KR101758228B1

KR101758228B1 - 항염증 활성을 나타내는 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물

Info

Publication number: KR101758228B1
Application number: KR1020160032994A
Authority: KR
Inventors: 조정희; 조현우; 안병관; 장지훈; 김민석; 이기호; 우경완
Original assignee: 한약진흥재단
Priority date: 2016-03-18
Filing date: 2016-03-18
Publication date: 2017-07-14

Abstract

본 발명은 신규 화합물 및 상기 신규 화합물 또는 이의 염, 또는 이들을 함유하는 금붓꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다. 상기 신규 화합물 또는 이의 염, 또는 이들을 함유하는 금붓꽃 추출물은 우수한 항염증 효과를 나타내고, 세포독성을 나타내지 않으므로 염증을 예방 또는 치료하기 위한 약학적, 화장료, 또는 식품 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

항염증 활성을 나타내는 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물{Novel compound having anti-inflammatory activity and composition comprising the same for anti-inflammatory}

본 발명은 항염증 활성을 나타내는 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항염증 활성을 나타내는 신규 화합물, 및 상기 신규 화합물 또는 이의 염, 또는 이들을 함유하는 금붓꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 치료용 약학적, 화장료, 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 보건복지부 한의약정책관 한의약정책과의 지원하에 수행된 한의약산업육성 기반구축사업으로, 한약진흥재단의 주관으로 수행된 한국 토종자원의 한약재 기반구축사업의 결과물이다.

최근 경제 발전에 따른 의료기술의 발달 및 평균수명의 연장으로 고령자 비율이 계속하여 증가하고 있으며, 환경오염 및 스트레스 증가에 따른 면역계 이상으로 염증반응의 만성화가 진행되어 아토피, 천식 등의 만성 염증성 질환이 증가하고 있는 추세이다(Chang et al., 1994, Korean J. Gastroentrol., 26:907-918.; Heinzemann and Daser, 2002, Int. Arch. Allergy Immunol. 127:170-180.; Song et al., 1998, Korean J. Intern. Med., 55:158-168.; Sung et al., 2012, J. Ethnopharmacol. 144:94-100.).

일반적으로 염증반응은 세균감염과 같은 외부자극이나 생체 내 대사산물과 같은 내부자극에 대한 생체조직의 방어기전으로 세포 내 다양한 염증조절인자들인 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-6(IL-6) 등과 같은 여러 사이토카인(cytokine) 및 산화질소(nitric oxide, NO)가 생성된다. 또한, 내독소로 알려진 지질다당체(LPS, lipopolysaccharide)는 그람 음성균의 세포 외막에 존재하여, 대식세포 또는 단핵세포에서 세포내 전사요소인 핵 인자-κB(NF-κB, nuclear facter-κB)의 활성화를 유도하여 염증성 사이토카인, 유동성 산화질소 신타아제(iNOS, inducible nitric oxide synthase), 사이클로옥시게나아제-2(COX-2, cyclooxygenase-2)의 유전자 발현을 유도하며, 염증 매개물질을 생성한다. 따라서, 염증반응의 조절을 위하여 iNOS, COX-2, 또는 NF-κB의 발현, 및 사이토카인과 산화질소의 분비 조절은 염증반응의 핵심요소로 인식되고 있으며, 이와 같은 인자들의 활성을 조절하는 물질이 염증질환의 예방 및 치료제로서 주목받고 있다(Kim et al., 2013b, J. Korean Med. Ophthalmol. Otolaryngol. Dermatol., 26:54-64.)

현재 항염의 목적으로 이용되고 있는 물질로는 비스테로이드 계통인 플루페나믹산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin) 등; 스테로이드 계통으로 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손(dexamethasone), 하이드로코티손(hydrocortisone), 베타메타손(betamethasone) 등이 있으나, 이들 물질은 독성이 강하며, 간 손상, 암, 뇌졸중과 같은 여러 심각한 부작용을 초래하여 사용 시 제한되고 있다. 또한, 염증 원인에 대하여 선택적으로 작용하기 못하여 심한 면역억제를 유발하는 문제가 생기는 경우도 있다.

이에 생체에 안전하고, 유효성분이 안정하며, 종래 의약품에 비해 장기간 섭취가 용이한 장점을 가지고 있는 천연물을 이용한 염증 치료제의 개발이 활발히 이루어지고 있다.

한편, 금붓꽃(Iris minutiaurea Makino, Iris savatieri)은 붓꽃과 여러해살이풀로, 한국의 남쪽 중앙 지방에서만 자생하는 한국 특산종이다. 이러한 금붓꽃의 씨앗(마린자라고도 불림)은 예로부터 인후염, 폐렴, 및 백일해를 치료하기 위해 사용되어져 왔으며, 붓꽃속(Iris genus) 식물로부터 분리된 Iridal type의 트리터페노이드(triterpenoids), 플라보노이드(flavonoids), 및 퀴논(quinone)은 세포독성 및 신경보호 활성을 나타낸다고 알려져 있다(Eom TH et al., 2013, Korea Journal of Herbology, 28:85-93.; Zhang CL et al., 2015, Tetrahedron, 71:5579-5583.; Zhang CL et al., 2014, Journal of Natural Products, 77:411-415.; Cui YM et al., 2011, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 21:4400-4403.; Lin B et al., Fitoterapia, 82:1137-1139.). 그러나, 금붓꽃에 함유되어 있는 화합물(phytochemical)의 성분 및 생리활성에 관한 연구가 거의 전무한 실정이다.

이에 본 발명자들은 천연물 유래 화합물(phytochemical)로서 인체에 안전하면서도 항염증 효과가 우수한 물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행하던 중, 금붓꽃으로부터 신규 화합물을 발견하였고, 상기 신규 화합물은 세포독성을 나타내지 않으며 우수한 항염증 활성을 나타내므로, 상기 신규 화합물 또는 이의 염, 또는 이들을 함유하는 금붓꽃 추출물을 염증 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 세포독성을 나타내지 않으며, 우수한 항염증 활성을 가지는 신규 화합물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 신규 화합물 또는 이의 염, 또는 이들을 함유하는 금붓꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 염증 예방 또는 치료용 약학적, 화장료, 또는 식품 조성물을 제공하는데 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 세포독성을 나타내지 않으며, 우수한 항염증 활성을 가지는 신규 화합물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "항염증"은 염증을 예방 또는 치료하는 것을 의미한다. 여기서, 상기 염증은 외부 감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발 물질 등)의 침입에 의하여 유발되는 질환을 말하며, 상기 질환으로는 아토피성 피부염, 알러지성 피부염, 염증성 장질환, 위궤양, 또는 천식 등이 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 개체에서 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제 (b) 질환 또는 질병의 경감 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 상기 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫드, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 신규 화합물은 IUPAC명이 1-히드록시-3,5-디메톡시-크산톤-6-Ο-β-D-글루코시드(1-hydroxy-3,5-dimethoxy-xanthone-6-Ο-β-D-glucoside)인 화합물로, 하기 화학식 1의 구조를 가진다.

[화학식 1]

본 발명에서는 상기 화학식 1의 화합물을 이하, 아이리스미누사이드(irisminuside)라고 칭한다.

본 발명에 있어서, 상기 아이리스미누사이드(irisminuside)은 금붓꽃(Iris minutiaurea Makino, Iris savatieri)으로부터 분리되거나 화학적으로 합성된 것일 수 있으며, 바람직하게는 금붓꽃으로부터 분리된 것이다.

상기 아이리스미누사이드(irisminuside)를 금붓꽃으로부터 분리하는 경우, 당업계에 공지된 통상의 방법을 이용하여 금붓꽃의 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 지상부(잎, 줄기, 및 꽃), 및 전초로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부위, 바람직하게는 금붓꽃의 지상부로부터 아이리스미누사이드(irisminuside)를 추출 및 분리할 수 있다.

구체적으로, 상기 아이리스미누사이드(irisminuside)는 당업계에서 통상적으로 사용되는 추출용매를 사용하여 추출 및 분리할 수 있는데, 추출용매는 예를 들어, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 사용할 수 있다. 한편, 본 발명의 아이리스미누사이드(irisminuside)는 상기한 추출용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

또한, 상기 아이리스미누사이드(irisminuside)는 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 이외에 통상적인 분리 및 정제과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 아이리스미누사이드(irisminuside)를 수득할 수 있다.

하나의 구체적 예로, 본 발명의 아이리스미누사이드(irisminuside)는 당업계에 통상적으로 사용되는 추출용매를 이용하여 금붓꽃 추출물을 제조한 다음, 상기 금붓꽃 추출물을 물에 현탁하고 염화메틸렌, 에틸 아세테이트, 및 부틸렌은 차례로 분배하여 염화메틸렌 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, 및 부틸렌 분획물을 용출한 다음, 상기 에틸 아세테이트 분획물을 크로마토그래피에 흡착시키고 이동상으로 염화메틸렌 : 에틸 아세테이트 : 메탄올의 농도구배(5 : 1: 0.25 → 5: 1: 1.5)를 적용하여 염화메틸렌 : 에틸 아세테이트 : 메탄올의 농도(5 : 1 : 1.0)에서 얻어지는 분획물(E3)을 1차 분리 및 정제한 후, 물 : 아세토니트릴(75 : 25 → 60 : 40) 혼합용매를 사용하여 크로마토그래피에 2차 분리 및 정제하여 용출속도 42ml/분을 기준으로 머무름 시간(t _R) 24.4분에서 얻을 수 있다.

본 발명의 아이리스미누사이드(irisminuside)는 세포독성을 나타내지 않으며, 외부 감염원이 침입된 세포 내 일산화질소(NO) 및 염증조절인자들인 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β), 및 인터루킨-6(IL-6)의 생성을 저해하는 효과를 나타낸다.

특히, 본 발명의 아이리스미누사이드(irisminuside)는 금붓꽃으로부터 함께 분리되며, 종래 항염증 활성을 나타낸다고 알려진 틸리아닌(tilianin)과 달리 고농도에서도 세포독성을 나타내지 않으며, 외부 감염원이 침입된 세포 내 인터루킨-1β(IL-1β) 및 인터루킨-6(IL-6)의 생성을 저해하는 효과가 틸리아닌(tilianin)에 비해 각각 24 내지 38%, 7 내지 28% 더 우수하다.

따라서, 본 발명의 아이리스미누사이드(irisminuside), 아이리스미누사이드(irisminuside)의 염, 또는 상기 아이리스미누사이드(irisminuside) 또는 아이리스미누사이드(irisminuside)의 염을 함유하는 금붓꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 염증을 예방 또는 치료하기 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 아이리스미누사이드(irisminuside), 아이리스미누사이드(irisminuside)의 염, 또는 상기 아이리스미누사이드(irisminuside) 또는 이의 염을 함유하는 금붓꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 유효성분으로 포함하는 아이리스미누사이드(irisminuside), 아이리스미누사이드(irisminuside)의 염, 또는 상기 아이리스미누사이드(irisminuside) 또는 이의 염을 함유하는 금붓꽃 추출물은 전체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 30 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 아이리스미누사이드(irisminuside), 아이리스미누사이드(irisminuside)의 염, 또는 아이리스미누사이드(irisminuside) 또는 이의 염을 함유하는 금붓꽃 추출물의 함량이 0.001 중량% 미만일 경우 항염증 효과가 미약하고, 50 중량%를 초과하는 경우 함량 증가에 따른 효과 증가가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며, 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 아이리스미누사이드(irisminuside)의 염은 약학적, 화장학적, 또는 식품학적으로 허용되는 염의 형태일 수 있다. 그와 같은 염으로는 약학적, 화장학적, 또는 식품학적으로 허용되는 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염 또는 염기에 의해 형성되는 금속염이 유용하다. 예를 들어, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산으로는 염산, 황산, 브롬산, 아황산 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레인산, 후마산, 글루콘산, 메탄술폰 산 등을 사용할 수 있다. 또한, 금속염으로는 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 사용할 수 있다. 그러나 특별히 이로 제한되지는 않는다.

본 발명의 하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 조성물은 염증을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 사용되는 경우, 유효성분으로서 아이리스미누사이드(irisminuside), 아이리스미누사이드(irisminuside)의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 아이리스미누사이드(irisminuside) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 금붓꽃 추출물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 염증을 예방 또는 치료할 수 있는데, 치료방법은 상기 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물 내에 다양한 경로로 투여하는 것을 포함한다. 상기 투여방법은 모든 방식으로 이루어질 수 있는데, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥 내 주입, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 도포에 의한 국부 투여 등으로 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태 등의 요인에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 다만, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 다른 하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 조성물은 염증을 예방 또는 개선하기 위한 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용되는 경우, 유효성분으로서 아이리스미누사이드(irisminuside), 아이리스미누사이드(irisminuside)의 화장학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 아이리스미누사이드(irisminuside) 또는 이의 화장학적으로 허용가능한 염을 함유하는 금붓꽃 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림 등의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 조성물은 염증을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 사용되는 경우, 유효성분으로서 아이리스미누사이드(irisminuside), 아이리스미누사이드(irisminuside)의 식품학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 아이리스미누사이드(irisminuside) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 함유하는 금붓꽃 추출물 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 아이리스미누사이드(irisminuside), 아이리스미누사이드(irisminuside)의 식품학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 아이리스미누사이드(irisminuside) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 함유하는 금붓꽃 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 아이리스미누사이드(irisminuside), 아이리스미누사이드(irisminuside)의 식품학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 아이리스미누사이드(irisminuside) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 함유하는 금붓꽃 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 구체적 실시예에서 아이리스미누사이드(irisminuside)에 대한 세포독성 실험을 실시한 결과, 세포독성이 없는 무해한 물질임이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 유효성분인 아이리스미누사이드(irisminuside), 아이리스미누사이드(irisminuside)의 염, 또는 상기 아이리스미누사이드(irisminuside) 또는 이의 염을 함유하는 금붓꽃 추출물은 독성이 거의 없어 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 약학적, 화장료, 또는 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

본 발명의 아이리스미누사이드(irisminuside), 아이리스미누사이드(irisminuside)의 염, 또는 상기 아이리스미누사이드(irisminuside) 또는 이의 염을 함유하는 금붓꽃 추출물은 외부 감염원이 침입된 세포 내 일산화질소(NO), 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β), 및 인터루킨-6(IL-6)의 생성을 저해하는 항염증 효과를 나타내며, 종래 항염증 활성을 가지는 틸리아닌(tilianin) 보다 월등히 뛰어난 항염증 효과를 나타내므로 염증을 예방 또는 치료하기 위한 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 아이리스미누사이드(irisminuside), 아이리스미누사이드(irisminuside)의 염, 또는 상기 아이리스미누사이드(irisminuside) 또는 이의 염을 함유하는 금붓꽃 추출물은 세포독성이 없는 무해한 물질이므로 염증을 예방 또는 치료하기 위한 약학적, 화장료, 또는 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

도 1은 금붓꽃으로부터 분리된 화합물 1의 구조를 HMBC로 확정한 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 금붓꽃으로부터 분리한 화합물 1 또는 화합물 2의 지질 다당류(LPS)로 자극된 대식세포(RAW 264.7)에 대한 세포독성을 측정한 그래프이다.
도 3은 지질 다당류(LPS)로 자극된 대식세포(RAW 264.7)에서 금붓꽃으로부터 분리한 화합물 1 또는 화합물 2에 의한 일산화질소(NO)의 생성량을 측정한 그래프이다.
도 4는 지질 다당류(LPS)로 자극된 대식세포(RAW 264.7)에서 금붓꽃으로부터 분리한 화합물 1 또는 화합물 2에 의한 종양괴사인자-α(TNF-α)의 생성량을 측정한 그래프이다.
도 5는 지질 다당류(LPS)로 자극된 대식세포(RAW 264.7)에서 금붓꽃으로부터 분리한 화합물 1 또는 화합물 2에 의한 인터루킨-1β(IL-1β)의 생성량을 측정한 그래프이다.
도 6은 지질 다당류(LPS)로 자극된 대식세포(RAW 264.7)에서 금붓꽃으로부터 분리한 화합물 1 또는 화합물 2에 의한 인터루킨-6(IL-6) 생성량을 측정한 그래프이다.

이하, 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 등은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예 등에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 금붓꽃 유래 단일 화합물 분리

1-1. 금붓꽃 추출물 제조

2013년 1월에 전라남도 구례에서 채취하여 표본으로 재작된 금붓꽃의 지상부를 2kg을 분쇄한 후, 100% 메탄올을 가하여 환류 추출하였다. 그 다음, 상기 추출물을 여과지로 여과한 후, 이를 감압농축하여 200g의 금붓꽃 추출물을 제조하였다.

1-2. 금붓꽃 추출물로부터 유기용매 분획물 제조

상기 1-1에서 제조한 금붓꽃 추출물 200g을 증류수 800mL에 현탁하고, 염화메틸렌(CH₂Cl₂), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate, EtOAc), 및 부틸렌(butylene, BuOH)을 차례로 분배하여 각각 염화메틸렌 분획물 46g, 에틸 아세테이트 분획물 9.6g, 부틸렌 분획물 20 g을 제조하였다.

1-3. 유기용매 분획물로부터 활성 분획물 분리

상기 1-2에서 제조한 에틸 아세테이트 분획물 9g을 실리카 겔(230~400 mesh) 500g을 녹인 컬럼(Phenomenes Luna C18-100A column; 25 cm×3 mm, 6μm particle size)에 넣은 다음 염화메틸렌(CH₂Cl₂)-에틸 아세테이트(EtOAc)-메탄올(MeOH) 혼합용매를 이용하여 총 4개의 분획물을 얻었다(① CH₂Cl₂:EtOAc:MeOH = 5:1:0.25(E1), ② CH₂Cl₂:EtOAc:MeOH = 5:1:0.5(E2), ③ CH₂Cl₂:EtOAc:MeOH = 5:1:1.0(E3), ④ CH₂Cl₂:EtOAc:MeOH = 5:1:1.5(E4)).

1-4. 활성 분획물로부터 단일 화합물 분리

상기 1-3에서 분리한 E3 분획물 800mg을 메탄올로 녹인 후 HPLC (Phenomenex, Luna C₁₈-100A, 250 × 30 mm, 5 μm)에 흡착시켰다. 그 후 상기 E3 분획물이 흡착된 컬럼에 25%~40% 아세토니트릴(+0.1% formic acid)을 농도구배 용매로 사용하여 30분 동안 용출시킨 다음, 용출속도 42ml/분을 기준으로 머무름 시간 24.4분 및 25.5분에서 각각 20mg의 화합물 1 및 2를 분리하였다.

시험예 1: 화합물 1 및 2의 구조분석

상기 실시예 1-4에서 분리한 화합물 1 및 2의 분자량 및 분자식을 LC/MC (Shimadzu, Japan)를 사용하여 결정하고, 1D 및 2D NMR 스펙트로미터(Varian 600 spectrometer,¹H: 600MHz, ¹³C: 150 MHz)를 통하여 얻은 스펙트럼을 이용하여 분자구조를 결정하였다. 상기 스펙트럼을 통해 얻어진 화합물 1에 대한 자료를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었으며, 화합물 1 및 2의 화학구조를 하기와 같이 결정하였다.

No.	화합물 1
No.	δ_H	δ_C
1	-	162.5
2	6.69 (1H, d, J = 2.0 Hz)	97.3
3	-	166.4
4	6.39 (1H, d, J = 2.0 Hz)	92.9
4a	-	157.3
5	-	136.4
5a	-	149.8
6	-	155.7
7	7.32 (1H, d, J = 9.0 Hz)	112.6
8	7.84 (1H, d, J = 9.0 Hz)	120.3
8a	-	115.2
9	-	179.6
9a	-	102.7
Glc-1	5.14 (1H, d, J = 7.5 Hz)	100.2
2	3.33 m	73.2
3	3.31 m	76.7
4	3.20 m	69.5
5	3.42 m	77.3
6a	3.70 m	61.2
6b	3.47 m	61.2
3-OCH₃	3.89 (3H, s)	56.2
5-OCH₃	3.95 (3H, s)	60.5

실험결과, 화합물 1은 노르스름한(yellowish) 검으로 분리되었으며, ¹H NMR spectrum으로부터 4개의 aromatic ring proton [δ 7.84 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-8), 7.32 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-7), 6.69 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 및 6.39 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-4)], 한 개의 anomeric proton [δ 5.14 (1H, d, J = 7.5 Hz, Glc-1), 2개의 methoxy signal [δ 3.95 (3H, s, 5-OCH₃) 및 3.89 (3H, s, 3-OCH₃)]이 관찰되었다.

¹³C NMR spectrum을 통하여 21개의 탄소 신호를 발견하였으며, 1개의 carbonyl carbon (δ 179.6), 2개의 methoxy carbon (δ 60.5 and 56.2), 6개의 glucose carbons (δ 100.2, 77.3, 76.7, 73.2, 69.5, 및 61.2), 및 12개의 aromatic signals이 관찰되었다.

이러한 NMR 결과를 통해, 화합물 1은 당 부분의 부착위치를 제외하고 6-히드록시-3,5-디메톡시-크산톤-1-Ο-β-D-글루코시드(6-hydroxy-3,5-dimethoxy-xanthone-1-O-β-D-glucoside)와 유사한 구조를 나타냄을 알 수 있었다.

상기 화합물 1의 구조 결정은 HMBC로서 확정하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보듯이 화합물 1의 Glc-1(δ 5.14)은 C-6(δ 155.7)와 연결되어 있음을 확인하였다.

상기 결과를 종합하면, 상기 실시예 1-4에서 분리한 화합물 1의 구조는 하기 화학식 1(1-hydroxy-3,5-dimethoxy-xanthone-6-O-β-D-glucoside)과 같이 결정하였으며, 분자식은 C₂₁H₂₂O₁₁이었다.

이상의 결과를 바탕으로 기존의 문헌과 비교한 결과, 상기 화합물 1은 신규한 화합물임을 알 수 있었다. 본 발명자들은 화합물 1을 "아이리스미누사이드(irisminuside)"로 명명하였다.

[화학식 1]

한편, 상기 표 1에는 나타내지 않았으나 MNR 스펙트럼 분석을 통해 화합물 2의 구조는 하기 화학식 2와 같으며, 분자식(molecular formula)은 C₂₂H₂₂O₁₀임을 확인하였다. 이상의 결과를 바탕으로 기존의 문헌과 비교한 결과, 화합물 2는 틸리아닌(tilianin)이며, 상기 틸리아닌(tilianin)은 항염증 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다(대한민국 등록특허 제10-0454087호).

[화학식 2]

준비예 1: 세포준비

한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받은 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 10 % FBS(fetal bovine serum; Gibco, USA)와 100 unit/mL의 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/streptomycin; Gibco, USA)이 함유된 DMEM 배지(Dulbecco's modified eagle;s medium; Gibco, USA)를 사용하여 37℃, 5% 농도의 CO₂배양기에서 2일 동안 배양하여 준비하였다.

시험예 2: 금붓꽃으로부터 분리한 화합물 1 또는 2의 세포독성 시험

상기 준비예 1에서 준비한 대식세포(RAW 264.7)를 96 웰-플레이트에 2 × 10⁵cells/mL이 되도록 접종시키고 37℃, 5% 농도의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양한 후 상기 각 웰에 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 상기 실시예 1-4에서 분리한 화합물 1 또는 화합물 2를 6.25, 12.5, 25, 50, 또는 100 μM로 희석하여 전처리하였다. 그 다음, 각 웰에 LPS(Lipopolysaccaride; Sigma Chemical Co., St. Lousi, Mo, USA)를 각각 500 ng/mL씩 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 후의 각각 세포 배양액에 MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl_2H-tetrazolium; CellTiter 96 AQueous One Solution Cell proliferation Assay] 20μl을 첨가한 다음, 37℃에서 4시간 반응시켰다. 그 후 ELISA 마이크로플레이트 리더(microplate reader; Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(-)으로는 화합물 1 또는 화합물 2를 처리하지 않은 대식세포(RAW 264.7)를 사용하였다. 상기 실험에서 얻은 결과는 평균치±표준오차(mean±S.E.)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균차이는 Student's t-test로 분석하여 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실험결과, 모든 농도의 화합물 1은 대식세포에서 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

한편, 화합물 2는 6.25, 12.5, 25, 및 50μM의 농도에서 세포독성을 나타내지 않았으나, 100μM의 농도에서는 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다.

시험예 3: 금붓꽃으로부터 분리한 화합물 1 또는 2의 항염증 효과 확인

3-1. 금붓꽃으로부터 분리한 화합물 1 또는 2의 일산화질소(nitrogen monoxid, NO) 생성 억제 효과

상기 준비예 1에서 준비한 대식세포(RAW 264.7)를 96 웰-플레이트에 2 × 10⁵cells/mL이 되도록 접종시킨 다음, 상기 실시예 1-4에서 분리한 화합물 1 또는 2를 6.25, 12.5, 25, 50, 또는 100 μM 농도로 처리하여 37℃, 5% 농도의 CO₂배양기에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, 각 웰에 일산화질소 생성을 담당하는 효소인 iNOS(nitric oxide synthase)를 유도하는 것으로 알려진 LPS(Lipopolysaccaride; Sigma Chemical Co., St. Lousi, Mo, USA)를 각각 500 ng/mL씩 처리하여 대식세포를 자극하였다. 그 다음, 상기 세포 배양물로부터 상등액 100 μl를 수집하고, 상기 수집한 상등액과 그리스 시약(gress reagent system; G2930, Promega, USA)를 1:1로 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA 마이크로플레이트 리더(microplate reader; Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(-,-)으로는 화합물 1 또는 화합물 2과 LPS를 처리하지 않은 대식세포(RAW 264.7)를 사용하였으며, 양성 대조군(-,+)으로는 LPS만을 처리한 대식세포(RAW 264.7)를 사용하였다. 상기 실험에서 얻은 결과는 평균치±표준오차(mean±S.E.)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균차이는 Student's t-test로 분석하여 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

실험결과, 화합물 1과 화합물 2는 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 농도 의존적으로 일산화질소의 생성을 억제하는 것을 확인하였다.

3-2. 금붓꽃으로부터 분리한 화합물 1 또는 2의 염증성 사이토카인 생성 억제 효과

상기 준비예 1에서 준비한 대식세포(RAW 264.7)를 96 웰-플레이트에 2 × 10⁵cells/mL이 되도록 접종시킨 다음, 상기 실시예 1-4에서 분리한 화합물 1 또는 2를 6.25, 12.5, 25, 50, 또는 100 μM 농도로 처리하여 37℃, 5% 농도의 CO₂배양기에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, 각 웰에 LPS(Lipopolysaccaride; Sigma Chemical Co., St. Lousi, Mo, USA)를 각각 500 ng/mL씩 처리하여 대식세포를 자극하였다. 24시간 후, 세포 배양액을 수집하여 ELISA kit(R&D systems; DuoSet ELLISA Development Systems, MN, USA)를 이용하여 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 분비정도를 측정하였다. 대조군(-,-)으로는 화합물 1 또는 화합물 2과 LPS를 처리하지 않은 대식세포(RAW 264.7)를 사용하였으며, 양성 대조군(-,+)으로는 LPS만을 처리한 대식세포(RAW 264.7)를 사용하였다. 상기 실험에서 얻은 결과는 평균치±표준오차(mean±S.E.)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균차이는 Student's t-test로 분석하여 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다. 그 결과를 도 4 내지 6에 나타내었다.

실험결과, 화합물 1과 화합물 2는 농도 유의적으로 LPS로 자극된 대식세포 내 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 생성을 저해하는 것으로 확인되었다.

특히, 화합물 1은 화합물 2과 달리 저농도에서도 IL-1β와 IL-6의 생성을 억제하며, LPS로 자극된 대식세포 내 IL-1β 및 IL-6의 생성을 저해하는 효과가 화합물 2에 비해 각각 24 내지 38%, 7 내지 28% 더 우수한 것으로 확인되었다.

Claims

하기 화학식 1의 구조를 가지는 1-히드록시-3,5-디메톡시-크산톤-6-Ο-β-D-글루코시드(1-hydroxy-3,5-dimethoxy-xanthone-6-Ο-β-D-glucoside) 화합물.

[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 화합물은 금붓꽃 유래 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항의 화합물, 제1항의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 금붓꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항의 화합물, 제1항의 화장학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 제1항의 화합물 또는 이의 화장학적으로 허용가능한 염을 함유하는 금붓꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항의 화합물, 제1항의 식품학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 제1항의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 함유하는 금붓꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 개선용 식품 조성물.