 및 EtOAc, n-BuOH, H2O 분획물에서 SC50 값이 각각 134.4, 129.5, 108.7, 137.8 ㎍/㎖로 대조군인 BHT (261.0 ㎍/㎖) 보다 라디칼 소거 활성이 우수함을 확인하였다.
시료 SC 50 (㎍/㎖)
실시예 1 134.4
실시예 2 >400
실시예 3 129.5
실시예 4 108.7
실시예 5 137.8
대조군(BHT) 261.0
<실험예 2> 항염증 활성 분석 방법
마우스 대식 세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 cell은 한국세포주은행(KCLB; Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)과 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM 배지(dulbecco's modified eagle’s medium, GIBCO, Grand Island, YY, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터 조건에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대 배양을 시행하였다.
24 웰 플레이트(well plate)에 RAW 264.7 cells를 2×105 cells/㎖로 분주하고 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터 조건하에 18시간 배양한 후 실험에 사용하였다. 전 배양 후, 1 ㎍/㎖ LPS가 포함된 배지로 교환하여 시료를 첨가하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphylethylenediamine in 2.5% phosphoric acid)을 이용하여 세포배양액 중에서 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess 시약 100 ㎕를 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 아질산나트륨(sodium nitrite, NaNO2)를 이용하여 검정곡선을 작성하여 비교하였다.
세포독성 평가는 MTT 어세이를 이용하였으며, RAW 264.7 cell을 24 well plate에 2×105 cells/well로 분주하고 37 ℃, 5% CO2조건 하에서 전배양 후, LPS와 시료를 동시에 처리하여 배양하였다. 이후 500 ㎍/㎖의 농도로 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 첨가하여 37℃에서 3 내지 4시간 동안 반응시킨 후, MTT 용액을 제거하였다. 여기에 DMSO를 가하여 살아있는 세포와 반응하여 생긴 formazan 침전물을 용해시키고 570 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 생존률(%)을 계산하였다.
도 2는 올벚나무 잎 추출물 또는 이의 용매별 분획물의 항염증 효과를 분석하기 위해 NO의 생성과 세포 생존률을 분석한 결과이다. 각 시료는 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 분석결과 올벚나무 잎 추출물에서 37%의 저해율을 보였으며, 올벚나무 잎 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에서 76.3%로 NO 생성 저해 효과가 우수함을 확인하였다. 또한, 세포 생존률 분석결과 모든 시료에서 85% 이상으로 올벚나무 잎 추출물 또는 이의 분획물이 세포에 대한 독성은 없음을 확인하였다.
상기 실험에서 NO 생성 저해 효과가 우수한 에틸아세테이트 분획물에 대해 농도별로 추가실험을 진행하였다. 도 3은 올벚나무 잎 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물을 6.25 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후 세포 독성 및 NO 생성 억제 효과를 분석한 결과이다. 분석결과, 에틸아세테이트 분획물이 세포에 대한 독성 없이 NO의 생성을 농도 의존적으로 저해하는 효과가 우수함을 확인하였다.
<실험예 3> 올벚나무 잎 추출물의 항염증 활성 기전 연구
올벚나무 잎 추출물의 항염증 활성 기전을 확인하기 위해 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 키트를 이용하여 PGE2 및 전염증성 사이토카인의 생성량을 확인하였다. 24 웰 플레이트(well plate)에 2×105 cells/well로 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 18시간 배양 후 배지를 제거하였다. 1 ㎍/㎖의 LPS를 포함하는 배지로 교환 후, 시료를 농도별로 각각 첨가하여 24시간 배양하였다. 이후 세포배양 상등액의 사이토카인 생성 함량을 ELISA 키트를 이용하여 정량하였으며, PGE2 ELISA kit (R&D Systems, USA), TNF-α ELISA 키트 (Invitrogen, USA), IL-1β ELISA 키트 (R&D Systems, USA), IL-6 ELISA 키트 (Invitrogen, USA)를 사용하였다. Standard에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.99 이상이었다.
또한 웨스턴 블랏(Western blot) 분석법을 이용하여 염증 관련 단백질인 iNOS 및 COX-2의 발현량을 확인하였다. 60Φ dish에 9×105cells/dish로 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 18시간 배양 후 배지를 제거하였다. 1 ㎍/㎖의 LPS를 포함하는 배지로 교환 후, 시료를 농도별로 각각 첨가하여 24시간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, RIPA buffer (Sigma, USA)를 이용해 4℃, overnight으로 lysis 시킨 후 원심분리하여 단백질 상등액만 분리하였다. 단백질 농도는 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)을 표준으로 브래드포드(Bradford) 시약(BIO-RAD, USA)을 사용하여 정량하였다. 정량한 단백질을 8~12% 의 SDS-polyacrylamide gel에 전기영동하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인(membrane)에 전이시켰다. 단백질이 전이된 membrane을 5% 탈지분유(skim milk)를 포함한 TTBS (0.1% Tween 20, Tris-buffered saline)에 넣고 상온에서 2시간 블락킹(blocking) 시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체 반응은 iNOS 안티바디(antibody) (1:1000, SantaCruze, USA), COX-2 안티바디(antibody) (1:1000, BD, USA), β-actin antibody clone AC-74 (1:20000, Sigma, USA)를 이용하여 4℃에서 overnight 반응 시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 membrane은 TTBS 용액으로 5회 세척 후, peroxidase-conjugated 2차 항체(1:5000 또는 1:20000, SantaCruze, USA)와 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤, TTBS 용액으로 5회 세척하였다. 단백질은 WESTA NOVA 2.0 (Cyanagen, Italy) 용액을 이용해 ECL 기질과 반응 시킨 후, Chemidoc (Fusion solo, VILBER LOURMAT, Germany)을 이용하여 각각의 단백질 발현 정도를 분석하였다.
도 4는 에틸아세테이트 분획물의 전염증성 사이토카인 억제활성을 분석한 결과이고, 도 5는 올벚나무 잎 출물물의 에틸아세테이트 분획물의 염증관련 단백질의 발현 억제 활성을 분석한 결과이다. 도 4에서 올벚나무 잎 EtOAc 추출물은 PGE2 및 IL-1β, IL-6의 생성을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인하였다. 또한 도 5에서 올벚나무 잎 EtOAc 분획물이 농도 의존적으로 iNOS 또는 COX-2 단백질의 발현을 억제시킴을 확인하였다.
<실험예 4> 올벚나무 잎 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 화합물의 분리 및 구조 동정
상기 실험예 1, 2, 3의 내용을 토대로 추출물의 활성원인이 되는 성분의 분리를 위해 가장 우수한 활성을 나타내는 EtOAc 분획물(실시예 3)을 선택하였다.
EtOAc 분획물을 VLC와 Sephadex LH-20 CC를 사용하여 5개의 화합물을 분리하였다. 분리된 화합물의 구조는 NMR data를 이용하였으며, 문헌 및 알려진 화합물과 비교하여 동정하였다.
EtOAc 분획물 5.0 g을 분획하기 위하여 순상 실리카 겔(silica gel)로 충진한 유리 필터(glass filter)를 이용하여 VLC(vacuum liquid chromatography)를 수행하였다. n-Hex/EtOAc (0~100%), EtOAc/MeOH (0~100%)로 용매 극성을 5%씩 높이는 방법으로 각 300 mL씩 용출하여 총 32개의 fraction을 얻었다(Fr. V1~V32). VLC fration들 중 Fr. V9 (40.6 mg)는 단일 화합물인 compound 1로 확인되었고, Fr. V23 (836.3 mg)은 Sephadex LH-20 CC를 H2O:MeOH=1:1의 용매조건으로 수행하여 compound 2 (130.6 mg), compound 3 (13.6 mg), compound 4 (143.9 mg)를 얻었다. Fr. V24 (770.4 mg) 또한 Sephadex LH-20 CC를 H2O:MeOH=1:1의 용매조건으로 용출하여 compound 5 (158.0 mg)를 분리하였다.
상기 실험결과 분리된 화합물의 화학구조는 아래의 표 2에 나타내었다.
Figure 112018122807889-pat00001
분리된 화합물 중 compound 4는 항산화 효과가 있다고 보고되어있고, compound 1, 3, 4 및 5는 항염 효과가 있다고 보고되어 있다.
본 연구는 산업통상자원부와 한국산업기술진흥원이 지원하는 경제협력권산업 육성사업(No. P0002225, 천연물과 바이오기술을 이용한 민감성 피부 개선 화장품 개발)으로 수행된 연구결과입니다.

Claims (10)

  1. 올벚나무 잎 70% 에탄올 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 NO의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 에틸아세테이트 분획물은 우르솔산(ursolic acid), 메틸 파라-쿠마레이트(methyl p-coumarate), 캠페롤(kaempferol) 및 아스트라갈린(astragalin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 올벚나무 잎 70% 에탄올 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는, 염증 개선 또는 예방용 건강기능성 식품 조성물.
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서,
    상기 에틸아세테이트 분획물은 우르솔산(ursolic acid), 메틸 파라-쿠마레이트(methyl p-coumarate), 캠페롤(kaempferol) 및 아스트라갈린(astragalin)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 건강기능성 식품 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
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