CN114729378B - 新的启动子和使用所述启动子生产所需物质的方法 - Google Patents

新的启动子和使用所述启动子生产所需物质的方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及新的启动子和使用所述启动子生产所需物质的方法。

Description

新的启动子和使用所述启动子生产所需物质的方法
技术领域
本申请涉及新的启动子和使用所述启动子生产目标物质的方法。
背景技术
棒杆菌是工业微生物，其已经被最广泛和常规地用于生产氨基酸和核酸相关物质。棒杆菌是***，其主要用于生产在动物饲料、药物、药剂，食品等领域具有各种应用的化学物质，包括氨基酸和各种核酸，并且棒杆菌的生长需要生物素。该细菌的特征在于在细胞***期间以直角弯曲，并且其优点之一是它们对所产生的代谢物具有低降解活性。
在棒杆菌产生的产物中，L-氨基酸是蛋白质的基本结构单元，被用作医药原料、食品添加剂、动物饲料、营养补充剂、农药、消毒剂等的重要原料。因此，氨基酸的工业生产已经成为经济上重要的工业方法。
已经进行了各种用于有效生产氨基酸的研究。例如，已经努力开发用于高效生产氨基酸的微生物或发酵工艺技术。特别是，已经开发了对目标物质具有特异性的方法，例如，在棒杆菌属菌株中，增加编码参与氨基酸生物合成的酶的基因的表达或删除氨基酸生物合成所不必要的基因(US 8030036B2等)。除了这些方法之外，还利用了移除不参与氨基酸产生的基因的方法和移除在产生氨基酸中功能不明确的基因的方法。然而，仍然需要研究以高产率有效生产氨基酸的方法。
为了通过基因工程或代谢工程从棒杆菌中开发高滴度菌株，应当选择性地调控微生物中参与多种代谢途径的基因的表达。对于这种调控，重要的是调控启动子的活性，启动子是一种调控基因，在启动子区域，转录通过RNA聚合酶与DNA分子的结合而启动。
发明内容
技术问题
本申请的发明人通过努力开发了表现出强表达诱导活性的启动子，结果，本申请的发明人通过核苷酸取代修饰棒杆菌染色体上的ilvC基因启动子，并鉴定了所修饰的启动子可以增加与其可操作地连接的基因的表达，从而完成了本申请。
技术方案
本申请提供了具有启动子活性的多核苷酸，其中SEQ ID NO:1的核苷酸序列中至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代。
本申请提供了包含所述多核苷酸的启动子。
本申请提供了包含所述启动子和编码目标蛋白的基因的载体。
本申请提供包含所述多核苷酸的棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物。
本申请提供了用于产生目标物质的方法，所述方法包括在培养基中培养棒杆菌属微生物。
本发明提供了增强目标基因表达的方法，所述方法包括将所述启动子可操作地连接到所述目标基因。
本申请提供了多核苷酸作为启动子的用途，其中SEQ ID NO:1的核苷酸序列中至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代。
有益效果
具有本申请的新启动子活性的多核苷酸可用于增加与其连接的目标基因的表达，并因此可用于产生目标物质。
附图简要说明
图1-4显示缬氨酸生产菌株的ilvC启动子区。
图5和图6显示产生异亮氨酸菌株的ilvC启动子区域。
图7和图8显示产生亮氨酸菌株的ilvC启动子区域。
发明详述
下文详细描述本申请。本文公开的一个方面的每个描述和实例可应用于另一方面中关于重叠内容的的描述和实例。此外，在本申请的详细描述中公开的各种元素的所有组合都属于本申请的范围。此外，本申请的范围不受以下提供的具体描述的限制。
此外，本领域技术人员能认识到或能够通过使用常规实验来确定本文所述的公开内容的具体实施方案的多种等同方案。这种等同方案旨在被本申请所涵盖。
根据本申请的一个方面，提供了多核苷酸，其中SEQ ID NO:1的核苷酸序列中至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代并且具有启动子活性。
本文所用术语“多核苷酸”是指由以共价连接为长链的核苷酸单体组成的核苷酸聚合物，例如具有预定长度或更长长度的DNA链。
本文所用术语“具有启动子活性的多核苷酸”是指存在于涉及目标基因转录的位点附近的DNA区域，包括RNA聚合酶、增强子等结合的位点，用于其下游连接的目标基因的表达。为了本申请的目的，多核苷酸可用作一般用途的增强启动子。多核苷酸可以是配置为调控与其可操作地连接的目标基因的表达和由所述目标基因编码的蛋白质的产生和/或活性的多核苷酸，并且可以是与常规启动子或细胞内源启动子相比，配置为增加目标产物(生物活性物质，例如选自氨基酸、核酸、维生素、蛋白质、脂肪酸和有机酸中的至少一种)的产生和/或活性的多核苷酸，其中涉及在细胞中产生蛋白质，但不限于此。
在一个实施方案中，本申请的具有启动子活性的多核苷酸可以用作能够增强乙酰羟酸异构还原酶的表达的启动子。所述多核苷酸可以是参与增加氨基酸(包括氨基酸，特别是支链氨基酸，更特别是亮氨酸，缬氨酸和异亮氨酸，但不限于此)的产生或产量的多核苷酸，并且包括但不限于具有启动子活性的多核苷酸序列。
在本申请中，SEQ ID NO:1是具有启动子活性的序列，并且SEQ ID NO:1的核苷酸序列可以从已知数据库NCBI Genbank中鉴定，并且可以源自棒杆菌(Corynebacteriumsp.)，但不限于此。可以包括与该核苷酸序列具有相同活性的任何序列，而不受任何限制。同时，SEQ ID NO:1可以是乙酰羟酸异构还原酶的启动子。然而，该序列不限于此。
本文所用术语“乙酰羟酸异构还原酶”是指参与L-支链氨基酸的生物合成的酶。关于L-支链氨基酸的生物合成途径，首先，乙酰羟酸合酶催化丙酮酸的脱羧以及丙酮酸与另一个丙酮酸分子的缩合反应以产生乙酰乳酸(缬氨酸的前体)，或丙酮酸的脱羧以及丙酮酸与2-酮丁酸酯的缩合反应以产生乙酰羟基丁酸酯(异亮氨酸的前体)。乙酰羟酸异构还原酶通过利用由此产生的乙酰乳酸或乙酰羟基丁酸酯作为底物使反应进行到下一步骤，从而产生L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸。具体地，通过乙酰乳酸或乙酰羟基丁酸酯(由乙酰羟酸合酶的反应产生)与乙酰羟酸异构还原酶的反应，然后通过还原反应发生异构化，由每种底物产生(2R)-2,3-二羟基-3-异戊酸或(2R,3R)-2,3-二羟基-3-甲基戊酸。使(2R)-2,3-二羟基-3-异戊酸进行由二羟基酸脱水酶和转氨酶B催化的反应以产生L-缬氨酸，并依次进行由二羟基酸脱水酶、2-异丙基苹果酸合酶、异丙基苹果酸异构酶、3-异丙基苹果酸脱氢酶和转氨酶B催化的反应以产生L-亮氨酸。使(2R,3R)-2,3-二羟基-3-甲基戊酸酯进行由二羟基酸脱水酶和转氨酶B催化的反应以产生L-异亮氨酸。因此，乙酰羟酸异构还原酶是L-支链氨基酸生物合成途径中的重要酶。
本申请的具有启动子活性的多核苷酸是指SEQ ID NO:1的核苷酸序列中至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代的多核苷酸和/或与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或同一性的核苷酸序列。具有同源性或同一性的核苷酸序列可以是上述范围内的那些，不包括具有100％同一性的序列，或者可以是具有小于100％同一性的序列。
具体地，具有启动子活性的多核苷酸可以包含如下所述的具有启动子活性的多核苷酸，SEQ ID NO:1的核苷酸序列中至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代；或者可以由如下所述的具有启动子活性的多核苷酸组成，SEQ ID NO:1的核苷酸序列中至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代。
具有启动子活性的多核苷酸可以是由通式X-Y-Z表示的多核苷酸，其中i)X是CNGN；ii)Y是CTAATTN；iii)Z是CATGTGTGTGGTANAAN；iv)N选自腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T)，鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)。在通式的多核苷酸序列中，Z可以由SEQ ID NO:2组成，Y可以由SEQID NO:3组成，或者X可以由SEQ ID NO:4组成。
具体地，在通式中，X可以用CN1GN2表示，Y可以用CTAATTN3表示，Z可以用CATGTGTGTGGTATAAT表示，其中N1、N2和N3各自是选自腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T)，鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)中的任何一种。
更具体地，在通式中，i)N1可以是胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)、ii)N2可以是腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)、iii)N3可以是腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，或iv)可以存在i)到iii)的取代的组合，但不限于此。
在一个实施方案中，在通式的多核苷酸序列中，在Z中，第14位核苷酸N和第17位核苷酸可以是在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)，其中在X中，第2位核苷酸N可以是胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)，并且第4位核苷酸N可以是在SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列中的腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)，或者X可以是SEQ ID NO:8至11中的任一个；在Y中，第7位核苷酸N可以是SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)。具体而言，在Z中，第14位核苷酸N和第17位核苷酸可以是SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)；X可以是SEQ ID NOS:8至11中的任一个；Y可以是SEQ ID NO:6或7。
在另一个实施方案中，多核苷酸可以具有选自SEQ ID NOS:13至20的任何一个多核苷酸序列。
尽管在本申请中使用表述“具有特定序列号中所示的核苷酸序列的多核苷酸”或“包含特定序列号中所示的核苷酸序列的多核苷酸”进行了描述，但是在本申请中显然也可以使用具有在多核苷酸序列的一部分中具有缺失、修饰、取代或添加的多核苷酸，只要该多核苷酸具有与由相应序列号的核苷酸序列组成的多肽相同或相应的活性。例如，这样的表述显然不排除相应序列编号的核苷酸序列的上游或下游的无义序列的任何添加、其天然存在的突变或沉默突变，只要该多核苷酸具有与所述多核苷酸相同或等同的活性，并且具有这样的序列添加或突变的核苷酸序列也在本申请的范围内。
同源性或同一性是指两个给定核苷酸序列之间的相关性程度，并且可以表示为百分比。
术语同源性和同一性通常可以互换使用。
保守多核苷酸的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且可以一起使用由要使用的程序建立的默认缺口罚分。基本上，同源或相同的序列通常可以沿着整个序列或全长序列的至少约50％、60％、70％、80％或90％在中等或高度严格条件下彼此杂交。在待杂交的多核苷酸中，也考虑含有简并密码子而不是密码子的多核苷酸。
任何两个多核苷酸序列是否具有同源性、相似性或同一性可以使用已知的计算机算法，如“FASTA”程序，通过使用Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444的默认参数来确定。或者，这可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)，其在欧洲分子生物学开放软件套件(European MolecularBiology Open Software Suite(EMBOSS))包的Needleman程序中进行(Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276–277)(5.0.0版或其后的版本)(GCG程序包(包括GCG程序包)(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.,et al.,JMOLEC BIOL 215:403(1990)；Guide to Huge Computers,MartinJ.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,和CARILLO et al.(1988)SIAM JApplied Math48:1073)。例如，可以使用来自国家生物技术信息中心数据库(NationalCenter for Biotechnology Information database)的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性或同一性。
多核苷酸的同源性、相似性或同一性可以通过GAP计算机程序比较序列信息来确定，例如Needleman et al.,(1970),J Mol Biol.48:443，如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482所公开的。简言之，GAP程序将同源性、相似性或同一性定义为通过将相似比对的符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列中符号的总数而获得的值。用于GAP程序的默认参数可以包括：(1)二进制比较矩阵(包含相同的值1和不相同的值0)和Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，公开于Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,NationalBiomedical Research Foundation,pp.353–358(1979)(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵)；(2)每个缺口的罚分为3.0，并且每个缺口中的每个符号的额外的0.10罚分(或缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5)；(3)端部缺口无罚分。因此，本文所用的术语“同源性”或“同一性”是指序列之间的相关性。
另外，可以与能够从已知基因制备的探针杂交的任何多核苷酸序列，例如，在严格条件下与上述多核苷酸序列的一部分或全部互补并且具有相同活性的序列可以包括在内，但不限于此。术语“严格条件”是指能够在多核苷酸之间进行特异性杂交的条件。这样的条件具体公开于文献中(例如，J Sambrook et al.，同上)。例如，条件可以包括如下所述的条件，具有高同源性或同一性的基因(例如具有至少40％、特别是至少70％、至少80％、至少85％、或至少90％、更特别是至少95％、还更特别是至少97％、并且甚至还更特别是至少99％的同源性或同一性的基因)彼此杂交，但具有比上述范围更低的同源性或同一性的基因彼此不杂交的条件；或者用于Southern杂交的典型洗涤条件，即，洗涤在对应于60℃、1×SSC和0.1％SDS，特别是60℃、0.1×SSC和0.1％SDS，更特别是68℃、0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度和温度下进行一次，特别是两次或三次。
杂交需要两个核酸具有互补序列，尽管根据杂交严格性，碱基之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述可彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，在DNA中，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本申请不仅可以包括基本上相似的核酸序列，而且可以包括与整个序列互补的分离的核酸片段。
具体地，具有同源性或同一性的多核苷酸可以在55℃的Tm值下通过使用包括杂交步骤的杂交条件和使用上述条件来检测。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据目的适当地控制。
用于杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度及其互补程度，并且其变量在本领域中是熟知的(参见Sambrook et al.，同上，9.50-9.51，11.7-11.8)。
根据本申请的另一方面，提供了包含本申请的多核苷酸的启动子。
本文所用术语“启动子”是指非翻译的核苷酸序列，其位于编码区的上游，含有RNA聚合酶的结合位点，并具有启动目标基因转录成mRNA的活性，即，RNA聚合酶结合从而启动基因的转录的DNA区。启动子可以位于mRNA转录的起始位点的5'区。
本申请的启动子可以具有与常规启动子相比增强的启动子活性。也就是说，启动子可以增加目标基因的表达以及由目标基因编码的蛋白质的表达和活性。
为了本申请的目的，用于增强表达的目标基因可以根据要产生的产物(即“目标产物”)而适应性改变，并且启动子可以用作增强目标基因的通用启动子。
对于本申请的目的，术语“目标基因”是指表达由本申请的启动子序列调控的基因。由目标基因编码的蛋白可以表述为“目标蛋白”，编码“目标蛋白”的基因可以表述为“目标基因”。例如，启动子的目标基因可以是编码乙酰羟酸异构还原酶的基因，也就是说，可以是ilvC，但不限于此。
由于密码子简并性或考虑到多核苷酸在其中表达的生物体的偏好密码子，编码目标蛋白的多核苷酸可以在其编码区中具有各种修饰，在不改变多核苷酸序列的范围内。多核苷酸序列的描述如上所述。
根据本申请的又一方面，提供了包含本申请的启动子的载体。
根据本申请的另一方面，提供了包含本申请的启动子和编码目标蛋白的基因的载体。
具体地，载体可以是目标蛋白是乙酰羟酸异构还原酶的载体，但不限于此。
本文所用术语“载体”是指含有编码目标多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，所述目标多核苷酸与适当的表达控制区或表达控制序列可操作地连接，以在适当的宿主中表达目标多核苷酸。表达控制序列可以包括能够启动转录的启动子，用于控制这种转录的任何操纵子序列，用于编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列，和用于控制转录和翻译终止的序列，具体地，表达控制序列可以包括本申请的启动子。在转化入适当的宿主后，载体可以独立于宿主的基因组复制或起作用，或者可以整合到基因组本身中。
例如，可以通过用于细胞中染色体***的载体来实现染色体中目标多核苷酸的替换。将多核苷酸***染色体可以使用本领域已知的任何方法进行，例如同源重组，但不限于此。载体可以进一步包括用于鉴定染色体***的选择标记。选择标记用于选择用载体转化的细胞，即，确认目标核苷酸分子是否已经成功***，并且可以使用赋予选择性表型的标记，例如耐药性、营养缺陷型、对细胞毒性药物的抗性和表面蛋白的表达。在被选择性试剂处理的情况下，只有能够表达选择标记的细胞才能存活或表现出其它表型性状，从而可以选择被转化的细胞。
本申请中使用的载体没有特别限制，可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的实例可包括天然或重组质粒，粘粒，病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可以用作噬菌体载体或粘粒载体，并且基于pBR、基于pUC、基于pBluescriptII、基于pGEM、基于PTZ、基于pCL和基于pET的载体可以用作质粒载体。具体而言，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC等。
根据本申请的另一方面，提供了含有本申请的具有启动子活性的多核苷酸的棒杆菌(Corynebacterium sp.)微生物。
根据本申请的又一方面，提供了含有本申请的多核苷酸和编码目标蛋白的基因的棒杆菌(Corynebacterium sp.)微生物。
本文所用术语“微生物”包括所有野生型微生物，或具有天然或人工遗传修饰的微生物，并且是指其中由于***外源基因或增强或减弱内源基因的活性而减弱或增强特定机制的微生物。本申请的微生物可以包括这样的微生物，微生物中引入了本申请的具有启动子活性的多核苷酸，或者微生物包含多核苷酸，但不限于此。
具体地，微生物可以是通过用含有本申请的具有启动子活性的多核苷酸和编码目标蛋白的基因的载体转化而制备的微生物，或包含具有启动子活性的多核苷酸和编码目标蛋白的基因的微生物，或包含含有以上的载体的微生物。具体地，微生物可以是包含具有启动子活性的多核苷酸和编码目标蛋白的基因的微生物，因此具有产生目标蛋白或目标产物的能力，其中目标蛋白或目标产物的产生涉及目标蛋白，但不限于此。微生物可以是天然具有产生目标蛋白或目标产物的能力的微生物，或通过向不具有产生目标蛋白或目标产物的能力的亲本菌株赋予产生目标蛋白或目标产物能力而获得的微生物，但不限于此。
本文所用术语“产生目标蛋白或目标产物的微生物”包括所有野生型微生物或具有天然或人工发生的遗传修饰的微生物，并且是指其中由于***外源基因或增强或失活内源基因的活性而减弱或增强特定机制的微生物，其中所述微生物可具有用于产生目标蛋白或产物的遗传突变。相应的微生物可以是：通过目标蛋白、编码所述目标蛋白的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体中的任一种进行遗传修饰的微生物；经修饰以表达所述蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸的微生物；表达所述目标蛋白或编码所述目标蛋白的多核苷酸的重组微生物；或具有目标蛋白活性的重组微生物，但不限于此。
本文所用术语“转化”是指将本申请的多核苷酸或含有本申请的多核苷酸和编码目标蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞或微生物，以允许目标蛋白在宿主细胞中表达。可以包括任何宿主细胞，只要目标蛋白可以在宿主细胞中表达，无论***宿主细胞或微生物的多核苷酸或载体是***并位于宿主细胞的染色体中还是位于染色体外。多核苷酸可以以任何形式引入，只要多核苷酸可以在宿主细胞中引入和表达即可。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，表达盒是含有自身表达所需的所有因子的基因构建体。表达盒通常可以包括与多核苷酸可操作地连接的启动子，转录终止信号，核糖体结合位点和翻译终止信号，并且启动子可以是本申请的具有启动子活性的多核苷酸。表达盒可以是能够自我复制的表达载体。此外，编码目标蛋白的多核苷酸可以与本申请的多核苷酸可操作地连接并如此地引入宿主细胞，但不限于此。
本文所用术语“可操作地连接”是指基因序列和启动子序列之间的功能连接，所述启动子序列启动和介导编码目标蛋白的多核苷酸的转录。启动子序列可以是本申请中提供的启动子。
用本申请的载体转化的方法包括将核酸引入细胞的任何方法，并且可以根据宿主细胞选择和进行本领域已知的任何合适的标准技术。技术的实例可以是电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)方法、DEAE-右旋糖酐方法、阳离子脂质体方法、乙酸锂-DMSO方法等，但不限于此。
为了本申请的目的，微生物是产生目标蛋白或目标产物的微生物，其中所述微生物通过包含本申请的多核苷酸而具有增加的产生目标蛋白或目标产物的能力。
在一个实施方案中，包含本申请的多核苷酸的微生物可以是由于在SEQ ID NO:1的多核苷酸序列中至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代而具有增强的目标蛋白活性的微生物，但不限于此。
具体地，微生物是包括多核苷酸的微生物，所述多核苷酸由于在SEQ ID NO：1的多核苷酸序列中至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代而具有启动子活性，其中所述具有启动子活性的多核苷酸可以由通式X-Y-Z表示，其中X是CNGN；Y是CTAATTN；Z为CATGTGTGGTANAAN；N选自腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T)，鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)。多核苷酸如上文所述。
在一个实施方案中，由于用包含本申请的多核苷酸和编码目标蛋白的基因的载体转化，本申请的微生物可以具有增强的目标蛋白活性。
在本申请中，产生目标蛋白或目标产物的微生物或具有产生目标蛋白或目标产物的能力的微生物可以是参与目标蛋白或产物的生物合成途径的一些基因被增强或减弱，或参与目标蛋白或目标产物的降解途径的一些基因被增强或减弱的微生物。
例如，当目标蛋白是参与支链氨基酸产生的蛋白时，微生物可以是天然具有产生支链氨基酸的能力的微生物或通过向不具有产生支链氨基酸的能力的亲本菌株赋予产生支链氨基酸而获得的微生物，但不限于此。
在一个实施方案中，当目标蛋白是乙酰羟酸异构还原酶时，微生物可以是细胞或微生物，其中本申请的多核苷酸与编码乙酰羟酸异构还原酶的基因可操作地连接，以增强乙酰羟酸异构还原酶的活性，并且在这种情况下，宿主细胞或微生物可以是能够通过目标蛋白产生支链氨基酸的微生物。
本文中，“能够产生支链氨基酸的微生物”可以与“产生支链氨基酸的微生物”和“具有产生支链氨基酸的能力的微生物”互换使用。
本文所用术语“支链氨基酸”是指在侧链上具有支链烷基的氨基酸，包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。具体地，在本申请中，支链氨基酸可以是L-支链氨基酸，并且L-支链氨基酸可以是L-缬氨酸，L-异亮氨酸或L-亮氨酸，但不限于此。
本文所用术语“产生支链氨基酸的微生物”包括所有野生型微生物或具有天然或人工发生的遗传修饰的微生物，并且是指其中由于***外源基因或增强或失活内源基因的活性而减弱或增强特定机制的微生物，其中所述微生物可具有用于产生目标支链氨基酸的遗传突变或增强的活性。为了本申请的目的，产生支链氨基酸的微生物可以是通过包含本申请的具有启动子活性的多核苷酸而具有增加的产生目标支链氨基酸的能力的微生物，并且具体地，微生物可以是棒杆菌属的微生物。具体地，产生支链氨基酸的微生物或具有产生支链氨基酸的能力的微生物可以是参与支链氨基酸的生物合成途径的一些基因被增强或减弱，或参与支链氨基酸的降解途径的一些基因被增强或减弱的微生物。例如，产生支链氨基酸的微生物可以由于包含本申请中提供的具有启动子活性的多核苷酸而具有编码乙酰羟酸异构还原酶的ilvC的表达增加，但不限于此。
本文所用术语“产生支链氨基酸的棒杆菌属的微生物”可以是天然或通过修饰而具有产生支链氨基酸的能力的棒杆菌属的微生物。具体地，本申请的产生支链氨基酸的棒杆菌属微生物可以是如下所述的棒杆菌属微生物，其包含编码乙酰羟酸异构还原酶的ilvC，并且通过增强ilvC的启动子活性而具有增强的产生支链氨基酸的能力。更具体地，本申请的产生支链氨基酸的棒杆菌属微生物可以是如下所述的棒杆菌属微生物，其包含本申请的具有启动子活性的多核苷酸，或者由于用含有多核苷酸和编码目标蛋白的基因的载体转化而具有增加的产生支链氨基酸的能力。
“具有产生支链氨基酸的能力的棒杆菌属微生物”是指与转化前的亲本菌株或未修饰的微生物相比，具有增加的产生支链氨基酸的能力的微生物。“未修饰的微生物”是指野生型菌株本身，不包含编码乙酰羟酸异构还原酶的基因的微生物，或不包含本申请的多核苷酸序列或不用含有本申请的多核苷酸和编码目标蛋白的基因的载体转化的微生物。
“亲本菌株”可以是产生支链氨基酸的棒杆菌属的微生物。具体地，亲本菌株可以是具有天然或人工发生的遗传修饰的产生支链氨基酸的微生物。例如，亲本菌株可以是由于向棒杆菌属微生物引入修饰(ilvN(A42V)；Biotechnology and BioprocessEngineering,June 2014,Volume 19,Issue 3,pp.456–467)而具有提高的产生L-缬氨酸能力的菌株，或由于向棒杆菌属微生物引入lysC(L377K)变体和hom(G378E)变体(Appl.Microbiol.Biotechnol.45,612–620(1996))并向编码L-苏氨酸脱水酶的基因中引入ilvA(V383A)修饰(World J Microbiol Biotechnol(2015)31:1369–1377)而具有提高的产生L-异亮氨酸能力的菌株。此外，亲本菌株可以是由于向棒杆菌属微生物引入修饰(向棒杆菌属微生物)具有提高的产生L-亮氨酸能力的菌株，但不限于此。
在本申请中，“棒杆菌属的微生物”可以包括棒杆菌属的所有微生物。具体地，实例可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagene)，乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，嗜热棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)，高效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)，静止棒杆菌(Corynebacterium stationis)，Corynebacterium crudilactis、沙漠棒杆菌(Corynebacterium deserti)、Corynebacterium callunae、Corynebacterium singulare，Corynebacteriumhalotolerans，纹带棒杆菌(Corynebacterium stritum)，Corynebacterium visutisoli，Corynebacterium misaans，睾丸棒杆菌(Corynebacterium testudinoris)，黄色棒杆菌(Corynebacterium flavescens)等，但不限于此。
根据本申请的又一方面，提供了用于产生目标物质的方法，所述方法包括在培养基中培养棒杆菌属微生物。
目标物质具体可以是氨基酸，更具体地可以是支链氨基酸，但不限于此。
在该方法中，微生物的培养可以通过已知的浴培养、连续培养、补料分批培养等进行，但不限于此。培养条件可以不受特别限制，但是可以使用碱性化合物(例如氢氧化钠，氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)来实现调节至合适的pH(例如pH 5至pH 9，特别是pH 6至pH 8，并且最特别是pH 6.8)，并且可以通过向培养物中添加氧气或含氧气体混合物来维持有氧条件。培养温度可以维持在20℃至45℃，特别是25℃至40℃，并且培养可以进行约10至160小时，但条件不限于此。通过培养产生的氨基酸可以被释放到培养基中或者可以保留在细胞中而不被释放。
在用于培养的培养基中，作为碳源，糖和碳水化合物(例如，葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油，向日葵籽油，花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸，硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、有机酸(例如，乙酸)等可以单独或组合使用，但碳源不限于此。作为氮源，可以单独或组合使用含氮有机化合物(例如，蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，麦芽提取物，玉米浆，大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵)等，但氮源不限于此。作为磷源，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、相应的含钠盐等可以单独或组合使用，但磷源不限于此。此外，培养基可以含有必要的促生长物质，例如其它金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。
本申请的用于产生目标物质的方法可以进一步包括从培养基中回收目标物质。
为了回收培养步骤中产生的目标物质，可以根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养基中收集目标物质。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换层析、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物中回收目标物质。
此外，回收步骤可以包括纯化过程，可以使用本领域已知的适当方法进行。例如，当目标物质是氨基酸时，回收的氨基酸可以具有纯化的形式或可以是含有氨基酸的微生物发酵液(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering,A.J.Nair.,2008).
根据本申请的另一方面，提供了用于增强目标基因表达的方法，所述方法包括将包含本申请的多核苷酸的启动子可操作地连接到目标基因。
多核苷酸、目标基因、启动子等如上文所述。
根据本申请的另一方面，提供了SEQ ID NO:1的核苷酸序列中具有至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代的多核苷酸作为启动子的用途。
多核苷酸如上文所述。
[实施本发明的方式]
在下文中，将参考示例性实施例详细描述本申请。然而，提供这些示例性实施例用于具体说明本申请，本申请的范围不限于此。
实施例1：通过随机突变选择具有增加的缬氨酸产生能力的突变株
实施例1-1：通过UV照射的随机诱变
为了选择具有增加的缬氨酸生产能力的突变菌株，将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCCM11201P(US8465962B2)(其为缬氨酸生产菌株)接种在含有琼脂的营养培养基上并在30℃下培养36小时。将获得的数百个菌落在室温下用UV照射以对菌株中的基因组进行随机诱变。
<营养培养基(pH7.2)>
葡萄糖10g，肉汁5g，蛋白胨10g，氯化钠2.5g，酵母提取物5g，琼脂20g和尿素2g(基于1L蒸馏水)。
实施例1-2：对诱变菌株的发酵滴定试验和菌株的选择
为了选择与用作亲本菌株的谷氨酸棒杆菌KCCM11201P相比具有增加的L-缬氨酸生产能力的突变菌株，对诱变的菌株进行发酵滴定试验。将各菌落在营养培养基中继代培养，然后将各菌株接种到含有25mL生产培养基的250mL三角烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养72小时。此后，使用HPLC分析L-缬氨酸的浓度，并将所分析的L-缬氨酸的浓度制表于表1中。
<营养培养基(pH7.2)>
葡萄糖10g，肉汁5g，蛋白胨10g，氯化钠2.5g，酵母提取物5g，琼脂20g和尿素2g(基于1L蒸馏水)。
<生产培养基(pH7.0)>
葡萄糖100g，硫酸铵40g，大豆蛋白2.5g，固体玉米浆5g，尿素3g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸镁0.5g，生物素100μg，硫胺素-HCl 1mg，泛酸钙2mg，尼古丁酰胺3mg，碳酸钙30g(基于1L蒸馏水)
表1
/>
如表1所示，选择M4和M15菌株，它们与作为对照的KCCM11201P菌株相比，缬氨酸的产量分别增加178％和174％。
实施例2：通过基因测序进行修饰的研究
对产缬氨酸能力增强的M4和M15菌株的缬氨酸生物合成途径中的主要基因进行了测序，并将测序结果与KCCM11201P菌株、野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14067、ATCC13032和ATCC13869进行了比较。结果鉴定出M4和M15菌株在ilvC启动子区的特定位置含有相同的突变(参见图1)，ilvC是编码乙酰羟酸异构还原酶(AHAIR)的基因。具体而言，在M4和M15中，在包括SEQ ID NO:5所示序列的启动子区的序列中，第14位核苷酸G和第17位核苷酸C被T取代。SEQ ID NO:5所示的序列是通常包含在野生型谷氨酸棒杆菌菌株(ATCC14067、ATCC13032和ATCC13869)的ilvC启动子区中的序列。在下面的实施例中，研究了上述突变是否影响棒杆菌属微生物的氨基酸产量。
实施例3：引入突变的菌株的制备和缬氨酸生产能力的研究
实施例3-1：引入突变的谷氨酸棒杆菌KCCM11201P的菌株的制备和缬氨酸生产能力的评价
实施例3-3-1：菌株的制备
为了在SEQ ID NO:5所示的多核苷酸序列中用T取代第14和第17位核苷酸，构建了含有将突变引入缬氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11201P的目标突变的载体。
具体地，使用G-spin总DNA提取迷你试剂盒(Intron，货号17045)，根据试剂盒提供的方案，提取野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14067的基因组DNA。使用基因组DNA作为模板进行PCR。为了构建将突变引入ilvC基因启动子区的载体，分别使用引物1(SEQ ID NO:21)和引物2(SEQ ID NO:22)的引物对和引物3(SEQ ID NO:23)和引物4(SEQ ID NO:24)的引物对获得DNA片段A和B。
使用两个片段作为模板以及引物1(SEQ ID NO:21)和引物4(SEQ ID NO:24)进行重叠PCR，以获得大约1.4kb的PCR产物(下文称为“突变引入片段”)。所用的引物示于表2中。
表2
引物 核苷酸序列 SEQ ID NO:
引物1 CTATTCTAGAGTGATGAATCTGCAGCAGAAGATC 21
引物2 GACAACTATATATATACCACACACATGCA 22
引物3 TGCATGTGTGTGGTATAATAATAATGTAGTTGTC 23
引物4 CTATTCTAGAGAAGAGGTCGGTGACGGTCTCAGC 24
用限制性内切酶XbaI(New England Biolabs，Beverly，MA)处理获得的突变引入片段，然后与用同样的限制性内切酶处理的pDZ载体和T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)进行连接(WO2008-033001A1)。将制备的基因转化到大肠杆菌DH5α中，然后从含卡那霉素的LB培养基中进行选择，并使用DNA-spin质粒DNA纯化试剂盒(iNtRON)获得DNA，从而构建重组质粒pDZ-ilvC(Pm3)-14067。使用野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869和ATCC13032的基因组DNA代替ATCC14067的基因组DNA进行了相同操作，分别构建了pDZ-ilvC(Pm3)-13869和pDZ-ilvC(Pm3)-13032重组质粒。
在如上构建的三种重组质粒中，通过染色体同源重组(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52:541–545,1999)将pDZ-ilvC(Pm3)-14067转化到谷氨酸棒杆菌KCCM11201P(L-缬氨酸生产菌株)中。从含有25mg/L卡那霉素的培养基筛选通过同源序列重组使得载体***染色体的菌株。之后，使用引物1和引物4对已经完成二次重组的谷氨酸棒杆菌转化菌株进行PCR，以构建菌株KCCM11201P-ilvC(Pm3)，其中突变被引入染色体上的ilvC启动子(图2)。该重组菌株被命名为谷氨酸棒杆菌CA08-1063，依据布达佩斯条约的规定，于2019年8月21日，将其国际保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM，国际保藏机构)，登录号为KCCM12574P。
实施例3-1-2：缬氨酸生产能力的评价
为了比较缬氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11201P和KCCM11201P-ilvC(Pm3)的缬氨酸生产能力，进行了发酵滴定度评价。将每种菌株在营养培养基中继代培养，然后接种到含有25mL生产培养基的250mL三角烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养72小时。此后，使用HPLC分析L-缬氨酸的浓度，并将所分析的L-缬氨酸的浓度列于表3中。
<营养培养基(pH7.2)>
葡萄糖10g，肉汁5g，蛋白胨10g，氯化钠2.5g，酵母提取物5g，琼脂20g和尿素2g(基于1L蒸馏水)。
<生产培养基(pH7.0)>
葡萄糖100g，硫酸铵40g，大豆蛋白2.5g，固体玉米浆5g，尿素3g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸镁0.5g，生物素100μg，硫胺素-HCl 1mg，泛酸钙2mg，尼古丁酰胺3mg，碳酸钙30g(基于1L蒸馏水)
表3KCCM11201P和KCCM11201P-ilvC(Pm3)的L-缬氨酸生产能力。
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如上述结果所示，与对照相比，KCCM11201P-ilvC(Pm3)菌株的L-缬氨酸生产能力提高了11％。因此，通过ilvC基因启动子的突变可以提高L-缬氨酸生产能力。
实施例3-2：将突变引入谷氨酸棒杆菌CJ7V的菌株的制备和缬氨酸生产能力的评价
实施例3-2-1：缬氨酸生产菌株CJ7V的制备
为了研究在产生L-缬氨酸的其它谷氨酸棒杆菌菌株中是否还存在与上述相同的效果，将一种突变(ilvN(A42V)(Biotechnology and Bioprocess Engineering,June2014,Volume 19,Issue 3,pp.456–467)引入到野生型谷氨酸棒杆菌ATCC14067中以制备具有增加的L-缬氨酸生产能力的菌株。
具体地，通过使用G-spin总DNA提取微型试剂盒(Intron，货号17045)，根据试剂盒提供的方案，提取野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14067的基因组DNA。使用基因组DNA作为模板进行PCR。为了构建用于将A42V突变引入ilvN基因的载体，分别使用引物5(SEQ ID NO:25)和引物6(SEQ ID NO:26)的引物对和引物7(SEQ ID NO:27)和引物8(SEQ ID NO:28)的引物对获得基因片段(A和B)。PCR的条件如下：94℃变性5分钟，25个循环(94℃变性30秒，55℃退火30秒，以及72℃延伸60秒)，然后在72℃延伸7分钟。所用的引物示于表4中。
表4
结果，对于片段A和B都可以获得537bp的多核苷酸。使用两个片段作为模板以及引物5(SEQ ID NO:25)和引物8(SEQ ID NO:28)进行重叠PCR，以获得大约1044bp的PCR产物(下文称为“突变引入片段”)。
用限制酶XbaI(New England Biolabs，Beverly，MA)处理获得的突变引入片段，然后与用同样的限制酶处理的pDZ载体和T4连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)进行连接。将制备的基因转化到大肠杆菌DH5α中，然后从含有卡那霉素的LB培养基中进行筛选，并使用DNA-spin质粒DNA纯化试剂盒(iNtRON)获得DNA。具有将A42V引入ilvN基因的目的的载体被命名为pDZ-ilvN(A42V)。
然后，通过染色体同源重组(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol52:541–545,1999)，将如上构建的重组质粒pDZ-ilvN(A42V)转化到野生型谷氨酸棒杆菌ATCC14067中。从含有25mg/L卡那霉素的培养基筛选通过同源序列重组使得载体***染色体的菌株。之后，使用引物5和引物8对已经完成二次重组的谷氨酸棒杆菌转化菌株进行PCR，以实现基因片段扩增，然后通过基因测序鉴定引入突变的菌株。将重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌CJ7V。
实施例3-2-2：缬氨酸生产能力的评价
通过与实施例3-1相同的方法，将pDZ-ilvC(Pm3)-14067转化到实施例3-2-1中制备的具有L-缬氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌CJ7V中，从而制备在ilvC基因启动子中具有突变的菌株，命名为CJ7V-ilvC(Pm3)(图3)。为了比较制备的菌株之间的L-缬氨酸生产能力，培养菌株并通过与实施例3-1相同的方法分析L-缬氨酸的浓度，分析的L-缬氨酸浓度列于下表5中。
表5CJ7V和CJ7V-ilvC(Pm3)的L-缬氨酸生产能力。
如上述结果所示，与对照相比，CJ7V-ilvC(Pm3)菌株的L-缬氨酸生产能力提高了14％。由此再次证明，L-缬氨酸生产能力可以通过ilvC基因启动子的突变来提高。
实施例3-3：将突变引入谷氨酸棒杆菌CJ8V的菌株的制备和L-缬氨酸生产能力的评价
实施例3-3-1：缬氨酸生产菌株CJ8V的制备
为了研究在产生L-缬氨酸的其它谷氨酸棒杆菌菌株中是否也具有与上述相同的效果，将一种突变(ilvN(A42V))引入到野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869中，通过与实施例3-2相同的方法制备具有L-缬氨酸产生能力的菌株。将重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌CJ8V。
实施例3-3-2：缬氨酸生产能力的评价
制备将ilvC启动子突变引入到实施例3-3-1中制备的具有L-缬氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌CJ8V中的菌株。将实施例3-1-1中制备的重组载体pDZ-ilvC(Pm3)-14067和pDZ-ilvC(Pm3)-13869各自转化至CJ8V(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol52:541–545,1999)。在含有25mg/L卡那霉素的培养基上筛选通过同源序列重组使得载体***染色体的菌株。之后，使用引物1和引物4对已经完成二次重组的谷氨酸棒杆菌转化菌株进行PCR，以构建菌株CJ8V-ilvC(Pm3)和CJ8V-ilvC(Pm3)-2，其中将突变引入染色体上的ilvC启动子(图4)。在重组菌株中，CJ8V-ilvC(Pm3)-2被命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CA08-2034，根据布达佩斯条约的规定，将其在2019年8月21日国际保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，登录号为KCCM12575P。
为了比较制备的菌株的L-缬氨酸生产能力，通过与实施例3-1相同的方法培养菌株并分析L-缬氨酸的浓度，分析的L-缬氨酸浓度列于下表6中。
表6CJ8V、CJ8V-ilvC(Pm3)和CJ8V-ilvC(Pm3)-2的L-缬氨酸生产能力
如上述结果所示，与对照相比，CJ8V-ilvC(Pm3)和CJ8V-ilvC(Pm3)-2菌株各自的L-缬氨酸生产能力提高了8.6％。由此再次鉴定出L-缬氨酸生产能力可以通过ilvC基因启动子的突变来提高。
实施例4：生产异亮氨酸的菌株的制备和生产能力的评价
实施例4-1：L-异亮氨酸生产谷氨酸棒杆菌KCCM11248P菌株中引入ilvC启动子突变的菌株的制备
按照与实施例3相同的方法，通过染色体同源重组将实施例3-1中构建的重组质粒pDZ-ilvC(Pm3)-14067和pDZ-ilvC(Pm3)-13869引入L-异亮氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11248P(韩国专利10-1335789号)，将这些菌株分别命名为KCCM11248P::ilvC(Pm3)和KCCM11248P::ilvC(Pm3)-2(图5)。通过如下方法培养制备的菌株，然后比较异亮氨酸产生能力。
将每种菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL三角烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养20小时。然后，将1mL种子培养物接种到含有24mL生产培养基的250mL三角烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。
<种子培养基(pH7.0)>
葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，尿素1.5g、KH2PO44g、K2HPO48g、MgSO47H2O0.5g，生物素100μg，硫胺素HCl 1000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺2000μg(基于1L蒸馏水)
<生产培养基(pH7.0)>
葡萄糖50g、(NH4)2SO412.5g，大豆蛋白2.5g，固体玉米浆5g，尿素3g、KH2PO41g、MgSO47H2O0.5g，生物素100μg，硫胺盐酸盐1000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺3000μg、CaCO330g(基于1L蒸馏水)
培养完成后，测定L-异亮氨酸产生能力。测试的每个菌株的培养基中L-异亮氨酸的浓度示于下表7中。
表7
如上表7所示，与产生L-异亮氨酸的菌株KCCM11248P相比，由引入ilvC启动子增强突变的KCCM11248P::ilvC(Pm3)和KCCM11248::ilvC(Pm3)-2产生的L-异亮氨酸的浓度分别增加了约32.3％和27.8％。由此证明，通过ilvC基因的启动子突变提高了L-异亮氨酸生产能力。上述结果表明，在产L-异亮氨酸的棒杆菌属菌株中引入ilvC启动子突变可有效地产生L-异亮氨酸。
实施例4-2：引入ilvC启动子突变的野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032的L-异亮氨酸生产菌株的制备和L-异亮氨酸生产能力的评价
为了研究引入ilvC启动子突变对L-异亮氨酸生产能力的影响，通过向谷氨酸棒杆菌ATCC13032(下文称为WT)引入lysC(L377K)变体(KR 10-2019-0003019A)和hom(G378E)变体(Appl.Microbiol.Biotechnol.45,612–620(1996))，并且将ilyA(V383A)突变(World JMicrobiol Biotechnol(2015)31：1369-1377)引入编码L-苏氨酸脱水酶的已知基因，并比较L-异亮氨酸产生能力。所用的引物示于表8中。
表8
引物 核苷酸序列(5’-3') SEQ ID NO:
9 TCCTCTAGAGCTGCGCAGTGTTGAATACG 29
10 TGGAAATCTTTTCGATGTTCACGTTGACAT 30
11 ACATCGAAAAGATTTCCACCTCTGAGATTC 31
12 GACTCTAGAGTTCACCTCAGAGACGATTA 32
实施例4-2-1：L377K突变的引入
使用WT染色体作为模板以及引物9和10的引物对或引物11和12的引物对进行PCR。PCR的条件是：95℃变性5分钟，30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒)，然后在72℃延伸7分钟。结果，分别获得lysC基因突变的5'-上游区域的509bp DNA片段和其3'-下游区域的520bp DNA片段。
使用两个扩增的DNA片段作为模板以及引物9和12的引物对进行PCR。PCR的条件是：95℃变性5分钟，30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒)，然后在72℃延伸7分钟。结果，扩增到包含lysC基因突变的1011bp DNA片段，其编码天冬氨酸激酶变体，其中377位亮氨酸被赖氨酸取代。
将不能在谷氨酸棒杆菌中复制的pDZ载体和1011bp DNA片段用限制性内切酶XbaI处理并用DNA连接酶连接，然后克隆得到质粒，命名为pDZ-lysC(L377K)。
通过电脉冲方法(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999),52:541–545)将如上获得的pDZ-lysC(L377K)载体引入WT菌株，然后从含有25mg/L卡那霉素的选择性培养基获得转化的菌株。获得了菌株，其中通过二次重组过程(交叉)***染色体的DNA片段引入lysC基因的核苷酸突变。
实施例4-2-2：G378E突变的引入
为了构建用于引入hom(G378E)突变的载体，使用WT基因组DNA作为模板以及引物13和14的引物对以及引物15和16的引物对进行PCR。PCR的条件是：95℃变性5分钟，30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒)，然后在72℃延伸7分钟。结果，分别获得hom基因突变的5'-上游区的220bp DNA片段和其3'-下游区的220bp DNA片段。使用两种PCR产物作为模板以及引物13和16的引物对进行PCR。PCR的条件是：95℃变性5分钟，30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒)，然后在72℃延伸7分钟。结果，扩增到包含hom基因突变的440bp DNA片段。所用的引物示于表9中。
表9
引物 核苷酸序列(5’-3') SEQ ID NO:
13 TCCTCTAGACTGGTCGCCTGATGTTCTAC 33
14 GCCAAAACCTCCACGCGATC 34
15 ATCGCGTGGAGGTTTTGGCT 35
16 GACTCTAGATTAGTCCCTTTCGAGGCGGA 36
用限制性内切酶XbaI处理先前使用的pDZ载体和440bp DNA片段，用DNA连接酶进行连接，然后克隆得到质粒，命名为pDZ-hom(G378E)。
通过电脉冲方法将获得的pDZ-hom(G378E)载体引入实施例4-2-1中制备的WT::lysC(L377K)菌株，然后从含有25mg/L卡那霉素的选择性培养基中获得转化的菌株。获得了菌株WT:lysC(L377K)-hom(G378E)，其中核苷酸突变借由二次重组过程(交叉)通过***染色体的DNA片段被引入hom基因。
实施例4-2-3：ilvC启动子突变的引入
通过与上述实施例相同的方法，通过染色体同源重组将实施例3-1中制备的重组质粒pDZ-ilvC(Pm3)-14067和pDZ-ilvC(Pm3)-13032引入实施例4-2-2中制备的WT::lysC(L377K)-hom(G378E)菌株中。这些菌株分别命名为WT::lysC(L377K)-hom(G378E)-ilvC(Pm3)和WT::lysC(L377K)-hom(G378E)-ilvC(Pm3)-3。
实施例4-2-4：ilvA突变的引入
为了构建引入用于ilvA基因的先前已知的ilvA(V383A)突变(World JMicrobiolBiotechnol(2015)31:1369–1377)的载体，设计了用于扩增突变位置的5’-上游区域的一对引物(引物17和18)和用于扩增其3’-下游区域的一对引物(引物19和20)。将BamHI酶位点(下划线)***引物17和20中的每一个的一端，并将核苷酸取代突变(下划线)置于设计用于引物18和19中交叉的位点。所用的引物示于表10中。
表10
引物 核苷酸序列(5'-3') SEQ ID NO:
17 ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG 37
18 GCGCTTGAGGTACTCtgcCAGCGTGATGTC 38
19 GACATCACGCTGgcaGAGTACCTCAAGCGC 39
20 ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC 40
使用WT染色体作为模板沿着引物对17和19以及引物对19和20进行PCR。PCR的条件是：95℃变性5分钟，30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒)，然后在72℃延伸7分钟。结果，分别获得ilvA基因突变的5’-上游区的627bp DNA片段和其3’-下游区的608bp DNA片段。使用两个扩增的DNA片段作为模板以及引物对17和20进行PCR。PCR的条件是：95℃变性5分钟，30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒)，然后在72℃延伸7分钟。结果，扩增到包含ilvA基因突变的1217bp DNA片段，所述DNA片段编码用丙氨酸取代了383位缬氨酸的ilvA变体。
用限制性内切酶BamHI处理pECCG117载体(韩国专利10-0057684号)和1011bp DNA片段，用DNA连接酶进行连接，然后克隆得到质粒，命名为pECCG117-ilvA(V383A)。
分别制备将pECCG117-ilvA(V383A)载体引入ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)和ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)-3的菌株。这些菌株分别命名为ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)/pECCG117-ilvA(V383A)和ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)-3/pECCG117-ilvA(V383A)(图6)。此外，还制备了仅将ilvA(V383A)突变引入ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)的菌株作为对照。
实施例4-2-5：异亮氨酸生产能力的评价
通过实施例4-1中所示的相同方法培养菌株，并分析培养物中L-异亮氨酸的浓度。
表11
如上表11所示，与野生型菌株ATCC13032::-hom(G378E)-lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(V383A)相比，各自包括ilvC突变的ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)/pECCG117-ilvA(V383A)和ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)-3/pECCG117-ilvA(V383A)中的L-异亮氨酸浓度分别增加了约25％和24％。上述结果表明，在产L-异亮氨酸的棒杆菌属菌株中引入ilvC启动子突变可有效地产生L-异亮氨酸。
实施例5：生产亮氨酸的菌株的制备和生产能力的研究
实施例5-1：将ilvC启动子突变引入L-异亮氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11661P和KCCM11662P的菌株的制备和亮氨酸生产能力的评价
通过染色体同源重组(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52:541–545,1999)，将实施例3-1中构建的pDZ-ilvC(Pm3)-14067重组质粒转化到L-亮氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11661P(US 10351859B2)和KCCM11662P(US 10351859B2)中。从含有25mg/L卡那霉素的培养基筛选通过同源序列重组将载体***染色体的菌株。之后，使用引物1和引物4对已经完成二次重组的谷氨酸棒杆菌转化菌株进行PCR，以构建已将突变引入染色体上的ilvC启动子的菌株。重组菌株分别命名为谷氨酸棒杆菌KCCM11661P-ilvC(Pm3)和KCCM11662P-ilvC(Pm3)(图7)。为了比较产亮氨酸菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11661P-ilvC(Pm3)和KCCM11662P-ilvC(Pm3)之间的亮氨酸生产能力，进行了发酵滴定度评价。将每种菌株在营养培养基中继代培养，然后接种到含有25mL生产培养基的250mL三角烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养72小时。此后，使用HPLC分析L-亮氨酸的浓度，并将分析的L-缬氨酸浓度列在下表12中。
<营养培养基(pH7.2)>
葡萄糖10g，肉汁5g，蛋白胨10g，氯化钠2.5g，酵母提取物5g，琼脂20g和尿素2g(基于1L蒸馏水)。
<生产培养基(pH7.0)>
葡萄糖50g，硫酸铵20g，固体玉米浆20g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸镁0.5g，生物素100μg，硫胺素-HCl 1mg，碳酸钙15g(基于1L蒸馏水)
表12
KCCM11661P、KCCM11661P-ilvC(Pm3)、KCCM11662P和KCCM11662P-ilvC(Pm3)的L-亮氨酸生产能力。
如上述结果所示，与对照相比，KCCM11661P-ilvC(Pm3)和KCCM11662P-ilvC(Pm3)菌株的L-亮氨酸生产能力提高了11％和10％。因此证实，通过ilvC基因的启动子突变，可以提高L-亮氨酸的生产能力。
实施例5-2：将突变引入到产亮氨酸菌株谷氨酸棒杆菌CJL8001中的菌株的制备和L-亮氨酸生产能力的评价
为了研究在生产L-亮氨酸的其它谷氨酸棒杆菌菌株中是否也产生与上述相同的效果，将一种突变(leuA(R558H、G561D)；US 2020-0032305 A1)引入野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032以制备具有改进的L-亮氨酸生产能力的菌株。
具体而言，通过染色体同源重组(van der Rest et al.,Appl MicrobiolBiotechnol 52:541–545,1999)，将上述专利中构建的重组质粒pDZ-leuA(R558H、G561D)转化到野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC130332中。之后，对已经完成二次重组的谷氨酸棒杆菌转化菌株进行基因测序，以鉴定引入突变的菌株。将重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌CJL8001。
最后，通过与实施例5-1相同的方法，将pDZ-ilvC(Pm3)-14067和pDZ-ilvC(Pm3)-13032载体转化到具有L-亮氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌CJL8001中，从而制备CJL8001-ilvC(Pm3)和CJL8001-ilvC(Pm3)-3，其中突变被引入ilvC基因的菌株(图8)。CJL8001-ilvC(Pm3)-3被命名为谷氨酸棒杆菌CA13-8101，将其在2019年8月21日根据布达佩斯条约的规定国际保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，并且分配了登录号KCCM12576P。
为了比较制备的菌株之间的L-亮氨酸生产能力，通过与实施例5-1相同的方法培养菌株并分析L-缬氨酸的浓度，并将分析的L-亮氨酸浓度列在下表13中。
表13
CJL8001、CJL8001-ilvC(Pm3)和CJL8001-ilvC(Pm3)-3的L-亮氨酸生产能力
如上述结果所示，与对照相比，CJL8001-ilvC(Pm3)和CJL8001-ilvC(Pm3)-3菌株各自的L-亮氨酸生产能力提高了15％。由此进一步证明，通过谷氨酸棒杆菌属微生物中ilvC基因的启动子突变，可以提高L-亮氨酸的生产能力。
根据以上描述，本申请所属领域的技术人员够理解，在不脱离本申请的技术精神或实质特征的情况下，本申请可以以其它具体形式来实施。因此，上述实施方案应当被解释为是示例性的，而不是限制本申请。本申请的范围应该被理解为使得从权利要求及其等同物的定义和范围得到的所有改变或修改都落入本申请的范围内。
/>
/>
/>
序列表
<110> CJ第一制糖株式会社(CJ CheilJedang Corporation)
<120> 新的启动子和使用所述启动子生产所需物质的方法
<130> OPA20073-PCT
<150> KR 10-2019-0108263
<151> 2019-09-02
<160> 40
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221>
<222>
<223> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 1
ccgtctaatt gcatgtgtgt ggtagaac 28
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 启动子_通式Z
<400> 2
catgtgtgtg gtanaan 17
<210> 3
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<222>
<223> 启动子_通式Y
<400> 3
ctaattn 7
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<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 启动子_通式X
<400> 4
cngn 4
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 启动子_式Z
<400> 5
catgtgtgtg gtagaac 17
<210> 6
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 启动子_式Y
<400> 6
ctaattg 7
<210> 7
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 启动子_式Y
<400> 7
ctaatta 7
<210> 8
<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221>
<222>
<223> 启动子_式X
<400> 8
ccgt 4
<210> 9
<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221>
<222>
<223> 启动子_式X
<400> 9
cgga 4
<210> 10
<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 启动子_式X
<400> 10
cggt 4
<210> 11
<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 启动子_式X
<400> 11
ccga 4
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 启动子_式Z
<400> 12
catgtgtgtg gtataat 17
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 启动子
<400> 13
ccgtctaatt gcatgtgtgt ggtataat 28
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<222>
<223> 启动子
<400> 14
ccgtctaatt acatgtgtgt ggtataat 28
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 启动子
<400> 15
cggactaatt gcatgtgtgt ggtataat 28
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221>
<222>
<223> 启动子
<400> 16
cggactaatt acatgtgtgt ggtataat 28
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<222>
<223> 启动子
<400> 17
ccgactaatt gcatgtgtgt ggtataat 28
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221>
<222>
<223> 启动子
<400> 18
ccgactaatt acatgtgtgt ggtataat 28
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 启动子
<400> 19
cggtctaatt gcatgtgtgt ggtataat 28
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 启动子
<400> 20
cggtctaatt acatgtgtgt ggtataat 28
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 21
ctattctaga gtgatgaatc tgcagcagaa gatc 34
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 22
gacaactaca ttattattat accacacaca tgca 34
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 23
tgcatgtgtg tggtataata ataatgtagt tgtc 34
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
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<223> 引物
<400> 24
ctattctaga gaagaggtcg gtgacggtct cagc 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 25
aatttctaga ggcagaccct attctatgaa gg 32
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 26
agtgtttcgg tctttacaga cacgagggac 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221>
<222>
<223> 引物
<400> 27
gtccctcgtg tctgtaaaga ccgaaacact 30
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 引物
<400> 28
aatttctaga cgtgggagtg tcactcgctt gg 32
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 引物
<400> 29
tcctctagag ctgcgcagtg ttgaatacg 29
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 30
tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 31
acatcgaaaa gatttccacc tctgagattc 30
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 引物
<400> 32
gactctagag ttcacctcag agacgatta 29
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221>
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<223> 引物
<400> 33
tcctctagac tggtcgcctg atgttctac 29
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<223> 引物
<400> 34
gccaaaacct ccacgcgatc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 35
atcgcgtgga ggttttggct 20
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 36
gactctagat tagtcccttt cgaggcgga 29
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 37
acggatccca gactccaaag caaaagcg 28
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 38
gcgcttgagg tactctgcca gcgtgatgtc 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 39
gacatcacgc tggcagagta cctcaagcgc 30
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 40
acggatccaa ccaaacttgc tcacactc 28

Claims (12)

1.多核苷酸，其由以下通式1表示的核苷酸序列组成：
X–Y–Z
[通式1]
其中，
X是CN1GN2，
Y是CTAATTN3，并且
Z是CATGTGTGTGGTATAAT，
其中X的N1是胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)，X的N2是腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)，Y的N3是腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中X是SEQ ID NO:8至11中的任一个，并且Y是SEQID NO:6或7。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸由选自SEQ ID NOS:13至20的任何一个多核苷酸序列组成。
4.启动子，其由权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸组成。
5.载体，其包含权利要求4所述的启动子和编码目标蛋白的基因。
6.如权利要求5所述的载体，其中所述目标蛋白是乙酰羟酸异构还原酶。
7.棒杆菌属(Corynebacterium)微生物，其包含权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸。
8.如权利要求7所述的棒杆菌属微生物，其中所述棒杆菌属微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
9.用于生产目标物质的方法，所述方法包括：
在培养基中培养权利要求7所述的棒杆菌属(Corynebacterium)微生物；以及
回收所述培养基中的目标物质。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述目标物质是氨基酸。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述氨基酸是L-支链氨基酸。
12.增强目标基因表达的方法，所述方法包括将包含权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸的启动子与所述目标基因可操作地连接。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113994002B (zh) * 2021-05-07 2022-06-03 Cj第一制糖株式会社 新型启动子及其用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1920040A (zh) * 1999-06-25 2007-02-28 Basf公司 编码参与碳代谢和能量产生的蛋白质的谷氨酸棒杆菌基因
CN106148336A (zh) * 2015-04-07 2016-11-23 中国科学院天津工业生物技术研究所 新型的l-苏氨酸-诱导型启动子及其应用
CN106318964A (zh) * 2016-09-01 2017-01-11 宁夏伊品生物科技股份有限公司 棒杆菌发酵生产l‑赖氨酸的方法及其启动子改造
CN106459977A (zh) * 2015-01-29 2017-02-22 Cj第制糖株式会社 新的启动子及其用途
CN108026539A (zh) * 2016-08-31 2018-05-11 Cj第制糖株式会社 新型启动子及其应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0787977A (ja) * 1993-08-12 1995-04-04 Mitsubishi Chem Corp コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片
EP1649403A2 (en) 2003-07-29 2006-04-26 Ajinomoto Co., Inc. Method for determining metabolic flux affecting substance production
US8604180B2 (en) * 2004-09-09 2013-12-10 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth DNA fragment having promoter function
CN101573438B (zh) 2006-09-15 2013-01-02 Cj第一制糖株式会社 具有增加的l-赖氨酸生产力的棒状杆菌和使用其生产l-赖氨酸的方法
KR100832740B1 (ko) * 2007-01-17 2008-05-27 한국과학기술원 분지쇄 아미노산 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를이용한 분지쇄 아미노산의 제조방법
KR101117022B1 (ko) 2011-08-16 2012-03-16 씨제이제일제당 (주) Ｌ-발린 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-발린 제조방법
KR101335789B1 (ko) 2012-01-13 2013-12-02 씨제이제일제당 (주) Ｌ-이소루신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-이소루신 제조방법
RU2012112651A (ru) * 2012-04-02 2013-10-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") САМОИНДУЦИРУЕМАЯ ЭКСПРЕССИОННАЯ СИСТЕМА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛЕЗНЫХ МЕТАБОЛИТОВ С ПОМОЩЬЮ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
PL2811028T3 (pl) * 2013-06-03 2017-07-31 Evonik Degussa Gmbh Sposób wytwarzania L-waliny z zastosowaniem zrekombinowanych bakterii maczugowatych zawierających operon ilvBN indukowany propionianem
KR101796830B1 (ko) 2015-08-25 2017-11-13 씨제이제일제당 (주) Ｌ-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-류신의 제조방법
PL3858987T3 (pl) 2016-12-28 2023-05-22 Cj Cheiljedang Corporation Nowy wariant syntazy izopropylojabłczanowej i sposób wytwarzania l-leucyny z jego wykorzystaniem
KR102011994B1 (ko) 2017-06-30 2019-08-20 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법
KR102063909B1 (ko) * 2019-03-29 2020-01-08 씨제이제일제당 주식회사 아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 또는 이를 이용하는 l-분지쇄 아미노산 생산 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1920040A (zh) * 1999-06-25 2007-02-28 Basf公司 编码参与碳代谢和能量产生的蛋白质的谷氨酸棒杆菌基因
CN106459977A (zh) * 2015-01-29 2017-02-22 Cj第制糖株式会社 新的启动子及其用途
CN106148336A (zh) * 2015-04-07 2016-11-23 中国科学院天津工业生物技术研究所 新型的l-苏氨酸-诱导型启动子及其应用
CN108026539A (zh) * 2016-08-31 2018-05-11 Cj第制糖株式会社 新型启动子及其应用
CN106318964A (zh) * 2016-09-01 2017-01-11 宁夏伊品生物科技股份有限公司 棒杆菌发酵生产l‑赖氨酸的方法及其启动子改造

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