KR102058022B1 - 백산차 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 백산차(Ledum palustre L.) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증용 조성물에 관한 것으로, 항산화 및 항염증용 식품 및 화장료 조성물과 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

백산차 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증용 조성물{Composition for antioxidant and anti-inflammatory comprising fraction of Ledum palustre L. extract as effective component}
본 발명의 백산차(Ledum palustre L.) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 항산화 기능과 염증 매개 물질인 NO의 발생 및 염증성 사이토카인의 발생을 억제하여, 항산화 및 항염증용 식품 및 화장료 조성물과 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
산업사회의 발달과 고령화 인구의 증가에 따라 건강한 삶을 영위하고자 하는 욕구가 증가하고 있고, 전 세계적으로 기능성 식품 및 화장품에 대한 소비자의 관심이 커지고 있다. 따라서 이에 대한 연구 개발이 활발해졌으며, 항산화와 항염효과 등의 활성성분 발견을 위한 근거 중심적 연구가 활발하게 진행되고 있다. 활성산소는 대부분 불안정하여 전자를 잃거나 얻어서 보다 안정된 상태로 가려는 성질이 있으며 이들의 높은 반응성은 생체내에서 산화적 손상을 일으킨다. 생체의 산화반응 과정 중에 생성되는 활성산소들은 체내의 SOD(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase), 글루타치온 산화효소(glutathione peroxidase)와 같은 항산화효소에 의해 제거되지만, ROS(reactive oxygen species)는 지질과산화, 단백질산화, 단백질 분해효소의 활성화, DNA산화와 같은 손상을 야기한다. 이러한 손상의 결과로 고혈압, 당뇨병, 아토피성 피부염, 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환이 발생하게 된다. 이와 같은 과량의 ROS로 인한 산화적 스트레스가 항산화물질에 의해 감소하는 것이 알려지면서 항산화 물질을 개발하기 위한 연구들이 지속적으로 이루어지고 있으며, 합성 항산화제의 부작용이 증가함에 따라 천연물 유래의 항산화제에 관한 연구가 더욱 활발히 진행되고 있다. 식물 유래의 2차 대사산물들은 자유유리기와 활성산소의 생성을 억제하거나 제거시켜서 산화에 의한 세포손상을 방지하는 것으로 알려져 있으며, 천연물로부터의 라디칼 소거능을 확인하는 방법으로 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)와 ABTS(2,2-azinobis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid) 분석이 널리 연구되고 있다. 염증반응은 인체에 외부 병원체 등의 각종 외부 물질의 침입을 식별하고 이를 제거하여 항상성을 유지하는 자기 방어체계인 1차적 면역반응이며, 대식세포는 대표적인 염증 매개물질인 NO(nitric oxide) 생성에 관여한다. 활성산소의 하나인 NO는 염증 반응 시에 iNOS(inducible NO synthase)에 의해 과도하게 생성되어 염증을 심화시키게 된다. 또한, 대식세포에 그람 음성세균의 세포외막에 존재하는 내독소 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β) 및 IL-6(interleukin-6) 등과 같은 사이토카인의 분비를 증가시킨다. 또한 iNOS에 의해 생성되는 NO와 COX-2(cyclooxygenase-2)에 의해 생성되는 PGE2(prostaglandin E2) 등의 염증유발인자들도 생성된다. 이러한 염증유발인자들은 NO와 ROS의 생성을 더 자극하게 되어 염증 반응이 과도해지며 이러한 현상은 만성 염증 질환의 원인이 된다. 따라서 다양한 만성 염증 질환의 예방 및 치료를 위하여 항산화 및 항염증 효과가 있는 기능성 소재의 개발이 중요시되고 있다.
백산차(Ledum palustre L.)는 백두산 지역에 자생하는 진달래과의 상록 소교목으로 높은 산의 숲 밑에서 자라며 뿌리에서 어린 싹이 돋고 다갈색의 털이 빽빽이 나는 형태를 가진다. 시베리아, 북유럽에서는 동종요법에서 자주 사용하였으며, 우리나라에서는 차로 마시면서 식후의 청량감을 준다. 백산차는 방부제로도 사용하였다고 알려져 있으며 잎 부위를 약용으로 사용한다. 백산차 잎과 뿌리 속에는 탄닌(tannin), 테르펜(terpene)이 함유되어 있으며, 만성기관지염, 월경불순, 불임, 위궤양, 류마티스성 관절염에 효능이 있다. 그러나 아직까지 백산차에 대한 연구는 많이 부족한 실정이며 백산차의 항산화 및 항염증 활성 역시 보고된 바가 없다.
한국등록특허 제1456287호에는 배암차즈기 잎을 이용한 항산화 및 항염 기능성 차의 제조방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0071698호에는 항산화 및 항염 기능성 엄나무순 차의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 백산차 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증용 조성물과는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 백산차를 추출하는 데 있어서, 추출 용매 및 용매 분획물에 대해 항산화 및 항염증 활성을 검증하여, 추출물 내 항산화 및 항염증 활성이 증진된 백산차 추출물의 제조방법을 확립하는데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 백산차 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 백산차 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 백산차 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 백산차 추출물의 분획물은 항산화 및 항염증용 식품 및 화장료 조성물과 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로서 유용하게 사용할 수 있어, 예로부터 전통차로서 우리 민족이 즐겨 마셔 오던 백두산 백산차의 항산화 및 항염증 기능성 소재로서의 활용이 가능하다.
도 1은 백산차 추출물 및 분획물의 세포 독성을 비교한 그래프이다.
도 2는 백산차 추출물 및 분획물의 NO 생성량을 비교한 그래프이다.
도 3은 백산차 추출물 및 분획물의 프로스타글라딘 E2 생성량을 비교한 그래프이다.
도 4는 백산차 추출물 및 분획물의 염증성 사이토카인 생성량을 비교한 그래프이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 백산차(Ledum palustre L.) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 건강기능식품에서, 상기 백산차 에탄올 추출물은 바람직하게는 백산차에 60~80% 에탄올을 18~22배(v/w) 첨가한 후 20~28시간씩 1~3회 추출한 추출물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 백산차에 70% 에탄올을 20배(v/w) 첨가한 후 24시간씩 2회 추출한 추출물일 수 있다.
본 발명의 항산화 및 항염증용 건강기능식품은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다.
그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 또한, 백산차(Ledum palustre L.) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명은 또한, 백산차(Ledum palustre L.) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다
1. 재료 및 방법
(1) 실험재료 및 추출물의 제조
백산차는 ㈜파이로젠(대구 달성군 소재)으로부터 5월에 건조된 것을 구입하여 본 실험에 사용하였으며 분쇄기(IKA ⓡ Werke GmbH & Co., KG, Staufen, Germany)를 이용 40 mesh 이하로 분쇄한 후 -20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다. 추출방법은 백산차의 열수 추출은 분쇄된 시료 100 g에 9배의 증류수를 끊인 후 시료를 가하고 3시간 2회 반복 추출하였고(LPW), 초음파추출(ultrasonification extraction)은 시료 100 g에 9배의 증류수를 넣은 유리병을 초음파 수조(NXPC-4020P, KODO, Hwaseong, Korea) 바닥에 닿지 않도록 하여 40 kHz로 3시간 2회 반복 추출하였다(LPU). 고온가압추출(autoclave extraction)은 autoclave(JSAC-100, JS Research Inc., Gongju, Korea)에 분쇄된 시료 100 g에 9배의 증류수를 넣은 후 121℃에서 3시간 동안 2회 반복 추출하였으며(LPA), 70% 에탄올추출(70% ethanol extraction)은 시료 100 g에 20배의 70% 에탄올 2 L를 넣고 24시간 동안 2회 침지 추출하였다(LPE). 각각의 추출물은 여과지(Whatman No.2, Maidstone, England)로 여과한 후 회전진공 농축기(WB2000, Heidolph, Schwabach, Germany)로 농축하였다. 농축액은 동결건조(FD SFESM12, Samwon, Busan, Korea)하여 분말을 제조하였으며, 제조한 추출분말은 -70℃에 저장하여 실험에 사용하였다. 이후 얻어진 추출물 중 실험을 통하여 가장 효능이 우수한 70% 에탄올 추출물을 이용하여 용매 분획을 하였다. 70% 에탄올 추출물 8 g을 100 mL의 증류수로 현탁시킨 후에 n-헥산(n-hexane) 1 L씩 3회(LPE/H), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 1 L씩 3회(LPE/E), 그리고 n-부탄올(n-butanol) 1 L씩 3회(LPE/B)로 순차적으로 분획하였으며, LPE/H, LPE/E, LPE/E와 물층(LPE/W)은 모두 농축하여 각각의 분획물을 확보한 후 동결 건조하고 -70℃에서 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다.
(2) DPPH 라디칼 소거 활성
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성은 DPPH에 대한 전자공여 효과로 측정하였다. 0.2 mM DPPH 용액 50 μL와 시료 100 μL를 혼합한 다음 상온에서 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(SunriseTM, Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성률은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 산출하였다.
(3) ABTS 라디칼 소거 활성
ABTS(2,2-azinobis-(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulphonate)) 라디칼 소거활성은 7 mM의 ABTS 용액에 과황산칼륨(potassium persulfate)을 2.45 mM이 되도록 용해시켜 빛을 차단시켜 12-16시간 동안 반응시킨 후 사용하였다. ABTS 용액을 흡광도가 0.6-0.8이 되도록 에탄올로 조정한 다음, 용액 100 μL와 시료 50 μL를 혼합하고 실온에서 15분간 반응시킨 다음 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성률은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 산출하였다.
(4) 세포 배양
마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포는 american type culture collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며, 세포배양을 위해 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(dulbecco’s modified eagle medium, Invitrogen Carlsbad, CA, USA)배지를 사용하였다. Raw 264.7 세포는 75 T-flask에서 37℃, 5%, CO2 인큐베이터 조건에서 배양하였다.
(5) MTT 분석
본 실험에서 Raw 264.7 세포에 대한 백산차 추출물 및 용매분획물의 유효농도를 결정하기 위한 세포생존율 측정은 MTT 분석으로 진행하였다. 배양된 Raw 264.7 세포를 48 웰 플레이트에 각각 5×104 cells/well로 접종하고 24시간 배양하였다. 동일 배지로 교체한 후 백산차 추출물 및 분획물을 농도별로 희석하여 처리한 후 24시간 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 5 mg/mL 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT, Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액을 배양된 세포에 20 μL씩 처리한 후 4시간 반응시켰다. 그 후 demethyl sulfoxide(DMSO, Duksan Co., Ltd., Ulsan, Korea) 100 μL 넣은 후, 10분간 교반 한 후 마이크로플레이트 리더로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(6) NO(Nitric oxide) 생성량 측정
NO 발현을 측정하기 위하여 Raw 264.7 세포를 48-웰 플레이트에 5×104 cells/well로 접종하고 24시간 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 뒤 serum free DMEM으로 교체한 후 LPS(1 μg/mL)를 처리하였다. 1시간 후 serum free DMEM 로 희석된 백산차 추출물 및 분획물을 농도별로 처리한 후 18시간 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 세포의 상등액과 그리스 시약(Sigma)을 1:1 비율로 혼합한 뒤 10분간 반응시켰다. 그 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(7) PGE2 생성량 측정
Raw 264.7 세포를 2×105 cells/mL 되도록 24-웰 플레이트에 접종하고 24시간동안 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후 serum free DMEM 배지로 교환한 후 LPS 1 μg/mL로 처리한 뒤 1시간 동안 전처리를 하고 난 다음 백산차 추출 물 및 분획물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포의 상층액을 취하여 PGE2 생성량을 측정하였다. PGE2 측정은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay(ELISA) kit(R&D system Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며, 스텐다드(standard)에 대한 표준곡선 R2 값은 0.99 이상이었다.
(8) 염증성 사이토카인 생성량 측정
세포배양액 내의 TNF-α, IL-1β, IL-6 생성량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay(ELISA) kit를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 5×105 cells/ml로 조절한 후 6-웰 플레이트에 접종하고, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 세포에 1 μg/mL의 LPS를 처리한 뒤 1시간 후에 백산차 추출물 및 분획물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 얻어진 상층액의 pro-inflammatory cytokine 함량을 측정하였으며, 정량은 ELISA kit를 이용하여 정량하였으며, 스텐다드(standard)에 대한 표준곡선 R2 값은 0.99 이상이었다.
(9) 통계처리
모든 실험은 3회 이상 반복하여 실시하였으며 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 유의성 검증은 SPSS statistics 20(IBM, Armonk, NY, USA) software package program을 이용하여 Duncan's multiple range test와 t-test를 실시하였다.
실시예 1. 백산차 추출방법에 따른 수율
백산차를 건조하고 분쇄한 시료 각각 100 g에 대하여 추출물 제조 방법에 따라 추출하여 동결 건조한 뒤 측정한 시료의 무게는 LPA > LPW > LPE > LPU 순으로 11.62 g, 10.38 g, 8.65 g, 5.82 g이 얻어졌으며 수율은 11.62%, 10.38%, 8.65%, 5.82%이었다. 위와 같이 얻어진 4가지 시료에 대하여 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하고 비교한 결과 LPE(70% 에탄올 추출물을 동결 건조한 시료)가 DPPH 라디칼에 대하여 RC50=197.2 μg/mL와 1,000 μg/mL 농도에서 82.3% 소거 활성을 나타내었고 ABTS 라디칼에 대하여 RC50=143.5 μg/mL와 1,000 μg/mL 농도에서 99.8% 소거 활성을 나타내어 두가지 라디칼 소거 활성 모두에서 가장 뛰어난 결과를 나타내었다(표 1 및 3). 이에 따라, 용매분획은 LPE 8 g을 취하여 분획물 제조 방법에 따라 분획하고 동결 건조하였으며 얻어진 각각의 분획물 시료의 무게는 LPE/W > LPE/B > LPE/E > LPE/H 순으로 2.62 g, 1.86 g, 1.23 g, 0.06 g이었고 회수율은 32.75%, 23.25%, 15.37%, 0,75%이었다.
실시예 2. 백산차 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성
DPPH는 화학적으로 안정화된 자유 라디칼을 가지고 있는 수용성 물질로 아스코르브산(ascorbic acid), 토코페롤(tocopherol), 폴리하이드록시(polyhydroxy) 방향족 화합물 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는데, 이것은 다양한 천연 소재로부터 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다. ROS(reactive oxygen species)는 체내 방어기전에 의해 대부분 제거되지만 제거되지 못할 경우 생체분자들과 신속하게 반응하여 단백질의 변성이나 생체막의 지질 과산화, DNA 손상 등을 일으키며, 세포 내로 확산되거나 혈류를 통해 이동된 지질 과산화물은 새로운 라디칼 반응을 촉진시켜 각종 질환의 원인으로 작용하였다. 본 실험에서는 추출방법을 달리한 4가지 추출물과 가장 효과가 우수한 70% 에탄올 추출물에 대한 4가지 용매 분획물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 추출방법에 따른 4가지 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 표 1과 같이 나타났다. DPPH 라디칼 소거 활성은 1,000 μg/mL 농도에서 LPE > LPU > LPA > LPW 순으로 측정되었으며, 가장 우수한 활성을 나타낸 LPE로부터 용매 분획물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 1,000 μg/mL의 농도에서 LPE/E이 91.8%의 활성을 나타내었고 RC50값은 43.5 μg/mL으로 측정되어, 비타민 C의 라디칼 소거 활성과 유사한 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(표 2).
백산차 추출물의 DPPH 라디칼 소거능(%)
시료 농도(μg/mL) Rc50
10 100 1000
LPW(열수 추출) 13.7±2.3 41.0±3.2 75.2±2.2 272.1±1.9
LPA(고온가압추출) 19.5±1.9 41.4±0.5 79.2±0.8 242.1±1.1
LPU(초음파 추출) 29.9±1.1 38.1±1.4 81.0±1.0 281.5±0.8
LPE(에탄올추출) 19.2±0.7 43.4±0.5 82.3±1.3 197.2±2.4
아스코르브산 24.5±0.5 47.5±0.9 90.2±0.8 135.3±1.1
백산차 분획물의 DPPH 라디칼 소거능(%)
시료 농도(μg/mL) Rc50
10 100 1000
헥산 분획물 22.7±1.7 37.6±2.1 83.2±1.3 364.2±1.3
에틸 아세테이트 분획물 48.0±0.9 62.7±1.1 91.8±1.5 43.5±0.9
부탄올 분획물 36.2±1.0 52.8±1.7 80.6±1.6 92.7±0.9
물 분획물 20.2±1.6 28.3±2.3 68.7±2.2 542.7±1.4
아스코르브산 24.5±0.5 47.5±0.9 90.2±0.8 135.3±1.1
실시예 3. ABTS 라디칼 소거 활성
유기용매에 용해되는 DPPH는 친수성 화합물의 항산화력을 측정함에 어려움이 있으나, 2,2-azino-bis(3-ethylbenthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS)는 645, 734, 815 nm의 파장에서 최대의 흡광도를 가지므로 추출물 고유의 색소에 의한 영향이 최소화되어 DPPH에서 보다 정확한 항산화력을 측정할 수 있다고 보고되었다. ABTS+ radical cation 소거 활성은 ABTS와 potassium persulfate와의 반응으로 ABTS+·radical이 생성되면 특유의 색인 청록색을 띄게 되며 hydrogen donating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있다. ABTS 라디칼 소거 활성에서도 백산차의 추출방법을 달리한 4가지 추출물에 대한 활성을 먼저 측정하였으며, 그 결과는 표 3에서 나타낸 것처럼 1,000 μg/mL 농도에서 LPE > LPU > LPW > LPA순으로 측정되었으며, LPE의 경우 가장 높은 농도인 1,000 μg/mL의 농도에서 99.8%의 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 추출물 중 가장 높은 활성을 나타낸 LPE의 용매 분획물에 대하여 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 1,000 μg/mL 농도 에서 LPE/E > LPE/B > LPE/H > LPE/W 순서로 측정되었으며 LPE/E 역시 1,000 μg/mL의 농도에서 99.6%의 높은 소거 활성이 확인되었다(표 4). 이러한 결과를 토대로 가장 우수한 라디칼 소거 활성을 지닌 백산차 추출물은 LPE와 LPE의 분획물인 LPE/E임을 알 수 있었으며 이들의 활성은 10-100 μg/mL 농도 사이에서도 비타민 C의 활성과 유사할 만큼 우수한 결과이다.
백산차 추출물의 ABTS 라디칼 소거능(%)
시료 농도(μg/mL) Rc50
10 100 1000
LPW(열수 추출) 12.4±1.6 40.6±4.1 92.1±2.7 251.5±0.8
LPA(고온가압추출) 11.8±2.7 39.2±3.6 86.3±1.3 273.9±2.5
LPU(초음파 추출) 12.0±0.9 45.7±1.9 98.7±2.4 158.5±2.4
LPE(에탄올추출) 9.4±0.5 50.5±2.5 99.8±2.7 143.5±1.7
아스코르브산 18.2±0.9 49.7±2.2 99.3±1.7 156.5±1.5
백산차 분획물의 ABTS 라디칼 소거능(%)
시료 농도(μg/mL) Rc50
10 100 1000
헥산 분획물 10.2±0.9 47.9±4.1 97.5±5.1 178.2±4.2
에틸 아세테이트 분획물 26.1±1.1 64.9±3.2 99.6±4.7 25.0±2.2
부탄올 분획물 16.8±2.0 50.3±1.9 98.3±2.5 168.5±2.9
물 분획물 7.8±0.8 64.7±1.2 80.7±2.4 367.0±1.5
아스코르브산 18.2±0.9 49.7±2.2 99.3±1.7 156.5±1.5
실시예 4. 세포 독성 측정
백산차 추출물 및 분획물에 의한 macrophage세포에서의 독성을 MTT assay에 의해 확인한 결과를 도 1에 나타내었다. 백산차 추출물 및 분획물의 항염효과가 LPS로 유도된 염증관련 물질의 생성을 감소시킨 것에서 기인하는지, 추출물의 세포 독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하는지를 고려하기 위한 실험한 결과, 백산차 4가지 추출물 및 4가지 분획물 모두 25 μg/mL의 농도 이하에서 90% 이상의 높은 생존율을 나타내었다. 따라서 NO, PGE2, TNF-α, IL-1β와 IL-6 생성 저해 활성은 25 μg/mL이하의 농도에서 진행하였다.
실시예 5. NO(nitric oxide) 생성 저해 활성
체내 염증과정에서는 과량의 NO 및 PGE2(prostaglandin E2)등의 염증인자가 유도형 NO synthase(iNOS) 및 cycloxygenase(COX)-2에 의해 형성된다. 일반적으로 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만 병리학적인 원인에 의한 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시키게 되며, 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발한다. 백산차 추출물이 이러한 NO의 생성 저해 활성이 있는지를 알아보기 위해 본 실험에서는 우선 백산차 4가지 추출방법에 따른 추출물에 대하여 Raw 264.7 세포에서 LPS 자극에 의해 생성되는 NO 생성량에 대한 영향을 측정하였다. 4가지 추출물이 모두 농도 의존적으로 세포 내에서의 NO 생성량을 감소시켰지만 그 중 LPE은 25 μg/mL의 농도에서 50%의 저해 활성을 나타내었다. LPE의 용매 분획물에 대한 활성을 측정한 결과, LPE/E에서 가장 높은 생성 저해 활성이 확인되었으며, 25 μg/mL의 농도에서 57%의 저해 활성을 나타내어 풀솜대 에틸아세테이트 분획물의 100 μg/mL 농도에서 50% 이하의 저해 활성을 나타낸 것보다 우수한 활성을 보였다(도 2).
실시예 6. PGE2 (prostaglandin E2 ) 생성 저해 활성
프로스타글란딘(prostaglandin)은 국소적으로 활성화되는 물질로서 염증 반응을 유도하는 중요한 인자로 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 COX(cyclooxygenase)의 작용에 의해 합성된다. 그 중 체내에서 염증의 발생과정에서 과량의 PGE2는 COX-2(cycloxygenase-2) 등의 작용에 의해 발현되게 되며, PGE2는 잘 알려진 염증 유발 인자로서 면역세포를 염증 부위로의 이동에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서 PGE2의 생성 저해 활성은 NO 생성 저해 활성 실험에서 가장 우수한 결과를 나타낸 LPE와 LPE 용매 분획 물에 대해서만 측정하였다. Raw 264.7 세포에서의 과량의 염증 유발 인자인 PGE2의 생성량 저해에 LPE와 그 용매 분획물들이 미치는 효과를 측정한 결과 LPE의 경우 25 μg/mL에서 70%의 저해 활성을 나타내었으며, LPE/E의 경우도 농도 의존적으로 높은 저해 활성을 나타내었다. 특히 12.5, 25 μg/mL의 농도에서 각각 40%, 73%의 높은 저해 효과를 나타내었다(도 3). 따라서 백산차 에탄올 추출물과 백산차 에틸아세테이트 분획물이 PGE2의 생성을 강하게 저해함으로써 유의성 있는 항염증 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7. 염증성 사이토카인 생성 저해 활성
염증반응에는 다양한 염증조절인자인 TNF-α, IL-1β, IL-6등과 같은 pro-inflammatory cytokines, prostagrandin, free radicals 등 다양한 매개물질이 관여한다. 특히, IL-6 와 IL-1β는 발열작용을 일으키며, 면역계를 자극하는 pro-inflammatory cytokine으로서 TNF-α와 더불어 종양형성에 관여한다고 알려져 있는 염증 매개물질이다. 이러한 염증성 사이토카인들의 과량 발현을 억제하는 소재는 염증반응으로 유도되는 여러 염증 질환을 예방 혹은 조절할 수 있는 가능성이 있음을 나타낸다. 본 실험에서는 Raw 264.7 세포에서의 LPS 자극에 의한 염증 조절 인자인 TNF-α, IL-1β, IL-6 과발현에 LPE와 그 용매 분획물이 미치는 영향을 측정하였다. 측정 결과, LPE과 LPE/E는 TNF-α, IL-1β, IL-6 사이토카인을 농도 의존적으로 저해하였다. LPE의 경우 25 μg/mL의 농도에서 TNF-α, IL-1β, IL-6를 각각 24%, 47%, 40%로 저해하여 TNF-α, IL-6보다 IL-1β에 서 우수한 저해 활성을 보였다. 특히 LPE/E는 25 μg/mL의 농도에서 TNF-α와 IL-1β 생성량을 각각 51%, 57% 저해시켰으며, IL-6의 경우 같은 농도에서 62%의 저해 활성을 나타내었다(도 4).

Claims (5)

  1. NO(nitric oxide), PGE2(prostaglandin E2), TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 백산차(Ledum palustre L.)에 70% 에탄올을 20배(v/w) 첨가한 후 24시간씩 2회 추출한 백산차 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증용 건강기능식품.
  2. 삭제
  3. NO(nitric oxide), PGE2(prostaglandin E2), TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 백산차(Ledum palustre L.)에 70% 에탄올을 20배(v/w) 첨가한 후 24시간씩 2회 추출한 백산차 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증용 화장료 조성물.
  4. NO(nitric oxide), PGE2(prostaglandin E2), TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 백산차(Ledum palustre L.)에 70% 에탄올을 20배(v/w) 첨가한 후 24시간씩 2회 추출한 백산차 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물.
  5. 삭제
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