KR101420274B1 - Ｃｓｐ－ｂ ５＇ｓａｒ 인자를 포함하는 동물세포 발현 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) CSP-B(Cytotoxic Serine Protease-B)의 5‘-SAR(Scaffold or Matrix Attachment Region); (b) 동물세포에서 작동하는(operable) 프로모터; 및 (c) 폴리아데닐화 서열을 포함하는 동물세포용 발현 벡터, 그리고 이를 이용하여 재조합 유전자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 벡터는 CSP-B 5' SAR을 포함하는 벡터로, 동물세포에 도입한 외래 유전자의 위치에 따른 유전자 발현 억제 현상을 극복하는 효과를 가지며, 목적 단백질의 발현율을 크게 향상시킨다. 본 발명의 벡터는 의약품용 재조합 단백질(예컨대, EPO) 또는 항체(예컨대, 항-HER2 항체)를 동물세포에서 효과적으로 발현시킨다. 본 발명의 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법은 의약품의 산업적 대량 생산에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 CSP-B(Cytotoxic Serine Protease-B, 세포독성 세린 프로테아제-B) 5‘ SAR(Scaffold Attachment Region) 인자를 포함하는 동물세포 발현 벡터 및 이 벡터를 이용하여 재조합 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다.
CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포와 같은 동물세포에 재조합 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 도입하면 임상적 치료를 위한 단백질 의약품을 생산할 수 있다.
적혈구증식인자인 NESP(Novel Erythropoiesis Stimulating Protein)는 다베포에틴 알파(Darbepoetin alfa)라고도 불리우며, 천연형 에리스로포이에틴(erythropoietin)에 2개의 N-연결 당쇄 부위가 생성되도록 유전자 조작이 된 단백질 의약품이다(Egrie and Browne, Br . J. Cancer . 84 Suppl. 1:3-10(2001)). NESP는 조혈모세포를 자극하고 적혈구계로의 분화를 촉진하여 적혈구의 생성을 증가시킨다. NESP의 혈청 반감기는 기존의 재조합 에리스로포이에틴보다 3배나 길기 때문에 만성신부전 환자의 빈혈치료에서 적은 투여 빈도로 동등한 치료효과를 기대할 수 있다.
항악성종양제인 트라스투주맙(Trastuzumab)은 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조된 인간화 단일클론항체(humanized monoclonal antibody)로서, 세포 표면에 있는 인간 표피증식인자 수용체 2(Human Epidermal growth factor Receptor 2, HER2)에 선택적으로 작용한다. 원발성 유방암의 25-30%에서 HER2의 과발현이 확인되고 있으며, 트라스투주맙은 HER2가 과발현된 인간의 종양세포 증식을 억제한다.
외래 유전자는 동물세포 염색체의 어느 위치에 삽입되는가에 따라서 그 발현율이 달라질 수 있는데, 주변의 조절 인자들 혹은 크로마틴(chromatin)의 구조에 의해서 외래 유전자의 발현이 영향을 받기 때문이다(Zahn-Zabal et al., J. Biotechnol . 87, 29-42 (2001)).
주위의 크로마틴이 외래 유전자의 발현에 영향을 주지 않도록 하는 크로마틴 인자를 사용하면 이러한 위치에 따른 유전자 발현 억제 현상(position effect)을 극복할 수 있고, 재조합 단백질을 고발현하는 동물세포 클론을 분리할 수 있는 기회를 높여서 의약품 생산 세포주를 제조하는 시간을 단축할 수 있다. 위치에 따른 유전자 발현 억제 현상을 극복할 수 있는 크로마틴 인자를 사용하여 안정적 세포주(stable cell line)를 만들려는 시도가 이루어지고 있으며, 그러한 인자에는 BE(Boundary Element), SAR/MAR(Scaffold or Matrix Attachment Region), LCR(Locus Control Region) 등이 있다.
SAR는 MAR라고도 불리우는 300-3000 bp 길이의 DNA이고, 염색체 상의 크로마틴이 세포핵 매트릭스(nuclear matrix)의 단백질과 결합하게 하고 유전자의 발현을 조절한다고 알려져 있으며(Makrides (Ed.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells . Elsevier . Chapter 10 (2003)), 형질전환 세포주에서 외래 유전자의 발현을 향상시킬 수 있다(Poljak et al., Nucleic Acids Res . 22, 4386-4394 (1994); Kalos and Fournier, Mol . Cell . Biol . 15, 198-207 (2005)).
Zahn-Zabal 등은 닭 라이소자임(chicken lysozyme) 5' MAR를 루시퍼라제(luciferase) 발현 벡터에 도입하고 이 벡터로 CHO 세포를 형질전환하여 안정적 세포(stable cell)를 만들었다(Zahn-Zabal et al., J. Biotechnol . 87, 29-42 (2001) ). MAR를 포함하지 않은 벡터로 형질전환한 안정적 세포와 비교했을 때, 라이소자임 5' MAR를 포함한 벡터로 형질전환한 안정적 세포는 더 높은 루시퍼라제 발현율을 나타내었다. 또한, 라이소자임 5' MAR를 1 카피 포함한 벡터의 경우보다 MAR를 2 카피 포함한 벡터의 경우 더 높은 루시퍼라제 발현율을 나타내었다. 이러한 결과는 동물세포 발현 벡터에 MAR를 도입하여 목적 단백질의 발현율을 높일 수 있음을 보여준다.
대한민국 특허 출원번호 제2000-0043996호에서는 동물세포 발현 벡터에 인간 베타 글로빈(human β-globin) MAR를 포함시켜서, 동물세포에 외래 유전자를 도입할 때 발생하는 유전자 발현 억제 현상을 극복하였다. 이 특허에는 인간 베타 글로빈 MAR 이외에, GenBank M83137에 등록되어 있는 인간 인터페론 베타(human interferon-β) MAR와 GenBank M62716에 등록되어 있는 인간 CSP-B 3' SAR가 사용되었고, 이 세 가지 SAR/MAR가 목적 단백질인 베타 갈락토시다제(β-galactosidase)의 발현율을 향상시킴을 기술하였다. 또한, 이 특허에는 베타 글로빈 MAR가 인터페론 베타 MAR 또는 CSP-B 3' SAR보다 효과가 우수하다는 연구 결과가 공지되어 있다.
대한민국 특허 출원번호 제2001-0079227호에서는 동물세포 발현 벡터에 인간 인터페론 베타 MAR를 도입하여 외래 유전자의 발현을 증가시키고 효율적으로 재조합 단백질을 발현시켰다. 또한, 대한민국 특허 출원번호 제2007-0108451호에서는 동물세포 발현 벡터에 인간 베타 글로빈 MAR를 2 카피 포함시켜서 베타 글로빈 MAR가 1 카피일 경우보다 더 우수하게 목적 단백질의 발현율을 향상시킴을 기술하였다. 이 특허에는 MAR 인자 1 카피와 2카피의 비교 연구 결과가 기술되어 있고, MAR 인자 2 카피와 3 카피의 비교 연구 내용이 기재되어 있지 않다.
Hanson과 Ley는 약 70 kb의 인간 염색체 14q11.2 조혈 세린 프로테아제 유전자 군(hematopoietic serine protease gene cluster)에서 CSP-B 5' SAR와 3' SAR를 찾아내어 염기서열을 밝히고, 이들 SAR가 세포의 핵에서 유래하는 스캐폴드(scaffold)와 결합하는 것을 생체외 실험(in vitro)에서 확인하였다(Hanson and Ley, Blood. 79, 610-618 (1992)).
CSP-B 5' SAR와 3' SAR의 염기서열은 각각 GenBank M62717과 M62716에 등록되어 있고, 그 길이는 각각 2429 bp와 1233 bp로써 CSP-B 5' SAR가 3' SAR에 비하여 2배 정도 더 길다. GenBank AL136018에는 인간 염색체 14 지놈(genome)의 염기서열이 등록되어 있으며, 이 서열 상에서 CSP-B 단백질을 암호화하는 유전자의 번역 개시 코돈(codon)과 그 상위(upstream)에 있는 5' SAR 사이의 길이는 1195 bp이고, CSP-B 단백질을 암호화하는 유전자의 번역 종결 코돈과 그 하위(downstream)에 있는 3' SAR 사이의 길이는 4543 bp이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 동물세포에서 재조합 단백질을 효율적으로 생산할 수 있는 벡터를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, CSP-B(Cytotoxic Serine Protease-B)의 5‘-SAR(Scaffold or Matrix Attachment Region)를 벡터에 포함시켜(incorporated) 사용하는 경우에 매우 우수한 생산효율로 재조합 단백질을 생산할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 동물세포용 발현 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 발현 벡터에 의해 형질전환된 동물세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 단백질의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 동물세포용 발현 벡터를 제공한다:
(a) CSP-B(Cytotoxic Serine Protease-B)의 5‘-SAR(Scaffold or Matrix Attachment Region);
(b) 동물세포에서 작동하는(operable) 프로모터; 및
(c) 폴리아데닐화 서열.
본 발명자들은 동물세포에서 재조합 단백질을 효율적으로 생산할 수 있는 벡터를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, CSP-B(Cytotoxic Serine Protease-B)의 5‘-SAR(Scaffold or Matrix Attachment Region)를 벡터에 포함시켜(incorporated) 사용하는 경우에 매우 우수한 생산효율로 재조합 단백질을 생산할 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 동물세포용 발현 벡터는 CSP-B의 5‘-SAR, 동물세포에서 작동하는프로모터; 및 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
본 발명의 가장 큰 특징은 CSP-B의 5‘-SAR가 포함된 벡터를 이용하는 것이다. 본 발명에서 이용되는 CSP-B 5‘-SAR는 바람직하게는 GenBank M62717에 등록되어 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 서열목록 제1서열에 그 예시적인 뉴클레오타이드 서열이 기재되어 있다.
CSP-B의 5‘-SAR은 발현 벡터에서 재조합 단백질의 생산 효율을 크게 증가시킨다.
CSP-B의 5‘-SAR은 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 위치할 수 있으며, 바람직하게는 다운스트림에 위치한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, CSP-B 5' SAR는 종래의 CSP-B 3' SAR 및 베타 글로빈 MAR 인자보다 동물세포에서 목적 단백질의 발현율을 향상시킨다. 예를 들어, CHO 동물세포에서 목적 단백질인 베타 갈락토시다제를 발현시키는 벡터에 CSP-B 5' SAR, CSP-B 3' SAR 및 베타 글로빈 MAR 인자를 1 카피 씩 도입한 경우, SAR 인자를 도입하지 않은 경우보다 베타 갈락토시다제 활성이 각각 10.0배, 2.2배 및 8.7배 높게 측정되었다(도 7). 즉, CSP-B 5' SAR 인자는 다른 인자들보다 상대적으로 우수한 목적 단백질의 발현율을 나타낸다.
또한, 목적 단백질을 NESP로 하여 SAR 인자의 효과를 확인하였을 때 유사한 결과가 도출되었다. CSP-B 5' SAR와 CSP-B 3' SAR 인자를 벡터에 도입하고 CHO 세포를 형질전환한 경우, SAR 인자를 도입하지 않은 경우보다 NESP의 발현율이 각각 11.2배 및 3.2배 높게 측정되었다(표 3 및 도 9). 벡터에 CSP-B 5' SAR 인자를 도입하였을 때, 그 형질전환 세포에서 NESP를 발현하는 양성 클론(positive clone)의 형성 빈도가 증가하였고, 무작위로 선택한 클론들의 NESP 발현율 역시 증가하였다(표 4, 표 5, 도 10 및 도 11).
목적 단백질을 항-HER2 항체로 하여 CSP-B 5' SAR 인자의 효과를 확인하였다. CSP-B 5' SAR 인자 2 카피를 벡터에 도입하고 CHO 세포를 형질전환한 경우, SAR 인자를 도입하지 않은 경우보다 항-HER2 항체의 발현율이 상대적으로 높게 측정되었다(표 6 및 도 13). 벡터에 SAR 인자를 도입하였을 때, 무작위로 선택한 클론들의 항-HER2 항체 발현율이 높게 나타났다(도 14 및 도 15).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 5‘-SAR는 발현 벡터에서 복수 개의 카피로 존재하며, 이 경우 1 카피로 존재하는 경우보다 재조합 단백질의 생산 효율을 증가시킨다. 보다 바람직하게는, 5‘-SAR는 발현 벡터에서 2 카피로 존재한다. 하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 5‘-SAR는 발현 벡터에서 3 카피로 존재하는 경우보다 2 카피로 존재하는 경우에 재조합 단백질의 생산 효율이 보다 우수하다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, CSP-B 5' SAR 인자를 벡터에 1, 2 및 3 카피 도입하여 카피 수에 따른 효과를 확인한 결과, 이 SAR 인자를 연속적으로 2 카피 도입했을 때 베타 갈락토시다제 활성이 가장 높게 측정되었다(도 8). 즉, 벡터 내 SAR 인자의 카피 수가 목적 단백질의 발현율에 영향을 주며 2 카피의 SAR가 가장 바람직하다고 볼 수 있다.
5‘-SAR가 발현 벡터에서 복수 개의 카피로 존재하는 경우, 상기 복수 개의 카피는 연속적 또는 이격되어 위치할 수 있다. 바람직하게는, 상기 복수 개의 카피는 연속적으로 존재하며, 보다 바람직하게는 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 다운스트림에 연속적으로 존재한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 동물세포에서 작동하는(operable) 프로모터는 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40(Simian Virus 40) 프로모터, SV40E1 프로모터, HSV(Herpes simplex virus)의 tk 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF1(elongation factor-1 alpha) 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2(interluekin-2) 유전자의 프로모터, 인간 IFN(interferon) 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 또는 인간 GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor) 유전자의 프로모터이고, 보다 바람직하게는 CMV 프로모터, SV40 프로모터, SV40E1 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터 또는 베타-액틴 프로모터이고, 가장 바람직하게는 CMV 프로모터이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 발현하고자 하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함하며 바람직하게는 호르몬, 사이토카인, 항체, 펩타이드 앱타머, 어드넥틴(AdNectin), 어피바디(affibody, 미국 특허 제5,831,012호), 아비머(Avimer, Silverman, J. et al, Nature Biotechnology 23(12):1556(2005)) 또는 쿠니쯔 도메인(Kunitz domain, Arnoux B et al., Acta Crystallogr . D Biol . Crystallogr . 58(Pt 7):12524(2002)), 및 Nixon, AE, Current opinion in drug discovery & development 9(2):2618(2006))이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 벡터를 이용하여 발현하고자 하는 단백질은 EPO(erythropoietin), EPO 유사체 또는 항-HER2(Human epidermal growth factor receptor 2) 항체이다. 가장 바람직하게는 EPO, EPO 유사체로서 NESP(Novel Erythropoiesis Stimulating Protein, A30N, H32T, P87V, W88N, P90T) 또는 항-HER2 항체이다.
상기 EPO 유사체는 인간 EPO의 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상이 변이 된 것을 포함한다. EPO 유사체는 아미노산 잔기의 추가(addition), 삭제(deletion) 또는 치환(substitution)를 통해 변이를 생성(mutagenesis)함으로써 제작할 수 있으며, 이를 통해 당쇄화(glycosylation) 위치(site)를 증가시키거나 그 위치를 바꿀 수 있다. EPO 유사체는 인간 EPO 보다 많은 수의 탄수화물 사슬(carbohydrate chain)을 가지며, 적어도 하나 이상의 추가된 당쇄화 위치를 포함한다. 또한, EPO 유사체는 추가된 당쇄화 위치에 의해 자연(natural occurring) 인간 EPO 보다 높은 시알산(sialic acid) 레벨을 나타내지만, 그로 인해 생물학적 활성에 중요한 단백질 2 또는 3차 구조가 변하지는 않는다. EPO 유사체는 N-당쇄화(N-glycosylation) 또는 O-당쇄화(O-glycosylation)에 대한 추가적인 위치를 1, 2 또는 3군데 가질 수 있다. 예를 들면, 69번째 루신(leucine)이 아스파라긴(asparagine)으로 치환되면 이것이 N-당쇄화의 4번째 위치로서의 역할을 하게 된다.
본 발명의 벡터에서 발현하고자 하는 EPO 유사체의 예는, EPO 서열(예컨대, GenBank M11319의 서열)에서 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 및 138번 위치에서 선택되는 최소 하나의 위치에 추가적인 당쇄화 위치가 도입된 것이다. 가장 바람직하게는, EPO 유사체는 A30N, H32T, P87V, W88N 및 P90T 변이를 포함하는 NESP이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 폴리아데닐화 서열은 소성장 호르몬 터미네이터, HSV(Herpes simplex virus) 유래 TK(Thymidine kinase) 또는 SV40(Simian virus 40) 유래 폴리 아데닐화 서열을 포함한다.
본 발명의 벡터에서 바람직한 컨스트럭트는 5‘ to 3' 순서로 동물세포에서 작동하는 프로모터-발현 단백질 유전자-폴리아데닐화 서열-CSP-B 5‘-SAR이며, 보다 바람직한 컨스트럭트는 동물세포에서 작동하는 프로모터-발현 단백질 유전자-폴리아데닐화 서열-CSP-B 5‘-SAR-CSP-B 5‘-SAR이다.
본 발명의 벡터는 선택마커를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 선택마커의 예는 진핵세포에 작용하는 항생제에 대한 내성 유전자를 포함하고, 바람직하게는 네오마이신, 제네티신(G418) 및 카나마이신에 대한 내성 유성자이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 동물세포에서 목적 단백질을 발현하는 데 이용된다. 상기 동물세포는 포유류, 설치류, 조류 또는 곤충세포이며, 보다 바람직하게는 CHO(Chinese hamster ovary), VERO, HeLa 세포, WI38, BHK(Baby hamster kidney), COS 세포 또는 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 CHO, VERO, HeLa 또는 MDCK이고, 가장 바람직하게는 CHO 세포이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 디히드로폴레이트 환원효소 (dihydrofolate reductase: DHFR) 코딩 서열을 포함한다. 상기 서열은 벡터의 증폭에 유용하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 발현 벡터에 의해 형질전환된 동물세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 형질전환된 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 사용한 CSP-B 5' SAR 인자는, 종래 기술에서 동물세포 발현 벡터에 도입하여 의약품용 재조합 단백질의 생산성을 향상시키려는 시도에 사용되지 않았던 인자이다. 하기의 실시예로부터, CSP-B 5' SAR를 벡터에 도입하면 동물세포에서 목적 단백질의 발현율을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다. 재조합 단백질의 생산을 위해서 기존에 사용하지 않았던 새로운 CSP-B 5' SAR를 벡터에 도입하여 목적 단백질의 발현 효율을 보다 높일 수 있는 방법을 개발한다면 단백질 의약품의 산업적 생산성을 증대시킬 수 있다.
종래 기술에서 CSP-B 5' SAR를 동물세포 발현 벡터에 도입하여 의약품용 재조합 단백질의 생산성을 향상시키려는 시도는 보고되지 않았다. 또한 SAR를 벡터에 1 카피, 2 카피, 혹은 3 카피 도입하여 이 벡터로 동물세포를 형질전환하였을 때, 몇 카피의 SAR를 포함하는 벡터를 사용하는 것이 재조합 단백질의 생산성을 가장 높일 수 있는가에 대해서도 연구되지 않았다. 또한 SAR 인자의 위치에 따른 목적 유전자의 발현율 증대 효과에 대한 상세한 선행연구 결과가 공개되어 있지 않다.
본 발명의 발현 벡터를 세포에 도입하여 형질전환된 동물세포를 제조하는 경우, 다양한 방법으로 벡터를 세포에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 동물 세포 내로 주입할 수 있다.
형질전환된 동물세포의 배양은 당업계에 공지된 다양한 방법을 프로토콜을 이용하여 실시할 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat . New Biol . 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc . Soc . Exp . Bio . Med ., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer . Med . Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp . Cell Res . 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal . Biochem . 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl . Cancer Inst . 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc . Soc . Exp . Biol . Med . 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 동물세포 배양 및 배지에 대한 설명은, R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells , A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York에 상세하게 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명의 벡터는 CSP-B 5' SAR을 포함하는 벡터로, 동물세포에 도입한 외래 유전자의 위치에 따른 유전자 발현 억제 현상을 극복하는 효과를 가지며, 목적 단백질의 발현율을 크게 향상시킨다.
(b) 본 발명의 벡터는 의약품용 재조합 단백질(예컨대, EPO) 또는 항체(예컨대, 항-HER2 항체)를 동물세포에서 효과적으로 발현시킨다.
(c) 본 발명의 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법은 의약품의 산업적 대량 생산에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 베타 갈락토시다제 발현 벡터의 구조에 대한 개략도이다. lacZ는 베타 갈락토시다제 유전자, BGH pA는 소 성장호르몬 유전자의 폴리아데닐화 서열 및 TK pA는 싸이미딘 카이나아제 유전자의 폴리아데닐화 서열이다.
도 2는 SAR/MAR 인자를 1 카피 포함하는 베타 갈락토시다제 발현 벡터의 구조에 대한 개략도이다.
도 3은 SAR 인자를 2 카피 포함하는 베타 갈락토시다제 발현 벡터의 구조에 대한 개략도이다.
도 4는 CSP-B 5' SAR 인자를 3 카피 포함하는 베타 갈락토시다제 발현 벡터의 구조에 대한 개략도이다.
도 5는 NESP 발현 벡터의 구조에 대한 개략도이다.
도 6은 SAR/MAR 인자를 포함하는 NESP 발현 벡터의 구조에 대한 개략도이다.
도 7은 SAR/MAR 인자를 1 카피 도입한 벡터로 형질전환한 세포의 상대적 베타 갈락토시다제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 SAR 인자를 1, 2 및 3 카피 도입한 벡터로 형질전환한 세포의 상대적 베타 갈락토시다제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 SAR 인자를 도입한 벡터로 형질전환한 세포의 상대적 NESP(적혈구 자극인자) 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 SAR 인자를 도입하지 않은 pCLS07A1 벡터로 형질전환한 세포에서 무작위 선택한 24개 클론의 NESP 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 11은 CSP-B 5' SAR 인자를 도입한 pCLS10A1f1 벡터로 형질전환한 세포에서 무작위 선택한 24개 클론의 NESP 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 12는 항-HER2 항체 발현 벡터의 구조에 대한 개략도이다.
도 13은 SAR 인자를 2 카피 도입한 벡터로 형질전환한 세포의 상대적 항-HER2 항체 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 14는 SAR 인자를 도입하지 않은 pCLS05H2 벡터로 형질전환한 세포에서 무작위 선택한 19개 클론의 항-HER2 항체 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 15는 CSP-B 5' SAR 인자를 2 카피 도입한 pCLS05H2f2 벡터로 형질전환한 세포에서 무작위 선택한 19개 클론의 항-HER2 항체 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 SAR/MAR 인자를 1 카피 포함하는 베타 갈락토시다제 발현 벡터의 구조에 대한 개략도이다.
도 3은 SAR 인자를 2 카피 포함하는 베타 갈락토시다제 발현 벡터의 구조에 대한 개략도이다.
도 4는 CSP-B 5' SAR 인자를 3 카피 포함하는 베타 갈락토시다제 발현 벡터의 구조에 대한 개략도이다.
도 5는 NESP 발현 벡터의 구조에 대한 개략도이다.
도 6은 SAR/MAR 인자를 포함하는 NESP 발현 벡터의 구조에 대한 개략도이다.
도 7은 SAR/MAR 인자를 1 카피 도입한 벡터로 형질전환한 세포의 상대적 베타 갈락토시다제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 SAR 인자를 1, 2 및 3 카피 도입한 벡터로 형질전환한 세포의 상대적 베타 갈락토시다제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 SAR 인자를 도입한 벡터로 형질전환한 세포의 상대적 NESP(적혈구 자극인자) 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 SAR 인자를 도입하지 않은 pCLS07A1 벡터로 형질전환한 세포에서 무작위 선택한 24개 클론의 NESP 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 11은 CSP-B 5' SAR 인자를 도입한 pCLS10A1f1 벡터로 형질전환한 세포에서 무작위 선택한 24개 클론의 NESP 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 12는 항-HER2 항체 발현 벡터의 구조에 대한 개략도이다.
도 13은 SAR 인자를 2 카피 도입한 벡터로 형질전환한 세포의 상대적 항-HER2 항체 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 14는 SAR 인자를 도입하지 않은 pCLS05H2 벡터로 형질전환한 세포에서 무작위 선택한 19개 클론의 항-HER2 항체 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 15는 CSP-B 5' SAR 인자를 2 카피 도입한 pCLS05H2f2 벡터로 형질전환한 세포에서 무작위 선택한 19개 클론의 항-HER2 항체 발현율을 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: SAR/MAR 인자의 준비
인간 CSP-B 5' SAR 및 3' SAR 인자의 준비
GenBank M62717 및 AL136018에 등록된 인간 CSP-B 5' SAR DNA를 PCR(Polymerase Chain Reaction)로 증폭하기 위하여, 인간 자연 살상 세포(natural killer 세포, NK 세포 및 ATCC CRL-2407)의 지노믹(genomic) DNA를 준비하였다. DNA 분리 키트(Dneasy Blood & Tissue Kit, Qiagen, Cat. No. 69504)를 사용하여 NK 세포로부터 지노믹 DNA를 준비하였고, 이것을 5' SAR DNA PCR의 주형으로 사용하였다.
NK 세포의 지노믹 DNA를 주형으로 Cs5S300F 프라이머(attct tcagc acctc cttaa ttttt ctccc) 및 Cs5S300R 프라이머(ccagg cagcc aaaga tcagt agttg tgttg)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 2분 30초의 조건으로 35회 반복하여 PCR을 수행하였다.
다음으로, 이 PCR 산물을 pGEM-T 벡터(Promega, Cat. No. A3600)에 클로닝하여 pGEMT-CS5S.3.0k 벡터를 제조하였다.
GenBank M62716 및 AL136018에 등록된 인간 CSP-B 3' SAR DNA를 준비하기 위하여, NK 세포의 지노믹 DNA를 주형으로 2kCspSF 프라이머(tggtt ccttc attgg aaaag gaaaa cac) 및 2kCspSR 프라이머(tccgc tgagg ctgtg cccac agcca cc)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 1차 PCR 산물을 주형으로 CspSF 프라이머(ggatc ccatt ctcct tgatg tacta at) 및 CspSR 프라이머(gaatt caaac aactc aatag caaga aac)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 5분의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 2차 PCR 산물을 pGEM-T 벡터에 클로닝하여 pGEMT-CS3S.1.2k 벡터를 제조하였다.
인간 베타 글로빈 MAR 인자의 준비
GenBank L22754와 NW_001838021에 등록된 인간 베타 글로빈 MAR DNA를 PCR로 증폭하기 위하여, 인간 G-2 세포의 지노믹 DNA를 준비하였다. DNA 분리 키트를 사용하여 G-2 세포로부터 지노믹 DNA를 준비하였고, 이것을 5' MAR DNA PCR의 주형으로 사용하였다. G-2 세포의 지노믹 DNA를 주형으로 Bg5MF-100F-NheI 프라이머(aattg ctagc ttgta ttctg tttcg tgagg caagg ttt) 및 Bg5MR-100R-XhoI 프라이머(aattc tcgag ttcct ctcta tgttg gctca aatgt cct)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 3분 20초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pcDNA3.3-TOPO 벡터(Invitrogen, Cat. No. K8300-01)에 클로닝하여 pcDNA3.3-Bg5M 벡터를 제조하였다.
실시예 2: 베타 갈락토시다제 발현 벡터의 제조
pC06 벡터의 제조
사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 프로모터, 다수 제한효소 클로닝 부위(Multiple Cloning Sites, MCS) 및 소 성장 호르몬(Bovine Growth Hormone, BGH) 폴리아데닐레이션 서열(polyadenylation sequence, pA)을 순서대로 포함하는 pC06 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저, pcDNA3.1(-) 벡터(Invitrogen, Cat. No. V795-20)를 주형으로 V6_F 프라이머(aagct tggat ccgaa ttcat cgatg gccgg ccggt accct cgagc tgtgc cttct agttg ccagc) 및 V6_R 프라이머(gctag ctaga gcccc agctg gttct ttccg)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pcDNA3.3-TOPO 벡터(Invitrogen)에 클로닝하여 pC06 벡터를 제조하였다.
pC04' 벡터의 제조
SV40(Simian Virus 40) 프로모터, 코작 서열(Kozak sequence, gccatc), dhfr(dihydrofolate reductase) 유전자 및 TK(herpes simplex virus thymidine kinase) pA를 순서대로 포함하는 pC04' 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pcDNA3.3 벡터를 주형으로 PsvApaDraF 프라이머(aaaat tgggc cccac tacgt gctgt ggaat gtgtg tcagt taggg t) 및 PsvKzDHR 프라이머(tggtc gaacc atgat ggcgc gaaac gatcc tcatc ctgtc tct)를 사용하여 PCR을 수행하였고, pOptiVEC-TOPO 벡터(Invitrogen, Cat. No. 12744-017)를 주형으로 DHKzPsvF 프라이머(ggatc gtttc gcgcc atcat ggttc gacca ttgaa ctgca tcg) 및 TKNheNdeR 프라이머(tgtgt gcata tggct agcga taaca atttc acaca ggaaa cag)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 두가지 PCR 산물을 중복(overlapping) PCR을 통해 연결하고, pGEM-T 벡터의 ApaI 및 NdeI 제한효소 부위에 클로닝하여 pC04' 벡터를 제조하였다.
pC04
벡터의 제조
pC04' 벡터가 포함하는 SV40 프로모터에서 72 bp(ggtgt ggaaa gtccc caggc tcccc agcag gcaga agtat gcaaa gcatg catct caatt agtca gcaac ca)의 인핸서(enhancer) 1개를 제거(SV40dE1 프로모터)한 pC04 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pC04' 벡터를 SphI 제한효소로 절단하고, 다음으로 큰 DNA 절편을 자가 라이게이션(self-ligation)시켜 pC04 벡터를 제조하였다.
pCLS07
벡터의 제조
pC06 벡터의 BGH pA와 SV40 프로모터 사이에 SV40dE1 프로모터, 코작 서열, dhfr 유전자 및 TK pA가 삽입된 pCLS07 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pC04 벡터를 주형으로 PsvApaDraF 프라이머 및 TKNheNdeR 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분 20초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물과 pC06 벡터를 DraIII 및 NheI 제한효소로 각각 절단하고, 여기에서 얻은 두 개의 큰 DNA 절편을 라이게이션 시켜서 pCLS07 벡터를 제조하였다.
pCLS08
벡터의 제조
pCLS07 벡터의 NheI 제한효소 부위에 MCS를 삽입하여 pCLS08 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEM-T 벡터에 클로닝되어 있는 에리스로포이에틴 유전자를 주형으로 NhAsE1F 프라이머(aattg ctagc atata gcgat cgcgc aggac agctt ccgac agcag ggcca gg) 및 BbPsSbNhE1R 프라이머(aattg ctagc atata cctgc aggta tatgg gccca tatag ctgag gttga atgag aatat cactg tccca gacac)를 사용하여 PCR을 수행하여 MCS를 제조하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 15초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS07 벡터의 NheI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS08 벡터를 제조하였다.
pCLS08G1
벡터의 제조
pCLS08 벡터의 HindIII와 XhoI 제한효소 부위 사이에 lacZ 및 lacY 유전자를 삽입하여 pCLS08G1 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pSV-β-Galactosidase 벡터(Promega, Cat. No. TB094)를 주형으로 galHinF 프라이머(aatta agctt ctcgc gcaac ctatt ttccc ctcga ac) 및 galXhoR 프라이머(aattc tcgag ccgag tttgt cagaa agcag accaa ac)를 사용하여 PCR을 수행하여 lacZ 및 lacY 유전자를 증폭하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 3분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS08 벡터의 HindIII 및 XhoI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS08G1 벡터를 제조하였다.
pCLS09G1
벡터의 제조
pCLS08G1 벡터의 두 NheI 제한효소 부위 사이에 있는 MCS를 다른 MCS로 바꾸어서 pCLS09G1 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEM-T 벡터에 클로닝되어 있는 에리스로포이에틴 유전자를 주형으로 NhSbE1F 프라이머(aattg ctagc atata cctgc aggtt gaatg agaat atcac tgtcc cagac a)와 NhAsSfPsE1R 프라이머(aattg ctagc atata gcgat cgcta tatgg ccatg atggc catat agggc ccagg acagc ttccg acagc agggc caggc)를 사용하여 PCR을 수행하여 새로운 MCS를 제조하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 15초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, pCLS08G1 벡터의 두 NheI 제한효소 부위 사이에 있는 기존의 MCS를 제거하고 여기에 PCR로 새롭게 만든 MCS를 클로닝하여 pCLS09G1 벡터를 제조하였다. pCLS09G1 벡터의 맵(map)은 도 1에 나타내었다.
실시예
3:
SAR
/
MAR
를 포함하는 베타
갈락토시다제
발현 벡터의 제조
pCLS09G1t1
벡터의 제조
pCLS09G1 벡터의 SbfI 및 PspOMI 제한효소 부위 사이에 CSP-B 3' SAR 인자를 삽입하여 pCLS09G1t1 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEMT-CS3S.1.2k 벡터를 주형으로 cs3sSbf1F 프라이머(aattc ctgca gggga tccca ttctc cttga tgtac taat) 및 cs3sPsp1R 프라이머(aattg ggccc gaatt caaac aactc aatag caaga aac)를 사용하여 PCR을 수행하여 CSP-B 3' SAR 인자를 증폭하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 2분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS09G1 벡터의 SbfI 및 PspOMI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09G1t1 벡터를 제조하였다.
pCLS09G1f1
벡터의 제조
pCLS09G1 벡터의 SbfI 및 PspOMI 제한효소 부위 사이에 CSP-B 5' SAR 인자를 삽입하여 pCLS09G1f1 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEMT-CS5S.3.0k 벡터를 주형으로 cs5sSbf1F 프라이머(aattc ctgca gggaa ttcct aaaca gagca attag gtaag) 및 cs5sPsp1R 프라이머(aattg ggccc gaatt ccagt gtaaa cgtct tcctt gt)를 사용하여 PCR을 수행하여 CSP-B 5' SAR 인자를 증폭하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 2분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS09G1 벡터의 SbfI 및 PspOMI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09G1f1 벡터를 제조하였다.
pCLS09G1g1
벡터의 제조
pCLS09G1 벡터의 SbfI 및 PspOMI 제한효소 부위 사이에 베타 글로빈 MAR 인자를 삽입하여 pCLS09G1g1 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pcDNA3.3-Bg5M 벡터를 주형으로 glmSbf1F 프라이머(aattc ctgca ggttg tattc tgttt cgtga ggcaa ggttt) 및 glmPsp1R 프라이머(aattg ggccc ttcct ctcta tgttg gctca aatgt cct)를 사용하여 PCR을 수행하여 베타 글로빈 MAR 인자를 증폭하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 3분 20초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS09G1 벡터의 SbfI 및 PspOMI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09G1g1 벡터를 제조하였다.
pCLS09G1t2
벡터의 제조
pCLS09G1t1 벡터의 PspOMI 및 SfiI 제한효소 부위 사이에 CSP-B 3' SAR 인자를 삽입하여 pCLS09G1t2 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEMT-CS3S.1.2k 벡터를 주형으로 cs3sPsp2F 프라이머(aattg ggccc ggatc ccatt ctcct tgatg tacta at) 및 cs3sSfi2R 프라이머(aattg gccat gatgg ccgaa ttcaa acaac tcaat agcaa gaaac)를 사용하여 PCR을 수행하여 CSP-B 3' SAR 인자를 증폭하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 2분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS09G1t1 벡터의 PspOMI 및 SfiI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09G1t2 벡터를 제조하였다.
pCLS09G1f2
벡터의 제조
pCLS09G1f1 벡터의 PspOMI 및 SfiI 제한효소 부위 사이에 CSP-B 5' SAR 인자를 삽입하여 pCLS09G1f2 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEMT-CS5S.3.0k 벡터를 주형으로 cs5sPsp2F 프라이머(aattg ggccc gaatt cctaa acaga gcaat taggt aag) 및 cs5sSfi2R 프라이머(aattg gccat gatgg ccgaa ttcca gtgta aacgt cttcc ttgt)를 사용하여 PCR을 수행하여 CSP-B 5' SAR 인자를 증폭하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 2분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS09G1f1 벡터의 PspOMI 및 SfiI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09G1f2 벡터를 제조하였다.
pCLS09G1tf
벡터의 제조
pCLS09G1t1 벡터의 PspOMI 및 SfiI 제한효소 부위 사이에 CSP-B 5' SAR 인자를 삽입하여 pCLS09G1tf 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEMT-CS5S.3.0k 벡터를 주형으로 cs5sPsp2F 프라이머(aattg ggccc gaatt cctaa acaga gcaat taggt aag) 및 cs5sSfi2R 프라이머(aattg gccat gatgg ccgaa ttcca gtgta aacgt cttcc ttgt)를 사용하여 PCR을 수행하여 CSP-B 5' SAR 인자를 증폭하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 2분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS09G1t1 벡터의 PspOMI 및 SfiI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09G1tf 벡터를 제조하였다.
pCLS09G1f3
벡터의 제조
pCLS09G1f2 벡터의 CMV 프로모터 및 bla 프로모터 사이에 있는 BglII 제한효소 부위에 CSP-B 5' SAR 인자를 삽입하여 pCLS09G1f3 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEMT-CS5S.3.0k 벡터를 주형으로 cs5sBgl3F 프라이머(aatta gatct gaatt cctaa acaga gcaat taggt aag) 및 cs5sBgl3R 프라이머(aatta gatct gaatt ccagt gtaaa cgtct tcctt gt)를 사용하여 PCR을 수행하여 CSP-B 5' SAR 인자를 증폭하였다. 98℃에서 10, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 2분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS09G1f2 벡터의 BglII 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09G1f3 벡터를 제조하였다.
pCLS09G1f4
벡터의 제조
pCLS09G1f1 벡터의 CMV 프로모터 및 bla 프로모터 사이에 있는 BglII 제한효소 부위에 CSP-B 5' SAR 인자를 삽입하여 SAR가 목적 유전자인 lacZ 및 lacY 유전자의 양쪽에 위치하는 pCLS09G1f4 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEMT-CS5S.3.0k 벡터를 주형으로 cs5sBgl3F 프라이머(aatta gatct gaatt cctaa acaga gcaat taggt aag) 및 cs5sBgl3R 프라이머(aatta gatct gaatt ccagt gtaaa cgtct tcctt gt)를 사용하여 PCR을 수행하여 CSP-B 5' SAR 인자를 증폭하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 2분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS09G1f1 벡터의 BglII 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09G1f4 벡터를 제조하였다.
실시예
4:
SAR
/
MAR
도입 벡터를 사용한 베타
갈락토시다제
발현
pCLS09G1
,
pCLS09G1f1
,
pCLS09G1t1
,
pCLS09G1g1
벡터를 사용한 형질전환
CSP-B 5' SAR, CSP-B 3' SAR, 및 베타 글로빈 MAR 인자를 벡터에 1 카피 씩 도입하여 다음과 같이 그 효과를 알아보기 위하여, 다음과 같은 방법으로 CHO DG44 세포(Invitrogen, Cat. No. 12609)를 형질전환하였다.
부착배양 형태의 DG44 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 4 x 105 세포로 분주하였다. 24시간 후 세포가 플레이트 바닥에 완전히 부착된 것을 확인하였다. Opti-MEM 배지(Gibco, Cat. No. 31985-070)를 멸균된 tube 3개에 각각 500 ㎕ 씩 분주한 후 미리 준비한 pCLS09G1, pCLS09G1f1, pCLS09G1t1 및 pCLS09G1g1 벡터를 2 ㎍ 씩 혼합하고 약하게 피펫팅 하였다. Opti-MEM 배지를 멸균된 tube 3개에 각각 500 ㎕ 씩 분주하였다. 여기에 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Cat. No. 11668-027)을 10 ㎕ 씩 취하여 혼합하고 약하게 피펫팅 한 다음 상온에서 5분간 방치하였다. DNA와 시약 용액을 혼합하여 상온에서 20분간 방치하고, 이 혼합액을 각 DNA 당 준비한 6-웰 플레이트의 웰에 넣고 잘 혼합하였다.
pCLS09G1
,
pCLS09G1f1
,
pCLS09G1t1
,
pCLS09G1g1
벡터로 형질전환한 세포 풀(
pool
)의 베타
갈락토시다제
활성 확인
pCLS09G1, pCLS09G1f1, pCLS09G1t1 및 pCLS09G1g1 벡터로 DG44 세포를 형질전환하고 24시간 후 10% FBS와 500 ㎍/㎖ 제네티신(Geneticin)이 포함된 배지로 교환하였다. 3-4일에 한 번씩 배지를 교환하며 3주 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하여 안정적 세포의 풀을 제조하였다.
베타 갈락토시다제 분석 키트(Stratagen, Cat. No. 200383)를 사용하여 형질전환한 안정적 세포에 대한 베타 갈락토시다제 활성을 확인하고, 벡터에 따른 베타 갈락토시다제 활성과 pCLS09G1 벡터를 기준으로 한 상대적(relative) 베타 갈락토시다제 활성을 구하였다. 표 1 및 도 7에 나타낸 바와 같이, SAR/MAR 인자가 도입되지 않은 pCLS09G1 벡터에 비해 SAR/MAR 인자를 도입한 벡터는 모두 베타 갈락토시다제 활성이 증가하였다. 또한, 베타 글로빈 MAR 인자를 도입한 pCLS09G1g1 벡터에 비하여 CSP-B 5' SAR 인자를 도입한 pCLS09G1f1 벡터의 경우 더 높은 베타 갈락토시다제 활성 증가를 보였다. 따라서, 목적 단백질의 발현율 증가를 위하여 벡터에 CSP-B 5' SAR를 도입하는 것이 바람직하다.
| 형질전환에 사용한 벡터 |
도입된 SAR/MAR | 베타 갈락토시다제 활성 (units/㎎) |
베타 갈락토시다제 상대적 활성 |
| pCLS09G1 | 없음 | 3.4 | 1.0 |
| pCLS09G1f1 | CSP-B 5' SAR | 34.3 | 10.0 |
| pCLS09G1t1 | CSP-B 3' SAR | 7.4 | 2.2 |
| pCLS09G1g1 | 베타 글로빈 MAR | 29.8 | 8.7 |
pCLS09G1f1
,
pCLS09G1f2
,
pCLS09G1f3
,
pCLS09G1f4
벡터로 형질전환한 세포 풀의 베타
갈락토시다제
활성 확인
CSP-B 5' SAR 인자가 목적 단백질의 발현율을 증가시킨다는 것을 확인하고, 벡터에 도입하는 SAR 인자의 카피 수에 따라서 목적 단백질의 발현율 증가가 어떻게 달라지는지 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. pCLS09G1f1, pCLS09G1f2, pCLS09G1f3 및 pCLS09G1f4 벡터로 DG44 세포를 형질전환하고 제네티신 배지로 선별하여 세포 풀을 얻었다. 형질전환한 안정적 세포에 대한 베타 갈락토시다제 활성을 확인하고, 벡터에 따른 베타 갈락토시다제 활성을 구하였다. 표 2과 도 8에 나타낸 바와 같이, SAR 인자를 1 카피 또는 3 카피 도입한 벡터에 비하여 SAR 인자를 2 카피 도입한 벡터가 더 높은 베타 갈락토시다제 활성을 보였다. 즉, SAR 인자에 의한 목적 단백질의 발현율 증가는 SAR 인자의 카피 수에 따라 달라지고, SAR 인자를 벡터에 2 카피 도입함으로써 목적 단백질의 발현율을 최대로 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
| 형질전환에 사용한 벡터 |
도입된 SAR | 베타 갈락토시다제 활성 (units/㎎) |
베타 갈락토시다제 상대적 활성 |
||||||
| set1 | set2 | set3 | 평균 | set1 | set2 | set3 | 평균 | ||
| pCLS09G1f1 | CSP-B 5' SAR 1 카피 |
116 | 30 | 50 | 65 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| pCLS09G1f2 | CSP-B 5' SAR 연속 2 카피 |
147 | 103 | 107 | 119 | 1.3 | 3.4 | 2.1 | 2.3 |
| pCLS09G1f3 | CSP-B 5' SAR 3 카피 |
12 | 36 | 19 | 22 | 0.1 | 1.2 | 0.4 | 0.6 |
| pCLS09G1f4 | CSP-B 5' SAR 비연속 2 카피 |
112 | 112 | 66 | 97 | 1.0 | 3.7 | 1.3 | 2.0 |
실시예
5:
NESP
발현 벡터의 제조
에리스로포이에틴 유전자의 준비
GenBank M11319(human fetal liver genomic erythropoietin gene) 및 GenBank NM000799(human erythropoietin mRNA)에 등록되어 있는 582 bp의 에리스로포이에틴 유전자를 클로닝하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, Human liver Marathon-Ready cDNA library(BD, Cat. No. 7407-1)를 주형으로 IE1ATGF 프라이머(atggg ggtgc acgaa tgtcc tgcct) 및 IE1TGAR 프라이머(tcatc tgtcc cctgt cctgc aggcc t)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98℃에서 10초, 58℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분의 조건으로 40회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pGEM-T 벡터에 클로닝하였다.
NESP
유전자의 제조
대한민국 특허 출원번호 제1995-0701453호의 청구항 3에 명시된 에리스로포이에틴 유사체 NESP(A30N, H32T, P87V, W88N, P90T)의 유전자를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, A30N 및 H32T 유사체의 유전자를 제조하기 위하여, pGEM-T 벡터에 클로닝되어 있는 에리스로포이에틴 유전자를 주형으로 M13R 프라이머(gaaac agcta tgacc atg) 및 IA1g1R 프라이머(ctcat tcaag ctgca tgttt catta cagcc cgtcg tgat)를 사용하여 PCR을 수행하였고, M13F 프라이머(caggg ttttc ccagt cacga) 및 IA1g1F 프라이머(atcac gacgg gctgt aatga aacat gcagc ttgaa tgag)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 40초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 두가지 PCR 산물을 중복 PCR을 통해 연결하고, pGEM-T 벡터의 NdeI 및 SphI 제한효소 부위에 클로닝하였다.
A30N, H32T 유사체의 유전자를 A30N, H32T, P87V, W88N 및 P90T 유사체의 유전자로 돌연변이화 시키고 번역 개시 코돈(codon) 앞에 코작 서열(gccacc)을 붙이기 위하여, pGEM-T 벡터에 클로닝되어 있는 A30N, H32T 유사체의 유전자를 주형으로 M13R 프라이머 및 IA1G2R 프라이머(cacat gcagc tgcag tgtct cattc acctg ggaag agttg ac)를 사용하여 PCR을 수행하였고, M13F 프라이머 및 IA1G2F 프라이머(gtcaa ctctt cccag gtgaa tgaga cactg cagct gcatg tg)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 40초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 두가지 PCR 산물을 주형으로 IE1KzATGHinF 프라이머(aatta agctt gccac catgg gggtg cacga atgtc ctgcc t)와 IE1TGAXhoR 프라이머(aattc tcgag tcatc tgtcc cctgt cctgc aggcc t)를 사용하여 중복 PCR을 수행하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 50초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다.
pCLS07A1
벡터의 제조
상기 NESP 유전자의 PCR 산물을 pCLS07 벡터의 MCS 중 HindIII 및 XhoI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS07A1 벡터를 제조하였다.
실시예
6:
SAR
를 포함하는
NESP
발현 벡터의 제조
pCLS10A1
벡터의 제조
NESP를 동물세포에서 발현할 수 있는 pCLS07A1 벡터의 NheI 제한효소 부위에 SAR 또는 MAR 인자를 도입하기 위한 MCS를 삽입하여 pCLS10A1 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pcDNA3.1(-) 벡터를 주형으로 NhAsf1F 프라이머(aattg ctagc atata ggcgc gccaa cttga ttagg gtgat ggttc acgta g) 및 NhClPaPsf1R 프라이머(aattg ctagc atata atcga ttata tttaa ttaaa tatag ggccc ttgag tgttg ttcca gtttg gaaca aga)를 사용하여 PCR을 수행한 후 MCS를 얻었다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 15초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 이 PCR 산물을 pCLS07A1 벡터의 NheI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS10A1 벡터를 제조하였다.
pCLS10A1t1
벡터의 제조
pCLS10A1 벡터의 AscI 및 PspOMI 제한효소 부위 사이에 CSP-B 3' SAR 인자를 삽입하여 pCLS10A1t1 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEMT-CS3S.1.2k 벡터를 주형으로 cs3sAsc1F 프라이머(aattg gcgcg ccgga tccca ttctc cttga tgtac taat) 및 cs3sPsp1R 프라이머(aattg ggccc gaatt caaac aactc aatag caaga aac)를 사용하여 PCR을 수행하여 CSP-B 3' SAR 인자를 증폭하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 2분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS10A1 벡터의 AscI 및 PspOMI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS10A1t1 벡터를 제조하였다.
pCLS10A1f1
벡터의 제조
pCLS10A1 벡터의 AscI 및 PspOMI 제한효소 부위 사이에 CSP-B 5' SAR 인자를 삽입하여 pCLS10A1f1 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEMT-CS5S.3.0k 벡터를 주형으로 cs5sAsc1F 프라이머(aattg gcgcg ccgaa ttcct aaaca gagca attag gtaag) 및 cs5sPsp1R 프라이머(aattg ggccc gaatt ccagt gtaaa cgtct tcctt gt)를 사용하여 PCR을 수행하여 CSP-B 5' SAR 인자를 증폭하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 2분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS10A1 벡터의 AscI 및 PspOMI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS10A1f1 벡터를 제조하였다.
실시예
7:
SAR
도입 벡터를 사용한
NESP
발현
pCLS07A1
,
pCLS10A1f1
,
pCLS10A1t1
벡터로 형질전환한
DG44
세포 풀의
NESP
발현율 확인
베타 갈락토시다제 활성 실험을 통해 확인한 SAR 인자의 효과가 다른 재조합 단백질의 발현에도 적용되는가를 알아보기 위하여, 목적 단백질인 NESP와 SAR 인자를 포함하는 pCLS07A1, pCLS10A1f1, pCLS10A1t1 벡터를 DG44 세포에 형질전환하고 제네티신 포함 배지로 선별한 후 세포 풀을 얻어서 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법으로 NESP의 발현율을 확인하였다. 표 3 및 도 9에 나타낸 바와 같이, SAR 인자가 도입된 경우 발현량이 증가하는 것을 확인하였으며, 특히 CSP-B 5' SAR 인자를 NESP 유전자의 하위(downstream)에 도입한 경우 도입하지 않은 경우보다 NESP의 발현율이 11.2배 증가하는 것을 확인하였다.
| 형질전환에 사용한 벡터 |
도입된 SAR/MAR | NESP 발현율 (㎍/㎖) |
NESP 상대적 발현율 |
| pCLS07A1 | 없음 | 0.7 | 1.0 |
| pCLS10A1f1 | CSP-B 5' SAR | 7.9 | 11.2 |
| pCLS10A1t1 | CSP-B 3' SAR | 2.3 | 3.2 |
NESP
를 발현하는 양성 클론의 형성 빈도 확인
외래 유전자의 위치에 따른 유전자 발현 억제 현상을 극복할 수 있는 SAR 인자의 효과를 확인하기 위하여, pCLS07A1, pCLS10A1t1 및 pCLS10A1f1 벡터를 DG44 세포에 형질전환 한 후 96-웰 플레이트를 사용해서 단일 콜로니(single colony)를 만들었다. 현미경 관찰을 통해 각 벡터의 콜로니 형성 빈도를 확인하고, 배양액을 채취하여 발현율을 측정하여 각 벡터마다 NESP를 발현하는 양성 클론 형성 빈도를 구하였다. 표 4 및 표 5에 나타낸 바와 같이, SAR 인자 미도입시 82%의 콜로니 형성 빈도가 나타났고, CSP-B 5' SAR 인자 도입시 90%, 3' SAR 인자 도입시 50%의 웰에서 콜로니가 형성되었다. 또한, 양성 클론의 빈도는 SAR 인자 미도입시 및 3' SAR 인자 도입시 약 40% 정도로 나타났으며, 5' SAR 인자 도입시 59%로 증가하였다. 즉, 5' SAR 인자 도입시 외래 유전자의 위치에 따른 유전자 발현 억제 현상이 극복되어 목적 유전자인 NESP를 발현하는 클론이 더 많이 형성됨을 확인할 수 있었다.
| 형질전환에 사용한 벡터 |
도입된 SAR/MAR | 전체 웰 갯수 |
콜로니 형성 웰 갯수 |
콜로니 형성 빈도 (%) |
| pCLS07A1 | 없음 | 240 | 197 | 82 |
| pCLS10A1f1 | CSP-B 5' SAR | 240 | 217 | 90 |
| pCLS10A1t1 | CSP-B 3' SAR | 240 | 119 | 50 |
| 형질전환에 사용한 벡터 |
도입된 SAR/MAR | 전체 콜로니 갯수 |
양성 클론 갯수 |
양성 클론 빈도 (%) |
| pCLS07A1 | 없음 | 197 | 89 | 45 |
| pCLS10A1f1 | CSP-B 5' SAR | 217 | 127 | 59 |
| pCLS10A1t1 | CSP-B 3' SAR | 119 | 51 | 43 |
단일 클론의
NESP
발현율 확인
NESP의 발현이 확인된 96-웰 플레이트 상의 양성 클론 중 임의로 벡터당 24개를 골라 24-웰 플레이트로 계대한 후 배양액을 채취하여 발현율을 측정하였다. 도 10과 도 11에 나타낸 바와 같이, CSP-B 5' SAR 인자를 도입한 벡터의 경우 임의로 선택한 24개의 양성 클론 중 10 ㎍/㎖ 이상의 발현율을 나타내는 고발현 클론이 13개 나타났고, SAR 인자 미도입 벡터의 경우 5개 나타났다. 즉, 벡터에 5' SAR 인자를 도입시 고발현 클론의 출현 빈도수가 증가하는 것을 확인하였다.
실시예
8: 항-
HER2
항체 발현 벡터의 제조
pC01
벡터의 제조
네오마이신 저항 유전자, 암피실린 저항 유전자, CMV 프로모터, MCS, 및 BGH pA를 순서대로 포함하는 pC01 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pcDNA3.1(-) 벡터를 주형으로 V1_F 프라이머(aagct tcctc agcat cgatg gccgg ccgga tccct gtgcc ttcta gttgc cagcc atctg t) 및 V1_R 프라이머(tagag cccca gctgg ttctt tccgc ctcag)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pcDNA3.3-TOPO 벡터에 클로닝하여 pC01 벡터를 제조하였다.
pC02
벡터의 제조
CMV 프로모터, pC01 벡터의 MCS와 다른 MCS 및 BGH pA를 순서대로 포함하는 pC02 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pcDNA3.1(-) 벡터를 주형으로 V2_F 프라이머(gaatt ctgta caggt acccc tgcag gctcg agctg tgcct tctag ttgcc agcca tctgt) 및 V2_R 프라이머(tagag cccca gctgg ttctt tccgc ctcag)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pcDNA3.3-TOPO 벡터에 클로닝하여 pC02 벡터를 제조하였다.
pC03
벡터의 제조
pC01 벡터에 포함된 네오마이신 저항 유전자, 암피실린 저항 유전자, CMV 프로모터, 첫번째 MCS, BGH pA, pC02 벡터에 포함된 CMV 프로모터, 두번째 MCS 및 BGH pA를 순서대로 포함하는 pC03 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저, pC01 벡터를 DraIII 및 AgeI 제한효소로 절단하고 큰 DNA 절편을 얻었다. 다음으로 pC02 벡터를 주형으로 PcmvAgeF 프라이머(aatct gaccg gtgtt aggcg ttttg cgctg cttcg cg) 및 BGHNheDraR 프라이머(ttact acact acgtg gatcg agcta gctag agccc cagct ggttc tttcc g)를 사용하여 PCR을 수행하고 이 PCR 산물을 DraIII 및 AgeI 제한효소로 절단하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 마지막으로, pC01 벡터를 DraIII 및 AgeI 제한효소로 절단한 DNA 절편과 이 PCR 산물을 라이게이션 시켜서 pC03 벡터를 제조하였다.
pCLS05
벡터의 제조
pC03 벡터의 BGH pA와 SV40 프로모터 사이에 SV40dE1 프로모터, 코작 서열, dhfr 유전자 및 TK pA가 삽입된 pCLS05 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pC04 벡터를 주형으로 PsvApaDraF 프라이머 및 TKNheNdeR 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물과 pC03 벡터를 DraIII 및 NheI 제한효소로 각각 절단하고, 여기에서 얻은 두 개의 큰 DNA 절편을 라이게이션 시켜서 pCLS05 벡터를 제조하였다.
pCLS05H1
벡터의 제조
pCLS05 벡터의 EcoRI 및 XhoI 제한효소 부위 사이에 항-HER2 항체 중쇄(heavy chain) 유전자를 삽입하여 pCLS05H1 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, 합성한 항-HER2 항체 유전자를 주형으로 H1ssF 프라이머(ctctt cttgg tagca acagc tacag gtgtc cactc cgagg tccaa ctggt cgaaa gcggt gga)와 H1TGAXhoR 프라이머(aattc tcgag tcatt taccc ggaga caggg agagg ctctt)를 사용하여 PCR을 수행하여 시그날 서열(signal sequence)의 일부가 있는 중쇄 유전자를 증폭하고, 이 PCR 산물을 주형으로 H1ssEcoF 프라이머(aattg aattc gccac catgg gatgg agctg tatca tcctc ttctt ggtag caaca gctac agg)와 H1TGAXhoR 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 코작 서열과 시그날 서열이 있는 중쇄 유전자를 증폭하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pGEM-T 벡터에 클로닝하고, EcoRI 및 XhoI 제한효소로 절단하여 코작 서열과 시그날 서열이 있는 중쇄 유전자를 얻은 후, pCLS05 벡터의 EcoRI 및 XhoI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS05H1 벡터를 제조하였다.
pCLS05H2
벡터의 제조
pCLS05H1 벡터의 HindIII 및 BamHI 제한효소 부위 사이에 항-HER2 항체 경쇄(light chain) 유전자를 삽입하여 pCLS05H2 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 합성한 항-HER2 항체 유전자를 주형으로 H2ssF 프라이머(ctctt cttgg tagca acagc tacag gtgtc cactc cgata tccag atgac ccaga gtccc tct)와 H2TGABamR 프라이머(aattg gatcc tcaac actct cccct gttga agctc tttgt)를 사용하여 PCR을 수행하여 시그날 서열의 일부가 있는 경쇄 유전자를 증폭하고, 이 PCR 산물을 주형으로 H2ssHinF 프라이머(aatta agctt gccac catgg gatgg agctg tatca tcctc ttctt ggtag caaca gctac agg)와 H2TGABamR 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 코작 서열과 시그날 서열이 있는 경쇄 유전자를 증폭하였다. 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pGEM-T 벡터에 클로닝하고, HindIII 및 BamHI 제한효소로 절단하여 코작 서열과 시그날 서열이 있는 경쇄 유전자를 얻은 후, pCLS05H1 벡터의 HindIII 및 BamHI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS05H2 벡터를 제조하였다. pCLS05H2 벡터의 맵은 도 12에 나타내었다.
실시예
9 :
SAR
를 포함하는 항-
HER2
항체 발현 벡터의 제조
pCLS05H2f2
벡터의 제조
항-HER2 항체를 동물세포에서 발현할 수 있는 pCLS05H2 벡터의 중쇄 유전자와 dhfr 유전자 사이에 CSP-B 5' SAR 인자를 2카피 도입하여 pCLS05H2f2 벡터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. pCLS05H2 벡터 및 pCLS09G1f2 벡터를 XhoI 및 BssHII 제한효소로 각각 절단하고 여기에서 얻은 두 개의 큰 DNA 절편을 라이게이션 시켜서 pCLS05H2f2 벡터를 제조하였다. pCLS05H2f2 벡터의 맵은 도 12에 나타내었다.
실시예
10 :
SAR
도입 벡터를 사용한 항-
HER2
항체 발현
pCLS05H2
,
pCLS05H2f2
벡터로 형질전환한
DG44
세포 풀의 항-
HER2
항체 발현율 확인
목적 단백질인 항-HER2 항체의 유전자를 포함하는 pCLS05H2 벡터와 항체 유전자 및 SAR 인자를 포함하는 pCLS05H2f2 벡터를 각각 DG44 세포에 형질전환하고 제네티신 포함 배지로 선별한 후 세포 풀을 얻어서 ELISA 방법으로 항-HER2 항체의 발현율을 확인하였다. 표 6 및 도 13에 나타낸 바와 같이, SAR 인자를 2 카피 도입한 경우 도입하지 않은 경우보다 항-HER2 항체의 발현율이 30배 높은 것을 확인하였다. SAR 인자를 포함하는 pCLS05H2f2 벡터를 사용했을 때 제네티신에 저항성을 나타내며 살아남은 세포의 개수가 상대적으로 많았다.
| 형질전환에 사용한 벡터 |
도입된 SAR | 항-HER2 항체 발현율 (㎍/㎖) |
항-HER2 항체 상대적 발현율 |
||||||
| set1 | set2 | set3 | 평균 | set1 | set2 | set3 | 평균 | ||
| pCLS05H2 | 없음 | 0.29 | 0.50 | 0.26 | 0.35 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| pCLS05H2f2 | CSP-B 5' SAR 연속 2 카피 |
6.74 | 8.22 | 13.6 | 9.54 | 22.7 | 16.2 | 52.6 | 30.5 |
단일 클론의 항-
HER2
항체 발현율 확인
항-HER2 항체의 발현이 확인된 96-웰 플레이트 상의 양성 클론을 임의로 골라 24-웰 플레이트로 계대한 후 배양액을 채취하여 발현율을 측정하였다. 도 14와 도 15에 나타낸 바와 같이, CSP-B 5' SAR 인자를 2 카피 도입한 벡터의 경우 임의로 선택한 19개의 양성 클론 중 5 ㎍/㎖ 이상의 발현율을 나타내는 고발현 클론이 10개 나타났고, SAR 인자 미도입 벡터의 경우 6개 나타났다. 즉, 벡터에 5' SAR 인자를 도입시 상대적으로 재조합 단백질을 고발현하는 클론의 출현 빈도수가 증가하는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Chongkundang
<120> Animal Expression Vectors Carrying CSP-B 5' SAR Factor and
Methods for Preparing Recombinant Proteins Using the Same
<130> PN110228
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 12452
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCLS09G1f1 vector
<220>
<221> promoter
<222> (4140)..(4834)
<220>
<221> gene
<222> (4937)..(8164)
<220>
<221> gene
<222> (8216)..(8418)
<220>
<221> gene
<222> (8711)..(11139)
<400> 1
cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 60
tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 120
cttttgattt ataagggatt ttggggattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 180
aacaaaaatt taacgcgaat taattctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc 240
cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag 300
gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 360
gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 420
cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 480
ctctgcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 540
caaaaagctc ccgggagctt gtatatccat tttcggatct gatcaagaga caggatgagg 600
atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 660
gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 720
ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 780
gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 840
cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 900
gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 960
tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 1020
gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 1080
tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 1140
catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 1200
ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 1260
ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 1320
tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 1380
tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgcgaaatg accgaccaag 1440
cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg 1500
gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc 1560
tggagttctt cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 1620
atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 1680
ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg 1740
cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 1800
acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 1860
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 1920
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 1980
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 2040
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 2100
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 2160
ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 2220
cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 2280
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 2340
tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 2400
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 2460
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 2520
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 2580
gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 2640
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 2700
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 2760
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 2820
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 2880
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 2940
tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 3000
ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 3060
gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 3120
gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 3180
taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 3240
tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 3300
ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 3360
tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 3420
ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 3480
tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 3540
ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 3600
aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 3660
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 3720
aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 3780
tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 3840
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 3900
ctgacgtcga cggatcggga gatctcccga tcccctatgg tcgactctca gtacaatctg 3960
ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatct gctccctgct tgtgtgttgg aggtcgctga 4020
gtagtgcgcg agcaaaattt aagctacaac aaggcaaggc ttgaccgaca attgcatgaa 4080
gaatctgctt agggttaggc gttttgcgct gcttcgcgat gtacgggcca gatatacgcg 4140
ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 4200
cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 4260
caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 4320
gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 4380
tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 4440
ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 4500
attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata 4560
gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 4620
ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca 4680
aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg 4740
tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgggaccg 4800
atccagcctc cggactctag aggatcgaac ccttaagctt ctcgcgcaac ctattttccc 4860
ctcgaacact ttttaagccg tagataaaca ggctgggaca cttcacatga gcgaaaaata 4920
catcgtcacc tgggacatgt tgcagatcca tgcacgtaaa ctcgcaagcc gactgatgcc 4980
ttctgaacaa tggaaaggca ttattgccgt aagccgtggc ggtctggtac cggtgggtga 5040
agaccagaaa cagcacctcg aactgagccg cgatattgcc cagcgtttca acgcgctgta 5100
tggcgagatc gatcccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca 5160
acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg 5220
caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgct ttgcctggtt 5280
tccggcacca gaagcggtgc cggaaagctg gctggagtgc gatcttcctg aggccgatac 5340
tgtcgtcgtc ccctcaaact ggcagatgca cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt 5400
gacctatccc attacggtca atccgccgtt tgttcccacg gagaatccga cgggttgtta 5460
ctcgctcaca tttaatgttg atgaaagctg gctacaggaa ggccagacgc gaattatttt 5520
tgatggcgtt aactcggcgt ttcatctgtg gtgcaacggg cgctgggtcg gttacggcca 5580
ggacagtcgt ttgccgtctg aatttgacct gagcgcattt ttacgcgccg gagaaaaccg 5640
cctcgcggtg atggtgctgc gctggagtga cggcagttat ctggaagatc aggatatgtg 5700
gcggatgagc ggcattttcc gtgacgtctc gttgctgcat aaaccgacta cacaaatcag 5760
cgatttccat gttgccactc gctttaatga tgatttcagc cgcgctgtac tggaggctga 5820
agttcagatg tgcggcgagt tgcgtgacta cctacgggta acagtttctt tatggcaggg 5880
tgaaacgcag gtcgccagcg gcaccgcgcc tttcggcggt gaaattatcg atgagcgtgg 5940
tggttatgcc gatcgcgtca cactacgtct gaacgtcgaa aacccgaaac tgtggagcgc 6000
cgaaatcccg aatctctatc gtgcggtggt tgaactgcac accgccgacg gcacgctgat 6060
tgaagcagaa gcctgcgatg tcggtttccg cgaggtgcgg attgaaaatg gtctgctgct 6120
gctgaacggc aagccgttgc tgattcgagg cgttaaccgt cacgagcatc atcctctgca 6180
tggtcaggtc atggatgagc agacgatggt gcaggatatc ctgctgatga agcagaacaa 6240
ctttaacgcc gtgcgctgtt cgcattatcc gaaccatccg ctgtggtaca cgctgtgcga 6300
ccgctacggc ctgtatgtgg tggatgaagc caatattgaa acccacggca tggtgccaat 6360
gaatcgtctg accgatgatc cgcgctggct accggcgatg agcgaacgcg taacgcgaat 6420
ggtgcagcgc gatcgtaatc acccgagtgt gatcatctgg tcgctgggga atgaatcagg 6480
ccacggcgct aatcacgacg cgctgtatcg ctggatcaaa tctgtcgatc cttcccgccc 6540
ggtgcagtat gaaggcggcg gagccgacac cacggccacc gatattattt gcccgatgta 6600
cgcgcgcgtg gatgaagacc agcccttccc ggctgtgccg aaatggtcca tcaaaaaatg 6660
gctttcgcta cctggagaga cgcgcccgct gatcctttgc gaatacgccc acgcgatggg 6720
taacagtctt ggcggtttcg ctaaatactg gcaggcgttt cgtcagtatc cccgtttaca 6780
gggcggcttc gtctgggact gggtggatca gtcgctgatt aaatatgatg aaaacggcaa 6840
cccgtggtcg gcttacggcg gtgattttgg cgatacgccg aacgatcgcc agttctgtat 6900
gaacggtctg gtctttgccg accgcacgcc gcatccagcg ctgacggaag caaaacacca 6960
gcagcagttt ttccagttcc gtttatccgg gcaaaccatc gaagtgacca gcgaatacct 7020
gttccgtcat agcgataacg agctcctgca ctggatggtg gcgctggatg gtaagccgct 7080
ggcaagcggt gaagtgcctc tggatgtcgc tccacaaggt aaacagttga ttgaactgcc 7140
tgaactaccg cagccggaga gcgccgggca actctggctc acagtacgcg tagtgcaacc 7200
gaacgcgacc gcatggtcag aagccgggca catcagcgcc tggcagcagt ggcgtctggc 7260
ggaaaacctc agtgtgacgc tccccgccgc gtcccacgcc atcccgcatc tgaccaccag 7320
cgaaatggat ttttgcatcg agctgggtaa taagcgttgg caatttaacc gccagtcagg 7380
ctttctttca cagatgtgga ttggcgataa aaaacaactg ctgacgccgc tgcgcgatca 7440
gttcacccgt gcaccgctgg ataacgacat tggcgtaagt gaagcgaccc gcattgaccc 7500
taacgcctgg gtcgaacgct ggaaggcggc gggccattac caggccgaag cagcgttgtt 7560
gcagtgcacg gcagatacac ttgctgatgc ggtgctgatt acgaccgctc acgcgtggca 7620
gcatcagggg aaaaccttat ttatcagccg gaaaacctac cggattgatg gtagtggtca 7680
aatggcgatt accgttgatg ttgaagtggc gagcgataca ccgcatccgg cgcggattgg 7740
cctgaactgc cagctggcgc aggtagcaga gcgggtaaac tggctcggat tagggccgca 7800
agaaaactat cccgaccgcc ttactgccgc ctgttttgac cgctgggatc tgccattgtc 7860
agacatgtat accccgtacg tcttcccgag cgaaaacggt ctgcgctgcg ggacgcgcga 7920
attgaattat ggcccacacc agtggcgcgg cgacttccag ttcaacatca gccgctacag 7980
tcaacagcaa ctgatggaaa ccagccatcg ccatctgctg cacgcggaag aaggcacatg 8040
gctgaatatc gacggtttcc atatggggat tggtggcgac gactcctgga gcccgtcagt 8100
atcggcggaa ttccagctga gcgccggtcg ctaccattac cagttggtct ggtgtcaaaa 8160
ataataataa ccgggcaggc catgtctgcc cgtatttcgc gtaaggaaat ccattatgta 8220
ctatttaaaa aacacaaact tttggatgtt cggtttattc tttttctttt acttttttat 8280
catgggagcc tacttcccgt ttttcccgat ttggctacat gacatcaacc atatcagcaa 8340
aagtgatacg ggtattattt ttgccgctat ttctctgttc tcgctattat tccaaccgct 8400
gtttggtctg ctttctgaca aactcggctc gagctgtgcc ttctagttgc cagccatctg 8460
ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 8520
cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 8580
gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 8640
atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agctagcata 8700
tacctgcagg gaattcctaa acagagcaat taggtaagaa aatgaaagaa aaggtatcca 8760
attatgaagg aagaagtaaa actatttcta tttgcagatg acatgactgt atacaaagaa 8820
aatcccaaat aatccacaca aaaactagta gagttaataa gcaaattcaa caaatttcag 8880
ggtacaaaat cagttgtgtt tctatacaca aacccacaat gaacaataaa aaaaggaaac 8940
taagaaaaca atttccttta taataacatc ccaaagaata aaatacatgg gactaaattt 9000
aaccaaggaa gtgaaagaat tgtacactaa aaaccacaaa taattgctga ttaaatggaa 9060
agatgtccca tgttcacgga tagggatact taatattgtt aaatggcaat acttcccaaa 9120
gcaatctata gattcaatgc aatctctgtc aaaatttcaa atggtcttct ttgctgaaat 9180
ggaaaagcca atcctaaaat tcatatgtaa ttccatagga tccaaaaaag caaaaccaat 9240
attgaaatag aaaaacaaag ttggagtact tacacttctc aatttcaaaa cttacaagct 9300
acagtaatta aaacagcatg gcaaaggcat aaggatagac atatggatca atggaataga 9360
ttcagagtcc agaaataaac acaacattta tggccatttg atttttgata aggattgtca 9420
agggggtctt gaacattcag tggggaaaga ataatatctt caacaagtgg tgctggaaca 9480
attggatagc catgtgcaaa atactctagt agactcctac cttatgtcac atacaataat 9540
taatttaaaa taaatcaatc ctaaatataa gggccaaaac cataaaactc ttagaagaaa 9600
acaggcgtaa tcttcatggt ttctgatttg tcaatggatt cttaaatttg acaccaaaag 9660
cacaagcaac aaaagataaa attgatacat ttgaatgcat aaaatttttt taatttgcac 9720
atgaaatgac aatatcaaga aaatgaaaag acaatctgca gaatgggaga aaatatttac 9780
aagccacata tctgataagg gctgagtatc cagaatatat aacaaactct tccagctcaa 9840
caatgaaaac aaaaacaacg caattttaag aatgggcaaa ggacttgaat caacatttct 9900
ccaaagaaga tatgcgaata accagcaaac acatgaagtg atgctcaaca tcattactca 9960
taaaggaaat gtgaatcaaa accatatgac atactacttt acacccatta ggatgaagat 10020
aataatttta aaataacaag tgtcagcaag gatgcagaga aataggaact ttcctatgtt 10080
gctgataagc aatgcaaaag gatacaacca ctgtggaaaa cagtttggtg gttccttaaa 10140
aaattaaaaa taggattatt gtataactca gaaattccaa aagtatatat atttggtata 10200
tatccaaaag aactgaaaac atattgttca tgcagaaatt tgtacacaaa tgcttattat 10260
tgctgcatta gctacaatag ccaaaagatg aaaacaaccc aaatgtccat tgacagatga 10320
acaaataact tgtggtataa acatacaatg ggaatattat ttttccatca aaaagaacga 10380
atactggcat gtgctacagc ttgtatgaat ctcagaaaca ttattacaag tgaatgtagc 10440
cagccacaac aggccatgta ttgtgtgatt ccgtttatat gaaatatcca gaggtggtgg 10500
ttgcagattt tgaatgtgct aaatgtcact gaattgaata ctttaaaatg gttaattgta 10560
tgttatgtga attttacctc aattttttaa atgggtcata aacttatgtt tagcataatc 10620
cccttttaat tttaaaaaat gcagatatta catgagaaaa aatgtgctag agcatatttc 10680
aagacattaa agatggttat cagtgaatga tgagaaatta ggtaatgttt attattttcg 10740
ctttgctaaa attatttaaa aattacttgc atattaaatt ttttaatgcc taggaaagaa 10800
agactatagt tgtattgact aagatttcta cgagcatggg gaaaatgctt aatttgtagg 10860
gttaatcaag gataaaataa attgcattgt atgtacaatg tgatcccaag tatttaaaac 10920
acactgctta tggtaacagt cagtctgtgg gagacaggtt aaaaagtgat attttccctt 10980
cctactctcc aaattttctt aacaaacata tattatgact ataatcagaa aaaattattt 11040
ttaaaacgtc tactatgggg caagctaggt tcaaaaaata gaagtttgat aaatgtagtt 11100
ggcttgctat tgacaaggaa gacgtttaca ctggaattcg ggccctatat ggccatcatg 11160
gccatatagc gatcgctata tgctagcgat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc 11220
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ttggctgcga gccctgggcc ttcacccgaa cttggggggt ggggtgggga aaaggaagaa 11340
acgcgggcgt attggcccca atggggtctc ggtggggtat cgacagagtg ccagccctgg 11400
gaccgaaccc cgcgtttatg aacaaacgac ccaacacccg tgcgttttat tctgtctttt 11460
tattgccgtc atagcgcggg ttccttccgg tattgtctcc ttccgtgttt cagttagcct 11520
cccccgttta aactcattac taaccggttt tagtctttct tctcgtagac ttcaaactta 11580
tacttgatgc ctttttcctc ctggacctca gagaggacgc ctgggtattc tgggagaagt 11640
ttatatttcc ccaaatcaat ttctgggaaa aacgtgtcac tttcaaattc ctgcatgatc 11700
cttgtcacaa agagtctgag gtggcctggt tgattcatgg cttcctggta aacagaactg 11760
cctccgacta tccaaaccat gtctacttta cttgccaatt ccggttgttc aataagtctt 11820
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ctactgagaa ctatattaat tctgtccttt aaaggtcgat tcttctcagg aatggagaac 11940
caggttttcc tacccataat caccagattc tgtttacctt ccactgaaga ggttgtggtc 12000
attctttgga agtacttgaa ctcgttcctg agcggaggcc agggtaggtc tccgttcttg 12060
ccaatcccca tattttggga cacggcgacg atgcagttca atggtcgaac catgatggcg 12120
cgaaacgatc ctcatcctgt ctcttgatca gatccgaaaa tggatataca agctcccggg 12180
agctttttgc aaaagcctag gcctccaaaa aagcctcctc actacttctg gaatagctca 12240
gaggcagagg cggcctcggc ctctgcataa ataaaaaaaa ttagtcagcc atggggcgga 12300
gaatgggcgg aactgggcgg agttaggggc gggatgggcg gagttagggg cgggactatg 12360
gttgctgact aattgagatg catgctttgc atacttctgc ctgctgggga gcctggggac 12420
tttccacacc ctaactgaca cacattccac ag 12452
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<211> 14876
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<213> Artificial Sequence
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<223> pCLS09G1f2 vector
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<220>
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<221> gene
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<220>
<221> gene
<222> (11146)..(13574)
<400> 2
cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 60
tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 120
cttttgattt ataagggatt ttggggattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 180
aacaaaaatt taacgcgaat taattctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc 240
cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag 300
gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 360
gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 420
cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 480
ctctgcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 540
caaaaagctc ccgggagctt gtatatccat tttcggatct gatcaagaga caggatgagg 600
atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 660
gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 720
ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 780
gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 840
cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 900
gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 960
tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 1020
gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 1080
tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 1140
catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 1200
ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 1260
ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 1320
tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 1380
tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgcgaaatg accgaccaag 1440
cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg 1500
gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc 1560
tggagttctt cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 1620
atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 1680
ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg 1740
cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 1800
acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 1860
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 1920
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 1980
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 2040
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 2100
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 2160
ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 2220
cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 2280
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 2340
tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 2400
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 2460
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 2520
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 2580
gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 2640
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 2700
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 2760
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 2820
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 2880
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 2940
tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 3000
ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 3060
gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 3120
gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 3180
taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 3240
tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 3300
ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 3360
tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 3420
ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 3480
tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 3540
ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 3600
aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 3660
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 3720
aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 3780
tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 3840
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 3900
ctgacgtcga cggatcggga gatctcccga tcccctatgg tcgactctca gtacaatctg 3960
ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatct gctccctgct tgtgtgttgg aggtcgctga 4020
gtagtgcgcg agcaaaattt aagctacaac aaggcaaggc ttgaccgaca attgcatgaa 4080
gaatctgctt agggttaggc gttttgcgct gcttcgcgat gtacgggcca gatatacgcg 4140
ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 4200
cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 4260
caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 4320
gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 4380
tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 4440
ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 4500
attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata 4560
gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 4620
ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca 4680
aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg 4740
tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgggaccg 4800
atccagcctc cggactctag aggatcgaac ccttaagctt ctcgcgcaac ctattttccc 4860
ctcgaacact ttttaagccg tagataaaca ggctgggaca cttcacatga gcgaaaaata 4920
catcgtcacc tgggacatgt tgcagatcca tgcacgtaaa ctcgcaagcc gactgatgcc 4980
ttctgaacaa tggaaaggca ttattgccgt aagccgtggc ggtctggtac cggtgggtga 5040
agaccagaaa cagcacctcg aactgagccg cgatattgcc cagcgtttca acgcgctgta 5100
tggcgagatc gatcccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca 5160
acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg 5220
caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgct ttgcctggtt 5280
tccggcacca gaagcggtgc cggaaagctg gctggagtgc gatcttcctg aggccgatac 5340
tgtcgtcgtc ccctcaaact ggcagatgca cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt 5400
gacctatccc attacggtca atccgccgtt tgttcccacg gagaatccga cgggttgtta 5460
ctcgctcaca tttaatgttg atgaaagctg gctacaggaa ggccagacgc gaattatttt 5520
tgatggcgtt aactcggcgt ttcatctgtg gtgcaacggg cgctgggtcg gttacggcca 5580
ggacagtcgt ttgccgtctg aatttgacct gagcgcattt ttacgcgccg gagaaaaccg 5640
cctcgcggtg atggtgctgc gctggagtga cggcagttat ctggaagatc aggatatgtg 5700
gcggatgagc ggcattttcc gtgacgtctc gttgctgcat aaaccgacta cacaaatcag 5760
cgatttccat gttgccactc gctttaatga tgatttcagc cgcgctgtac tggaggctga 5820
agttcagatg tgcggcgagt tgcgtgacta cctacgggta acagtttctt tatggcaggg 5880
tgaaacgcag gtcgccagcg gcaccgcgcc tttcggcggt gaaattatcg atgagcgtgg 5940
tggttatgcc gatcgcgtca cactacgtct gaacgtcgaa aacccgaaac tgtggagcgc 6000
cgaaatcccg aatctctatc gtgcggtggt tgaactgcac accgccgacg gcacgctgat 6060
tgaagcagaa gcctgcgatg tcggtttccg cgaggtgcgg attgaaaatg gtctgctgct 6120
gctgaacggc aagccgttgc tgattcgagg cgttaaccgt cacgagcatc atcctctgca 6180
tggtcaggtc atggatgagc agacgatggt gcaggatatc ctgctgatga agcagaacaa 6240
ctttaacgcc gtgcgctgtt cgcattatcc gaaccatccg ctgtggtaca cgctgtgcga 6300
ccgctacggc ctgtatgtgg tggatgaagc caatattgaa acccacggca tggtgccaat 6360
gaatcgtctg accgatgatc cgcgctggct accggcgatg agcgaacgcg taacgcgaat 6420
ggtgcagcgc gatcgtaatc acccgagtgt gatcatctgg tcgctgggga atgaatcagg 6480
ccacggcgct aatcacgacg cgctgtatcg ctggatcaaa tctgtcgatc cttcccgccc 6540
ggtgcagtat gaaggcggcg gagccgacac cacggccacc gatattattt gcccgatgta 6600
cgcgcgcgtg gatgaagacc agcccttccc ggctgtgccg aaatggtcca tcaaaaaatg 6660
gctttcgcta cctggagaga cgcgcccgct gatcctttgc gaatacgccc acgcgatggg 6720
taacagtctt ggcggtttcg ctaaatactg gcaggcgttt cgtcagtatc cccgtttaca 6780
gggcggcttc gtctgggact gggtggatca gtcgctgatt aaatatgatg aaaacggcaa 6840
cccgtggtcg gcttacggcg gtgattttgg cgatacgccg aacgatcgcc agttctgtat 6900
gaacggtctg gtctttgccg accgcacgcc gcatccagcg ctgacggaag caaaacacca 6960
gcagcagttt ttccagttcc gtttatccgg gcaaaccatc gaagtgacca gcgaatacct 7020
gttccgtcat agcgataacg agctcctgca ctggatggtg gcgctggatg gtaagccgct 7080
ggcaagcggt gaagtgcctc tggatgtcgc tccacaaggt aaacagttga ttgaactgcc 7140
tgaactaccg cagccggaga gcgccgggca actctggctc acagtacgcg tagtgcaacc 7200
gaacgcgacc gcatggtcag aagccgggca catcagcgcc tggcagcagt ggcgtctggc 7260
ggaaaacctc agtgtgacgc tccccgccgc gtcccacgcc atcccgcatc tgaccaccag 7320
cgaaatggat ttttgcatcg agctgggtaa taagcgttgg caatttaacc gccagtcagg 7380
ctttctttca cagatgtgga ttggcgataa aaaacaactg ctgacgccgc tgcgcgatca 7440
gttcacccgt gcaccgctgg ataacgacat tggcgtaagt gaagcgaccc gcattgaccc 7500
taacgcctgg gtcgaacgct ggaaggcggc gggccattac caggccgaag cagcgttgtt 7560
gcagtgcacg gcagatacac ttgctgatgc ggtgctgatt acgaccgctc acgcgtggca 7620
gcatcagggg aaaaccttat ttatcagccg gaaaacctac cggattgatg gtagtggtca 7680
aatggcgatt accgttgatg ttgaagtggc gagcgataca ccgcatccgg cgcggattgg 7740
cctgaactgc cagctggcgc aggtagcaga gcgggtaaac tggctcggat tagggccgca 7800
agaaaactat cccgaccgcc ttactgccgc ctgttttgac cgctgggatc tgccattgtc 7860
agacatgtat accccgtacg tcttcccgag cgaaaacggt ctgcgctgcg ggacgcgcga 7920
attgaattat ggcccacacc agtggcgcgg cgacttccag ttcaacatca gccgctacag 7980
tcaacagcaa ctgatggaaa ccagccatcg ccatctgctg cacgcggaag aaggcacatg 8040
gctgaatatc gacggtttcc atatggggat tggtggcgac gactcctgga gcccgtcagt 8100
atcggcggaa ttccagctga gcgccggtcg ctaccattac cagttggtct ggtgtcaaaa 8160
ataataataa ccgggcaggc catgtctgcc cgtatttcgc gtaaggaaat ccattatgta 8220
ctatttaaaa aacacaaact tttggatgtt cggtttattc tttttctttt acttttttat 8280
catgggagcc tacttcccgt ttttcccgat ttggctacat gacatcaacc atatcagcaa 8340
aagtgatacg ggtattattt ttgccgctat ttctctgttc tcgctattat tccaaccgct 8400
gtttggtctg ctttctgaca aactcggctc gagctgtgcc ttctagttgc cagccatctg 8460
ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 8520
cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 8580
gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 8640
atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agctagcata 8700
tacctgcagg gaattcctaa acagagcaat taggtaagaa aatgaaagaa aaggtatcca 8760
attatgaagg aagaagtaaa actatttcta tttgcagatg acatgactgt atacaaagaa 8820
aatcccaaat aatccacaca aaaactagta gagttaataa gcaaattcaa caaatttcag 8880
ggtacaaaat cagttgtgtt tctatacaca aacccacaat gaacaataaa aaaaggaaac 8940
taagaaaaca atttccttta taataacatc ccaaagaata aaatacatgg gactaaattt 9000
aaccaaggaa gtgaaagaat tgtacactaa aaaccacaaa taattgctga ttaaatggaa 9060
agatgtccca tgttcacgga tagggatact taatattgtt aaatggcaat acttcccaaa 9120
gcaatctata gattcaatgc aatctctgtc aaaatttcaa atggtcttct ttgctgaaat 9180
ggaaaagcca atcctaaaat tcatatgtaa ttccatagga tccaaaaaag caaaaccaat 9240
attgaaatag aaaaacaaag ttggagtact tacacttctc aatttcaaaa cttacaagct 9300
acagtaatta aaacagcatg gcaaaggcat aaggatagac atatggatca atggaataga 9360
ttcagagtcc agaaataaac acaacattta tggccatttg atttttgata aggattgtca 9420
agggggtctt gaacattcag tggggaaaga ataatatctt caacaagtgg tgctggaaca 9480
attggatagc catgtgcaaa atactctagt agactcctac cttatgtcac atacaataat 9540
taatttaaaa taaatcaatc ctaaatataa gggccaaaac cataaaactc ttagaagaaa 9600
acaggcgtaa tcttcatggt ttctgatttg tcaatggatt cttaaatttg acaccaaaag 9660
cacaagcaac aaaagataaa attgatacat ttgaatgcat aaaatttttt taatttgcac 9720
atgaaatgac aatatcaaga aaatgaaaag acaatctgca gaatgggaga aaatatttac 9780
aagccacata tctgataagg gctgagtatc cagaatatat aacaaactct tccagctcaa 9840
caatgaaaac aaaaacaacg caattttaag aatgggcaaa ggacttgaat caacatttct 9900
ccaaagaaga tatgcgaata accagcaaac acatgaagtg atgctcaaca tcattactca 9960
taaaggaaat gtgaatcaaa accatatgac atactacttt acacccatta ggatgaagat 10020
aataatttta aaataacaag tgtcagcaag gatgcagaga aataggaact ttcctatgtt 10080
gctgataagc aatgcaaaag gatacaacca ctgtggaaaa cagtttggtg gttccttaaa 10140
aaattaaaaa taggattatt gtataactca gaaattccaa aagtatatat atttggtata 10200
tatccaaaag aactgaaaac atattgttca tgcagaaatt tgtacacaaa tgcttattat 10260
tgctgcatta gctacaatag ccaaaagatg aaaacaaccc aaatgtccat tgacagatga 10320
acaaataact tgtggtataa acatacaatg ggaatattat ttttccatca aaaagaacga 10380
atactggcat gtgctacagc ttgtatgaat ctcagaaaca ttattacaag tgaatgtagc 10440
cagccacaac aggccatgta ttgtgtgatt ccgtttatat gaaatatcca gaggtggtgg 10500
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tgttatgtga attttacctc aattttttaa atgggtcata aacttatgtt tagcataatc 10620
cccttttaat tttaaaaaat gcagatatta catgagaaaa aatgtgctag agcatatttc 10680
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ctttgctaaa attatttaaa aattacttgc atattaaatt ttttaatgcc taggaaagaa 10800
agactatagt tgtattgact aagatttcta cgagcatggg gaaaatgctt aatttgtagg 10860
gttaatcaag gataaaataa attgcattgt atgtacaatg tgatcccaag tatttaaaac 10920
acactgctta tggtaacagt cagtctgtgg gagacaggtt aaaaagtgat attttccctt 10980
cctactctcc aaattttctt aacaaacata tattatgact ataatcagaa aaaattattt 11040
ttaaaacgtc tactatgggg caagctaggt tcaaaaaata gaagtttgat aaatgtagtt 11100
ggcttgctat tgacaaggaa gacgtttaca ctggaattcg ggcccgaatt cctaaacaga 11160
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ttctatttgc agatgacatg actgtataca aagaaaatcc caaataatcc acacaaaaac 11280
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acatcccaaa gaataaaata catgggacta aatttaacca aggaagtgaa agaattgtac 11460
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ctgtcaaaat ttcaaatggt cttctttgct gaaatggaaa agccaatcct aaaattcata 11640
tgtaattcca taggatccaa aaaagcaaaa ccaatattga aatagaaaaa caaagttgga 11700
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gttcatgcag aaatttgtac acaaatgctt attattgctg cattagctac aatagccaaa 12720
agatgaaaac aacccaaatg tccattgaca gatgaacaaa taacttgtgg tataaacata 12780
caatgggaat attatttttc catcaaaaag aacgaatact ggcatgtgct acagcttgta 12840
tgaatctcag aaacattatt acaagtgaat gtagccagcc acaacaggcc atgtattgtg 12900
tgattccgtt tatatgaaat atccagaggt ggtggttgca gattttgaat gtgctaaatg 12960
tcactgaatt gaatacttta aaatggttaa ttgtatgtta tgtgaatttt acctcaattt 13020
tttaaatggg tcataaactt atgtttagca taatcccctt ttaattttaa aaaatgcaga 13080
tattacatga gaaaaaatgt gctagagcat atttcaagac attaaagatg gttatcagtg 13140
aatgatgaga aattaggtaa tgtttattat tttcgctttg ctaaaattat ttaaaaatta 13200
cttgcatatt aaatttttta atgcctagga aagaaagact atagttgtat tgactaagat 13260
ttctacgagc atggggaaaa tgcttaattt gtagggttaa tcaaggataa aataaattgc 13320
attgtatgta caatgtgatc ccaagtattt aaaacacact gcttatggta acagtcagtc 13380
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gtatcgacag agtgccagcc ctgggaccga accccgcgtt tatgaacaaa cgacccaaca 13860
cccgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg cgggttcctt ccggtattgt 13920
ctccttccgt gtttcagtta gcctcccccg tttaaactca ttactaaccg gttttagtct 13980
ttcttctcgt agacttcaaa cttatacttg atgccttttt cctcctggac ctcagagagg 14040
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aattccggtt gttcaataag tcttaaggca tcatccaaac ttttggcaag aaaatgagct 14280
cctcgtggtg gttctttgag ttctctactg agaactatat taattctgtc ctttaaaggt 14340
cgattcttct caggaatgga gaaccaggtt ttcctaccca taatcaccag attctgttta 14400
ccttccactg aagaggttgt ggtcattctt tggaagtact tgaactcgtt cctgagcgga 14460
ggccagggta ggtctccgtt cttgccaatc cccatatttt gggacacggc gacgatgcag 14520
ttcaatggtc gaaccatgat ggcgcgaaac gatcctcatc ctgtctcttg atcagatccg 14580
aaaatggata tacaagctcc cgggagcttt ttgcaaaagc ctaggcctcc aaaaaagcct 14640
cctcactact tctggaatag ctcagaggca gaggcggcct cggcctctgc ataaataaaa 14700
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aatgatgaga aattaggtaa tgtttattat tttcgctttg ctaaaattat ttaaaaatta 13200
cttgcatatt aaatttttta atgcctagga aagaaagact atagttgtat tgactaagat 13260
ttctacgagc atggggaaaa tgcttaattt gtagggttaa tcaaggataa aataaattgc 13320
attgtatgta caatgtgatc ccaagtattt aaaacacact gcttatggta acagtcagtc 13380
tgtgggagac aggttaaaaa gtgatatttt cccttcctac tctccaaatt ttcttaacaa 13440
acatatatta tgactataat cagaaaaaat tatttttaaa acgtctacta tggggcaagc 13500
taggttcaaa aaatagaagt ttgataaatg tagttggctt gctattgaca aggaagacgt 13560
ttacactgga attcgggccc gaattcctaa acagagcaat taggtaagaa aatgaaagaa 13620
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caaatttcag ggtacaaaat cagttgtgtt tctatacaca aacccacaat gaacaataaa 13800
aaaaggaaac taagaaaaca atttccttta taataacatc ccaaagaata aaatacatgg 13860
gactaaattt aaccaaggaa gtgaaagaat tgtacactaa aaaccacaaa taattgctga 13920
ttaaatggaa agatgtccca tgttcacgga tagggatact taatattgtt aaatggcaat 13980
acttcccaaa gcaatctata gattcaatgc aatctctgtc aaaatttcaa atggtcttct 14040
ttgctgaaat ggaaaagcca atcctaaaat tcatatgtaa ttccatagga tccaaaaaag 14100
caaaaccaat attgaaatag aaaaacaaag ttggagtact tacacttctc aatttcaaaa 14160
cttacaagct acagtaatta aaacagcatg gcaaaggcat aaggatagac atatggatca 14220
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acaccaaaag cacaagcaac aaaagataaa attgatacat ttgaatgcat aaaatttttt 14580
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tgacagatga acaaataact tgtggtataa acatacaatg ggaatattat ttttccatca 15240
aaaagaacga atactggcat gtgctacagc ttgtatgaat ctcagaaaca ttattacaag 15300
tgaatgtagc cagccacaac aggccatgta ttgtgtgatt ccgtttatat gaaatatcca 15360
gaggtggtgg ttgcagattt tgaatgtgct aaatgtcact gaattgaata ctttaaaatg 15420
gttaattgta tgttatgtga attttacctc aattttttaa atgggtcata aacttatgtt 15480
tagcataatc cccttttaat tttaaaaaat gcagatatta catgagaaaa aatgtgctag 15540
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tatttaaaac acactgctta tggtaacagt cagtctgtgg gagacaggtt aaaaagtgat 15840
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ccccgtttaa actcattact aaccggtttt agtctttctt ctcgtagact tcaaacttat 16440
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ttccacaccc taactgacac acattccaca g 17311
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cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 60
tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 120
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tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 2400
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 2460
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 2520
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ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 2820
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 2880
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 2940
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tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 3420
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aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 3660
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 3720
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actgtataca aagaaaatcc caaataatcc acacaaaaac tagtagagtt aataagcaaa 4080
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ataaaaaaag gaaactaaga aaacaatttc ctttataata acatcccaaa gaataaaata 4200
catgggacta aatttaacca aggaagtgaa agaattgtac actaaaaacc acaaataatt 4260
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cttctttgct gaaatggaaa agccaatcct aaaattcata tgtaattcca taggatccaa 4440
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tgataaggat tgtcaagggg gtcttgaaca ttcagtgggg aaagaataat atcttcaaca 4680
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ggagaaaata tttacaagcc acatatctga taagggctga gtatccagaa tatataacaa 5040
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gcgcctttcg gcggtgaaat tatcgatgag cgtggtggtt atgccgatcg cgtcacacta 8400
cgtctgaacg tcgaaaaccc gaaactgtgg agcgccgaaa tcccgaatct ctatcgtgcg 8460
gtggttgaac tgcacaccgc cgacggcacg ctgattgaag cagaagcctg cgatgtcggt 8520
ttccgcgagg tgcggattga aaatggtctg ctgctgctga acggcaagcc gttgctgatt 8580
cgaggcgtta accgtcacga gcatcatcct ctgcatggtc aggtcatgga tgagcagacg 8640
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tatcgctgga tcaaatctgt cgatccttcc cgcccggtgc agtatgaagg cggcggagcc 9000
gacaccacgg ccaccgatat tatttgcccg atgtacgcgc gcgtggatga agaccagccc 9060
ttcccggctg tgccgaaatg gtccatcaaa aaatggcttt cgctacctgg agagacgcgc 9120
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gggcaactct ggctcacagt acgcgtagtg caaccgaacg cgaccgcatg gtcagaagcc 9660
gggcacatca gcgcctggca gcagtggcgt ctggcggaaa acctcagtgt gacgctcccc 9720
gccgcgtccc acgccatccc gcatctgacc accagcgaaa tggatttttg catcgagctg 9780
ggtaataagc gttggcaatt taaccgccag tcaggctttc tttcacagat gtggattggc 9840
gataaaaaac aactgctgac gccgctgcgc gatcagttca cccgtgcacc gctggataac 9900
gacattggcg taagtgaagc gacccgcatt gaccctaacg cctgggtcga acgctggaag 9960
gcggcgggcc attaccaggc cgaagcagcg ttgttgcagt gcacggcaga tacacttgct 10020
gatgcggtgc tgattacgac cgctcacgcg tggcagcatc aggggaaaac cttatttatc 10080
agccggaaaa cctaccggat tgatggtagt ggtcaaatgg cgattaccgt tgatgttgaa 10140
gtggcgagcg atacaccgca tccggcgcgg attggcctga actgccagct ggcgcaggta 10200
gcagagcggg taaactggct cggattaggg ccgcaagaaa actatcccga ccgccttact 10260
gccgcctgtt ttgaccgctg ggatctgcca ttgtcagaca tgtatacccc gtacgtcttc 10320
ccgagcgaaa acggtctgcg ctgcgggacg cgcgaattga attatggccc acaccagtgg 10380
cgcggcgact tccagttcaa catcagccgc tacagtcaac agcaactgat ggaaaccagc 10440
catcgccatc tgctgcacgc ggaagaaggc acatggctga atatcgacgg tttccatatg 10500
gggattggtg gcgacgactc ctggagcccg tcagtatcgg cggaattcca gctgagcgcc 10560
ggtcgctacc attaccagtt ggtctggtgt caaaaataat aataaccggg caggccatgt 10620
ctgcccgtat ttcgcgtaag gaaatccatt atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg 10680
atgttcggtt tattcttttt cttttacttt tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc 10740
ccgatttggc tacatgacat caaccatatc agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc 10800
gctatttctc tgttctcgct attattccaa ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc 10860
ggctcgagct gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc 10920
cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc 10980
gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg 11040
ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga 11100
ggcggaaaga accagctggg gctctagcta gcatatacct gcagggaatt cctaaacaga 11160
gcaattaggt aagaaaatga aagaaaaggt atccaattat gaaggaagaa gtaaaactat 11220
ttctatttgc agatgacatg actgtataca aagaaaatcc caaataatcc acacaaaaac 11280
tagtagagtt aataagcaaa ttcaacaaat ttcagggtac aaaatcagtt gtgtttctat 11340
acacaaaccc acaatgaaca ataaaaaaag gaaactaaga aaacaatttc ctttataata 11400
acatcccaaa gaataaaata catgggacta aatttaacca aggaagtgaa agaattgtac 11460
actaaaaacc acaaataatt gctgattaaa tggaaagatg tcccatgttc acggataggg 11520
atacttaata ttgttaaatg gcaatacttc ccaaagcaat ctatagattc aatgcaatct 11580
ctgtcaaaat ttcaaatggt cttctttgct gaaatggaaa agccaatcct aaaattcata 11640
tgtaattcca taggatccaa aaaagcaaaa ccaatattga aatagaaaaa caaagttgga 11700
gtacttacac ttctcaattt caaaacttac aagctacagt aattaaaaca gcatggcaaa 11760
ggcataagga tagacatatg gatcaatgga atagattcag agtccagaaa taaacacaac 11820
atttatggcc atttgatttt tgataaggat tgtcaagggg gtcttgaaca ttcagtgggg 11880
aaagaataat atcttcaaca agtggtgctg gaacaattgg atagccatgt gcaaaatact 11940
ctagtagact cctaccttat gtcacataca ataattaatt taaaataaat caatcctaaa 12000
tataagggcc aaaaccataa aactcttaga agaaaacagg cgtaatcttc atggtttctg 12060
atttgtcaat ggattcttaa atttgacacc aaaagcacaa gcaacaaaag ataaaattga 12120
tacatttgaa tgcataaaat ttttttaatt tgcacatgaa atgacaatat caagaaaatg 12180
aaaagacaat ctgcagaatg ggagaaaata tttacaagcc acatatctga taagggctga 12240
gtatccagaa tatataacaa actcttccag ctcaacaatg aaaacaaaaa caacgcaatt 12300
ttaagaatgg gcaaaggact tgaatcaaca tttctccaaa gaagatatgc gaataaccag 12360
caaacacatg aagtgatgct caacatcatt actcataaag gaaatgtgaa tcaaaaccat 12420
atgacatact actttacacc cattaggatg aagataataa ttttaaaata acaagtgtca 12480
gcaaggatgc agagaaatag gaactttcct atgttgctga taagcaatgc aaaaggatac 12540
aaccactgtg gaaaacagtt tggtggttcc ttaaaaaatt aaaaatagga ttattgtata 12600
actcagaaat tccaaaagta tatatatttg gtatatatcc aaaagaactg aaaacatatt 12660
gttcatgcag aaatttgtac acaaatgctt attattgctg cattagctac aatagccaaa 12720
agatgaaaac aacccaaatg tccattgaca gatgaacaaa taacttgtgg tataaacata 12780
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tgattccgtt tatatgaaat atccagaggt ggtggttgca gattttgaat gtgctaaatg 12960
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ggttttagtc tttcttctcg tagacttcaa acttatactt gatgcctttt tcctcctgga 14040
cctcagagag gacgcctggg tattctggga gaagtttata tttccccaaa tcaatttctg 14100
ggaaaaacgt gtcactttca aattcctgca tgatccttgt cacaaagagt ctgaggtggc 14160
ctggttgatt catggcttcc tggtaaacag aactgcctcc gactatccaa accatgtcta 14220
ctttacttgc caattccggt tgttcaataa gtcttaaggc atcatccaaa cttttggcaa 14280
gaaaatgagc tcctcgtggt ggttctttga gttctctact gagaactata ttaattctgt 14340
cctttaaagg tcgattcttc tcaggaatgg agaaccaggt tttcctaccc ataatcacca 14400
gattctgttt accttccact gaagaggttg tggtcattct ttggaagtac ttgaactcgt 14460
tcctgagcgg aggccagggt aggtctccgt tcttgccaat ccccatattt tgggacacgg 14520
cgacgatgca gttcaatggt cgaaccatga tggcgcgaaa cgatcctcat cctgtctctt 14580
gatcagatcc gaaaatggat atacaagctc ccgggagctt tttgcaaaag cctaggcctc 14640
caaaaaagcc tcctcactac ttctggaata gctcagaggc agaggcggcc tcggcctctg 14700
cataaataaa aaaaattagt cagccatggg gcggagaatg ggcggaactg ggcggagtta 14760
ggggcgggat gggcggagtt aggggcggga ctatggttgc tgactaattg agatgcatgc 14820
tttgcatact tctgcctgct ggggagcctg gggactttcc acaccctaac tgacacacat 14880
tccacag 14887
Claims (10)
- 다음을 포함하는 동물세포용 발현 벡터:
발현하고자 하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
CSP-B(Cytotoxic Serine Protease-B)의 5‘-SAR(Scaffold or Matrix Attachment Region), 상기 CSP-B의 5‘-SAR은 상기 발현하고자 하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 다운스트림(downstream)에 위치하며;
동물세포에서 작동하는(operable) 프로모터; 및
폴리아데닐화 서열.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 5‘-SAR는 2 카피(copies)로 존재하는 것을 특징으로 하는 동물세포용 발현 벡터.
- 제 1 항에 있어서, 상기 동물세포에서 작동하는(operable) 프로모터는 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40(Simian Virus 40) 프로모터, SV40E1 프로모터, HSV(Herpes simplex virus)의 tk 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF1(elongation factor-1 alpha) 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2(interluekin-2) 유전자의 프로모터, 인간 IFN(interferon) 유전자의 프로모터, 인간 IL-4(interluekin-4) 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 또는 인간 GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor) 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는 동물세포용 발현 벡터.
- 제 1 항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 서열은 소성장 호르몬(Bovine Growth Hormone), HSV(Herpes simplex virus) 유래 TK(Thymidine Kinase) 또는 SV40(Simian virus 40) 유래 폴리 아데닐화 서열인 것을 특징으로 하는 동물세포용 발현 벡터.
- 제 1 항에 있어서, 상기 동물세포는 CHO(Chinese hamster ovary), VERO, HeLa 세포, WI38, BHK(Baby hamster kidney), COS 세포 또는 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포인 것을 특징으로 하는 동물세포용 발현 벡터.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 호르몬, 사이토카인, 항체, 펩타이드 앱타머, 어드넥틴(AdNectin), 어피바디(affibody), 아비머(Avimer) 또는 쿠니쯔 도메인(Kunitz domain)인 것을 특징으로 하는 동물세포용 발현 벡터.
- 제 7 항에 있어서, 상기 단백질은 EPO(erythropoietin), EPO 유사체 또는 항-HER2(Human epidermal growth factor receptor 2) 항체인 것을 특징으로 하는 동물세포용 발현 벡터.
- 상기 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 발현 벡터에 의해 형질전환된 동물세포.
- 상기 제 9 항의 형질전환된 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법.
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