KR101757827B1 - 때죽나무(Styrax japonica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 히알루로니다아제(HAase, hyaluronidase) 저해제 및 이를 포함하는 항염증 및 항알레르기 조성물 - Google Patents
때죽나무(Styrax japonica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 히알루로니다아제(HAase, hyaluronidase) 저해제 및 이를 포함하는 항염증 및 항알레르기 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 때죽나무(Styrax japonica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 히알루로니다아제(HAase: hyaluronidase) 저해제 및 이를 포함하는 항염증 및 항알레르기 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 천연물 유래의 때죽나무(Styrax japonica) 줄기 추출물을 유효성분으로 하는 천연물 유래의 항염증, 항알레르기 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 500종의 천연물 추출물로부터 검색된 때죽나무 줄기 추출물을 포함하는 히알루로니다아제 저해제를 포함함으로써, 트라닐라스트, 인도메타신 및 아스피린 등과 같은 경우보다 부작용을 대폭 줄일 수 있다.
또한, 우수한 저해능력을 가짐으로써, 히알루로니다아제가 유도하는 알레르기, 염증반응의 저해제로써 다양하게 사용될 수 있으며, 필러 보조제, 국소마취제 효과를 지니는 신약의 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
본 발명은 500종의 천연물 추출물로부터 검색된 때죽나무 줄기 추출물을 포함하는 히알루로니다아제 저해제를 포함함으로써, 트라닐라스트, 인도메타신 및 아스피린 등과 같은 경우보다 부작용을 대폭 줄일 수 있다.
또한, 우수한 저해능력을 가짐으로써, 히알루로니다아제가 유도하는 알레르기, 염증반응의 저해제로써 다양하게 사용될 수 있으며, 필러 보조제, 국소마취제 효과를 지니는 신약의 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 때죽나무(Styrax japonica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 히알루로니다아제(HAase: hyaluronidase) 저해제 및 이를 포함하는 항염증 및 항알레르기 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 천연물 유래의 때죽나무(Styrax japonica) 줄기 추출물을 유효성분으로 하는 천연물 유래의 항염증, 항알레르기 조성물에 관한 것이다.
히알루론산(hyaluronic acid)는 소 눈의 초자체에서 최초로 발견된 고분자 다당류로서 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민이 배당체 결합된 이당류(disaccharide units)가 β-1, 4 결합을 반복하는 직선상 구조를 갖고 있다. 히알루론산은 인체 안구의 유리체, 연골, 활막액, 태반, 피부 등에 존재하며, 점액 다당류(mucopolysaccharide)의 형태로 세포 외 기질(extracellular matrix)의 수분흡수 및 세포 간 유연성을 부여하는 필수적인 역할을 한다.
히알루론산은 구성당의 당쇄 길이에 따라 조직 내에서 그 기능적 차이를 나타낸다. 즉, 고분자 히알루론산의 경우, 대식세포의 식작용(phagocytosis)을 억제하여 항 염증반응을 나타내며, 고분자 히알루론산가 분해된 저분자성 히알루론산 분해산물의 경우 대식세포의 염증반응 촉진, 상처 치유에 관여되는 콜라겐과 섬유형성을 증가시키는 원인 물질이 된다.
히알루로니다아제(hyaluronidase)는 연쇄상 구균에서 처음 발견된 효소로서, 세포간극의 구성성분인 히알루론산(hyaluronic acid)을 분해하여 약물의 확산을 용이하게 해주는 특징 때문에 주사제, 항바이러스제 등 피하주사 시 주로 사용된다. 히알루로니다아제(hyaluronidase)는 히알루론산(hyaluronic acid)를 가수분해하는 기작에 따라 포유류 형 히알루로니다아제 (Mammalian type, EC 3.2.1.35, hyaluronoglucosaminidase), 거머리 형 히알루로니다아제 (Leeches type, EC 3.2.1.36, hyaluronoglucuronidase)와 박테리아 형 히알루로니다아제 (Bacterial type, EC 4.2.2.1, hyaluronate lyase)로 구분된다.
특히, 포유류 형 히알루로니다아제는 인체 내의 고환, 피부, 간, 태반 체액 등에 존재하여 히알루론산의 구성성분인 글루쿠론산과 글루코사민 사이의 β-1, 4 배당체 결합을 가수분해하여 사당류(tetrasaccharide)를 생성하거나, 우리 몸의 관절에 있는 활액 및 연골의 성분인 콘드로이틴, 콘드로이틴-4-황산, 콘드로이틴-6-황산을 가수분해하는 특징이 있다.
이 효소는 류마티스 관절염 같은 염증 질환 시 활성화되어 혈관계 투과성 및 염증반응에 관여하기도 한다. 또한, 신생혈관 형성과 암 전이의 촉진에 관여하고, 배아형성 등과 같은 발생과정과 정자의 첨체 부분에 존재하여 수정 시 난자의 막인 난구세포를 분해하는데 관련이 있어 불임과 연관되어 연구되고 있다.
최근, 히알루로니다아제는 알레르기 반응유발, 염증유도 및 암 전이 등과의 연관성이 있는 것이 보고된 바 있고, 히알루로니다아제의 저해제에 관한 연구를 통해 항 알레르기 약물, 항 염증약물 및 기능성 식품 개발이 시도되고 있다. 지금까지 연구된 히알루로니다아제 저해제의 대표적인 물질로는 항 알레르기 및 항염증 약물제인 트라닐라스트, 다이소디움 크로모슬리세이트(disodium cromoglycate, DSCG), 인도메타신 및 아스피린 등이 있다. 그러나, 이들 물질은 합성된 항 염증약물로서 저해효과는 우수하나 여러 부작용이 있는 것이 단점이다.
따라서, 식물과 같은 천연물에서 새로운 히알루로니다아제의 저해제를 개발하고자 연구를 시도하였으나 아직 상용화될 정도로 우수한 저해제는 개발되지 않았다.
이에 본 발명자들은 히알루로니다아제 저해 활성이 있는 물질을 개발하고, 그 방법을 확립하고자 국내에서 자생하는 500종의 천연물로부터 메탄올 추출물을 얻고, 이를 이용하여 히알루로니다아제 저해효과를 탐색하여 때죽나무(Styrax japonica) 줄기 추출물이 히알루로니다아제를 강하게 저해하는 것을 확인하였다. 따라서, 때죽나무(Styrax japonica) 줄기 추출물은 항 알레르기, 항염증제로 활용될 수 있음을 확인하였다.
삭제
본 발명은 천연물 유래의 때죽나무(Styrax japonica) 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 히알루로니다아제(HAase, hyaluronidase) 저해제 및 이를 포함하는 항염증 및 항알레르기 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 때죽나무(Styrax japonica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 히알루로니다아제(HAase: hyaluronidase) 저해제를 제공한다.
또한, 바람직하게 본 발명은 때죽나무(Styrax japonica) 추출물은 때죽나무 줄기의 추출물인 것을 특징으로 하는 히알루로니다아제(HAase: hyaluronidase) 저해제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 때죽나무 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 히알루로니다아제(HAase: hyaluronidase) 저해제를 포함하는 항 알레르기성 약학적 조성물 또는 항염증 조성물을 제공한다.
바람직하게, 본 발명은 때죽나무(Styrax japonica)의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매의 가용추출물 및 식품학적으로 허용되는 식품 보조 첨가제를 함유하는 염증 및 알레르기 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 건강기능식품에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 염증 및 알레르기 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 500종의 천연물 추출물로부터 검색된 때죽나무 줄기 추출물을 포함하는 히알루로니다아제 저해제를 포함함으로써, 트라닐라스트, 인도메타신 및 아스피린 등과 같은 경우보다 부작용을 대폭 줄일 수 있다.
또한, 우수한 저해능력을 가짐으로써, 히알루로니다아제가 유도하는 알레르기, 염증반응의 저해제로써 다양하게 사용될 수 있으며, 필러 보조제, 국소마취제 등으로도 활용될 수 있을 것이다.
도 1a 내지 도 1c는 1차 검색을 통하여 우수한 히알루로니다아제 저해효과를 보인 3종의 천연물 추출물과 양성대조군인 DSCG를 농도별 (0.5, 1, 1.5, 2 mg/ml)로 처치하여 히알루로니다아제 저해효과를 나타낸다.
도 2는 히알루로니다아제 저해활성 실험에 사용한 우베로데 점도계로, A, B, C는 입구를 나타내며, D는 효소-기질 혼합물이 정치하는 부분, E는 측정 부분이다.
도 3은 우베로데 점도계를 이용한 히알루로니다아제 저해활성 효과를 나타낸 그래프로 유럽 약전 기준 히알루로니다아제의 활성값을 기준으로 하여 양성대조군인 DSCG와 때죽나무, 매화말발도리, 박달목서의 저해활성 효과를 나타낸다.
도 4는 때죽나무의 유기용매 추출방법에 대한 모식도를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 농도별 때죽나무 메탄올, 에틸아세테이트 추출물이 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포의 성장에 미치는 영향을 나타내었다,
도 6a 및 도 6b는 농도별 때죽나무 메탄올, 에틸아세테이트 추출물이 지질 다당류에 자극을 받은 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포의 일산화질소 생성량을 나타내어 항염증 효과를 확인하였다.
도 7a 및 도 7b는 농도별 때죽나무 메탄올, 에틸아세테이트 추출물을 처치한 지질 다당류에 자극을 받은 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포에서 단백질을 추출하여 이를 이용하여 염증관여 인자인 COX-2의 발현량을 나타내었다.
도 2는 히알루로니다아제 저해활성 실험에 사용한 우베로데 점도계로, A, B, C는 입구를 나타내며, D는 효소-기질 혼합물이 정치하는 부분, E는 측정 부분이다.
도 3은 우베로데 점도계를 이용한 히알루로니다아제 저해활성 효과를 나타낸 그래프로 유럽 약전 기준 히알루로니다아제의 활성값을 기준으로 하여 양성대조군인 DSCG와 때죽나무, 매화말발도리, 박달목서의 저해활성 효과를 나타낸다.
도 4는 때죽나무의 유기용매 추출방법에 대한 모식도를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 농도별 때죽나무 메탄올, 에틸아세테이트 추출물이 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포의 성장에 미치는 영향을 나타내었다,
도 6a 및 도 6b는 농도별 때죽나무 메탄올, 에틸아세테이트 추출물이 지질 다당류에 자극을 받은 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포의 일산화질소 생성량을 나타내어 항염증 효과를 확인하였다.
도 7a 및 도 7b는 농도별 때죽나무 메탄올, 에틸아세테이트 추출물을 처치한 지질 다당류에 자극을 받은 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포에서 단백질을 추출하여 이를 이용하여 염증관여 인자인 COX-2의 발현량을 나타내었다.
본 발명은 때죽나무(Styrax japonica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 히알루로니다아제(HAase: hyaluronidase) 저해제 및 이를 포함하는 항염증 및 항알레르기 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 천연물 유래의 때죽나무(Styrax japonica) 줄기 추출물을 유효성분으로 하는 천연물 유래의 항염증, 항알레르기 조성물에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하나, 이들이 발명의 내용을 제한하는 것은 아니다.
[
실시예
1] 천연물의 메탄올 추출물 조제
본 발명에서 사용한 천연물 추출물 500종의 사용된 부위는 주로 전초(265종, 53%), 줄기(94종, 18%), 줄기껍질(32종, 6%)등이며 메탄올 추출물이다. 추출방법은 각 부위에 따라 분리하여 음건된 천연물을 각 1 kg씩을 분쇄하여 메탄올을 3배 첨가하고 60℃에서 3시간씩 3회 추출하였다. 수집된 추출액은 3M 여과지로 여과한 후 농축기로 농축하여 디메틸 설프옥사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)로 10 mg/ml 농도로 조제하여 사용하였다.
[
실시예
2] 1차 검색을 통한 천연물 히알루로니다아제 저해활성 측정
500종의 천연물 추출물에 대한 히알루로니다아제 저해활성 정량원리는 히알루론산이 히아룰로니다아제에 의해 분해되어 생성된 N-아세틸글루코사민의 정량을 DMAB 용액 (파라-디메틸아미노벤즈알데히드(p-dimethylaminobenzaldehyde) 0.4 g, 아세트산 35 ml, 10 N 염화수소 5 ml)으로 발색시킨 후, 분광공도계를 이용하여 540 nm에서 비색 정량하였다. 정량법은 0.1 M 초산 완충액 (pH 3.5)에 녹인 히알루로니다아제 (10 mg/ml) 6 μl를 천연물 시료 6 μl와 혼합시킨 후 37℃ 항온수조에서 20분간 반응시켰다. 대조군은 천연물 시료 대신 초산 완충액을 사용하였다. 히알루로니다아제를 활성화시키기 위해 히알루로니다아제 용액에 12.5 mM 염화칼슘 6 μl를 가한 후 37℃ 항온수조에서 20분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 0.1 M 초산 완충액 (pH 3.5)에 녹인 기질 히알루론산 (6 mg/ml) 12 μl를 반응액에 첨가하여 37℃ 항온수조에서 40분간 반응시켰다. 기질-효소 반응 정지를 위해 0.4 N 수산화나트륨 6 μl와 0.4 M 칼륨 붕사(potassium tetraborate) 6 μl를 반응액에 가하여 100℃에서 3분간 반응시킨 후, 상온에서 완전히 냉각시켰다. 기질-효소 혼합액에 발색제인 DMAB 용액 180 μl를 가한 후 분광광도계를 이용하여 540 nm에서 흡광도값을 측정하였다. 저해활성은 다음 식을 사용하여 계산하였다.
ODc 는 540 nm에서의 대조군의 흡광도, ODs는 540 nm에서의 시료용액의 흡광 이며, 각 실험은 3회 반복하여 평균값을 계산하였다.
| 학 명 | 사용 부위 | 히알루로니다아제 저해율 (2 mg/ml) |
| 매화말발도리 | 줄기 | 53.50 |
| 박달목서 | 줄기껍질 | 53.19 |
| 주엽나무 | 줄기껍질 | 49.79 |
| 회목나무 | 줄기 | 49.21 |
| 큰세잎쥐손이 | 지상부 | 47.17 |
| 개회나무 | 줄기 | 46.86 |
| 굴거리 | 줄기 | 46.25 |
| 분버들 | 줄기 | 45.74 |
| 비름 | 전부위 | 44.82 |
| 낙동구절초 | 전부위 | 44.21 |
| 당조팝나무 | 줄기 | 43.60 |
| 올괴불나무 | 줄기 | 40.74 |
| 좀꿩의다리 | 전부위 | 40.02 |
| 비쭈기나무 | 줄기껍질 | 38.80 |
| 떡갈나무 | 줄기 | 37.27 |
| 향모 | 전부위 | 36.86 |
| 큰수리취 | 전부위 | 36.14 |
| 숫잔대 | 종자 | 35.22 |
| 넓은잎쥐오줌풀 | 줄기 | 34.71 |
| 참개별꽃 | 전부위 | 34.51 |
| 석잠풀 | 전부위 | 34.30 |
| 털개구리미나리 | 전부위 | 34.20 |
| 사철쑥 | 전부위 | 33.90 |
| 산딸나무 | 줄기, 뿌리 | 32.57 |
| 털갈매나무 | 줄기 | 32.36 |
| 좀명아주 | 전부위 | 31.45 |
| 초롱꽃 | 전부위 | 29.40 |
| 청비녀골풀 | 전부위 | 29.40 |
| 왕괴불나무 | 줄기 | 29.30 |
| 꿀풀 | 전부위 | 28.38 |
| 깽깽이풀 | 전부위 | 28.08 |
| 황근 | 줄기껍질 | 26.34 |
| 물쑥 | 전부위 | 25.83 |
| 등수국 | 잎 | 23.68 |
| 맥문동 | 전부위 | 23.28 |
| 왕원추리 | 전부위 | 22.97 |
| 띠 | 잎 | 20.83 |
| 신감채 | 전부위 | 18.68 |
| 머루 | 줄기 | 18.37 |
| 모시풀 | 전부위 | 17.86 |
| 솔새 | 전부위 | 16.33 |
| 배암차즈기 | 전부위 | 16.13 |
| 노랑하늘타리 | 잎, 줄기 | 11.94 |
| 개쑥갓 | 전부위 | 11.33 |
| 잔디 | 전부위 | 10.51 |
| 껄껄이풀 | 전부위 | 7.86 |
| 오동나무 | 잎, 줄기 | 4.39 |
| 동백나무겨우살이 | 전부위 | 3.16 |
| 진부애기나리 | 전부위 | - |
천연물 500종 가운데 히알루로니다아제 저해 활성이 우수한 50종의 천연물을 선별한 결과를 표 1에 나타내었다. 그 가운데 히알루로니다아제 저해활성이 가장 우수한 천연물 3종은 때죽나무(Styrax japonica) 줄기 57.28%, 매화말발도리(Deutzia coreana) 줄기 53.50%, 박달목서(Osmanthus insularis) 줄기 53.19% 순으로 억제 효과를 보였다. 시험에 사용된 추출물의 기원은 줄기 추출물이 다른 부위 보다 히알루로니다아제 저해 효과가 크게 나타났다.
[
실시예
3] 2차 검색을 통한 천연물 농도별 히알루로니다아제 저해활성 실험
1차 검색을 통해 50% 이상의 히알루로니다아제 저해율(%)을 보인 천연물 3종을 선별하여 농도별 저해활성을 확인하였다. 즉, 0.1 M 초산 완충액(pH 3.5)로 각 천연물시료를 0, 0.25, 0.5, 1, 2 mg/ml의 농도로 희석한 뒤 히알루로니다아제 저해활성을 측정하여 농도별 저해율을 계산하였다. 양성대조군인 항알레르기 약물인 DSCG를 동일 농도(0, 0.25, 0.5, 1, 2 mg/ml)로 하여 히알루로니다아제 저해율 변화를 비교 분석하였으며, 효소활성 저해율을 산출하여 IC 값으로 평가하였다. 이때 IC은 효소 활성을 50% 저해하는 농도이다.
1차 검색을 통해 선별된 때죽나무, 매화말발도리, 박달목서 추추물들을 0, 0.25, 0.5, 1, 2 mg/ml의 농도로 조성하여 농도별 히알루로니다아제 저해활성 측정 결과를 표 1과 도면 1에 나타내었다. 때죽나무, 매화말발도리의 추출물은 2 mg/ml의 농도에서 양성 대조군인 DSCG과 유사한 저해율을 확인하였다. 농도별 저해활성 결과에 따른 IC의 결과는 표 3에 나타내었다. 때죽나무 추출물은 1.67 mg/ml의 농도에서 IC값을 나타내었으며, 매화말발도리와 박달목서 추출물은 각각 1.57 mg/ml, 2.01 mg/ml에서 IC값을 나타내었다. 양성대조군으로 사용된 DSCG는 0.23 mg/ml와 같은 저 농도에서 IC값을 보였다.
결과적으로 천연물 2 mg/ml 이하의 농도에서는 모든 천연물이 양성 대조군보다 낮은 저해활성과 IC값을 보였지만, 모든 시료에서 농도 의존적으로 HAase 저해활성이 증가하여 2 mg/ml에 농도에서는 양성대조군과 유사한 HAase 저해율이 확인되었다.
[ 실시예 4] 우베로데 점도계( Ubbelohde viscometer)를 이용한 히아루로니다아제 저해 활성 측정
1차 검색을 통해 50% 이상의 저해율을 보인 천연물 3종을 우베로데 점도계(Ubbelohde viscometer)를 사용하여 저해활성을 측정하였다. 유럽약전(European Phamacopoeia) 기준 히알루로니다아제 (1113.17 IU/mg)을 희석액[Gelatin hydrolysate enzymatic 0.7%, 1 M 인산완충액 (pH 6.4) 500 ml, 증류수 500 ml]으로 희석한 후 0.66 IU/ml의 농도로 조성하였다. 실험군에는 66 IU/ml의 농도로 희석한 히알루로니다아제 1 ml와 희석액에 녹인 천연물 시료(10 mg/ml) 2 ml를 증류수 97 ml를 혼합하여 히알루로니다아제 혼합용액을 제조하였다.
기질액은 히알루론산 0.5 g에 증류수 100 ml 혼합한 후, 12시간 동안 4℃에서 교반하였고, 점도측정은 점도계를 37℃ 항온수조 내에 설치하여 측정하였다. 점도측정 방법은 기질액 5 ml와 PBS(pH 6.4) 7.5 ml, 히알루로니다아제 혼합용액 2.5 ml를 혼합한 뒤 도면 2에 명시된 점도계의 A 부분으로 시료를 넣었다.
그 후 A, B 부분을 공기가 통하지 않도록 막은 뒤 C 부분을 석션(suction)하여 D부분까지 시료 혼합액에 정치하도록 하였다. A, B 부분을 다시 공기가 통하게 하여 혼합액이 흐르도록 한 뒤 E부분에서 F부분까지 시료가 흐르는 시간을 6회 반복 측정하였다. 즉, 점액성분을 가진 당 복합체인 히알루론산을 기질로 천연물시료와 히알루로니다아제의 혼합액과 반응시켜 글루크론산과 글루코사민사이의 β-(1,4) 당 결합을 가수분해하는 효소반응에 의해 점도계 내에서 혼합액이 흐르는 시간(t)의 변화와 점성도(η)의 기울기변화를 계산하여 시료의 활성을 다음 식으로 계산하였다.
ηr = (k x t2) / 0.6915
k = 점도계 상수(mm2/s2),
t2 = 액의 유출 시간(초)
0.6915 = 37℃에서 완충액의 운동 점도(mm2/s)
다음 식으로 Specific activity (IU/mg)를 계산하였다.
A = 유럽약전 기준 히알루로니다아제 활성 (IU/mg)
2차 검색결과 히알루로니다아제 저해율이 50% 이상을 보인 때죽나무, 매화말발도리, 박달목서 추출물을 우베로데 점도계(Ubbelohde viscometer)를 이용한 히알루로니다아제 저해활성 측정법으로 확인 실험한 결과는 도 3에 나타내었다. 효소액인 히알루로니다아제는 유럽약전 기준 효소 활성 수치인 0.667 IU/ml로 조제하고, 여기에 양성대조군인 DSCG와 천연물 추출물(0.2 mg/ml)을 처치하였을 때, DSCG 처치군 에서는 음성 대조군(미처치군) 보다 38.1% 활성이 저해되었고, 때죽나무 추출물은 34.8% 저해, 매화말발도리 추출물은 34.8% 저해 및 박달목서 추출물은 5.1%의 효소활성이 각각 저해되었다.
따라서 2차 선발된 천연물을 대상으로 히알루로니다아제 저해효과를 점도측정 법으로 확인한 결과, 때죽나무, 매화말발도리, 박달목서 순으로 저해효과를 보여 1차, 2차 검색 결과와 유의성 있는 연구결과를 확인하였다.
[
실시예
5] 때죽나무 분류 및 전처리
때죽나무는 멸균수를 이용하여 이물질 제거 후, 60℃ 배양기에서 3일 동안 음건 건조하여 사용하였다. 때죽나무는 줄기만 분리하여 줄기 건조물 1 kg을 마쇄기로 분쇄한 후 추출용기에 넣었다. 3배량의 메탄올을 첨가하여 70℃에서 4시간 동안 추출하였다. 이 과정을 3회 반복하여 얻어진 메탄올 추출물은 40℃의 감압농축기에서 농축하였다.
[
실시예
6] 때죽나무의
유기용매
추출방법
유기용매별 추출방법은 도 4에 표시하였다. 추출방법은 때죽나무 메탄올 추출물을 물과 헥세인을 1:9:10의 비율로 섞은 뒤 분액깔때기에 넣어서 12시간 동안 정치하였다. 각각의 용매가 잘 섞이도록 반복적으로 강하게 흔들어 주었으며, 실험은 3회 반복 수행하였다. 물과 헥세인 층으로 나눠진 분획에서 헥세인 층을 분리하여 50℃에서 감압 농축하여 추출물을 얻었다.
위 과정에서 얻어진 물 층에 동일량의 클로로폼을 첨가한 후, 12시간 정치 후 클로로폼층 추출물을 분획화하였다. 클로로폼 층에서 얻어진 물 층에 에틸아세테이트를 동일량 첨가한 후, 균일하게 혼합하였다. 12시간 정치하여 에틸아세테이트층에 분리된 분획물을 얻었으며 위 과정에서 분리된 물 층에 부탄올을 동량 가하고, 혼합하였다. 12시간 동안 정치하여 부탄올층 분획물을 분리하였다.
최종적으로 부탄올에서 얻어진 물 층은 12시간 정치하여 물 층으로 분리된 분획물을 얻었다. 또한 최초 사용한 용매인 메탄올 추출물 일부와 각각의 과정에서 얻어진 추출물은 감압농축기와 동결건조기를 이용하여 고형 성분으로 제조하였다. 추출물의 수율은 표 4에 나타내었다.
건조된 때죽나무 줄기로부터 메탄올 침전에 의해 수득한 추출물의 초기 수율은 8.12%이었다. 다시 메탄올 추출물을 이용한 5가지 유기용매를 이용한 각각의 추출물 수율은 헥세인 0.41%, 클로로폼 0.48%, 에틸아세테이트 0.23%, 부탄올 1.31% 물에서 2.3%의 수율을 보였다.
[ 실시예 7] 마이크로 플레이트를 이용한 때죽나무 분획물의 히알루로니다아제 저해활성
때죽나무의 유기용매 추출물을 각각 0.1 M 초산 완충액 (pH 3.5)와 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 10 mg/ml가 되도록 조제하였으며, DMSO의 농도는 최종농도 0.5%로 하여 실험에 사용하였다. 정량법은 0.1 M 초산 완충액 (pH 3.5)에 녹인 히알루로니다아제 (10 mg/ml) 6 μl를 때죽나무 유기용매 추출물 6 μl와 혼합시킨 후 37℃ 항온수조에서 20분간 반응시켰다.
대조군은 천연물 시료 대신 초산 완충액를 사용하였다. 히알루로니다아제를 활성화시키기 위해 혼합액에 12.5 mM 염화칼슘 6 ul를 가한 후 37℃ 항온수조에서 20분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 0.1 M 초산 완충액 (pH 3.5)에 녹인 기질용액 히알루론산 (6 mg/ml) 12 μl를 반응액에 첨가하여 37℃ 항온 수조에서 40분간 반응시켰다. 기질-효소 반응 정지를 위해 0.4 N NaOH 6 ul와 0.4 M 칼륨 붕사(potassium tetraborate) 6 μl를 반응액에 가하여 100℃에서 3분간 반응시킨 후, 상온에서 완전히 냉각시켰다. 기질-효소 혼합액에 발색제인 DMAB 혼합액을 180 μl를 가한 후, 분광광도계를 이용하여 540 nm에서 OD값을 측정하였다. 저해활성은 다음 식을 사용하여 계산하였다.
저해활성은 다음의 식을 통해 구하였다.
Hyaluronidase Inhibition (%) = 
여기서 ODc(optical density)는 540 nm에서의 대조군의 흡광도이고, ODs는 540 nm에서의 시료용액의 흡광도이다. 각 실험은 3회 반복하여 평균치를 구하였으며, 그 결과는 표 5에 나타내었다.
때죽나무 6개의 유기용매 추출물의 히알루로니다아제 저해효과에 대한 결과 히알루로니다아제 저해활성이 가장 우수한 유기용매 추출물은 메탄올 추출물 65.24 ± 2.57%, 에틸아세테이트 추출물 60.01 ± 2.00%, 헥세인 추출물 59.92 ± 2.38% 순으로 나타났다.
[
실시예
8] 때죽나무 추출물이 대식세포 Raw 264.7 cell에 미치는 영향
세포 생존율 측정: Raw 264.7 세포를 96 마이크로 플레이트에 각 well 당 5 x 10⁴ cell/ml가 되게 180 ul 분주하고, 시료를 20 ul 첨가하여 최종농도가 각각 100, 10, 1, 0.1, 0 ug/ml 되도록 하였다. 그 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양한 뒤 5 mg/ml 농도로 제조한 MTT 용액 20 ul를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well에 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 100 ul를 가하여 실온에서 5분간 반응시킨 뒤 분광광도계 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료와 동일한 양의 인산완충액를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
[
실시예
9 : 실험결과]
마우스 대식세포인 raw 264.7 세포에 메탄올, 에틸아세테이트 추출물을 각각 최종농도 100 ~ 0.1 ul/ml로 조성하여 24시간 배양하고 세포 생존율 측정을 한 결과, 음성대조군(control)의 생장률을 100%로 기준으로 메탄올 추출물이 저도농부터 각각 93.02±1.75%, 93.62±1.82%, 71.61±4.51%, 57.83±1.17%, 55.21±0.38%, 49.93±0.13%, 45.65±0.77%로 나타났으며, 에틸아세테이트 추출물은 저농도부터 98.31±2.92%, 95.31±4..92%, 93.08±2.52%, 91.15±3.94%, 85.06±4.34%, 75.44±3.41%, 59.89±3.29%, 58.26±2.45%로 나타났다. 그 결과, 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소함을 확인하였으며, 대조군에 비해 메탄올 추출물이 7 ~ 50%, 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 추출물이 2 ~ 35%의 낮은 세포독성을 나타냈다.
9.1 일산화질소 (Nitric oxide) 측정
때죽나무 추출물의 항염증 효과를 평가하기 위해 염증반응을 매개하는 NO의 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 측정법은 Raw 264.7 세포를 96 well plate에 각 well 당 5 x 10⁴cell/ml가 되게 180 ul 분주하고 지질다당류(lipopolysaccharide)를 각 well에 1 ng/ml 첨가하여 일산화질소 생성을 자극시킨 뒤, 2시간 동안 37℃, 5% CO₂incubator에서 배양하였다. 배양 후 때죽나무 메탄올, 에틸아세테이트 추출물 시료를 20 ul 첨가하여 최종농도가 각각 100, 10, 1, 0.1, 0 ug/ml 되도록 하였다.
그 후 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 24시간 배양한 뒤 상층액을 새로운 96 마이크로 플레이트에 옮겨 griess reagent로 10분간 반응시킨 후에 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 지질 다당류만 첨가한 군에서 생산된 일산화질소의 양을 100%로 하여 시료가 첨가된 경우에 측정된 흡광도를 환산하여 표기하였다. 수행 결과는 도 6에 나타내었다.
9.2 일산화질소
측정 실험결과
마우스 대식세포인 raw 264.7세포에 지질다당류(LPS)를 처리한 후 때죽나무 메탄올 추출물과 에틸아세테이트 추출물을 농도별 (0.1~100 μg/mL)로 처리한 결과 일산화질소 생성량 변화로 때죽나무 메탄올 추출물과 에틸아세테이트 추출물은 농도가 증가함에 따라 일산화질소 생성량이 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었으며, 특히 때죽나무 메탄올 추출물을 10μg/mL 처리군에서 지질다당류(LPS)을 처리한 군과 비교했을 때, 60% 이상의 일산화질소 생성 억제를 일으키는 것을 확인할 수 있었다. 또한 때죽나무 에틸아세테이트 추출물을 25μg/mL 처리군에서 지질다당류(LPS)을 처리한 군과 비교했을 때, 60% 이상의 일산화질소 생성 억제를 일으키는 것을 확인할 수 있었다.
9.3 Western blotting
때죽나무 추출물을 이용하여 염증 관여인자인 COX-2의 단백질 발현양상을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯팅(western blotting) 실험을 수행하였다. 실험방법으로 Raw 264.7 세포를 100 mm 조직용 플레이트에 부착한 후 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 인산완충액으로 2번 세척하였다. 리파 완충액을 (Radioimmunoprecipitation, RIPA) 10 ml 가하여 4℃, 12,000 rpm에서 20분간 원심 분리하였다.
원심 분리하여 얻은 상층액은 BCA assay로 정량하여 30ul의 단백질을 10%의 나트륨 도데실설폰산염 폴리아크릴아미드 겔 전기이동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)를 이용하여 전기 영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 폴리비닐이딘 플루오라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 에 옮긴 다음 실온에서 1시간 블로킹 완충액 (5% skin milk in tris-buffered saline and tween 20)에서 배양시켰다.
일차 항체(antibody)를 희석하여 4℃에서 12시간 동안 교반한 다음, 다시 10분 간격으로 블로킹 완충액로 3회 수세하고 마우스 항-래빗 IgG HPR(mouse anti-rabbit IgG HPR), 보바인 항-염소 IgG HRP(bovine anti-goat IgG HRP)의 각각의 이차 항체(antibody)를 1 : 1,000 으로 희석하여 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 2회 세척한 뒤 ELC 키트(Enhanced chemiluminescence kit)와 반응시켜 엑스레이 필름에 노출시켰다. LAS 4,000 이미지 분석 프로그램를 이용하여 밴드 현상확인 및 정량하였다. 실험 결과는 도 7에 나타내었다.
지질다당류에 의해 활성화된 Raw 264.7 세포에 메탄올 추출물과 에틸아세테이트 추출물을 농도별 (50, 25, 10, 5 μg/mL)로 처리한 결과, 25 μg/mL 처리군에서 일산화질소 생성과 관계있는 COX-2 단백질의 60% 이상의 저해율을 확인하였다.
이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 500 종의 천연물 추출물로부터 검색된 때죽나무 줄기 추출물을 포함하여, 알루로니다아제 저해능력이 우수하여, 히알루로니다아제가 유도하는 알레르기, 염증반응의 저해제로써 활용될 수 있다.
상기에 제시된 실시예는 예시적인 것으로 이 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위에서 제시된 실시예에 대한 다양한 변형 및 수정 고안을 만들 수 있을 것이다. 이러한 변형 및 수정 고안에 의하여 본 발명의 범위는 제한되지 않는다.
Claims (4)
- In vitro(시험관)에서 때죽나무(Styrax japonica) 추출물을 처리하는 단계를 포함하는, in vitro(시험관)에서 히알루로니다아제의 활성을 저해하는 방법.
- 때죽나무(Styrax japonica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 in vitro(시험관)에서의 히알루로니다아제 저해용 조성물.
- 삭제
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 박달목서(Osmanthus insularis) 추출물, 또는 매화말발도리(Deutzia coreana) 추출물을 더 포함하는 것인, 히알루로니다아제 저해용 조성물.
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160040498A (ko) | 2016-04-14 |
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