KR102057056B1

KR102057056B1 - 다능성 세포

Info

Publication number: KR102057056B1
Application number: KR1020187005114A
Authority: KR
Inventors: 알리레자 레자니아
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2008-04-24
Filing date: 2009-04-22
Publication date: 2019-12-18
Also published as: KR101832902B1; EP2283113A2; EP2283113B1; MX2010011739A; BRPI0911599A2; PL2283113T3; ES2663421T3; EP3327114B1; ES2633455T3; USRE43876E1; KR101690773B1; KR20100134127A; AU2009239442A1; EP2669366A3; CN102083965B; RU2010147817A; WO2009132063A3; JP5763524B2; WO2009132063A2; CN102083965A

Abstract

본 발명은 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상의 배양에서 용이하게 증가될 수 있으며, 영양세포주를 필요로 하지 않는 다능성 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 배아 줄기 세포로부터 다능성 세포주를 유도하는 방법을 제공한다.

Description

다능성 세포{PLURIPOTENT CELLS}

본 발명은 조직 배양 폴리스티렌 상에서의 배양에서 용이하게 증가될 수 있으며, 영양세포주 (feeder cell line)를 필요로 하지 않는 다능성 줄기 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 배아 줄기 세포로부터 다능성 줄기 세포주를 유도하는 방법을 제공한다.

제 1형 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포 대체 치료법의 발전으로, 생착 (engraftment)에 적합한 인슐린 생산 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되어 왔다. 한 가지 접근법은 예를 들어, 배아 줄기 세포와 같은 다능성 줄기 세포로부터 기능성 β 세포를 생성하는 것이다.

척추동물 배아 발생에서, 다능성 세포는 낭배형성 (gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽 (three germ layers) (외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽 (definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 다수의 마커, 예컨대 HNF-3 베타, GATA-4, Mixl1, CXCR4 및 SOX-17을 발현한다.

췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스 (homeobox) 유전자, PDX-1을 발현한다. Pdx-1이 없는 경우, 췌장은 복측아 (ventral bud) 및 배측아 (dorsal bud)의 형성을 능가하여 발현하지 못한다. 따라서, PDX-1 발현은 췌장 기관 형성에 있어서 중요한 단계가 된다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.

췌도 세포의 특징을 지닌 세포가 마우스의 배아 세포로부터 유래된 것으로 보고되었다. 예를 들어, 루멜스키(Lumelsky) 등 (문헌[Science 292:1389, 2001])은 마우스 배아 줄기 세포가 췌도와 유사한 인슐린 분비 구조로 분화한 것을 보고하였다. 소리아(Soria) 등 (문헌[Diabetes 49:157, 2000])은 마우스 배아 줄기 세포로부터 유래된 인슐린 분비 세포가 스트렙토조토신 유도된 당뇨 마우스에서 혈당을 정상화시킴을 보고하였다.

한 예에서, 호리(Hori) 등 (문헌[PNAS 99: 16105, 2002])은 마우스 배아 줄기 세포를 포스포이노시티드 3-키나제의 억제제(LY294002)로 처리하여 β 세포와 닮은 세포를 생성하였음을 개시하였다.

다른 예에서는, 블리츠주크(Blyszczuk) 등 (문헌[PNAS 100:998, 2003])은 구성적으로 Pax4를 발현하는 마우스 배아 줄기 세포로부터 인슐린 생산 세포를 생성하는 것을 보고하였다.

미칼레프(Micallef) 등은 PDX-1 양성 췌장 내배엽이 형성되게 하는 배아 줄기 세포의 책무를 레틴산이 조절할 수 있음을 보고하였다. 레틴산은 배아에서 낭배형성의 마지막에 해당하는 기간 동안 배아 줄기 세포 분화의 4일째에 배양물에 첨가될 때 PDX-1 발현을 유도하는 데 가장 효과적이다 (문헌[Diabetes 54:301, 2005]).

미야자키(Miyazaki) 등은 PDX-1을 과다 발현하는 마우스 배아 줄기 세포주를 보고하였다. 그들의 결과는 외인성 PDX-1 발현이 생성된 분화된 세포에서 인슐린, 소마토스타틴, 글루코키나제, 뉴로제닌3, P48, Pax6, 및 HNF6 유전자의 발현을 명확히 향상시켰음을 보여준다 (문헌[Diabetes 53: 1030, 2004]).

스코우디(Skoudy) 등은 액티빈-A (TGFβ 수퍼패밀리의 구성원)가 마우스 배아 줄기 세포에서 외분비 췌장 유전자(p48 및 아밀라아제) 및 내분비 유전자(PDX-1, 인슐린 및 글루카곤)의 발현을 상향조절함을 보고하고 있다. 최대 효과는 1 nM 액티빈-A를 이용할 때 관찰되었다. 그들은 또한 인슐린 및 PDX-1 mRNA의 발현 수준이 레틴산에 의해 영향을 받지 않지만, 3 nM FGF-7 처리가 Pdx1의 전사체의 수준을 증가시킴을 관찰하였다 (문헌[Biochem. J. 379: 749, 2004]).

쉬라키(Shiraki) 등은 배아 줄기 세포의 PDX-1 양성 세포로의 분화를 특이적으로 향상시키는 성장 인자들의 효과를 연구하였다. 그들은 TGFβ2가 재현성있게 더 높은 비율의 PDX-1 양성 세포를 생성함을 관찰하였다 (문헌[Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16]).

고든(Gordon) 등은 혈청의 부재 하에서 그리고 Wnt 시그널링의 억제제와 함께 액티빈의 존재 하에서 마우스 배아 줄기 세포로부터의 브라큐리(brachyury)+/HNF-3베타+내배엽 세포의 유도를 증명하였다 (미국 특허 출원 공개 제2006/0003446A1호).

고든 등 (문헌[PNAS, Vol 103, page 16806, 2006])은 "Wnt 및 TGF-베타/노달(nodal)/액티빈 시그널링은 전방 원시선 (primitive streak)의 생성에 동시에 필요하였다"라고 진술한다.

그러나, 배아 줄기 세포 발생의 마우스 모델은 예를 들어, 인간과 같은 고등 포유류에서의 발생 프로그램을 정확하게 모방하지 않을 수 있다.

톰슨(Thomson) 등은 인간 배반포로부터 배아 줄기 세포를 분리하였다 (문헌[Science 282:114, 1998]). 동시에, 기어하트(Gearhart)와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 배(human embryonic germ, hEG) 세포주를 유도하였다 (문헌[Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]). 백혈병 억제 인자(Leukemia Inhibitory Factor, LIF)와 함께 배양함으로써 간단하게 분화를 방지할 수 있는 마우스 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건 하에서 유지되어야 한다 (미국 특허 제6,200,806호; 국제특허 공개 WO 99/20741호; 국제특허 공개 WO 01/51616호).

드'아무르 (D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다 (문헌[KA et al. 2005]). 마우스의 신장 피막하에 이들 세포를 이식하면 일부 내배엽 기관의 특징을 가진 보다 성숙한 세포로의 분화가 야기되었다. 인간 배아 줄기 세포 유래의 완성 내배엽 세포는 FGF-10의 첨가 후에 PDX-1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다 (미국 특허 출원 공개 제2005/0266554A1호).

드'아무르 등 (문헌[Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)])은 "우리는 인간 배아 줄기 (hES) 세포를 췌장 호르몬 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린(ghrelin)을 합성할 수 있는 내분비 세포로 전환시키는 분화 과정을 개발하였다. 이 과정은 도중에 완성 내배엽, 창자관 내배엽, 췌장 내배엽, 및 내분비 전구체를 닮은 단계들을 통해 세포를 내분비 호르몬 발현 세포가 되도록 함으로써 생체내 (in vivo) 췌장 기관형성을 모방한다"고 밝혔다.

다른 예에서, 피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌도 세포를 생성하는 시스템을 보고하였다 (미국 특허 출원 공개 제2006/0040387A1호). 이 경우에, 분화 경로를 세 단계로 나누었다. 인간 배아 줄기 세포를 먼저 n-부티레이트와 액티빈-A의 조합물을 이용하여 내배엽으로 분화시켰다. 이어서, 세포를 EGF 또는 베타셀룰린과 조합된 노긴(Noggin)과 같은 TGFβ 길항제와 함께 배양하여, PDX-1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.

일 예에서, 벤베니스트리(Benvenistry) 등은 "우리는 PDX-1의 과다 발현이 췌장에 풍부한 유전자의 발현을 향상시켰으며 인슐린 발현의 유도는 생체내에서만 존재하는 추가의 시그널을 필요로 할 수 있다고 결론내린다"라고 밝혔다 (문헌[Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:19231930]).

인간 배아 줄기 세포를 배양하는 현행의 방법은 세포외 기질 단백질 또는 섬유아세포 영양세포층 또는 외인성 성장 인자, 이를 테면 bFGF의 첨가를 필요로 한다.

일 예에서, 천(Cheon) 등 (문헌[BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105. 046870, October 19, 2005])은 배아 줄기 세포 자가 재생을 일으킬 수 있는 상이한 성장 인자로 보충된 비조절된 혈청 대체 (serum replacement, SR) 배지에서 배아 줄기 세포가 유지되는 영양세포가 없는 무혈청 배양 시스템을 개시하였다.

다른 예에서, 레벤스타인(Levenstein) 등 (문헌[Stem Cells 24: 568-574, 2006])은 bFGF로 보충된 배지를 이용하여, 섬유아세포 또는 조절된 배지의 부재 하에서 인간 배아 줄기 세포의 장기 배양을 위한 방법을 개시하였다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050148070호는 혈청 없이 그리고 섬유아세포 영양 세포 없이 규명된 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시하였으며, 이 방법은 알부민, 아미노산, 비타민, 미네랄, 적어도 하나의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 적어도 하나의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 함유한 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양 배지는 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없으며 적어도 약 100 ng/mL의, 섬유아세포 성장 인자 시그널링 수용체를 활성화시킬 수 있는 섬유아세포 성장 인자를 함유하며, 여기서 성장 인자는 단지 섬유아세포 영양세포층 이외의 공급원으로부터 공급되며, 배지는 영양 세포 또는 조절된 배지 없이 미분화된 상태로 줄기 세포의 증식을 지지한다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050233446호는 미분화 영장류 원시 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 배양하는 데 유용한 규명된 배지를 개시한다. 용액에서, 배지는 배양되는 줄기 세포와 비교할 때 사실상 등장성이다. 주어진 배양물에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 사실상 미분화된 성장을 지지하는 데 필요한 양의 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각을 포함한다.

다른 예에서, 미국 특허 제6800480호는 "일 실시형태에서, 사실상 미분화된 상태의 영장류-유래 원시 줄기 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 배지가 제공되며 이 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 저 삼투압, 저 내독소 기본 배지를 포함한다. 기본 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 영양 혈청과, 영양 세포 및 영양 세포로부터 유래된 세포외 기질 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 기질과 조합된다. 이 배지는 추가로 비필수 아미노산, 산화방지제, 및 뉴클레오시드와 피루베이트염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 성장 인자를 포함한다"고 진술하였다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050244962호는 "일 태양에서 본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없는 (바람직하게는 또한 본질적으로 임의의 동물 혈청이 없는) 배지에서 그리고 단지 섬유아세포 영양세포층 이외의 공급원으로부터 공급된 섬유아세포 성장 인자의 존재 하에서 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태에서, 이전에는 줄기 세포 배양을 지속하기 위해 필요했던 섬유아세포 영양세포층이 충분한 섬유아세포 성장 인자의 첨가에 의해 불필요해지게 된다"고 밝혔다.

추가의 예에서, 국제특허 공개 WO2005065354호는 본질적으로 영양세포가 없는 그리고 무혈청인 규명된 등장성 배양 배지를 개시하였으며, 이 배지는 a. 기본 배지; b. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 bFGF; c. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005086845호는 미분화 줄기 세포의 유지 방법을 개시하였으며, 상기 방법은 원하는 결과를 성취하기에 충분한 시간 동안 미분화 상태의 세포를 유지하기에 충분한 양의 형질전환 성장 인자-베타 (transforming growth factor-beta, TGFβ) 패밀리 단백질의 구성원, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 패밀리 단백질의 구성원, 또는 니코틴아미드 (NIC)에 줄기 세포를 노출시키는 것을 포함한다.

또한, 인간 배아 세포로부터의 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 또는 췌장 호르몬 분비 세포의 형성에는 인간 배아 줄기 세포의 유전자 조작이 필요할 수 있다. 통상적 기법, 예컨대 리포펙타민 또는 전기천공법 (electroporation)을 사용하는 인간 배아 줄기 세포의 트랜스펙션 (transfection)은 불충분하다.

국제특허 공개 WO2007027157호는 (a) 배아 줄기 (ES) 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 배아 줄기 세포로부터 전구 세포주를 확립하는 단계를 포함하는 방법을 개시하였으며, 여기서 전구 세포주는 이의 자가 재생능을 기준으로 하여 선택된다. 바람직하게, 이 방법에서, 이들의 자가 재생 불능을 기준으로 체세포가 선택적으로 제거된다. 바람직하게는, 전구 세포주는 공동-배양물의 부재 하에, 바람직하게는 영양세포의 부재 하에 유도되거나 확립되며, 바람직하게는 배아 줄기 세포가 선택적으로 제거된다. 임의로, 이 방법은 (d) 전구 세포주로부터 분화된 세포를 유도하는 단계를 포함한다.

따라서, 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 또는 췌장 호르몬 분비 세포로의 분화능을 보유하면서, 현재의 임상적 필요성에 대처하게 증가될 수 있는 다능성 줄기 세포주를 확립하기 위한 조건을 개발하는 것이 여전히 상당히 필요하다.

본 발명은 인간 배아 줄기 세포의 특징을 가지는 세포 집단을 제공하며, 이는 낮은 혈청의 배양 중에 용이하게 증가될 수 있고, 영양세포주 또는 복합 기질 단백질의 코팅을 필요로 하지 않고, 단일 세포 현탁액으로 계대될 수 있고, 매우 높은 효능으로 트랜스펙션될 수 있으며, 저산소 (hypoxic) 조건 하에서 배양될 수 있다. 이 독특한 속성을 가지는 조합물은 본 발명에서 기술된 세포를 종래 기술과 차별화시킨다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명은

a. 세포를 수득하는 단계, 및

b. 세포를 배양하기 전에 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서 저산소 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 다능성 마커를 발현하는 세포를 포함하는 세포 집단의 유도 방법을 제공한다.

세포는 인간 배아 줄기 세포이거나, 이들은 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 인간 배아 줄기 세포는 세포를 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서 배양하기 전에 정상산소 (normoxic) 조건 하에 배양될 수 있다. 대안적으로, 인간 배아 줄기 세포는 저산소 조건에서 배양될 수 있다.

인간 배아 줄기 세포는 세포를 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않고, Rho 키나제 억제제로 처리된 조직 배양 기재 상에서 배양하기 전에 정상산소 조건 하에 배양될 수 있다. 대안적으로, 인간 배아 줄기 세포는 저산소 조건에서 배양될 수 있으며, Rho 키나제 억제제로 처리될 수 있다.

완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 세포를 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서 배양하기 전에, 정상산소 조건에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 저산소 조건에서 배양될 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명은

a. 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계,

b. 인간 배아 줄기 세포를 완성 내배엽 세포의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계 및

c. 세포를 제거한 후, 세포를 배양하기 전에, 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서 저산소 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 다능성 마커를 발현하는 세포를 포함하는 세포 집단의 유도방법을 제공한다.

세포는 혈청, 액티빈-A 및 Wnt 리간드를 함유하는 배지 중에, 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서, 저산소 조건 하에 배양될 수 있다. 대안적으로, 세포는 혈청, 액티빈-A, Wnt 리간드 및 IGF-1을 함유하는 배지 중에, 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서, 저산소 조건 하에 배양될 수 있다.

세포는 혈청, Rho 키나제 억제제, 액티빈-A 및 Wnt 리간드를 함유하는 배지 중에, 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서, 저산소 조건 하에 배양될 수 있다. 대안적으로, 세포는 혈청, Rho 키나제 억제제, 액티빈-A, Wnt 리간드 및 IGF-1을 함유하는 배지 중에, 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서, 저산소 조건 하에 배양될 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명은

a. 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계, 및

b. 세포를 제거한 후, 이들을 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서 저산소 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 다능성 마커를 발현하는 세포를 포함하는 세포 집단의 유도방법을 제공한다.

세포는 혈청, Rho 키나제 억제제, 액티빈-A 및 Wnt 리간드를 함유하는 배지 중에, 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서, 저산소 조건 하에 배양될 수 있다. 대안적으로, 세포는 혈청, Rho 키나제 억제제, 액티빈-A, Wnt 리간드 및 IGF-1을 함유하는 배지 중에, 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서, 저산소 조건 하에 배양될 수 있다. 본 발명의 방법으로 유래되는 다능성 마커를 발현하는 세포는 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에, 저산소 조건 하에서의 배양에서 증가할 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명은 세포를 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서 저산소 조건 하에 배양시키는 단계를 포함하는, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 증가방법을 제공한다. 일 실시형태에 있어서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 본 발명의 방법에 의해 형성된 다능성 세포로부터 유래된다.

세포는 혈청, 액티빈-A, Wnt 리간드 및 GSK-3B 억제제를 함유하는 배지 중에, 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서, 저산소 조건 하에 배양될 수 있다.

<도 1>
도 1은 4일 동안의 낮은 혈청 +액티빈-A + WNT-3A로의 처리 후에, 완성 내배엽으로 분화되는 54 계대의 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터의 세포에서의 CXCR4 (CD 184, Y 축) 및 CD9 (X 축)의 발현을 나타낸 것이다.
<도 2>
도 2는 실시예 5에 약술된 완성 내배엽 분화 프로토콜의 4일 및 6일째의 54 계대의 인간 배아 줄기 세포주 H9으로부터의 세포의 실시간 (real-time) PCR 분석을 나타낸 것이다. 패널 a)는 AFP, Bry, CXCR4, GSC 및 SOX-7의 발현을 도시한 것이다. 패널 b)는 SOX-17, GATA-4 및 HNF-3 베타의 발현을 도시한 것이다.
<도 3>
도 3은 본 발명의 방법에 따라 배아 줄기 세포로부터 EXPRES 세포를 유도하는 데 사용된 분리 프로토콜을 나타낸 것이다.
<도 4>
도 4는 2% FBS + DMEM-F12 + 100 ng/mL의 액티빈 (Activin)-A (패널 a) 또는 2% FBS + DMEM-F12 + 100 ng/mL의 액티빈-A + 20 ng/mL의 WNT-3A (패널 b) 중에서 배양된 11일째의 P0의 증가된 EXPRES 세포의 형태를 나타낸 것이다. 패널 c는 3 계대의 EXPRES 세포의 형태를 나타낸 것이다.
<도 5>
도 5는 3회의 계대에 대하여 2-5% FBS + DMEM-F12 + 100 ng/mL의 액티빈-A + 20 ng/mL의 WNT-3A 중에 배양된 증가된 EXPRES 세포의 실시간 PCR 분석을 나타낸 것이다. 패널 a)는 AFP, Bry, CXCR4, GSC 및 SOX-7의 발현을 도시한 것이다. 패널 b)는 SOX-17, GATA-4 및 HNF-3 베타의 발현을 도시한 것이다.
<도 6>
도 6은 EXPRES 세포에서 유전자 발현 상의 Wnt-3A의 첨가 효과를 나타낸 것이다. 패널 a)는 SOX-17, GATA-4 및 HNF-3 베타의 실시간 PCR 표현을 도시한 것이다. 패널 b)는 AFP, Bry, CXCR4, GSC 및 SOX-7의 실시간 PCR 표현을 도시한 것이다.
<도 7>
도 7은 EXPRES 세포에서 유전자 발현 상의 IGF-1, Wnt-3A 및 액티빈-A의 효과를 나타낸 것이다. 패널 a)는 SOX-17, GATA-4, HNF-3 베타, Bry, CXCR4 및 GSC의 실시간 PCR 표현을 도시한 것이다. 패널 b는 SOX-7 및 AFP의 실시간 PCR 표현을 도시한 것이다. 패널 c)는 OCT-4의 실시간 PCR 표현을 도시한 것이다.
<도 8>
도 8은 a) 2% FBS +DMEM-F12 + 100 ng/mL의 AA + 20 ng/mL의 WNT-3A, b) 2% FBS + DMEMF12 + 100 ng/mL의 AA, c) 2% FBS + DMEM-F12 + 50 ng/mL의 IGF-I에서 배양된 54 계대의 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터 유래된, 증가된 EXPRES 세포의 형태를 나타낸 것이다.
<도 9>
도 9는 저산소 조건 하에 조직 배양 폴리스티렌 상에서 배양된 EXPRES 01 및 02 세포의 증가 잠재력을 나타낸 것이다. EXPRES 01을 2% FBS + DM-F12 + 100 ng/mL의 AA + 20 ng/mL의 WNT-3A + 50 ng/mL의 IGF-I에서 배양하고, EXPRES 02 세포를 2% FBS + DM-F12 + 100 ng/mL의 AA + 20 ng/mL의 WNT-3A에서 배양하였다.
<도 10>
도 10은 DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT3A + 50 ng/mL의 IGF-I 중에서 TCPS (조직 배양 폴리스티렌) 상에 미분화 ES 세포의 단일 세포 현탁액으로부터 유래된 EXPRES 세포의 형태를 나타낸 것이다.
<도 11>
도 11은 24 계대 세포에서 EXPRES 01 세포의 FACS에 의해 결정된 단백질 발현을 나타낸 것이다. 패널 a)는 E-카드헤린의 발현 수준을 나타낸 것이며, 패널 b)는 CXCR4의 발현 수준을 나타낸 것이고, 패널 c)는 CD9의 발현 수준을 나타낸 것이며, 패널 d)는 CD117의 발현 수준을 나타낸 것이고, 패널 e)는 CD30의 발현 수준을 나타낸 것이며, 패널 f)는 LIF 수용체의 발현 수준을 나타낸 것이고, 패널 g)는 TRA 1-60의 발현 수준을 나타낸 것이며, 패널 h)는 TRA 1-81의 발현 수준을 나타낸 것이고, 패널 i)는 SSEA-1의 발현 수준을 나타낸 것이며, 패널 j)는 SSEA-3의 발현 수준을 나타낸 것이고, 패널 k)는 SSEA-4의 발현 수준을 나타낸 것이며, 패널 l)은 CD56의 발현 수준을 나타낸 것이다.
<도 12>
도 12는 21 계대 세포에서 EXPRES 02 세포의 FACS에 의해 결정된 단백질 발현을 나타낸 것이다. 패널 a)는 E-카드헤린의 발현 수준을 나타낸 것이며, 패널 b)는 CXCR4의 발현 수준을 나타낸 것이고, 패널 c)는 CD9의 발현 수준을 나타낸 것이며, 패널 d)는 CD117의 발현 수준을 나타낸 것이고, 패널 e)는 CD30의 발현 수준을 나타낸 것이며, 패널 f)는 LIF 수용체의 발현 수준을 나타낸 것이고, 패널 g)는 TRA 1-60의 발현 수준을 나타낸 것이며, 패널 h)는 TRA 1-81의 발현 수준을 나타낸 것이고, 패널 i)는 SSEA-1의 발현 수준을 나타낸 것이며, 패널 j)는 SSEA-3의 발현 수준을 나타낸 것이고, 패널 k)는 SSEA-4의 발현 수준을 나타낸 것이며, 패널 l)은 CD56의 발현 수준을 나타낸 것이다.
<도 13>
도 13은 2% FBS + DMEM-F12 + 100 ng/mL의 AA + 20 ng/mL의 WNT-3A + 50 ng/mL의 IGF-I에서 배양된 10 계대의 EXPRES 01의 면역 형광 이미지를 나타낸 것이다. 패널 a) 패널 b에 대한 DAPI 이미지, 패널 b) 나노그 (Nanog), 패널 c) DAPI (청색) 및 Oct-4 (녹색) 공동-염색, 패널 d) 패널 e에 대한 DAPI 이미지, 패널 e) SOX-2 및 패널 f) DAPI (청색) 및 HNF-3 베타 (녹색) 공동-염색.
<도 14>
도 14는 2% FBS + DMEM-F12 + 100 ng/mL의 AA + 20 ng/mL의 WNT-3A에서 배양된 9 계대의 EXPRES 02의 면역 형광 이미지를 나타낸 것이다. 패널 a) 패널 b에 대한 DAPI 이미지, 패널 b) HNf3B, 패널 c) 패널 d에 대한 DAPI 이미지, 패널 d) OCT-4, 패널 e) 패널 f에 대한 DAPI 이미지, 패널 f) SOX-2, 패널 g) 패널 h에 대한 DAPI 이미지, 패널 h) 나노그.
<도 15>
도 15는 EXPRES 01 세포, EXPRES 02 세포, H9 세포로부터 유래된 EB, MEF-CM 중에서 MATRIGEL 상에서 배양된 SA002 및 MEFCM 중에서 MATRIGEL 상에 배양된 미분화 H9 세포에 대하여 실시간 PCR에 의해 결정된 유전자 발현을 나타낸 것이다. 모든 발현 수준을 미분화 H9 세포로 정상화시켰다. 패널 a)는 SOX-1 발현을 나타내며, 패널 b)는 FOXD3, MYOD1, POU5F1 및 ZFP42 발현을 나타내고, 패널 c)는 ABCG2, 커넥신 (Connexin) 43, 커넥신 45 및 사이토케라틴 15 발현을 나타내며, 패널 d)는 네스틴 (nestin), SOX-2, UTF1 및 비멘틴 (vimentin)을 나타내고, 패널 e)는 GATA-2, 브라큐리, TERT 및 투불린 (tubulin)-베타 III 발현을 나타내며, 패널 f)는 CFC1 및 GATA-4 발현을 나타내고, 패널 g)는 AFP 및 FOXA2 발현을 나타내며, 패널 h)는 IPF1A 및 MSX1 발현을 나타낸다.
<도 16>
도 16은 a) 조직 배양 폴리스티렌 상에서 성장 배지 중에 배양한 다음, 2일 동안 DMEM-F12 + 0.5% FBS + 100 ng/mL의 액티빈-A 및 20 ng/mL의 WNT3A로 바꾼 다음, DMEM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL의 액티빈-A에서 추가 2일 동안 배양된 EXPRES 01 세포 5 계대 세포, b) 배양 배지 중에서 조직 배양 폴리스티렌 상에 배양한 다음, 2일 동안 DMEM-F12 + 0.5% FBS + 100 ng/mL의 액티빈-A 및 20 ng/mL의 WNT3A로 바꾼 다음, DMEM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL의 액티빈-A에서 추가 2일 동안 배양된 EXPRES 02 세포 4 계대 세포의 CXCR4 (Y-축) 및 CD9 (x-축)의 FACS에 의해 결정된 발현을 나타낸 것이다.
<도 17>
도 17은 저혈청 + AA + WNT3a로 처리된 a) EXPRES 01 세포 및 b) EXPRES 02 세포에서의 실시간 PCR에 의해 결정된 유전자 발현을 나타낸 것이다.
<도 18>
도 18은 2% FBS + DMEM-F12 + 100 ng/mL의 AA + 20 ng/mL의 WNT-3A + 50 ng/mL의 IGF-I에서 배양된 다음, DMEM-F12 + 0.5% FBS + 100 ng/mL의 액티빈-A 및 20 ng/mL의 WNT3A로 2일 동안 바꾼 다음, DMEM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL의 액티빈-A에서 추가 2일 동안 배양된 5 계대의 EXPRES 01 세포의 면역 형광 이미지를 나타낸 것이다. 패널 a) 패널 b에 대한 DAPI 이미지, 패널 b) GATA-4, 패널 c) 패널 d에 대한 DAPI 이미지, 패널 d) SOX-17, 패널 e) 패널 f에 대한 DAPI 이미지, 패널 f) HNF-3 베타, 패널 g) 패널 h에 대한 DAPI 이미지 및 패널 h) OCT-4.
<도 19>
도 19는 2% FBS + DMEM-F12 + 100 ng/mL의 AA + 20 ng/mL의 WNT-3A에서 배양된 다음 DMEM-F12 + 0.5% FBS + 100 ng/mL의 액티빈-A 및 20 ng/mL의 WNT3A로 2일 동안 바꾼 다음 DMEM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL의 액티빈-A에서 추가 2일 동안 배양된 4 계대에서의 EXPRES 02 세포의 면역 형광 이미지를 나타낸 것이다. 패널 a) 패널 b에 대한 DAPI 이미지, 패널 b) GATA-4, 패널 c) 패널 d에 대한 DAPI 이미지, 패널 d) SOX-17, 패널 e) 패널 f에 대한 DAPI 이미지, 패널 f) HNF-3 베타, 패널 g) 패널 h에 대한 DAPI 이미지 및 패널 h) OCT-4.
<도 20>
도 20은 조직 배양 폴리스티렌 상에서, 성장 배지에서 배양된 다음, DMEM-F12 + 0.5% FBS + 100 ng/mL의 액티빈-A + 100 nM GSK-3B 억제제 IX 및 20 ng/mL의WNT3A로 4일 동안 바꾸어 배양된 a) 19 계대의 EXPRES 01 세포 및 b) 14 계대의 EXPRES 02 세포에 대한 CXCR4 (Y-축) 및 CD9 (x-축)의 FACS로 결정된 단백질 발현을 나타낸 것이다.
<도 21>
도 21은 2% FBS + DMEM-F12 + 100 ng/mL의 AA + 20 ng/mL의 WNT-3A + 50 ng/mL의 IGF-I에서 배양된 19 계대의 EXPRES 01 세포 및 2% FBS + DMEM-F12 + 100 ng/mL의 AA + 20 ng/mL의 WNT-3A에서 배양된 다음, DMEM-F12 + 0.5% FBS + 100 ng/mL의 액티빈-A + 100 nM GSK-3B 억제제 IX 및 20 ng/mL의 WNT3A로 5일 동안 바꾸어 배양된 14 계대의 EXPRES 02 세포의 면역 형광 이미지를 나타낸 것이다. 패널 a) 패널 b에 대한 DAPI 이미지, 패널 b) HNF-3 베타, 패널 c) 패널 d에 대한 DAPI 이미지, 패널 d) GATA-4, 패널 e) 패널 f에 대한 DAPI 이미지, 패널 f) SOX-17, 패널 g) 패널 h에 대한 DAPI 이미지, 패널 h) HNF-3 베타, 패널 i) 패널 j에 대한 DAPI 이미지, 패널 j) GATA-4, 패널 k) 패널 l에 대한 DAPI 이미지, 패널 l) SOX-17.
<도 22>
도 22는 저혈청 + AA + WNT3a + GSK-3B IX 억제제로 5일 동안 처리된 a) EXPRES 01 및 EXPRES 02 세포에 대한 실시간 PCR로 결정된 유전자 발현을 나타낸 것이다. 패널 a는 AFP, 브라큐리, CDX2, Mox1, OCT3/4, SOX-7 및 ZIC1의 발현을 도시한 것이며, 패널 b는 CXCR4, GATA-4, 구스코이드 (Goosecoid), HNf3B 및 SOX-17의 발현 수준을 나타낸 것이다.
<도 23>
도 23은 성장 배지 중에서 조직 배양 폴리스티렌 상에 5000-40000개 세포/㎠로 씨딩 (seeded)된 다음, 저산소 조건 하에서 4일 동안 DMEM-F12 + 0.5% FBS + 100 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT3A + 100 nM GSK-3B 억제제 IX로 바꾸어 배양된 EXPRES 01 세포에 대한 실시간 PCR에 의해 결정된 유전자 발현을 나타낸 것이다. 패널 a는 AFP, 브라큐리, SOX-7 및 OTX2의 발현 수준을 도시한 것이다. 패널 b는 CXCR4, HNF-3 베타, GATA-4, SOX-17, Cerb 및 GSC의 발현 수준을 도시한 것이다.
<도 24>
도 24는 낮은 말단소체 조절 세포 (low telomere control cells) (레인 1), 24 계대의 EXPRES 01 세포 (레인 2), 17 계대의 EXPRES 02 세포 (레인 3), 40 계대의 인간 배아 줄기 세포주 H1으로부터의 미분화 세포 (레인 4) 및 높은 말단소체 길이 조절 세포 (레인 5)에서의 말단소체 길이 분석의 결과를 나타낸 것이다.
<도 25>
도 25는 전장 내배엽 세포 (S3), 췌장 내배엽 세포 (S4) 및 췌장 내분비 세포 (S5)로 분화되는 21 계대의 EXPRES 01 세포에 대한 실시간 PCR 데이터에 의해 결정된 유전자 발현을 나타낸 것이다.
<도 26>
도 26은 실시예 18에 따라 배양된 35 계대의 EXPRES 01의 면역 형광 이미지를 나타낸 것이다. 패널 a) 패널 b에 대한 DAPI 이미지, 패널 b) 항-1 트립신, 패널 c) HNF-3 베타 (녹색) 알부민 (적색), 패널 d) 알부민 (적색) 및 DAPI (청색), 패널 e) 패널 f에 대한 DAPI 이미지, 패널 f) PDX-1, 패널 g) 패널 h에 대한 DAPI 이미지, 패널 h) SOX-17, 패널 i) 패널 j에 대한 DAPI 이미지, 패널 j) CDX-2.
<도 27>
도 27은 패널 a) EXPRES 01 세포 (y-축)를 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터의 미분화 세포 (x-축)와 비교하고, 패널 b) EXPRES 02 세포 (y-축)를 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터의 미분화 세포 (x-축)와 비교하고, 패널 c) EXPRES 01 세포 (y-축)를 EXPRES 02 세포 (x-축)와 비교하고, 패널 d) EXPRES 01 세포 (y-축)를 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터의 완성 내배엽으로 분화된 세포 (x-축)와 비교하고, 패널 e) EXPRES 02 세포 (y-축)를 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터의 완성 내배엽으로 분화된 세포 (x-축)와 비교하고, 패널 f) 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터의 미분화 세포 (y-축)를 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터의 완성 내배엽으로 분화된 세포 (x-축)와 비교함으로써, 마이크로어레이 데이터의 산포도 (scatter plot)를 나타낸 것이다.
<도 28>
도 28은 EXPRES 01 세포에 의해 형성된 EB 바디 (body)의 형태를 나타낸 것이다.
<도 29>
도 29는 EXPRES 01 세포주의 세포, EXPRES 02 세포주의 세포 및 NOD-SCID 마우스의 신장 피막 아래의 이식 5주 후 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터의 43 계대의 세포에 대하여 실시간 PCR에 의해 결정된 유전자 발현을 나타낸 것이다. 패널 a-e는 중배엽 마커를 나타낸 것이다. 패널 f & g는 외배엽 마커를 나타낸 것이다. 패널 h & i는 내배엽 마커를 나타낸 것이다. 패널 j는 배아외 (extra embryonic) 내배엽 마커를 나타낸 것이다. 패널 k-m은 다능성 마커를 나타낸 것이다.
<도 30>
도 30은 BRDU 도입에 의해 결정된 EXPRES 03 세포의 증식 및 세포 주기 상태를 나타낸 것이다. EXPRES 03 세포를 패널 a) 액티빈-A (100 ng/mL) 및 wnt3a (20ng/mL), 패널 b) 액티빈-A (100 ng/mL) 및 wnt3a (20ng/mL) 및 IGF (50nh/mL)로 보충된 2% FBS/DMEM/F12에서 배양하였다. 나타낸 다른 세포는 패널 c) hES 세포 (H9p43), 패널 d) 양수 세포 (AFDX002) 및 패널 e) 미토마이신 처리 MEF 세포를 포함한다. 패널 f)는 연구된 상이한 세포 집단에 대한 세포 주기의 S-단계, G1 및 G2/M-단계의 세포의 빈도를 나타낸다.
<도 31>
도 31은 EXPRES 01 세포 및 단일 세포 분산액 또는 세포 무리 중 하나로서 플레이팅된 인간 배아 줄기 세포에서의 트랜스펙션 효능 및 EGFP의 발현을 나타낸 것이다. 세포를 24 시간 후에 형광 현미경 및 유세포 분석기로 분석하였다. 패널 A)는 EXPRES 01 세포로부터 수득된 데이터를 나타낸 것이다. 패널 B)는 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 분산액으로부터 수득된 데이터를 나타내며, 패널 C)는 인간 배아 줄기 세포의 세포 무리로부터 수득된 데이터를 나타낸 것이다.
<도 32>
도 32는 a) 대기 산소 (약 21%)에서 배양된 EXPRES 01 세포, b) 3% O2에서 배양된 EXPRES 01 세포, c) 대기 산소 (약 21%)에서 배양된 EXPRES 02 세포, d) 3% O2 조건에서 배양된 EXPRES 02 세포에 대한 MTS 분석으로 결정된, 세포수에 대한 데하이드로게나제 효소 활성을 나타내는 평균 OD 판독치를 나타낸 것이다.
<도 33>
도 33은 DMEMF12 + 0.5% FBS + 100 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT3A + 100 nM GSK-3B 억제제 IX 중에서 조직 배양 폴리스티렌 상에 10000개 세포/㎠로 씨딩된 EXPRES 01 P27 세포에 대한 실시간 PCR에 의해 결정된 유전자 발현을 나타낸 것이다. 패널 a는 AFP, 브라큐리, SOX-7 및 OTX2의 발현 수준을 도시한 것이다. 패널 b는 CXCR4, HNF-3 베타, GATA-4, SOX-17, Cer1 및 GSC의 발현 수준을 도시한 것이다.
<도 34>
도 34는 3 계대 동안 DMEM-F12 + 0.5% FBS + 100 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT3A + 100 nM GSK-3B 억제제 IX 중에서 조직 배양 폴리스티렌 상에 배양된 EXPRES 01 P27 세포에 대한 FACS에 의해 결정된 CXCR4 (Y-축) 및 CD9 (x-축)의 단백질 발현을 나타낸 것이다.
<도 35>
도 35는 GSK-3B 및 베타-카테닌의 발현에서의 siRNA 트랜스펙션의 영향를 나타낸 것이다. EXPRES 세포를 형광 현미경 및 정량적 RT-PCR 방법으로 분석하였다. A) i) CY3 표지된 siRNA 및 ii) 플루오레세인 (Fluorescein) 표지된 siRNA로 트랜스펙션된 세포의 형광 현미경. B) i) GSK3b 및 ii) 베타-카테닌 siRNA 올리고 서열로 트랜스펙션된 세포에서의 잔존 활성%로 나타낸 표적 유전자 낙다운 (knockdown).
<도 36>
도 36은 본 발명의 방법에 의해 유도된 두 세포주의 핵형 (karyotype)을 나타낸 것이다. 패널 a: EXPRES 01 세포주. 패널 b: EXPRES 02 세포주.
<도 37>
도 37은 a) 2% FBS + DM-F12 + 100 ng/mL의 액티빈-A+ 20 ng/mL의 WNT-3A + 50 ng/mL IGF 또는 b) 2% FBS + DM-F12 + 100 ng/mL의 액티빈-A+ 20 ng/mL의 WNT-3A + 50 ng/mL IGF + 10 μM의 Rho 키나제 억제제 Y-27632 중에서의 24시간 배양 후에 0 계대의 EXPRES 15 세포의 형태를 나타낸 것이다.
<도 38>
도 38은 12 계대 동안 2% FBS + DM-F12 + 100 ng/mL의 액티빈-A+ 20 ng/mL의 WNT-3A + 50 ng/mL IGF + 10 μM의 Rho 키나제 억제제 Y-27632 중에 배양된 EXPRES 15 세포의 핵형을 나타낸 것이다.
<도 39>
도 39는 IGF, 액티빈-A, Wnt3A 및 GSK 억제제 IX가 지정된 농도로 보충된 기초 배지에서 24시간 (패널 a), 48시간 (패널 b) 및 96시간 (패널 c) 배양된 EXPRES 11 세포의 A₄₉₀에 의해 결정된 증식을 나타낸 것이다.

개시 내용의 명확함을 위하여, 그리고 제한하지 않고서, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 소정의 특징, 실시형태, 또는 응용을 설명하거나 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉘어진다.

정의

줄기 세포는 단일 세포 수준에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 전구 세포 (progenitor), 비재생 전구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포 (progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 (in vitro) 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.

줄기 세포는 이들의 발생능에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배아외 세포형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성; (3) 세포 계통의 서브세트이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 서브세트가 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성 (예를 들어, 조혈 줄기 세포 (HSC)는 HSC (자가 재생), 혈액 세포 제한된 소기능성 (oligopotent) 전구 세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포형 및 요소 (예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능성 줄기 세포보다 더 제한된 세포 계통의 세브세트가 생기게 할 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통 (예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단기능성.

분화는 특화되지 않은("미결정된 (uncommitted)") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화 유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된 (committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경 하에서 특정 세포형 또는 세포형의 서브세트로 계속 분화할 것이며 통상적인 환경 하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화 (De-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된 (또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "AFP" 또는 "알파-태아단백질 (alpha-fetoprotein protein)"은 간 발생의 개시시에 생성되는 항원을 말한다. AFP는 또한 배아외 세포에서 발현될 수 있다.

"알부민"은 성인에서 모든 혈청 단백질의 약 절반을 구성하는 용해성 단량체성 단백질이다.

"β-세포 계통"은 전사 인자 PDX-1 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나에 대해 양성 (positive) 유전자 발현을 가진 세포를 말한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. β 세포 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 β 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "브라큐리"는 T-박스 (T-box) 유전자 패밀리 구성원이다. 이것은 원시선 및 중배엽 세포에 대한 마커이다.

본 명세서에 사용되는 "완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX-17, GATA-4, HNF-3 베타, GSC, Cer1, 노달 (Nodal), FGF8, 브라큐리, Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소데르민 (eomesodermin) (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.

"c-Kit" 및 "CD117" 둘 모두는 유전자은행 (Genbank) 기탁 번호 X06182에 개시된 서열, 또는 그것의 자연 발생 변이체 서열 (예를 들어, 대립유전자 변이체)을 가진 세포 표면 수용체 티로신 키나제를 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "CD99"는 기탁 번호 NM_002414를 가진 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말한다.

*본 명세서에 사용되는 바와 같이 "췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, HNF-1베타, PTF-1 알파, HNF-6, 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 "췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, 또는 PTF-1 알파. 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 및 췌장 호르몬 분비 세포, 및 β-세포 계통의 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "Cer1" 또는 "세레브루스 (Cerebrus)"는 시스테인 노트 (knot) 수퍼패밀리 단백질의 구성원이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "CXCR4"는 "LESTR" 또는 "퓨신 (fusin)"으로도 알려진, 기질 세포-유래 인자 1 (stromal cell-derived factor-1, SDF-1) 수용체를 말한다. 낭배형성중인 마우스 배아에서, CXCR4는 완성 내배엽 및 중배엽에서 발현되지만 배아외 내배엽에서는 발현되지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "완성 내배엽"은 낭배형성 중에 상배엽으로부터 생기는 세포의 특징을 보유하며 위장관을 형성하는 세포 및 그 파생 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: HNF-3 베타, GATA-4, SOX-17, 세르베루스, OTX2, 구스코이드, C-Kit, CD99, 및 Mixl1.

본 명세서에 사용되는 "배아외 내배엽"은 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포 집단을 말한다: SOX-7, AFP, 및 SPARC.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "FGF-2", "FGF-4" "FGF-8" "FGF-10", 및 "FGF-17"은 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 구성원이다.

"GATA-4" 및 "GATA-6"은 GATA 전사 인자 패밀리의 구성원이다. 이 전사 인자 패밀리는 TGF-β 시그널링에 의해 유도되며, 초기 내배엽 마커의 유지에 기여한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "GLUT-2"는 췌장, 간, 장, 뇌, 및 신장을 비롯한 많은 태아 및 성체 조직에서 발현되는 글루코스 수송 분자를 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "구스코이드" 또는 "GSC"는 원구의 배순에서 발현되는 호메오도메인 (homeodomain) 전사 인자를 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "HB9"는 호메오박스 유전자 9를 말한다.

"HNF-1 알파", "HNF-1 베타", "HNF-3 베타", 및 "HNF-6"은 전사 인자의 간 핵 인자 패밀리에 속하며, 이는 고도로 보존된 DNA 결합 도메인 및 두 개의 짧은 카복시-말단 도메인을 특징으로 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "Islet-1" 또는 "Isl-1"은 LIM/호메오도메인 패밀리의 전사 인자의 구성원이며, 발생 중인 췌장에서 발현된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "MafA"는 췌장에서 발현되는 전사 인자이며, 인슐린 생합성 및 분비에 관련된 유전자들의 발현을 조절한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 수준은 다른 세포에 비하여 관심있는 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 관심있는 세포는 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 식별되고 구별될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 "중내배엽 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: CD48, 에오메소데르민 (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 베타, GSC, FGF17, GATA-6.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "Mixl1"은 원시선, 중배엽, 및 내배엽에서 당해 세포에 대한 마커인 호메오박스 유전자를 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "NeuroD"는 신경발생에 연루된 기초적 헬릭스-루프-헬릭스 (basic helix-loop-helix, bHLH) 전사 인자이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "NGN-3"은 기초적 루프헬릭스-루프 전사 인자의 뉴로제닌 패밀리의 구성원이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "Nkx-2.2" 및 "Nkx-6.1"은 Nkx 전사 인자 패밀리의 구성원이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "노달 (Nodal)"은 TGF 베타 수퍼패밀리의 단백질의 구성원이다.

"Oct-4"는 POU-도메인 전사 인자의 구성원이며 다능성 줄기 세포의 특질로 널리 간주된다. 다능성 줄기 세포에 대한 Oct-4의 관계는 미분화된 다능성 줄기 세포에 엄격하게 제한된 Oct-4의 발현에 의해 나타내어진다. 체세포 계통으로 분화시에, Oct-4의 발현은 신속하게 사라진다.

본 명세서에 사용되는 "췌장 내분비 세포" 또는 "췌장 호르몬 발현 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드.

본 명세서에 사용되는 "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "Pax-4" 및 "Pax-6"은 췌도 발생에 연루된 췌장 β 세포 특이적 전사 인자이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "PDX-1"은 췌장 발생에 연루된 호메오도메인 전사 인자를 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전원시선 (pre-primitive streak) 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 노달 또는 FGF8

본 명세서에 사용되는 "원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 브라큐리, Mix-유사 호메오박스 단백질 또는 FGF4.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "PTF-1 알파"는 삼량체성 췌장 전사 인자-1(PTF1)의 서열-특이적 DNA-결합 서브유닛인 48 kD의 기초적 헬릭스-루프-헬릭스 단백질을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "SOX-1", "SOX-2", "SOX-7" 및 "SOX-17"은 SOX 전사 인자 패밀리의 구성원이며, 배아발생에 연루된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "SPARC"는 또한 "산성이며 시스테인이 풍부한 분비 단백질"로도 알려져 있다.

"SSEA-1" (단계 특이적 배아 항원-1 (Stage Specific Embryonic Antigen)-1)은 뮤린 기형암종 줄기 세포 (EC), 뮤린 및 인간 배아 배 세포 (EG) 및 뮤린 배아 줄기 세포(ES)의 표면 상에 존재하는 당지질 표면 항원이다.

"SSEA-3" (단계 특이적 배아 항원-3)은 인간 기형암종 줄기 세포 (EC), 인간 배아 배 세포 (EG) 및 인간 배아 줄기 세포 (ES)의 표면 상에 존재하는 당지질 표면 항원이다.

"SSEA-4" (단계 특이적 배아 항원-4)는 인간 기형암종 줄기 세포 (EC), 인간 배아 배 세포 (EG) 및 인간 배아 줄기 세포 (ES)의 표면 상에 존재하는 당지질 표면 항원이다.

"TRA1-60"은 인간 기형암종 줄기 세포 (EC), 인간 배아 배 세포 (EG) 및 인간 배아 줄기 세포 (ES)의 표면 상에서 발현되는 케라틴 설페이트 관련 항원이다.

"TRA1-81"은 인간 기형암종 줄기 세포 (EC), 인간 배아 배 세포 (EG) 및 인간 배아 줄기 세포 (ES)의 표면 상에서 발현되는 케라틴 설페이트 관련 항원이다.

"TRA2-49"는 인간 기형암종 줄기 세포 (EC) 및 인간 배아 줄기 세포 (ES)의 표면 상에서 발현되는 알칼라인 포스파타제 동질효소 (isozyme)이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "UTF-1"은 다능성 배아 줄기 세포 및 배아외 세포에서 발현되는 전사 공동활성인자를 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 "Zic1"은 Zic 전사 인자 패밀리의 구성원이다. Zic1은 신경 및 신경능 (neural crest)-특이적 유전자의 발현을 조절하며 배측 신경관 (dorsal neural tube) 및 전이동성 (premigratory) 신경능의 세포에서 발현된다.

다능성 마커를 발현하는 세포를 유도하는 방법

본 발명은 인간 배아 줄기 세포의 특징을 가지는 세포 집단을 제공하며, 이는 낮은 혈청의 배양 중에 용이하게 증가될 수 있고, 영양세포주 또는 복합 기질 단백질의 코팅을 필요로 하지 않고, 단일 세포 현탁액으로 계대될 수 있고, 매우 높은 효능으로 트랜스펙션될 수 있으며, 저산소 조건 하에서 배양될 수 있다. 이 독특한 속성을 가지는 조합물은 본 발명에서 기술된 세포를 종래 기술과 차별화시킨다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명은

a. 세포를 수득하는 단계, 및

b. 세포를 배양하기 전에 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서 저산소 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 다능성 마커를 발현하는 세포를 포함하는 세포 집단의 유도방법을 제공한다.

세포는 인간 배아 줄기 세포이거나, 이들은 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 인간 배아 줄기 세포는 세포를 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서 배양하기 전에, 정상산소 조건 하에 배양될 수 있다. 대안적으로, 인간 배아 줄기 세포는 저산소 조건 하에 배양될 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명은

a. 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계,

일 실시형태에 있어서, 본 발명은

a. 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계, 및

b. 세포를 제거한 후, 세포를 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서 저산소 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 다능성 마커를 발현하는 세포를 포함하는 세포 집단의 유도방법을 제공한다.

단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상의 저산소 조건 하에서의 세포 배양

일 실시형태에 있어서, 세포는 세포외 기질로 코팅되지 않은 조직 배양 기재 상에서 저산소 조건 하에 약 1일 내지 약 20일 동안 배양된다. 대안적인 실시형태에 있어서, 세포는 세포외 기질로 코팅되지 않은 조직 배양 기재 상에서 저산소 조건 하에 약 5일 내지 약 20일 동안 배양된다. 대안적인 실시형태에 있어서, 세포는 세포외 기질로 코팅되지 않은 조직 배양 기재 상에서 저산소 조건 하에 약 15일 동안 배양된다.

일 실시형태에 있어서, 저산소 조건은 약 1% O₂ 내지 약 20% O₂이다. 일 실시형태에 있어서, 저산소 조건은 약 2% O₂ 내지 약 10% O₂이다. 일 실시형태에 있어서, 저산소 조건은 약 3% O₂이다.

세포는 혈청, 액티빈-A 및 Wnt 리간드를 함유하는 배지 중에, 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서, 저산소 조건 하에 배양될 수 있다. 대안적으로, 배지는 또한 IGF-1을 함유할 수 있다.

배양 배지는 약 2% 내지 약 5% 범위의 혈청 농도를 가질 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 혈청 농도는 약 2%일 수 있다.

액티빈-4는 약 1 pg/mL 내지 약 100 ㎍/mL의 농도로 사용될 수 있다. 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/mL 내지 약 1 ㎍/mL일 수 있다. 다른 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/mL 내지 약 100 ng/mL일 수 있다. 다른 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 50 ng/mL 내지 약 100 ng/mL일 수 있다. 다른 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 100 ng/mL일 수 있다.

Wnt 리간드는 Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a 및 Wnt-7a로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-1이다. 대안적 실시형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-3a이다.

Wnt 리간드는 약 1 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 대안적 실시형태에서, Wnt 리간드는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, Wnt 리간드의 농도는 약 20 ng/mL이다.

IGF-1은 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, IGF-1은 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, IGF-1의 농도는 약 50 ng/mL이다.

본 발명의 방법으로 유도되는 다능성 마커를 발현하는 세포는 단백질 또는 세포외 기질로 예비처리되지 않은 조직 배양 기재 상에서, 저산소 조건 하에서의 배양에서 증가할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 유도되는 다능성 마커를 발현하는 세포는 ABCG2, 크립토 (cripto), FoxD3, 커넥신43, 커넥신45, Oct4, SOX-2, 나노그, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 및 Tra1-81로 이루어진 군으로부터 선택되는 하기 다능성 마커 중 적어도 하나를 발현한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 유도되는 다능성 마커를 발현하는 세포는 전원시선 세포의 특징으로 나타내는 마커를 발현할 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 유도되는 다능성 마커를 발현하는 세포는 원시선 세포의 특징을 나타내는 마커를 발현할 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 유도되는 다능성 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포의 특징을 나타내는 마커를 발현할 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 유도되는 다능성 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포의 특징을 나타내는 마커를 발현할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 유도되는 다능성 마커를 발현하는 세포의 추가의 분화

본 발명의 방법에 의해 유도되는 다능성 마커를 발현하는 세포는 해당 분야의 임의의 방법에 의하여 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 유도되는 다능성 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 유도되는 다능성 마커를 발현하는 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662 (2004)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 유도되는 다능성 마커를 발현하는 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25, 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 유도되는 다능성 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 유도되는 다능성 마커를 발현하는 세포는 다능성 줄기 세포를 혈청의 부재 하에 액티빈-A를 함유하는 배지 중에서 배양한 다음, 세포를 액티빈-A 및 혈청과 함께 배양하고, 이어서 세포를 상이한 농도의 액티빈-A 및 혈청과 함께 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌 [D'Amour et al, Nature Biotechnology, 23, 1534-1541, 2005]에 개시되어 있다.

완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 추가의 분화

완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 해당 분야의 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민으로 처리하고, 이어서 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 세포를 레틴산, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌 [D' Amour et al, Nature Biotechnology, 24: 1392-1401, (2006)]에 개시되어 있다.

췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 추가의 분화

췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 해당 분야의 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

제한 없이, 하기의 섹션은 본 발명의 방법에 따라, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커 및 다능성 마커를 발현하는 세포를 형성하는 데 적합한 출발 물질인 세포를 수득하는 방법의 예를 포함한다.

인간 배아 줄기 세포의 분리, 증가 및 배양

인간 배아 줄기 세포의 특성화: 인간 배아 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원 (stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 인간 배아 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra- 1-60, 및 Tra-1-81 발현 (존재한다면)의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 인간 배아 줄기 세포는 전형적으로 알칼라인 포스파타제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사(Vector Laboratories, Burlingame Calif.)가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드 (Vector Red)를 이용하여 현상함으로써 검출될 수 있다. 미분화된 다능성 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, Oct-4 및 TERT를 발현한다.

증식된 인간 배아 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽의 세포, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽 조직으로 분화하는 잠재력이다. 인간 배아 줄기 세포의 다능성은 예를 들어, 세포를 SCID 마우스 내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 다능성은 배양체 (embryoid)의 형성 및 삼배엽과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정할 수 있다.

증식된 인간 배아 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.

인간 배아 줄기 세포의 공급원: 사용될 수 있는 인간 배아 줄기 세포의 유형은 전-배아 (pre-embryonic) 조직 (예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 그러나 전형적으로 약 10-12주 임신 전일 필요는 없는 임의의 시점에 취한 태아 조직을 비롯한, 임신 후 형성된 조직으로부터 유래된 인간 배아 세포의 확립된 주를 포함한다. 비제한적인 예로는 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 배아 배 세포의 확립된 주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 그러한 세포의 초기 확립 또는 안정화 중에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 다능성 세포일 것이다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 다능성 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (BresaGen, Athens, GA)가 또한 적합하다.

일 실시형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨 (Thomson) 등 (미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science 282:1145, 1998]; 문헌[Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998];문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995])에 개시된 바와 같이 제조된다.

인간 배아 줄기 세포의 배양: 일 실시형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 영양세포가 본질적으로 없으나, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 겪지 않고 인간 배아 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 인간 배아 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 인간 배아 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.

대안적 실시형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 먼저 다양한 방식으로 인간 배아 줄기 세포를 지지하는 영양세포층과 배양된다. 그 다음, 인간 배아는 영양세포가 본질적으로 없으나, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 겪지 않고 인간 배아 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템으로 옮겨진다.

본 발명에 사용하기에 적합한 조절된 배지의 예는 제US20020072117호, 제US6642048호, 제WO2005014799호 및 수 (Xu) 등의 문헌[Stem Cells 22: 972-980, 2004]에 개시되어 있다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 화학적 규명 배지의 예는 제US20070010011호에서 찾을 수 있다.

적합한 배양 배지는 하기 성분들, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM), Gibco # 11965-092; 낙아웃(Knockout) 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), Gibco # 10829-018; Ham's F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, Gibco # 15039-027; 비-필수 아미노산 용액, Gibco 11140-050; β-메르캅토에탄올, Sigma # M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), Gibco # 13256-029로부터 제조될 수 있다.

일 실시형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 본 발명의 방법에 따른 처리 전에 처리된 적합한 배양 기재 상에 플레이팅된다. 일 실시형태에서, 처리는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막에서 유래되거나 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 일 실시형태에서, 적합한 배양 기재는 MATRIGEL (Becton Dickenson)이다. MATRIGEL은 실온에서 젤화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐(Engelbreth-Holm-Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다.

다른 세포외 기질 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.

인간 배아 줄기 세포는 적합한 분포로 그리고 세포 생존, 증식 및 바람직한 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재하에서 기재상에 플레이팅된다. 모든 이들 특징들은 씨딩 분포에 대해 신중한 주의를 기울이는 것으로부터 이익을 얻으며 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

그 다음, 인간 배아 줄기 세포는 본 발명에 따른 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커 및 다능성 마커를 발현하는 세포를 형성하기 위한 방법에 따른 처리 전에, 처리된 조직 배양 기재로부터 제거되고, 미처리 조직 배양 기재 상에 플레이팅된다.

인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로의 분화

인간 배아 줄기 세포는 해당 분야의 임의의 방법에 의해 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 본 발명의 방법에 따른 처리에 적합하다.

예를 들어, 인간 배아 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 인간 배아 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662 (2004)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 인간 배아 줄기 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25, 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

세포외 기질 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로의 분화

일 실시형태에서, 본 발명은 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 인간 배아 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은

a. 세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에 인간 배아 줄기 세포를 플레이팅하는 단계, 및

b. 인간 배아 줄기 세포를 액티빈-A 및 Wnt 리간드와 함께 배앙하는 단계를 포함한다.

그 다음, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 순차적으로 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커 및 다능성 마커를 발현하는 세포를 형성하기 위한 본 발명의 방법에 의해 처리된다.

인간 배아 줄기 세포를 액티빈 A와 Wnt 리간드와 함께 배양하는 것은 단일 배양 배지에서 실시될 수 있다. 대안적으로, 인간 배아 줄기 세포를 액티빈-A 및 Wnt 리간드와 함께 배양하는 것은 1가지 초과의 배양 배지 중에서 실시될 수 있다. 일 실시형태에서, 인간 배아 줄기 세포를 액티빈-A 및 Wnt 리간드와 함께 배양하는 것은 2가지의 배양 배지에서 실시된다.

세포외 기질: 본 발명의 일 태양에서, 인간 배아 줄기 세포는 세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양되고 분화된다. 세포외 기질는 마우스 육종 세포로부터 추출된 가용화된 기저막 제제일 수 있다(상표명 MATRIGEL로 BD Biosciences에서 판매함). 대안적으로, 세포외 기질는 성장 인자-감소된 MATRIGEL일 수 있다. 대안적으로, 세포외 기질는 피브로넥틴일 수 있다. 대안적 실시형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 인간 혈청으로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양되고 분화된다.

세포외 기질은 조직 배양 기재를 코팅하기 전에 희석될 수 있다. 세포외 매트릭스를 희석하고 조직 배양 기재를 코팅하기 위한 적합한 방법의 예는 문헌[Klei nMan, H.K., et al., Biochemistry 25:312 (1986)] 및 문헌[Hadley, M.A., et al., J.Cell.Biol. 101:1511 (1985)]에서 찾을 수 있다.

일 실시형태에서, 세포외 기질는 MATRIGEL이다. 일 실시형태에서, 조직 배양 기재는 1:10 희석의 MATRIGEL로 코팅된다. 대안적 실시형태에서, 조직 배양 기재는 1:15 희석의 MATRIGEL로 코팅된다. 대안적 실시형태에서, 조직 배양 기재는 1:30 희석의 MATRIGEL로 코팅된다. 대안적 실시형태에서, 조직 배양 기재는 1:60 희석의 MATRIGEL로 코팅된다.

일 실시형태에서, 세포외 기질는 성장 인자-감소된 MATRIGEL이다. 일 실시형태에서, 조직 배양 기재는 1:10 희석의 성장 인자-감소된 MATRIGEL로 코팅된다. 대안적 실시형태에서, 조직 배양 기재는 1:15 희석의 성장 인자-감소된 MATRIGEL로 코팅된다. 대안적 실시형태에서, 조직 배양 기재는 1:30 희석의 성장 인자-감소된 MATRIGEL로 코팅된다. 대안적 실시형태에서, 조직 배양 기재는 1:60 희석의 성장 인자 감소된 MATRIGEL로 코팅된다.

단일의 배양 배지를 사용하는 세포외 기질 상에서의, 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로의 분화: 일 실시형태에서, 본 발명은 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 인간 배아 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은:

a. 세포외 기질로 코팅된 조직 배양 기재 상에 인간 배아 줄기 세포를 플레이팅하는 단계, 및

b. 인간 배아 줄기 세포를 액티빈-A 및 Wnt 리간드와 함께 배양하는 단계를 포함한다.

배양 배지는 완성 내배엽으로의 인간 배아 줄기 세포의 분화를 허용하기에 충분히 낮은 농도의 소정의 인자들, 예를 들어 인슐린 및 IGF를 함유해야 한다 (제WO2006020919호에 개시된 바와 같음). 이것은 혈청 농도를 낮추거나, 또는 대안적으로 인슐린과 IGF가 결핍된 화학적 규명 배지를 이용함으로써 성취될 수 있다. 화학적 규명 배지의 예는 윌스 (Wiles) 등 (문헌[Exp Cell Res. 1999 Feb 25; 247(1): 241-8.])에서 개시된다.

배양 배지는 약 0% 내지 약 10% 범위의 혈청 농도를 가질 수 있다. 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 0% 내지 약 5% 범위일 수 있다. 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 0% 내지 약 2% 범위일 수 있다. 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 2%일 수 있다.

액티빈 A 및 Wnt 리간드와 함께 배양하는 시간은 약 1일 내지 약 7일 범위일 수 있다. 대안적 실시형태에서, 배양 시간은 약 1일 내지 약 3일 범위일 수 있다. 대안적 실시형태에서, 배양 시간은 약 3일일 수 있다.

액티빈-A는 인간 배아 줄기 세포의 분화를 야기하기에 적합한 임의의 농도로 사용될 수 있다. 상기 농도는 약 1 pg/mL 내지 약 100 ㎍/mL일 수 있다. 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/mL 내지 약 1 ㎍/mL일 수 있다. 다른 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/mL 내지 약 100 ng/mL일 수 있다. 다른 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 50 ng/mL 내지 약 100 ng/mL일 수 있다. 다른 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 100 ng/mL일 수 있다.

Wnt 리간드의 선택은 분화 과정의 효율을 개선하기 위해 최적화될 수 있다. Wnt 리간드는 Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a 및 Wnt-7a로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-1이다. 대안적 실시형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-3a이다.

Wnt 리간드는 약 1 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL의 농도일 수 있다. 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL일 수 있다.

단일 배양 배지는 또한 GSK-3B 억제제를 함유할 수 있다. GSK-3B 억제제는 GSK-3B 억제제 IX 및 GSK-3B 억제제 XI로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, GSK-3B 억제제는 GSK-3B 억제제 IX이다.

인간 배아 줄기 세포를 GSK-3B 억제제와 함께 배양할 경우, GSK-3B 억제제의 농도는 약 1 nM 내지 약 1000 nM일 수 있다. 대안적 실시형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 약 10 nM 내지 약 100 nM의 농도의 GSK-3B 억제제와 함께 배양된다.

단일 배양 배지는 또한 인간 배아 줄기 세포로부터 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포를 형성하는 것을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 다른 추가 인자를 함유할 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 증식을 향상시킬 수 있다. 추가로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포가 다른 세포 유형을 형성하는 능력을 향상시키거나, 또는 임의의 다른 추가의 분화 단계의 효율을 개선할 수 있다.

적어도 하나의 추가 인자는 예를 들어, 니코틴아미드, TGF-β1, 2 및 3을 비롯한 TGF-β 패밀리의 구성원, 혈청 알부민, 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 구성원, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자 (IGF-I, II), 성장 분화 인자 (GDF-5, -6, -8, -10, 11), 글루카곤 유사 펩티드-I 및 II (GLP-I 및 II), GLP-1 및 GLP-2 미메토바디, 엑센딘-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 프로게스테론, 아프로티닌, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 베타 메르캅토에탄올, 상피 성장 인자 (EGF), 가스트린 I 및 II, 구리 킬레이팅제, 예를 들어, 트라이에틸렌 펜타민, 포르스콜린, Na-부티레이트, 액티빈, 베타셀룰린, ITS, 노긴, 신경돌기 성장 인자, 노달, 발포르산, 트라이코스타틴 A, 부티르산나트륨, 간세포 성장 인자 (HGF), 스핑고신 1, VEGF, MG132 (EMD, CA), N2 및 B27 보충물 (Gibco, CA), 스테로이드 알칼로이드, 예를 들어, 사이클로파민 (EMD, CA), 각질형성세포 성장 인자 (KGF), 딕코프 단백질 패밀리, 소과 뇌하수체 추출물, 췌도 신생-관련 단백질 (INGAP), 인디안 헤지호그, 소닉 헤지호그, 프로테아좀 억제제, 노치 경로 억제제, 소닉 헤지호그 억제제, 또는 그 조합일 수 있다.

적어도 하나의 다른 추가 인자는 췌장 세포주, 예를 들어, PANC-1 (ATCC 번호: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC 번호: HTB-79), BxPC-3 (ATCC 번호: CRL-1687), HPAF-II (ATCC 번호: CRL-1997), 간 세포주, 예를 들어, HepG2 (ATCC 번호: HTB-8065), 및 장 세포주, 예를 들어, FHs 74 (ATCC 번호: CCL-241)로부터 얻은 조절된 배지에 의해 공급될 수 있다.

2가지 배양 배지를 사용하는 세포외 기질 상의 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로의 분화: 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽 계통의 세포로의 분화는 인간 배아 줄기 세포를 2가지 배양 배지를 사용하여 액티빈-A 및 Wnt 리간드와 함께 배양함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 인간 배아 줄기 세포의 분화는 하기와 같이 달성될 수 있다:

b. 인간 배아 줄기 세포를 제1 배양 배지에서 액티빈-A와 Wnt 리간드와 함께 배양하는 단계, 및

c. 인간 배아 줄기 세포를 제2 배양 배지에서 액티빈-A와 함께 배양하는 단계.

제1 배양 배지는 저 농도의 혈청을 함유할 수 있으며, 제2 배양 배지는 제1 배양 배지보다 더 높은 농도의 혈청을 함유할 수 있다.

제2 배양 배지는 Wnt 리간드를 함유할 수 있다.

제1 배양 배지: 제1 배양 배지는 인간 배아 줄기 세포가 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포로 분화되도록 하기에 충분히 낮은 농도의 소정의 인자들, 예를 들어, 인슐린 및 IGF를 함유해야 한다 (제WO2006020919호에 개시된 바와 같음). 이것은 혈청 농도를 낮추거나, 또는 대안적으로 인슐린과 IGF가 결핍된 화학적 규명 배지를 이용함으로써 성취될 수 있다. 화학적 규명 배지의 예는 윌스 등 (문헌[Exp Cell Res. 1999 Feb 25; 247(1): 241-8.])에서 개시된다.

제1 배양 배지에서는 제2 배양 배지에 비하여, 더 낮은 농도의 혈청이 있을 수 있다. 제2 배양 배지에서 혈청 농도를 증가시키면 세포의 생존을 증가시키거나, 또는 대안적으로는 세포의 증식을 향상시킬 수 있다. 제1 배지의 혈청 농도는 약 0% 내지 약 10% 범위일 수 있다. 대안적으로, 제1 배지의 혈청 농도는 약 0% 내지 약 2% 범위일 수 있다. 대안적으로, 제1 배지의 혈청 농도는 약 0% 내지 약 1% 범위일 수 있다. 대안적으로, 제1 배지의 혈청 농도는 약 0.5%일 수 있다.

적어도 두 가지의 배양 배지를 이용하여 액티빈-A와 Wnt 리간드와 함께 인간 배아 줄기 세포를 배양할 때, 제1 배양 배지에서의 배양 시간은 약 1일 내지 약 3일 범위일 수 있다.

제1 배양 배지는 또한 GSK-3B 억제제를 함유할 수 있다. GSK-3B 억제제는 제1 배양 배지에, 제2 배양 배지에, 또는 제1 및 제2 배양 배지 둘 모두에 첨가될 수 있다.

GSK-3B 억제제는 GSK-3B 억제제 IX 및 GSK-3B 억제제 XI로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, GSK-3B 억제제는 GSK-3B 억제제 IX이다.

GSK-3B 억제제와 함께 인간 배아 줄기 세포를 배양할 경우, GSK-3B 억제제의 농도는 약 1 nM 내지 약 1000 nM일 수 있다. 대안적 실시형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 약 10 nM 내지 약 100 nM의 농도의 GSK-3B 억제제와 함께 배양된다.

제1 배양 배지는 또한 인간 배아 줄기 세포로부터 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포를 형성하는 것을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 다른 추가 인자를 함유할 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 증식을 향상시킬 수 있다. 추가로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포가 다른 세포 유형을 형성하는 능력을 향상시키거나, 또는 임의의 다른 추가의 분화 단계의 효율을 개선할 수 있다.

적어도 하나의 추가 인자는 예를 들어, 니코틴아미드, TGF-β1, 2, 및 3을 비롯한 TGF-β패밀리의 구성원, 혈청 알부민, 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 구성원, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자 (IGF-I, II), 성장 분화 인자 (GDF-5, -6, -8, -10, 11), 글루카곤 유사 펩티드-I 및 II (GLP-I 및 II), GLP-1 및 GLP-2 미메토바디, 엑센딘-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 프로게스테론, 아프로티닌, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 베타 메르캅토에탄올, 상피 성장 인자 (EGF), 가스트린 I 및 II, 구리 킬레이팅제, 예를 들어, 트라이에틸렌 펜타민, 포르스콜린, Na-부티레이트, 액티빈, 베타셀룰린, ITS, 노긴, 신경돌기 성장 인자, 노달, 발포르산, 트라이코스타틴 A, 부티르산나트륨, 간세포 성장 인자 (HGF), 스핑고신-1, VEGF, MG132 (EMD, CA), N2 및 B27 보충물 (Gibco, CA), 스테로이드 알칼로이드, 예를 들어, 사이클로파민 (EMD, CA), 각질형성세포 성장 인자 (KGF), 딕코프 단백질 패밀리, 소과 뇌하수체 추출물, 췌도 신생-관련 단백질 (INGAP), 인디안 헤지호그, 소닉 헤지호그, 프로테아좀 억제제, 노치 경로 억제제, 소닉 헤지호그 억제제, 또는 그 조합일 수 있다.

제2 배양 배지: 제2 배양 배지는 배양된 세포의 생존을 촉진하기에 충분한 농도로, 소정의 인자들, 예를 들어, 인슐린 및 IGF (제WO2006020919호에 개시된 바와 같음)를 함유해야 한다. 이것은 혈청 농도를 증가시키거나, 또는 대안적으로, 제1 배양 배지에 비하여 인슐린과 IGF의 농도가 증가된 화학적 규명 배지를 이용함으로써 성취될 수 있다. 화학적 규명 배지의 예는 윌스 등 (문헌[Exp Cell Res. 1999 Feb 25; 247(1): 241-8.])에서 개시된다.

보다 높은 농도의 혈청을 가진 제2 배양 배지에서는, 제2 배양 배지의 혈청 농도는 약 0.5% 내지 약 10% 범위일 수 있다. 대안적으로, 제2 배양 배지의 혈청 농도는 약 0.5 % 내지 약 5% 범위일 수 있다. 대안적으로, 제2 배양 배지의 혈청 농도는 약 0.5% 내지 약 2% 범위일 수 있다. 대안적으로, 제2 배양 배지의 혈청 농도는 약 2% 일 수 있다. 제2 배양 배지로 인간 배아 줄기 세포를 배양할 경우, 배양 시간은 약 1일 내지 약 4일 범위일 수 있다.

제1 배양 배지와 유사하게, 액티빈-A는 인간 배아 줄기 세포의 분화를 야기하기에 적합한 임의의 농도로 사용될 수 있다. 상기 농도는 약 1 pg/mL 내지 약 100 ㎍/mL일 수 있다. 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/mL 내지 약 1 ㎍/mL일 수 있다. 다른 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/mL 내지 약 100 ng/mL일 수 있다. 다른 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 50 ng/mL 내지 약 100 ng/mL일 수 있다. 다른 대안적 실시형태에서, 상기 농도는 약 100 ng/mL일 수 있다.

제2 배양 배지는 또한 GSK-3B 억제제를 함유할 수 있다. GSK-3B 억제제는 제1 배양 배지에, 제2 배양 배지에, 또는 제1 및 제2 배양 배지 둘 모두에 첨가될 수 있다.

제1 배양 배지와 유사하게, 제2 배양 배지는 또한 인간 배아 줄기 세포로부터 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 형성을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 다른 추가 인자를 함유할 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포의 증식을 향상시킬 수 있다. 추가로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포가 다른 세포 유형을 형성하는 능력을 향상시키거나, 또는 임의의 다른 추가의 분화 단계의 효율을 개선할 수 있다.

본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.

실시예 1

인간 배아 줄기 세포 배양

인간 배아 줄기 세포주 H1, H7 및 H9를 WiCell Research Institute, Inc.)(Madison, WI)로부터 입수하였으며 공급처인 상기 인스티튜트에 의해 제공된 설명서에 따라 배양하였다. 요약하면, 세포를 20% 낙아웃(knockout) 혈청 대체물로 보충된 DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO), 100 nM MEM 비필수 아미노산, 0.5 mM 베타-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민 - 4 ng/mL 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함함 - (모두 Invitrogen/GIBCO로부터 입수)으로 이루어진 ES 세포 배지에서 마우스 배아 섬유아세포 (MEF) 영양 세포 상에서 배양하였다. E13 내지 13.5 마우스 배아로부터 유래된 MEF 세포를 Charles River로부터 구매하였다. MEF 세포를 10% FBS (Hyclone), 2 mM 글루타민, 및 100 mM MEM 비필수 아미노산으로 보충된 DMEM 배지에서 증가시켰다. 서브-컨플루언트 (Sub-confluent) MEF 세포 배양물을 3시간 동안 10 ㎍/mL 마이토마이신 C (Sigma, St. Louis, MO)로 처리하여 세포 분열을 중지시키고, 이어서 트립신처리하고 0.1% 소과 젤라틴-코팅된 디쉬에 2x104/㎠로 플레이팅하였다. 2 내지 4 계대로부터의 MEF 세포를 영양세포층으로 사용하였다. MEF 세포 영양세포층 상에 플레이팅된 인간 배아 줄기 세포를 가습된 조직 배양 인큐베이터 내에서 5% CO₂의 분위기에서 37℃에서 배양하였다. 컨플루언트일 때 (플레이팅 후 약 5-7일), 인간 배아 줄기 세포를 5-10분 동안 1 mg/mL의 IV형 콜라게나제 (Invitrogen/GIBCO)로 처리하고 이어서 5 ml 피펫을 이용하여 표면으로부터 부드럽게 긁어내었다. 세포를 5분 동안 900 rpm에서 회전시키고, 펠렛을 재현탁시키고 신선한 배양 배지 중에 1:3 내지 1:4 비의 세포로 재플레이팅하였다.

병행하여, H1, H7 및 H9 인간 배아 줄기 세포를 또한 1:30 희석의 성장 인자 감소된 MATRIGEL (BD Biosciences)로 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하고, 8 ng/mL bFGF로 보충된 MEF-조절된 배지에서 배양하였다. MATRIGEL에서 배양된 세포를 통상적으로 콜라게나제 IV (Invitrogen/GIBCO), Dispase (BD Biosciences) 또는 LIBERASE 효소를 사용하여 계대하였다. 인간 배아 줄기 세포 배양물의 일부를 저산소 조건 (대략 3% O₂)에서 인큐베이션하였다.

실시예 2

형광-활성화 세포 분류 (Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS) 분석

부착된 인간 배아 줄기 세포를 TrypLE™ Express 용액 (Invitrogen, CA)을 사용하여 5분의 인큐베이션에 의하여 배양 플레이트로부터 제거하였다. 유리된 세포를 인간 배아 줄기 세포 배양 배지에 재현탁시키고 원심분리에 의해 회수하고, 이어서 PBS 중의 2% BSA, 0.05% 소듐 아자이드로 이루어진 염색 완충액 (Sigma, MO)에 세포를 세척하고 재현탁시켰다. 적절할 경우, 세포를 0.1% γ-글로불린 (Sigma) 용액을 이용하여 15분 동안 Fc-수용체를 블로킹하였다. 분취물 (약 1x10⁵개 세포)을 표 IA에 표시된 바와 같이, 피코에리티린 (PE) 또는 알로피코시아닌 (APC) 컨쥬게이션된 단일클론 항체 (5 ㎕의 항체/1x10⁶개 세포)와, 또는 비컨쥬게이션된 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 대조군은 적절한 아이소타입 (isotype) 매치된 항체, 비염색 세포, 및 이차 컨쥬게이션 항체만으로 염색된 세포를 포함하였다. 항체를 이용한 모든 인큐베이션은 4℃에서 30분 동안 실시하였으며 그 후 세포를 염색 완충액으로 세척하였다. 비컨쥬게이션 일차 항체로 염색된 샘플을 이차 컨쥬게이션 PE 또는 -APC 표지된 항체로 4℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. 사용된 이차 항체의 목록에 대해서는 표 IB를 참고한다. 세척된 세포를 펠렛화하고 염색 완충액에 재현탁시키고, 세포 표면 분자를 FACS 분석 (Array) (BD Biosciences) 기기를 사용하여 적어도 10,000 경우를 수집하여 확인하였다.

실시예 3

면역세포화학

부착된 세포를 4% 파라포름알데히드를 사용하여 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS/0.1%BSA/10% 정상 병아리 혈청/0.5% 트리톤 X-100으로 실온에서 1시간 동안 블로킹하고 이어서 4℃에서 PBS/0.1%BSA/10% 정상 병아리 혈청 중의 일차 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 일차 항체 및 그들의 작업 희석도의 목록을 표 IA에 나타내었다. PBS/0.1% BSA에서 세 번 세척 후, PBS에서 1:100으로 희석된 형광 이차 항체 (표 IB)를 실온에서 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하여 결합되도록 하였다. 대조 샘플은 일차 항체가 생략되거나 또는 일차 항체가 일차 항체와 동일한 농도의 상응하는 매치되는 음성 대조 면역글로불린으로 대체된 반응물을 포함하였다. 염색된 샘플을 헹구었으며; 다이아미디노-2-페닐인돌, 2염산염 (DAPI)을 함유한 PROLONG® (Invitrogen, CA) 한 방울을 각 샘플에 첨가하여 핵을 대조-염색하고 빛바램-방지 (anti-fade) 시약으로서 기능하도록 하였다. Nikon Confocal Eclipse C-1 역상 현미경 (Nikon, Japan) 및 10-60X 대물렌즈를 이용하여 이미지를 얻었다.

실시예 4

ES 유래 세포의 PCR 분석

RNA 추출, 정제 및 cDNA 합성: 에탄올-함유, 고염 완충액의 존재하에서 실리카겔 막 (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA)에 결합시킨 후 세척하여 오염물질을 제거함으로써 RNA 샘플을 정제하였다 TURBO DNA-free 키트 (Ambion, INC)를 이용하여 RNA를 추가로 정제하고, 이어서 고 품질 RNA를 물에 용출시켰다. 수율 및 순도를 분광광도계 상에서의 A260 및 A280 판독치에 의해 평가하였다. ABI (ABI, CA) 고성능 cDNA archive 키트를 사용하여 CDNA 카피를 정제된 RNA로부터 만들었다.

실시간 PCR 증폭 및 정량적 분석: 달리 나타내지 않는 한, 모든 시약을 Applied Biosystems에서 구입하였다. 실시간 PCR 반응은 ABI PRISM® 7900 서열 탐지 시스템을 이용하여 실시하였다. TAQMAN® UNIVERSAL PCR MASTER MIX® (ABI, CA)를 20 ㎕의 총 반응 부피 중에 20 ng의 역전사된 RNA와 함께 이용하였다. 각각의 cDNA 샘플을 두벌씩 실행하여 피펫팅 오류에 대해 보정하였다. 프라이머 및 FAM-표지된 TAQMAN® 프로브를 200 nM 농도로 사용하였다. 각 표적 유전자의 발현 수준은, Applied Biosystems에 의해 이전에 개발된 인간 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH) 내인성 대조군을 이용하여 정상화하였다. 프라이머 및 프로브 세트를 표 II에 열거하였다. SOX-17 프라이머를 PRIMERS 프로그램 (ABI, CA)을 사용하여 설계하였으며, 다음의 서열이었다: SOX-17: TGGCGCAGCAGATACCA, AGCGCCTTCCACGACTTG, 및 CCAGCATCTTGCTCAACTCGGCG. 50℃에서 2분 동안 및 이어서 95℃에서 10분 동안 초기 인큐베이션 후, 샘플을 두 단계로 40회 사이클링시켰다 - 95℃에서 15초 동안 변성화 단계 및 이어서 60℃에서 1분 동안 어닐링/연장 단계. 데이터 분석은 GENEAMP®7000 서열 탐지 시스템 소프트웨어를 이용하여 실시하였다. 각각의 프라이머/프로브 세트에 대하여, 형광 강도가 증폭의 지수 영역의 중간의 특정 값에 도달하는 사이클 수로서 Ct 값을 결정하였다. 상대적인 유전자 발현 수준을 비교 Ct 방법을 이용하여 계산하였다. 요약하면, 각각의 cDNA 샘플에 대하여, 내인성 대조 Ct 값을 관심있는 유전자의 Ct로부터 차감하여 델타 Ct 값 (ΔCt)을 얻었다. 증폭이 100% 효율이라고 가정하고, 표적의 정상화된 양을 2-ΔCt로서 계산하였다. 최종 데이터를 보정 샘플에 대하여 표현하였다.

실시예 5

MATRIGEL로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽 (DE)으로의 분화

저산소 조건 (약 3% O₂) 하에서 배양되고 MATRIGEL (1:30 희석) 코팅된 디쉬 상에 플레이팅된 54 계대의 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터의 세포를 0.5% FBS, 20 ng/mL WNT-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, R&D Systems, MN) 및 100 ng/mL 액티빈-A (R&D Systems, MN)로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS 및 100 ng/mL 액티빈-A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3-4일 동안 처리하였다. 도 1은 4일째의 FACS에 의한 CXCR4의 발현을 도시한 것이다. 도 2는 저혈청 + AA + WNT3A로 처리된 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터의 세포 배양물에 대한 4일 및 6일째의 실시간 PCR 데이터를 나타낸 것이다. 이 프로토콜은 완성 내배엽 마커의 상당한 상향조절을 야기하였다. 이 과정은 또한 DE (완성 내배엽) 프로토콜로 언급될 것이다.

실시예 6

완성 내배엽 단계로 분화된 인간 배아 줄기 세포 유래의 세포의 분리 및 증가

다양한 계대 (30-54 계대)의 인간 배아 줄기 세포주 H1 및 H9로부터의 세포를 저산소 조건 (약 3% O₂)에서 적어도 3 계대 동안 배양하였다. 세포를 8 ng/mL의 bFGF로 보충된 MEF-CM 중에서 배양하고, 실시예 1에 따라 MATRIGEL 코팅된 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 실시예 5에 요약된 DE 프로토콜에 노출시켰다. 3-6일에, 배양물을 TrypLE™ Express 용액 (Invitrogen, CA)에 5분 동안 노출시켰다. 유리된 세포를 DMEM-F12 + 2% FBS 배지 중에 재현탁시키고, 원심분리하여 회수하고, 혈구계를 사용하여 계수하였다. 유리된 세포를 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS) 처리된 플라스크 상에 1000-10,000개 세포/㎠로 씨딩하고, 표준 조직 배양 인큐베이터에서, 저산소 조건 (약 3% O₂) 하에 37℃에서 DMEM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL 액티빈-A + 20 ng/mL WNT-3A 중에 배양하였다. TCPS 플라스크를 MATRIGEL 또는 다른 세포외 기질 단백질로 코팅하지 않았다. 배지를 매일 교환하였다. 일부 배양물에서, 배지에 10-50 ng/mL의 IGF-I (R&D Systems (MN)로부터의 인슐린 성장 인자-I) 또는 1X ITS (Invitrogen (Ca)으로부터의 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄)를 추가로 보충하였다. 일부 배양 조건에서, 기초 배지 (DM-F12 + 2% FBS)에 0.1 mM 메르캅토에탄올 (Invitrogen, CA) 및 비필수 아미노산 (Invitrogen (CA)으로부터의 1X, NEAA)을 추가로 보충하였다. 첫번째 계대 세포를 P1로 언급하였다. 병행하여, 유사한 배양물을 정상산소 조건 (약 21% O₂) 하에서 확립하였다. 이 분리 과정의 요약은 도 3에 나타내었다.

5-15일의 배양 후에, 노쇠 중인 것으로 보이는 수많은 확대된 (enlarged) 세포에 의해 둘러싸인 분명한 세포 콜로니가 나타났다 (도 4a-b). 약 50-60%의 컨플루언시에서, 배양물을 실온에서 TrypLE™ Express 용액에 5분 동안 노출시킴으로써 계대하였다. 유리된 세포를 DMEM-F12 + 2% FBS 배지 중에 재현탁시키고, 원심분리로 회수하고, 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS) 처리된 플라스크 상에 DMEM-F12 + 2%FBS + 100 ng/mL 액티빈-A + 20 ng/mL WNT-3A +/- 50 ng/mL의 IGF-I 중에 10,000개 세포/㎠로 씨딩하였다. 이 배지는 또한 "성장 배지"로 언급될 것이다. 도 4 c는 10,000개 세포/㎠로 씨딩된 3 계대에서의 세포의 형태를 나타낸 것이다. 초기 분리 후 3 계대 (패널 c)에서 세포가 높은 핵 대 세포질 비를 가지는 균일한 상피-유사 형태를 가지는 것으로 나타났다.

일부 배양에서, 성장 배지에 1X NEAA + 0.1 mM 메르캅토에탄올을 추가로 보충하였다. 3 내지 4 계대 이후에, 부착된 세포는 높은 핵 대 세포질 비를 가지는 균일한 형태를 갖는 것으로 나타났다. 정상산소 조건 하에 확립된 병행 배양은 부착된 세포에 의한 왕성한 콜로니 형성을 나타내지 못했다. 2 내지 3 계대 이후에, 정상산소 조건 하에 확립된 배양은 낮은 성장 속도 때문에 중단하였다.

실시예 7

다수의 계대 후에 DE 마커의 증가 및 유지에서의 액티빈 -A, WNT3A 및 IGF -I의 역할

실시예 6에 기재된 방법에 따라 부모 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터 유래된 배양물을 매 4-7일 마다 계대하였다. 도 5는 3 계대 동안 2% FBS + DMEM-F12 + 100 ng/mL의 액티빈-A + 20의 WNT3A 중에 배양된 증가된 세포에 대한 실시간 PCR 결과를 나타낸 것이다. 이 데이터는 실시예 5에 약술된 DE 프로토콜의 6일째의 분리된 세포주에 대한 것이다. 각 계대 후에 SOX-17 및 HNF-3 베타와 같은 DE 마커의 명백한 감소가 있었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 액티빈-A를 함유하는 성장 배지로의 WNT3A의 첨가는 DE 마커의 발현의 상당한 상승으로 이어진다. 그러나, 50 ng/mL의 IGF-I의 첨가 및 액티빈-A 및 WNT-3A의 사용 중지 (도 7 a-c)는 OCT-4와 함께 DE 마커 발현의 급격한 감소와 SOX-7 및 AFP와 같은 내장 내배엽 마커 발현의 증가로 이어졌다. 도 8 a-c는 a) 2% FBS + DMF12 + 100 ng/mL의 액티빈-A + 20 ng/mL의 WNT-3A, b) 2% FBS + DM-F12 + 100 ng/mL의 액티빈-A, c) 2% FBS + DM-F12 + 50 ng/mL의 IGF-I 중에 배양된 5 계대의 H9p54로부터 유래된 증가 세포의 형태를 나타낸 것이다. 액티빈-A 또는 액티빈-A + WNT3A의 존재 하에 배양된 세포의 형태는 2% FBS + IGF-I 중에 배양된 세포의 형태와 매우 비슷하면서도 뚜렷이 구별되었다.

실시예 8

완성 내배엽 단계로 분화되는 인간 배아 줄기 세포 유래 세포의 증가 잠재력

실시예 6에 기재된 방법에 따라 부모 인간 배아 줄기 세포주로부터 확립된 배양물을 성장 배지가 50 ng/mL의 IGF-I 또는 ITS를 함유하는 경우에는 매 4-5일마다 계대하였다. 그러나, IGF 또는 ITS 보충물이 결여된 성장 배지를 공급한 배양물은 더 느린 성장 속도를 나타내었으며, 매 5-7일마다 계대하였다. 성장 배지 + 50 ng/mL의 IGF-I가 공급된 세포의 집단 배가 시간은 대략 55 시간이었으며, 성장 배지만 공급한 배양물의 집단 배가 시간은 대략 75 시간이었다. 실시예 6에 따라 증가된 세포 집단은 EXPRES 세포 (증가가능한 전원시선 세포)로 언급될 것이다. 표 III은 실시예 6에 약술된 방법에 따라 확립된 다양한 EXPRES 세포를 열거한 것이다. 두 세포주 (EXPRES 01 및 02)의 증가 잠재력을 도 9에 도시하였다.

실시예 9

단일 인간 배아 줄기 세포의 현탁액으로부터의 EXPRES 세포의 유도

인간 배아 줄기 세포주 H1 P33 및 H9 P45로부터의 세포를 저산소 조건 (약 3% O₂) 하에 적어도 3회의 계대에서 배양하였다. 세포를 실시예 1에 따라, 8 ng/mL의 bFGF로 보충된 MEF-CM 중에 배양하고, MATRIGEL 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다. 약 60%의 컨플루언시에서, 배양물을 TrypLE™ Express 용액 (Invitrogen, CA)에 5분 동안 노출시켰다. 유리된 세포를 DMEM-F12 + 2% FBS 배지 중에 재현탁시키고, 원심분리하여 회수하고, 혈구계를 사용하여 계수하였다. 유리된 세포를 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS) 처리된 플라스크 상에 1000 내지 10,000개 세포/㎠로 씨딩하고, 표준 조직 배양 인큐베이터에서, 저산소 조건 (약 3% O₂) 하에, 37℃에서 DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL 액티빈-A + 20 ng/mL WNT-3A + 50 ng/mL의 IGF-I + 0.1 mM 메르캅토에탄올 (Invitrogen, CA) 및 비필수 아미노산 (Invitrogen (CA)으로부터의 1X, NEAA) 중에 배양하였다. TCPS 플라스크를 MATRIGEL 또는 다른 세포외 기질 단백질로 코팅하지 않았다. 배지를 매일 교환하였다. 첫번째 계대 세포를 P1로 언급하였다. 병행하여, 유사한 배양물을 정상산소 조건 (약 21% O₂) 하에서 확립하였다. 대기 조건 하에 확립된 배양물은 콜로니 형성이 야기되지 않았으며, 세포 증식이 낮았다. 그러나, 저산소 조건 하에 확립된 배양물은 많은 콜로니의 형성 (도 10)을 야기하였으며, 이는 MATRIGEL 또는 MEF 영양세포 상에 배양된 배아 줄기 세포 콜로니와 비슷하다. 이들 배양물은 ES 또는 DE 분화 중에 분리된 EXPRES 세포의 성질과 매우 비슷하였다.

실시예 10

EXPRES 세포에 의한 세포 표면 단백질의 발현

세포주 EXPRES 01 및 EXPRES 02를 다능성과 관련된 마커를 비롯한 다양한 세포 표면 마커의 발현에 대하여 평가하였다. EXPRES 01로부터의 세포를 9 내지 24 계대에서 평가하였다. EXPRES 02로부터의 세포를 7 내지 20 계대에서 평가하였다. 두 세포주는 전형적으로 미분화 인간 배아 줄기 세포에 할당된 다능성 마커의 강력한 발현을 나타내었다. 그러나 EXPRES 02 세포주는 EXPRES 01 세포주에 비해 CXCR4, LIF 수용체 및 NCAM과 같은 분화 마커의 더 높은 발현 퍼센트를 나타내었다. 대표적인 FACS 플롯 (plot)을 EXPRES 01 P24에 대한 것은 도 11에, EXPRES 02 P21 세포주에 대한 것은 도 12에 도시하였다. 표 IV는 3개의 상이한 실험으로부터의 평가된 세포 표면 마커의 범위 (괄호 내에)와 함께 평균 발현 수준을 열거한 것이다.

실시예 11

EXPRES 세포-면역 형광 (IF) 염색에 의한 다능성 관련 마커의 발현

EXPRES 01 및 02 세포 각각의 성장 배지에 유지시킨 EXPRES 01 및 02 세포를 실시예 3에 약술된 방법을 사용하여 다능성 관련 마커에 대하여 염색하였다. 도 13은 2% FBS + DM-F12 + 100 ng/mL 액티빈-A + 20 ng/mL WNT3A + 50 ng/mL IGF-I 중에 배양된 EXPRES 01 P10 세포에 대한 OCT-4, 나노그, SOX-2 및 HNF-3 베타의 IF 이미지를 도시한 것이다. 도 14는 2% FBS + DM-F12 + 100 ng/mL 액티빈-A + 20 ng/mL WNT3A 중에 배양된 9 계대의 EXPRES 02 세포에 대한 OCT-4, 나노그, SOX-2 및 HNF-3 베타의 IF 이미지를 도시한 것이다. EXPRES 01 세포는 OCT-4, 나노그 및 SOX-2에 대하여 강하게 양성으로 염색되었고, HNF-3 베타에 대하여는 약하게 염색되었다. 그러나, EXPRES 02 세포는 HNF-3 베타에 대하여 더 강한 발현을 나타내고 더 약한 OCT-4, 나노그 및 SOX-2의 발현을 나타내었다.

실시예 12

실시간 PCR에 의한 완성 내배엽 및 미분화 배아 줄기 세포 마커의 발현

각 성장 배지에서 배양된 11 계대의 EXPRES 01 세포주 및 7 계대의 EXPRES 02 세포주에 의해 발현되는 배아 마커 (POU5F1, SOX-2, UTF1, ZFP42, 커넥신43, 커넥신45, FOXD3), 배아외 마커 (AFP, KRT15), 외배엽 마커 (SOX-1, TUBB3, NESTIN), 내배엽 마커 (FOXA2, IPF1, KRT15, GATA-4) 및 중배엽 마커 (GATA-4, GATA-2, MYOD, MSX1, CFC1, ABCG2)의 실시간 PCR 분석을 도 15 a-h에 도시하였다. 모든 데이터를 MATRIGEL 코팅된 플레이트 상에서 MEF-CM 중에 배양된 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터의 미분화 세포에 대한 배수 변화로 정상화시켰다. 대조군으로서, EB 바디를 H9 세포로부터, 표준 콜라게나제 절단 방법을 사용하여, 약 10일 동안 DMEM-F12 + 20 % FBS 중에서 미처리 표면에 씨딩하여 형성하였다. 다양한 배층의 유전자 발현은 미분화 ES 세포에 비해 EB 바디에 의해 상향조절된다. 또다른 참조 RNA를 MEF-CM 중에서 MATRIGEL 상에 배양된 미분화 SA002 세포주 (Cellartis, Sweden)로부터 수집하였다. 예상된 바와 같이, 다양한 배층의 유전자 발현은 EXPRES 01, EXPRES 02, SA002 및 H9 세포주에 비하여 EB 바디에 의해 강력하게 상향조절되었다. EXPRES 01 및 02 세포주 둘 모두는 미분화 SA002 및 H9 세포주에 비해 FOXA2의 발현을 나타내었다. EXPRES 세포주 중의 어느 것도 배아외, 중배엽 또는 외배엽 마커의 강력한 발현을 가지지 않았다. 또한, EXPRES 세포에 의한 배아 마커의 발현은 SA002 및 H9 참조 세포주와 유사하였다.

실시예 13

EXPRES 세포의 증가에 유용한 다양한 성장 배지

EXPRES 세포를 하기의 배지 조성으로 적어도 계대 2-30 동안 성공적으로 배양하였다.

1. DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT-3A

2. DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT-3A + 50 ng/mL IGF-I

3. DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT-3A + 10 ng/mL IGF-I

4. DM-F12 + 2% FBS + 50 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT-3A + 50 ng/mL IGF-I

5. DM-F12 + 2% FBS + 50 ng/mL AA + 10 ng/mL WNT-3A + 50 ng/mL IGF-I

6. DM-F12 + 2% FBS + 50 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT-3A + 10 ng/mL IGF-I

7. DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL AA + 10 ng/mL WNT-3A + 10 ng/mL IGF-I

8. HEScGRO 규명 배지 (Chemicon, CA)

상기 열거된 배지의 기본 성분은 RPMI, DMEM, CRML, Knockout™ DMEM 및 F12와 같은 유사 배지로 교체될 수 있다.

실시예 14

조직 배양 기재 상에 배양된 EXPRES 세포의 완성 내배엽 (DE) 세포로의 분화

TCPS 상에서 그들 각각의 배지 중에 배양된 계대 5의 EXPRES 01 세포 및 계대 4의 EXPRES 02 세포를 0.5% FBS, 20 ng/mL WNT-3a 및 100 ng/mL 액티빈-A (R&D Systems, MN)로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시킨 후에, 2% FBS 및 100 ng/mL 액티빈-A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가로 3-5일 동안 처리하였다. 도 16은 EXPRES 01 세포 (도 16 a, 약 17% CXCR4 양성) 및 EXPRES 02 세포 (도 16b, 약 40% CXCR4 양성)에 대한 FACS에 의한 4일째의 CXCR4의 발현을 도시한 것이다. 도 17은 약 2-5일에 저혈청 + AA + WNT3A로 처리된 EXPRES 01 세포 (도 17a) 및 EXPRES 02 세포 (도 17b) 배양물에 대한 실시간 PCR 데이터를 나타낸 것이다. 도 18 및 19는 4일 동안 각각 상술된 바와 동일하게 처리된 EXPRES 01 및 02 세포의 면역형광 이미지를 도시한 것이다. 전체 EXPRES 02 세포는 EXPRES 01 세포에 비하여 더 강한 DE 마커의 발현을 나타내는 것으로 보인다. FACS, 면역 염색 및 PCR 데이터에 의해 증명된 바와 같이, 혈청 농도를 감소시키고 IGF를 제거하면 DE 마커의 발현이 증가된다. 그러나, CXCR4 및 HNF-3 베타와 같은 DE 마커의 총 발현 수준은 DE 단계로 분화되는 미분화 인간 ES 배양물에서 통상적으로 관찰되는 것보다 더 낮았다.

DE 마커의 발현을 증진시키기 위하여, DE 분화 프로토콜을 다음으로 바꾸었다: 각각의 그들의 배지에서 TCPS 상에 배양된 계대 19의 EXPRES 01 세포 및 계대 14의 EXPRES 02 세포를 0.5% FBS, 20 ng/mL WNT-3a, 100 ng/mL activin-A 및 100 nM GSK-3B 억제제 IX (카탈로그 번호 361550, Calbiochem, CA)로 보충된 DMEM/F12 배지에 4일 내지 5일 동안 노출시켰다. 도 20은 EXPRES 01 (도 20 a, 약 57% CXCR4 양성) 및 EXPRES 02 (도 20b, 약 86% CXCR4 양성)에 대한 4일째의 CXCR4의 발현을 FACS에 의해 도시한 것이다. 도 21은 DE 단계로 분화되는 EXPRES 01 세포 (패널 a-f) 및 EXPRES 02 세포 (패널 g-l)에 대한 5일째의 상응하는 면역 형광 이미지를 도시한 것이다. 도 22는 EXPRES 01 (도 22a) 및 EXPRES 02 (도 22b)에 대한 실시간 PCR 데이터를 나타낸 것이다.

실시예 15

EXPRES 01 세포의 DE로의 분화에서 씨딩 밀도의 영향

EXPRES 01 P31 세포를 표준 조직 배양 인큐베이터에서, 37℃에서 저산소 조건 (약 3% O₂) 하에, TCPS 플레이트 상에 DM-F12 + 2% FBS + 0.1 mM 메르캅토에탄올 + 1X, NEAA + 100 ng/mL 액티빈-A + 20 ng/mL WNT3A 중에 5000, 10000, 20000, 또는 40000개 세포/㎠로 씨딩하였다. 씨딩 후 2일에, 표준 조직 배양 인큐베이터에서 37℃에서, 저산소 조건 (약 3% O₂)하에 4일 동안 배지를 DMEM-F12 + 0.5% FBS + 100 ng/mL 액티빈-A + 20 ng/mL WNT3A + 100 nM GSK-3B 억제제 IX로 바꾸었다. 도 23은 분화 4일째에 완성 내배엽 마커의 실시간 PCR 분석을 도시한 것이다. 적어도 10000-20000개 세포/㎠의 씨딩 밀도가 완성 내배엽의 왕성한 형성에 필요한 것으로 보인다.

실시예 16

EXPRES 세포의 말단소체 길이

인간 배아 줄기 세포주 H1으로부터의 미분화 세포와 함께, 실시예 5에 따라 분리된 2개의 EXPRES 세포주의 말단소체 길이를 Telo TAGGG Telomere Length Assay (Roche, IN)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 분석하였다. 도 24는 척도 마커와 함께, P24에서의 EXPRES 01 세포, P17에서의 EXPRES 02 세포, P40에서의 H1 세포, 키트에 의해 제공되는 높은 말단소체 대조군 및 낮은 말단소체 대조군에 대한 말단소체 길이를 도시한 것이다. 두 선은 모두 미분화 ES 세포보다 더 짧은 길이의 말단소체를 가지는 것으로 나타났다.

실시예 17

조직 배양 기재 상에 배양된 EXPRES 세포의 췌장 내배엽으로의 추가 분화

계대 21의 EXPRES 01 세포를 0.5% FBS, DMEM:F12 배지 중의 100 ng/mL 액티빈-A, 10 ng/mL의 Wnt3a 및 100 nM GSK3베타 억제제 IX로 처리함으로써 5일 분화를 수행하였다. 세포를 FACS로 분석하였으며, 세포의 80%가 CXCR4에 대하여 양성인 것으로 나타났다. 그 다음, 세포를 하기의 단계 각각으로 3일 동안 처리하였다: 50ng/mL FGF-10 및 0.25μM KAAD-사이클로파민 (Calbiochem, CA)을 함유하는 2%FBS DMEM:F12; 이어서, 50 ng/mL FGF-10, 0.25μM KAAD-사이클로파민 및 1μM 레틴산 (Sigma, MO)을 함유하는 저 글루코스 1%B27 DMEM; 이어서, 1μM DAPT (Calbiochem, CA) + 50 ng/mL 엑센딘4 (Sigma, MO)를 함유하는 저 글루코스 1%B27 DMEM; 및 마지막으로 이어서 각각 50ng/mL의 IGF, HGF 및 엑센딘4를 함유하는 1% B27 DMEM CMRL. 샘플을 각 단계의 마지막에 취하고, RNA를 세포에 대해 추출하였다. Q-RT PCR을 나타낸 마커에 대하여 수행하였다. 도 25에 도시한 바와 같이, 인슐린 수준은 미처리 세포에 대하여 100배 증가하였으며, PDX-1 수준도 또한 1000배 증가하였다.

실시예 18

조직 배양 기재 상에 배양된 EXPRES 세포의 전장 내배엽으로의 추가의 분화

계대 35의 EXPRES01 세포를 0.5% FBS, DMEM:F12 배지 중의 100 ng/mL 액티빈-A, 20 ng/mL의 Wnt3a 및 100 nM GSK3베타 억제제 IX로 처리함으로써 5일의 분화를 수행하였다. 세포를 FACS로 분석하였으며, 세포의 약 70%가 CXCR4에 대하여 양성인 것으로 나타났다. 그 다음, 세포를 하기의 단계 각각으로 처리하였다: 3일 동안, 50ng/mL FGF-10 및 0.25μM KAAD-사이클로파민 (Calbiochem, CA)을 함유하는 2%FBS DMEM:F12; 단계 3, 4일 동안, 50 ng/mL FGF-10, 0.25μM KAAD-사이클로파민 및 1μM 레틴산 (Sigma, MO)을 함유하는 저 글루코스 1%B27 DMEM; 및 단계 4, 4일 동안, 1μM DAPT (Calbiochem, CA) + 50 ng/mL 엑센딘4 (Sigma, MO)를 함유하는 저 글루코스 1%B27 DMEM. 이 프로토콜은 드'아무르 등 (문헌[Nature Biotech, 24, 1392, 2006])에 의한 이전의 개시물을 기초로 하였다. 단계 4의 마지막에 세포를 고정하고, PDX-1, HNF-3 베타, SOX-17, 알부민, 항-트립신 및 CDX-2에 대하여 염색하였다. 도 26에 도시된 바와 같이, EXPRES 세포는 PDX-1 (배양물의 약 20%가 양성으로 염색), HNF-3 베타 (약 90% 양성), 알부민 (약 5% 양성), 항-1-트립신 (약 70% 양성), SOX-17 (약 70%) 및 CDX-2 (약 5% 양성)의 발현으로 측정되는 바와 같이 전장 내배엽으로 용이하게 분화될 수 있다.

실시예 19

미분화 인간 배아 줄기 세포에 대한 EXPRES 세포의 마이크로어레이 분석

전체 RNA를 RNeasy mini 키트 (Qiagen)를 사용하여 계대 44의 인간 배아 줄기 세포주 H9, EXPRES 01 P11 및 EXPRES 02 P7의 배양물로부터 분리하였다: 모든 군은 세 가지 생물학적 반복을 포함하였으며 각 생물학적 반복은 두 가지 별도의 유전자 칩 상에서 반복되었다. 샘플 준비, 혼성화 및 이미지 분석은 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array에 따라 실시하였다. 정상화 및 로그 환산 후, 데이터 분석을 OmniViz® 소프트웨어 (MA) 및 GENESIFTER (VizXLabs, WA)를 이용하여 실시하였다. 샘플들 사이에서 유전자 발현의 유의한 차이를 변이의 분석 및 0.05 이하의 조정된 P-값 (벤자미니 및 호치버그 보정)을 이용한 F-검정을 이용하여 평가하였다. 적어도 하나의 군에서 프레즌트 콜 (present call)을 가진 유전자만을 분석에 포함시켰다. 표 V는 각 유전자에 대한 조정된 P-값과 함께, 군들 (미분화 ES, EXPRES 01 및 EXPRES 02 세포) 사이에 적어도 5배 차이를 나타내는 유전자의 정상화되고 로그-환산된 평균 신호 세기를 열거한 것이다. 원시선 또는 완성 내배엽을 나타내는 유전자는 굵은 체로 강조하였다. 상향조절되거나 하향 조절되는 오직 상위 200개의 유전자를 표 V에 나타내었다.

실시예 20

DE 단계로 분화된 인간 배아 줄기 세포에 대한 DE 단계로 분화된 EXPRES 세포의 마이크로어레이 분석

전체 RNA를 RNeasy mini 키트 (Qiagen)를 사용하여 다음의 배양물로부터 분리하였다: A) MATRIGEL-코팅된 플레이트 (1:30 희석) 상에서 배양되고 0.5% FBS 및 100 ng/mL 액티빈-A 및 20 ng/mL의 wnt3A로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출된 후 2% FBS 및 100 ng/mL 액티빈-A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리된 H9P33 세포; B) TCPS 상에서 배양되고, 0.5% FBS, 100 ng/mL 액티빈-A, 20 ng/mL의 WNT3A 및 100 nm GSK-3B IX 억제제 (카달로그 번호 361550, Calbiochem, CA)로 보충된 DMEM/01F12 배지에 5일 동안 노출된 EXPRES 01 P24 세포, C) TCPS 상에서 배양되고, 0.5% FBS, 100 ng/mL 액티빈-A, 20 ng/mL의 WNT3A 및 100 nm GSK-3B IX 억제제 (카달로그 번호 361550, Calbiochem, CA)로 보충된 DMEM/F12에 5일 동안 노출된 EXPRES02 P17 세포, D) MATRIGEL-코팅된 플레이트 (1:30 희석) 상에서 배양되고 0.5% FBS 및 100 ng/mL 액티빈-A 및 20 ng/mL의 wnt3A로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출되고 이어서 2% FBS 및 100 ng/mL 액티빈-A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 2일 동안 노출된 H9P39 세포. RNA 샘플을 2시간, 6시간, 24시간, 30시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 그룹 D로부터 수집하였다. EXPRES 01 및 02 각각의 성장 배지에서 배양된 EXPRES 01 및 02도 또한 대조군으로서 포함시켰다. 모든 군은 세 가지 생물학적 반복을 포함하였으며 각 생물학적 반복은 두 가지 별도의 유전자 칩 상에서 반복되었다.

샘플 준비, 혼성화 및 이미지 분석은 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array에 따라 실시하였다. 정상화 및 로그 환산 후, 데이터 분석을 OmniViz® 소프트웨어 (MA) 및 GENESIFTER (VizXLabs, WA)를 이용하여 실시하였다. 샘플들 사이에서 유전자 발현의 유의한 차이를 변이의 분석 및 0.05 이하의 조정된 P-값(벤자미니 및 호치버그 보정)을 이용한 F-검정을 이용하여 평가하였다. 적어도 하나의 군에서 프레즌트 콜을 가진 유전자만을 분석에 포함시켰다. 표 VI는 각 유전자에 있어서 조정된 P-값과 함께 다양한 시간에서 A 군, B 군, C 군 및 D 군 사이에 적어도 5배 차이를 나타내는 유전자의 정상화되고 로그-환산된 평균 신호 세기를 열거한 것이다. 상향조절되거나 하향 조적되는 오직 상위 200개의 유전자를 표 VI에 나타내었다. 원시선 또는 완성 내배엽을 나타내는 유전자는 굵은 체로 강조하였다. 표 VII은 각 비교 군에 대한 보정 계수를 열거한 것이다. 보정 게수에 상당하는 산포도를 도 27에 도시하였다. EXPRES 01 세포의 전반적인 발현 프로필은 30시간 이하의 DE 단계에서의 샘플의 발현 프로필과 유사한 것으로 보이며, EXPRES 02 세포는 48시간 초과의 DE 단계에서의 샘플의 발현 프로필과 유사한 것으로 보인다.

실시예 21

배양체 바디의 형성 및 다양한 계통으로의 분화

계대 27의 EXPRES 01 배양물을 TrypLE™ Express 용액을 사용하여 단일 세포로서 제거하고, 200g에서 4분 동안 회전시키고, DMEM-F12 + 20% FBS 중에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 부착력이 낮은 페트리 디쉬 상에 씨딩하였다. 씨딩 후 3-4일에, 배양체 바디 (EB) 유사 구조가 형성되었다 (도 28). 배양물의 DMEM-F12 + 2% FBS + 1 마이크로몰 레틴산으로의 처리는 NeuroD와 같은 외배엽 마커의 발현을 유도하였다.

실시예 22

NOD- SCID 마우스의 신장 피막에서의 기형종 형성

42 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터의 미분화 세포, EXSPRES 01 계대 30 및 EXPRES 02 P22 세포를 TRYPLE를 사용하여 배양물로부터 유리시킨 다음, DMEM-F12 기초 배지 중에 현탁시켰다. 약 1x10⁶의 미분화 H9 P42, 150만의 EXPRES 01 및 02 세포를 6주령의 NOD-SCID 마우스의 신장 피막에 주사하였다. 이식 5주 후에, 동물을 희생시키고; 신장을 절개하고, 포르말린에서 고정시키고, 용해 완충액에 넣고, 이후의 PCR 분석을 위하여 RNA를 수집하였다. 도 29는 수집된 샘플에 대한 중배엽, 외배엽, 내배엽, 배아외 내장 내배엽의 특징을 나타내는 마커 및 다능성 마커의 발현을 도시한 것이다. H9 세포주와 유사하게, 두 EXPRES 세포주는 배아외 내배엽과 함께 모든 배층의 강력한 발현을 나타내었다.

실시예 23

EXPRES 03 세포의 증식 및 세포 주기 분석

인간 배아 줄기 세포는 다른 체세포와 구별되는 독특한 세포 주기 상태를 가지며, 세포의 높은 비율의 S-단계 및 단축되거나 감소된 Gap 단계를 특징으로 한다. hES 세포에서의 세포 주기 조절 메카니즘은 이들의 자가-재생 및 이들 세포의 다능성 능력과 기능적으로 연결될 수 있으며, 이들의 분화/결정된 대응물의 조절 메카니즘과 다를 수 있다. 이들 실험은 다능성 hES 세포의 많은 마커를 발현하는 것으로 나타난 EXPRES 세포의 세포 주기 성질을 결정하기 위하여 설계하였다.

방법: 세포를 세포 결합 조직 배양 플라스크 (Cell Bind tissue culture flasks) (Corning)에 5,000-10,000개 세포 /㎠로 씨딩하고, 2-4일 동안 배양하였다. EXPRES 03 세포를 DMEM/F12 중의 2% FBS 및 액티빈-A (100 ng/mL), wnt3a (10-20 ng/mL) 및 IGF (50 ng/mL)를 함유하는 성장 배지 중에서 배양하였다. 증식 비교 분석을 위하여, IGF를 때때로 성장 인자 칵테일로부터 생략하였다. 세포 증식을 제조자의 지침서에 따라 APC BRDU Flow 키트를 사용하여 분석하였다 (BD Biosciences, San Diego, CA). 요약하면, 세포를 배양 기간의 마지막에 BRDU를 사용하여 1-2시간 동안 펄싱 (pulsed)하고, Tryple E Express를 사용하여 유리시키고, 계수하였다. 세포를 BD Cytofix/Cytosperm 완충액으로 고정시키고, 30분 동안 인큐베이션한 다음, BD Cytoperm 완충액과 함께 얼음에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 DNAse로 37℃에서 1시간 동안 처리하여, 도입된 BRDU를 노출시키고, 이어서 APC 컨쥬게이션된 항-BRDU 항체로 염색하였다. 세포 주기 분석을 위하여, 세포를 7AAD로 염색하고, FACS Array에서 분석하였다.

결과: 고도로 hES 세포와 유사하게, EXPRES 03 세포는 배양물 중에 BRDU를 도입하기 위한 이들의 능력에 의해 결정된 높은 퍼센트의 S-단계 세포에 의해 나타난 바와 같이, 고도의 증식 속도를 보유하였다. S-단계 세포의 빈도는 hES 세포와 유사하게 전형적으로 45% (범위 40-60%)보다 컸다 (도 30 a-c). IGF의 존재 하에 배양된 EXPRES 03 세포의 수가 IGF의 부재 하에 3-4일 후에 성장된 세포 수의 2-3배이지만, 세포를 1시간 이상 동안 BRDU에 노출시키는 경우 세포의 S-단계의 빈도에는 오직 근소한 차이만이 있었다. 세포의 S-단계의 높은 빈도 및 세포 주기 구조는 인간 양수 세포 (AFDX002)에 대하여 여기 나타낸 바와 같이 체세포에서 관찰되는 것과 다르다 (도 30 d). 또한, 미토마이신 처리된 세포 마우스 배아 섬유아세포 (MEF, 도 30 e)는 S-단계에 이르지 않으나, G2/M 단계 (64%)의 명백한 축적을 나타내며, 이는 미토마이신 처리된 세포가 유사분열 시에 DNA 가닥을 분리하지 못하는 것과 관련될 수 있다.

실시예 24

ES 세포 대 EXPRES 세포의 트랜스펙션 효능

hES의 유전자 조작의 주요한 한계는 통상적인 트랜스펙션 방법 및 바이러스 형질도입에 대한 이들의 상대적 저항성이다. EXPRES 세포는 이들의 빠른 증식 속도 외에, 시험관 내에서 쉽게 트랜스펙션된다. 트랜스펙션 효능을 비교하기 위하여, 배양 중의 EXPRES 및 hES 세포를 EGFP로 트랜스펙션시키고, 형광 현미경 및 유세포 분석 방법으로 분석하였다.

방법: EXPRES 01 세포를 DMEM/F12 중의 2% FBS, 액티빈-A (100 ng/mL), wnt3a (10-20 ng/mL) 및 IGF (50 ng/mL)를 포함하는 성장 배지에서, 인간 피브로넥틴 코팅된 (10ug/mL) 6 웰 조직 배양 플레이트 상에 씨딩하였다. 세포 무리를 위하여, hES 세포를 콜라게나제를 사용하여 통상의 방법에 의해 MATRIGEL 코팅된 6 웰 배양 플레이트에 계대하고, MEF 조절된 hES 배지 중에서 성장시켰다. 단일의 세포를 위하여, hES 세포를 37℃에서 TRYPLE에 3분 동안 노출시키고, 이어서 MATRIGEL 코팅된 6 웰 배양 플레이트에 플레이팅함으로써 세포를 계대하였다. 세포가 원하는 컨플루언시에 도달할 때 (70-80%), 세포를 제조자의 지침서에 따라 Lipofectamine 2000으로 트랜스펙션시켰다 (Invitrogen, Carlsbad, CA). 요약하면, 4 ㎍의 DNA를 250 ㎕ Opti-MEM I Reduced 혈청 배지로 희석시켰다. 5 마이크로리터의 Lipofectamine 200을 총 250 ㎕ Opti-MEM I 배지에 5분 동안 혼합하고, 희석된 DNA와 서서히 혼합하였다. 실온에서 20분 동안 DNA/Lipofectamine 복합체가 형성되도록 한 다음, 서서히 혼합시키기 위하여 플레이트를 서서히 스월링 (swirling)시키면서 각 웰에 가하였다. 세포를 복합체의 존재 하에서 또다른 24 시간 동안 인큐베이션하고 이어서 배지를 완전히 교환하였다. 세포를 트랜스펙션 후 48 시간에 형광 현미경 및 유세포 분석기에 의해 분석하였다.

결과: eGFP의 흡수 및 발현을 단일 세포 분산물 또는 세포 무리로 플레이팅된 EXPRES 01 세포 및 hES 세포의 트랜스펙션에 의해 비교하고, 48 시간 이후에 분석하였다. EXPRES 01 세포는 유세포 분석에 의하여 eGFP를 발현하는 세포가 75%로, 가장 높은 수준의 eGFP 단백질 발현을 나타내었다 (도 31). 반면, hES는 세포 무리가 사용되는 경우, FACS에 의하여, eGFP 단백질을 발현하는 세포가 오직 3%로, 트랜스펙션에 더 저항성이 있었다. hES의 단일 세포 분산물을 제조하면, DNA 흡수 및 eGFP 발현의 수준이 약 20%로 증가되었으나, 여전히 EXPRES 01 세포에서의 발현보다 약 3배 더 적었다.

실시예 25

스크리닝을 위한 다용도 도구로서의 EXPRES 세포

EXPRES 세포를 2% FBS, 100ng/mL 재조합 인간 액티빈-A (R&D Systems) 및 20ng/mL 재조합 마우스 Wnt3a (R&D Systems)를 함유하는 DMEM:F12 배지에서 생장시켰다. EXPRES 01 세포를 위한 성장 배지는 또한 50ng/mL 재조합 인간 IGF-1 (R&D Systems)을 함유하였다. 두 세포주는 모두 통상적으로 37℃에서, 낮은 산소 (3%) 및 5% CO₂ 분위기에 생장시켰다. EXPRES 01 및 EXPRES 02 세포를 TrypLE 효소 분해 (Invitrogen, CA)를 사용하여 단일 세포 현탁액으로서 배양물로부터 유리시킨 다음, 세척하고 계수하여 정확한 세포수 및 생존력을 결정하였다(>95%). 1,250 내지 80,000개 세포 범위의 분취물을 96-웰 플레이트 (Corning-Costar)의 인간 피브로넥틴 코팅된 웰에 100 ㎕ 배양 배지의 최종 부피 중으로 분배하였다. 대조군 웰도 또한 피브로넥틴-코팅하였으며, 세포 없이 동등 부피의 배양 배지를 함유하였다. 플레이트를 가습된 챔버에서 표준 낮은 산소, 5% CO₂하에 37℃에서 밤새 평형화되게 하였다. 이 시간 중에, 세포는 초기 씨딩 밀도에 따라 다양한 컨플루언시 정도로 단층 배양물로서 부착된다. 밤새 배양 후에, 20㎕의 MTS 시약 (CellTiter 96 Aqueous Assay; Promega)을 각 웰에 가하였다. MTS는 포르마잔으로 바꾸고, 살아있는 세포의 수에 정비례하는 데하이드로게나제 효소 활성의 척도로 사용될 수 있다. 하나의 플레이트를 저산소 배양으로 전환시키고, 동일한 병행의 플레이트를 정상 산소 (20%)에서 인큐베이션시켰다. 4시간 후에, 분광광도계 플레이트 판독기 (Molecular Devices)로 490nm에서 흡광도를 판독하였다. 평균 OD, 표준 분포 및 변이 계수 퍼센트 (CV)에 대한 통계적 계산을 각 플레이트 내의 중복 샘플 세트에 대하여 결정한 다음, 두 플레이트들 사이의 유사한 웰과 비교하였다.

표준 분포 및 변이계수 퍼센트 값은 EXPRES 세포가 높은 플레이팅 효율 및 훌륭한 웰-대-웰 재현성을 가지고, 웰 사이에 고르게 분배될 수 있다는 것을 나타낸다 (표 VIII a-f). 동등한 수의 세포에 대한 평균 OD₄₉₀ 판독치로 관찰되는 바와 같이, EXPRES 01 세포주는 EXPRES 02 세포주보다 더 큰 대사 활성을 가졌다. 각 EXPRES 세포주에 대하여, 두 플레이트들 간의 CV 퍼센트 값은 이 단기간 분석 중에 분위기 산소 수준과 관계없이 병행 조건에 대하여 대사 활성에 차이가 없는 것을 암시하였다. 이 분석법에 대한 선형 범위 내의 웰당 최적의 세포수는 평균 OD 판독치를 그래프로 나타냄으로써 결정하였다 (도 32): EXPRES 01에 대하여 20,000개 세포/웰 미만 및 EXPRES 02에 대하여 40,000개 세포 미만. 다시, 산소 수준의 분위기 차이는 이러한 단기간 분석법에서 최적의 세포수 결과에 영향을 미치지 않았다. 이들 결과는 EXPRES 세포가 세포 증식 및/또는 대사 속도에서의 다양한 제제의 독성 효과를 측정할 수 있는 프로토콜을 스크리닝할 수 있음을 암시한다.

실시예 26

EXPRES 세포로부터 유래된 DE-유사 세포의 증가

이전의 실시예들은 EXPRES 세포가 배아 줄기 세포로부터 유래될 수 있으며, 다양한 성장 배지 중에, TCPS 상에서 용이하게 증가될 수 있음을 입증하였다. 이들 배지 제제의 대부분은 보충물로서 IGF 또는 성장 배지에 사용되는 2% FBS 중의 인슐린/IGF를 함유한다. 이들 인자는 PI-3 키나제 경로를 통하여 DE 관련 유전자를 억제하는 것으로 나타났다 (문헌[Stem cells, 25:29-38, 2007]). 대안적인 배지는 DM-F12 + 0.5% FBS + 100 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT3A + 100 nM GSK-3B 억제제 IX (또한 "DE 세포용 성장 배지"로도 언급)에 기초하여 제제화하였다. 상기 배지에서 배양된 계대 27에서의 EXPRES 01 세포는 DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL AA + 20 ng/mL WNT3A + 50 ng/mL IGF-I에서 배양된 세포와 동일한 속도로 증식할 수 있다. 또한, DE 세포용 성장 배지에서 배양된 세포는 3 계대를 통해 실시간 PCR (도 33)에 의하여 강한 DE 마커를 발현하였다. 약 72%의 세포가 CXCR4를 발현하였다 (도 34).

실시예 27

EXPRES 세포에서의 표적 유전자의 siRNA 낙다운

siRNA를 사용한 인간 배아 줄기 세포에서 표적 유전자의 효율적인 낙다운은 무리 콜로니로서 성장하는 인간 배아 줄기 세포에서의 높은 수준의 트랜스펙션을 달성하는 능력에 의해 엄하게 제한된다. EXPRES 세포는 통상을 방법을 사용하여 siRNA로 쉽게 트랜스펙션됨에 따라, siRNA 올리고 서열을 스크리닝할 뿐 아니라 표적 유전자에 의해 수행되는 역할을 평가하기 위한 가치있는 시스템을 제공한다.

방법: EXPRES 03 세포를 DMEM/F12 중의 2% FBS, 액티빈-A (100 ng/mL), wnt3a (10-20 ng/mL) 및 IGF (50 ng/mL)를 포함하는 성장 배지 중에서, 피브로넥틴 코팅된 (10㎍/mL) 6 웰 조직 배양 플레이트에 씨딩하였다. 6 웰 플레이트에 대하여, siRNA 올리고 서열로 트랜스펙션하기 24시간 전에 200,000개 세포를 씨딩하였다.

표적 유전자 낙다운을 평가하기 위하여, 70-80% 컨플루언시 세포에서의 세포를 제조자의 지침서 (Ambion (Applied Biosystems), Foster City, CA)에 따라 Lipofectamine 2000을 사용하여 트랜스펙션하였다. 요약하면, 적절한 양의 siRNA를 250 ㎕ Opti-MEM I Reduced 혈청 배지로 희석하여, 100 nmol의 총 농도를 달성하였다. 5 마이크로리터의 Lipofectamine 2000을 250 ㎕ Opti-MEM I 배지로 희석하고, 5분 동안 인큐베이션하였다. 복합체를 실온에서 15-20분 동안 인큐베이션한 다음, 세포에 가하고 서서히 혼합시키기 위하여 플레이트를 서서히 스월링시켰다. 세포를 siRNA의 존재 하에 다시 24시간 동안 인큐베이션한 다음, 배지를 완전히 교환하였다. 세포를 트랜스펙션 24-48시간 후에 형광 현미경으로 가시화시키고, RNA를 정량 RT-PCR 방법에 의한 표적 유전자 낙다운의 분석을 위해 수집하였다. Ambion으로부터 구매한 다음의 예비-입증된 siRNA 올리고 서열을 시험하였다: 베타-카테닌 (식별 번호 42816) 및 GSK3b (식별 번호 42839).

결과: 형광 현미경으로 형광 표지된 siRNA를 사용한 경우, EXPRES 세포에 의한 매우 높은 수준의 siRNA 흡수가 나타났다 (>80%) (도 35). 세포로부터 수집된 RNA를 표적 유전자 낙다운에 대하여 PCR로 분석하고 대조군 siRNA 올리고 트랜스펙션된 세포와 비교하였다. 베타-카테닌 및 GSK3b siRNA 올리고는 EXPRES 세포에서 93% 초과의 유전자 낙다운으로, 매우 높은 수준의 유전자 낙다운을 달성하였다. Hes-1, Oct-4와 같은 다른 유전자 표적에 대한 다른 미입증된 올리고 서열은 더 낮고 가변적인 표적 유전자 낙다운을 달성하였다. 올리고 서열의 특이성은 다른 유전자 전사물의 분석에 의해 입증하였으며, 이는 어떤 감지할 수 있는 낙다운도 나타내지 않았다.

실시예 28

EXPRES 01 및 02 세포주에 대한 사이토카인 항체 어레이 분석

22 및 23 계대에서의 EXPRES 01 및 02 세포주를 이들의 각각의 배지에서 각각 약 70% 컨플루언시로 생장시킨 다음, 포유류 세포 용해 키트 (Sigma-Aldrich, MO)를 사용하여 세포 용해물을 수집하였다. 사이토카인 어레이 분석은 RayBiotech, GA (http://www.raybiotech.com/)에 의해 제공된 사이토카인 어레이 패널을 이용하여 완료하였다. 표 IX a-c는 데이터의 정상화 및 백그라운드 차감 후에 사이토카인, 사이토카인 및 성장 인자 수용체 발현을 열거한 것이다. 각 패널에 있어서, 양성 및 음성 대조군이 또한 포함된다. 패널을 세포 유형당 2개의 상이한 샘플에 대하여 진행하였다.

실시예 29

핵형 분석

20 계대의 EXPRES 01 세포 및 15 계대의 EXPRES 02 세포의 핵형을 G-밴드 분석으로 결정하였다. EXPRES 01로부터 21개의 G-밴드형 세포 및 EXPRES 02으로부터 20개의 G-밴드형 세포에서 세포유전자 분석을 수행하였다. G-밴드형 EXPRES 01 세포의 절반은 정상 46XX 핵형을 나타내었으나, 나머지는 삼염색체 17과 같은 비정상 핵형을 나타내었다. EXPRES 02 세포주도 또한 거의 모든 염색체 1 쇼트-암 (short-arm)의 중복과 함께 염색체 재배열을 나타내었다.

실시예 30

Rho- 키나제 (ROCK) 억제제의 존재 하에 단일 인간 배아 줄기 세포의 현탁액으로부터의 EXPRES 세포의 유도

계대 35 세포주의 인간 배아 줄기 세포주 H9로부터의 세포를 저산소 조건 (약 3% O₂) 하에 적어도 3회의 계대 동안 배양하였다. 세포를 실시예 1에 따라, 8 ng/mL의 bFGF로 보충된 MEF-CM 중에 배양하고, MATRIGEL 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다. 약 60%의 컨플루언시에서, 배양물을 TrypLE™ Express 용액 (Invitrogen, CA)에 5분 동안 노출시켰다. 유리된 세포를 DMEM-F12 + 2% FBS 배지 중에 재현탁시키고, 원심분리하여 회수하고, 혈구계를 사용하여 계수하였다. 유리된 세포를 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS) 플라스크 상에 1000 내지 10,000개 세포/㎠로 씨딩하고, 표준 조직 배양 인큐베이터에서, 저산소 (약 3% O₂) 하에, 37 ℃에서 DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL 액티빈-A + 20 ng/mL WNT-3A + 50 ng/mL의 IGF-I + 0.1 mM 메르캅토에탄올 (Invitrogen, CA) 및 비필수 아미노산 (Invitrogen (CA)으로부터의 1X, NEAA) +/- 10 μM ROCK 억제제 (Y-27632, Calbiochem, CA) 중에 배양하였다. TCPS 플라스크를 MATRIGEL 또는 다른 세포외 기질 단백질로 코팅하지 않았다. 배지를 매일 교환하였다. 첫번째 계대 세포를 P1으로 언급하였다. 도 37에 나타낸 바와 같이, 씨딩 후 24시간에, ROCK 억제제의 첨가는 ROCK 억제제의 부재 하에 유도된 배양물에 비해 상당히 더 큰 수의 부착 세포를 야기하였다. ROCK 억제제, Y27632를 사용하여 유도된 EXPRES 세포를 EXPRES 15로 표기하였다.

실시예 31

핵형 분석

계대 5 및 21에서의 EXPRES 15 세포의 핵형을 G-밴드 분석으로 결정하였다. EXPRES 15로부터의 21개의 G-밴드형 세포에서 세포유전자 분석을 수행하였으며, 모든 세포가 정상 46XX 핵형을 나타내었다 (도 38). 염색체 12 및 17의 FISH 분석으로, 모든 세포가 염색체 12 상에 위치하는 ETV6 BAP (TEL) 유전자에 대하여 정상 신호 패턴을 보이며, 모든 세포가 염색체 17 상의 Her2/neu 유전자 및 17 동원체에 대하여 정상 신호 패턴을 보임이 나타났다.

실시예 32

EXPRES 세포는 IGF , WNT3A , 액티빈 -A 및 GSK -3B 억제제의 많은 농도를 함유하는 배지 내에서 유지될 수 있다

EXPRES 11 세포는 2% FBS, 100ng/mL 액티빈-A, 20ng/mL Wnt3a 및 50ng/mL IGF를 함유하는 DMEM/F12 (Invitrogen) 중에 생장시켰다. 80% 컨플루언시에, 세포를 TrypLE Express (Invitrogen)를 사용하여 2% FBS를 함유하는 DMEM/F12 중에 4000개 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트로 옮겼다. 50 내지 100ng/mL 범위의 액티빈-A, 10 내지 20ng/mL 범위의 Wnt3a, 10 내지 50ng/mL 범위의 IGF 및 50 내지 100 nM의 GSK-3B 억제제 (IX)를 첨가하기 전에, 세포가 37℃, 5% CO2로 유지된 가습 인큐베이터내에서 1시간 동안 기재에 부착되도록 하였다. 24, 48 및 96 시간에, 세포 생존력을 CellTiter® 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)를 사용하여 결정하였다. 요약하면, MTS 시약을 96-웰 플레이트에 가하고, 세포와 함께 1-4 시간 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트 판독기에서 490㎚에서의 흡광도를 판독하였다. 흡광도 판독치는 살아있는 세포의 수에 정비례한다. 도 39 a-c는 씨딩 후 a) 24 시간, b) 48 시간 및 c) 96 시간에서의 흡광도 판독치를 나타낸 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양이 실시예와 바람직한 실시형태를 참고로 하여 상기에서 예시되었지만, 본 발명의 범주는 전술한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 의해서가 아니라 특허법의 원리 하에서 적절하게 해석되는 하기 특허청구범위에 의해 규정됨이 이해될 것이다.

[표 IA]

[표 IB]

[표 II]

[표 III]

[표 IV]

[표 V]

[표 VI]

[표 VII]

[표 VIII]

[표 IX]

SEQUENCE LISTING <110> Rezania, Alireza <120> PLURIPOTENT CELLS <130> CEN5217USNP <140> 12/108,872 <141> 2008-04-24 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC CONSTRUCT <400> 1 tggcgcagca gatacca 17 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC CONSTRUCT <400> 2 agcgccttcc acgacttg 18 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC CONSTRUCT <400> 3 ccagcatctt gctcaactcg gcg 23

Claims

(a) 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 혈청, 액티빈 A 및 Wnt 리간드로 보충된 배지에서 1% 내지 5% O₂에서 배양함으로써 세포를 증식하는 단계; 및
(b) 단계 (a)의 세포를 췌장 내배엽 계통 세포로 분화시키는 단계를 포함하며,
여기서 췌장 내배엽 계통 세포는 췌장 전장 내배엽 세포 또는 췌장 내배엽 세포이고, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 SOX-17, GATA-4, HNF-3 베타, GSC, Cer1, 노달, FGF8, 브라큐리, Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF4, CD48, EOMES, DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-kit, CD99 또는 OTX2 중 적어도 하나를 발현하는 것인, 췌장 내배엽 계통 세포를 생성하는 방법.
제1항에 있어서, Wnt 리간드가 Wnt-3A인, 방법.
제1항에 있어서, 배지가 GSK-3B 억제제로 추가로 보충되는, 방법.
삭제
제1항에 있어서, 세포가 3% O₂에서 배양되는, 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b)가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민으로 처리하고, 이어서 세포를 레틴산 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지 내에서 배양하는 것을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 췌장 내배엽 계통 세포는 췌장 전장 내배엽 세포이고, 상기 방법이:
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 FGF-10 및 KAAD-사이클로파민으로 보충된 배지 내에서 배양하는 단계;
이어서 세포를 FGF-10, KAAD-사이클로파민 및 레틴산으로 보충된 배지 내에서 배양하는 단계; 및
이어서 세포를 DAPT 및 엑센딘 4로 보충된 배지 내에서 배양하여 췌장 내배엽 세포를 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 췌장 내배엽 계통 세포는 췌장 내배엽 세포이고, 상기 방법이:
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 FGF-10 및 KAAD-사이클로파민으로 보충된 배지 내에서 배양하는 단계;
이어서 세포를 FGF-10, KAAD-사이클로파민 및 레틴산으로 보충된 배지 내에서 배양하는 단계;
이어서 세포를 DAPT 및 엑센딘 4로 보충된 배지 내에서 배양하는 단계; 및
이어서 세포를 IGF, HGF 및 엑센딘 4로 보충된 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제1항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 췌장 내배엽 계통 세포를 췌장 내분비 계통 세포로 분화시키는 것을 더 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 다능성 줄기 세포로부터 유래한 것인, 방법.
제10항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 배아 줄기 세포인, 방법.
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