KR102098122B1

KR102098122B1 - 피리미도[4,5-b]인돌 유도체 및 조혈 줄기 세포의 증식에서의 이의 용도

Info

Publication number: KR102098122B1
Application number: KR1020147023818A
Authority: KR
Inventors: 가이 소바지우; 이베스 갸호; 헤쟝 뤼엘; 스테판 진그라스; 이만 파레
Original assignee: 유니버시떼 드 몬트리얼
Priority date: 2012-01-27
Filing date: 2013-01-25
Publication date: 2020-04-07
Also published as: JP2015504902A; BR112014018524A2; PT2807165T; CN104144931A; RS59002B1; HUE044070T4; HUE044070T2; US9409906B2; BR112014018524A8; HK1203945A1; AU2013212457A1; EP2807165B1; US20150011543A1; EP2807165A4; LT2807165T; CN104144931B; WO2013110198A1; IL233587B; US20160222017A1; US20170334904A1

Abstract

피리미도[4,5-b]인돌 유도체를 제공한다. 이들 화합물은 조혈 줄기 세포 집단, 특히 인간 조혈 줄기 세포 집단을 증식시키는데 사용가능하다. 또한, 본 화합물은 조혈 줄기 세포와 관련된 질환을 의학적으로 치료하는데 유용하다.

Description

피리미도[4,5-b]인돌 유도체 및 조혈 줄기 세포의 증식에서의 이의 용도 {PYRIMIDO[4,5-B]INDOLE DERIVATIVES AND USE THEREOF IN THE EXPANSION OF HEMATOPOIETIC STEM CELLS}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2012년 1월 27일자 미국 가출원 61/591,521호에 대해 우선권을 주장한다. 이 출원의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 피리미도[4,5-b]인돌 유도체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 조혈 줄기 세포를 증식시키기 위한 피리미도[4,5-b]인돌 유도체의 용도에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 조혈 줄기 세포와 관련된 질환에 대한 의학적 치료에 관한 것이다.

조혈 줄기 세포 (HSC)의 주 공급원은 골수와 제대혈 (UCB)이다. HSC는, 조혈 악성 질환, 골수기능 부전 병태, 전세계적으로 문제가 되고 있는 다양한 선천성 질환들 (예, 겸상 적혈구 빈혈 및 지중해 빈혈) 및 루푸스 등의 자가면역 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 가장 효과적인 치료 전략들 중 한가지를 구성하는, (자가 또는 동종) 이식 상황들에 사용된다. 그러나, 이러한 생명 구조 또는 삶을 개선하는 치료 기회는 시술이 안전하고 성공적으로 이루어질 수 있을 정도로 세포를 충분히 생체외에서 증식시키지 못하기 때문에, 세계적으로 수많은 사람들에게 이용될 수 없다. 보다 구체적으로, 환자 3명 당 한명은 인간 백혈구 항원 (HLA)이 동일한 공여자를 찾을 수 없기 때문에 이식 기회를 갖지 못하게 될 것이다. 환자 3명 당 나머지 2명은, 성공적인 이식을 위한 그래프트 (즉, 제대혈 또는 자가)에 이용가능한 HSC가 너무 적기 때문에, 이식에까지 도달하지 못할 것이다. 골수 이식의 안전성과 효과는 생착에 이용가능한 HSC 및 선조 세포의 갯수에 의해 직접적으로 결정된다. 더 많이 주입할 수록, 조혈 기능의 복구는 더 빨라지며, 혈소판 부족으로 인한 출혈 또는 과립구 부족으로 인한 감염이 발생할 위험 가능성이 줄어든다. 충분한 HSC를 제공하는데 있어서의 어려움은, (전세계적으로 이환과 사망의 주된 유전학적 요인) 주요 선천성 혈액 장애에 대한 유전자 치료 측면에서와 같이, 골수 비소멸성 조건 형성이 바람직한 경우에, 더욱 고조된다.

성인의 경우, HSC는 주로 골수에 위치하고 있어, 자가 또는 동종 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)을 위해 혈장 교환으로 수집하기 전에 순환계로 유입되도록 유동시켜야 한다. CD34+ 세포의 투여량 (dose)이 조혈 회복의 성공과 속도에 영향을 미치기 때문에, HSC의 서로게이트 마커 (surrogate marker)인 CD34+ 세포를 적절한 수로 수집하는 것이 가장 중요하다. 몇몇 보고들에서, 주입된 CD34+ 세포의 투여량을 높이는 것은 독립적으로 생존성 개선을 예견하는 것으로 제시되고 있다.

가장 흔히 사용되는 2가지 유동 요법 (mobilizing regimen)은 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 및 G-CSF + 화학요법이다. 미국 식의약청 (FDA)으로부터 2008년, 그리고 캐나다 보건국으로부터 2011년에 승인받은 CXCR4 길항제인 플레리사포르 (Plerixafor)는 G-CSF와 함께 투여하였을 때 HSC의 유동성을 강화한다. 현행 유동 요법을 이용하여 충분한 수의 CD34+ 세포/kg를 수득하지 못하는 경우는, 환자의 최대 15%에 달하는 것으로 추산된다 (질환에 따라 차이가 있음). 혈액암에 자가 HSCT를 사용하는 것은, 정상 및 암 줄기 세포들이 모두 골수에 존재하므로 함께 유동될 수 있다는 점에서 대게 제한적이다.

동종 HSCT + BM 또는 mPBSC는 또 다른 이식 대안책이다. 그러나, 이러한 유형의 이식에 알맞은 환자들 중 약 1/3 내지 1/4은 적합한 공여자를 찾을 수 없다. 이식을 받게되는 환자들의 경우에는, 이식 편대 숙주 질환, 재발 또는 이식 거부로 인한 이식 관련 사망 빈도가 높으며, 장기간 면역결핍이 될 위험성이 높다. 대안으로서, 제대혈은 동종 HSCT에 유효한 옵션으로 입증되고 있다. 하지만, CB 1 유닛으로는 일반적으로 성인 환자에게 신속하고 효과적으로 조혈을 재생하기에는 HSC를 충분하게 제공하지 못한다.

마우스 재구축 분석으로 측정한 뮤라인 또는 인간 HSC의 수를 사이토카인-매개로 단기간 유지시키거나 또는 심지어 소폭 증가시키는 것으로 입증된 시험관내 조건은 일반적으로 선조 세포 집단의 후기 타입들을 훨씬 더 많이 증가시킨다. 최근 들어, 섬유모세포 성장인자 (FGF), 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질, 안지오포이에틴-유사 성장인자 및 플레이오트로핀 (pleiotrophin)과 같은 다른 인자를 함유한 배양물들에서 뮤라인 및 인간 HSC가 보다 현저하게 증가한다는 것이 보고되고 있다. 그러나, 이들 최근의 보고는 유일하며 독립적인 검증을 기다리고 있다. 표준 사이토카인을 이용하여 수득되는 단기간의 HSC 증가는 또한 필연적으로 궁극적인 HSC 고갈로 이어진다.

인간 HSC를 증식시키기 위한 또 다른 전략은 기질 인자 (stromal element) 또는 가용성의 형태형성 리간드 (예, Notch, Wnt 및 Hedgehog 경로들을 자극함)를 이용한 이의 배양, 특이적인 세포내 신호전달 경로에 대한 타겟화된 조작 (PGE2, ROS, p38 및 MAPK 저해제) 또는 특이적인 전사 인자 (예, Hox, Hlf)의 조작을 포함한다. HSC를 생체외에서 증식시키기 위한 다른 전임상 방법들로는, i) 아릴 탄화수소 수용체 길항제인 StemRegenin1 (SR1) (Boitano, AE et al. "Aryl carbohydrogen receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells" Science 329: 1345-1348. 2010); ii) 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 저해제인 Garcinol (Nishino, T et al. "Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells by Garcinol, a potent inhibitor of histone acetyltransferase" PLoS ONE 6(9): e24298. 2011); 및 iii) 비-펩티딜 소형 분자 c-MPL 작용제인 NR-101 (Nishino et al. "Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells by a small-molecule agonist of c-MPL" Exp. Hem. 2009; 37:1364-1377)을 이용한 배양을 포함한다. SR1의 특정화를 통해, 저분자량 (LMW) 화합물이 HSC 증식을 촉진시키는 능력을 가지고 있다는 이론에 대한 증거가 갖추어졌다.

임상 실험들은, 투여되는 이식물들의 영구성 뿐만 아니라 단기간의 주입된 재집락성 세포의 수에 의존하는, 이식 후 유효한 과립구 수준에 도달하는데 소요되는 시간의 최소화가 중요하다는 것을 역설해준다. 사이토카인을 이용한 배양으로 증식시킨 골수 또는 제대혈 세포의 이식이, 무처리 세포에 비해 조혈 재생을 임상적으로 유용하게 가속화한다는 것은 아직 입증되지 않았다. 고정된 Notch 리간드를 이용하여 증식시킨 세포로 수행한 실험의 초기 결과들에서는 임의의 (보다 온건한) 선조 세포 증식 전략에 대한 잠재적인 임상 유용성이 최초로 입증되었다 (Delaney et al. "Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution" Nat. Med. 16(2): 232-236. 2010). 그러나, 이런 방식은, 생체외 증식 단계 동안에 고정된 Delta-1 융합 단백질을 이용해야 할 필요가 있고 줄기 세포에 대해 입증된 효능 부족으로 인해 제한적이다 (영향은 좀더 분화된 전구체에 한정되어 나타남). 임상 시도에서 다른 방식으로는, i) StemEx, 무처리 UCB 세포와 공동-주입한, 구리 킬레이터 테트라에틸렌펜타민 (TEPA) 및 사이토카인을 이용하여 배양한, UCB 세포와; I상 실험에서 UCBT의 회귀를 개선시키기 위해 사용되는 16-16 다이메틸 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 조합을 포함하며; I상 결과에서, 호중구 또는 혈소판 생착 시간은 이전 보고에 비해 개선되지 않았다 (de Lima M et al. "Transplantation of ex vivo expanded cord blood cells using the copper chelator tetraethylenepentamine: a phase I/II clinical trial" Bone Marrow Transplant. 2008; 41(9): 771-778).

따라서, 조혈 줄기 세포 및 선조 세포의 증식을 높이기 위한 새로운 전략이 요구되고 있다. 이를 위해 사용되는 특정한 피리미도[4,5-b]인돌 유도체들이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며; 예를 들어, WO 2003/037898; WO 2004/058764; WO 1998/042708; WO 1997/002266; WO 2000/066585; WO 1993/020078; WO 2006/116733; WO 2008/055233; WO 2010/006032; WO 1995/019970; WO 2005/037825; 및 WO 2009/004329에 개시되어 있다. 그러나, 이들 문헌들에는 본 발명에 따른 피리미도[4,5-b]인돌 유도체나 조혈 줄기 세포 및 선조 세포의 증식에서의 이의 용도는 개시되어 있지 않다.

본 발명자들은 특정한 피리미도[4,5-b]인돌 유도체들을 발견하게 되었다. 이들 화합물은 조혈 줄기 세포 집단, 특히 인간 조혈 줄기 세포 집단을 증식시키는데 사용가능하다. 또한, 이들 화합물은 조혈 줄기 세포와 관련된 질환에 대한 의학적인 치료에 사용가능하다.

일 측면에서, 본 발명은 하기 일반식 I, II, III, IV, V 및 VI의 화합물을 제공한다:

상기 일반식 I, II, III, IV, V 및 VI에서 치환기들, 즉 Z, W, L, Li, X, X_i, R¹, R², R³, R⁴ 및 m은 아래 본원에서 정의된 바와 같이 정의된다.

일 측면에서, 본 발명은 일반식 I, II, III, IV, V 또는 VI의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 조혈 줄기 세포를 증식시키기 위한 일반식 I, II, III, IV, V 또는 VI의 화합물의 용도를 제공한다. 본 발명의 구현예들에서, 조혈 줄기 세포는 인간 세포이다.

일 측면에서, 본 발명은, 일반식 I, II, III, IV, V 또는 VI의 화합물의 존재 하에 출발 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는, 조혈 줄기 세포 또는 선조 세포를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 구현예들에서, 출발 세포 집단은 생체내, 시험관내 또는 생체외이다. 또한, 본 발명의 구현예들에서, 출발 세포 집단은 유동화된 (mobilized) 말초혈 (mPB), 골수 (BM) 또는 제대혈 (UCB)로부터 회수한 CD34+ 세포를 포함한다. 아울러, 본 발명에 따른 방법의 구현예들에서, 선택적으로, 일반식 I, II, III, IV, V 또는 VI의 화합물의 존재 하에 출발 세포 집단의 배양은 생물 분자 또는 다른 소형 분자인 하나 이상의 세포 증식 인자와 함께 수행된다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 증식시킨 세포 집단, 보다 구체적으로 본 발명에 따른 화합물을 이용하여 증식시킨 세포 집단을 제공한다. 구현예들에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 증식시킨 조혈 줄기 세포, 보다 구체적으로 본 발명에 따른 화합물을 이용하여 증식시킨 조혈 줄기 세포를 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은, 일반식 I, II, III, IV, V 또는 VI의 화합물을 이용하여 증식시킨 조혈 줄기 세포를 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 조혈 장애/조혈 악성 질환, 자가면역 질환 및/또는 유전성 면역결핍성 질환을 치료하는 방법, 또는 일반식 I, II, III, IV, V 또는 VI의 화합물을 제공한다.

본 발명의 구현예들에서, 조혈 장애/조혈 악성 질환, 자가면역 질환 및/또는 유전성 면역결핍성 질환은 전세계적으로 문제가 되는 다양한 선천성 질환인 골수 기능 부전 병태들 (예, 겸상 적혈구 빈혈증 및 지중해 빈혈), 루푸스, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 장애, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 재생불량성 빈혈, 순수적혈구 무형성증 (pure red cell aplasia), 혈색소뇨증, 판코니 빈혈, 지중해 빈혈, 겸상 적혈구 빈혈증, 비스코트-알드리히 증후군, 선천성 대사 이상 (예, 특히 고셔병)을 포함한다.

일 측면에서, 본 발명은 일반식 I, II, III, IV, V 또는 VI의 화합물과 사용 설명서를 포함하는, 줄기 세포 또는 선조 세포를 증가시키거나, 또는 조혈 줄기 세포를 증식시키는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 구현예들에서, 본 키트는 생물 분자 또는 다른 소형 분자인 하나 이상의 세포 증식 인자를 포함한다.

도 1: 화합물 1은 아릴 탄화수소 (AhR) 경로를 통해 작용하지 않는다. 유동화된 말초혈 CD34(+) 세포를 12시간 동안 DMSO, SR1 [AhR 길항제 1000nM], 및 화합물 1 [500nM]과 함께 배양한 다음, 세포를 회수하고, AhR-반응 유전자 (CYP1B1 및 AhRR)에 대한 실시간 정량 RT-PCR을 수행하였다. 화합물 1은, SR1과는 다르게, AhR-하류 타겟 유전자들을 억제하지 않으므로, 이의 기능은 AhR 경로와 독립적인 것으로 시사된다.
도 2: 화합물 1의 효과는 가역적이다. 유동화된 말초혈 CD34(+) 세포를 7일간 화합물 1 (녹색으로 표시됨) 또는 비히클 (DMSO, 청색으로 표시됨)과 함께 배양한 다음 헹군 후, 화합물이 첨가 또는 첨가되지 않은 (각각 실선 또는 점선) 신선한 배지에 재접종하였다. 세포를 다시 8일간 배양한 다음, CD34+CD45RA- 비율을 모니터링하였다. 화합물 1을 씻어 제거하였을 때 CD34+CD45RA- 비율의 급격한 감소가 관찰되었으며, 이는 그 효과가 가역적이라는 것을 의미한다.
도 3: Flt3, SCF 및 TPO는 화합물 1 매개 줄기 세포 증식에 필요하다. 유동화된 말초혈 CD34(+) 세포를 성장인자 (Flt3+SCF+TPO)의 존재 하에 또는 부재 하에 7일간 배양하였다. 임의의 성장 인자 부재시 CD34+CD45RA- 세포 카운트가 더 적어, 관찰되는 효과에 성장 인자의 필요성이 시사되었다.
도 4: A) 화합물 1은 CD34+ 유동화된 말초혈 세포의 분화를 감소시킨다. FACS 분석에 의해 확인된 바와 같이, 화합물 1은 DMSO 처리한 대조군 세포에 비해 CD34+ 세포 집단을 증식시킬 수 있었다. SR1은 화합물 1과 증식된 배양 세포가 CD34+를 유지하는데 상승적인 효과를 발휘하며, 이는 분화 저해가 조합시 훨씬 더 강하다는 것을 의미한다. B) 화합물 1은 CD34⁺ 제대혈 세포의 분화를 감소시킨다. C) 화합물 40은 CD34⁺ 제대혈 세포의 분화를 감소시킨다. D) 화합물 40은 CD34⁺ 세포의 분화 억제에 용량-의존적인 효과를 나타낸다.
도 5: A) 화합물 1은 유동화된 말초혈-매개 CD34+ 및 CD34+CD45RA- 세포 집단들을 생체외에서 증식시킨다. 세포의 총 카운트는 DMSO 처리 세포와 화합물 1 처리한 세포에서 동일하였지만, CD34+ 집단은 DMSO에 비해 2배 이상이었다. 마찬가지로, CD34+CD45RA- 집단은 DMSO와 비교하여 화합물 1 처리군에서 3배 이상이었다. 이러한 결과는 SR1과 공동-처리시 강화되었다. B) 화합물 1은 7일간 배양하는 동안 제대혈 유래 CD34+ 및 CD34+CD45RA- 세포의 증식을 강화한다. C) 화합물 1은 12일간 배양하는 동안 제대혈 유래 CD34+ 및 CD34+CD45RA- 세포의 시험관내 증식에 긍정적인 효과를 발휘한다.
도 6: CD34+ mPB 세포를 비히클 (DMSO), SR1, 화합물 1 및 화합물 1과 SR1의 조합의 존재 하에 10일간 배양하였다. 처리 세포 50,000주 및 500,000주를 NSG 마우스에 이식하고, 이식한지 13일 후 골수 분석을 수행하여 인간 조혈 생착을 평가하였다. 임의의 주어진 세포 용량에서, 화합물 1이 처리된 CD34+ mPB 세포가 DMSO에 비해 생착성이 우수하였다. 흥미롭게도, BM에서 인간 CD45+ 세포의 퍼센트는 개개 화합물에 비해 조합 (화합물 1 + SR1)을 처리한 세포를 이식한 NSG 마우스에서 가장 높았다.
도 7: A) 화합물 1로 증식시킨 세포는 NSG 마우스에서 인간 조혈 세포를 재구축할 수 있다. 비히클 (DMSO), SR1, 화합물 1 및 조합물을 처리한 CD34+ CB 세포 5,000주를 면역저하 NSG 마우스에 이식하였다. 이식한 지 8주 후, 골수 분석시, DMSO를 제외한 모든 처리군들에서 인간 CD45+ 생착이 확인되었다. 조합 (화합물 1 + SR1)을 처리한 세포가 가장 우수한 생착율을 나타내었다. B) 12일간 시험관내에서 배양하는 동안, 화합물 40은 NSG 마우스 골수에 생착하는 능력을 가진 인간 조혈 세포의 감소를 방지한다.
도 8: 유세포 측정으로 측정에 따른 피드-배치 방식을 이용한 생물반응조에서의 원시 세포 (primitive cell) 표현형 (CD34⁺, CD34⁺CD90⁺ 및 CD34⁺CD45RA⁺)의 증가. FB 대조군 = 화합물 40이 무첨가된 피드-배치, Cpd 40 = 화합물 40이 첨가된 피드-배치.

본 발명자들은 특정한 피리미도[4,5-b]인돌 유도체들을 발굴하게 되었다. 이들 화합물들은 조혈 줄기 세포 집단, 특히 인간 조혈 줄기 세포 집단을 증식시키는데 사용가능하다. 또한, 이들 화합물은 조혈 줄기 세포와 관련된 질환을 의학적으로 치료하는데 유용하다.

본 발명에 따른 화합물은 하기에 표시된 일반식 I, II, III, IV, V 또는 VI를 가진다. 이들 화합물의 염 또는 프로드럭들 역시 본 발명에 따른 화합물의 범위에 포함된다.

상기 식 I, II, III, IV, V 및 VI에서, 치환기들은 후술된 바와 같이 정의된다.

Z는: 1) -P(O) (OR¹) (OR¹), 2) -C(O)OR¹, 3) -C(O)NHR¹, 4) -C(O)N(R¹)R¹, 5) -C(O)R¹, 6) -CN, 7) -SR¹, 8) -S(O)₂NH₂, 9) -S(O)₂NHR¹, 10) -S(O)₂N(R¹)R¹, 11) -S(O)R¹, 12) -S(O)₂R¹, 13) -L, 14) R^A 또는 R¹ 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환된, -벤질, 15) L 또는 헤테로아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로아릴, 16) L 또는 헤테로사이클릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로사이클릴, 17) L 및 아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-아릴, 18) R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -헤테로아릴, 또는 19) R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -아릴이다. 이 리스트에서, 각 치환기는, 아직 존재하지 않는 경우, L 기에 선택적으로 부착되며; (R¹) 및 R¹이 질소 원자와 결합하는 경우, 선택적으로 이는 질소 원자와 연결되어, N, O 및 S로부터 선택되는 다른 이종 원자를 1개 이상 선택적으로 포함하며, 선택적으로 R^A 또는 R¹ 1개 이상으로 치환된, 3-7원성의 고리를 형성한다.

W는 H, 할로겐, 또는 N, O, S 또는 C인 원자를 통해 분자의 피리미도 인돌 코어에 부착되는 기이다. 선택적으로, W는 탄소수 1-20의, 포화, 불포화, 선형, 분지형 및/또는 사이클릭 알킬 및/또는 헤테로알킬을 포함한다. 또한, 선택적으로, 상기 모이어티는 N, O 또는 S인 하나 이상의 다른 이종 원자를 포함한다. 당업자가 숙지하는 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물의 화학식에서 W는 당해 기술 분야에 통상적으로 사용되는 화학적 기들의 다양한 카테고리에 속할 수 있다.

보다 구체적으로, W는 다음과 같다: 1) -H, 2) -할로겐, 3) -OR¹, 4) -L-OH, 5) -L-OR¹, 6) -SR¹, 7) -CN, 8) -P(O)(OR¹)(OR¹), 9) -NHR¹, 10) -N(R¹)R¹, 11) -L-NH₂, 12) -L-NHR¹, 13) -L-N(R¹)R¹, 14) -L-SR¹, 15) -L-S(O)R¹, 16) -L-S(O)₂R¹, 17) -L-P(O)(OR¹)(OR¹), 18) -C(O)OR¹, 19) -C(O)NH₂, 20) -C(O)NHR¹, 21) -C(O)N(R¹)R¹, 22) -NHC(O)R¹, 23) -NR¹C(O)R¹, 24) -NHC(O)OR¹, 25) -NR¹C(O)OR¹, 26) -OC(O)NH₂, 27) -OC(O)NHR¹, 28) -OC(O)N(R¹)R¹, 29) -OC(O)R¹, 30) -C(O)R¹, 31) -NHC(O)NH₂, 32) -NHC(O)NHR¹, 33) -NHC(O)N(R¹)R¹, 34) -NR¹C(O)NH₂, 35) -NR¹C(O)NHR¹, 36) -NR¹C(O)N(R¹)R¹, 37) -NHS(O)₂R¹, 38) -NR¹S(O)₂R¹, 39) -S(O)₂NH₂, 40) -S(O)₂NHR¹, 41) -S(O)₂N(R¹)R¹, 42) -S(O)R¹, 43) -S(O)₂R¹, 44) -OS(O)₂R¹, 45) -S(O)₂OR¹, 46) R^A 또는 R¹ 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환된, -벤질, 47) L 또는 헤테로아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로아릴, 48) L 또는 헤테로사이클릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로사이클릴, 49) L 또는 아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-아릴, 50) -L-NR¹(R¹), 51) -L-)₂ NR¹, 52) -L-(N(R¹)-L)_n-N(R¹)R¹, 53) L 또는 헤테로아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-(N(R¹)-L)_n-헤테로아릴, 54) L 또는 헤테로사이클릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-(N(R¹)-L)_n-헤테로사이클릴, 55) L 또는 아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-(N(R¹)-L)_n-아릴, 56) -O-L-N(R¹)R¹, 57) L 또는 헤테로아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -O-L-헤테로아릴, 58) L 또는 헤테로사이클릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -O-L-헤테로사이클릴, 59) L 또는 아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -O-L-아릴, 60) -O-L)₂-NR¹, 61) -O-L-(N(R¹)-L)_n-N(R¹)R¹, 62) L 또는 헤테로아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -O-L-(N(R¹)-L)_n-헤테로아릴, 63) L 또는 헤테로사이클릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -O-L-(N(R¹)-L)_n-헤테로사이클릴, 64) R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -O-L-(N(R¹)-L)_n-아릴, 65) R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -S-L-헤테로아릴, 66) R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -S-L-헤테로사이클릴, 67) L 또는 아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -S-L-아릴, 68) -S-L)₂ NR¹, 69) -S-L-(N(R¹)-L)_n-N(R¹)R¹, 70) R^A 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -S-L-(N(R¹)-L)_n-헤테로아릴, 71) R^A 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -S-L-(N(R¹)-L)_n-헤테로사이클릴, 72) R^A 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -S-L-(N(R¹)-L)_n-아릴, 73) -NR¹(R¹), 74) -(N(R¹)-L)_n-N(R¹)R¹, 75) -N(R¹)L)₂-NR¹, 76) -(N(R¹)-L)_n-N(R¹)R^A, 77) R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -(N(R¹)-L)_n-헤테로아릴, 78) R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -(N(R¹)-L)_n-헤테로사이클릴, 79) R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -(N(R¹)-L)_n-아릴, 80) R^A 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -헤테로아릴, 또는 81) R^A 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -아릴. 이 리스트에서, 각 치환기는, 아직 존재하지 않는 경우, L 기에 선택적으로 부착되며; 2개의 R¹ 치환기들이 동일한 질소 원자 상에 존재하는 경우, 이들 각각의 R¹ 치환기는 독립적으로 후술되는 R¹ 리스트로부터 선택되며; n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5 중 어느 하나의 정수이고; (R¹) 및 R¹이 질소 원자와 결합하는 경우, 선택적으로 이들은 질소 원자와 연결되어, N, O 및 S로부터 선택되는 다른 이종 원자를 1개 이상 선택적으로 포함하며, 선택적으로 R¹ 또는 R^A 1개 이상으로 치환된, 3-7원성의 고리를 형성한다.

L은 다음과 같다: 1) -C_1-6알킬, 2) -C_2-6알케닐, 3) -C_2-6알키닐, 4) -C_3-7사이클로알킬, 5) -C_3-7사이클로알케닐, 6) 헤테로사이클릴, 7) -C_1-6알킬-C_3-7 사이클로알킬, 8) -C_1-6알킬-헤테로사이클릴, 9) 아릴, 또는 10) 헤테로아릴. 이 리스트에서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 기들은 독립적으로 R^A 치환기 1개 또는 2개로 선택적으로 치환된다.

R¹은 다음과 같다: 1) -H, 2) -C_1-6알킬, 3) -C_2-6 알케닐, 4) -C_2-6알키닐, 5) -C_3-7사이클로알킬, 6) -C_3-7사이클로알케닐, 7) -C_1-5 과불소화 (perfluorinated), 8) -헤테로사이클릴, 9) -아릴, 10) -헤테로아릴, 11) -벤질, 또는 12) 5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜타노일. 이 리스트에서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알케닐, 과불소화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 및 벤질 기들은 각각 독립적으로 R^A 또는 R¹ 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환된다.

R²는 다음과 같다: 1) -H, 2) -C_1-6 알킬, 3) -SR¹, 4) -C(O)R¹, 5) -S(O)R¹, 6) -S(O)₂R¹, 7) R^A 또는 R¹ 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환된, -벤질, 8) L 및 헤테로아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로아릴, 9) L 또는 헤테로사이클릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로사이클릴, 10) L 및 아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-아릴, 11) R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -헤테로아릴, 또는 12) R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -아릴. 이 리스트에서, 각 치환기는, 아직 존재하지 않는 경우, L 기에 선택적으로 부착된다.

R^A는 다음과 같다: 1) -할로겐, 2) -CF₃, 3) -OH, 4) -OR¹, 5) -L-OH, 6) -L-OR¹, 7) -OCF₃, 8) -SH, 9) -SR¹, 10) -CN_,11) -NO₂, 12) -NH₂, 13) -NHR¹, 14) -NR¹R¹, 15) -L-NH₂, 16) -L-NHR¹, 17) -L-NR⁴R¹, 18) -L-SR¹, 19) -L-S(O)R¹, 20) -L-S(O)₂R¹, 21) -C(O)OH, 22) -C(O)OR¹, 23) -C(O)NH₂, 24) -C(O)NHR¹, 25) -C(O)N(R¹)R¹, 26) -NHC(O)R¹, 27) -NR¹C(O)R¹, 28) -NHC(O)OR¹, 29) -NR¹C(O)OR¹, 30) -OC(O)NH₂, 31) -OC(O)NHR¹, 32) -OC(O)N(R¹)R¹, 33) -OC(O)R¹, 34) -C(O)R¹, 35) -NHC(O)NH₂, 36) -NHC(O)NHR¹, 37) -NHC(O)N(R¹)R¹, 38) -NR¹C(O)NH₂, 39) -NR¹C(O)NHR¹, 40) -NR¹C(O)N(R¹)R¹, 41) -NHS(O)₂R¹, 42) -NR¹S(O)₂R¹, 43) -S(O)₂NH₂, 44) -S(O)₂NHR¹, 45) -S(O)₂N(R¹)R¹, 46) -S(O)R¹, 47) -S(O)₂R¹, 48) -OS(O)₂R¹, 49) -S(O)₂OR¹, 50) -벤질, 51) -N₃, 또는 52) -C(-N=N-)(CF₃). 이 리스트에서, 벤질 기는 R^A 또는 R¹ 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환된다.

본 발명의 구현예들에서, 화합물들은 하기 표시한 일반식 IIA, IIB, IIC, IVA 또는 VIA를 가진다. 이들 화합물들의 염 또는 프로드럭들도 본 발명에 따른 화합물의 범위에 포함된다.

상기 일반식 IIA의 화합물에 따른 본 발명의 구현예에서, R¹, W 및 R²는 각각 상기 본원에 정의된 바와 같이 정의된다.

상기 일반식 IIB의 화합물에 따른 본 발명의 구현예에서, W 및 R²는 각각 상기 본원에 정의된 바와 같이 정의되며, Het는 상기 본원에 정의된 R¹ 또는 R^A 하나 이상으로 선택적으로 치환된 3-7원성 헤테로사이클이다.

상기 일반식 IIC의 화합물에 따른 본 발명의 구현예에서, W 및 R²는 각각 상기 본원에 정의된 바와 같이 정의되며; R⁵ 및 R⁶는 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 상기에서 정의된 L이거나, 또는 이들은 C와 연결되어, N, O 및 S로부터 선택되는 이종 원자를 1개 이상 선택적으로 포함하며, 선택적으로 R¹ 또는 R^A 1개 이상으로 치환된, 5-7원성의 고리를 형성한다. 추가적인 구현예들에서, 고리는 5원성 고리이고, 이종원자는 질소 원자이다. 또 다른 구현예들에서, 고리는 4개의 질소 원자를 포함한다. 또 다른 구현예들에서, R²는 벤질이다.

상기 일반식 IVA의 화합물에 따른 본 발명의 구현예에서, W, L, R¹ 및 R²는 각각 상기 본원에 정의된 바와 같이 정의된다. 또한, m, Li, R³ 및 R⁴는 각각 상기 본원에 정의된 바와 같이 정의된다.

상기 일반식 VIA의 화합물에 따른 본 발명의 구현예에서, Z는 CO₂Me 또는 2-메틸-2H-테트라졸-5-일이고; R²는 벤질, 3-티에닐메틸 또는 3-피리디닐 메틸이고; W는 NH-L-N(R¹)R¹이되 여기서 L은 C_2-4 알킬이고, R¹은 C_1-4 알킬이거나 또는 (R¹) 및 R¹은 질소 원자와 연결되어, N, O 및 S로부터 선택되는 다른 이종 원자를 1개 이상 선택적으로 포함하며, 선택적으로 R¹ 또는 R^A 1개 이상으로 치환된, 3-7원성의 고리를 형성한다.

본 발명의 구현예들에서, 본 발명의 화합물은 하기 표 1에 도시된 화합물 1 내지 55이다. 이들 화합물의 염 또는 프로드럭들도 본 발명에 따른 화합물의 범위에 포함된다.

본 발명의 다른 구현예들에서, 화합물은 하기 표 1에 나타낸 식들을 가진다. 이들 화합물의 염 또는 프로드럭들도 본 발명에 따른 화합물의 범위에 포함된다.

정의:

달리 언급되지 않는 한, 하기 용어들이 적용된다:

단수형 "부정 관사 (a, an)" 및 "정관사 (the)"는 명시적으로 다른 것으로 기술되지 않은 한 대응되는 복수의 지칭도 포함한다.

본원에서, 용어 "포함하는"은 용어 "포함하는" 다음에 오는 요소 리스트가 필수적이거나 의무적이지만, 다른 요소들도 선택적이며 존재하거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 의미하는 것으로 의도된다.

본원에서, 용어 "으로 구성된"은 표현 "으로 구성된" 다음에 오는 모든 것을 포함하며 이로 한정되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 즉, "으로 구성된"이라는 표현은 열거된 요소들이 필수 또는 의무적이지만, 다른 요소들은 존재할 수 없다는 것을 의미한다.

본원에서, 용어 "알킬"은 명시된 탄소수를 가진 분지쇄 및 직쇄의 포화된 지방족 탄화수소 기들을 포함하는 것으로 의도되며, 예를 들어, C₁-C₆알킬에서 C₁-C₆는 탄소를 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 가지는 선형 또는 분지형의 포화된 배열의 기들을 포함하는 것으로 정의된다. 상기 정의된 C₁-C₆ 알킬의 예로는, 비제한적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, t-부틸, i-부틸, 펜틸 및 헥실을 포함한다.

본원에서, 용어 "사이클로알킬"은 명시된 탄소수를 가진 단환식 포화 지방족 탄화수소 기를 의미하는 것으로서, 예를 들어, C₃-C₇사이클로알킬에서 C₃-C₇은 탄소를 3, 4, 5, 6 또는 7개 가지는 단환식의 포화된 배열의 기들을 포함하는 것으로 정의된다. 상기 정의된 C₃-C₇ 사이클로알킬의 예로는, 비제한적으로, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 사이클로헵틸을 포함한다.

본원에서, 용어, "알케닐"은 명시된 탄소수를 가지며, 탄소 원자 2개 이상이 서로 이중 결합으로 결합되어 있으며, E 또는 Z 위치화학 (regiochemistry) 중 하나 또는 이들의 조합을 가지는, 불포화된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 기들을 의미한다. 예를 들어, C₂-C₆ 알케닐에서 C₂-C₆는 탄소 2, 3, 4, 5 또는 6개를 선형 또는 분지형 배열로 가지며 이들 탄소 원자 2 이상이 이중 결합에 의해 서로 결합된 기들을 포함하는 것으로 정의된다. C₂-C₆알케닐의 예로는, 비제한적으로, 에테닐 (비닐), 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐 등을 포함한다.

본원에서, 용어 "알키닐"은 명시된 탄소수를 가지며, 탄소 원자 2개 이상이 서로 삼중 결합으로 결합되어 있는, 불포화된 직쇄 탄화수소 기들을 의미한다. 예를 들어, C₂-C₄ 알키닐은 탄소 2, 3 또는 4개를 체인에 가지며 이들 탄소 원자 2 이상이 삼중 결합에 의해 서로 결합된 기들을 포함하는 것으로 정의된다. 이들 알키닐의 예로는, 비제한적으로, 에티닐, 1-프로피닐, 2-프로피닐 등을 포함한다.

본원에서, 용어 "사이클로알케닐"은 명시된 탄소수를 가지는 단환식의 포화된 지방족 탄화수소 기를 의미하며, 예를 들어, C₃-C₇ 사이클로알케닐에서 C₃-C₇은 탄소 3, 4, 5, 6 또는 6개를 단환식 배열로 가지는 기들을 포함하는 것으로 정의된다. 상기 정의된 C₃-C₇ 사이클로알케닐의 예로는, 비제한적으로, 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐 등을 포함한다.

본원에서, 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 F, Cl, Br 또는 I를 의미한다.

본원에서, 용어 "할로알킬"은, 각 수소 원자가 연속하여 할로겐 원자로 치환될 수 있는, 상기 정의된 알킬을 의미한다. 할로알킬의 예로는, 비제한적으로, CH₂F, CHF₂ 및 CF₃를 포함한다.

본원에서, 용어 "아릴"은 단독으로 또는 다른 라디칼과 조합하여, 방향족, 포화 또는 불포화될 수 있는 제2의 5- 또는 6원성 카보사이클릭 기와 추가로 융합될 수 있는, 탄소 원자 6개를 포함하는 카보사이클릭 방향족 단환식 기를 의미한다. 아릴의 예로는, 비제한적으로, 페닐, 인다닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 테트라하이드로나프틸 등을 포함한다. 아릴은 사이클로알킬 고리 또는 방향족 고리 상의 적정 위치에서 다른 기와 연결될 수 있다.

본원에서, 용어 "헤테로아릴"은, 고리 하나 이상이 방향족이고 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 이종 원자 1-4개를 포함하는, 최대 10개의 원자로 구성된 단환식 또는 이환식 고리 시스템을 의미한다. 헤테로아릴은 고리의 탄소 원자나 또는 이종원자들 중 하나를 통해 서로 부착될 수 있다. 헤테로아릴의 예로는, 비제한적으로, 티에닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조[b]티에닐, 푸릴, 벤조푸라닐, 피라닐, 이소벤조푸라닐, 크롬에닐, 크산테닐, 2H-피롤릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 인돌릴, 인다졸릴, 푸리닐, 4H-퀴놀리지닐, 이소퀴놀릴, 퀴놀릴, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프테리디닐, 이소티아졸릴, 이소크로마닐, 크로마닐, 이속사졸릴, 푸라자닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 티아졸로[4,5-b]-피리딘, 테트라졸릴, 옥사다이아졸릴, 티아다이아졸릴, 티에닐 및 플루오로세인 유도체를 포함한다.

본원에서, 용어 "헤테로사이클," "헤테로사이클릭" 또는 "헤테로사이클릴"은, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 이종 원자 1-4개를 포함하는 3, 4, 5, 6 또는 7원성의 비-방향족 고리 시스템을 의미한다. 헤테로사이클의 예로는, 비제한적으로, 피롤리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 피페리딜, 3,5-다이메틸피페리딜, 피롤리닐, 피페라지닐, 이미다졸리디닐, 모르폴리닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 후술되는 바와 같이 고리의 탄소 원자 또는 질소 원자 어느 하나 상에서 고리 부착이 이루어질 수 있는 것 등을 포함한다:

또는

본원에서, 용어 "치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된" 또는 이의 등가의 용어 "치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된"은, 상황들 다음에 기술된 현상들이 발생하거나 발생하지 않을 수 있으며, 기술 내용이 현상 또는 상황이 발생하는 경우와 그렇지 않은 경우를 포함하는 것을 의미한다. 이 정의는 치환기 0 - 5개를 의미하는 것으로 의도된다.

본원에서, 용어 "개체" 또는 "환자"는 인간, 및 영장류, 고양이, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 토끼, 랫, 마우스 등의 인간을 제외한 포유류를 의미하는 것으로 의도된다.

치환기들 자체가 본원에 기술된 합성 방법들에 적합하지 않다면, 이 치환기는 이들 방법들에 사용되는 반응 조건에 적합한 적정 보호기 (PG)로 보호되어야 한다. 보호기는 방법의 반응 순서에서 적정 지점에서 제거하여, 원하는 중간산물 또는 타겟 화합물을 수득할 수 있다. 적정 보호기와 이들 적정 보호기를 이용하여 여러가지 치환기들을 보호 및 탈-보호하는 방법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 그 예들은 T. Greene and P. Wuts, "Protecting Groups in Chemical Synthesis" (4th ed.), John Wiley & Sons, NY (2007)에서 확인할 수 있으며, 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 도처에서 사용되는 보호기의 예로는, 비제한적으로, Fmoc, Bn, Boc, CBz 및 COCF₃를 포함한다. 일부 경우에, 치환기는 특히 본원에 기술된 방법에서 사용되는 반응 조건 하에 반응성인 것으로 선택할 수 있다. 이들 경우에, 반응 조건은, 선택된 치환기를, 본원에 기술된 방법의 중간산물 화합물에 유용하거나 또는 타겟 화합물에서 적합한 치환기인 다른 치환기로 변환한다.

본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 산 부가 염과 염기 부가 염 둘다를 의미하는 것으로 의도된다.

본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 산 부가 염"은, 유리 염기의 생물학적 효능 및 특성을 보유하되, 생물학적이지 않거나 또는 그렇지 않으면 부적절한 것은 아닌 염으로서, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산 및 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 말델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등과 같은 유기 산과 형성된, 염을 의미하는 것으로 의도된다.

본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 염기 부가 염"은 유리 산의 생물학적 효능 및 특성을 보유하되 생물학적이지 않거나 또는 그렇지 않으면 부적절한 것은 아닌 염을 의미하는 것으로 의도된다. 이들 염은 유리 산에 무기 염기나 유기 염기를 부가함으로써 제조된다. 무기 염기로부터 유래되는 염으로는, 비제한적으로, 소듐, 포타슘, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등을 포함한다. 유기 염기로부터 유래되는 염으로는, 비제한적으로, 1차, 2차 및 3차 아민, 천연 치환된 아민 등의 치환된 아민, 사이클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 다이에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-다이메틸아미노에탄올, 2-다이에틸아미노에탄올, 다이사이클로헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌다이아민, 글루코스아민, 메틸글루카민, 테오브로민, 푸린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지의 염들 등을 포함한다.

본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 하나 이상의 비대칭 센터, 키랄 축 및 키랄 평면을 포함할 수 있으며, 따라서 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 및 다른 입체 이성질체 형태들로 형성될 수 있으며, 아미노산에서 (D)- 또는 (L)-와 같이, (R)- 또는 (S)-과 같은 절대 입체화학 측면으로 정의될 수 있다. 본 발명은 이러한 가능한 모든 이성질체들 뿐만 아니라 이의 라세믹 형태 및 광학적으로 순수한 형태를 포괄하는 것으로 의도된다. 광학 활성의 (+) 및 (-), (R)- 및 (S)-, 또는 (D)- 및 (L)-이성질체들은 키랄 신톤 (synthon) 또는 키랄 반응 시약을 이용하여 제조하거나, 또는 역상 HPLC와 같은 통상적인 기법을 이용하여 분리할 수 있다. 라세믹 혼합물로 제조한 후, 분리된 광학 이성질체로 분리하거나, 또는 이들 광학 이성질체를 키랄 합성에 의해 제조할 수 있다. 거울상 이성질체는, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 방법으로, 예를 들어, 부분입체 이성질체 염을 형성시킨 다음, 결정화, 가스-액체 또는 액체 크로마토그래피, 한가지 거울상 이성질체와 거울 이성질체 특이 시약과의 선택적인 반응에 의해 분리할 수 있다. 또한, 당해 기술 분야의 당업자는, 원하는 거울상 이성질체를 분리 기법에 의해 다른 화학체로 변환시키는 경우, 원하는 거울상 이성질체 형태를 형성하기 위해 추가적인 단계가 필요하다는 것을 인지할 것이다. 다른 예로, 특정 거울상 이성질체를 광학 활성 시약, 기질, 촉매 또는 용매를 이용하여 비대칭 합성에 의해 합성하거나, 또는 한가지 거울상 이성질체를 비대칭 변환에 의해 다른 것으로 변환함으로써 합성할 수 있다.

본 발명에 따른 특정 화합물들은 에피머들의 혼합으로서 존재할 수 있다. 에피머는 대상 화합물에 존재하는 2개 이상의 입체 중심 (stereogenic center) 중 단지 하나에만 반대 배위를 가지는 부분입체 이성질체를 의미한다.

본 발명에 따른 화합물은 양성 형태로 존재할 수 있으며, 본 발명은 이들 화합물의 양성 형태들 및 이의 혼합물을 포함한다.

아울러, 본 발명에 따른 화합물은 또한 수화된 형태 및 무수 형태로 존재할 수 있다. 본원에 기술된 임의의 식에 따른 화합물의 수화물을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 식에 따른 화합물은 일수화물이다. 본 발명의 구현예들에서, 본원에 기술된 화합물은 물을 약 10% 또는 그 미만, 약 9 % 또는 그 미만, 약 8% 또는 그 미만, 약 7% 또는 그 미만, 약 6% 또는 그 미만, 약 5% 또는 그 미만, 약 4% 또는 그 미만, 약 3% 또는 그 미만, 약 2% 또는 그 미만, 약 1% 또는 그 미만, 약 0.5% 또는 그 미만, 약 0.1% 또는 그 미만의 중량%로 포함한다. 다른 구현예들에서, 본원에 기술된 화합물은 물을 약 0.1% 또는 그 이상, 약 0.5% 또는 그 이상, 약 1% 또는 그 이상, 약 2% 또는 그 이상, 약 3% 또는 그 이상, 약 4% 또는 그 이상, 약 5% 또는 그 이상, 또는 약 6% 또는 그 이상의 중량%로 포함한다.

화합물은 프로드럭 형태로 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 바람직할 수 있다. 즉, 용어 "프로드럭"은, 본원에서, (예를 들어, 생체내에서) 대사되었을 때, 원하는 활성 화합물이 되는 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 프로드럭은 비활성이거나 또는 원하는 활성 화합물 보다 활성이 낮지만, 취급, 투여 또는 대사에 유리한 특성을 제공할 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 화합물에 대한 언급은 또한 이의 프로드럭을 포괄한다.

본원에서, 용어 "EC₅₀"은 비히클 배양물 (DMSO) 대비 CD34+CD45RA- 세포 카운트를 50% 증가시키는 농도를 의미한다.

본원에서, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 과립구 (예, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염구), 적혈구 (예, 망상적혈구, 적혈구), 혈전구 (예, 거핵아구, 혈소판을 생산하는 거핵구, 혈소판), 및 단핵구 (예, 단핵구, 마크로파지) 등의 성숙한 기능성 세포로의 분화를 허용하는 다능성과 이들의 다능성 (자가-복제)을 유지하면서 재생할 수 있는 능력을 모두 가진 세포를 의미하는 것으로 의도된다.

HSC는 출발 세포 집단의 일부이다. 이들 세포는 선택적으로 조혈 기원의 세포를 함유한 신체 장기 또는 신체로부터 수득된다. 이들 소스는 미-분획화된 골수, 제대혈, 말초혈, 간, 흉선, 림프 및 비장을 포함한다. 전술한 조 (crude) 산물 또는 미-분획화된 혈액 산물 모두 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방식으로 조혈 줄기 세포 특징들을 가진 세포에 대해 농화시킬 수 있다.

본원에서, 용어 "출발 세포 집단"은, 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 전술한 다양한 소스들 중 한가지로부터 회수한 HSC를 포함하는 세포 집단을 표시하는 것을 의미한다. 출발 세포 집단은 세포 표면 마커 CD34+의 존재를 기초로 선별된 세포 집단을 의미하는 CD34+ 세포에 대해 농화될 수 있다. CD34+ 세포는 예를 들어 유세포 측정과 형광 표지된 항-CD34 항체를 이용하여 검출 및 계수할 수 있다. 아울러, 출발 세포 집단은 즉시 증식에 이용하거나, 향후 시점에 사용하기 위해 동결 및 보관할 수 있다.

조혈 작용 동안에, HSC가 먼저 선조 단계 (progenitor stage)를 거쳐 골수 계통과 림프구 계통으로 나뉜 다음, 골수성 줄기 세포 (혼성 콜로니 형성 세포들, CFU-GEMM)와 림프구성 줄기 세포 각각으로 분화된다. 나아가, 골수성 줄기 세포는 적아구군 형성 세포 (BFU-E)와 적아구 콜로니 형성 세포 (CFU-E)를 거쳐 적혈구로, 거핵구 콜로니 형성 세포 (CFU-MEG)를 거쳐 혈전구로, 과립구-마크로파지 콜로니 형성 세포 (CFU-GM)를 거쳐 단핵구, 호중구 및 호염구로, 그리고 호산구 콜로니 형성 세포 (CFU-Eo)를 거쳐 호산구로 분화하며, 림프 줄기 세포는 T 림프구 선조 세포를 경유하여 T 세포로, B 림프구 선조 세포를 경유하여 B 세포로 분화한다. 이들 골수성 줄기 세포와 이들로부터 파생된 다양한 조혈 선조 세포들은 소프트 아가, 반고형 메틸셀룰로스 배지 등에서 다양한 사이토카인의 존재 하에 형성하는 콜로니 특성들로 식별된다.

또한, 본 발명은 자가 또는 동종 이식과 같은 비-제한적인 장애 리스트를 앓고 있는 개체 (또는 환자)를 치료하기 위한, 또는 자가면역 장애 또는 전술한 장애를 앓고 있는 개체 (또는 환자)를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 본 발명에 따른 화합물, 및 본원에 정의된 바와 같이, 이의 염의 용도를 포함한다. 혈액 악성 종양/장애 및 선천성 질환의 예로는, 비제한적인 예로, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 장애, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 재생불량성 빈혈, 순수적혈구 무형성증, 혈색소뇨증, 판코니 빈혈, 지중해 빈혈, 겸상 적혈구 빈혈증, 비스코트-알드리히 증후군, 선천성 대사 이상 (예, 특히 고셔병)을 포함한다. 이식이 유용할 수 있는 면역 장애의 예들은 많이 있으며, 다발성 경화증, 루푸스, 특정 형태 (certain form) 또는 관절염, 중증 복합 면역결핍증 등을 포함한다.

이에, 본 발명은 전술한 장애/악성 질환들 중 임의의 한가지를 앓고 있는 환자에게, 본 발명에 따른 화합물을 이용하여 증식시킨 HSC의 투여를 포함한다.

아울러, 본원에 기술된 화합물 및 조성물은 자가 또는 동종 이식과 같은 비제한적인 상황들 또는 전술한 장애나 자가면역 장애를 앓고 있는 개체 (또는 환자)의 치료에 이용할 수 있다. 혈액 악성 종양/장애 및 선천성 질환의 예로는, 비제한적인 예로, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 장애, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 재생불량성 빈혈, 순수적혈구 무형성증, 혈색소뇨증, 판코니 빈혈, 지중해 빈혈, 겸상 적혈구 빈혈증, 비스코트-알드리히 증후군, 선천성 대사 이상 (예, 특히 고셔병)을 포함할 수 있다. 이식이 유용할 수 있는 면역 장애의 예들은 많이 있으며, 다발성 경화증, 루푸스, 특정 형태 (certain form) 또는 관절염, 중증 복합 면역결핍증 등을 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 본원에 기술된 바와 같이 증식시킨 후 수득되는 세포 집단도 본 발명에 포함된다. 조혈 줄기 세포 및 선조 세포들 모두 성체, 제대혈, 태아 및 배아 소스로부터 회수할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용한 세포 증식을 통해, 예를 들어 호중구 또는 혈소판이 생착하는데 소요되는 시간을 단축하는데 유용한 선조 세포를 수적으로 증가시킬 수 있다. 이러한 방법은, HSC를 포함하는 출발 집단을 HSC를 수적으로 증가시킬 수 있는 물질과 함께 배양하는 단계를 포함한다. 출발 집단은 대상 세포 표면 마커 또는 이들의 조합 (예, CD34+, CD34+CD45RA+/-)에 대해 농화시킬 수 있다.

HSC 증식 방법

따라서, 본 발명은, (a) 조혈 줄기 세포를 포함하는 출발 세포 집단을 제공하는 단계, 및 (b) 조혈 줄기 세포를 증식시키기 위한 적정 조건에서 상기 출발 세포 집단을 생체외 배양하는 단계를 포함하는, 조혈 줄기 세포의 증식 방법에 관한 것이다.

이에, 본 발명은, (a) 조혈 줄기 세포를 포함하는 출발 세포 집단을 제공하는 단계, 및 (b) 조혈 줄기 세포를 증식시키기 위한 적정 조건에서 상기 출발 세포 집단을 생체외 배양하는 단계를 포함하는, 조혈 줄기 세포의 증식 방법에 관한 것이다.

구체적인 일 구현예에서, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 방법은 (a) 조혈 줄기 세포를 포함하는 출발 세포 집단을 제공하는 단계, 및 (b) 상기 출발 세포 집단을 본 발명의 화합물 또는 조성물의 존재 하에 생체외 배양하는 단계를 포함한다.

세포 집단은 출발 세포 집단을 제공하기 위해, 먼저, 특이적인 세포 마커를 기준으로 세포를 음성 및/또는 양성 선별하는 것을 비롯하여, 농화 또는 정제 단계를 거칠 수 있다. 상기 출발 세포 집단을 특이적인 세포 마커를 기준으로 분리하는 방법은 유세포 측정이라고도 하는 형광 활성화된 세포 분류 (FACS) 기법이나 또는 특이적인 세포 표면 마커와 상호작용하는 항체나 리간드가 결합된 고형 또는 불용성 기질을 이용할 수 있다. 예를 들어, 세포를 항체가 함유된 고형 기질 (예, 비드 컬럼, 플라스크, 자기 입자)과 접촉시키고, 결합되지 않은 세포들 모두 제거할 수 있다. 자기 비드 또는 상자성 비드를 포함하는 고형 기질을 사용하는 경우, 이 비드에 결합된 세포는 자기 분리기에 의해 쉽게 분리할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 출발 세포 집단은 CD34+ 세포로 농화되어 있다. 혈액 세포 집단에서 CD34+ 세포를 농화하는 방법은 Miltenyi Biotec (CD34+ 직접 분리 키트, Miltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, Germany) 또는 Baxter (Isolex 3000)에서 시판하는 키트를 포함한다.

단산으로부터 수득되는 제대혈의 양은 종종 성인이나 나이 많은 어린이를 치료하는데 충분하지 않다. 본 발명의 화합물 또는 조성물을 이용한 증식 방법의 한가지 이점은, 오직 하나의 제대혈 유닛으로부터 조혈 줄기 세포를 충분한 양으로 생산할 수 있다는 것이다.

이에, 일 구현예에서, 출발 세포 집단은 CD34+ 세포로 농화된 신생아 제대혈 세포로부터 유래된다. 관련된 일 구현예에서, 상기 출발 세포 집단은 1 또는 2종의 제대혈 유닛으로부터 유래된다.

다른 구현예에서, 출발 세포 집단은 CD34+ 세포로 농화된 인간의 유동화된 말초혈 세포로부터 유래된다. 관련된 일 구현예에서, 상기 출발 세포 집단은 오직 한명의 환자로부터 분리된 인간의 유동화된 말초혈 세포로부터 유래된다.

상기 출발 세포 집단은, 바람직하게는, CD34+ 세포를 적어도 50%로, 일부 구현예들에서 CD34+ 세포를 90% 이상으로 포함할 수 있다.

조혈 줄기 세포를 증식시키기 위한 출발 세포 집단의 배양 조건은 출발 세포 집단, 원하는 최종 세포 수 및 원하는 최종 HSC 비율에 따라 달라질 것이다.

일 특정 구현예에서, 구체적으로, 배양 조건은, CD34+ 세포로 농화된 제대혈 세포로부터 유래된 출발 세포 집단을 이용하여, HSC 증식에 대해 당해 기술 분야에 일반적으로 공지된 사이토카인 및 성장인자와 같은 다른 세포 증식 인자의 사용을 포함한다. 상기한 사이토카인 및 성장인자는 생물학적 분자 또는 소형 분자이며, 이는, 비제한적인 예로, IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, G-CSF, GM-CSF, SCF, FlT3-L, 트롬보포이에틴 (TPO), 에리트로포이에틴 및 이들의 유사체를 포함한다. 본원에서, "유사체"는, 비제한적인 예로, TPO 수용체 (예, 특허 공개공보 WO 2007/145227 등에 상세히 기술된 바와 같이, VB22B sc(Fv)2)에 대한 작용제 항체 등의 사이토카인 수용체 작용제 또는 천연 형태와 비교하였을 때, 강화 또는 감소된 생물 활성을 가진 변이체들을 비롯하여, 천연 형태와 같은 생물 활성을 가진 사이토카인 및 성장인자의 모든 구조 변이체들을 포함한다. 최종적으로 분화된 세포가 형성되는 것을 제한하면서, HSC 및 선조 세포를 증식시키기 위한 사이토카인 및 성장인자 조합물을 선택한다. 일 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인 및 성장인자는 SCF, Flt3-L 및 TPO로 이루어진 군으로부터 선택된다.

B-세포 자극 인자 2로도 알려진 인간 IL6 또는 인터루킨-6가 (Kishimoto, Ann. review of 1 mm. 23:1 2005)에 의해 개시되었으며, 상업적으로 구입가능하다. 인간 SCF 또는 c-ki 리간드라고도 하는 줄기 세포 인자, 비만 세포 성장인자 또는 Steel 인자가 개시되어 있으며 (Smith, M A et al., ACTA Haematologica, 105, 3:143, 2001), 상업적으로 구입가능하다. Flt3-L 또는 FLT-3 리간드는, 또한 FL이라고도 하는 것으로, flt3-수용체에 결합하는 인자이다. 이는 개시되어 있으며 (Hannum C, Nature 368 (6472): 643-8), 상업적으로 구입가능하다. TPO 또는 거핵구 성장인자 (MGDF)라고도 하는 트롬보포이에틴 또는 c-Mpl 리간드가 개시되었으며 (Kaushansky K (2006). N. Engl. J. Med. 354 (19): 2034-45), 상업적으로 구입가능하다.

전술한 화학적 구성요소 및 생물학적 구성요소들은 이를 배지에 첨가할 뿐만 아니라 배양에 사용되는 기질 또는 지지체의 표면 상에 이를 고정함으로써, 구체적으로는, 사용할 구성요소를 적정 용매에 용해하고 이 용액을 기질 또는 지지체에 코팅한 다음 과량의 구성요소들 씻어 제거함으로써, 사용할 수 있다. 사용할 구성요소는 상기 구성요소에 결합하는 물질로 예비 코팅한 기질 또는 지지체에 첨가할 수 있다.

HSC의 증식은 조성 측면에서 천연 배지, 반합성 배지 또는 합성 배지에서 수행될 수 있으며, 형태 측면에서 고체 배지, 반고체 배지 또는 액체 배지에서 수행될 수 있으며, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 선조 세포 배양에 사용되는 임의의 영양 배지에 전술한 세포 증식 인자들의 혼합물이 보충된다. 이러한 배지는 전형적으로 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 인, 염소, 아미노산, 비타민, 사이토카인, 호르몬, 항생제, 혈청, 지방산, 당류 등을 포함한다. 배양 시, 다른 화학적 구성요소 또는 생물학적 구성요소들을 필요한 경우에 따라 단독으로 또는 조합하여 투입할 수 있다. 배지에 투입되는 이러한 구성요소들은 소 태아 혈청, 인간 혈청, 말 혈청, 인슐린, 트랜스페린, 락토페린, 콜레스테롤, 에탄올아민, 소듐 셀레나이트, 모노티오글리세롤, 2-머캅토에탄올, 소 혈청 알부민, 소듐 피루베이트, 폴리에틸렌 글리콜, 다양한 비타민류, 다양한 아미노산류, 한천, 아가로스, 콜라겐, 메틸셀룰로스, 다양한 사이토카인들 또는 다양한 성장인자들 등일 수 있다. HSC 증식 방법에 적절한 이러한 기본 배지의 예들로는, 비제한적인 예로, StemSpan™ 무혈청 증식 배지 (SFEM) (StemCell Technologies, Vancouver, Canada), StemSpan™ H3000-제한 배지 (StemCell Technologies, Vancouver, Canada), CellGro™, SCGM (CellGenix, Freiburg Germany), StemPro™-34 SFM (Invitrogen), 둘베코의 변형된 이글스 배지 (DMEM), 햄의 영양 혼합물 H12 혼합물 F12, 맥코이의 5A 배지, 이글스 최소 필수 배지 (EMEM), αMEM 배지 (α 변형된 이글스 최소 필수 배지), RPMI1640 배지, 이소코브의 변형된 둘베코 배지 (IMDM), StemPro34 (Invitrogen), X-VIVO 10 (Cambrex), X-VIVO 15 (Cambrex) 및 Stemline II (Sigma-Aldrich)를 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 HSC 증식에 적합한 농도로 상기 출발 세포 집단을 증식시키는 방법의 수행 중에 투여한다. 일 특정 구현예에서, 상기 화합물 또는 조성물은 1 - 3000 nmol 또는 예를 들어 1 - 100 nmol로 구성된 농도에서 투여한다.

출발 세포 집단이 필수적으로 2 유닛 이상의 제대혈로부터, 또는 유동화된 PB 세포나 회수한 골수로부터 농화시킨 CD34+ 세포로 구성된 일 특정 구현예에서, 상기 세포는 HSC 증식 조건 하에, 예를 들어 2 - 21일간, 및/또는 지정된 배수 증식 및 특징적인 세포 집단이 수득될 때까지 배양한다. 일 특정 구현예에서, 상기 세포는 21일, 12일, 10일 또는 7일 이하로 HSC 증식 조건에서 생체외 배양한다.

그런 후, 세포 집단을 세척하여 본 발명의 화합물 또는 조성물 및/또는 세포 배양물의 임의의 다른 성분을 제거하고, 단기간 사용하기 위한 적절한 세포 현탁 배지 또는 장기 저장 배지, 예를 들어 저온보존에 적합한 배지에 재현탁한다.

HSC 및/또는 조혈 선조 세포는 페트리 디쉬, 플라스크, 플라스틱 백, Teflon™ 백 등의 동물 세포 배양에 일반적으로 사용되는 배양 바셀에서, 선택적으로 세포외 기질 또는 세포 유착 분자로 사전 코팅한 후, 배양할 수 있다. 이러한 코팅용 물질은 콜라겐 I - XIX, 파이브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌 1 - 12, 질소, 테나신, 트롬보스폰딘, 본 빌레블란트 인자, 오스테오포닌, 파이브리노겐, 다양한 엘라스틴류, 다양한 프로테오글리칸, 다양한 카드헤린, 데스모콜린, 데스모글레인, 다양한 인테그린, E-셀렌틴, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 면역글로불린 슈퍼 패밀리, 마트리겔, 폴리-D-라이신, 폴리-L-라이신, 키틴, 키토산, 세파로스, 알긴산 겔, 하이드로겔 또는 이의 단편일 수 있다. 이러한 코팅 물질은 인공적으로 변형된 아미노산 서열을 가진 재조합 물질일 수 있다. 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 선조 세포는 배지 조성, pH 등을 공학적으로 조절할 수 있는 생물반응기를 이용함으로써 배양할 수 있으며, 고 밀도의 배양물을 수득할 수 있다 (Schwartz R M, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:6760, 1991; Koller M R, Bone Marrow Transplant, 21:653, 1998; Koller, M R, Blood, 82: 378, 1993; Astori G, Bone Marrow Transplant, 35: 1101, 2005).

본 발명은 전술한 증식 방법에 의해 수득가능한 또는 수득되는 증식된 HSC를 포함하는 세포 집단을 추가로 제공한다. 일 특정 구현예에서, 이러한 세포 집단을 포유류 동물 숙주에 투여하기 적합한 약제학적으로 허용가능한 배지에 재현탁하여, 치료학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 포유류 동물 개체에게 자가 또는 동종 줄기 세포 이식에 사용하기 위한 증식된 HSC 또는 이의 조성물을 포함하는 세포 집단을 추가로 제공한다.

본원에 언급되는 개체는, 예를 들어, 골수 공여자 또는 혈액 세포 수준이 고갈 또는 한정될 위험성을 가진 또는 위험성이 있는 개체이다. 선택적으로, 개체는 골수를 회수하기 전의 골수 공여자 또는 골수를 회수한 이후의 골수 공여자이다. 개체는, 선택적으로 골수 이식의 수여자이다. 본원에 기술된 방법은, 예를 들어, 백혈병 또는 림프종을 치료하기 위한 화학요법과 같은 면역 고갈 치료 또는 골수제거 치료에 이전에 노출된 노인 개체 또는 개체 등의 제한된 골수 보존성 (bone marrow reserve)을 가진 개체에게 특히 유용하다. 개체는, 선택적으로, 감소된 혈액 세포 수준을 가지거나, 또는 대조군 혈액 세포 수준에 비해 감소된 혈액 세포 수준을 나타낼 위험이 있다. 본원에서, 용어 대조군 혈액 세포 수준은 개체에서 혈액 세포 수준을 변화시키는 현상이 실질적으로 없거나 또는 그 이전에 개체에서의 평균 혈액 세포 수준을 지칭한다. 개체에서 혈액 세포 수준을 변화시키는 현상은, 예를 들어, 빈혈, 외상, 화학요법, 골수 이식 및 방사선 치료를 포함한다. 예를 들어, 개체는 빈혈 또는 예를 들어 외상으로 인한 실혈을 가진다.

이식은 본 발명의 방법에 의해 증식시킨 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 선조 세포와 더불어, 완충액, 항생제, 약제를 포함하는 조성물일 수 있다.

증식시킨 HSC 집단 또는 상기 세포 집단을 포함하는 조성물은, 개체, 예를 들어, 화학요법, 방사선 치료 또는 골수 이식 전에, 동시에 또는 이후에 개체에게 투여한다. 개체는, 선택적으로, 예를 들어, 골수 감소 또는 골수 고갈이 특징적인 선천성, 유전성 또는 후천성 증후군과 관련된 골수 고갈을 나타낸다. 따라서, 개체는 선택적으로 조혈생성이 필요한 개체이다. 선택적으로, 개체는 골수가 고갈된 또는 골수 고갈 위험이 있는 개체이거나 또는 골수 공여자이다.

조혈 줄기 세포의 조작은 화학요법 또는 방사선 치료에 보충 치료로서 유용하다. 예를 들어, HSC는 말초혈로 위치되고, 화학요법을 시술받게 될 개체에서 분리한 다음, 치료법을 수행한 후 세포를 복귀시킨다. 즉, 개체는 화학요법, 방사선 치료와 같은 면역 세포 고갈 치료를 시술 중이거나 시술이 예상되거나, 또는 골수 이식의 공여자로서 제공되는 개체이다. 골수는 신체에서 가장 풍부한 조직들 중 하나로, 따라서 화학요법제 및 방사능에 의해 일차로 손상되는 장기이다. 그 결과, 혈액 세포 집단은 화학요법 또는 방사선 치료를 받는 동안 급속도록 파괴되므로, 환자를 화학요법으로 다시 치료하기 전에 조혈계가 혈액 세포 공급을 보충할 수 있도록 화학요법 또는 방사선을 중지하여야 한다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같이, 본원에 기술된 방법에 의해 제조되는 HSC 또는 혈액 세포는 선택적으로 추가적인 혈액 세포가 필요한 상기한 개체에게 투여한다.

전술한 본 발명의 화합물 또는 조성물을, HSC의 증식을 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 강화할 수 있는 치료제 (예, 소형 분자, 항체 등) 및 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 조합하여, 증식시킨 HSC를 제공한다. HSC 증식을 강화할 수 있는 치료제는, TPO 수용체에 대한 작용제 항체 (예, WO 2007/145227에 상세히 기술된, VB22B sc(Fv)2 등); 사이토카인, 예컨대, SCF, IL-6, Flt-3 리간드, TPO 또는 TPO 모방체 (예, WO/2007/022269; WO/2007/009120; WO/2004/054515; WO/2003/103686; WO/2002/085343; WO/2002/049413; WO/2001/089457; WO/2001/039773; WO/2001/034585; WO/2001/021180; WO/2001/021180; WO/2001/017349; WO/2000/066112; WO/2000/035446; WO/2000/028987; WO/2008/028645 등에 기술된 것); 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF); 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF); 프로스타글란딘 또는 프로스타글란딘 수용체 작용제 (예, 특허 공개공보 WO/2008/073748에 상세히 기술된 프로스타글란딘 E2 수용체-1 (EP-I) 작용제, 프로스타글란딘 E2 수용체-2 (EP-2) 작용제, 프로스타글란딘 E2 수용체-3 (EP-3) 작용제 및 프로스타글란딘 E2 수용체-4 (EP-4) 작용제); 테트라에틸렌펜트아민 (TEPA); Notch-리간드 (Delta-1); 및/또는 WNT 작용제를 의미한다. 아울러, 줄기 세포를 간엽 줄기 세포 (MSC)와 함께 배양하여 이식 편대 숙주 질환 (GVHD)을 방지하며, 줄기 세포 증식을 도울 수 있다.

약제학적으로 허용가능한은, 물질이 생물학적이지 않거나 또는 그렇지 않으면 부적절하지 않다는 것을 의미하며, 즉, 물질은 함유된 약학 조성물의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않거나 또는 부적절한 생물학적 효과를 야기하지 않으면서, 개체나 세포에게 투여할 수 있다. 담체 또는 부형제는 활성 성분의 분해를 최소화하고, 개체나 세포에서 부작용을 최소화하도록 선택된다.

조성물은 본원에 기술된 방법으로 사용하기 위해 모든 통상적인 방식으로 제형화한다. 투여는 당업자들에게 유효한 것으로 공지된 임의 경로를 통해 이루어진다. 예를 들어, 조성물은 경구, 비경구 (예, 정맥내), 근육내 주입, 복막내 주입, 경피로, 체외로, 코내로 또는 국소적으로 투여한다.

바람직한 투여 방법은 정맥내 주입이다. 수혈된 세포의 수는 성별, 연령, 체중, 질환 또는 장애의 타입, 장애의 병기, 세포 집단에서 원하는 세포의 퍼센트 및 치료학적 효과를 형성하는데 필요한 세포의 양과 같은 인자를 고려할 것이다. 일 특정 구현예에서, 조성물은 정맥내 주입에 의해 투여하며, 제대혈의 경우 적어도 ≥ 0.3 x 10⁵ CD34⁺/ kg 또는 > 2 x 10⁶ CD34⁺를 포함하며, 골수 또는 유동화된 말초혈 세포의 경우에는 ≥ 2.5 x 10⁵ CD34⁺/kg을 포함한다. 일 특정 구현예에서, 주입된 세포는 모두 단산에서 수득하여 증식시킨 제대혈 세포로부터 유래된다.

증식시킨 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 선조 세포는, 예를 들어 백혈병 치료의 경우, 드립 (drip)에 의해, 암 세포 박멸 또는 공여 세포의 생착 용이화를 위해 항암제, 전신 자극 또는 면역억제제로 사전치료된 환자에게 주입할 수 있다. 치료할 질환, 사전치료 및 세포 이식 방법은 담당의에 의해 적절하게 선택된다. 수여자에서 이렇게 이식된 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 선조 세포의 생착, 조혈 회복, 이식 부작용 발생 및 이식의 치료학적 효과는 이식 요법에 사용되는 일상적인 분석으로 판단할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 증식된 HSC를 이용하여 단기간 안전하고 용이하게 이식 요법을 수행하고, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 선조 세포를 증식시키는 것을 가능하게 한다.

또한, 본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 컨테이너를 포함하는 키트를 제공한다. 상기한 키트는 선택적으로 필요에 따라 원하는 바에 따라 용액 및 완충제를 포함한다. 키트는 선택적으로 본원에 기술된 방법으로 제조된 줄기 세포의 증식 집단을 포함하거나 또는 HSC의 증식된 집단을 제조하기 위한 컨테이너 또는 조성물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 본 발명에 개요에 정의된 화합물 및 HSC 증식 방법에 이러한 화합물을 사용하기 위한 설명서, 선택적으로 하나 이상의 세포 증식 인자 또는 세포 배양 배지, 특히 전술한 HSC 배양 배지를 포함하는, 조혈 줄기 세포를 생체외에서 증식시키기 위한 키트를 제공한다. 본 키트는, 항-CD34, 항-CD38 및/또는 항-CD45RA 항체 등의 세포의 생산을 모니터링하기 위한 항체를 추가로 포함할 수 있다. 일 특정 구현예에서, 이러한 키트는 IL6, FLT3-L, SCF 및 TPO로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포 증식 인자를 추가로 포함한다. 선택적으로, 이들 팩(들) 또는 키트(들)에 사용 설명서가 첨부된다.

생체내 용도: 또한, 일정 기간 동안 사용하기 위한 화합물을 1회 이상의 용량으로 포함하는, 개체에서 HSC를 증가시키기 위해 본 발명의 화합물을 유효량으로 제공하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 키트내 본 발명의 화합물의 총량은 개체에서 HSC를 증가시키는데 충분한 유효량에 해당된다. 일정 기간은 약 1일 내지 수일, 1주 내지 수주 또는 1달 내지 수개월이다. 즉, 일정 기간은 적어도 약 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 20, 21, 30 또는 60일 또는 그 이상, 또는 1 - 180일 중 임의 일수이다.

생물학적 분석

스크리닝 분석:

HSC 자가-복제에 대한 새로운 추정의 작용제를 동정하기 위해, 일차 인간 유동화된 CD34+ 세포를 대상으로 소형 분자 라이브러리 (저분자량 화합물 5,280종)를 검사하기 위한 고성능 스크리닝 분석을 개조하였다. CD34+ 세포를 분리하기 위해 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 다양한 소스들로부터 유래된 CD34+ 세포들에게 동일한 공정이 적용되는 것으로 이해된다. 단핵구 세포를 마우스 항인간 CD34+APC (BD Pharmingen)로 염색한 후, 항-APC 자기 마이크로비드 (M ACS, Miltenyi Biotec)를 이용하여 자기 표지하였다. 자기 표지된 세포를 다시 AutoMACS 컬럼을 이용하여 보유시켰다. 본 실험은, 인터루킨-6, 트롬보포이에틴, Flt-3 리간드 및 줄기 세포 인자가 보충된 배지에서 배양한 유동화된 말초혈-유래 CD34+CD45RA- 세포가, 단핵구 세포 (MNC)의 증식을 촉진시키는 동시에 CD34+CD45RA- 집단 감소와 HSC 고갈을 일으킬 것이라는 점에 기반한 것이었다. 따라서, 이러한 감소를 방지하는 저분자량의 화합물은 HSC 증식의 작용제로서 작용할 수 있다.

384웰 플레이트에서, 2000주의 CD34⁺세포/웰을 1 μM 시험 화합물 또는 0.1% DMSO (비히클)이 함유된 배지 50 ㎕에서 배양하였다. 실험 개시시와 7일 배양한 후 CD34⁺CD45RA^- 세포의 비율을 측정하였다. 여러가지 화학적 백그라운드를 가진 총 5,280종의 화합물들 중 6종이 먼저 CD34+CD45RA- 세포 증식을 촉진하였으며, 열일곱 (17) 종은 대조군 (DMSO) 대비 CD34-CD45RA+ 세포 비율 증가에 의해 확인된 바와 같이 분화를 강화하였다. CD34+CD45RA- 세포 집단의 증식을 촉진하는 이들 6종의 화합물을 2차 스크리닝에서 재-분석하였다. 이들 6종 중 4종의 화합물이 huCD34+ 세포의 생체외 증식을 촉진하는 것으로 입증된 작용 기전 (SR'1과 동일)으로 아릴 탄화수소 수용체 (AhR) 길항제로서 작용한다. 아릴 탄화수소 수용체 (AhR) 길항제가 아닌 것으로 확인된 나머지 화합물 2종은, 7일간 배양하는 동안 CD34+ 세포를 비롯한 MNC의 증식을 촉진하는 것으로 확인되었다. 이들 2종 중 하나는 화합물 1로 표시한다 (표 1).

아래 생물학적 분석을 이용하여 조혈 줄기 세포 증식에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 평가하였다. 배양 배지: 사용된 배양 배지는, 비히클 (DMSO), 양성 대조군 (SR1), 또는 본 발명의 화합물 또는 화합물들의 조합의 존재 하에, 인터루킨-6, 트롬보포이에틴, Flt-3 리간드 및 줄기 세포 인자와 같은 재조합 사이토카인들이 각각 최종 농도 100 ng/ml로 첨가된 무혈청 배지로 구성된다. 배양 배지: 1차 수확물의 CD34+ 세포의 순도는 유세포 측정으로 확인 시 90% 이상이었다. CD34+CD45RA- 서브집단은 70% 이상의 순도에 도달하였다. 세포를 40,000 cells/ml로 접종하여, 37℃, 5% CO₂에서 7-12일간 배양하였다. 장기간의 배양을 위해, 유동화된 PB로부터 유래된 200,000주의 CD34+ cells/ml을 인터루킨-6, 트롬보포이에틴, Flt-3 리간드 및 줄기 세포 인자가 각각 최종 농도 100 ng/ml로 첨가된 무혈청 배지와 함께 비히클 (DMSO), 양성 대조군 또는 본 발명의 화합물 500 nM의 존재 하에 접종하였다. 10일간 생체외 배양한 후, 화합물 1 (표 1)은 투입 값 (0일)과 비교하여 MNC의 증식을 7배 이상, CD34+ 세포에서는 5배 이상의 증가를 촉진시켰으며, 비히클에 대해 결정된 값에 비해서는 거의 4배 증가를 촉진하였다. 생체외 배양 10일 후, 화합물 1-처리 세포 (65.8±5.5%)는 비히클 (DMSO)과 함께 배양한 세포 (22.8±0.9%)에 비해 CD34 발현 수준을 높게 유지하였다. 아울러, 유일하게 화합물 1-처리 세포만 비히클 (4.7±0.4%) 대비 가장 높은 CD34+CD45RA- 집단 발현성 (24.8±0.9%)을 유지하였다. 화합물 1과 함께 배양한 CD34+CD45RA-의 수는 비히클에 비해 거의 3배 이상 증가하였으며, 투입량에 비해 7배 이상 증가하였다. 마지막으로, 본 발명의 화합물을 용량 반응 포멧 (1 nM - 5000 nM 범위의 농도)으로 분석하여, 비히클 조건에 비해 CD34+CD45RA- 세포의 수가 50% 증가하는 효과적인 농도를 확인하였다. 그 결과는 표 1에 나타낸다.

화합물 1은 아릴 탄화수소 (AhR) 경로를 통해 작용하지 않는다 (도 1)

본 발명자들은, 다음으로, 원시 CD34+CD45RA- 조혈 세포에 대한 화합물 1의 효과가 배양시 급속도록 가역적이라는 것을 입증하였다. 이 효과는, CD34+ 유동화된 말초혈 세포가 최대 7일간 화합물 1의 존재 하에 배양한 도 2에서 최고였으며, 이때 화합물 1을 세포를 세척함으로써 제거한다. 녹색 점선은, CD34+ CD45RA- 세포 비율이 대조군 배양물 (DMSO: 청색 솔리드 및 점선) 다음으로 신속하게 감소되는 반면, 화합물 1에서 유지시킨 세포는 2주간의 배양을 통해 보다 원시적인 표현형을 유지 (솔리드 녹색 선)한다는 것을 보여준다. 이들 결과는, 화합물에 노출하지 않은 2일 이내에, 세포가 대조군 배양물에서 보여지는 바와 같이 후천성 분화 마커를 이미 가진다는 것을 명확하게 보여준다. 즉, 화합물 1의 효과는 원시 인간 세포에서 급속도록 가역적이다.

화합물 1은 미토겐이 아니다 (도 3)

또한, 본 발명자들은, 화합물 1이 성장인자 부재시 세포 증식을 독립적으로 촉발시키지 않는다는 것을 입증하였다. 도 3에 나타낸 이들 결과는, 아릴 탄화수소 수용체 (SR1)의 길항제를 이용하여 관찰된 바와 유사하게, 화합물 1은 열거된 임의의 3종의 성장인자, 즉 Flt3, TPO 및 SCF의 부재시에는 세포 증식을 유도하지 못한다는 것을 보여준다. 이는, SR1과 유사하게, 원시 HSC 표현형을 생체외에서 유지하는데 있어 화합물 1의 효과는 이 집단에 대한 미토겐 효과가 아니라 세포 분화의 방지가 그 이유라는 것을 의미한다.

화합물 1과 화합물 40은 둘다 세포 분화를 방지하고 AhR 길항제와 상승 작용한다 (도 4)

또한, 본 발명자들은, 화합물 1과 또한 이의 유력한 유도체들 중 하나인 화합물 40의 세포 분화에 대한 효과를 세포 분석 및 유세포 측정을 이용하여 분석하였다. 이들 2가지 타입에 대한 실험들에서, 화합물 1과 이의 유도체 화합물 40이 세포 분화를 방지하는 것으로 나타났다. FACS 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4A는, 유동화된 말초혈 세포의 분화에 대한 화합물 1의 효과를 예시해준다. 7일간 증식시킨 후, 유동화된 말초혈의 상대적으로 순수한 (>85% CD34⁺) 집단을 대조군 (DMSO), 화합물 1, SR1 또는 화합물 1 + SR1에 노출시켰다. 그 결과, 대조군 배양시 세포가 CD34 세포 표면 발현을 빠르게 상실하는 반면, 최적 수준의 SR1 및 화합물 1을 도입함으로써 이 효과는 일부 무효화는 것으로, 명확하게 나타났다. 흥미롭게도, SR1 및 화합물 1 둘다 세포 표면 상에 CD34 발현을 유지하는데 상승적으로 작용한다. 이들 관찰 결과는 도 4B에서 제대혈 표본들에서 반복적으로 나타나며, 도 4C에서는 화합물 40에서도 동일하였다.

이 외에도, 본 발명자들은, 화합물 1 또는 화합물 40의 효과가 훨씬 원시적인 표현형을 가진 세포에서 가장 인상적이라는 것을 확인하였다. 예를 들어, CD34⁺CD45RA^- 세포 (도 4A - 4C의 하단 패널들에서 좌측 상단 사분위)는, SR1 또는 대조군 배양물에서 그러한 것 보다 화합물 1 또는 40을 첨가한 배양물에서 매우 많다. 즉, 화합물 1 또는 화합물 40 + SR1의 상가 효과가 이들 배양물들에서 관찰된다.

도 4D는 원시 인간 HSC로 농화된 집단의 표면에서 CD34 마커 소실을 방지함에 있어 화합물 40의 효과를 보여주는 용량-반응 곡선을 제시한다. 여러가지 용량의 화합물을 이용한 CD34의 발현 변화에 주목한다.

화합물 1과 40은 생체외에서 인간 HSC 표현형을 확대시킨다 (도 5)

도 5는, 화합물 1과 또한 화합물 40은 단기 및 장기간의 배양시 인간 HSC 표현형을 생체외에서 확대시킨다는 것을 보여준다. 도 5A는, 세포의 총 카운트는 CD34+ 유동화된 말초혈 (mPB)로 개시하여 12일간 유지시킨 배양물에서의 투입량 보다 약 20배 까지 증가하는 것을 보여준다. 확대 수준은, 배양을 화합물 1, SR1, 화합물 1 + SR1 또는 대조군 DMSO로 개시하든 동일하다. 가장 현저하게도, 화합물 1의 효과는 보다 원시적인 CD34⁺CD45RA^- 세포 아집단에서 관찰되며, 이는 화합물 1의 존재 시 약 10배까지, 화합물 1 + SR1의 존재시 약 15배까지 늘어난다. 이러한 관찰 결과는, 도 4의 결과와 더불어, 화합물 1이 세포 증식에는 효과가 없고 오히려 CD34⁺ CD45RA^- 세포의 분화를 방지하여, 총 증식에서 보다 성숙한 세포를 없게한다는 명확하게 보여준다. 도 5B의 결과는, 화합물 1이 7일간 CD34⁺CD45RA- 제대혈 세포를 30-40배까지 증가시키는 반면, 이들 세포는 DMSO (대조군)의 존재시 약 15배까지 증가된다는 것을 보여준다. 도 5C는 유사한 결과를 보여주지만, 이 배양 시간을 12일로 연장하였으며, 화합물 1을 화합물 40으로 대체한다. 즉, 좌측 패널에 나타낸 바와 같이, 총 세포 수 증가는 세포를 DMSO (대조군), SR1, 화합물 40 또는 화합물 40 + SR1에 노출시키든 동일하다. 가장 놀랍게도, 보다 원시적인 CD34⁺ CD45RA- 세포는 화합물 40을 첨가한 배양물에서 12일간 80배까지 증가되는 반면, 이들 세포는 SR1으로 개시한 배양물에서는 20배 보다 약간 적게 증가되어, 아릴 탄화수소 억제자 길항제 대비 이들 화합물의 우수성을 나타낸다.

요컨대, 이들 결과는, 화합물 1과 화합물 40이 유동화된 말초혈 또는 제대혈 세포로부터 유래된 CD34+를 가진, CD34⁺ 및 보다 원시적인 CD34⁺ CD45RA- 집단 둘다의 증가에 중요한 효과를 발휘한다는 것을 보여준다.

배양 (CFU-C) 분석에서 통상적인 콜로니 형성 단위를 이용하여 증식된 세포의 생체외 기능성을 검사하였다. 무처리 세포, DMSO와 함께 배양한 세포, 양성 대조군 또는 본 발명의 화합물을 메틸셀룰로스 배지에 통상적인 조건에서 접종하였다. 일 예로, 화합물 1 (표 1, 실시예 1)은 다능성 조혈 선조체들의 수를 증가시킨다. 10일간 화합물 1을 처리한 CD34+ mPB 세포 1000주의 메틸셀룰로스 배양물은, 투입한 세포 대비 다계통 (multilineage) 과립구 적혈구, 마크로파지 및 거핵구 (GEMM 콜로니)가 5배 증가되었으며, 대조군 세포에 비해 10배 증가되었다. 이는, 본원에 기술된 화합물 1이 또한 다능성 선조세포의 증가를 촉진시킨다는 것을 제시해준다.

배양된 mPB HSC에 대한 화합물 1의 효과를 NSG 마우스 모델을 이용하여 분석하였다 (도 6).

다음으로, 10-12일간 시험관내에서 증식시키고 NSG 마우스 모델에 생체내로 도입한, 제대혈 및 유동화된 말초혈 인간 HSC에 대한 화합물 1과 화합물 40의 효과를 분석하였다. 이 실험의 목표는 도 4 및 5에 나타낸 원시 HSC 표현형에 대한 본 화합물의 효과가 또한 장기간 재집락화한 골수 줄기/선조 세포에서 관찰되는지를 검증하기 위한 것이다. 도 6은 이식 후 13주간 분석한 인간 세포에 의한 마우스 골수의 재구축을 보여준다. 유동화된 혈액의 경우, 결과물 세포 50,000주 및 500,000주를 도 6A에 나타낸다. 이에 나타난 바와 같이, HSC 작용제인 SR1은 NSG 마우스 모델에서 분석시 인간 줄기 세포를 증식시키는데 있어 DMSO (대조군) 보다 항상 우수하였다. 즉, 화합물 1은 이들 실험들에서 SR1 보다 우수한 것으로 보인다. 시험관내 배양물에서 관찰되는 바와 같이, 화합물 1과 SR1은 이들 실험에서 상승 효과를 나타내었다 (도 6).

NSG 마우스 모델을 이용하여 분석한 제대혈 (CB) HSC 배양물에 대한 화합물 1과 화합물 40의 효과

도 7은, NSG 마우스 모델에서 생체내 분석한 배양한 제대혈 인간 HSC에 대한 화합물 1과 화합물 40의 효과를 보여준다. 도 7A의 결과는, 화합물 1이 대조군 배양물과 비교하여 인간 세포의 재구축 활성에 명백한 효과가 있다는 것을 보여준다. 이 실험은 단기 배양, 즉 7일 배양에서 행하였다. 가장 중요한 점은, 도 7B에서, 화합물 40이 꽤 상당한 효과를 가지며, CD34⁺세포 1500주를 이용하였을 때 평균 재구축율이 DMSO 대조군 2%와 비교하여 10%이라는 것을 보여준다. 이 실험에서, 화합물 1에 비해 높은 화합물 40의 효과 (도 7A)는 잠재적으로 도 7B에 기술된 실험들에서 사용된 보다 긴 배양 기간 때문이다. 보다 제한적인 생체내 실험들은 장기간 (12-16일)의 배양 기간을 이용한 다음 섹션에 제시된다.

NSG 마우스 모델을 이용하여 분석한 제대혈 (CB) HSC 배양물에 대한 화합물 1과 화합물 40의 효과 (도 8)

Zandstra 등은, 최근, 피드-배치로 지칭되는 새로운 방법이 인간 HSC 증식을 유도하도록 시험관내 조건을 최적화함을 입증하였다 (미국 특허 US7,795,024). 본 발명자들은, 이전에 최적화된 이러한 피드-배치 조건에서 본 발명의 화합물이 활성형인지를 검증하고자 하였다. 이 실험에서, 12일 또는 16일간 피드-배치 + 화합물 40을 이용한 시험관내 배양을 수행한 후 제대혈 유래 조혈 줄기 세포 (HSC)의 증가를 평가하였다. HSC의 수를 면역결핍 마우스에 대한 인간 세포의 생착을 기반으로 분석하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 화합물 40 (Cpd 40)을 첨가한 경우, 최대 적어도 16일간 CD34+CD45RA- 세포를 비롯하여 검사한 모든 집단들이 증가하는데, 주된 효과가 나타났다. 이 효과는 12-16일 시점에 가장 현저하였으며, 피드-배치 (도 8에서 FB)와 화합물 40 간의 상승 작용을 입증해준다.

아울러, 신선하게 농화한 CD34+ 세포와 12 또는 16일간 증식시킨 세포를, 이식하기 24시간 전에 치사 수준 (250rad) 이하로 방사선 조사한 NOD/SCID/IL-2Rγc-null (NSG) 암컷 마우스에 이식하였다. 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 지정된 시점 (3주, 9주 및 16주)에, 동물을 희생시키고, 골수를 2개의 경골과 2개의 대퇴부에서 회수하였다. 골수에서 적혈액 세포를 고갈시키고, 유세포 측정으로 분석하여, 인간 세포의 생착을 정량하였다. 세포의 ≥0.5%가 인간 CD45 및 인간 HLA-ABC에 대해 양성인 경우 세포를 생착에 대해 양성으로 계수하였다. 각 분석 시점에, 일부 동물들은 독립적인 조직 분석을 위해 이송시켰다.

하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 이후 16주에, 각 조건에서 용량에 따른 생착 반응이 존재한다. 제한 희석 분석에서, 피드-배치 + 화합물 40을 12일간 배양하였을 때 최고 수준의 HSC 증식이 이루어지는 것이 확인되었다 (18.4배). 이는, 피드-배치 대조군 12일 배양시 이루어지는 증식 (8.1배) 보다 현저하게 높았다. 양쪽 조건에서 12일 배양시 16일 배양에 비해 증식 수준이 더 높았다. 이들 결과는, 화합물 40의 존재시 시험관내 인간 HSC의 총 증식과 피드-배치 조건에서의 이의 활성에 대한 명확한 입증을 제공해준다 (도 8 + 표 2).

표 2: 16주의 제한 희석 생착 데이타 요약

조건	HSC 빈도	TNC 증식	0일 HSC 당량	총 HSC 증식*
0일 신선	1/6115	NA	1/6115	NA
12일 피드-배치	1/117676	156	1/754.3	8.1
12일 피드-배치 + Cpd 40	1/54548	164	1/332.6	18.4
16일 피드-배치	1/635952	413	1/1539.8	4
16일 피드-배치 + Cpd 40	1/323585	495	1/653.7	9.4

* 총 HSC 증식 = (# HSC 0일)/(# HSC 12일 또는 16일); 16주에 NSG 마우스에서 제한 희석 분석 (LDA)을 이용하여 측정함

합성 방법

후술되는 합성 방법은, 치환기 Z가 피리미도 인돌 핵의 7번 위치에 존재하는 본 발명의 구현예들에 관한 것이다. 당업자들이 알 수 있는 바와 같이, 치환기 Z가 예를 들어 5, 8 또는 6번 위치, 특히 6번 위치 등의 다른 위치에 존재하는 본 발명의 구현예들에 대해 이들에게 명확한 변형이 가미된 유사한 합성 방법을 수행할 수 있다.

반응식 1은 공통 전구체 (1-VI)를 본 발명의 화합물로 합성하는 과정을 기술한다. 제1 단계에서, 아릴 플루오라이드 1-I에 비제한적인 예로 수소화나트륨 등의 염기의 존재 하에 알킬 시아노아세테이트 1-II를 처리한다. 수득되는 산물 1-III에 비제한적인 예로 아세트산 중의 아연 분진 등의 환원제를 처리하여, 아미노 인돌 1-IV을 제조한 다음 이를 포름아미드 및 암모늄 포르메이트로 처리하여 피리미딘 1-V로 변환한다. 화합물 1-V에 포스포릴 클로라이드 또는 포스포릴 브로마이드 등의 시약을 처리하여 반응 중간산물 1-VI을 수득하고, 여기에 아민 1-VII을 처리하여 본 발명의 화합물 1-VIII을 제조한다.

반응식 1

반응식 2는 화합물 2-V의 제조 방법을 기술한다. 4,6-다이클로로-5-요오도피리미딘 2-II를, 대응되는 페놀, 아닐린 또는 티오페놀을 염기 (Morsin M. et al. Chemistry-A European Journal, 2009, vol.　15,　#6, pp.　1468-1477) 또는 팔라듐 촉매의 첨가 하에 또는 첨가없이 반응시켜, 중간산물 2-III를 제조한다. 수득되는 중간산물 2-III는 Pd(OAc)₂를 이용하여 삼환식 부가 생성물 2-IV로 변환시킨다 (Zhang M. et al. Tetrahedron Letters, 2002, vol.43, p. 8235). 마지막으로, 후술된 실시예 1에 따라 본 발명의 화합물 2-V를 수득한다.

반응식 2

반응식 3: 화합물 4-II에 하이드록실 아민을 처리한 다음 다이메틸아세트아미드 다이메틸아세탈을 처리한다 (Tully W.R. et al. Journal of Medicinal Chemistry, 1991, vol. 34, p. 2060. 이로써 화합물 5-I을 수득한다.

반응식 3

반응식 4: 중간산물 1B (하기 실시예 1)에 HCl/다이옥산 중의 프로피오니트릴을 처리한 다음 염기적 처리를 수행하여, 메틸 2-에틸-4-하이드록시-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (6-I)를 수득한다. 그런 후, 실시예 1에 기술된 공정에 따라 화합물 6-II를 수득한다.

반응식 4

반응식 5: 메틸 3-플루오로-4-니트로벤조에이트 7-I으로부터 실시예 1의 공정에 따라, 화합물 7-II를 수득한다.

반응식 5

실시예

일반적인 사항

기록한 HPLC 체류 시간은 다음과 같은 조건, 즉 용매 A: MeOH:H₂O:TFA (5:95:0.05); 용매 B: MeOH:H₂O:TFA (95:5:0.05); 유속: 3.0 mL/min; 농도 구배 2.0분간 0 -> 100% B; 컬럼: ZorbaxC18, 3.5 ㎛, 4.6 x 30 mm: 파장 220 nm를 이용한, 역상 HPLC (Agilent, 1200 시리즈)에 대한 것이다.

질량 스펙트럼은 Agilent Technologies 사의 6210 G1969A LC/MSD TOF 스펙트로미터 또는 Agilent Technologies 상의 Quadrupole LC/MS Model G6120B에서 다음과 같은 LC 조건을 이용하여 기록하였다: 용매 A: AcCN:H₂O:HCOOH (5:95:0.05); 용매 B: AcCN:H₂O:HCOOH (95:5:0.05); 2.0분간 농도 구배 0 -> 100% B; 유속: 0.3 mL/min; 컬럼: ZorbaxC18, 3.5 ㎛, 2.1 x 30 mm; 파장 220 nm.

실험 공정들

실시예 1

메틸 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트

중간산물 1A

메틸 4-(1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸)-3-니트로벤조에이트

에틸 2-시아노아세테이트 (10.9 mL, 102 mmol)를 천천히 N,N-다이메틸포름아미드 (125 mL) 중의 60% 수소화 나트륨 현?물 (4.10 g, 102 mmol)에 0℃에서 첨가하여, 회색 현탁물을 수득하였다. 혼합물을 0℃에서 15분간 교반하고, N,N-다이메틸포름아미드 (125 mL) 중의 메틸 4-플루오로-3-니트로벤조에이트 (10.2 g, 51 mmol)를 첨가하였다. 수득되는 암적색 혼합물을 0℃에서 30분간 교반하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1N HCl (40 mL) 및 에틸 아세테이트 (40 mL)로 희석하였다. 분리한 수 층을 에틸 아세테이트 (3 x 50 mL)로 추출하였다. 유기 층을 조합하여, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조, 여과 및 농축하여, 잔사 (26 g)를 수득하고, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여 (100% 헥산으로 시작하여, 점차적으로 에틸 아세테이트를 농도를 높이면서 첨가하여 100% 에틸 아세테이트로 종결함), 14.9 g의 표제 화합물을 수득하였다. LCMS m/z 291.0 (M - H)^-, 체류 시간 (분석용 HPLC) = 1.76분.

중간산물 1B

3-에틸 6-메틸 2-아미노-1H-인돌-3,6-다이카르복실레이트

500 mL의 둥근 바닥 플라스크에 메틸 4-(1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸)-3-니트로벤조에이트 (14.9 g, 51.0 mmol)와 아연 분진 (16.7 g, 255 mmol)을 아세트산 (255 mL) 중에서 첨가하여, 회색의 현탁물을 수득하였다. 아연 첨가는 실온에서 질소 분위기 하에 35분간 수행하였으며, 명확하게 발열 반응이었다. 혼합물을 15시간 동안 100℃에서 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고, 셀라이트로 여과한 다음 에틸 아세테이트로 헹구었다. 증발시켜 잔류물을 수득하고, 이를 다이클로로메탄-헥산에서 트리튜레이션하고, 여과하여 6.3 g의 표제 화합물을 수득하였다. LCMS m/z 263.2 (M + H)⁺, 체류 시간 (분석용 HPLC) = 1.90분.

중간산물 1C

메틸 4-하이드록시-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트

100 mL의 둥근 바닥 플라스크에, 3-에틸 6-메틸 2-아미노-1H-인돌-3,6-다이카르복실레이트 (1.1 g, 4.19 mmol), 암모늄 포르메이트 (0.53 g, 8.39 mmol) 및 포름아미드 (16.7 mL, 419 mmol)를 넣어, 황갈색 (tan) 현탁물을 수득하였으며, 이를 12시간 동안 165℃로 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물을 첨가하였다. 수득되는 석출물을 여과하고, 공기 중에 건조한 다음 고 진공 하에 밤새 건조하여, 1.1 g의 표제 화합물을 수득하였다. LCMS m/z 244.2 (M + H)⁺, 체류 시간 (분석용 HPLC) = 1.51분.

중간산물 1D

메틸 4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트

100 mL의 둥근 바닥 플라스크에, 메틸 4-하이드록시-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (1.1 g, 4.5 mmol) 및 포스포러스 옥시클로라이드 (15 mL, 161 mmol) 혼합물을 넣어, 16시간 동안 90℃로 가열한 다음, 실온으로 냉각시키고, 감압 증발시켰다. 잔류물을 다이클로로메탄 (20 mL)에 현탁하여, 셀라이트로 여과하였다. 증발시켜, 표제 화합물을 오렌지색 고형물로 수득하였다 (360 mg). LCMS m/z 262.0 (M+H)⁺, 체류 시간 (분석용 HPLC) = 2.02분.

실시예 1

2-5 mL의 마이크로웨이브 바이얼에, 메틸 4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (86 mg, 0.33 mmol), 트리에틸아민 (0.09 mL, 0.66 mmol) 및 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-아민 (0.078 mL, 0.49 mmol)을 메탄올 (2 mL) 중에 넣고, 혼합물을 마이크로웨이브 반응기에서 15분간 140℃로 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 감압 증발시켰다. 조 물질을 N,N-다이메틸포름아미드에 용해하고, 역상 Zorbax SB-C18 컬럼 21.2 x 100 mm에서 정제하여 MeOH - 물 - 0.1% TFA로 용출시켰다. 농도 구배: 4분간 등용매 20% -> 15분간 100% MeOH까지 농도 구배. 표제 화합물을 트리플루오로아세트산 염으로서 수득하였다 (대응되는 유리 염기 및 HCl 염은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 표준 공정에 따라 제조하였음). LCMS m/z 368.2 (M+H)⁺, 체류 시간 (분석용 HPLC) = 1.38분.

실시예 14

7-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-아민 및 7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-아민.

중간산물 14A

4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르보니트릴

4-플루오로-3-니트로벤조니트릴에서 출발하여, 중간산물 2A를 실시예 1에 기술된 공정에 따라 제조하였다.

중간산물 14B

N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)-7-(2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-아민

2-5 mL의 마이크로웨이브 바이얼에, 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르보니트릴 (47.5 mg, 0.142 mmol) 및 아지도트리부틸틴 (409 ㎕, 1.491 mmol)을 (트리플루오로메틸)벤젠 (2 mL)) 중에 넣어, 황갈색 현탁물을 수득하였다. 바이얼을 마이크로웨이브 하에 배치하여, 30분간 180℃로 가열하였다. 혼합물을 건조물로 농축하고, MeOH (3 mL)와 이후 다이옥산 (1.07 mL, 4.26 mmol) 중의 HCl 4M을 첨가하여, 노란색 용액을 수득하였다. 수득한 용액에 다이에틸 에테르 (3 mL)를 첨가하여, 20℃에서 16시간 동안 교반하였다. 수득한 고형물은 부흐너 (Buchner) 상에 수집하였다. 케이크를 다이에틸 에테르 (3 x 1 mL)로, 그리고 헥산 (3 x 1 mL)으로 헹군 다음, 고형물을 중량이 일정해질 때까지 고 진공 하에 30℃에서 건조하여, 56 mg의 표제 화합물을 HCl 염으로서 수득하였다. LCMS m/z 378.2 (M+H)⁺, 체류 시간 (분석용 HPLC) = 1.30분.

실시예 14

7-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-아민 및 7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-아민

25 mL의 둥근 바닥 플라스크에, N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)-7-(2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-아민 하이드로클로라이드 (43 mg, 0.10 mmol) 및 N,N-다이이소프로필에틸아민 (36 ㎕, 0.21 mmol)을 테트라하이드로푸란 (2 mL)과 메탄올 (0.5 ml) 중에 넣어, 황갈색 현탁물을 수득하였다. 그런 후 헥산 (260 ㎕, 0.52 mmol) 중의 트리메틸실릴다이아조메탄 2M을 첨가하였다. 수득되는 묽은 노란색 현탁물을 20℃에서 3시간 교반하고, 아세트산 (59 ㎕, 1.04 mmol)을 첨가하였다. 30분간 계속 교반하고, 용매를 진공 하에 제거하여, 잔류물을 수득한 후, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (100% 다이클로로메탄으로 시작하며, 점차적으로 다이클로로메탄 : 메탄올 : 28%wt. 수성 암모늄 하이드록사이드 (90 : 10 : 1) 혼합물을 농도를 증가시키면서 첨가하여 100% 다이클로로메탄 : 메탄올 : 28%wt. 수성 암모늄 하이드록사이드 (90 : 10 : 1)에서 종료함). 수득되는 1차 용출 산물은 7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-아민 (19 mg)이었다. LCMS m/z 392.2 (M+H)⁺, 체류 시간 (분석용 HPLC) = 1.44분. 2차 용리 산물은 7-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)-N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-아민 (5 mg)이었다. LCMS m/z 392.2 (M+H)⁺, 체류 시간 (분석용 HPLC) = 1.27분.

실시예 15

DMF (53 mL) 중의 차가운 2-시아노아세트아미드 (7.18 g, 85 mmol) 용액에, NaH (3.41 g, 85 mmol)를 나누어 첨가하였다. 실온에서 30분 후, DMF 15 mL 중의 메틸 4-플루오로-3-니트로벤조에이트 (8.5 g, 42.7 mmol) 용액을 점적 첨가하였다. 3시간 후, 얼음, 물 및 12 mL HCl (10%) 혼합물을 첨가하였다. 수득한 고형물을 여과하여 물로 헹군 다음 고 진공 하에 밤새 건조하여, 9.1 g의 메틸 4-(2-아미노-1-시아노-2-옥소에틸)-3-니트로벤조에이트를 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 3.93 (s, 3 H) 5.78 (s, 1 H) 7.77 (s, 1 H) 7.91 (d, J=7.83 Hz, 1 H) 8.04 (s, 1 H) 8.39 (dd, J=8.02, 1.76 Hz, 1H) 8.56 (d, J=1.56 Hz, 1 H).

패릭 클로라이드 헥사하이드레이트 (1.540 g, 5.70 mmol)와 아연 (1.242 g, 19.00 mmol)을, DMF (4.75 mL) 및 물 (4.75 mL) 중의 상기에서 제조한 조산물 시아노-아미드 (0.5 g, 1.900 mmol)의 용액에 첨가하여, 노란색 현탁물을 수득하였다. 발열 후, 혼합물을 45분간 100℃로 가열한 다음, 서서히 20℃로 냉각시켜 22시간 동안 교반하였다. 고형물을 여과하여, DMF (3 x 3 mL)로 헹군 다음, 여과물을 0℃에서 교반하면서 물 (40 mL)로 희석하였다. 고형물을 여과하고, 케이크를 물 (2 x 5 mL)로 헹구었다. 고형물은 대부분 불순물들을 포함한다. 수층을 EtOAc (3 x 50 mL)로 추출하고, 조합한 유기 층들을 물 (50 mL)과 이후 브린 (30 mL)으로 헹구었다. 유기 층을 무수 MgSO₄ 상에서 건조한 다음 여과 및 농축하여, 갈색 고형물 287 mg을 수득하였으며, 이에 아세톤 (6 mL)을 처리하여 고형 현탁물을 수득한 다음 이를 헥산 (5 mL)으로 희석하였다. 그런 다음, 고형물을 수집하고, 중량이 일정해질 때까지 고 진공 하에 40℃에서 건조하여, 중간산물 15B 메틸 2-아미노-3-카바모일-1H-인돌-6-카르복실레이트 (162 mg, 36.6% 수율)를 오프-화이트 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 3.80 (s, 3 H) 6.62 (br. s., 2 H) 7.04 - 7.18 (m, 2 H) 7.53 - 7.63 (m, 2 H) 7.72 (s, 1 H) 10.80 (s, 1 H); MS m/z 232.2 (M+H)⁺; HPLC ca. 96%, RT = 1.37분.

메탄올 (0.954 mL) 중의, 중간산물 15B (0.100 g, 0.429 mmol), 메틸 2-(피리딘-3-일)아세테이트 (0.130 g, 0.858 mmol) 및 MeOH (0.196 mL) 중의 소듐 메톡사이드 25%wt의 혼합물을, 마이크로웨이브 오븐에 넣어, 45분간 140℃로 가열하였다. 냉각 후, AcOH (0.050 mL, 0.879 mmol)를 첨가하여, 수득되는 슬러리를 20℃에서 1시간 교반하였다. 고형물을 여과하여, MeOH (3 x 0.5 mL)로 헹군 다음, 무게가 일정해 질때까지 고 진공 하에 20℃에서 건조하여, 중간산물 15C: 메틸 4-하이드록시-2-(피리딘-3-일메틸)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (82 mg, 57.2% 수율)를 갈색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 3.87 (s, 3 H) 4.09 (s, 2 H) 7.34 - 7.40 (m, 1 H) 7.79 (dt, J=8.1, 1.8 Hz, 1 H) 7.83 (dd, J=8.2, 1.2 Hz, 1 H) 7.99 (d, J=0.8 Hz, 1 H) 8.02 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 8.48 (dd, J=4.9, 1.4 Hz, 1 H) 8.60 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 12.49 (br. s., 2 H): MS m/z 335.2 (M+H)⁺; HPLC 95.2% @ 220 nm 및 92.8% @ 254 nm, RT = 1.42분.

POCl₃ (0.948 mL, 10.17 mmol) 중의 메틸 4-하이드록시-2-(피리딘-3-일메틸)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.050 g, 0.150 mmol) 혼합물을 바이얼에 넣고, 마이크로웨이브 오븐에서 15분간 175℃로 가열하였다. 냉각 후, 반응 혼합물을 빙수 (19 mL)에 부은 후 50% NaOH 수용액 (2.7 mL)을 서서히 첨가하여 pH 8로 염기성화한 다음, 마지막으로 EtOAc (20　mL)로 희석하고, 고형물을 여과 (1차 클로라이드 수확)한 다음 수층을 EtOAc (20 mL)로 추출하고, 조합한 유기 층들을 무수 MgSO₄ 상에 건조, 여과 및 건조물로 농축하여, 원하는 클로라이드 유도체 35 mg을 추가로 수득하였다. 분리한 메틸 4-클로로-2-(피리딘-3-일메틸)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (53 mg, 100% 수율) 수확물들을 조합하여, 다음 단계에 바로 사용하였다.

MeOH (2.5 mL) 중의, 메틸 4-클로로-2-(피리딘-3-일메틸)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.053 g, 0.150 mmol), 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-아민 (0.072 mL, 0.451 mmol) 및 트리에틸아민 (0.063 mL, 0.451 mmol) 혼합물을 바이얼에 넣고, 마이크로웨이브 오븐에서 15분간 140℃로 가열하였다. 냉각시키고, 용매를 증발시킨 후, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 23 mg의 노란색 오일 + 고형물을 수득하였고, 이를 CH₃CN (3 mL)으로 희석하여 30분간 교반하였다. 고형물을 여과하여 CH₃CN (2 x 0.5 mL)으로 세척한 다음, 중량이 일정해질 때까지 고 진공 하에 30℃에서 건조하여, 실시예 15의 화합물: 메틸 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-2-(피리딘-3-일메틸)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (11 mg, 16% 수율)를 황갈색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 1.31 - 1.44 (m, 2 H) 1.44 - 1.56 (m, 4 H) 1.71 - 1.86 (m, 2 H) 2.17 - 2.47 (m, 6 H) 3.56 - 3.66 (m, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.08 (s, 2 H) 7.28 - 7.34 (m, 1 H) 7.43 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 7.76 (dt, J=7.8, 2.0 Hz, 1 H) 7.81 (dd, J=8.2, 1.4 Hz, 1 H) 7.99 (d, J=1.4 Hz, 1 H) 8.35 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 8.41 (dd, J=4.7, 1.6 Hz, 1 H) 8.59 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 12.08 (s, 1 H); MS m/z 459.2 (M+H)⁺; HPLC >99.5%, RT = 1.43분.

실시예 22

MeOH (3.8 mL) 중의 메틸 2-((벤질옥시)(페닐)메틸)-4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (실시예 15에 기술된 바와 같이 제조함, 0.228 g, 0.498 mmol), 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-아민 (0.158 mL, 0.996 mmol) 및 트리에틸아민 (0.173 mL, 1.245 mmol) 혼합물을 마이크로웨이브 오븐에 넣어, 140℃에서 30분간 열처리하였다. 실온으로 냉각한 후, 혼합물을 건조물로 농축하고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 메틸 2-((벤질옥시)(페닐)메틸)-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (172 mg, 61.3% 수율)를 연노란색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.29 - 1.42 (m, 2 H) 1.42 - 1.56 (m, 4 H) 1.72 - 1.91 (m, 2 H) 2.18 - 2.47 (m, 6 H) 3.66 (tt, J=13.2, 6.6 Hz, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.54 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 4.64 (d, J=12.1 Hz, 1 H) 5.50 (s, 1 H) 7.21 - 7.43 (m, 8 H) 7.51 (t, J=5.9 Hz, 1 H) 7.57 (d, J=7.0 Hz, 2 H) 7.82 (dd, J=8.2, 1.2 Hz, 1 H) 8.00 (d, J=1.2 Hz, 1 H) 8.38 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.22 (s, 1 H); HRMS m/z 564.2979 (M+H)⁺; HPLC 99.6%, RT = 2.02분.

유도체 메틸 2-((벤질옥시)(페닐)메틸)-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.042 g, 0.075 mmol)에 대해 Pd-C 10%wt (50% wet) (0.159 g, 0.075 mmol) 및 암모늄 포르메이트 (0.235 g, 3.73 mmol)의 존재하에 수소 하에 메탄올 중에서 벤질 기의 수소화 분해를 수행하였다. 55℃에서 26시간 교반한 후, 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고, MeOH로 헹군 다음 rotovap에서 건조물로 농축하여, 잔류물 133 mg을 수득한 다음, 이를 Zorbax SB-C18 컬럼 21.2 x 150 mm을 이용하여 MeOH - 물 - 0.1% TFA로 용출시켜 RP HPLC로 정제함으로써 21.9 mg (50% 수율)의 실시예 22: 메틸 2-(하이드록시(페닐)메틸)-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트, TFA 염을 백색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.30 - 1.43 (m, 1 H) 1.52 - 1.73 (m, 3 H) 1.79 (br. d, J=14.5 Hz, 2 H) 1.96 - 2.09 (m, 2 H) 2.54 (s, 1 H) 2.74 - 2.89 (m, 2 H) 3.11 (dt, J=10.4, 5.4 Hz, 2 H) 3.38 (d, J=12.1 Hz, 2 H) 3.71 - 3.77 (m, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 5.63 (s, 1 H) 7.19 - 7.26 (m, 1 H) 7.27 - 7.35 (m, 2 H) 7.48 - 7.56 (m, 2 H) 7.62 (t, J=5.9 Hz, 1 H) 7.85 (dd, J=8.2, 1.4 Hz, 1 H) 8.03 (d, J=1.4 Hz, 1 H) 8.38 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 8.92 (br. s., 1 H) 12.21 (s, 1 H); HRMS m/z 474.2511 (M+H)⁺; HPLC >99%, RT = 1.68분.

데스-마틴 페리오디난 시약 (22.67 mg, 0.053 mmol)을, DCM (1000 ㎕, 15.54 mmol) 중의 메틸 2-(하이드록시(페닐)메틸)-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (실시예 22의 화합물) 및 TFA (15.7 mg, 0.027 mmol) 혼합물에 첨가하여, 연한 오렌지색 용액을 제조하였다. 1시간 후, 용매를 증발시키고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 실시예 23: 메틸 2-벤조일-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (10 mg, 79% 수율)를 연노란색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.27 - 1.36 (m, 2 H) 1.36 - 1.48 (m, 4 H) 1.74 - 1.88 (m, 2 H) 2.14 - 2.44 (m, 6 H) 3.52 - 3.68 (m, 2 H) 3.91 (s, 3 H) 7.54 (t, J=7.8 Hz, 2 H) 7.69 (t, J=7.4 Hz, 1 H) 7.76 (t, J=5.1 Hz, 1 H) 7.90 (dd, J=8.2, 1.4 Hz, 1 H) 7.94 (d, J=7.0 Hz, 2 H) 8.10 (d, J=1.4 Hz, 1 H) 8.52 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.43 (s, 1 H) ; HRMS m/z 472.2342 (M+H)⁺; HPLC 97.1% @ 220 nm 및 98.9% @ 254 nm, RT = 1.86분.

실시예 25

하이드록실아민 하이드로클로라이드 (0.08 g, 1.2 mmol)를, MeOH (4.00 mL) 및 피리딘 (0.666 mL) 중의 메틸 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (실시예 33) (0.285 g, 0.515 mmol)에 첨가하여, 노란색 용액을 수득하였다. 5일간 60℃에서 가열한 후, 혼합물을 건조물로 농축하고, 잔류물을 DCM (75 mL) 및 MeOH (15 mL)에 용해시켜, 이 용액을 포화 NaHCO₃ (20 mL)로 헹구었다. 수층을 CH₂Cl₂ (50 mL) 및 MeOH (10 mL) 혼합물로 2번 추출하고, 유기 층을 조합하여 무수 MgSO₄ 상에서 건조, 여과 및 건조물로 농축하여, 메틸 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-(하이드록시이미노)에틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (293 mg, 100% 수율)를 오프-화이트 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.32 - 1.43 (m, 2 H) 1.44 - 1.56 (m, 4 H) 1.76 - 1.87 (m, 2 H) 2.23 - 2.44 (m, 6 H) 3.57 - 3.67 (m, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.04 - 4.12 (m, 2 H) 7.25 - 7.33 (m, 1 H) 7.34 - 7.46 (m, 2 H) 7.50 (m, J=7.6, 4.1 Hz, 1 H) 7.55 (d, J=7.4 Hz, 1 H) 7.81 (dd, J=8.2, 1.2 Hz, 1 H) 7.99 (d, J=1.2 Hz, 1 H) 8.36 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.07 (d, J=3.5 Hz, 1 H); MS m/z 569.2 (M+H)+; HPLC >95%, RT = 1.88분.

토실 클로라이드 (0.048 g, 0.251 mmol)를, DCM (10.00 mL) 중의 메틸 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-(하이드록시이미노)에틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.130 g, 0.229 mmol), 4-다이메틸아미노피리딘 (2.79 mg, 0.023 mmol) 및 트리에틸아민 (0.038 mL, 0.274 mmol)의 차가운 혼합물에 첨가하여, 백색 현탁물을 제조하였다. 이를 실온에서 1시간 경과한 후, 호박색 용액을 DCM (10 mL)으로 희석하여 물 (3 x 10 mL)로 헹구었다. 유기 층을 무수 MgSO4 상에서 건조 및 여과하고, 건조물로 농축하여, 메틸 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-((토실옥시)이미노)에틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (188 mg, 99%의 수율)를 황갈색 폼으로서 수득하였다: MS m/z 723.2 (M+H)+; HPLC >89%, RT = 2.09분.

-78℃로 냉각시킨 DCM (5.00 mL) 중의 메틸 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-((토실옥시)이미노)에틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.188 g, 0.260 mmol) 용액에, 암모니아 (1.689 mL, 78 mmol)를 첨가하고, 시험관을 밀봉하여 20℃까지 승온시켰다. 반응 혼합물은 시간 경과에 따라 청색으로 변하였고, 3.5시간 후 다시 -78℃로 냉각시킨 다음 septa + 질소 유출구를 이용하여 20℃까지 서서히 승온시켜 암모니아 대부분을 증발시켰다. 3.5시간 후, 반응 혼합물을 부흐너로 여과하여 암모늄 p-톨루엔설포네이트 대부분을 제거하고, 고형물을 DCM (3 x 1.5 mL)으로 헹군 다음 여과물을 건조물로 농축하여, 노란색 폼을 수득하였으며, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 메틸 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-2-(3-(3-(트리플루오로메틸)다이아지리딘-3-일)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (115 mg, 78% 수율)를 백색 폼으로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.31 - 1.43 (m, 2 H) 1.50 (quin, J=5.3 Hz, 4 H) 1.80 (dt, J=14.1, 7.0 Hz, 2 H) 2.32 (m, J=6.7, 6.7 Hz, 6 H) 3.58 - 3.67 (m, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 3.93 (br. d, J=7.4 Hz, 1 H) 4.05 (br. d, J=8.6 Hz, 1 H) 4.07 (s, 2 H) 7.32 - 7.43 (m, 3 H) 7.47 (m, J=6.3 Hz, 1 H) 7.59 (s, 1 H) 7.81 (dd, J=8.4, 1.2 Hz, 1 H) 7.99 (d, J=1.2 Hz, 1 H) 8.35 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 12.07 (s, 1 H); MS m/z 568.2 (M+H)⁺; HPLC >94%, RT = 1.72분.

요오드 (0.028 g, 0.111 mmol)를 DCM (2 mL) 중의 메틸 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-2-(3-(3-(트리플루오로메틸)다이아지리딘-3-일)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.060 g, 0.106 mmol) 및 트리에틸아민 (0.044 mL, 0.317 mmol) 혼합물에 첨가하여, 노란색 용액을 수득한다. 15분 후, 용매를 감압 증발시켜 잔류물을 수득하고, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 노란색 폼으로서 95 mg을 수득하였다. 이 폼을 DCM (15 mL)에 용해하여, 포화 NaHCO₃ (10 mL)로 헹군 다음. 유기 층을 무수 MgSO₄ 상에서 건조, 여과 및 건조물로 농축하여, 실시예 25의 화합물: 메틸 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-2-(3-(3-(트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (50 mg, 84% 수율)를 연노란색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.36 (m, J=5.1 Hz, 2 H) 1.48 (quin, J=5.5 Hz, 4 H) 1.76 (quin, J=7.0 Hz, 2 H) 2.30 (br. t, J=6.5, 6.5 Hz, 6 H) 3.54 - 3.67 (m, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.09 (s, 2 H) 7.14 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 7.26 (s, 1 H) 7.38 - 7.47 (m, 2 H) 7.52 (d, J=7.4 Hz, 1 H) 7.81 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.99 (s, 1 H) 8.35 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.06 (s, 1 H); HRMS m/z 566.2497 (M+H)⁺; HPLC 94.5% @ 220 nm 및 92.9% @ 254 nm, RT = 2.05분.

실시예 33 및 34

메틸 2-(3-브로모벤질)-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (실시예 15에서와 같이 제조함, 0.090 g, 0.168 mmol), 트리에틸실란 (0.054 mL, 0.336 mmol) 및 PdCl₂(dppf) (6.14 mg, 8.39 μmol) 용액에 CO 가스를 버블링한 다음, 혼합물을 밤새 95℃에서 가열하였다. 조 혼합물을 분취용 HPLC로 정제하여, 44 mg의 카르보닐화된 산물을 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.28 - 1.40 (m, 1 H) 1.50 - 1.72 (m, 3 H) 1.73 - 1.84 (m, 2 H) 1.95 - 2.06 (m, 2 H) 2.74 - 2.87 (m, 2 H) 3.03 - 3.12 (m, 2 H) 3.33 - 3.41 (m, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.20 (s, 2 H) 7.46 - 7.60 (m, 2 H) 7.73 (d, J=7.83 Hz, 1 H) 7.79 (d, J=7.43 Hz, 1 H) 7.84 (dd, J=8.22, 1.57 Hz, 1 H) 7.91 (s, 1 H) 8.01 (d, J=1.17 Hz, 1 H) 8.37 (d, J=8.61 Hz, 1 H) 8.92 (br. s., 1 H) 10.00 (s, 1 H) 12.16 (s, 1 H).

트리메틸(트리플루오로메틸)실란 (0.7 mL, 3.5 mmol)을, 0℃로 냉각시킨 메틸 2-(3-포르밀벤질)-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.260 g, 0.535 mmol) 및 세슘 플루오라이드 (5.69 mg, 0.037 mmol) 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 2일간 교반한 후, 2 mL 수 중의 진한 HCl (0.5 mL)를 첨가하여, 15분간 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하여, Na₂CO₃ 고형분으로 중화한 다음, 상을 분리하여 수 층을 EA로 2번 추출하였다. 조합한 유기 층들을 물로 헹구고, 무수 MgSO₄ 상에 건조, 여과 및 용매를 제거하여 잔류물을 수득하고, 이를 분취용 HPLC로 정제하여, 126 mg의 대응되는 TFA 염을 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.24 - 1.43 (m, 1 H) 1.49 - 1.73 (m, 4 H) 1.73 - 1.82 (m, 2 H) 1.97 - 2.07 (m, 2 H) 2.80 (q, J=11.70 Hz, 2 H) 3.02 - 3.12 (m, 2 H) 3.36 - 3.42 (m, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.10 (s, 2 H) 5.12 (q, J=7.17 Hz, 1 H) 6.81 (br. s., 1 H) 7.30 - 7.35 (m, 2 H) 7.36 - 7.42 (m, 1 H) 7.48 - 7.58 (m, 2 H) 7.84 (dd, J=8.41, 1.37 Hz, 1 H) 8.01 (s, 1 H) 8.37 (d, J=8.61 Hz, 1 H) 8.95 (br. s., 1 H) 12.17 (s, 1 H); MS m/z 554.2 (M+H)+; HPLC RT 2.142분.

데스-마틴 페리오디난 (56.5 mg, 0.133 mmol)을 DCM (753 ㎕) 중의 메틸 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-하이드록시에틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (20 mg, 0.036 mmol)에 첨가하여, 백색 현탁물을 수득하였다. 이를 20℃에서 1시간 교반한 후, 혼합물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 메틸 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트를 실시예 33에서와 같이 (18.4 mg, 92% 수율) 노란색 고형물로 수득하였다: DMSO-d₆에서의 ¹H NMR은 원하는 산물과 동일하였지만, 수화물 형태의 존재로 인해 복합적이었다; HRMS m/z 554.2384 (M+H)⁺; HPLC >95%, RT = 1.76 및 1.87분 (케톤 + 수화물).

실시예 35

중간산물 35B: N2 이성질체 전구체

톨루엔 (165 mL) 중의 4-플루오로벤조니트릴 (5 g, 41.3 mmol), 다이부틸틴 옥사이드 (2.055 g, 8.26 mmol) 및 트리메틸실릴 아지드 (8.22 mL, 61.9 mmol) 혼합물을 100℃로 가열하여, 16.5시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각한 후, 유기 층을 NaOH 1M (83 mL)로 추출하고, 수층을 EtOAc (2 x 85 mL)로 헹구었다. 수층을 HCl 2M (41.3 mL)을 첨가하여 pH 2로 산성화하였다. 수성 혼합물을 EtOAc로 2번 추출하고 (200 mL -> 100 mL), 조합한 유기 층들을 브린 (60 mL)으로 세척한 다음, 무수 MgSO₄ 상에서 건조, 여과 및 건조물로 농축하여, 중간산물 35A (5-(4-플루오로페닐)-2H-테트라졸, 6.61 g, 98% 수율)를 백색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 7.42 - 7.53 (m, 2 H) 8.04 - 8.14 (m, 2 H); MS m/z 165.2 (M+H)⁺; HPLC >99.5%, RT = 1.96분.

아세토니트릴 (115 mL) 중의 5-(4-플루오로페닐)-2H-테트라졸 (6.61 g, 40.3 mmol), K₂CO₃ (6.68 g, 48.3 mmol) 및 요오도메탄 (3.02 mL, 48.3 mmol) 혼합물을 1시간 동안 환류 가열하였다 (ca. 82℃). 냉각 후, 혼합물을 건조물로 농축하고, 잔류물을 물 (75 mL)과 EtOAc (100 mL)로 분할하였다. 층 분리를 수행하고, 수층을 back-EtOAc (50 mL)로 추출하고, 조합한 유기 층들을 물 (50 mL)과 브린 (50 mL)으로 헹구었다. 유기 층을 무수 MgSO₄ 상에서 건조, 여과 및 농축하여, 9.5 g을 무색 오일로 수득하였으며, 이는 세워두었을 때 고체화되었다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 2종의 주된 산물들: N2 이성질체로서 중간산물 35B: 5-(4-플루오로페닐)-2-메틸-2H-테트라졸 (5.09 g, 70.9% 수율)을 백색 고형물로 수득하였다: 4.42 ppm에서 메틸기와 방향족 프로톤 간에 NOE는 관찰되지 않았다; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 4.42 (s, 3 H) 7.33 - 7.45 (m, 2 H) 8.03 - 8.14 (m, 2 H); MS m/z 179.2 (M+H)⁺; HPLC >99.5%, RT = 1.75분.

N1 이성질체: 5-(4-플루오로페닐)-1-메틸-1H-테트라졸 (1.87 g, 26.1% 수율)을 백색 고형물로 수득하였다: 4.16 ppm에서의 메틸기와 7.89 - 7.97 ppm에서의 2종의 방향족 프로톤들 간에 관찰되는 NOE는 구조를 검증해준다; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 4.16 (s, 3 H) 7.43 - 7.53 (m, 2 H) 7.89 - 7.97 (m, 2 H); MS m/z 179.2 (M+H)⁺; HPLC >99.5%, RT = 1.29분.

중간산물 35C 및 D

황산 (16.45 mL, 309 mmol) 중의 중간산물 35B (5-(4-플루오로페닐)-2-메틸-2H-테트라졸, 1 g, 5.61 mmol) 용액을 0℃로 냉각시킨 다음 발연 질산 (0.288 mL, 6.17 mmol)을 점적 첨가하였다. 2.5시간 후, 발연 질산을 더 (0.065 mL, 1.403 mmol) 첨가하고, 혼합물을 20℃로 가온하였다. 5시간 후, 혼합물을 2:1의 얼음-물 혼합물 (150 mL)에 부었고, 백색 현탁물이 형성되었다. 30분 후, 고형물을 여과하고, 물 (4 x 10 mL, 세정액의 pH가 중성일 때까지)로 헹군 다음, 중량이 일정해질 때까지 고 진공 하에 25℃에서 건조하였다: 5-(4-플루오로-3-니트로페닐)-2-메틸-2H-테트라졸 (1.16 g, 93% 수율)을 오프-화이트 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 4.47 (s, 3 H) 7.81 (dd, J=11.2, 8.8 Hz, 1 H) 8.44 (ddd, J=8.7, 4.2, 2.3 Hz, 1 H) 8.68 (dd, J=7.2, 2.2 Hz, 1 H); MS m/z 224.2 (M+H)⁺; HPLC 98.3%, RT = 1.72분.

DMF (2.268 mL) 중의 2-시아노아세트아미드 (0.888 g, 10.56 mmol) 용액을, 미네랄 오일 (0.443 g, 11.08 mmol) 중의 60%wt 수소화 나트륨 현탁물에 DMF (5.67 mL) 중에서 첨가하여, 회색 현탁물을 수득하였다. 이를 0℃로 냉각한 후 (주의: 수소 가스가 발생됨), 제조된 혼합물을 0℃에서 30분간 교반하였다. 그런 후, DMF (2.3 mL) 중의 5-(4-플루오로-3-니트로페닐)-2-메틸-2H-테트라졸 (1.15 g, 5.15 mmol) 용액을 첨가하여, 진보라색 용액을 수득하였다. 3시간 후, 반응 혼합물을 천천히 얼음-물 혼합물 (33.0 mL)과 진한 HCl (0.952 mL)에 부었다. 수득되는 노란색 슬러리를 30분간 교반하고, 고형물을 여과하여 물 (3 x 5 mL)과 이후 헥산 (2 x 5 mL)으로 헹군 다음, 중량이 일정해질 때까지 고 진공 하에 40℃에서 건조하여, 2-시아노-2-(4-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-2-니트로페닐)아세트아미드 (1.41 g, 95% 수율)를 노란색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 4.49 (s, 3 H) 5.77 (s, 1 H) 7.77 (s, 1 H) 7.95 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 8.03 (s, 1 H) 8.51 (dd, J=8.2, 1.8 Hz, 1 H) 8.70 (d, J=1.8 Hz, 1 H); MS m/z 288.1 (M+H)⁺; HPLC 96.4% @ 220 nm, RT = 1.31분.

패릭 클로라이드 헥사하이드레이트 (2.82 g, 10.44 mmol) 및 아연 (2.276 g, 34.8 mmol)을, DMF (8.71 mL) 및 물 (8.71 mL) 중의 2-시아노-2-(4-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-2-니트로페닐)아세트아미드 (1 g, 3.48 mmol) 혼합물에 나누어 첨가하여, 노란색 현탁물을 수득하였고, 이를 1.25시간 동안 100℃로 가열하였다. 그런 후, 혼합물을 20℃로 냉각하고, MeOH (50.0 mL)로 희석한 다음 셀라이트에서 여과하고, ca. 20 mL로 감압하 농축하였다 (대부분의 MeOH 제거됨). 그런 후, 혼합물을 물 (50 mL)과 EtOAc (100 mL)로 희석하고, 활발하게 교반하고 여과하였다. 수층을 EtOAc (2 x 50 mL)로 추출하고, 조합한 유기 층들을 포화 NaHCO₃ (50 mL)와 브린 (50 mL)으로 헹구었다. 유기 층을 무수 MgSO₄ 상에서 건조, 여과 및 농축하여, 489 mg을 보라색 고형물로 수득하였고, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 2-아미노-6-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-1H-인돌-3-카르복스아미드 (356 mg, 39.7% 수율)를 보라색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 4.38 (s, 3 H) 6.57 (s, 2 H) 7.01 (s, 2 H) 7.61 - 7.69 (m, 2 H) 7.81 (s, 1 H) 10.77 (s, 1 H); MS m/z 258.2 (M+H)⁺; HPLC ca. 78%, RT = 1.34분.

MeOH (0.467 mL) 및 메탄올 (3.03 mL) 중의 중간산물 35D (2-아미노-6-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-1H-인돌-3-카르복스아미드, 0.35 g, 1.361 mmol), 메틸 2-페닐아세테이트 (0.288 mL, 2.041 mmol) 및 소듐 메톡사이드 25%wt 혼합물을 마이크로웨이브 관에 넣어 마이크로웨이브 오븐에 넣은 후, 1시간 동안 140℃로 가열하였다. 이를 실온으로 냉각한 후, 물 (1 mL)과 AcOH (4 mL)로 희석하고, 혼합물을 30분간 교반하여 결정화하였다. 고형물을 여과하고, MeOH (5 x 1 mL)로 헹군 다음, 무게가 일정해질 때까지 고 진공 하에 40℃에서 건조하여, 2-벤질-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-올 (220 mg, 45.2% 수율)을 갈색 고형물로 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 4.03 (s, 2 H) 4.43 (s, 3 H) 7.24 - 7.29 (m, 1 H) 7.34 (t, J=7.8 Hz, 2 H) 7.37 - 7.43 (m, 2 H) 7.92 (dd, J=8.0, 1.4 Hz, 1 H) 8.04 - 8.10 (m, 2 H) 12.38 (s, 1 H) 12.47 (s, 1 H); MS m/z 358.2 (M+H)⁺; HPLC 82.9%, RT = 1.89분.

2-5 mL의 마이크로웨이브 바이얼에 조산물 2-벤질-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-올 (0.220 g, 0.616 mmol)과 POCl₃ (3.90 mL, 41.9 mmol)를 넣어, 갈색 현탁물을 수득하였다. 이 바이얼을 마이크로웨이브 오븐에 넣어, 15분간 175℃로 가열한 다음 냉각시켰다. 그런 후, 반응 혼합물을 물과 얼음 혼합물 (80 ml)에 붓고, NaOH 50%wt (11 mL)를 서서히 첨가하여 pH 8로 염기성화한 다음 EtOAc (80 mL)를 첨가하였다. 일부 고형물을 여과하고, 층 분리하였다. 수층을 EtOAc (80 mL)로 추출하고, 유기 층을 무수 MgSO₄ 상에서 건조, 여과 및 건조물로 농축하여, 대응되는 클로로 유도체: 2-벤질-4-클로로-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌 (189 mg, 82% 수율)을 갈색 고형물로 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 4.31 (s, 2 H) 4.46 (s, 3 H) 7.20 - 7.26 (m, 1 H) 7.28 - 7.39 (m, 4 H) 8.09 (dd, J=8.2, 1.2 Hz, 1 H) 8.21 - 8.25 (m, 1 H) 8.39 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.93 (s, 1 H); MS m/z 376.2 (M+H)⁺; HPLC 95.6%, RT = 2.30분.

MeOH (0.6 mL) 중의 상기에서와 같이 제조한 2-벤질-4-클로로-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌 (0.050 mg, 0.133 mmol) 및 Et₃N (0.037 mL, 0.266 mmol) 및 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-아민 (0.033 mL, 0.200 mmol) 혼합물을 마이크로웨이브 오븐에서 25분간 140℃에서 가열하였다. 이를 냉각시키고, 용매를 증발시킨 후, 잔류물을 RP-HPLC로 정제하여 (MeOH-물 (0.5% TFA) 20% -> 100% MeOH), 실시예 35를 55 mg 수득하였다: 2-벤질-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-아민 2,2,2-트리플루오로아세테이트; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.27 - 1.41 (m, 1 H) 1.53 - 1.72 (m, 3 H) 1.79 (d, J=13.69 Hz, 2 H) 1.98 - 2.09 (m, 2 H) 2.75 - 2.87 (m, 2 H) 3.09 (dt, J=10.27, 5.23 Hz, 2 H) 3.39 (d, J=11.35 Hz, 2 H) 3.69 (q, J=5.87 Hz, 2 H) 4.09 (s, 2 H) 4.44 (s, 3 H) 7.18 - 7.24 (m, 1 H) 7.31 (t, J=7.63 Hz, 2 H) 7.35 - 7.42 (m, 2 H) 7.51 (br. s., 1 H) 7.93 (dd, J=8.22, 1.17 Hz, 1 H) 8.11 (d, J=1.17 Hz, 1 H) 8.43 (d, J=8.22 Hz, 1 H) 9.04 (br. s., 1 H) 12.15 (s, 1 H); HPLC 99%, 254 nm, Rt 2.063분; HRMS m/z 482.2817 (M+H)⁺.

실시예 36 (시아니드로부터 메틸 옥사다이아졸)

하이드록실아민 하이드로클로라이드 (32.7 mg, 0.471 mmol)를, EtOH (1.5 mL) 중의 실시예 37 (2-벤질-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르보니트릴, 50 mg, 0.118 mmol) 용액에 첨가한 다음 DIPEA (84 ㎕, 0.483 mmol)를 첨가하여, 연노란색 현탁물을 수득하였다. 이를 실온에서 2.5일간 그리고 75℃에서 6시간 동안 교반한 후, 용매를 증발시키고, 물 (3 mL)을 첨가한 다음 30분간 교반하였다. 고형물을 수집하여 물 (3 x 1 mL)로 헹구고, 고형물을 중량이 일정해 질때까지 고 진공에서 35℃에서 건조하여, (Z)-2-벤질-N'-하이드록시-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복스이미드아미드 - HCl (53 mg, 0.107 mmol, 91% 수율)을 황갈색 고형물로 수득하였다; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.58 - 1.85 (m, 6 H) 1.98 - 2.10 (m, 2 H) 2.69 - 2.90 (m, 2 H) 2.94 - 3.15 (m, 2 H) 3.34 - 3.46 (m, 2 H) 3.59 - 3.74 (m,2 H) 4.05 (s, 2 H) 5.84 (br. s., 2 H) 7.15 - 7.24 (m, 1 H) 7.29 (t, J=7.4 Hz, 3 H) 7.37 (d, J=7.4 Hz, 2 H) 7.55 (dd, J=8.2, 1.2 Hz, 1 H) 7.72 (d, J=1.2 Hz, 1 H) 8.25 (d, J=8.6 Hz, 1 H) 9.47 (d, J=7.4 Hz, 1 H) 9.56 (s, 1 H) 11.88 (s, 1 H); HRMS m/z 458.2662 (M+H)⁺. HPLC 95.4% @ 220 nm 및 97.4% @ 254 nm, RT = 1.40분.

아세트산 무수물 (0.917 mL, 9.72 mmol)을 (Z)-2-벤질-N'-하이드록시-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복스이미드아미드, HCl (0.040 g, 0.081 mmol))에 첨가하여, 황갈색 현탁물을 수득하였으며, 이 혼합물을 마이크로웨이브로 30분간 140℃로 가열하였다. 그 후, 용매를 증발시키고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 36 mg (85% 수율)의 1-(2-벤질-7-(5-메틸-1,2,4-옥사다이아졸-3-일)-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-9-일)에타논을 황갈색 고형물을 수득하였으며, 이를 즉시 메탄올 (2.3 mL)에 용해하고, DBU (0.021 mL, 0.138 mmol)를 처리하였다. 수득되는 노란색 용액을 30분간 환류 가열한 다음, 1시간 동안 교반하면서 0℃로 냉각시켰다. 고형물을 여과하고, 차가운 MeOH (2 x 0.5 mL)로 헹군 후, 무게가 일정해질 때까지 고 진공 하에 40℃에서 건조하여, 실시예 36: 2-벤질-7-(5-메틸-1,2,4-옥사다이아졸-3-일)-N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-아민 (20 mg, 51.3%의 수율)을 황갈색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.38 (m, J=4.7 Hz, 2 H) 1.50 (quin, J=5.5 Hz, 4 H) 1.80 (quin, J=6.9 Hz, 2 H) 2.18 - 2.45 (m, 6 H) 2.67 (s, 3 H) 3.57 - 3.70 (m, 2 H) 4.04 (s, 2 H) 7.15 - 7.22 (m, 1 H) 7.27 (m, J=7.6, 7.6 Hz, 2 H) 7.34 (t, J=5.9 Hz, 1 H) 7.36 - 7.40 (m, 2 H) 7.83 (dd, J=8.2, 1.4 Hz, 1 H) 8.01 (d, J=1.4 Hz, 1 H) 8.39 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.02 (br. s., 1 H); HRMS m/z 482.2663 (M+H)⁺. HPLC 99.3%, RT = 1.79분.

실시예 37

메탄올 (2.82 mL) 중의 2-아미노-6-시아노-1H-인돌-3-카르복스아미드 (0.172 g, 0.859 mmol), 메틸 2-페닐아세테이트 (0.303 mL, 2.148 mmol) 및 소듐 메톡사이드 30%wt/MeOH (0.403 mL, 2.148 mmol) 혼합물을 마이트로웨이브 튜브에서 140℃에서 45분간 열처리하였다. 그런 후, 새로운 투입량의 메틸 2-페닐아세테이트 (0.151 mL, 1.074 mmol) 및 소듐 메톡사이드 30%wt/MeOH (0.201 mL, 1.074 mmol)를 첨가하고, 바이얼을 마이크로웨이브 하에 배치하여, 140℃에서 45분간 다시 열처리하였다. 그 후, 실온으로 냉각한 후, AcOH (0.197 mL, 3.44 mmol)를 첨가하고, 수득되는 슬러리를 20℃에서 1시간 교반하였다. 고형물을 여과하고, MeOH (3 x 1 mL)로 헹군 다음, 중량이 일정해질 때까지 고 진공 하에 20℃에서 건조하여, 중간산물 37B: 2-벤질-4-하이드록시-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르보니트릴 (182 mg, 70.5% 수율)을 황갈색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 4.03 (s, 2 H) 7.22 - 7.29 (m, 1 H) 7.30 - 7.36 (m, 2 H) 7.36 - 7.43 (m, 2 H) 7.58 (dd, J=8.2, 1.4 Hz, 1 H) 7.82 - 7.87 (m, 1 H) 8.05 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.59 (br. s., 2 H); MS m/z 301.2 (M+H)⁺; HPLC 94.2% @ 220 nm 및 91.3% @ 254 nm; RT = 1.90분.

2-벤질-4-하이드록시-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르보니트릴 (중간산물 37B, 0.180 g, 0.599 mmol) 및 포스포러스 옥시클로라이드 (3.63 mL, 39.0 mmol)의 적색 혼합물을 95℃로 가열하여 16시간 교반하였다. rotovap에서 건조물로 농축한 후, 수득되는 진한 적색 폼을 포화 NaHCO₃ (10 mL)에 현탁하여 30분 간 교반하였다. 고형물을 수집하여, 물 (3 x 1 mL)로 헹군 다음, 중량이 일정해질 때까지 고 진공 하에 40℃에서 건조하여, 중간산물 37C: 2-벤질-4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르보니트릴 (190 mg, 99% 수율)을 황갈색 고형물로 수득하였으며, 이를 바로 다음 공정에 사용하였다: MS m/z 319.2 (M+H)⁺; HPLC 95.0% @ 220 nm 및 92.3% @ 254 nm , RT = 2.28분.

MeOH (4.50 mL) 중의 2-벤질-4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르보니트릴 (중간산물 37C, 0.190 g, 0.596 mmol), 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-아민 (0.142 mL, 0.894 mmol) 및 트리에틸아민 (0.208 mL, 1.490 mmol) 혼합물을 마이크로웨이브로 140℃에서 30분간 가열하였다. 그런 후, 이를 건조물로 농축하여, 346 mg의 오렌지색 고형물을 수득하였고, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 176 mg의 노란색 고형물을 수득하여 에테르 (7 mL)에 현탁한 다음, 20℃에서 1시간 교반하였다. 고형물을 여과하고, 에테르 (3 x 1 mL)로 헹군 후, 중량이 일정해질 때까지 고 진공 하에 30℃에서 건조하여, 2-벤질-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르보니트릴을 실시예 37에서와 같이 (172 mg, 68.0% 수율) 연노란색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.30 - 1.43 (m, 2 H) 1.43 - 1.57 (m, 4 H) 1.80 (m, J=5.5 Hz, 2 H) 2.18 - 2.47 (m, 6 H) 3.62 (q, J=6.4 Hz, 2 H) 4.04 (s, 2 H) 7.15 - 7.22 (m, 1 H) 7.27 (m, J=7.4, 7.4 Hz, 2 H) 7.33 - 7.39 (m, 2 H) 7.47 (t, J=5.7 Hz, 1 H) 7.62 (dd, J=8.2, 1.2 Hz, 1 H) 7.79 (d, J=1.2 Hz, 1 H) 8.43 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.19 (s, 1 H); HRMS m/z 425.2448 (M+H)⁺; HPLC >99%, RT = 1.68분.

실시예 43

2-5 mL의 마이크로웨이브 바이얼에 메틸 2-벤질-4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.100 g, 0.284 mmol), (E)-1-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보롤란-2-일)부트-3-엔-1-일)피페리딘 (0.113 g, 0.426 mmol), 포타슘 카보네이트 (0.106 g, 0.768 mmol) 및 Pd(Ph₃P)₄ (0.05 g, 0.044 mmol)를 넣었다. 이 바이얼에 N₂ (3 진공 + 리필 사이클)를 퍼징하였다. DME (2.84 mL) 및 물 (0.398 mL)을 첨가하고, 바이얼에 N2 (1 진공 + 리필)를 주입한 다음 24시간 동안 교반하면서 110℃로 가열하였다. 이를 냉각한 후, 혼합물을 감압 하에 건조물로 농축하고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, (E)-메틸 2-벤질-4-(4-(피페리딘-1-일)부트-1-엔-1-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (55 mg, 0.121 mmol, 42.6% 수율)를 연노란색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.41 (s, 2 H) 1.50 - 1.61 (m, 4 H) 2.30 - 2.47 (m, 4 H) 2.53 - 2.59 (m, 2 H) 2.59 - 2.70 (m, 2 H) 3.91 (s, 3 H) 4.27 (s, 2 H) 7.16 - 7.24 (m, 1 H) 7.29 (t, J=7.6 Hz, 2 H) 7.34 - 7.43 (m, 4 H) 7.88 (dd, J=8.2, 1.4 Hz, 1 H) 8.07 (d, J=1.4 Hz, 1 H) 8.41 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.48 (s, 1 H); HRMS m/z 455.2442 (M+H)⁺; HPLC 100% @ 220 nm 및 99.4% @ 254 nm, RT = 1.84분.

MeOH (2 mL) 및 THF (2 mL) 중의 (E)-메틸 2-벤질-4-(4-(피페리딘-1-일)부트-1-엔-1-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (20 mg, 0.044 mmol) 및 Pd-C 10%wt. (50% wet) (23.41 mg) 혼합물에 17시간 동안 수소를 처리하였다. 반응 혼합물을 DCM (3 mL)로 희석하고, 여과한 다음 MeOH (2 x 2 mL)과 이후 DCM (2 x 2 mL)로 헹군 후 건조물로 농축하여, 19 mg을 연노란색 고형물을 수득하고, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여 백색 고형물 (14 mg)을 수득하고, 여기에 CH₃CN (2 mL)을 처리하였다. 20℃에서 1시간 동안 백색 현탁물을 교반한 후, 고형물을 여과하고, CH₃CN (1 x 1 mL)로 헹군 다음, 무게가 일정해질 때까지 고 진공 하에 40℃에서 건조하여, 실시예 43의 화합물을 메틸 2-벤질-4-(4-(피페리딘-1-일)부틸)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (14.4 mg, 71.7%의 수율)로서 백색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.36 (m, J=5.5 Hz, 2 H) 1.45 (quin, J=5.5 Hz, 4 H) 1.57 (quin, J=7.3 Hz, 2 H) 1.83 (dt, J=14.9, 7.4 Hz, 2 H) 2.18 - 2.31 (m, 6 H) 3.20 - 3.28 (m, 2 H) 3.91 (s, 3 H) 4.26 (s, 2 H) 7.16 - 7.22 (m, 1 H) 7.28 (t, J=7.4 Hz, 2 H) 7.32 - 7.38 (m, 2 H) 7.90 (dd, J=8.2, 1.2 Hz, 1 H) 8.09 (d, J=1.2 Hz, 1 H) 8.25 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.48 (br. s., 1 H); HRMS m/z 457.2598 (M+H)⁺; HPLC >99.5%, RT = 1.75분.

실시예 44

MeOH (1 mL) 중의 메틸 2-벤질-4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.100 g, 0.284 mmol), Et₃N (0.079 mL, 0.569 mmol) 및 tert-부틸 (3-아미노프로필)(메틸)카바메이트 (0.080 g, 0.426 mmol) 혼합물을 140℃에서 40분간 마이크로웨이브 오븐에서 가열하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 0.092 mg의 조산물 Boc 유도체를 수득하고, 이를 바로 다음 공정에 사용하였다. TFA (1.0 ml, 12.98 mmol)를, 메틸 2-벤질-4-((3-((tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.092 g, 0.183 mmol)의 차가운 현탁물에 점적 첨가하고, 이 혼합물을 30분에 걸쳐 실온으로 승온시켰다. 톨루엔으로 희석한 후, 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 EtOAc로 희석하여, 고형물 85 mg을 수득하였고, 이를 다음 공정에 바로 사용하였다: HRMS m/z 404.2091 (M+H)⁺.

메틸 2-벤질-4-((3-(메틸아미노)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트 (0.020 g, 0.039 mmol), 소듐 카보네이트 (8.81 mg, 0.083 mmol), 소듐 아이오다이드 (1.448 mg, 9.66 μmol) 및 2-(2-(2-클로로에톡시)에톡시)에탄올 (6.46 ㎕, 0.044 mmol) 혼합물을 아세톤 (0.2 mL) 중에서 70℃로 가열하였다. 15시간 후, 2차 분량의 2-(2-(2-클로로에톡시)에톡시)에탄올 시약 (6.46 ㎕, 0.044 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 다시 15시간 동안 70℃에서 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 물로 헹군 다음 무수 MgSO₄ 상에서 건조, 여과 및 용매를 증발시켜, 잔류물을 수득하였고, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 9 mg의 실시예 44의 화합물을 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.74 - 1.85 (m, 2 H) 2.25 (br. s., 3 H) 2.55 (br. s., 2 H) 3.32 - 3.36 (m, 4 H) 3.39 - 3.46 (m, 6 H) 3.51 (t, J=5.87 Hz, 2 H) 3.64 (q, J=6.52 Hz, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.04 (s, 2 H) 4.53 (br. s., 1 H) 7.18 (t, J=7.40 Hz, 1 H) 7.28 (t, J=7.63 Hz, 2 H) 7.37 (d, J=7.04 Hz, 2 H) 7.55 (t, J=5.28 Hz, 1 H) 7.82 (dd, J=8.22, 1.17 Hz, 1 H) 7.99 (s, 1 H) 8.27 (d, J=8.22 Hz, 1 H) 12.05 (s, 1 H); HRMS m/z 536.2855 (M+H)⁺; HPLC RT 2.035분.

실시예 45 및 51

2-5 mL의 마이크로웨이브 바이얼에, 메틸 2-벤질-4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.050 g, 0.142 mmol) 및 N1-(3-아미노프로필)-N1-메틸프로판-1,3-다이아민 (0.115 mL, 0.711 mmol)을 MeOH (2.000 mL, 49.4 mmol)) 중에 첨가하여, 황갈색 현탁물을 수득하였다. 바이얼을 마이크로웨이브 하에 배치하여, 30분간 140℃로 가열하였다. 30분 후, 혼합물을 rotavap 상에서 건조물로 농축하고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제한 다음 CH₃CN으로부터 동결건조하여 2개의 별개의 산물로 수득하였다: 모노-N-알킬화 산물로서 실시예 45: 메틸 4-((3-((3-아미노프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-벤질-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (44 mg, 67.2% 수율)를 백색 고형물로 수득하였다; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.44 (dt, J=13.8, 6.6 Hz, 2 H) 1.72 (dt, J=13.7, 6.8 Hz, 2 H) 2.11 (s, 3 H) 2.24 - 2.30 (m, 2 H) 2.33 (t, J=6.7 Hz, 2 H) 2.47 (br. s., 2 H) 3.51 - 3.61 (m, 2 H) 3.76 - 3.85 (m, 3 H) 3.97 (s, 2 H) 7.08 - 7.15 (m, 1 H) 7.17 - 7.24 (m, 2 H) 7.27 - 7.34 (m, 2 H) 7.50 (t, J=5.3 Hz, 1 H) 7.76 (dd, J=8.2, 1.6 Hz, 1 H) 7.92 (d, J=1.6 Hz, 1 H) 8.20 (d, J=8.2 Hz, 1 H); MS m/z 461.2 (M+H)⁺; HPLC >99%, RT = 1.63분.

비스-알킬화 산물로서 실시예 51: 다이메틸 4,4'-(((메틸아잔다이일)비스(프로판-3,1-다이일))비스(아잔다이일))비스(2-벤질-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트) (3.7 mg, 6.71% 수율)를 연노란색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.18 - 1.29 (m, 4 H) 1.79 - 1.91 (m, 4 H) 2.25 (s, 3 H) 3.58 - 3.71 (m, 4 H) 3.84 (s, 6 H) 3.97 (s, 4 H) 7.07 - 7.16 (m, 2H) 7.22 (t, J=7.4 Hz, 4 H) 7.29 - 7.34 (m, 4 H) 7.53 (t, J=5.3 Hz, 2 H) 7.77 (dd, J=8.2, 1.4 Hz, 2 H) 7.96 (d, J=1.4 Hz, 2 H) 8.22 (d, J=8.2 Hz, 2 H) 12.01 (s, 2H); MS m/z 776.3 (M+H)⁺; HPLC 94.6% @ 220 nm 및 93.8% @ 254 nm, RT = 2.01분.

실시예 52

2,5-다이옥소피롤리딘-1-일-5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노에이트 (12.01 mg, 0.035 mmol)를, DMF (750 ㎕, 9.69 mmol) 중의 메틸 4-((3-((3-아미노프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-벤질-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (실시예 45, 15 mg, 0.033 mmol) 및 트리에틸아민 (6.81 ㎕, 0.049 mmol) 용액에 첨가하여, 연노란색 용액을 수득하였다. 20℃에서 1시간 교반한 후, 혼합물을 건조물로 농축하고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 연노란색 폼을 수득하였다. 이 폼을 Et₂O (1 mL)에 현탁하여 30분 간 교반하고, 고형물을 수득하여 Et₂O (2 x 0.5 mL)로 세척한 다음, 중량이 일정해질 때까지 고 진공 하에 20℃에서 건조하여, 실시예 52의 화합물: 메틸 2-벤질-4-((3-(메틸(3-(5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)프로필)아미노)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (17 mg, 76% 수율)를 연노란색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.17 - 1.34 (m, 3 H) 1.36 - 1.51 (m, 2 H) 1.51 - 1.64 (m, 3 H) 1.78 (dt, J=13.5, 6.6 Hz, 2 H) 2.02 (t, J=7.4 Hz, 2 H) 2.17 (s, 3 H) 2.32 (t, J=7.0 Hz, 2 H) 2.40 (t, J=6.7 Hz, 2 H) 2.55 (d, J=12.3 Hz, 1 H) 2.77 (dd, J=12.3, 5.1 Hz, 1 H) 2.99 - 3.11 (m, 3 H) 3.58 - 3.68 (m, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.04 (s, 2 H) 4.08 (m, J=4.9, 4.9, 2.3 Hz, 1 H) 4.26 (dd, J=7.6, 5.3 Hz, 1 H) 6.34 (s, 1 H) 6.40 (s, 1 H) 7.14 - 7.22 (m, 1 H) 7.27 (t, J=7.4 Hz, 2H) 7.37 (d, J=7.0 Hz, 2 H) 7.54 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 7.74 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 7.82 (dd, J=8.2, 1.6 Hz, 1 H) 7.99 (d, J=1.6 Hz, 1 H) 8.27 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.05 (s, 1 H); MS m/z 687.3 (M+H)⁺; HPLC >99.5%, RT = 1.70분.

실시예 53

시판 에틸 2(3-톨릴)아세테이트로부터 중간산물 53A를 제조하였다. 그런 후, 실시예 15, 45 및 47에 기술된 바와 같이 중간산물 53B로 변환하였다. 그런 다음, 아지린 부분을 실시예 25에 제시된 내용에 따라 형성시켰다. 최종 공정은 실시예 52를 기반으로 하였다.

에틸 2-(m-톨릴)아세테이트 (4.8 g, 26.9 mmol), NBS (5.27 g, 29.6 mmol) 및 벤조일 퍼옥사이드 (0.110 g, 0.454 mmol) 혼합물을 CCl₄ (28 mL) 중에서 환류하였다. 5시간 후, 반응물을 5℃로 냉각하여 여과한 다음, 용매를 제거하였다. 에틸아세테이트-헥산을 이용한 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 대응되는 브로모벤질 유도체 3.8 g을 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.19 (t, J=6.70 Hz, 3 H) 3.67 (s, 2 H) 4.09 (q, J=6.70 Hz, 2 H) 4.69 (s, 2 H) 7.15 - 7.25 (m, 1 H) 7.27 - 7.42 (m, 3 H); 이 물질을 다음 공정에 바로 사용하였다.

1,4-다이옥산 (110 mL) 중의 에틸 2-(3-(브로모메틸)페닐)아세테이트 (8.11 g, 31.5 mmol) 및 4-메틸모르폴린 4-옥사이드 수화물 (5.54 g, 47.3 mmol) 혼합물을 1.5시간 동안 100℃로 가열하였다. 이를 실온으로 냉각한 후, 용매의 부피를 절반으로 줄인 다음 Et₂O:EtOAc (1:1, 120 mL)로 희석하고, 물 (50 mL)로 헹군 다음 수층을 EtOAc (60 mL)로 추출하였다. 조합한 유기 층들을 물 (2 x 50 mL)과 이후 브린 (50 mL)으로 헹구었다. 유기 층을 무수 MgSO₄ 상에서 여과 및 농축하여, 4.72 g의 연노란색 오일을 수득하고, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 2-(3-포르밀페닐)아세테이트 (2.91 g, 48% 수율)를 노란색 오일로서 수득하였다: ¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.19 (t, J=7.0 Hz, 3 H) 3.81 (s, 2 H) 4.09 (q, J=7.0 Hz, 2 H) 7.52 - 7.65 (m, 2 H) 7.79 - 7.85 (m, 2 H) 10.00 (s, 1 H); MS m/z 207.2 (M+H)⁺; HPLC 99%, RT = 1.67분.

트리메틸(트리플루오로메틸)실란 (3.13 mL, 21.20 mmol)을, 0 - 5℃로 냉각시킨 DMF (20.19 mL) 중의 에틸 2-(3-포르밀페닐)아세테이트 (2.91 g, 15.14 mmol) 및 세슘 플루오라이드 (0.161 g, 1.060 mmol) 혼합물에 첨가하였다. 1.5시간 동안 교반한 후, THF (15.14 mL) 중의 TBAF 1M 용액을 첨가하였다. 수득되는 노란색 용액을 0 - 5℃에서 교반하고, 혼합물을 물 (150 mL)에 부은 다음 MTBE (1 x 150 mL -> 2 x 100 mL)로 추출하였다. 조합한 유기 층들을 물 (1 x 150 mL -> 1 x 100 mL)과 브린 (100 mL)으로 헹군 다음 유기 층을 무수 MgSO₄ 상에서 건조, 여과 및 농축하여, 연오렌지색 오일로서 3.84 g을 수득하였으며, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여 에틸 2-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-하이드록시에틸)페닐)아세테이트 (663 mg, 16% 수율)를 무색 오일로서 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.17 (t, J=7.0 Hz, 3 H) 3.68 (s, 2 H) 4.08 (q, J=7.0 Hz, 2 H) 5.13 (q, J=7.4 Hz, 1 H) 6.82 (s, 1 H) 7.24 - 7.31 (m, 1 H) 7.37 (t, J=7.2 Hz, 3 H); MS m/z 263.1 (M+H)⁺; HPLC 93.7% @ 220 nm, RT = 1.82분.

벤질 브로마이드 (0.330 mL, 2.78 mmol)를, 아세토니트릴 (17.00 mL) 중의 에틸 2-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-하이드록시에틸)페닐)아세테이트 (0.648 g, 2.471 mmol) 및 K₂CO₃ (1.059 g, 7.66 mmol) 혼합물에 첨가하고, 이 혼합물을 24시간 동안 환류 가열 (75 - 80℃)하면서 교반하였다. 이를 냉각시키고 건조물로 농축한 후, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 중간산물 53A: 에틸 2-(3-(1-(벤질옥시)-2,2,2-트리플루오로에틸)페닐)아세테이트 (686 mg, 79% 수율)를 무색 오일로 수득하였다: MS m/z 353.2 (M+H)⁺; HPLC 99.7%, RT = 2.19분.

메탄올 (3.23 mL) 중의, 중간산물 15B (0.310 g, 1.329 mmol), 에틸 2-(3-(1-(벤질옥시)-2,2,2-트리플루오로에틸)페닐)아세테이트 (0.679 g, 1.927 mmol) 및 중간산물 53A 및 소듐 메톡사이드 30%wt/MeOH (0.524 mL) 혼합물을 혼합하여 갈색 현탁물을 수득한 다음, 이를 140℃에서 1시간 동안 마이크로웨이브 장치에서 가열하였다. 냉각시켜 MeOH (0.75 mL) 및 AcOH (0.167 mL, 2.92 mmol)로 희석한 후, 수득되는 현탁물을 2시간 동안 20℃에서 교반하였다. 그런 후, 고형물을 수집하여 MeOH (4 x 0.5 mL)로 헹군 다음 무게가 일정해질 때까지 고 진공 하에 40℃에서 건조하여, 메틸 2-(3-(1-(벤질옥시)-2,2,2-트리플루오로에틸)벤질)-4-하이드록시-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (399 mg, 57.6% 수율)를 황갈색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.87 (s, 3 H) 4.09 (s, 2 H) 4.45 - 4.57 (m, 2 H) 5.23 (q, J=7.2 Hz, 1 H) 7.20 - 7.29 (m, 5 H) 7.36 - 7.51 (m, 3 H) 7.52 (s, 1 H) 7.84 (dd, J=8.2, 1.4 Hz, 1 H) 8.01 (d, J=1.4 Hz, 1 H) 8.03 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.46 (br. s., 1 H) 12.56 (br. s., 1 H); MS m/z 522.2 (M+H)⁺; HPLC 92.7% @ 220 nm 및 91.7% @ 254 nm, RT = 2.20분.

포스포러스 옥시클로라이드 (6 mL, 64.4 mmol) 중의 메틸 2-(3-(1-(벤질옥시)-2,2,2-트리플루오로에틸)벤질)-4-하이드록시-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.395 g, 0.757 mmol) 혼합물을 2시간 동안 90℃로 가열한 다음 이를 냉각시킨 후, 건조물로 농축하여, 갈색 폼으로 650 mg을 수득한 다음 이를 포화 NaHCO₃ (15 mL)에 현탁하여 1시간 교반하였다. 고형물을 여과하여, 물 (3 x 2 mL)로 헹군 다음, 무게가 일정해질 때까지 고 진공 하에 40℃에서 건조하여, 메틸 2-(3-(1-(벤질옥시)-2,2,2-트리플루오로에틸)벤질)-4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (375 mg, 92% 수율)를 황갈색 고형물로 수득하였으며, 이를 다음 공정에 이와 같이 사용하였다: MS m/z 540.2 (M+H)⁺; HPLC 92%, RT 2.51분.

MeOH (9.83 mL, 243 mmol) 중의 메틸 2-(3-(1-(벤질옥시)-2,2,2-트리플루오로에틸)벤질)-4-클로로-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.375 g, 0.695 mmol) 및 N1-(3-아미노프로필)-N1-메틸프로판-1,3-다이아민 (0.784 mL, 4.86 mmol) 혼합물을 140℃에서 30분간 마이크로웨이브 오븐에서 가열하였다. 그런 후, 감압 하에 건조물로 농축한 후, 수득되는 갈색 오일을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 메틸 4-((3-((3-아미노프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(1-(벤질옥시)-2,2,2-트리플루오로에틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (288 mg, 63.9% 수율)를 노란색 폼으로서 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.48 (dt, J=14.0, 6.9 Hz, 2 H) 1.75 (quin, J=6.7 Hz, 2 H) 2.14 (s, 3 H) 2.24 - 2.42 (m, 4 H) 2.52 - 2.60 (m, 2 H) 3.61 (q, J=6.3 Hz, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.10 (s, 2 H) 4.49 (s, 2 H) 5.17 (q, J=7.0 Hz, 1 H) 7.18 - 7.30 (m, 5 H) 7.31 - 7.36 (m, 1 H) 7.39 (t, J=7.6 Hz, 1 H) 7.44 - 7.53 (m, 2 H) 7.58 (t, J=5.3 Hz, 1 H) 7.84 (dd, J=8.2, 1.4 Hz, 1 H) 8.00 (d, J=1.4 Hz, 1 H) 8.28 (d, J=8.2 Hz, 1 H); MS m/z 649.3 (M+H)⁺; HPLC 97.6% @ 220 nm 및 95.5% @ 254　nm, RT = 1.96분.

DCM (1 mL) 중의 다이-tert-부틸 다이카보네이트 (0.124 mL, 0.533 mmol) 용액을, DCM (3 mL) 및 MeOH (2 mL) 중의 메틸 4-((3-((3-아미노프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(1-(벤질옥시)-2,2,2-트리플루오로에틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.288 g, 0.444 mmol) 및 트리에틸아민 (0.074 mL, 0.533 mmol) 혼합물에 서서히 첨가하여, 노란색 용액을 수득한다. 이를 20℃에서 45분간 교반한 후, 용액을 건조물로 농축하여, 373 mg을 노란색 폼으로 수득하고, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 중간산물 53B를 메틸 2-(3-(1-(벤질옥시)-2,2,2-트리플루오로에틸)벤질)-4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (306 mg, 92% 수율)의 노란색 폼으로서 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.33 (s, 9 H) 1.52 (dt, J=14.1, 7.0 Hz, 2 H) 1.67 - 1.81 (m, 2 H) 2.12 (s, 3 H) 2.28 (t, J=7.2 Hz, 2 H) 2.34 (t, J=6.8 Hz, 2 H) 2.92 (q, J=6.7 Hz, 2 H) 3.54 - 3.67 (m, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.10 (s, 2 H) 4.49 (s, 2 H) 5.17 (q, J=6.8 Hz, 1 H) 6.76 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 7.16 - 7.30 (m, 5 H) 7.31 - 7.36 (m, 1 H) 7.39 (t, J=7.6 Hz, 1 H) 7.43 - 7.51 (m, 2 H) 7.53 (t, J=5.3 Hz, 1 H) 7.83 (dd, J=8.4, 1.4 Hz, 1 H) 8.00 (d, J=1.4 Hz, 1 H) 8.27 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.06 (s, 1 H); MS m/z 749.3 (M+H)⁺; HPLC 97.7%, RT = 2.06분.

MeOH (9.92 mL) 중의 메틸 2-(3-(1-(벤질옥시)-2,2,2-트리플루오로에틸)벤질)-4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.306 g, 0.409 mmol) 및 Pd-C 10%wt (50% wet) (0.304 g, 0.143 mmol) 혼합물에 수소를 22시간 동안 20℃에서 처리하였다. 그런 후, 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고, 케이크를 MeOH (2 x 10 mL)와 DCM:MeOH (1:1, 2 x 10 mL)로 헹군 다음, rotovap에서 건조물로 농축하여 오일 226 mg을 수득하였으며, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 메틸 4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-하이드록시에틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (202 mg, 75% 수율)를 백색 폼으로 수득하였다: ¹H　NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.33 (s, 9 H) 1.48 - 1.62 (m, 2 H) 1.71 - 1.85 (m, 2 H) 2.16 (s, 3 H) 2.25 - 2.35 (m, 2 H) 2.39 (t, J=6.8 Hz, 2 H) 2.86 - 3.00 (m, 2 H) 3.56 - 3.70 (m, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.06 (s, 2 H) 5.01 - 5.14 (m, 1 H) 6.77 (m, J=6.3 Hz, 2 H) 7.30 (d, J=4.7 Hz, 2 H) 7.36 - 7.42 (m, 1 H) 7.49 (s, 1 H) 7.51 - 7.57 (m, 1 H) 7.82 (dd, J=8.2, 1.2 Hz, 1 H) 7.99 (d, J=1.2 Hz, 1 H) 8.26 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.06 (br. s., 1 H); MS m/z 659.2 (M+H)⁺; HPLC >97%, RT = 1.90분.

DCM (7.50 mL) 중의 메틸 4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-하이드록시에틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.200 g, 0.304 mmol) 및 데스-마틴 페리오디난 시약 (0.567 g, 1.336 mmol) 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이를 건조물로 증발시킨 후, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 메틸 4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (181 mg, 91% 수율)를 노란색 폼으로서 수득하였다: DMSO-d6에서 ¹H NMR은 원하는 산물과 일치하였지만, 수화물 형태의 존재로 인해 복잡해졌다: MS m/z 657.3 (M+H)⁺; HPLC 96.0% @ 220 nm 및 95.3% @ 254 nm, RT 1.87 and 1.96 (케톤 + 수화물)분.

MeOH (1.9 mL) 중의 메틸 4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로아세틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.180 g, 0.274 mmol), 하이드록실아민 하이드로클로라이드 (0.023 g, 0.329 mmol) 및 피리딘 (0.355 mL) 혼합물을 마이크로웨이브 오븐에서 48시간 동안 65℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 건조물로 농축한 후, 잔류물의 용액을 포화 NaHCO₃ (15 mL)로 헹구고, 유기 층을 무수 MgSO₄ 상에서 건조, 여과 및 건조물로 농축하여, 메틸 4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-(하이드록시이미노)에틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (184 mg, 100% 수율)를 연노란색 폼으로서 수득하였다: MS m/z 672.3 (M+H)⁺; HPLC 96.0% @ 220 nm 및 91.4% @ 254 nm, RT = 2.01분.

Ts-Cl (0.060 g, 0.315 mmol)을, DCM (12 mL) 중의 메틸 4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-(하이드록시이미노)에틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.184 g, 0.274 mmol), DMAP (3.35 mg, 0.027 mmol) 및 트리에틸아민 (0.048 mL, 0.342 mmol) 혼합물에 나누어 첨가하여, 황갈색 용액을 수득하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 DCM (12 mL)으로 희석하여, 물 (3 x 12 mL)로 헹군 다음, 유기 층을 무수 MgSO₄ 상에서 건조, 여과 및 건조물로 농축하여, 메틸 4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-((토실옥시)이미노)에틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (217 mg, 96% 수율)를 황갈색 폼으로서 수득하였다: MS m/z 826.2 (M+H)⁺; HPLC 93.2% @ 220 nm 및 91.3% @ 254 nm, RT = 2.20분.

DCM (5.07 mL) 중의 메틸 4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-((토실옥시)이미노)에틸)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.217 g, 0.263 mmol) 용액을 -78℃로 냉각시키고, 암모니아 (1.7 mL, 79 mmol)를 밀폐된 튜브안에서 응결시켰다. 혼합물을 천천히 20℃로 승온시켜, 3시간 교반하였다. 다시 -78℃로 냉각시킨 후, 밀폐된 시험관에 가스 유출구를 가진 격막 (septa)을 장착하였으며, 천천히 20℃로 승온시켜 암모니아를 증발시켰다. 3시간 후, 혼합물을 건조물로 농축한 다음, 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 메틸 4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(3-(트리플루오로메틸)다이아지리딘-3-일)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (139 mg, 79% 수율)를 백색 폼으로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.34 (s, 9 H) 1.52 - 1.62 (m, 2 H) 1.72 - 1.89 (m, 2 H) 2.08 - 2.25 (m, 3 H) 2.30 - 2.44 (m, 4 H) 2.94 (q, J=6.4 Hz, 2 H) 3.64 (q, J=6.5 Hz, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 3.93 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 4.04 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 4.08 (s, 2 H) 6.78 (br. s., 1 H) 7.31 - 7.41 (m, 2 H) 7.44 - 7.50 (m, 1 H) 7.54 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 7.59 (s, 1 H) 7.83 (dd, J=8.4, 1.4 Hz, 1 H) 7.99 (d, J=1.4 Hz, 1 H) 8.27 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 12.07 (s, 1 H); MS m/z 671.4 (M+H)⁺; HPLC 98.6% @ 220 nm 및 96.4% @ 254 nm, RT = 1.91분.

요오드 (27.8 mg, 0.110 mmol)를, DCM (2 mL) 중의 메틸 4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(3-(트리플루오로메틸)다이아지리딘-3-일)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (70 mg, 0.104 mmol) 및 트리에틸아민 (43.6 ㎕, 0.313 mmol)이 미리-충전된, 차광된 5 mL의 둥근 바닥 플라스크에 넣어, 연노란색 용액을 수득하였다. 이를 15분간 20℃에서 교반한 후, 용매를 증발시키고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 메틸 4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(3-(트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (65 mg, 0.097 mmol, 93%의 수율)를 연노란색 폼으로서 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.33 (s, 9 H) 1.53 (dt, J=13.8, 7.0 Hz, 2 H) 1.70 - 1.82 (m, 2 H) 2.15 (br. s., 3 H) 2.24 - 2.34 (m, 2 H) 2.34 - 2.42 (m, 2 H) 2.87 - 2.98 (m, 2 H) 3.55 - 3.66 (m, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.10 (s, 2 H) 6.76 (br. s., 1 H) 7.14 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 7.27 (s, 1 H) 7.43 (t, J=7.8 Hz, 1 H) 7.49 - 7.58 (m, 2 H) 7.83 (dd, J=8.2, 1.4 Hz, 1 H) 7.99 (d, J=1.4 Hz, 1 H) 8.27 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.06 (s, 1 H); MS m/z 669.2 (M+H)⁺; HPLC 97.6% @ 220 nm 및 97.3% @ 254 nm, RT = 2.18분.

트리플루오로아세트산 (0.400 mL, 5.19 mmol)을, DCM (4 mL) 중의 메틸 4-((3-((3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(3-(트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (0.064 g, 0.096 mmol) 용액에 첨가하여, 연노란색 용액을 수득하였다. 이를 20℃에서 30분간 교반한 후, 반응 혼합물을 DCM (15　mL)로 희석하고 포화 NaHCO₃ (10 mL)로 헹군 다음, 수층을 DCM (10　mL)으로 역-추출하였다. 조합한 유기 층들을 무수 MgSO₄ 상에서 건조, 여과 및 0건조물로 농축하여, 중간산물 53C: 메틸 4-((3-((3-아미노프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(3-(트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (45 mg, 83% 수율)를 연노란색 폼으로서 수득하였다: HRMS m/z 569.2601 (M+H)⁺; HPLC 97.1% @ 220 nm 및 96.9% @ 254 nm, RT = 1.96분.

2,5-다이옥소피롤리딘-1-일-5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노에이트 (29.2 mg, 0.085 mmol)를, DMF (750 ㎕ 중의 메틸 4-((3-((3-아미노프로필)(메틸)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(3-(트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (45 mg, 0.079 mmol) 및 트리에틸아민 (16.55 ㎕, 0.119 mmol) 혼합물에 첨가하여, 노란색 용액을 수득하였다. 이를 30분간 20℃에서 교반한 후, 반응 혼합물을 연오렌지색 오일로 고 진공 하에 농축하고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 56 mg을 백색 고형물로 수득하였으며, 이를 CH₃CN으로부터 동결건조하여 실시예 53의 화합물: 메틸 4-((3-(메틸(3-(5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)프로필)아미노)프로필)아미노)-2-(3-(3-(트리플루오로메틸)-3H-다이아지린-3-일)벤질)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트 (51 mg, 0.064 mmol, 81% 수율)를 백색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.18 - 1.34 (m, 3 H) 1.35 - 1.50 (m, 3 H) 1.50 - 1.64 (m, 3 H) 1.70 - 1.82 (m, 2 H) 2.02 (t, J=7.4 Hz, 2 H) 2.15 (s, 3 H) 2.26 - 2.34 (m, 2 H) 2.37 (t, J=6.7 Hz, 2 H) 2.55 (d, J=12.5 Hz, 1 H) 2.77 (dd, J=12.1, 5.1 Hz, 1 H) 2.99 - 3.10 (m, 3 H) 3.56 - 3.66 (m, 2 H) 3.88 (s, 3 H) 4.03 - 4.14 (m, 1 H) 4.10 (s, 2 H) 4.26 (dd, J=7.6, 5.3 Hz, 1 H) 6.34 (s, 1 H) 6.39 (s, 1 H) 7.14 (d, J=7.4 Hz, 1 H) 7.28 (s, 1 H) 7.44 (t, J=7.8 Hz, 1 H) 7.52 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 7.56 (t, J=5.3 Hz, 1 H) 7.73 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 7.83 (dd, J=8.2, 1.4 Hz, 1 H) 8.00 (d, J=1.4 Hz, 1 H) 8.28 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 12.07 (s, 1 H); HRMS m/z 795.3368 (M+H)⁺; HPLC 95.4% @ 220 nm 및 96.2% @ 254 nm, RT = 2.06분.

실시예 55

2M 메틸아민/MeOH (10.00 mL) 중의 메틸 2-벤질-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7 카르복실레이트 (실시예 27, 0.030 g, 0.066 mmol) 용액을 밀폐된 튜브에 넣어, 66시간 동안 110℃로 가열한 다음, 혼합물을 20℃로 냉각시켜 건조물로 농축하고, 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 28 mg의 무색 오일을 수득하였으며, 이를 에테르 (2 mL)에 현탁하였다. 수득한 현탁물을 2시간 교반한 후, 고형물을 부흐너로 수집하였으며, 이 케이크를 에테르 (2 x 0.5 mL)로 세척하고, 산물을 무게가 일정해질 때까지 고 진공 하에 40℃에서 건조하여, 실시예 55: 2-벤질-N-메틸-4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복스아미드 (23 mg, 77%의 수율)를 백색 고형물로 수득하였다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.38 (m, J=5.1 Hz, 2 H) 1.50 (quin, J=5.5 Hz, 4 H) 1.80 (quin, J=7.0 Hz, 2 H) 2.22 - 2.41 (m, 6 H) 2.81 (d, J=4.3 Hz, 3 H) 3.58 - 3.68 (m, 2 H) 4.03 (s, 2 H) 7.15 - 7.21 (m, 1 H) 7.27 (m, J=7.4, 7.4 Hz, 3 H) 7.34 - 7.40 (m, 2 H) 7.70 (dd, J=8.2, 1.4 Hz, 1 H) 7.90 (d, J=1.4 Hz, 1H) 8.27 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 8.46 (q, J=4.3 Hz, 1 H) 11.96 (s, 1 H); HRMS m/z 457.2708 (M+H)⁺; HPLC >99.5% @ 220 nm 및 98.9% @ 254 nm, RT = 1.53분.

기록한 HPLC 체류 시간은 다음과 같은 조건, 용매 A: MeOH:H₂O:TFA (5:95:0.05); 용매 B: MeOH:H₂O:TFA (95:5:0.05); 유속: 3.0 mL/min.; 2.0분간 0 -> 100% B 농도 구배; 컬럼: ZorbaxC18, 3.5 ㎛, 4.6 x 30 mm; 파장 220 nm를 이용한 역상 HPLC (Agilent, 1200 series)에 대한 것이다.

표 1. 실시예들의 구조, 분석용 HPLC 체류 시간, LCMS 데이타 및 생물 데이타

화합물 번호	구조	HPLC R _T (min) 분석	MS m/z (M+H) ⁺	생물 데이타 (EC ₅₀ )*
1		1.38	368.2	C
2		1.35	354.2	D
3		1.55	342.2	C
4		1.30	314.2	D
5		1.29	328.2	B
6		1.41	354.2	C
7		1.43	382.2	D
8		1.34	300.2	C
9		1.35	384.2	C
10		1.34	326.2	B
11		1.40	354.2	C
12		1.29	370.2	A
13		1.45	394.2	D
14		1.44	392.2	D
15		1.43	459.2	E
16		1.78	459.2518	C
17		1.54	460.2	B
18		2.068	464.2145	E
19		2.349	662.063	E
20		2.206	508.2707	D
21		1.78	488.2665	E
22		1.68	474.2511	F
23		2.129	472.2342	F
24		2.083	472.2724	E
25		2.05	566.2497	E
26		2.152	472.2733	F
27		2.052	458.2598	E
28		2.194	538.1670	E
29		2.142	472.2756	E
30		2.142	472.2740	E
31		2.112	476.2499	E
32		2.070	488.2690	E
33		1.761.87 (hydrates)	554.2384	E
34		2.142	554.2	E
35		2.063	482.28	E
36		1.79	482.2663	F
37		1.68	425.2448	C
38		1.44	340.2	D
39		1.38	340.2	C
40		1.72	454.2	E
41		1.71	482.2785	E
42		1.92	459.2392	B
43		1.75	457.2598	F
44		2.035	536.2867	E
45		1.63	461.2	E
46		1.70	474.2476	E
47		1.85	512.2632	E
48		1.74	472.2717	E
49		2.161	586.2839	A
50		1.65	499.2823	F
51		2.01	776.3	E
52		1.70	687.3	C
53		2.06	795.3368	F
54		1.46	382.2	A
55		1.53	457.2708	A

EC₅₀은 비히클 배양물 (DMSO)와 비교하여 CD34+CD45RA- 세포 수를 50% 증가시키는 농도로 정의된다. * EC₅₀ : A >1000 nM; B = 500-1000 nM; C = 250-500 nM; D = 100-250; E = <100 nM; F = 1.3 배 보다 높은 증식 수준을 나타낸 화합물.

생체외 기능 분석:

증식시킨 세포의 생체외 기능성을 통상적인 콜로니-형성 유닛을 이용한 배양 (CFU-C) 분석을 이용하여 검사하였다. 무처리 세포, 또는 DMSO, 양성 대조군 또는 본 발명의 화합물과 함께 배양한 세포를, 통상적인 조건 하에 메틸셀룰로스 배지에 접종하였다. 일 예로, 화합물 1 (표 1, 실시예 1)은 다능성 조혈 선조 세포를 수적으로 증가시킨다. 10일 간 화합물 1을 처리한 CD34+ mPB 세포 1000주의 메틸셀룰로스 배양물에서는 다계통성 과립구 적혈구, 마크로파지 및 거핵구 (GEMM 콜로니)가 투입 세포에 비해 5배 증가되었고, 대조군 세포와 비교해서는 10배 증가되었다. 이는, 화합물 1이 다능성 선조 세포의 증식을 촉진시킨다는 것을 의미한다.

생체내 기능성 분석:

본 발명의 화합물과 함께 배양한 CD34+ mPB 세포를 면역결핍주 NOD scid 감마 (NSG) 마우스에 생착시켰다. 화합물 1 (표 1, 실시예 1) 또는 비히클 대조군 조건으로 10일간 배양한 결과물 CD34+ mPB 세포 2,000,000 및 500,000주를 NSG 마우스에 이식하였다. 이식한지 8주 후, 인간 조혈 세포 재구축을 인간 CD45에 대한 항체를 이용하여 NSG 골수에서 체크하였다. 화합물 1을 처리한 세포는 NSG 마우스에서 생착할 수 있었지만, 비히클을 처리한 세포는 그렇지 않았다. 아울러, 골수 세포가 각각 인간 CD33+ 및 CD19+에 양성이었으므로, 인간 골수 및 림프구 구획물들의 재구축도 검증되었다. 이들 결과는, 화합물 1을 이용하여 증식시킨 CD34+ mPB가 생착에 기여할 뿐만 아니라 생체내 다계통 재집락 잠재력도 보유한다는 것을 보여준다.

화합물들의 조합:

본 발명의 화합물을 이용하여 배양한 CD34+ mPB 세포를 면역결핍주 NOD scid 감마 (NSG) 마우스에 생착시켰다. 화합물 1 (표 1, 실시예 1) 또는 비히클 대조군 조건으로 10일간 배양한 결과물 CD34+ mPB 세포 2,000,000 및 500,000주를 NSG 마우스에 이식하였다. 이식한 지 8주 후, 인간 조혈 세포 재구축을 인간 CD45에 대한 항체를 이용하여 NSG 골수에서 체크하였다. 화합물 1을 처리한 세포는 NSG 마우스에서 생착할 수 있었지만, 비히클을 처리한 세포는 그렇지 않았다. 아울러, 골수 세포가 각각 인간 CD33+ 및 CD19+에 양성이었으므로, 인간 골수 및 림프구 구획물들의 재구축도 검증되었다. 이들 결과는, 화합물 1을 이용하여 증식시킨 CD34+ mPB가 생착에 기여할 뿐만 아니라 생체내 다계통 재집락 잠재력도 보유한다는 것을 보여준다.

본원에 기술된 실시예들과 구현예들은 단순 예시하기 위한 목적일 뿐이며, 당해 기술 분야의 당업자라면 이에 비추어 다양한 변형 또는 변경을 제시할 것이며, 이는 본 발명의 내용과 첨부된 청구항의 범위에 포함되는 것으로 이해된다.

Claims

일반식의 화합물, 또는 이의 염:

상기 식에서,
Z는
1) -C(O)OR¹,
2) -C(O)NHR¹,
3) -C(O)N(R¹)R¹,
4) -CN, 또는
5) R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -헤테로아릴이고,
(R¹) 및 R¹이 질소 원자와 결합하는 경우, 선택적으로 이들은 질소 원자와 연결되어, N, O 및 S로부터 선택되는 다른 이종 원자를 1개 이상 선택적으로 포함하는, 선택적으로 R^A 또는 R¹ 1개 이상으로 치환된, 3-7원성의 고리를 형성하며;
W는
1) -OR¹,
2) -NHR¹,
3) -N(R¹)R¹,
4) -L-N(R¹)R¹,
5) L 및 헤테로사이클릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로사이클릴,
6) L 및 헤테로사이클릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -O-L- 헤테로사이클릴,
7) n이 1인, -(N(R¹)-L)_n-N(R¹)R¹, 또는
8) n이 1인, R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -(N(R¹)-L)_n-헤테로사이클릴이되,
각각의 치환기가 아직 존재하지 않을 경우 L 기에 선택적으로 결합되며,
2개의 R¹ 치환기가 동일한 질소 원자 상에 존재하는 경우, 각 R¹ 치환기는 독립적으로 하기에 기술된 R¹ 리스트의 기들로부터 선택되며,
(R¹) 및 R¹이 질소 원자와 결합하는 경우, 선택적으로 이들은 질소 원자와 연결되어, 선택적으로 R¹ 또는 R^A 1개 이상으로 치환된, 3-7원성의 고리를 형성하며;
L은,
1) -C_1-6알킬,
2) -C_3-7사이클로알킬, 또는
3) 헤테로사이클릴이되,
여기서, 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴은 각각 독립적으로 R^A 치환기 1개 또는 2개로 선택적으로 치환되며;
R¹은,
1) -H,
2) -C_1-6알킬,
3) -C_2-6알키닐,
4) -C_1-5 과불소화 알킬,
5) -헤테로사이클릴,
6) -아릴, 또는
7) 5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜타노일이되,
여기서, 알킬, 과불소화 알킬, 헤테로사이클릴, 아릴은 각각 독립적으로 R^A 또는 R¹ 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환되며;
R²는,
1) -H,
2) -C_1-6 알킬,
3) -C(O)R¹,
4) R^A 또는 R¹ 치환기 1, 2 또는 3개로 선택적으로 치환된, -벤질,
5) L 및 헤테로아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-헤테로아릴, 또는
6) L 및 아릴 기들 중 하나 또는 양쪽에 부착되는 R^A 또는 R¹ 치환기 1개 이상으로 선택적으로 치환된, -L-아릴이되,
여기서 각 치환기는, 아직 존재하지 않을 경우, 선택적으로 L 기에 결합되며;
R^A는,
1) -할로겐,
2) -CF₃,
3) -OH,
4) -OR¹,
5) -NH₂,
6) -NHR¹,
7) -NR¹R¹,
8) -L-NH₂,
9) -L-NHR¹,
10) -C(O)R¹, 또는
11) -C(-N=N-)(CF₃)이며,
여기서, 헤테로아릴은 N, S 및 O로부터 선택되는 1-4개의 이종 원자와 하나 이상의 방향족 고리를 포함하는 3-10원성의 단환식 또는 이환식 고리 시스템이고,
헤테로사이클릴은 N, S 및 O로부터 선택되는 1-4개의 이종 원자를 포함하는 3-7원성의 비-방향족 고리이되,
단, 상기 화합물은 하기 화합물 이외의 화합물임:
하기 식의 화합물, 또는 이의 염:

상기 식에서,
R¹, W 및 R²는 각각 제1항에서 정의된 바와 동일하게 정의되고;
Het는 제1항에서 정의된 바와 동일하게 정의된 R¹ 또는 R^A 하나 이상으로 선택적으로 치환된 3-7원성의 헤테로사이클이고;
R⁵ 및 R⁶는 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 제1항에서 정의된 바와 동일하게 정의된 L이거나, 또는 이들은 C와 연결되어, N, O 및 S로부터 선택되는 이종 원자를 1개 이상 선택적으로 포함하는, 선택적으로 R¹ 또는 R^A 1개 이상으로 치환된, 5-7원성의 고리를 형성함.
제2항에 있어서,
상기 고리가 5원성 고리이고, N 4개를 포함하는, 화합물.
제1항에 있어서,
R²가 벤질인, 화합물.
제1항에 있어서,
상기 R²가 H인, 화합물.
제1항에 있어서,
W가
또는
인, 화합물.
제1항에 있어서,
식 IVA의 화합물 또는 이의 염인, 화합물:

상기 식에서,
Z, R¹ 및 R²는 각각 제1항에서 정의된 바와 동일하게 정의되며, Li는 제1항에서 정의된 바와 같이 정의된 L 이며;
m은 0이고;
R³ 및 R⁴는 동일하거나 또는 상이하며, 각각 독립적으로 H 또는 R¹이거나, 또는
R³와 R⁴는 이들이 결합된 N과 함께 N, O 및 S로부터 선택되는 다른 이종 원자를 1개 이상 선택적으로 포함하는 3-7원성의 고리를 형성하고, 상기 고리는 선택적으로 R¹ 또는 R^A1개 이상으로 치환됨.
제1항에 있어서,
Z가 CO₂Me 또는 2-메틸-2H-테트라졸-5-일이고;
R²가 벤질, 3-티에닐메틸 또는 3-피리디닐 메틸이고;
W는 NH-L-N(R¹)R¹이되, L이 C_2-4 알킬이고, R¹이 C_1-4 알킬이거나 또는 (R¹) 및 R¹은 질소 원자와 연결되어, N, O 및 S로부터 선택되는 다른 이종 원자를 1개 이상 선택적으로 포함하는 3-7원성의 고리를 형성하며, 상기 고리는 선택적으로 R¹ 또는 R^A 1개 이상으로 치환되는, 화합물.
제1항에 있어서,
하기 화합물 번호 1 내지 55로부터 선택되는 화합물 또는 이의 염인, 화합물:
제1항에 있어서,

,
, 또는
의 화합물 또는 이의 염인, 화합물.
제1항에 있어서,
상기 화합물이
의 하이드로브로마이드 염인, 화합물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는,
개체에서 조혈 장애/조혈 악성 질환, 자가면역 질환 및/또는 유전성 면역결핍성 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물.
제12항에 있어서,
상기 조혈 장애/조혈 악성 질환, 자가면역 질환 및/또는 유전성 면역결핍성 질환이 전세계적으로 문제가 되는 다양한 선천성 질환인 골수 기능 부전 병태, 루푸스, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 장애, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 재생불량성 빈혈, 순수적혈구 무형성증 (pure red cell aplasia), 혈색소뇨증, 판코니 빈혈, 지중해 빈혈, 겸상 적혈구 빈혈증, 비스코트-알드리히 증후군, 선천성 대사 이상을 포함하는, 약학적 조성물.
제13항에 있어서,
상기 조혈 장애/조혈 악성 질환, 자가면역 질환 및/또는 유전성 면역결핍성 질환이 겸상 적혈구 빈혈증 또는 지중해 빈혈인, 약학적 조성물.
제13항에 있어서,
상기 조혈 장애/조혈 악성 질환, 자가면역 질환 및/또는 유전성 면역결핍성 질환이 고셔병 (Gaucher disease)인, 약학적 조성물.
제12항에 있어서,
조혈 줄기 세포를 증식시키기 위한 것인, 약학적 조성물.
제16항에 있어서,
상기 조혈 줄기 세포가 인간 세포인, 약학적 조성물.
줄기 세포 및 선조 세포 (progenitor cell)를 증가시키기 위한 방법으로서,
출발 세포 집단을, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 염을 포함하는 물질과, 선택적으로 생물 분자 또는 그외 소형 분자인 하나 이상의 세포 증식 인자와 함께 시험관내 (in vitro) 또는 생체외 (ex vivo) 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
제18항에 있어서,
상기 출발 세포 집단이 유동화된 말초혈 (mPB: mobilized peripheral blood), 골수 (BM) 또는 제대혈 (UCB)로부터 회수된 CD34+ 세포를 포함하는, 방법.
제18항에 있어서,
상기 출발 세포 집단이 1 또는 2종의 제대혈 유닛 (umbilical cord blood unit)으로부터 정제된 CD34+ 세포로 필수적으로 구성되는, 방법.
제18항에 있어서,
상기 출발 세포 집단이 2-21일간 상기 화합물의 존재 하에 배양하는, 방법.
제18항에 있어서,
상기 화합물이 1 nM 내지 3000 nM의 농도에서 상기 출발 세포 집단에 투여되는, 방법.
제18항에 있어서,
상기 생물 분자가 인터루킨-3 (IL-3), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 트롬보포이에틴 (TPO), FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드 (FMS-Like Tyrosine Kinase 3 Ligand, FLT3-L), 줄기 세포 인자 (SCF), 인터루킨-6 (IL-6) 또는 이들의 조합물을 포함하는, 방법.
제23항에 있어서,
상기 생물 분자가 SCF, FLT3-L, TPO, IL-6 또는 이들의 조합물을 포함하는, 방법.
제18항에 있어서,
상기 그외 소형 분자가 StemRegenin 1인, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하며,
선택적으로, 생물 분자 또는 그외 소형 분자인 세포 증식 인자를 1종 이상 포함하는,
조혈 줄기 세포를 증식시키는데 사용하기 위한 키트.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제