KR101536668B1 - 인간 및 마우스 c-Met에 교차결합하는 항체 및 그의 용도 - Google Patents

인간 및 마우스 c-Met에 교차결합하는 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명의 항체는 인간 c-Met에 높은 특이성을 갖는 항체로 마우스 c-Met에 대해서도 교차결합능을 갖는다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 c-Met 뿐 만 아니라 마우스 c-Met에 특이적으로 결합할 수 있어 마우스 종양모델을 이용한 효능 평가에서 보다 정확한 전임상 결과를 확인할 수 있다. 본 발명의 항체는 높은 항 c-Met 결합 및 이에 따른 c-Met 기능 억제로 인해 다양한 암종 유래 암세포의 성장을 억제하며, c-Met과 하부 신호 전달물질들의 인산화를 억제함으로써 c-Met 신호전달을 억제하고, 신생혈관 형성을 억제함으로써 암의 예방 및 치료에 매우 유효하다.

Description

인간 및 마우스 c-Met에 교차결합하는 항체 및 그의 용도{Antibodies cross-reactive to Human and Mouse c-Met and Uses thereof}
본 발명은 인간 및 마우스 c-Met에 교차결합하는 항체 및 그의 용도에 관한 것이다.
간세포성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 표피성장인자(epidermal growth factor; EGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF) 와 같은 다양한 성장 인자들은 세포 표면의 수용체 타이로신 키나아제(receptor tyrosine kinase; RTK)들과 상호 작용하여 발생단계에서 뿐 아니라 세포 성장, 분화, 혈관신생, 조직 재생 등과 같은 중요한 세포생리적 조절을 유도한다. 이러한 성장인자와 수용체들이 변이, 과발현, 자체활성 촉진 등 생리적인 측면에서 탈조절 될 경우, 비정상적 세포 성장 또는 분화를 야기함으로써 암의 발달을 개시, 촉진시킨다(Lemmon MA & Schlessinger J, Cell. 141:1117-1134, 2010).
MET(met proto-oncogene; c-Met) 단백질은 간세포성장인자(HGF)/산란인자(scatter factor; SF) 수용체를 발현하는 원종양유전자로 알려져 있으며(Dean M et al., Nature. 318:385-388, 1985, Gherardi et al., Nat. Rev. Cancer. 12:89-103, 2012), 유일하게 알려진 리간드인 HGF와 상호 작용하여 중간엽-상피 이행(mesenchymal-epithelial transition; MET)을 유도하고, 암세포의 성장, 침투, 전이 기능을 촉진한다. c-Met의 경우, 여러 종양의 발달과정에서 리간드인 HGF와 상관없이 발생, 전이, 침습, 신생혈관 유도 등의 기작에도 관여하기 때문에 효과적인 항암 표적으로 여겨지고 있으며, 이러한 배경으로 인해 화학약물, 단클론항체 등과 같은 c-Met 저해제 관련 연구가 활발하다(Comoglio PM et al., Nat. Rev. Drug. Discov. 7:504-516, 2008).
항암표적 c-Met에 대한 길항항체(antagonistic antibody)의 개발은 대표적인 c-Met 저해에 의한 항암치료 전략이다. 항 c-Met 항체의 경우, 리간드인 HGF와 c-Met의 상호작용을 저해하거나, c-Met을 분해하여 불활성화 시키는 것으로 보고되고 있다. 예를 들어, 항 c-Met 항체로 개발된 ‘OA-5D5’ 한팔 길항 항체(one-armed antagonistic antibody)는 작용제(agonist)로서 c-Met 이량화(dmierization)를 유도하는 부작용을 갖지 않도록 변형된 항체로 개발 되었으며 (Martens T et al., Clin. Cancer Res. 15:6144-6152, 2006), ‘DN30’ 의 경우, c-Met 자체의 불활성화를 유도해 기능을 상실시킴으로써 종양형성 억제를 유도하도록 개발되었다(Petrelli A et al., PNAS. 103:5090-5095, 2006). 하지만 한팔 길항 항체의 경우는 항체 단독 처리에 의한 종양 억제 효과는 미미한 반면, 화학요법과 함께 처리될 때에 유의적인 치료효과를 보였고, c-Met 불활성화 항체는 리간드와 경쟁하는 양상이 낮고 작용제(agonist)로서의 효과를 부분적으로 보이는 단점이 있는 것으로 확인되었다. 따라서 인간 c-Met의 기능을 억제하는 치료용 항체의 개발은 지속적으로 요구되고 있다.
항암표적 항체 개발에 있어, in vitro 효능 평가뿐 아니라 마우스 종양모델을 이용한 in vivo 전임상 효능 평가가 필요하다. 특히, 마우스 종양모델을 이용한 효능 평가 시 확인 가능한 종양 크기 감소 능력, 생존 일수 증가와 같은 전임상 실험 결과를 통해 해당 항체의 치료 효능을 주요하게 판단하게 된다. 이 때 이용되는 마우스 종양모델은 항암표적을 과발현하는 인간 유래의 암세포를 주입하여 만들어지는데, 실제로 마우스 내 종양 미세환경(tumor microenvironment)은 주입된 인간 종양 세포 뿐 아니라 혼재된 마우스 유래 세포들의 간섭으로 인해 항체의 치료효과 확인 시 전임상 결과와 임상 결과와의 상관관계가 낮을 확률이 높다(Talmadge JE et al., Am. J. Pathol. 170:793-804, 2007). 따라서, 인간 유래 항암표적만을 억제하는 항체 뿐 아니라, 마우스 유래 항암표적 또는 리간드를 억제하는 항체와의 조합처치(combinatorial treatment) 또는 인간/마우스 이종 항암표적에 특이적인 항체가 종양모델에서 보다 정확한 전임상 치료 결과를 보여줄 수 있다. 예를 들어, 종양 내 혈관신생(angiogenesis)을 억제하는 항 Dll4(delta like ligand 4) 항체의 경우, 인간 Dll4 에 대한 항체 뿐 아니라 마우스 Dll4에 대한 항체를 마우스 종양모델에 조합처치 하였을 때 유의적으로 종양의 크기가 줄어드는 결과가 보고되었다(Hoey T et al., Cell Stem Cell. 5:168-177, 2009). 또한 혈관내피세포성장인자 수용체2(VEGFR-2) 또는 혈관내피세포성장인자(VEGF)를 표적하는 항체의 경우에서도, 인간/마우스 이종 항암표적에 교차반응(cross-reactive)하는 항체가 마우스 종양모델에서 높은 종양 억제 효과를 보임으로써 교차반응 항체 개발의 필요성을 시사하였다(Huang J et al., Cytotechnology. 62:61-71, 2010; Liang W-C et al., J. Biol. Chem. 281:951-961, 2006).
이와 같이, c-Met의 기능만을 억제하는 항 c-Met 항체의 경우, 인간 또는 마우스 유래 간세포성장인자의 오토크린(autocrine)/파라크린(paracrine) 작용에 대한 마우스 c-Met 수용체 억제 작용이 없어 마우스 종양모델에서의 전임상 효능 평가시 그 효과를 평가하는데 어려움이 있다. 인간 c-Met(P08581, UniProtKB/Swiss-Prot)은 1,390개, 마우스 c-Met(P16056, UniProtKB/Swiss-Prot)은 1379개의 아미노산으로 구성되어 있어 서로 89% 이상의 높은 서열 유사성을 갖는다(Chan AML et al., Oncogene. 2:593-599, 1988). 리간드인 간세포성장인자 역시 인간과 마우스 사이에 90% 이상의 매우 높은 서열 유사성이 있으며(Tashiro K et al., PNAS. 87:3200-3204, 1990), 리간드와 수용체가 작용하는 대표적인 위치 역시 세마 부위(Sema domain) 이기 때문에 교차반응 항체의 개발 및 적용 가능성이 높다고 할 수 있다. 따라서, 인간/마우스 c-Met에 대한 항체종양 미세 환경 내 암 특이 리간드-수용체 작용을 억제하여 마우스 종양모델에서 효과적인 전임상 연구결과를 확인할 수 있는 인간/마우스 c-Met에 교차반응하는 항체의 개발이 필요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 인간 c-Met에 결합하며 암을 예방 및 치료할 수 있는 항체를 개발하고자 노력한 결과, 인간 c-Met 및 마우스 c-Met에 교차결합능을 가지며, 암세포의 성장 및 신생혈관형성 억제능을 나타냄으로써 우수한 암의 예방 및 치료 효과를 갖는 신규한 항체를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 인간 c-Met에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 인간 c-Met에 대한 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 인간 c-Met에 대한 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 인간 c-Met에 대한 항체(클론명 1F12) 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:
(a) 다음의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열목록 제1서열의 CDRH1, 서열목록 제2서열의 CDRH2 및 서열목록 제3서열의 CDRH3; 그리고
(b) 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 서열목록 제4서열의 CDRL1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제6서열의 CDRL3.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 인간 c-Met에 대한 항체(클론명 2A01) 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:
(a) 다음의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열목록 제7서열의 CDRH1, 서열목록 제8서열의 CDRH2 및 서열목록 제9서열의 CDRH3; 그리고
(b) 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 서열목록 제10서열의 CDRL1, 서열목록 제11서열의 CDRL2 및 서열목록 제12서열의 CDRL3.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 인간 c-Met에 대한 항체(클론명 2C03) 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:
(a) 다음의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열목록 제13서열의 CDRH1, 서열목록 제14서열의 CDRH2 및 서열목록 제15서열의 CDRH3; 그리고
(b) 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 서열목록 제16서열의 CDRL1, 서열목록 제17서열의 CDRL2 및 서열목록 제18서열의 CDRL3.
본 발명자들은 인간 c-Met에 결합하며 암을 예방 및 치료할 수 있는 항체를 개발하고자 노력한 결과, 인간 c-Met 및 마우스 c-Met에 교차결합능을 가지며, 암세포의 성장 및 신생혈관형성 억제능을 나타냄으로써 우수한 암의 예방 및 치료 효과를 갖는 신규한 항체를 개발하였다.
본 발명의 항체는 인간 c-Met에 대하여 특이적 결합능을 갖는다. 특히, 본 발명의 항체는 인간 c-Met 및 마우스 c-Met에 대하여 교차결합능을 갖는다.
본 명세서에서, 인간 c-Met에 대한 항체를 언급하면서 사용되는 용어 “항체(antibody)”는 인간 c-Met에 대한 특이 항체로서, 인간 c-Met에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
본 명세서에서, 용어 “항원 결합 단편”은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 scFv 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에서, 용어“중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)에는 각각 3개의 CDRs이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 발명의 인간 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 인간 c-Met을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다. 또한 항체 가변영역 내 FR(framework region) 및 CDRs 서열순서 분석은 당업계에서 보편적으로 이용하는 IMGT(http://www.imgt.org/) 순서를 기준하여 표시할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 1F12 항체의 중쇄 가변영역은 서열목록 제19서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 1F12 항체의 경쇄 가변영역은 서열목록 제20서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 2A01 항체의 중쇄 가변영역은 서열목록 제21서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 2A01 항체의 경쇄 가변영역은 서열목록 제22서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 2C03 항체의 중쇄 가변영역은 서열목록 제23서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 2C03 항체의 경쇄 가변영역은 서열목록 제24서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체는 기본적으로, "중쇄의 가변 영역(VH)-링커-경쇄의 가변 영역(VL)"으로 이루어져 있다. 본 발명의 scFv 항체에서, 상기 링커는 중쇄 및 경쇄의 가변성 부위를 인위적으로 연결하는 작용을 하는 일정 길이의 아미노산 서열을 의미한다.
본 발명의 scFv 항체는 VH(서열목록 제19서열)-링커(서열목록 제25서열)-VL(서열목록 제20서열); VH(서열목록 제21서열)-링커(서열목록 제25서열)-VL(서열목록 제22서열); 및 VH(서열목록 제23서열)-링커(서열목록 제25서열)-VL(서열목록 제24서열)로 표시될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 c-Met 및 마우스 c-Met에 특이적으로 교차결합한다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 c-Met 뿐 만 아니라 마우스 c-Met에 특이적으로 결합할 수 있어 마우스 종양모델을 이용한 효능 평가에서 보다 정확한 전임상 결과를 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제19서열, 서열목록 제21서열 또는 서열목록 제23서열의 아미노산 서열을 포함하는 인간 c-Met 및 마우스 c-Met에 교차결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제20서열, 서열목록 제22서열 또는 서열목록 제24서열의 아미노산 서열을 포함하는 인간 c-Met 및 마우스 c-Met에 교차결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "핵산 분자“는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제26서열, 서열목록 제28서열 또는 서열목록 제30서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제27서열, 서열목록 제29서열 또는 서열목록 제31서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
인간 c-Met 항체를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “벡터”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스,의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 인간 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 인간 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 의해 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 인간 c-Met 항체는 높은 항 c-Met 결합 및 이에 따른 c-Met 기능 억제로 인해 다양한 암종 유래의 암세포의 성장을 억제하며, c-Met과 하부 신호 전달물질들의 인산화를 억제함으로써 c-Met 신호전달을 억제하고, 신생혈관 형성을 억제한다. 따라서, 본 발명의 항체는 암의 예방 및 치료에 매우 유효하다.
본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 당업계에 공지된 다양한 암을 포함하며, 예를 들어 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 자궁암, 비인두암, 후두암, 결장암, 난소암, 직장암, 대장암, 질암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 요도암, 전립선암, 기관지암, 방광암, 신장암 및 골수암을 포함한다.
구체적으로, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 c-Met 발현 암이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 암의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명의 항체는 인간 c-Met에 높은 특이성을 갖는 항체로 마우스 c-Met에 대해서도 교차결합능을 갖는다.
(b) 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 c-Met 뿐 만 아니라 마우스 c-Met에 특이적으로 결합할 수 있어 마우스 종양모델을 이용한 효능 평가에서 보다 정확한 전임상 결과를 확인할 수 있다.
(c) 본 발명의 항체는 높은 항 c-Met 결합 및 이에 따른 c-Met 기능 억제로 인해 다양한 암종 유래 암세포의 성장을 억제하며, c-Met과 하부 신호 전달물질들의 인산화를 억제함으로써 c-Met 신호전달을 억제하고, 신생혈관 형성을 억제함으로써 암의 예방 및 치료에 매우 유효하다.
도 1은 인간/마우스 c-Met에 교차결합이 가능한 scFv 항체 단편을 파지 디스플레이를 통해 선발해내는 과정에 대한 모식도이다.
도 2는 인간/마우스 c-Met에 교차결합하는 25종의 scFv 항체 단편들의 결합력을 나타낸다.
도 3a 및 3b는 3종의 항 c-Met scFv 항체 단편들이 표지된 각각의 파지 입자를 이용한 파지-ELISA 결과를 나타낸다.
도 4a 및 4b는 scFv 항체 단편 생산을 위한 파지미드 벡터 구성도와 실제 발현/정제된 각 scFv 항체 단편의 쿠마시 염색 결과이다.
도 5a 및 5b는 scFv 항체 단편 단백질의 인간/마우스 c-Met 교차결합능 및 c-Met 세포외 부위 결합능 확인 결과이다.
도 6은 항 c-Met scFv 항체 단편과 리간드 간세포성장인자 사이의 경쟁 반응 유무를 확인하기 위한 ELISA 실험 결과이다.
도 7은 c-Met을 과발현하는 세포주와 scFv 항체 단편들 사이의 결합능을 FACS 분석방법으로 분석한 결과이다.
도 8은 2종의 c-Met 과발현 세포주를 이용하여 c-Met 발현억제에 따른 scFv 항체 단편의 결합능 감소를 확인한 결과이다.
도 9는 3종의 c-Met 과발현 세포주를 이용하여 scFv 항체 단편의 처리에 따른 각 세포주의 성장억제 양상을 확인한 결과이다.
도 10은 U87MG 암세포주에 처리된 scFv 항체 단편의 위치 정보를 형광염색법을 통해 확인한 결과이다.
도 11은 U87MG과 MKN45 암세포주에 scFv 항체단편을 처리한 후 MET 신호전달경로의 하부신호전달물질들의 인산화를 웨스턴 블로팅법으로 확인한 결과이다.
도 12는 간세포성장인자(HGF)가 있는 조건에서 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)에 각 scFv 항체단편들을 처리하였을 때, 신생혈관형성의 억제가 관찰되는지 확인한 결과이다. 아래의 그래프는 혈관의 길이와 혈관에서 뻗어나오는 가지수를 측정한 결과이다.
도 13은 항원결정부지도작성에 사용된 c-Met 유래 15 mer 펩티드서열을 나타낸 것이다.
도 14는 각 scFv 항체단편이 c-Met의 어느 부분에 결합하는지 항원 결정부 지도작성을 통해 확인한 결과이다.
도 15는 표면 플라스몬 공명을 이용한 c-Met에 대한 각 scFv 클론들의 농도별 센서그램을 나타낸 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 항 c-Met scFv 항체 단편 동정을 위한 파지 디스플레이 스크리닝
기존에 제작된 합성 scFv 파지 라이브러리(Yang et al., Mol. Cells. 27:225- 235, 2009)를 이용하여 인간/마우스 c-Met에 교차반응하는 scFv 항체 단편을 파지 디스플레이 스크리닝을 통해 동정하였다. 파지 디스플레이 스크리닝 과정은 도 1과 같다.
상세하게, 대장균 숙주 ER2537 내에 도입되어 있는 파지미드(phagemid) 벡터를 파지 형태로 회수해내기 위해 4개의 하위 라이브러리 샘플을 각 400 ml의 배양배지(SB/암피실린/2% 글루코오스) 내에 첨가하여 약 2시간 동안 배양하였다. O.D 600에서 흡광도가 0.5까지 배양된 숙주 세포들은 5,000 g에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 제거 후 400 ml의 2차 배양배지(SB/암피실린) 내에 부유시킨 다음, 1012 pfu(plaque forming unit)의 헬퍼 파지(VCSM13)를 첨가하여 1시간 재배양하였다. 이후 카나마이신 항생제(헬퍼 파지 내 도입된 항생제 유전자)를 70 μg/ml 농도로 첨가한 후, 30℃에서 밤샘 배양을 통해 파지 라이브러리가 숙주 세포 외로 만들어질 수 있도록 하였다. 이후 원심 분리된 배양물은 PEG(polyethylene glycol) 용액을 이용하여 파지 입자만 침전시킴으로써 파지 라이브러리를 회수하였다. 각 하위 라이브러리로부터 회수된 파지를 계수하기 위해 각 샘플을 희석한 다음 다시 숙주세포(ER2537)에 감염시켜 LB/암피실린 배양배지에서 계수하였다.
파지 디스플레이 스크리닝은 반복 회차 패닝을 통해 실시하였다. 계수된 하위 라이브러리를 약 2.0 x 1012 pfu 수준이 되도록 취합한 후 TBS 내 10 μg/ml 수준으로 희석된 c-Met-Fc 단백질이 코팅된 면역튜브(immunotube)에 처리하였다. 처리 전 면역튜브 및 파지 입자는 TBS 내 3% 전지유를 함유하는 블로킹 용액을 1시간 처리하여 c-Met 외 비특이적인 결합을 방지하였다. 1시간 동안 파지 라이브러리를 c-Met에 처리한 후 TBST(0.1% Tween 20) 세척 용액으로 면역튜브를 세척한 다음 100 mM 트리에틸아민 1 ml을 첨가하여 10분간 정치함으로써, c-Met에 결합한 파지 입자들을 떼어내어 회수하였다. 회수된 파지(output) 수를 확인하기 위해 회수용액을 희석하여 숙주세포에 감염시킨 후 배양배지에서 계수하였다. 잔여 회수용액은 15 cm 배양배지에 도말하여 배양 후, 5 ml의 SB 배양배지(50% 글리세롤)를 첨가하여 콜로니들을 회수 및 보관(-80℃)하였다.
계속되는 패닝 회차를 위해 보관된 전 회차 파지 용액 중 50 μl를 취해 파지 입자 증폭 작업을 수행하였다. 숙주세포에 배양 후 헬퍼 파지를 첨가하여 회수된 파지 입자들은 PEG 침전을 통해 준비되었고, 이를 이용하여 다음 회차 패닝을 전 회차 패닝과 동일한 방법으로 진행하였다. 패닝은 마우스 c-Met에 대하여 총 4회차까지 진행하였으며, 이후 4회차 패닝에서 회수된 파지를 재증폭하여, 인간 c-Met에 대하여 2회차까지 패닝을 추가로 진행하였다. 파지 디스플레이 스크리닝 결과는 표 1과 같다.
마우스(M) 및 인간(H) cMet에 대한 파지 디스플레이 스크리닝(cfu/ml)
패닝 회차 1차 2차 3차 4차
M-Input 2.1 x 1012 2.3 x 1012 2.6 x 1012 2.8 x 1012
M-Output 7.2 x 106 4.7 x 107 3.8 x 107 1.1 x 108
H-Input 1.2 x 1011 6.2 x 1011 - -
H-Output 1.7 x 107 4.9 x 107 - -
실시예 2: 항 c-Met scFv 후보 선별을 위한 서열 분석 및 ELISA 선별
마우스/인간 c-Met에 대한 총 6회의 패닝이 종료된 후, 최종 회차에서 회수된 파지 입자들은 숙주세포에 감염을 통해 배양배지에서 콜로니로써 확인되었다. 이 콜로니들을 취하여 200 μl SB/암피실린 배양배지가 담긴 96웰 플레이트 내 각각 접종 후 배양하였다(37℃, 3시간 이내). 이후 scFv-pIII 단백질의 발현 유도를 위해 각 웰에 최종농도 1 mM의 IPTG를 처리하고 30℃에서 밤샘 배양하였다. 이후 배양 플레이트는 원심분리 및 상층액 제거 후 각 웰 내 배양세포의 주변세포질(periplasm) 부위를 회수하기 위하여 40 μl의 4℃로 유지해두었던 TES 용액(20% w/v 수크로오스, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)을 처리하여 4℃에서 30분 동안 정치함으로써 세포를 용해시켰다. 이후 다시 0.2X TES 용액 60 μl를 처리하여 30분 동안 정치하였고, 최종적으로 플레이트를 원심분리한 후 상층액을 회수함으로써 scFv-pIII 단백질을 소규모로 생산하였다.
한편, 인간 또는 마우스 c-Met-Fc 단백질이 코팅된 96웰 플레이트를 동시에 준비한 다음 회수된 주변세포질 부위 중 25 μl를 취하여 각 웰에 첨가 후 1시간 동안 결합시켰다. 이후 TBST를 이용, 3-4회 세척 과정을 거친 다음, HRP가 결합된 항 HA 항체를 1시간 결합시킨 후 다시 세척 및 발색반응(TMB substrate)을 유도한 후 O.D 450 nm에서 그 값을 측정하였다. 총 분석된 클론 수는 282개였으며, 이 중 25개의 클론(결합능 배수>2)들이 인간/마우스 c-Met에 대한 높은 결합능을 보였다(도 2). 패닝 시 c-Met 세포외 부위와 IgG의 Fc 부위가 결합된 항원형태를 이용했기 때문에, Fc 부위에 결합하는 파지 입자들을 배제하기 위해 대조군으로써 상용화된 항체(Erbitux) 또는 BSA 단백질을 이용하였다. 결과적으로, 각 클론들의 대조군 대비 인간/마우스 c-Met에 대한 교차결합능은 평균적으로 약 10 배 정도인 것을 확인하였다.
이후 scFv 서열을 확인하기 위해 각 클론들로부터 파지미드를 회수한 다음 DNA 서열 분석을 의뢰하였고, 그 결과 1D03/1D08/1E06/1F12/2B04/2D02/2DC09/3E07/3H08 클론들의 scFv 서열이 동일하게 확인되었으며, 마찬가지로 2A01/2B10 및 2C03/3B05 클론들의 서열 역시 서로 같았다. 총 25개의 클론 중 상기와 같은 9개, 2개, 2개 클론의 scFv 서열이 동일하게 확인된 것으로 비추어, 이 서열을 가지는 scFv 항체 단편들이 c-Met 세포외 부위 내 특정 에피토프(epitope)에 대한 각각의 결합 능력이 높기 때문에 스크리닝 과정에서 다수 선별된 것임을 알 수 있다. 이를 통해 3종의 인간/마우스 c-Met 교차반응 scFv 항체 단편들을 동정하였다(표 2, 3). 인간/마우스 c-Met에 대한 특이 결합능이 없었던 2D05 클론의 경우, 추후 3종의 scFv 항체 단편의 기능을 평가하는데 대조군으로 이용되었다.
인간/마우스 c-Met 교차반응 scFv 항체 중쇄 FR/CDR 서열
클론명 (V-gene family) 1F12 (IGHV3) 2A01 (IGHV3) 2CO3 (IGHV3)
FR1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAAS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
CDR1 GFTFSNYA GFTFSSYD GFTFSNYA
FR2 MSWVRQAPGKGLEWVSG MSWVRRAPGKGLEWVSW MSWVRQAPGKGLEWVSA
CDR2 ISYSGGST ISHGGSSI ISYDSGSI
FR3 YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC SYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC
CDR3 AKASRSCQRPACSYANGMDV AKDAYPIRQETFDY AKAARSCRNWSCSYANGMDV
FR4 WGQGTLVTVSS WGQGTLVTVSS WGQGTLVTVSS
인간/마우스 c-Met 교차반응 scFv 항체 경쇄 FR/CDR 서열
클론명 (V-gene family) 1F12 (IGLV1) 2A01 (IGLV1) 2CO3 (IGLV1)
FR1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGS
CDR1 SSNIGNNY SSNIGNND SSNIGSNY
FR2 VTWYQQLPGTAPKLLIY VSWYQQLPGTAPKLLIY VSWYRQLPGTAPKLLIY
CDR2 YNN PDS SDS
FR3 HRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC QRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC NRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC
CDR3 GSWDYSLSAYV ASWDSSLSGYV GSWDDSLSGYV
FR4 FGGGTKLTVL FGGGTKLTVL FGGGTKLTVL
실시예 3: 항 c-Met scFv 표지 파지를 이용한 c-Met 결합능 확인
3종의 scFv 항체 단편은 파지 디스플레이 스크리닝을 통해 선별되었기 때문에 파지의 구조에 발현된 채로 c-Met에 대한 결합능을 보임을 우선적으로 확인하였다. 3종의 scFv를 표지하는 각각의 파지 입자를 개별적으로 회수작업을 수행하여, 클론별로 각각 계수되었다(1F12: 2.58 x 1012 pfu, 2A01: 8.1 x 1011 pfu, 2C03: 8.5 x 1011 pfu, 2D05: 1.49 x 1012 pfu). 이후 인간 c-Met이 코팅된 96웰 플레이트에 각각의 파지 입자를 희석하여 그 농도에 따라 처리하여 항 파지 항체를 이용한 ELISA 분석을 통해 그 결합능을 확인하였다. 그 결과, 파지 입자수의 감소에 따라 결합능이 감소하는 양상을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 파지 입자수에 의한 c-Met에 대한 특이성을 검정할 수 있었다(도 3a). 재현성 확인을 위해 특정 파지 입자수(1 x 1010 pfu/웰) 만큼 각각의 파지를 처리하였을 때 역시, 대조군 파지(2D05) 대비 통계적으로 유의한 높은 결합력을 확인하였다(도 3b). 따라서 스크리닝 과정에서 c-Met에 대한 결합능을 기반으로 선별된 각 scFv 항체 단편들은 파지 구조체에 표지된 형태로도 c-Met에 대한 결합능을 보임을 검정할 수 있었다.
실시예 4: 항 c-Met scFv 단백질 생산 및 c-Met 결합능 확인
scFv 항체 단편 단독의 결합력 및 기능을 확인하기 위해 단백질 발현 균주(TOP10F’)를 이용하여 발현 및 정제과정을 거쳤다. 파지미드의 기본 구성은 도 4a에서 확인할 수 있으며, 스크리닝된 파지미드를 보유한 숙주세포(ER2537)는 scFv와 파지의 pIII 단백질 사이에 존재하는 전사억제 코돈(amber codon(UAG))을 억제하는 숙주로써 scFv 단독 발현이 불가능하기 때문에, 비억제 숙주(non-suppressor strain)인 발현균주(TOP10F’)를 이용하였다.
상세하게, 각 항체 단편을 코딩하는 파지미드는 숙주세포로부터 회수된 후 발현균주 내로 형질도입 되었다. 이후 DNA 서열분석을 통해 각 파지미드가 성공적으로 도입된 발현균주를 확인하였으며, 각 scFv가 도입된 발현균주들은 단일 콜로니를 취한 다음 LB/암피실린 배양배지 3 ml에 접종 후 37℃에서 밤샘배양 되었다. 밤샘배양 후 배양액은 400 ml의 배양배지(SB/암피실린)로 옮겨진 후, OD 600에서 0.5-0.8이 될 때까지 추가로 배양되었고, 최종 농도 1 mM의 IPTG를 첨가하여 30℃에서 다시 밤샘배양 되었다. 배양액은 원심분리 후 TES 용액 40 ml을 이용하여 발현숙주를 용해시킨 다음 주변세포질 부위를 회수하였으며, 회수된 배양액은 0.45 μm 필터를 통해 여과되었다. 여과된 용해용액 내 scFv 단백질은 His-tag 정제를 위해 Ni-NTA 비드(Qiagen) 1.2 ml이 첨가되어 상온에서 1시간 동안 결합되었으며, 이후 중력 컬럼(gravity column, Bio-rad)에 패킹되어 이미다졸 용액을 이용하여 세정 및 회수되었다. 각 클론의 발현 및 정제 후 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색(coomassie blue staining)결과는 도 4b에서와 같으며, 각각의 scFv는 약 28 kDa 크기를 가짐을 확인할 수 있었다. 각 정제 scFv 단백질들은 브래드포드(Bradford) 단백질 측정 방법을 통해 농도 측정 후 보관 및 추후 실험에 이용되었다.
생산된 scFv 단백질을 이용하여, 인간/마우스 c-Met 세포외 부위+Fc 단백질에 대한 결합능을 ELISA를 통해 확인하였다. 96웰 플레이트에 10 μg/ml 농도로 코팅된 인간/마우스 c-Met에 생산된 각각의 scFv 단백질(1F12, 2A01, 2C03, 2D05)들을 5 μg/ml 수준으로 처리 후 1시간 동안 상온에서 결합시켰다. 이후 0.1% TBST 용액을 이용하여 3회 세척한 다음, HRP가 결합된 항 HA 항체를 1시간 처리하여 c-Met과 결합중인 scFv 단백질을 탐지하였다. 이후 3회 세척 과정을 거친 후 기질인 TMB를 10 μl 처리하고 5분 정치 후 2 M 황산 용액을 이용하여 반응을 멈추고 난 다음 ELISA 분석기로 흡광도를 측정했다. 그 결과, 각각의 scFv 단백질은 대조군(IgG, BSA)에 비해 인간 및 마우스 c-Met 단백질에 대해 유의적인 결합능이 있음을 확인할 수 있었다(도 5a). 또한, Fc 부위가 붙어있지 않은 인간 c-Met 단백질을 이용하여 각 scFv 단백질을 500 ng/ml 농도로 처리한 후 동일한 ELISA 분석을 실시하였고, 마찬가지로 각 scFv 단백질별 결합능의 정도는 조금씩 차이가 났지만, 모두 성공적으로 c-Met 세포외 부위에 대한 특이성이 있음을 보여주었다(도 5b).
실시예 5: 항체 단편의 리간드(간세포성장인자) 및 c-Met 사이의 경쟁적 결합 억제 확인
선별된 scFv 단백질이 c-Met의 리간드인 간세포성장인자에 대한 경쟁 결합능이 있는지를 확인하기 위해 리간드 경쟁 ELISA 실험을 수행하였다. 실시예 2, 4에서와 같이, 코팅된 인간 c-Met을 준비하고, 각 scFv 단백질을 500 ng/ml 농도부터 1/2씩 약 1 ng/ml 농도가 될 때까지 희석한 샘플을 각 웰에 처리하였다. 처리 후 실험 과정은 실시예 4에서와 같이 진행되었고, 한편으로는 리간드와의 경쟁 결합능 확인을 위해 간세포성장인자가 2.5 μg/ml로 과다 처리된 실험구를 동일하게 수행하였다. 그 결과, 1F12 scFv 단백질 및 2C03 scFv 단백질을 처리한 경우, 과량의 리간드가 존재함에도 다소 둔감한 경쟁양상을 보였으며, 2A01 scFv 단백질을 처리했을 때는 처리 농도에 따른 민감한 경쟁양상이 있음을 확인할 수 있었다(도 6). 이를 통해 1F12나 2C03 클론보다 2A01 클론이 c-Met과 리간드의 결합 부위에 가깝게 결합하여 둘의 상호작용을 보다 잘 방해할 수 있을 것으로 확인되었다. 하지만, 리간드와 수용체의 경쟁을 잘 유도하지 못하더라도 그 수용체(또는 리간드)에 대한 결합능 자체가 뛰어난 항체의 경우에도 효과적인 치료효과를 보일 수 있다는 보고들이 있기 때문에, 1F12, 2C03 scFv 항체 역시 세포주를 이용한 기능 평가에 이용되었다.
실시예 6: c-Met 과발현 암세포주에 대한 scFv 항체 단편의 결합능 확인
현재까지 c-Met을 과발현하는 세포주 모델이 다수의 암종에서 보고되었으며, 이러한 것을 참고하여 총 5종의 암세포주를 이용하여 scFv 항체의 결합 정도를 FACS 분석을 통해 비교하였다. 5종의 세포주는 각각 위암(MKN45), 뇌종양(U87MG), 신장암(Caki-1), 폐암(H441), 간암(HepG2) 유래의 세포주를 이용하였고 각 세포주들을 배양배지(DMEM, 10% FBS)에서 배양 후 5 x 105 수의 세포를 각 튜브 내 준비하였다. 이후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시킨 다음, 원심분리 후 FACS 분석 용액으로 1회 세척하였다. 준비된 세포에 각 scFv 단백질을 1 μg 및 5 μg 처리한 다음 4℃ 에서 밤샘 배양을 통해 세포에 해당 항체 단편이 결합하도록 처치하였다. 이후 FACS 용액으로 비특이 결합된 scFv 단백질을 2회 세척해낸 후 형광(PE, phycoerythrin)이 결합된 항 HA 항체를 1시간 동안 결합시켰다. 그리고 다시 FACS 용액으로 세척 후 FACS 용액 500 μl를 추가하여 FACS 분석을 실시하였다. 결과적으로, 1F12, 2A01, 2C03 세 종의 scFv 항체 단편 모두 c-Met이 과발현된 세포주에 대조구(2D05) 대비 특이적인 결합능을 보였다(도 7). 또한 처리량에 따라 결합이 감소되는 양상 역시 확인되었기 때문에, 해당 scFv 항체 단편은 표적 단백질인 c-Met에 대한 특이성이 높음을 확인할 수 있었다.
아울러 해당 세포주 중 대표적인 두 세포주(U87MG, HepG2)를 이용하여 scFv 항체 단편들의 c-Met에 대한 특이성을 확인하기 위해 c-Met-siRNA를 이용한 발현 억제를 유도하였다. c-Met의 발현 억제는 SIHK1284, SIHK1285 Met siRNA (sigma-aldrich) 두 종을 동일 농도씩 섞어서 이용했으며, 세포도입 조건은 50 pmol/ml의 siRNA와 함께 리포좀(lipofectamine, Invitrogen)의 양을 반응 당 5 μl 또는 2 μl로 처리한 후 세포로부터 단백질을 회수하여 웨스턴 블롯을 통해 최적 발현 감소 조건을 확인했다(도 8a). siRNA 도입 후 항 c-Met 단일클론 항체를 이용하여 FACS 분석을 수행했고, 도 8b에서와 같이 U87MG 세포 및 HepG2 세포에서 모두 c-Met의 발현이 감소함을 확인하였다. 그리고 예상했던 것처럼, 각 5 μg/ml 씩 처리된 각 scFv 항체 단편들의 c-Met 발현감소 세포에 대한 결합능은 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다(도 8c). 이를 통해 동정된 scFv 항체 단편들이 실제 세포막에 존재하는 c-Met 세포외 부위에 대한 특이성이 있음을 확인하였다.
실시예 7: c-Met 과발현 암세포주에 대한 scFv 항체 단편의 세포성장 억제능 확인
동정한 1F12, 2A01, 2C03 scFv 항체 단편의 암세포 증식 억제를 통한 항암 능력을 검정하기 위하여 세포증식 분석법을 수행하였다. 실험은 세 종류의 암세포주, 즉 간세포성장인자를 자가 생산(autocrine)하여 세포 표면에 과발현된 c-Met에 작용하는 U87MG 및 KP-4 세포주와 간세포성장인자를 자가 생산하는 기능은 확실치 않지만 세포 표면에 과발현된 c-Met이 과활성화되어 세포 내로 신호를 지속적으로 유도하는 것으로 알려진 MKN45 세포를 이용하여 수행되었다. 3종의 세포주를 간세포성장인자가 있는 조건(10 ng/ml)과 없는 조건에서 100 μl 배양 배지 내에 1 x 103 개의 세포가 들어가도록 준비했다. 개별적인 scFv 항체 단편 클론들은 50 μg/ml 의 농도로 준비되어, 24시간 배양된 3종의 세포의 각 웰에 처리되었으며, 처리 후 0일, 1일, 2일, 3일, 4일까지 EZ-Cytox 세포 생존능 어세이 키트(Daeil Lab. Service)를 이용하여 세포의 성장 정도를 측정하였다.
결과적으로, 간세포성장인자가 처리되지 않은 실험구에서는, 3종의 세포 주 모두에서 2일 이후부터 모든 클론들에 의한 성장 억제 효과가 나타났다(도 9). 한편, 간세포성장인자를 처리한 조건에서는 1F12 scFv 항체 단편에 의한 성장 억제 양상이 가장 높게 나타났으며, 2A01과 2C03 scFv 항체 단편들 또한 낮지만 유의적인 수준 이상의 세포 성장 억제 효과를 보였다. 이러한 결과를 토대로, 1F12 scFv 항체 단편의 경우, 고유의 높은 항 c-Met 결합 및 이에 따른 c-Met 기능 억제로 인해 세포 성장을 억제함을 확인하였다.
실시예 8: 항체 단편의 c-Met 과발현 암세포 내 투과능 확인
항 c-Met 항체 단편의 세포 내 위치 확인을 위한 세포면역형광염색법을 수행하였다. 6웰 플레이트에 멸균된 슬라이드 덮개(coverslip)를 넣고 실험 세포주 MKN45를 처리(105 세포/웰 이하)하여 60-70%의 면적에서 세포가 증식될 때까지 배양했다. 이후 각 항체 단편을 배양되고 있는 배지에 5 μg/ml 농도로 처리한 다음, 37℃와 4℃에서 1시간 동안 정치하여 각 항체 단편과 c-Met의 상호작용을 유도하였다. 이후 파라포름알데히드를 처리한 고정 작업, 0.1% Triton X-100을 처리한 세포투과도 증진 작업을 수행했다. 이후 1% BSA 블로킹용액을 상온에서 1시간 처리 후, 각 후보항체 단편들의 세포 내 위치를 확인하기 위해 붉은 형광(Alexa-Fluor 647)물질이 표지된 마우스 항-HA 항체(Cell Signaling Technology)를 처리하고 상온에서 1시간 반응시켰다. 마지막으로 핵을 파란색으로 염색하기 위해 DAPI 염색을 수행한 후, 최종 세척 후 덮개를 잘 꺼내어 유리 슬라이드 위해 고정한 다음 공초점 레이저 주사현미경을 이용하여 관찰했다.
실험 결과, 항체단편을 처리한 후 4℃에서 정치한 경우, 음성대조군인 2D05 항체단편에서는 붉은 형광이 감지되지 않음을 확인했다. 나머지 3종의 후보항체단편에서는 세포막에서만 붉은 형광이 감지가 되며 세포질에서는 항체단편들이 감지되지 않음을 확인하였다(도 10). 항체단편을 처리한 후 37℃에서 정치한 경우에는 마찬가지로 음성대조군인 2D05 항체단편에서는 붉은형광이 감지되지 않음을 확인되었다. 하지만 4℃ 조건과는 다르게 37℃ 조건에서는 3종의 후보항체단편들이 세포막뿐만이 아니라 세포질에서도 위치되는 것이 확인이 되었으며, 그 정도를 볼 때, 1F12 항체 단편이 다른 항체단편들에 비해 세포 내로 잘 투과하는 양상을 보였다(도 10).
실시예 9: 항체 단편의 Met 신호전달경로 억제 확인
각 scFv 클론들이 c-Met 신호전달경로의 하부신호전달 물질에서의 인산화를 억제를 할 수 있는지 평가하기 위해서 웨스턴 블로팅법을 수행하였다. 실험세포주 U87MG 및 MKN45를 6웰 플레이트에서 배양을 하면서 각 항체단편과 함께 50 ng/ml의 간세포성장인자를 처리를 하였다. 이 후 RIPA 버퍼를 이용하여 각각의 단백질들을 준비한 후 10% 젤에서 SDS-PAGE 단백질전기영동을 수행하고, 전기영동 젤 상의 단백질을 전기장을 이용하여 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 후, c-Met 신호전달경로와 관계되는 AKT, ERK 등의 단백질들을 각각의 항체들로 탐지했다. 그 결과, 음성대조군인 2D05 항체 단편에 비해 세 종의 항체 단편 모두 p-AKT, p-ERT 등 c-Met 하부 신호전달 물질의 인산화를 억제함을 확인하였으며, 후보 항체 중 1F12 항체 단편이 c-Met 및 하부 신호 전달물질들의 인산화를 보다 잘 억제 할 수 있다는 것을 확인했다(도 11).
실시예 10: 신생혈관형성 억제 확인
HGF/c-Met 신호전달경로는 혈관내피세포성장인자와 많은 연관이 있으며, 혈관내피세포의 증식과 이동을 유도하여, 종양맥관형성을 촉진한다(Rosen EM et al.. Ciba Found Symp 212:215-226, 1997). 따라서, HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells) 모델 세포주에 간세포성장인자 유무 조건에서 각 클론들을 처리한 다음 신생혈관형성의 경향이 어떻게 변하는지를 관찰하였다. 마트리겔(BD science)을 저온에서 천천히 녹인 후, 96웰 플레이트에 50 μl 처리를 한 다음 37℃에서 굳힌다. EBM-2(basal medium) 배지에 20 ng/ml의 간세포성장인자를 처리하고 4,000개/웰의 세포가 들어가도록 분주를 한 다음 50 μg/ml의 농도로 각 항체단편들을 처리하였다. 6시간 동안 37℃ 이산화탄소배양기에서 혈관형성을 유도한 다음 광학현미경을 이용, 형성된 혈관을 촬영하였다.
실험 결과, 음성대조군 처리군(PBS, 2D05)에서는 간세포성장인자의 처리에 의해 HUVEC 세포주의 혈관생성이 촉진되었음을 확인하였고, 이러한 혈관생성 촉진 현상은 c-Met 결합능을 지닌 후보 항체들의 처리에 의해 효과적으로 억제됨을 시각적으로 확인하였다(도 12a). 또한 형성된 혈관 길이 또는 개수 등을 수치화함으로써 이러한 억제 효과가 음성대조군에 비해 유의적임을 확인하였다(도 12b).
실시예 11: 항원결정부 지도작성을 통한 각 클론들의 결합위치 확인
각 항체단편들의 c-Met에 대한 항원결정부지도작성은 펩타이드 어레이 기법을 이용하여 수행했다. c-Met의 세포외부위를 표현하는 아미노산 서열을 기반으로, 15개의 서로 다른 아미노산 펩타이드 조각이 총 224개가 박힌 셀룰로우스 막을 제작하였다(JPT Peptide Technologies, 도 13). 우선 TBS 세척단계에서 소수성 펩타이드의 침전을 피하기 위해 제작된 막을 1분 동안 메탄올에 담갔다. 그 후 TBS로 10분 동안 3번 세척 후 상온에서 3시간 동안 블로킹(5% 스킴 밀크) 하였다. 이후 블로킹 버퍼 내 1 μg/ml 농도로 희석된 각 항체단편을 처리한 다음 4℃에서 하룻밤 동안 정치하였다. 다음 날 TBST로 막을 1분씩 3번 세척하고, 1.0 mA/cm2의 전기장을 1시간 동안 가해주어서 펩타이드 막에 비공유결합으로 결합된 항체단편들을 PVDF 막으로 이동시켰다. 이를 3번 반복하여 수행을 하는데, 첫 번째와 두 번째 PVDF막에서는 비특이적인 신호(spot)들이 많이 나오기 때문에 세 번째 이동시킨 PVDF 막을 사용하였다. 세 번째 PVDF막을 TBST를 이용하여 10분씩 3번 세척하였다. 결합된 항체단편이 이동된 PVDF 막을 다시 3시간 동안 블로킹(5% 스킴 밀크) 한 후, 항-HA-HRP 항체를 상온에서 2시간 동안 처리하여 강하게 결합된 각 항체단편을 표지한 다음 TBST로 5분씩 3번 세척하였다. 이후 기질(Amersham ECL Prime Detection Reagent, GE healthcare)을 처리한 다음 필름에 노출 및 감광시켜서 항원결정부위를 확인하였다.
실험 결과, 1F12 항체단편의 경우 c-Met의 PSI 부위를 코딩하는 펩타이드 단편에 결합하는 것으로 확인이 되었으며, 2A01과 2C03 항체단편의 경우 c-Met의 Sema 부위를 코딩하는 펩타이드 단편에 결합하는 것으로 확인이 되었다(도 14). 이를 통해, 2A01 및 2C03의 경우 기존에 보고된 항체들의 항원결정부위(Sema domain)에 결합함으로써 간세포성장인자와의 경쟁을 통해 세포의 성장억제를 유도했을 것으로 추론할 수 있었다. 또한 흥미롭게도, 1F12 항체단편의 경우에는 기존에 잘 보고되지 않았던 새로운 항원결정부위(PSI domain)에 결합함으로써 다른 두 클론들보다 높은 결합능, 세포 성장억제, 세포내 신호전달 억제 등의 효과를 보였을 것으로 결론지었다.
실시예 12: 표면 플라스몬 공명을 이용한 각 클론들의 결합상수 결정
보다 정확한 결합능(결합상수) 검정을 위해 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 분석 방법을 통하여 c-Met에 대한 각 클론들의 결합능을 확인하였다. 각 항체단편들은 대장균 숙주에서 발현, 정제 후 PBS 용액으로 투석되었다. 분석에는 Biacore T100(GE healthcare) 장비가 이용되었으며, CM5 센서칩에 c-Met 단백질을 아민 결합반응을 통해서 dextran 매질에 고정시켰다. 각 항체단편들을 HBS-EP 용액에 희석되어 농도별 결합능(RU; Resonance Unit) 값이 분석되었으며(도 15), 이 값들을 토대로 BIA-evaluation 프로그램을 통해 동역학(kinetics) 분석이 수행되었다. 그 결과, 1F12 및 2A01 클론의 경우 6-9 x 10-8 M 수준의 KD 값이 측정되었으며, 2C03의 경우 10-7 M 수준의 KD 값이 확인되었다(표 4). 항체 형태가 단일사슬 항체단편인 것을 감안하면, 특히 1F12 및 2A01 클론의 해당 결합능은 꽤 높은 수준인 것을 알 수 있었으며, 이러한 결합능이 각 클론들의 세포성장, 신호전달 억제 등 c-Met의 기능 억제에도 중요한 역할을 했다는 것을 검정하였다.
표면 플라스몬 공명을 통해 측정된 Ka와 Kb를 기반으로 결합상수(Kd)를 측정한 결과
- KD(M) Ka(M-1S-1) Kd(S-1)
1F12 9.33 x 10-8 5.12 x 104 4.78 x 10-4
2A01 6.60 x 10-8 2.32 x 106 1.53 x 10-1
2C03 2.39 x 10-7 7.76 x 105 1.86 x 10-1
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Samsung Medical Center <120> scFv cross-reactive to human and mouse c-Met and uses thereof <130> PN130293 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F12 heavy chain CDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F12 heavy chain CDR2 <400> 2 Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F12 heavy chain CDR3 <400> 3 Ala Lys Ala Ser Arg Ser Cys Gln Arg Pro Ala Cys Ser Tyr Ala Asn 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F12 light chain CDR1 <400> 4 Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F12 light chain CDR2 <400> 5 Tyr Asn Asn 1 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F12 light chain CDR3 <400> 6 Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A01 heavy chain CDR1 <400> 7 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A01 heavy chain CDR2 <400> 8 Ile Ser His Gly Gly Ser Ser Ile 1 5 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A01 heavy chain CDR3 <400> 9 Ala Lys Asp Ala Tyr Pro Ile Arg Gln Glu Thr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A01 light chain CDR1 <400> 10 Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asp 1 5 <210> 11 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A01 light chain CDR2 <400> 11 Pro Asp Ser 1 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A01 light chain CDR3 <400> 12 Ala Ser Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2CO3 heavy chain CDR1 <400> 13 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2CO3 heavy chain CDR2 <400> 14 Ile Ser Tyr Asp Ser Gly Ser Ile 1 5 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2CO3 heavy chain CDR3 <400> 15 Ala Lys Ala Ala Arg Ser Cys Arg Asn Trp Ser Cys Ser Tyr Ala Asn 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2CO3 light chain CDR1 <400> 16 Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr 1 5 <210> 17 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2CO3 light chain CDR2 <400> 17 Ser Asp Ser 1 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2CO3 light chain CDR3 <400> 18 Gly Ser Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 19 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of synthetic 1F12 scFv A/a sequence <400> 19 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Ser Arg Ser Cys Gln Arg Pro Ala Cys Ser Tyr Ala Asn 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 20 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of synthetic 1F12 scFv A/a sequence <400> 20 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 21 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of synthetic 2A01 scFv A/a sequence <400> 21 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Ser His Gly Gly Ser Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ala Tyr Pro Ile Arg Gln Glu Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of synthetic 2A01 scFv A/a sequence <400> 22 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Pro Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 23 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of synthetic 2C03 scFv A/a sequence <400> 23 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Ala Arg Ser Cys Arg Asn Trp Ser Cys Ser Tyr Ala Asn 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 24 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of synthetic 2C03 scFv A/a sequence <400> 24 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence(G4S)3 in all of the scFv clones A/a sequence <400> 25 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 26 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of synthetic 1F12 scFv <400> 26 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctcttata gtggtggtag tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagctagt 300 cgttcttgtc agcggcctgc ttgttcttat gctaatggta tggacgtctg gggccagggt 360 acactggtca ccgtgagctc a 381 <210> 27 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of synthetic 1F12 scFv <400> 27 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc aataattatg tcacctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tataataatc atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt tcttgggatt atagcctgag tgcttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 28 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of synthetic 2A01 scFv <400> 28 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacaga ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccgggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatgg atctctcatg gtggtagtag tatatcttac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagatgct 300 tatcctattc ggcaggagac tttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tca 363 <210> 29 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of synthetic 2A01 scFv <400> 29 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc aataatgatg tctcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat cctgatagtc agcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgct tcttgggatt ctagcctgag tggctatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 30 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of synthetic 2C03 scFv <400> 30 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctcttatg atagtggtag tatatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagctgct 300 cgtagttgtc ggaattggtc gtgttcttat gctaatggta tggacgtctg gggccagggt 360 acactggtca ccgtgagctc a 381 <210> 31 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of synthetic 2C03 scFv <400> 31 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaattatg tctcctggta ccggcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tctgatagta atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt tcttgggatg atagcctgag cggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 32 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence(G4S)3 in all of the scFv clones <400> 32 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggatcc ggcggtggcg gatcg 45

Claims (16)

  1. 다음을 포함하는 인간 c-Met 및 마우스 c-Met에 교차결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    (a) 다음의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열목록 제1서열의 CDRH1, 서열목록 제2서열의 CDRH2 및 서열목록 제3서열의 CDRH3; 그리고
    (b) 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 서열목록 제4서열의 CDRL1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제6서열의 CDRL3.
  2. 다음을 포함하는 인간 c-Met 및 마우스 c-Met에 교차결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    (a) 다음의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열목록 제7서열의 CDRH1, 서열목록 제8서열의 CDRH2 및 서열목록 제9서열의 CDRH3; 그리고
    (b) 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 서열목록 제10서열의 CDRL1, 서열목록 제11서열의 CDRL2 및 서열목록 제12서열의 CDRL3.
  3. 다음을 포함하는 인간 c-Met 및 마우스 c-Met에 교차결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    (a) 다음의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열목록 제13서열의 CDRH1, 서열목록 제14서열의 CDRH2 및 서열목록 제15서열의 CDRH3; 그리고
    (b) 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 서열목록 제16서열의 CDRL1, 서열목록 제17서열의 CDRL2 및 서열목록 제18서열의 CDRL3.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제19서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열목록 제20서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제21서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제 2 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열목록 제22서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제 3 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제23서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제 3 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열목록 제24서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 삭제
  11. 서열목록 제19서열, 서열목록 제21서열 또는 서열목록 제23서열의 아미노산 서열을 포함하는 인간 c-Met 및 마우스 c-Met에 교차결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자.
  12. 서열목록 제20서열, 서열목록 제22서열 또는 서열목록 제24서열의 아미노산 서열을 포함하는 인간 c-Met 및 마우스 c-Met에 교차결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  14. 제 13 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  15. (a) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 인간 c-Met 및 마우스 c-Met에 교차결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 자궁암, 비인두암, 후두암, 결장암, 난소암, 직장암, 대장암, 질암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 요도암, 전립선암, 기관지암, 방광암, 신장암 또는 골수암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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