CN113544141A - 包含突变的LysE的微生物和使用其生产L-氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了包含突变的LysE的微生物和使用该微生物生产L‑氨基酸的方法。与野生型LysE相比，突变的LysE具有改善输出和/或生产L‑氨基酸的能力的作用。

Description

包含突变的LysE的微生物和使用其生产L-氨基酸的方法
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年2月13日向韩国知识产权局提交的KR10-2020-0017559的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
提供了包含突变的LysE的微生物和使用该微生物生产L-氨基酸的方法。与野生型LysE相比，突变的LysE可以增强输出和/或生产L-氨基酸的能力。
背景技术
属于棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物是革兰氏阳性的，并且已广泛用于生产L-氨基酸。L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸，在动物饲料工业以及人类医学和化妆品工业中获得应用。对于工业应用，L-氨基酸大部分是通过使用棒状杆菌属菌株发酵而产生的。
已经进行了许多尝试来改进使用棒状杆菌属菌株生产L-氨基酸的方法。其中之一是重组DNA技术的研究，通过该技术可操纵特定基因以敲低或减弱表达从而生产L-氨基酸。另外，已经进行了这样的研究，即扩增并分析了参与L-氨基酸生物合成的每种基因对L-氨基酸生产的影响，从而修饰生产L-氨基酸的棒状杆菌属菌株。另外，已经尝试引入源自其他细菌的外来基因。
然而，仍然需要开发用于提高有用物质如L-氨基酸的生产潜力的技术。
发明内容
技术问题
一种实施方式提供了突变的赖氨酸输出物。例如，突变的赖氨酸输出物可以是从SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N末端开始的第65位氨基酸天冬酰胺(Asn，N)被其他氨基酸取代的多肽。该多肽可以具有L-氨基酸(例如L-赖氨酸、L-精氨酸、其组合等)的输出物的活性。
另一种实施方式提供了编码该多肽(突变的赖氨酸输出物)的多核苷酸。
另一种实施方式提供了包含该多核苷酸的重组载体。
另一种实施方式提供了包含该多肽，编码所述多肽的多核苷酸或包含所述多核苷酸的重组载体的重组微生物。与非突变的微生物相比，重组微生物可以具有输出和/或生产L-氨基酸的能力，或者具有增加的输出和/或生产L-氨基酸的能力。
另一种实施方式提供了生产L-氨基酸的方法，其包括培养重组微生物或生产L-氨基酸的微生物。
技术方案
根据本文提供的实施方式，基于对棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)微生物中参与赖氨酸生产的基因的扩增如何影响其赖氨酸生产潜力的研究，提出了一种用于氨基酸生产的菌株修饰技术。通常，增加赖氨酸生产潜力的策略包括提高赖氨酸的生产收率或增加每单位时间赖氨酸的输出量(生产率)。作为其一部分，本文提出通过改进L-赖氨酸输出物蛋白来增加赖氨酸的收率和/或生产率，所述L-赖氨酸输出物蛋白是具有释放通过生物合成而生产的赖氨酸功能的膜蛋白。本申请的实施方式提供了涉及通过改进L-赖氨酸输出物蛋白和/或编码该蛋白的lysE基因而开发出具有增强的L-氨基酸(例如L-赖氨酸、L-精氨酸、其组合等)输出能力的菌株的技术。
一种实施方式提供了突变的赖氨酸输出物。例如，突变的赖氨酸输出物可以是从SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N末端开始的第65位氨基酸天冬酰胺(Asn，N)被其他氨基酸取代的多肽。该多肽可以具有L-氨基酸(例如L-赖氨酸、L-精氨酸、其组合等)的输出物的活性。
另一种实施方式提供了编码该多肽(突变的赖氨酸输出物)的多核苷酸。
另一种实施方式提供了包含该多核苷酸的重组载体。该重组载体可以用作表达载体。
另一种实施方式提供了包含该多肽，编码所述多肽的多核苷酸或包含所述多核苷酸的重组载体的重组微生物。与非突变微生物相比，重组微生物可以具有输出和/或生产L-氨基酸的能力，或者具有增加的输出和/或生产L-氨基酸的能力。
另一种实施方式提供了生产L-氨基酸的方法，其包括培养重组微生物或生产L-氨基酸的微生物。
L-氨基酸可以是L-赖氨酸、L-精氨酸或其组合。
微生物可以是棒状杆菌属(Corynebacterium)或埃希氏菌属(Escherichia)的微生物。
将给出本公开的详细描述。
如本文所用，术语“赖氨酸输出物蛋白或赖氨酸输出物(LysE)”可以指一种跨膜蛋白，这种跨膜蛋白能够从细胞中释放出胞内生物合成产物，如L-氨基酸，例如L-赖氨酸。在一种实施方式中，赖氨酸输出物蛋白可以源自棒状杆菌属的菌株，例如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。例如，赖氨酸输出物可以由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示。
突变的赖氨酸输出物可以是多肽，该多肽中氨基酸取代的突变被引入赖氨酸输出物中。在一种实施方式中，突变的赖氨酸输出物可以是从SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N末端开始的第65位氨基酸天冬酰胺(N)被其他氨基酸取代的多肽(例如，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N末端开始的第65位氨基酸天冬酰胺(N)被其他氨基酸取代的氨基酸序列表示的多肽)。更具体地，突变的赖氨酸输出物可以是SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N末端开始的第65位氨基酸天冬酰胺(N)被选自由以下组成的组中的一种取代的多肽：谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)和精氨酸(R)。在具体的实施方式中，突变的赖氨酸输出物可以是由SEQ ID NO:3(其中SEQ ID NO 1的第65位氨基酸天冬酰胺(N)被谷氨酸(E)取代)表示的多肽，但不限于此。引入这样的突变的多肽可以具有作为L-氨基酸(例如L-赖氨酸、L-精氨酸、其组合等)的输出物的功能。
如本文所用，术语“生产L-氨基酸的微生物”可以指通过将如上所述的赖氨酸输出物突变引入具有输出和/或生产L-氨基酸能力的微生物中而具有增加的输出和/或生产L-氨基酸的潜力的微生物，和/或通过将如上所述的赖氨酸输出物突变引入没有(缺乏)输出和/或生产L-氨基酸能力的微生物中而具有输出和/或生产L-氨基酸的潜力的微生物。如本文所用，术语“微生物”可旨在涵盖单细胞细菌，并且可与“细胞”互换使用。
L-氨基酸可以是L-赖氨酸、L-精氨酸或其组合。
在一种实施方式中，该微生物可以选自具有输出和/或生产L-氨基酸的能力的所有微生物(例如L-赖氨酸、L-精氨酸或其组合)。在一种实施方式中，该微生物可以是天然具有输出和/或生产L-氨基酸的能力的微生物，或是通过将突变引入没有或具有非常小的输出和/或生产L-氨基酸的能力的亲本菌株中而获得输出和/或生产L-氨基酸的能力的微生物。
例如，该微生物可以是选自由属于棒状杆菌属和埃希氏菌属的微生物组成的组中的至少一种，所述微生物天然具有输出和/或生产L-氨基酸的能力，或通过将突变引入没有或具有非常小的输出和/或生产L-氨基酸的能力的亲本菌株中而获得输出和/或生产L-氨基酸的能力。属于棒状杆菌属的微生物可以包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、嗜热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒状杆菌(Corynebacteriumefficiens)等，但不限于此。更具体地，属于棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌。属于埃希氏菌属的微生物可以是大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一种实施方式中，与属于相同物种的(同种的)未修饰微生物相比，引入了赖氨酸输出物突变的生产L-氨基酸的微生物可以具有增加的输出和/或生产L-氨基酸的能力。未修饰微生物可以指未引入赖氨酸输出物突变或引入赖氨酸输出物突变之前的微生物。
如本文所用，在引入赖氨酸输出物蛋白突变之前的微生物可以表示为宿主微生物或亲本菌株，以区别引入了赖氨酸输出物突变从而具有增加的输出和/或生产L-氨基酸的能力或获得输出的和/或生产L-氨基酸的能力的“生产L-氨基酸的微生物”。
如本文所用，术语“引入赖氨酸输出物突变”可以指用于将如上所述的突变的赖氨酸输出物引入宿主微生物的任何操作。
“引入了赖氨酸输出物的突变的生产L-氨基酸的微生物”可以指这样的微生物，所述微生物包含：
(1)如上所述的突变的赖氨酸输出物，例如从SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N末端开始的第65位氨基酸天冬酰胺(N)被其他氨基酸取代的多肽，
(2)编码该多肽的多核苷酸(突变的赖氨酸输出物)，或
(3)包含该多核苷酸的重组载体，
从而具有增加的输出和/或生产L-氨基酸的能力或获得输出和/或生产L-氨基酸的能力。
包含编码突变的赖氨酸输出物(例如从SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N末端开始的第65位氨基酸天冬酰胺(N)被其他氨基酸取代的多肽)的多核苷酸的微生物或包含多核苷酸的重组载体可以指：
(i)除自身的基因组外还包含多核苷酸或重组载体的微生物；和/或
(ii)包含作为内源赖氨酸输出物编码基因(例如LysE基因)的多核苷酸的微生物。
表述(ii)“包含作为内源赖氨酸输出物编码基因(例如LysE基因)的多核苷酸的微生物”可以指(a)通过替换内源赖氨酸输出物编码基因(例如LysE基因)而包含(***)该多核苷酸的微生物，和/或(b)通过基因编辑技术突变(修饰)内源赖氨酸输出物编码基因(例如LysE基因)从而具有该多核苷酸的核酸序列(即编码突变的赖氨酸输出物的核酸序列)的微生物。
在一种实施方式中，赖氨酸输出物或其编码基因可以源自宿主微生物(内源)或源自其他微生物(外源)。
在一种实施方式中，生产L-氨基酸的微生物可以包含编码如下的氨基酸序列的多核苷酸和/或含有该多核苷酸的重组载体，在该氨基酸序列中，从SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N末端开始的第65位氨基酸天冬酰胺(N)被选自由以下组成的组中的一种取代：谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)和精氨酸(R)。具体地，生产L-氨基酸的微生物可以包含编码如下的氨基酸序列的多核苷酸和/或含有该多核苷酸的重组载体，在该氨基酸序列中，从SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N末端开始的第65位氨基酸天冬酰胺(N)被谷氨酸(E)取代。更具体而言，生产L-氨基酸的微生物可以是包含编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸和/或含有该多核苷酸的重组载体的棒状杆菌属，例如谷氨酸棒状杆菌。例如，生产L-氨基酸的微生物可以是以登录号KCCM12641P保藏的微生物。
对于本文中所用的多核苷酸(可与“基因”互换使用)或多肽(可与“蛋白质”互换使用)，措辞“包含特定核酸或氨基酸序列”，“由特定核酸或氨基酸序列组成”和“表示为特定的核酸或氨基酸序列”是可互换的表述，其等同含义是多核苷酸或多肽基本上包含特定核酸或氨基酸序列。进一步地，这些措辞可被解释为“包含基本上等同的序列”(或“不排除引入以下突变”)，即特定核酸或氨基酸序列在多核苷酸或多肽保留其原始功能和/或期望功能这样的范围内的突变(缺失、取代、修饰和/或添加)。
在一种实施方式中，本文提供的核酸序列或氨基酸序列可包含通过常规突变方法(例如直接进化和/或定点诱变)获得的突变体，只要该突变体保留该序列的原始功能或期望功能即可。在一种实施方式中，多核苷酸或多肽“包含特定核酸或氨基酸序列或由特定核酸或氨基酸序列组成或由特定核酸或氨基酸序列表达”可以指基本上包含以下或基本上由以下组成的多核苷酸或多肽：(i)特定核酸或氨基酸序列，或(ii)具有60％或更高、70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高、或99.9％或更高的序列同一性的核酸或氨基酸序列，其中该多核苷酸或多肽保留其原始功能和/或期望功能。如本文所用，术语“原始功能”是指赖氨酸输出物功能本身(对于氨基酸序列来说)或编码具有赖氨酸输出物功能的蛋白的功能(对于核酸序列来说)，术语“期望功能”是指增加微生物中生产和/或输出L-氨基酸(例如L-赖氨酸、L-精氨酸或其组合)能力的功能或赋予微生物生产和/或输出L-氨基酸(例如L-赖氨酸、L-精氨酸或其组合)能力的功能。
对于本文所述的核苷酸序列，由于密码子的简并性或考虑到要表达蛋白的微生物优选的密码子，可以在编码区进行各种修饰，只要所述修饰不改变编码区表达的蛋白质(赖氨酸输出物)的氨基酸序列和/或功能即可。
在本公开中，术语“同源性”或“同一性”可以指两个给定氨基酸序列或碱基序列之间的关联程度，并可以以百分比表示。术语同源性和同一性经常可以互换使用。
保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法来确定，并且可以一起使用由所使用的程序建立的默认空位罚分。基本上，同源或同一的序列可以在中等或高度严格条件下，通常沿全长或整个序列的至少约50％、60％、70％、80％或90％彼此杂交。显然，对于杂交，多核苷酸不仅可以包括包含普通密码子的多核苷酸，而且也可以包括包含考虑了密码子简并性的密码子的多核苷酸。
任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性都可以通过已知的计算机算法来确定，该计算机算法如“FASTA”程序，使用例如由Pearson等人(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]:2444中给出的默认参数。可替代地，可以使用EMBOSS软件包(例如GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLEC BIOL 215]:403(1990)；大型计算机指南(Guide to Huge Computers),Martin J.Bishop,[ED.,]学术出版社,圣迭戈,1994,[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48:1073等)的Needlema程序(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)(版本5.0.0或后续版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。例如，可以使用国家生物技术信息中心的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性或同一性。
多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通过使用GAP计算机程序比较序列信息来确定，所述GAP计算机程序例如“Needleman等人.(1970),J Mol Biol.48:443”，例如如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中所述。总之，GAP程序可以通过将相似比对的符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短者的符号的总数来定义值。GAP程序的默认参数可以包括(1)“Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14:6745”的二进制比较矩阵(包含值为1表示同一性，值为0表示非同一性)和如Schwartz和Dayhoff编辑,蛋白质序列与结构图集(Atlas Of Protein Sequence And Structure),国家生物医学研究基金会(National Biomedical Research Foundation),第353-358页(1979)中所述的“Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14:6745”的加权比较矩阵(或EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)替代矩阵)；(2)对每个空位罚分3.0，对每个空位中每个符号再罚分0.10(或对空位开放的罚分10，对空位延伸的罚分0.5)；(3)末端空位不罚分。
另外，任意两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以通过在限定的严格条件下通过Southern杂交比较序列来确认，并且可以通过相关技术范围内的方法和本领域技术人员熟知的方法来确定适当的杂交条件(例如，J.Sambrook等人,分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual),第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989；F.M.Ausubel等人,分子生物学实验方案(Current Protocols inMolecular Biology),John Wiley和Sons公司,纽约)。
为了引入多核苷酸或载体，本领域技术人员可以适当地采用本领域已知的转化方法。如本文所用，术语“转化”可以指这样的作用，通过该作用将携带编码靶蛋白的多核苷酸的载体(赖氨酸输出物)引入宿主微生物以在宿主细胞中表达由该多核苷酸编码的蛋白。所引入的多核苷酸可以位于宿主微生物的染色体内部或外部，只要该多核苷酸在宿主微生物中表达即可。另外，该多核苷酸可包含用于编码靶蛋白的DNA和/或RNA。可以采用任何递送手段，只要该递送手段能够在宿主微生物中引入和表达多核苷酸。例如，多核苷酸可以采取包含自主表达必需的所有元件的表达盒的形式，以便将多核苷酸引入宿主微生物中。表达盒可包含可操作地连接至多核苷酸的常规表达调控元件，例如启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和/或翻译终止信号。表达盒可以是可自身复制的表达载体。另外，多核苷酸本身可以被引入宿主细胞中并且可以可操作地连接至在宿主细胞中表达所必需的序列。如本文所用，术语“可操作地连接”可以指表达调控元件(例如启动子)和多核苷酸之间的功能性连接，使得该表达调控元件可以控制(例如起始)编码靶蛋白(赖氨酸输出物)的多核苷酸的转录。可以使用本领域已知的遗传重组技术来实现可操作的连接，所述遗传重组技术例如典型的位点特异性DNA切割和连接，但不限于此。
可以采用任何引入方法，只要该方法允许将多核苷酸转化到宿主微生物中即可。可根据宿主微生物适当地选择本领域已知的转化技术。本领域已知的转化技术的实例可以包括电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)介导的摄取、DEAE-葡聚糖介导的递送、阳离子脂质体法、脂质体转染和乙酸锂-DMSO法，但不限于此。
本领域技术人员可以选择合适的引入突变的方法，例如将多核苷酸掺入宿主细胞的基因组(染色体)中或引入使内源基因(例如，LysE基因)编码突变的赖氨酸输出物的突变。例如，可以使用RNA引导的核酸内切酶***来引入突变，但不限于此，所述RNA引导的核酸内切酶***例如选自由以下组成的组中的至少一种：(a)RNA引导的核酸内切酶(例如Cas9蛋白等)、其编码基因或携带该基因的载体；和(b)向导RNA(即单链向导RNA(sgRNA)等)、其编码DNA或携带该DNA的载体(例如RNA引导的核酸内切酶蛋白和向导RNA的混合物)、复合物(例如核糖核蛋白(RNP))和载体(例如携带RNA引导的核酸内切酶编码基因的重组载体和编码向导RNA的DNA等)。
另一种实施方式提供了一种增加微生物的输出和/或生产L-氨基酸的能力或赋予微生物输出和/或生产L-氨基酸的能力的方法，包括引入(转化)突变的赖氨酸输出物，例如SEQ ID NO:1的氨基酸序列中从N末端开始的第65位氨基酸天冬酰胺(Asn，N)被其他氨基酸取代的多肽、编码该多肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的重组载体。
突变的赖氨酸输出物、多核苷酸和微生物如上所述。
如本文所用，术语“载体”可以指含有编码靶蛋白的核苷酸序列的DNA构建体，该核苷酸序列可操作地连接至能够影响靶蛋白在合适宿主中表达的合适调控序列。这样的调控序列可以包含能够启动转录的启动子，任选的控制这样的转录的操纵子序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和/或控制转录和/或翻译终止的序列。一旦转化成合适的宿主微生物，载体就可以独立于宿主基因组复制并用于表达靶蛋白，或者可以整合到宿主微生物的基因组中。
本文中可以使用任何载体，只要该载体在宿主细胞中复制，则不对其进行特别限制。所述载体可以选自常用的载体。这样的常用的载体的实例可以包括可以是天然形式或重组形式的质粒、粘粒、病毒、噬菌体等。例如，噬菌体载体或粘粒载体以pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A为例。质粒载体可以衍生自pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系和pET系。载体的实例可以包括但不限于pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC等。
本文可用的载体可以是已知的表达载体和/或用于将多核苷酸掺入宿主细胞的染色体中的载体。可以使用本领域已知的任何方法将多核苷酸掺入宿主细胞的染色体中，所述方法例如同源重组，但不限于此。载体可以进一步携带选择标记以用于确定目的基因是否被掺入染色体中。选择标记用于选择用载体转化的细胞，即确定多肽的掺入，并且可以选自赋予选择性表型的基因，所述选择性表型例如耐药性、营养缺陷型、细胞毒性耐药性和表达表面蛋白。在将选择剂应用于细胞的情况下，只有能够表达选择标记的细胞可以存活或表达独特的表型，从而可以选择转化的细胞。
另一种实施方式提供了生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养生产L-氨基酸的微生物的步骤。该方法可以进一步包括在培养步骤之后，从培养的微生物、培养基或这两者中回收L-氨基酸的步骤。
在该方法中，培养微生物的步骤可以通过已知的分批培养方法、连续培养方法、分批补料培养方法等进行，但不特别限制于此。在此，可以将培养条件使用碱性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)维持在最佳pH(例如pH为5至9，特别地pH为6至8，最特别地pH为6.8)，或通过向细胞培养物中供应氧气或含氧气体混合物将培养条件维持在需氧条件，但不特别限制于此。培养温度可以维持在20至45℃，特别是25至40℃，并且细胞可以培养约10至160小时，但不限于此。通过培养产生的L-氨基酸(例如L-赖氨酸、L-精氨酸或其组合)可以输出到培养基中或保留在细胞内。
可用于培养的培养基可以包含：选自糖和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如甘油和乙醇)和有机酸(例如乙酸)中的至少一种作为碳源；选自含氮有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、豆粕粉和尿素)、无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)中的至少一种作为氮源；选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与其对应的含钠盐中的至少一种作为磷源；和选自其他必需的促进生长的物质，如金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和/或维生素中的至少一种，但不限于此。
在回收L-氨基酸(例如L-赖氨酸、L-精氨酸或其组合)的步骤中，可以根据培养方法使用本领域已知的合适方法从培养基、培养物或微生物中收集期望氨基酸。举例来说，可以使用选自离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC中的至少一种方法进行回收步骤，并且可以使用本领域已知的任何合适的方法从培养基或微生物中回收期望的丙烯酸。该方法可以进一步包括在回收步骤之前、同时或之后的纯化步骤。
有益效果
将突变引入内源lysE基因使得赖氨酸生产菌株的L-氨基酸(例如L-赖氨酸、L-精氨酸或其组合)的赖氨酸生产潜力增加。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开，但是这些实施例仅用于说明性目的，并不旨在限制本公开的范围。对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以在不脱离本公开的精神的情况下修改以下描述的实施例。
实施例1：构建用于将突变引入到lysE基因的ORF中的载体文库
为了找到具有改善的L-赖氨酸输出能力的酶，如下构建用于获得突变的lysE基因的载体文库。
使用GenemorphII随机诱变试剂盒(Stratagene)，将突变引入包含lysE基因的DNA片段(711bp；SEQ ID NO:2)，其中引入了DNA片段的0至4.5个突变/kb。使用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032(WT)的基因组DNA作为模板并使用表1中的SEQ ID NO:5和6的引物进行易错PCR。针对包含WT菌株的基因组DNA(500ng)、引物(每种125ng)、Mutazyme II反应缓冲液(1x)、dNTP混合物(40mM)和Mutazyme II DNA聚合酶(2.5U)的反应溶液，通过在94℃下变性2分钟，然后以94℃下变性1分钟，56℃下退火1分钟，72℃下聚合30秒，共进行30个循环，然后在72℃下聚合10分钟进行PCR。将如上获得的DNA片段与限制性酶BamHI-HF(NEB)在37℃下反应1小时，并与pECCG117载体连接(KR专利第10-0057684号)，将所述载体用CIP(NEB)酶在37℃下处理30分钟，转化到大肠杆菌DH5α中，然后涂布在补充有卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基上。
在选择20个转化体菌落后，获得质粒并进行核酸序列分析，以确认突变被以0.5个突变/kb的频率引入到各个基因座中。最后，收集到约10,000个转化的大肠杆菌菌落，并使用质粒制备试剂盒(QIAGEN)从中提取质粒，并将该质粒命名为p117-lysE(mt)文库。另外，制备了将野生型lysE引入pECCG117载体的载体作为用于筛选的对照。如上所述，使用SEQID NO:5和6的引物通过PCR获得野生型lysE基因片段，以制备p117-lysE(WT)载体。通过在94℃下变性2分钟，然后以94℃下变性1分钟，56℃下退火1分钟，72℃下聚合30秒，共进行30个循环，然后在72℃下聚合10分钟进行PCR。
表1总结了所使用的引物的核酸序列：[表1]
引物 核酸序列(5'→3')
SEQ ID NO:5 CGGGATCCATGGTGATCATGGAAATCTTCATTAC
SEQ ID NO:6 AAGGATCCCTAACCCATCAACATCAGTTTG
实施例2：引入载体文库的菌株的产生和筛选
为了产生野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032缺失lysE基因的菌株，制备了用于lysE基因缺失的载体。具体地，通过将位于lysE基因的5'和3'末端的DNA片段(各600bp)与pDZ载体连接来制备重组载体(US 9109242 B2)。基于lysE基因的核酸序列(SEQ ID NO:2)合成了SEQ ID NO:7和8的引物，并且对应于距它们600bp的位置分别合成了SEQ ID NO:9和10的引物(表2)。
使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板并使用SEQ ID NO:7和9的引物进行PCR，制备lysE基因的5’末端的DNA片段。类似地，使用SEQ ID NO:8和10的引物进行PCR，制备lysE基因的3’末端的DNA片段。如下进行PCR：在94℃下变性2分钟，然后以94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃聚合30秒，共进行30个循环，然后在72℃聚合10分钟。将扩增的DNA片段用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，然后用作用于载体制备的***DNA片段。
使用融合克隆试剂盒将如上通过PCR扩增的***DNA片段和用限制性酶XbaI处理并在65℃下加热20分钟的pDZ载体(US 9109242 B2)连接，转化到大肠杆菌DH5α中，然后涂布在补充有卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基上。通过使用SEQ ID NO:7和8的引物进行PCR而将靶基因***了载体，选择用所述载体转化的菌落，然后通过常规的质粒提取方法从中获得了质粒，并将该质粒命名为pDZ-ΔlysE。
表2总结了所使用的引物的核酸序列：[表2]
引物 核酸序列(5'→3')
SEQ ID NO:7 GTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCTGGAAAGGCTCTTTACG
SEQ ID NO:8 GCCTGCAGGTCGACTCTAGATCTAGTTTCCCATCAACCATGT
SEQ ID NO:9 AAGTACTTCCATAGGTCACGTTTTCGCGGGTTTTGGAATC
SEQ ID NO:10 GATTCCAAAACCCGCGAAAACGTGACCTATGGAAGTACTT
通过电脉冲法(Van der Rest等人,Appl.Microbiol.Biotecnol.52:541-545,1999)将制备的载体pDZ-ΔlysE转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中，以制备其中lysE基因通过同源染色体重组而缺失的突变菌株。将获得的其中lysE基因缺失的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌13032::ΔlysE。
通过电脉冲法用实施例1中制备的p117-lysE(mt)文库转化13032::ΔlysE菌株，并涂布在补充有卡那霉素(25mg/l)的复合平板培养基上，获得约1,000个菌落。为了制备对照，如上所述用p117-lysE(WT)载体转化13032::ΔlysE菌株。
<复合平板培养基(pH 7.0)>
葡萄糖10g，蛋白胨10g，牛肉提取物5g，酵母提取物5g，脑心浸液18.5g，氯化钠2.5g，尿素2g，山梨糖醇91g，琼脂20g(每升蒸馏水)。
将获得的13032::ΔlysE_p117(lysE(WT))(对照)和13032::ΔlysE_p117(lysE(mt))文库分别接种在包含400μl种子培养基的96孔圆底深孔板(Bioneer)上，并在平板振荡培养箱(TAITEC)中在32℃和12000rpm的条件下培养约12个小时。
<种子培养基(pH 7.0)>
葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，尿素1.5g，KH2PO4 4g，K2HPO48g，MgSO4·7H2O 0.5g，生物素100μg，盐酸硫胺素1,000μg，泛酸钙2,000μg，烟酰胺2,000μg(每升蒸馏水)。
将上述温育的1000个菌落用补充有100g/L的L-赖氨酸盐酸盐的复合平板培养基连续稀释，并进行MIC(最低抑制浓度)测试，从而得到与对照菌株相比MIC显著增加的9个菌落。对每个菌落进行二次筛选。将每个菌落在包含400μl种子培养基的96孔圆底深孔板(Bioneer)上培养，并在平板振荡培养箱(TAITEC)中在32℃和12000rpm的条件下培养约12个小时。通过将最终培养菌落的初始光密度(OD)调整为相同值，用补充有100g/L L-赖氨酸盐酸盐的复合平板培养基进行连续稀释以及进行MIC测试，来进行二次筛选。结果，选择了与引入野生型lysE基因的对照菌株相比MIC显著增加的一个菌落，并将该菌落命名为13032::lysE(mt)，将该菌落用于以下实施例。
实施例3：突变lysE基因的测序
为了分析被***到实施例2中所选择的菌株13032::lysE(mt)中的基因的核酸序列，使用SEQ ID NO:11和12的引物通过PCR扩增了基因片段。在与实施例1相同的条件下进行PCR，使用GeneAll Expin GEL SV试剂盒(首尔，韩国)获得扩增的DNA片段，并进行核酸序列分析。
表3总结了所使用的引物的核酸序列：[表3]
引物 核酸序列(5'→3')
SEQ ID NO:11 CCTTCGAAGCTGCCTTCATC
SEQ ID NO:12 CTGGACAACAGCCTTGATTC
扩增的基因的核酸序列分析结果表明，13032::lysE(mt)菌株包含突变的lysE基因，其中从lysE基因ORF的起始密码子开始的第193至195位的核酸序列“AAT”(WT)被“GAA”取代，从而编码从野生型序列(SEQ ID NO:1)的N末端开始的第65位氨基酸天冬酰胺(N)被谷氨酸(E)取代的L-赖氨酸输出物突变体。
实施例4：制备用于引入突变的lysE基因的载体和引入了突变的lysE基因的菌株
为了引入在实施例3中证实的N65E突变，如下制备重组载体。使用从WT菌株(ATCC13032)中提取的基因组DNA为模板，合成表4中所示的SEQ ID NO:13和14的引物，其中限制性酶XbaI的限制性酶切位点分别***5’片段和3’片段，所述5’片段和3’片段分别在上游和下游方向距lysE基因(SEQ ID NO：2)的第193至195位区域大约600bp。另外，SEQ IDNO:15和16的引物用于在距该区域的两个末端600bp的位置处引入核苷酸取代突变。
表4总结了所使用的引物的核酸序列：[表4]
引物 核酸序列(5'->3')
SEQ ID NO:13 GTACCCGGGGATCCTCTAGAGCTCCACCCCAAGAAGCT
SEQ ID NO:14 GCCTGCAGGTCGACTCTAGACGAGTTGGAGGCGATCG
SEQ ID NO:15 AGCACGATCGGCGCGGCTTCGGACAAAAGATCAACGCCC
SEQ ID NO:16 GCGTTGATCTTTTGTCCGAAGCCGCGCCGATCGTG
具体地，通过将位于lysE基因的5'和3'末端的DNA片段(各600bp)与pDZ载体连接来制备重组载体(US 9109242 B2)。使用WT(野生型)菌株的基因组DNA作为模板并使用SEQID NO:13和15的引物进行PCR，以制备lysE基因的5’末端的基因片段(位于lysE基因的5'末端)。如下进行PCR：在94℃下变性2分钟，然后以94℃下变性1分钟，56℃下退火1分钟，72℃下聚合30秒，共进行30个循环，然后在72℃下聚合10分钟。以相同的方式，使用SEQ ID NO:14和16的引物进行PCR，以制备lysE基因的3'末端片段(位于lysE基因的3'末端)。将扩增的DNA片段用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，然后用作用于载体制备的***DNA片段。
使用融合克隆试剂盒将如上通过PCR扩增的***DNA片段和经限制性酶XbaI处理并在65℃下加热20分钟的pDZ载体连接，转化到大肠杆菌DH5α中。然后，将转化的菌株涂布在补充有卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基上。通过使用SEQ ID NO:13和14的引物进行PCR而将靶基因***载体，对用所述载体转化的菌落进行选择，然后通过常规的质粒提取方法从中获得质粒，并将该质粒命名为pDZ-lysE(N65E)。
通过电脉冲法将制备的载体pDZ-lysE(N65E)转化到具有赖氨酸生产潜力的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P菌株(KR专利第10-0159812号)中。将这样获得的其中异源核苷酸取代突变(N65E)被引入到lysE基因中的菌株命名为KCCM11016P::lysE(N65E)。
实施例5：lysE(N65E)突变菌株的L-赖氨酸生产潜力的测定
按照以下方式培养实施例4中制备的KCCM11016P::lysE(N65E)菌株和亲本菌株KCCM11016P(N65)，以便测量光密度(OD)值，L-赖氨酸生产收率和糖消耗速率。首先，将每种菌株接种到含有25ml种子培养基的250ml角挡板烧瓶(corner-baffle flask)中，然后在30℃下以200rpm振荡培养20小时。此后，将1ml种子培养液接种到含有24ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，然后在32℃下以200rpm振荡培养72小时。种子培养基和生产培养基的组成如下，培养结果在下表4中给出。
<种子培养基(pH 7.0)>
葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，尿素1.5g，KH2PO4 4g，K2HPO48g，MgSO4·7H2O 0.5g，生物素100μg，盐酸硫胺素1,000μg，泛酸钙2,000μg，烟酰胺2,000μg(每升蒸馏水)。
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖90g，(NH4)2SO4 30g，大豆蛋白20g，甜菜来源的糖蜜10g，KH2PO41.1g，MgSO4·7H2O 1.2g，生物素2mg，盐酸硫胺素10mg，泛酸钙10mg，烟酰胺30mg，MnSO4 20mg，FeSO4 20mg，ZnSO4 1mg，CuSO4 1mg，CaCO330g(每升蒸馏水)。
[表5]
亲本菌株和lysE(N65E)突变菌株的OD值(562nm)、L-赖氨酸生产率和糖消耗速率
Figure BDA0003033001570000161
与亲本菌株KCCM11016P相比，引入lysE基因突变的KCCM11016P::lysE(N65E)突变体显示OD值略有降低，L-赖氨酸生产收率提高了约12.1％，维持了相似的糖消耗速率。这些结果证明实施例2中选择的lysE(N65E)突变是增强L-赖氨酸输出物的输出能力的突变。赖氨酸生产潜力增强的KCCM11016P::lysE(N65E)菌株(称为‘谷氨酸棒状杆菌CM03-1012’)于2019年12月13日保藏于位于韩国首尔西大门区弘济内的韩国微生物保藏中心，保藏编号为KCCM12641P。
实施例6：制备包含突变的lysE基因的菌株，该突变的lysE基因编码包含在第65位天冬酰胺以外的氨基酸的氨基酸序列
在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中，第65位氨基酸被除天冬酰胺(野生型)和谷氨酸两者以外的其他氨基酸(18种氨基酸)中的每一种取代，其活性在实施例5中得到证实。为了引入核苷酸取代突变以编码这样的18种异源氨基酸取代突变体中的每一种，以如下方式制备了每种重组载体。
使用从WT菌株(ATCC13032)中提取的基因组DNA为模板，合成SEQ ID NO:17至52(如表6所示)的引物，所述引物用于将核苷酸取代突变***5’片段和3’片段，所述5’片段和3’片段分别在上游和下游方向距lysE基因的第193至195位区域大约600bp。具体地，通过将位于lysE基因的5'和3'末端的DNA片段(各600bp)与pDZ载体连接来制备重组载体(US9109242 B2)。使用WT(野生型)菌株的基因组DNA作为模板并使用SEQ ID NO:13和17的引物进行PCR，以制备lysE基因的5’末端的基因片段(位于lysE基因的5'末端)。如下进行PCR：在94℃下变性2分钟，然后以94℃下变性1分钟，56℃下退火1分钟，72℃下聚合30秒，共进行30个循环，然后在72℃下聚合10分钟。以相同的方式，使用SEQ ID NO:14和18的引物进行PCR，以制备lysE基因的3'末端片段(位于lysE基因的3'末端)。将扩增的DNA片段用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，然后用作用于载体制备的***DNA片段。
使用融合克隆试剂盒将如上通过PCR扩增的***DNA片段和经限制性酶XbaI处理并在65℃下加热20分钟的pDZ载体连接，并转化到大肠杆菌DH5α中。然后，将转化的菌株涂布在补充有卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基上。通过使用SEQ ID NO:13和14的引物进行PCR而将靶基因***载体，对用所述载体转化的菌落进行选择，然后通过常规的质粒提取方法从中获得质粒，并将该质粒命名为pDZ-lysE(N65G)。以相同的方式，使用引物SEQ ID NO:13和19以及SEQ ID NO:14和20制备pDZ-lysE(N65A)。使用引物SEQ ID NO:13和21以及SEQID NO:14和22制备pDZ-lysE(N65V)。使用引物SEQ ID NO:13和23以及SEQ ID NO:14和24制备pDZ-lysE(N65L)。使用引物SEQ ID NO:13和25以及SEQ ID NO:14和26制备pDZ-lysE(N65I)。使用引物SEQ ID NO:13和27以及SEQ ID NO:14和28制备pDZ-lysE(N65F)。使用引物SEQ ID NO:13和29以及SEQ ID NO:14和30制备pDZ-lysE(N65P)。使用引物SEQ ID NO:13和31以及SEQ ID NO:14和32制备pDZ-lysE(N65M)。使用引物SEQ ID NO:13和33以及SEQ IDNO:14和34制备pDZ-lysE(N65W)。使用引物SEQ ID NO:13和35以及SEQ ID NO:14和36制备pDZ-lysE(N65S)。使用引物SEQ ID NO:13和37以及SEQ ID NO:14和38制备pDZ-lysE(N65T)。使用引物SEQ ID NO:13和39以及SEQ ID NO:14和40制备pDZ-lysE(N65Q)。使用引物SEQ ID NO:13和41以及SEQ ID NO:14和42制备pDZ-lysE(N65Y)。使用引物SEQ ID NO:13和43以及SEQ ID NO:14和44制备pDZ-lysE(N65C)。使用引物SEQ ID NO:13和45以及SEQ IDNO:14和46制备pDZ-lysE(N65D)。使用引物SEQ ID NO:13和47以及SEQ ID NO:14和48制备pDZ-lysE(N65H)。使用引物SEQ ID NO:13和49以及SEQ ID NO:14和50制备pDZ-lysE(N65K)。使用引物SEQ ID NO:13和51以及SEQ ID NO:14和52制备pDZ-lysE(N65R)。
表6总结了所使用的引物的核酸序列：[表6]
Figure BDA0003033001570000181
Figure BDA0003033001570000191
通过电脉冲法将每种制备的载体转化到具有赖氨酸生产潜力的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P菌株(KR专利第10-0159812号)中。将如上获得的异源核苷酸取代突变被引入到lysE基因中18种菌株分别命名为KCCM11016P::lysE(N65G)、KCCM11016P::lysE(N65A)、KCCM11016P::lysE(N65V)、KCCM11016P::lysE(N65L)、KCCM11016P::lysE(N65I)、KCCM11016P::lysE(N65F)、KCCM11016P::lysE(N65VP)、KCCM11016P::lysE(N65M)、KCCM11016P::lysE(N65W)、KCCM11016P::lysE(N65S)、KCCM11016P::lysE(N65T)、KCCM11016P::lysE(N65Q)、KCCM11016P::lysE(N65Y)、KCCM11016P::lysE(N65C)、KCCM11016P::lysE(N65D)、KCCM11016P::lysE(N65H)、KCCM11016P::lysE(N65K)和KCCM11016P::lysE(N65R)。
实施例7：lysE突变菌株的L-赖氨酸生产潜力的测定
以与实施例5相同的方式培养实施例4中制备的亲本菌株KCCM11016P(N65)、菌株KCCM11016P::lysE(N65E)和实施例6中制备的18种菌株，以便测量OD值、L-赖氨酸生产收率和糖消耗速率。获得的结果示于表7：
[表7]
亲本菌株和lysE突变菌株的OD值(562nm)、L-赖氨酸生产率和糖消速耗率
Figure BDA0003033001570000201
与亲本菌株KCCM11016P相比，实施例5中选择的KCCM11016P::lysE(N65E)-突变体显示出OD值稍微降低，L-赖氨酸生产收率提高了约15.7％，维持了相似的糖消耗速率，实施例6中制备的所有18种菌株也显示出OD值相等或略微降低，并且L-赖氨酸的生产收率增加最大约21.7％，维持了相似的糖消耗速率。这些结果证明，在lysE中对应于第65位氨基酸天冬酰胺的位置对增强L-赖氨酸的输出能力是重要的。
实施例8：选择的lysE突变菌株的L-赖氨酸生产潜力的测定
为了测定lysE基因突变对其他具有L-赖氨酸生产潜力的亲本菌株的影响，将另一种L-赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P(N65)(US 9109242B2)用作亲本菌株来引入4种突变中的每一种，所述4种突变包括实施例3中选自的lysE(N65E)突变和选自实施例7的突变中的3种突变。将实施例4制备的pDZ-lysE(N65E)以及实施例6中制备的pDZ-lysE(N65K)、pDZ-lysE(N65Q)和pDZ-lysE(N65L)这4种载体中的每一种通过电脉冲法转化到谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P菌株中，以制备4种突变菌株KCCM10770P::lysE(N65E)、KCCM10770P::lysE(N65K)、KCCM10770P::lysE(N65Q)和KCCM10770P::lysE(N65L)。以与实施例5相同的方式培养亲本菌株KCCM10770P和4种突变菌株，以便测量OD值、L-赖氨酸生产收率和糖消耗速率。获得的结果示于表8：
[表8]
亲本菌株和lysE突变菌株的OD值(562nm)、L-赖氨酸生产率和糖消耗速率
Figure BDA0003033001570000211
如表8中所示，与亲本菌株相比，通过将实施例5中选择的突变(即SEQ ID NO:1的第65位氨基酸被谷氨酸取代)引入赖氨酸生产菌株KCCM10770P(亲本菌株)而制备的突变菌株显示出相似的糖消耗速率，增加的OD值和增加了约160.3％的L-赖氨酸生产收率。另外，与亲本菌株相比，另外3种突变菌株也显示出相似的糖消耗速率，增加的OD值和增加了约3.8％至17.9％的L-赖氨酸生产收率。这些结果提示了，尽管OD变化量和L-赖氨酸生产收率的增加根据亲本菌株而不同，但是lysE的第65位氨基酸天冬酰胺的位置在改善L-赖氨酸的输出能力中起重要作用，这与实施例7的结果一致。
实施例9：选择的lysE突变菌株的L-精氨酸生产潜力的测定
为了测定突变的L-赖氨酸输出物对L-精氨酸输出能力的影响，通过电脉冲法将实施例4中制备的pDZ-lysE(N65E)载体转化到L-精氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P(N65)菌株(US 8034602 B2)中。将这样制备的其中异源核苷酸取代突变被引入到lysE基因中的突变菌株命名为KCCM10741P::lysE(N65E)。以如下方式培养亲本菌株KCCM10741P和制备的KCCM10741P::lysE(N65E)菌株，以测量OD值、L-精氨酸生产收率和糖消耗速率。首先，将每种菌株接种到含有25ml种子培养基的250ml角挡板烧瓶(corner-baffle flask)中，然后在30℃下以200rpm振荡培养20小时。此后，将1ml种子培养液接种到含有24ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，然后在32℃下以200rpm振荡培养72小时。种子培养基和生产培养基的组成如下，培养结果在下表9中给出。
<种子培养基(pH 7.0)>
葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，尿素1.5g，KH2PO4 4g，K2HPO48g，MgSO4·7H2O 0.5g，生物素100μg，盐酸硫胺素1mg，泛酸钙2mg，烟酰胺2mg(每升蒸馏水)。
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖60g，硫酸铵30g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 2g，CSL(玉米浆)15g，NaCl 10g，酵母提取物5g，生物素100mg(每升蒸馏水)。
[表9]
亲本菌株和lysE(N65E)突变菌株的OD值(562nm)、精氨酸生产率和糖消耗速率
Figure BDA0003033001570000221
如表9所示，与亲本菌株KCCM10741P相比，引入lysE突变的KCCM10741P::lysE(N65E)菌株显示出相似的OD值和糖消耗速率，以及增加了约11.8％的L-精氨酸生产收率。这些结果表明，lysE(N65E)突变是能够增强L-精氨酸输出能力以及L-赖氨酸输出能力的突变。
根据以上描述，本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本公开可以以其他特定形式来体现。在这方面，应当理解，上述实施方式在所有方面都是说明性的，而非限制性的。本申请的范围应被解释为在本申请的范围之内，所有改变或修改均源自所附权利要求书的含义和范围以及其等同物而非具体实施方式。
(中文译文)
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收件人：CJ第一制糖株式会社
韩国首尔市中区东湖路330号
CJ第一制糖中心
(邮编)100-400
Figure BDA0003033001570000231
上述翻译文本与原文没有相违之处
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PCT/RO/134表
Figure QDA0003033001650000011

Claims (16)

1.一种多肽，其中，从SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N末端开始的第65位氨基酸天冬酰胺被其他氨基酸取代。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述第65位氨基酸天冬酰胺被谷氨酸、精氨酸、缬氨酸、赖氨酸、组氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、色氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺或甘氨酸取代。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其具有L-氨基酸输出物的活性。
4.一种多核苷酸，其编码权利要求1或2所述的多肽。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其由SEQ ID NO：4的核酸序列表示。
6.一种重组载体，其包含权利要求4所述的多核苷酸，
7.一种生产L-氨基酸的微生物，其包含权利要求1所述的多肽、编码所述多肽的多核苷酸或包含所述多核苷酸的重组载体。
8.根据权利要求7所述的生产L-氨基酸的微生物，其中，所述多肽具有L-氨基酸输出物的活性。
9.根据权利要求7所述的生产L-氨基酸的微生物，其中，所述多肽或所述多核苷酸源自属于生产L-氨基酸的微生物的相同物种的微生物。
10.根据权利要求7所述的生产L-氨基酸的微生物，其中，所述微生物属于棒状杆菌属(Corynebacterium)或埃希氏菌属(Escherichia)。
11.根据权利要求7所述的生产L-氨基酸的微生物，其中，所述微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的生产L-氨基酸的微生物，其与未修饰的微生物相比，具有改善的L-氨基酸的输出能力或生产潜力。
13.根据权利要求8所述的生产L-氨基酸的微生物，其中，所述L-氨基酸是L-赖氨酸、L-精氨酸或其组合。
14.一种生产L-氨基酸的方法，所述方法包括：
在培养基中培养权利要求7至11中任一项所述的生产L-氨基酸的微生物。
15.根据权利要求14所述的生产L-氨基酸的方法，进一步包括：在培养步骤之后，
从培养的微生物、培养基或两者中回收L-氨基酸。
16.根据权利要求14所述的生产L-氨基酸的方法，其中，所述L-氨基酸是L-赖氨酸、L-精氨酸或其组合。
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