CN102083965A - 多潜能细胞 - Google Patents
多潜能细胞 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102083965A CN102083965A CN200980124667XA CN200980124667A CN102083965A CN 102083965 A CN102083965 A CN 102083965A CN 200980124667X A CN200980124667X A CN 200980124667XA CN 200980124667 A CN200980124667 A CN 200980124667A CN 102083965 A CN102083965 A CN 102083965A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- protein
- base material
- substratum
- tissue culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Abstract
本发明涉及可容易地在培养物中在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上扩增，并且不需要饲养细胞系的多潜能细胞。本发明还提供了从人胚胎干细胞衍生所述多能干细胞的方法。
Description
技术领域
本发明涉及可容易地在培养物中在组织培养聚苯乙烯上扩增并且不需要饲养细胞系的多能干细胞。本发明还提供了从人胚胎干细胞衍生多能干细胞的方法。
背景技术
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，例如HNF-3β、GATA-4、Mixl1、CXCR4和SOX-17。
定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层的细胞可表达胰-十二指肠同源盒基因PDX-1。在不存在PDX-1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因此，PDX-1的表达标志着胰腺器官形成中的关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。
据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science 292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes 49：157，2000)报道，衍生自小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变正常。
例如，Hori等人(PNAS 99：16105，2002)揭示，用磷酸肌醇3-激酶(LY294002)的抑制剂处理小鼠胚胎干细胞产生了类似β细胞的细胞。
在另一例子中，Blyszczuk等人(PNAS 100：998，2003)报道，从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞产生了胰岛素生成细胞。
Micallef等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成PDX-1阳性胰腺内胚层。在胚胎干细胞分化的第4天(对应于胚胎中的原肠胚形成末期)将视黄酸添加到培养基中，此时视黄酸诱导PDX-1表达最有效(Diabetes54：301，2005)。
Miyazaki等人报道了过表达PDX-1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显示，外源PDX-1的表达明显增强了所得的分化细胞中胰岛素、生长抑素、葡糖激酶、神经元素3、P48、Pax6和HNF6基因的表达(Diabetes 53：1030，2004)。
Skoudy等人报道说，激活素A(TGFβ超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(PDX-1、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用1nM激活素A时观察到最大的效果。他们还观察到胰岛素和PDX-1 mRNA的表达水平不受视黄酸影响；然而，3nMFGF-7处理导致PDX-1的转录水平提高(Biochem.J.379：749，2004)。
Shiraki等人研究了能特异性增强胚胎干细胞分化成PDX-1阳性细胞的生长因子的作用。他们观察到，TGFβ2可再现地产生更高比例的PDX-1阳性细胞(Genes Cells.2005年6月；10(6)：503-16)。
Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同Wnt信号转导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury+/HNF-3β+内胚层细胞(US2006/0003446A1)。
Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806页，2006)声称“前原条的形成需要同时伴有Wnt和TGF-β/nodal/激活素信号传导”。
然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。
Thomson等人从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science 282：114，1998)。同时，Gearhart及其同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。与可简单通过与白血病抑制因子(LIF)一起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利No.6,200,806；WO99/20741；WO 01/51616)。
D’Amour等人描述了在存在高浓度激活素和低血清的情况下制备人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞的富集培养物(D’Amour KA等人，2005年)。将这些细胞移植到小鼠的肾囊下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟细胞。在添加FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成PDX-1阳性细胞(US 2005/0266554A1)。
D’Amour等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401(2006))声称：“我们已开发出使人胚胎干细胞(hES)转化成能合成胰腺激素胰岛素、高血糖素、生长抑素、胰多肽和生长激素释放肽的内分泌细胞的分化方法。该方法通过引导细胞经过类似于定形内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的阶段转变为表达内分泌激素的细胞来模拟体内胰腺器官发生”。
在另一个例子中，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的***(US2006/0040387A1)。在该情形中，分化途径分成三个阶段。首先，使用正丁酸盐和激活素A的组合，使人胚胎干细胞分化为内胚层。然后将细胞与TGFβ拮抗剂(例如成头蛋白(Noggin))联合EGF或β细胞素一起进行培养，以产生PDX-1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。
在一个实例中，Benvenistry等人声称：“我们得出如下结论：PDX-1的过表达增强了胰富集基因的表达，胰岛素表达的诱导可能需要仅存在于体内的额外信号”(Benvenistry等人，Stem Cells 2006；24：1923-1930)。
目前用于培养人胚胎干细胞的培养方法需要使用细胞外基质蛋白或成纤维细胞饲养层，或需要添加外源生长因子，例如bFGF。
例如，Cheon等人(BioReprod DOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养细胞的无血清培养***，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。
又如，Levenstein等人(Stem Cells 24：568-574，2006)公开了使用补充有bFGF的培养基，在不存在成纤维细胞或调理培养基的情况下长期培养人胚胎干细胞的方法。
又如，US20050148070公开了一种在无血清且无成纤维细胞饲养细胞的成分确定的培养基中培养人胚胎干细胞的方法，该方法包括：在含有白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、至少一种胰岛素或胰岛素替代品的培养基中培养干细胞，该培养基基本上无哺乳动物胎血清且含有至少约100ng/ml能激活成纤维细胞生长因子信号转导受体的成纤维细胞生长因子，其中该生长因子的供给来源不是仅为成纤细胞饲养层，该培养基支持干细胞在无饲养细胞或调理培养基的情况下以未分化状态增殖。
又如，US20050233446公开了一种用于培养干细胞，包括未分化的灵长类原始干细胞的限定培养基。在溶液中，此培养基较于在培养的干细胞基本上是等渗的。在给定的培养物中，特定的培养基包含基础培养基和各为一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持胚性干细胞进行基本上非分化性生长所必需。
又如，US6800480描述“在一个实施例中，提供了用于以基本上未分化状态培养灵长类来源的原始干细胞的细胞培养基，其包括低渗透压、低内毒素基础培养基，此培养基可有效用于支持灵长类来源的原始干细胞的生长。基础培养基混合了可有效支持灵长类来源的原始干细胞生长的营养血清和选自饲养细胞和衍生自饲养细胞的胞外基质组分的基底。该培养基还包括非必需氨基酸、抗氧化剂和选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子。”
又如，US20050244962描述：“在一个方面，本发明提供了一种培养灵长类胚胎干细胞的方法。在基本上不含哺乳动物胎血清(优选也基本上不含任何动物血清)的培养物中，并在存在由除仅成纤维细胞饲养层之外的来源提供的成纤维细胞生长因子情况下培养干细胞。在一种优选的形式中，通过添加足够的成纤维细胞生长因子，使得成纤维细胞饲养层(以前是维持干细胞培养物所需的)变成了非必需的。”
在又一个例子中，WO2005065354公开了一种基本上无饲养细胞和无血清的成分确定的等渗培养基，其包含：a.基础培养基；b.一定量的bFGF，该量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长；c.一定量的胰岛素，该量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长；和d.一定量的抗坏血酸，该量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长。
又如，WO2005086845公开了一种用于维持未分化干细胞的方法，所述方法包括：将干细胞暴露于一定量的转化生长因子β(TGFβ)蛋白家族中的成员、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族中的成员或烟酰胺(NIC)，该量足以维持细胞处于未分化的状态足够时间而获得所需结果。
另外，从人胚胎细胞形成胰腺内分泌细胞、胰激素表达细胞或胰激素分泌细胞可能需要对人胚胎干细胞进行遗传操纵。用传统技术(例如lipofectamine或电穿孔)转染人胚胎干细胞效率低下。
WO2007027157公开了一种方法，包括：(a)提供胚胎干(ES)细胞；和(b)从胚胎干细胞建立祖细胞系；其中基于祖细胞系自我更新的能力对其进行选择。优选的是，该方法基于体细胞不能自我更新来实现选择祖细胞而不选择体细胞。优选的是，在缺少共培养物，优选在缺少饲养细胞的条件下衍生或建立祖细胞系，其优选相对于胚胎干细胞进行选择。可任选的是，该方法包括(d)从祖细胞系衍生分化的细胞。
因此，仍明显需要开发用于建立能扩增以满足目前临床需要，同时又保持分化成胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞或胰腺激素分泌细胞的潜力的多能干细胞系的条件。
发明内容
本发明提供了具有人胚胎干细胞的特性的细胞群体，该细胞群体可容易地在低血清条件下在培养物中扩增(该扩增不需要饲养细胞系或复合物基质蛋白)，可在单细胞悬浮液中传代，可以很高的效率进行转染以及在低氧条件下培养。这种独特属性的组合使本发明描述的细胞与现有技术区别开来。
在一个实施例中，本发明提供了用于衍生包含表达多潜能标志物的细胞的细胞群体的方法，该方法包括如下步骤：
a.获得细胞，以及
b. 在低氧条件下在组织培养基材(tissue culture substrate)上培养所述细胞，在培养细胞之前该组织培养基材未用蛋白质或细胞外基质进行预处理。
该细胞可以是人胚胎干细胞，或者它们可以是表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。可在将人胚胎干细胞在未用蛋白质或细胞外基质处理过的组织培养基材上培养之前将细胞在常氧条件下培养。或者，可将人胚胎干细胞在低氧条件下培养。
可在将人胚胎干细胞在未用蛋白质或细胞外基质处理过的组织培养基材上培养之前将细胞在常氧条件下培养，并用Rho激酶抑制剂处理。或者，可将人胚胎干细胞在低氧条件下培养，并用Rho激酶抑制剂处理。
可在将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞在未用蛋白质或细胞外基质处理过的组织培养基材上培养之前将细胞在常氧条件下培养。或者，可将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞在低氧条件下培养。
在一个实施例中，本发明提供了用于衍生包含表达多潜能标志物的细胞的细胞群体的方法，该方法包括如下步骤：
a.培养人胚胎干细胞，
b.使所述人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层细胞特征性标志物的细胞，以及
c.移出细胞，随后将它们在低氧条件下在组织培养基材上培养，在培养所述细胞之前该组织培养基材未用蛋白质或细胞外基质进行预处理。
可将细胞在低氧条件下、在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上、在含有血清、激活素-A和Wnt配体的培养基中培养。或者，可将细胞在低氧条件下、在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上、在含有血清、激活素-A和Wnt配体和IGF-1的培养基中培养。
可将细胞在低氧条件下、在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上、在含有血清、Rho激酶抑制剂和激活素-A和Wnt配体的培养基中培养。或者，可将细胞在低氧条件下、在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上、在含有血清、Rho激酶抑制剂、激活素-A和Wnt配体和IGF-1的培养基中培养。
在一个实施例中，本发明提供了用于衍生包含表达多潜能标志物的细胞的细胞群体的方法，该方法包括如下步骤：
a.培养人胚胎干细胞，并且
b.移出细胞，随后将它们在低氧条件下在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上培养。
可将细胞在低氧条件下、在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上、在含有血清、激活素-A和Wnt配体的培养基中培养。或者，可将细胞在低氧条件下、在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上、在含有血清、激活素-A和Wnt配体和IGF-1的培养基中培养。
可将细胞在低氧条件下、在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上、在含有血清、Rho激酶抑制剂和激活素-A和Wnt配体的培养基中培养。或者，可将细胞在低氧条件下、在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上、在含有血清、Rho激酶抑制剂、激活素-A和Wnt配体和IGF-1的培养基中培养。
通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞能够在培养物中、在低氧条件下、在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上扩增。
在一个实施例中，本发明提供了扩增表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，该方法包括将细胞在低氧条件下、在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上培养的步骤。在一个实施例中，从通过本发明方法形成的多潜能细胞衍生表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
可将细胞在低氧条件下、在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上、在含有血清、激活素A和Wnt配体和GSK-3B抑制剂的培养基中培养。
附图说明
图1示出了来自第54代人胚胎干细胞系H9的细胞中的CXCR4(CD184，Y-轴)和CD9(X-轴)的表达，其中所述细胞在用低血清+激活素-A+WNT-3A处理4天后已经分化成定形内胚层。
图2示出了在实例5中所列的定形内胚层分化方案的第4天和第6天，来自第54代人胚胎干细胞系H9的细胞的实时PCR分析。分图a)示出了AFP、Bry、CXCR4、GSC和SOX-7的表达。分图b)示出了SOX-17、GATA-4和HNF-3β的表达。
图3示出了用于从根据本发明方法的胚胎干细胞衍生EXPRES细胞的分离方案。
图4示出了在第11天，第0代的扩增的EXPRES细胞的形态，所述细胞在2％FBS+DMEM-F12+100ng/mL激活素-A中(分图a)或在2％FBS+DMEM-F12+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT-3A中(分图b)培养。分图c示出了第3代的EXPRES细胞的形态。
图5示出了在2-5％FBS+DMEM-F12+100ng/mL的激活素-A+20ng/mL WNT-3A培养三代的扩增的EXPRES细胞的实时PCR分析。分图a)示出了AFP、Bry、CXCR4、GSC和SOX-7的表达。分图b)示出了SOX-17、GATA-4和HNF-3β的表达。
图6示出了添加Wnt-3A对EXPRES细胞中基因表达的作用。分图a)示出了SOX-17、GATA-4和HNF-3β的实时PCR表达。分图b)示出了AFP、Bry、CXCR4、GSC和SOX-7的实时PCR表达。
图7示出了IGF-1、Wnt-3A和激活素-A对EXPRES细胞中基因表达的作用。分图a)示出了SOX-17、GATA-4、HNF-3β、Bry、CXCR4和GSC的实时PCR表达。分图b)示出了SOX-7和AFP的实时PCR表达。分图c)示出了OCT-4的实时PCR表达。
图8示出衍生自第54代的人胚胎干细胞系H9的扩增的EXPRES细胞的形态，所述细胞在a)2％FBS+DMEM-F12+100ng/mL AA+20ng/mLWNT-3A、b)2％FBS+DMEMF12+100ng/mL AA、c)2％FBS+DMEM-F12+50ng/mL IGF-I中培养。
图9示出了在低氧条件下在组织培养聚苯乙烯上培养的EXPRES 01和02细胞的扩增潜能。EXPRES 01在2％FBS+DM-F12+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+50ng/mL IGF-I中培养，而EXPRES 02细胞在2％FBS+DM-F12+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A中培养。
图10示出了EXPRES细胞的形态，所述细胞衍生自DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+20ng/mL WNT3A+50ng/mL IGF-I中TCPS(组织培养聚苯乙烯)上的未分化ES细胞的单细胞悬浮液。
图11示出了通过FACS测定的第24代EXPRES 01细胞中的蛋白质表达。分图a)示出了E-钙粘蛋白的表达水平，分图b)示出了CXCR4的表达水平，分图c)示出了CD9的表达水平，分图d)示出了CD117的表达水平，分图e)示出了CD30的表达水平，分图f)示出了LIF受体的表达水平，分图g)示出了TRA 1-60的表达水平，分图h)示出了TRA 1-81的表达水平，分图i)示出了SSEA-1的表达水平，分图j)示出了SSEA-3的表达水平，分图k)示出了SSEA-4的表达水平，分图l)示出了CD56的表达水平。
图12示出了通过FACS测定的第21代EXPRES 02细胞中的蛋白质表达。分图a)示出了E-钙粘蛋白的表达水平，分图b)示出了CXCR4的表达水平，分图c)示出了CD9的表达水平，分图d)示出了CD117的表达水平，分图e)示出了CD30的表达水平，分图f)示出了LIF受体的表达水平，分图g)示出了TRA 1-60的表达水平，分图h)示出了TRA 1-81的表达水平，分图i)示出了SSEA-1的表达水平，分图j)示出了SSEA-3的表达水平，分图k)示出了SSEA-4的表达水平，分图l)示出了CD56的表达水平。
图13示出了第10代EXPRES 01的免疫荧光图像，所述细胞在2％FBS+DMEM-F 12+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+50ng/mL IGF-I中培养。分图a)分图b的DAPI图像，分图b)Nanog，分图c)DAPI(蓝色)和Oct-4(绿色)共染色，分图d)分图e的DAPI图像，分图e)SOX-2，分图f)DAPI(蓝色)和HNF-3β(绿色)共染色。
图14示出了第9代EXPRES 02的免疫荧光图像，所述细胞在2％FBS+DMEM-F12+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A中培养。分图a)分图b的DAPI图像，分图b)HNf3B，分图c)分图d的DAPI图像，分图d)OCT-4，分图e)分图f的DAPI图像，分图f)SOX-2，分图g)分图h的DAPI图像，分图h)NANOG。
图15示出了通过实时PCR测定的EXPRES 01细胞、EXPRES 02细胞、衍生自H9细胞的EB、在MATRIGEL上于MEF-CM中培养的SA002和在MATRIGEL上于MEF-CM中培养的未分化的H9细胞。将所有表达水平相对于未分化的H9细胞进行归一化。分图a)示出了SOX-1的表达，分图b)示出了FOXD3、MYOD1、POU5F1和ZFP42的表达，分图c)示出了ABCG2、连结素43、连结素45和细胞角蛋白15的表达，分图d)示出了nestin、SOX-2、UTF1和vimentin，分图e)示出了GATA-2、Brachyury、TERT和微管蛋白-βIII的表达，分图f)示出了CFC1和GATA-4的表达，分图g)示出了AFP和FOXA2的表达，分图h)示出了IPF1A和MSX1的表达。
图16示出了a)在组织培养聚苯乙烯上于生长培养基中培养然后转换为在DMEM-F12+0.5％FBS+100ng/mL激活素-A和20ng/mL WNT3A中培养2天，随后在DMEM-F12+2％FBS+100ng/mL激活素-A中培养另外2天的第5代EXPRES 01细胞中，b)在组织培养聚苯乙烯上于生长培养基中培养然后转换为在DMEM-F12+0.5％FBS+100ng/mL激活素-A和20ng/mLWNT3A中培养2天，随后在DMEM-F12+2％FBS+100ng/mL激活素-A中培养另外2天的第4代EXPRES 02细胞中，通过FACS测定的CXCR4(Y-轴)和CD9(x-轴)的表达。
图17示出了用低血清加AA+WNT3a处理过的a)EXPRES 01细胞和b)EXPRES 02细胞中，通过实施PCR测定的基因表达。
图18示出了第5代EXPRES 01细胞的免疫荧光图像，所述细胞在2％FBS+DMEM-F12+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+50ng/mL IGF-I中培养然后转换为在DMEM-F12+0.5％FBS+100ng/mL激活素-A和20ng/mLWNT3A中培养2天，随后在DMEM-F12+2％FBS+100ng/mL激活素-A中培养另外2天。分图a)分图b的DAPI图像，分图b)GATA-4，分图c)分图d的DAPI图像，分图d)SOX-17，分图e)分图f的DAPI图像，分图f)HNF-3β，分图g)分图h的DAPI图像，分图h)OCT-4。
图19示出了第4代EXPRES 02细胞的免疫荧光图像，所述细胞在2％FBS+DMEM-F12+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A中培养然后转换为在DMEM-F12+0.5％FBS+100ng/mL激活素-A和20ng/mL WNT3A中培养2天，随后在DMEM-F12+2％FBS+100ng/mL激活素-A中培养另外2天。分图a)分图b的DAPI图像，分图b)GATA-4，分图c)分图d的DAPI图像，分图d)SOX-17，分图e)分图f的DAPI图像，分图f)HNF-3β，分图g)分图h的DAPI图像，分图h)OCT-4。
图20示出了在组织培养聚苯乙烯上在生长培养基中培养然后转换为在DMEM-F12+0.5％FBS+100ng/mL激活素-A+100nM GSK-3B抑制剂IX和20ng/mL WNT3A中培养4天的a)第19代EXPRES 01细胞和b)第14代EXPRES 02细胞中，通过FACS测定的CXCR4(Y-轴)和CD9(x-轴)的蛋白质表达。
图21示出了在2％FBS+DMEM-F12+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+50ng/mL IGF-I中培养的第19代EXPRES 01细胞和在2％FBS+DMEM-F12+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A中然后转换为在DMEM-F12+0.5％FBS+100ng/mL激活素-A+100nM GSK-3B抑制剂IX以及20ng/mLWNT3A中培养5天的第14代EXPRES 02细胞的免疫荧光图像。分图a)分图b的DAPI图像，分图b)HNF-3β，分图c)分图d的DAPI图像，分图d)GATA-4，分图e)分图f的DAPI图像，分图f)SOX-17，分图g)分图h的DAPI图像，分图h)HNF-3β，分图i)分图j的DAPI图像，分图j)GATA-4，分图k)分图l的DAPI图像，分图l)SOX-17。
图22示出了用低血清加AA+WNT3a+GSK-3B IX抑制剂处理5天的a)EXPRES 01和EXPRES 02细胞的通过实时PCR数据测定的基因表达。分图a示出了AFP、Brachyury、CDX2、Mox1、OCT3/4、SOX-7和ZIC1的表达，分图b示出了CXCR4、GATA-4、Goosecoid、HNf3B和SOX-17的表达水平。
图23示出了EXPRES 01细胞的通过实时PCR测定的基因表达，所述细胞在低氧条件下以5000-40000细胞/cm2接种于生长培养基然后转换为DMEM-F12+0.5％FBS+100ng/mL AA+20ng/mL WNT3A+100nM GSK-3B抑制剂IX中的组织培养聚苯乙烯上四天。分图a示出了AFP、Brachyury、SOX-7和OTX2的表达水平。分图b示出了CXCR4、HNF-3β、GATA-4、SOX-17、Cerb和GSC的表达水平。
图24示出了低端粒对照细胞(泳道1)、第24代EXPRES 01细胞(泳道2)、第17代EXPRES 02细胞(泳道3)、来自第40代人胚胎干细胞系H1的未分化细胞(泳道4)和高端粒长度对照细胞(泳道5)中的端粒长度测定的结果。
图25示出了已向前肠内胚层细胞分化的第21代EXPRES 01细胞(S3)、已向胰腺内胚层细胞分化的第21代EXPRES 01细胞(S4)、已向胰腺内分泌细胞分化的第21代EXPRES 01细胞(S5)的通过实时PCR数据测定的基因表达。
图26示出了根据实例18培养的第35代EXPRES 01的免疫荧光图像。分图a)分图b的DAPI图像，分图b)1抗胰蛋白酶，分图c)HNF-3β(绿色)和白蛋白(红色)，分图d)白蛋白(红色)和DAPI(蓝色)，分图e)分图f的DAPI图像，分图f)PDX-1，分图g)分图h的DAPI图像，分图h)SOX-17，分图i)分图j的DAPI图像，分图j)CDX-2。
图27示出了微阵列数据的散点图，分图a)EXPRES 01细胞(y-轴)与来自人胚胎干细胞系H9的未分化细胞(x-轴)相比，分图b)EXPRES 02细胞(y-轴)与来自人胚胎干细胞系H9的未分化细胞(x-轴)相比，分图c)EXPRES 01细胞(y-轴)与EXPRES 02细胞(x-轴)相比，分图d)EXPRES 01细胞(y-轴)与来自已分化成定形内胚层的人胚胎干细胞系H9的细胞(x-轴)相比，分图e)EXPRES 02细胞(Y-轴)与来自已分化成定形内胚层的人胚胎干细胞系H9的细胞(x-轴)相比，分图f)来自人胚胎干细胞系H9的未分化细胞(y-轴)与来自已分化成定形内胚层的人胚胎干细胞系H9的细胞(x-轴)相比。
图28示出了由EXPRES 01细胞形成的EB体的形态。
图29示出了移植于NOD-SCID小鼠的肾囊下五周后，EXPRES 01细胞系的细胞、EXPRES 02细胞系的细胞和来自第43代人胚胎干细胞系H9的细胞的通过实时PCR测定的基因表达。分图a-e示出了中胚层标志物。分图f和g示出了外胚层标志物。分图h和i示出了内胚层标志物。分图j示出了胚外内胚层标志物。分图k-m示出了多潜能标志物。
图30示出了通过BRDU掺入法测定的EXPRES 03细胞的增殖和细胞周期状态。EXPRES 03细胞在2％FBS/DMEM/F12中培养，该2％FBS/DMEM/F12补充有：分图a)激活素-A(100ng/mL)和wnt3a(20ng/mL)，分图b)激活素-A(100ng/mL)和wnt3a(20ng/mL)和IGF(50nh/mL)。所示其他细胞包括分图c)hES细胞(H9p43)，分图d)羊水细胞(AFDX002)和分图e)丝裂霉素处理过的MEF细胞。分图f)示出了所研究的不同细胞群体处于细胞周期中的S期、G1和G2/M期的频率。
图31示出了以单细胞分散体或细胞簇接种的EXPRES 01细胞和人胚胎干细胞中EGFP的转染效率和表达。24小时后通过荧光显微镜法和流式细胞术分析细胞。分图A)示出了从EXPRES 01细胞获得的数据。分图B)示出了从人胚胎干细胞的单细胞分散体获得的数据，分图C)示出了从人胚胎干细胞的细胞簇获得的数据。
图32示出了a)在大气氧条件(大约21％)下培养的EXPRES 01细胞，b)在3％O2条件下培养的EXPRES 01细胞，c)在大气氧条件(大约21％)下培养的EXPRES 02细胞，d)在3％O2条件下培养的EXPRES 02细胞的MTS测定法所测量的代表脱氢酶活性的平均OD读数与细胞数目的关系曲线。
图33示出了EXPRES 01 P27细胞的通过实时PCR测定的基因表达，所述细胞以10000个细胞/cm2接种于DMEMF12+0.5％FBS+100ng/mL AA+20ng/mL WNT3A+100nM GSK-3B抑制剂IX中的组织培养聚苯乙烯上。分图a示出了AFP、Brachyury、SOX-7和OTX2的表达水平。分图b示出了CXCR4、HNF-3β、GATA-4、SOX-17、Cer1和GSC的表达水平。
图34示出了EXPRES 01P27细胞的通过FACS测定的CXCR4(Y-轴)和CD9(x-轴)的蛋白质表达，所述细胞在DMEM-F12+0.5％FBS+100ng/mL AA+20ng/mL WNT3A+100nM GSK-3B抑制剂IX中的组织培养聚苯乙烯上培养三代。
图35示出了siRNA转染对GSK-3B和β-连环蛋白的作用。EXPRES细胞通过荧光显微镜法和定量RT-PCR方法进行分析。A)用i)CY3标记的siRNA和ii)荧光素标记的siRNA转染的细胞的荧光显微镜分析。B)用i)GSK3b和ii)β-连环蛋白siRNA寡核苷序列转染的细胞中以％剩余活性表示的靶基因抑制(knockdown)。
图36示出了通过本发明方法衍生的两个细胞系的核型。分图a：EXPRES 01细胞系。分图b：EXPRES 02细胞系。
图37示出了在a)2％FBS+DM-F12+100ng/mL激活素-A+20ng/mLWNT-3A+50ng/mL IGF或b)2％FBS+DM-F12+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT-3A+50ng/mL IGF+10μM Rho激酶抑制剂Y-27632中培养24小时后的第0代EXPRES 15细胞的形态。
图38示出了在2％FBS+DM-F12+100ng/mL激活素-A+20ng/mLWNT-3A+50ng/mL IGF+10μM Rho激酶抑制剂Y-27632中培养12代的EXPRES 15细胞的核型。
图39示出了在补充有指定浓度的IGF、激活素-A、Wnt3A和GSK抑制剂IX的基础培养基中培养24小时(分图a)、48小时(分图b)和96小时(分图c)的EXPRES 11细胞通过A490测定的增殖。
具体实施方式
将本发明的具体实施方式部分分成以下几个分部分，来描述或举例说明本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。
根据它们的发育潜能将干细胞分为：(1)全能干细胞，意指能够产生所有胚胎或胚外细胞类型；(2)多能干细胞，意指能够产生所有胚胎细胞类型；(3)专能干细胞，意指能够产生一亚组细胞谱系，但这些细胞都位于特定的组织、器官或生理***内(例如，造血干细胞(HSC)能够产生包括HSC(自我更新)、血细胞限制性寡能祖细胞和为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如血小板)的子代；(4)寡能干细胞，意指能够产生比专能干细胞更为有限的一亚组细胞谱系；以及(5)单能干细胞，意指能够产生单种细胞谱系(如精原干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)程度较低的地位的过程。如本文所用，“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标志物是指与所关注谱系的细胞表型特异性相关并能够用于评价非定向细胞向所关注谱系的分化的特征。
如本文所用，“AFP”或“α-甲胎蛋白”是指在肝脏发育开始时产生的抗原。AFP还可在胚外细胞中表达。
“白蛋白”是可溶性单体蛋白，其构成成人中所有血清蛋白的约一半。
“β-细胞谱系”指对于转录因子PDX-1和至少一种以下转录因子具有阳性基因表达的细胞：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞包括β细胞。
如本文所用，“Brachyury”是T-box基因家族成员。它是原条和中胚层细胞的标志物。
如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：SOX-17、GATA-4、HNF-3β、GSC、Cer1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4、CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
“c-Kit”和“CD117”二者均指具有Genbank登录号X06182中所公开的序列或其天然存在的变体序列(如等位基因变体)的细胞表面受体酪氨酸激酶。
如本文所用，“CD99”是指由登录号为NM_002414的基因编码的蛋白。
如本文所用，“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：PDX-1、HNF-1β、PTF-1α、HNF-6或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞。
如本文所用，“表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞”指表达至少以下标志物之一的细胞：NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、NKX6.1、Pax-4、Ngn-3或PTF-1α。表达胰内分泌系特征性标志物的细胞包括胰内分泌细胞、胰激素表达细胞、胰激素分泌细胞和β细胞系的细胞。
如本文所用，“Cer1”或“Cerebrus”是半胱氨酸结蛋白质超家族的成员。
如本文所用，“CXCR4”是指基质细胞衍生因子1(SDF-1)受体，也称为“LESTR”或“融合素”。在形成原肠胚的小鼠胚胎中，CXCR4在定形内胚层和中胚层中表达，但不在胚外内胚层中表达。
如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列标志物：HNF-3β、GATA-4、SOX-17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和Mixl1。
如本文所用，“胚外内胚层”指表达至少一种以下标志物的细胞群体：SOX-7、AFP和SPARC。
如本文所用，“FGF-2”、“FGF-4”、“FGF-8”、“FGF-10”和“FGF-17”是成纤维细胞生长因子家族的成员。
“GATA-4”和“GATA-6”是GATA转录因子家族的成员。该转录因子家族由TGF-β信号传导诱导，并有助于早期内胚层标志物的维持。
如本文所用，“GLUT-2”指葡萄糖转运蛋白分子，其在许多胎儿组织和成人组织(包括胰腺、肝脏、肠、脑和肾)中表达。
如本文所用，“Goosecoid”或“GSC”指在胚孔背唇中表达的同源结构域转录因子。
如本文所用，“HB9”指同源盒基因9。
“HNF-1α”、“HNF-1β”、“HNF-3β”和“HNF-6”属于转录因子的肝核因子家族，其特征在于高度保守的DNA结合结构域和两个短的羧基端结构域。
如本文所用，“Islet-1”或“Isl-1”转录因子的LIM/同源结构域家族的成员，并在发育中的胰腺中表达。
如本文所用，“MafA”是在胰腺中表达的转录因子，并控制胰岛素生物合成和分泌中所涉及的基因的表达。
如本文所用，“标志物”是指在所关注细胞内差异表达的核酸或多肽分子。关于这一点，差异表达意指阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。与其他细胞相比，所关注细胞中的核酸或多肽标志物的可检测水平足够高或足够低，使得可以使用本领域已知的多种方法识别所关注细胞，并将所关注细胞与其他细胞区相区分。
如本文所用，术语“中内胚层细胞”指表达以下标志物中的至少一种的细胞：CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、SOX-17、DKK4、HNF-3β、GSC、FGF17、GATA-6。
如本文所用，“Mixl1”指同源盒基因，其为原条、中胚层和内胚层中的细胞的标志物。
如本文所用，“NeuroD”是神经形成中所涉及的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子。
如本文所用，“NGN-3”是碱性环-螺旋-环转录因子的神经元素家族的成员。
如本文所用，“Nkx-2.2”和“Nkx-6.1”是Nkx转录因子家族的成员。
如本文所用，“Nodal”是TGFβ蛋白质超家族的成员。
“Oct-4”是POU结构域转录因子的成员，并被广泛认为是多能干细胞的标志。Oct-4与多能干细胞的关系由其严格局限于未分化的多能干细胞的表达所表明。一旦向体细胞谱系分化时，Oct-4的表达很快消失。
如本文所用，“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”指能够表达下列激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰腺多肽。
如本文所用，“胰腺激素分泌细胞”指能够分泌以下激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
如本文所用，“Pax-4”和“Pax-6”是胰岛发育中牵涉的胰腺β细胞特异性转录因子。
如本文所用，“PDX-1”指胰腺发育中所涉及的同源结构域转录因子。
如本文所用，“前原条细胞”指表达一下标志物中的至少一种的细胞：Nodal或FGF8。
如本文所用，“原条细胞”指表达以下标志物中的至少一种的细胞：Brachyury、Mix-like同源盒蛋白或FGF4。
如本文所用，“PTF-1α”指48kD的碱性螺旋-环-螺旋蛋白质，其为三聚胰腺转录因子-1(PTF1)的序列特异性DNA结合亚基。
如本文所用，“SOX-1”、“SOX-2”、“SOX-7”和“SOX-17”是SOX转录因子家族的成员，并牵涉于胚胎形成中。
如本文所用，“SPARC”也称为“富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白”。
“SSEA-1”(阶段特异性胚胎抗原-1)是在鼠畸胎癌干细胞(EC)、鼠和人胚胎生殖细胞(EG)和鼠胚胎干细胞(ES)的表面上存在的糖脂表面抗原。
“SSEA-3”(阶段特异性胚胎抗原-3)是在人畸胎癌干细胞(EC)、人胚胎生殖细胞(EG)和人胚胎干细胞(ES)的表面上存在的糖脂表面抗原。
“SSEA-4”(阶段特异性胚胎抗原-4)是在人畸胎癌干细胞(EC)、人胚胎生殖细胞(EG)和人胚胎干细胞(ES)的表面上存在的糖脂表面抗原。
“TRA1-60”是在人畸胎癌干细胞(EC)、人胚胎生殖细胞(EG)和人胚胎干细胞(ES)的表面上表达的硫酸角蛋白相关抗原。
“TRA1-81”是在人畸胎癌干细胞(EC)、人胚胎生殖细胞(EG)和人胚胎干细胞(ES)的表面上表达的硫酸角蛋白相关抗原。
“TRA2-49”是在人畸胎癌干细胞(EC)和人胚胎干细胞(ES)的表面上表达的碱性磷酸酶同工酶。
如本文所用，“UTF-1”指在多能胚胎干细胞和胚外细胞中表达的转录辅激活因子。
如本文所用，“Zic1”是Zic转录因子家族的成员。Zic1调控神经基因和神经嵴特异性基因的表达，其在背神经管和迁移前(premigratory)神经嵴的细胞中表达。
衍生表达多潜能标志物的细胞的方法
本发明提供了具有人胚胎干细胞的特性的细胞群体，该细胞群体可容易地在低血清条件下在培养物中扩增(该扩增不需要饲养细胞系或复合基质蛋白涂层)，可在单细胞悬浮液中传代，可以很高的效率进行转染以及在低氧条件下培养。这种独特属性的组合使本发明描述的细胞与现有技术区别开来。
在一个实施例中，本发明提供了用于衍生包含表达多潜能标志物的细胞的细胞群体的方法，该方法包括如下步骤：
a.获得细胞，以及
b.在低氧条件下在组织培养基材上培养所述细胞，在培养细胞之前该组织培养基材未用蛋白质或细胞外基质进行预处理。
该细胞可以是人胚胎干细胞，或者它们可以是表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。可在将人胚胎干细胞在未用蛋白质或细胞外基质处理过的组织培养基材上培养之前将细胞在常氧条件下培养。或者，可将人胚胎干细胞在低氧条件下培养。
可在将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞在未用蛋白质或细胞外基质处理过的组织培养基材上培养之前将细胞在常氧条件下培养。或者，可将定形内胚层谱系特征性标志物的细胞在低氧条件下培养。
在一个实施例中，本发明提供了用于衍生包含表达多潜能标志物的细胞的细胞群体的方法，该方法包括如下步骤：
a.培养人胚胎干细胞，
b.使所述人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层细胞特征性标志物的细胞，以及
c.移出细胞，随后将它们在低氧条件下在组织培养基材上培养，在培养细胞之前该组织培养基材未用蛋白质或细胞外基质进行预处理。
在一个实施例中，本发明提供了用于衍生包含表达多潜能标志物的细胞的细胞群体的方法，该方法包括如下步骤：
a.培养人胚胎干细胞，并且
b.移出细胞，随后将它们在低氧条件下在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上培养。
细胞在低氧条件下在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基
材上的培养
在一个实施例中，将细胞在低氧条件下，在未用细胞外基质包被的组织培养基材上培养约1至约20天。在一个替代实施例中，将细胞在低氧条件下，在未用细胞外基质包被的组织培养基材上培养约5至约20天。在一个替代实施例中，将细胞在低氧条件下，在未用细胞外基质包被的组织培养基材上培养约15天。
在一个实施例中，低氧条件是约1％的O2至约20％的O2。在一个替代实施例中，低氧条件是约2％的O2至约10％的O2。在一个替代实施例中，低氧条件是约3％的O2。
可将细胞在低氧条件下、在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上、在含有血清、激活素A和Wnt配体的培养基中培养。作为另一种选择，该培养基还可含有IGF-1。
该培养基可具有在约2％至约5％的范围内的血清浓度。在一个替代实施例中，血清浓度可以为约2％。
激活素A可以约1pg/mL至约100μg/mL的浓度使用。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约1μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约50ng/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约100ng/ml。
Wnt配体可选自Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一个实施例中，Wnt配体为Wnt-1。在一个替代实施例中，Wnt配体为Wnt-3a。
Wnt配体可以约1ng/mL至约1000ng/mL的浓度使用。在一个替代实施例中，Wnt配体可以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度使用。在一个实施例中，Wnt配体的浓度是约20ng/mL。
IGF-1可以约1ng/mL至约100ng/mL的浓度使用。在一个替代实施例中，IGF-1可以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度使用。在一个实施例中，IGF-1的浓度是约50ng/mL。
通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞能够在低氧条件下在培养物中，在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上扩增。
通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞可表达至少一种选自如下的多潜能标志物：ABCG2、cripto、FoxD3、连接蛋白43、连接蛋白45、Oct4、SOX-2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60和Tra1-81。
在一个实施例中，通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞能表达前原条细胞特征性标志物。
在一个实施例中，通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞能表达原条细胞特征性标志物。
在一个实施例中，通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞能表达中内胚层细胞特征性标志物。
在一个实施例中，通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞能表达定形内胚层细胞特征性标志物。
通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞的进一步分化
可通过本领域的任何方法，使通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中公开的方法，使通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据Shinozaki等人，Development 131，1651-1662(2004)中公开的方法，使通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据McLean等人，Stem Cells 25，29-38(2007)中公开的方法，使通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后将所述细胞与激活素A和血清一起培养，再然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，使通过本发明方法衍生的表达多潜能标志物的细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology，23，1534-1541，2005中公开。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的进一步分化
可以通过本领域的任何方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，还通过下述方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞：用成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，随后将细胞在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基中进行培养。该方法的一个例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology，24：1392-1401，(2006)中公开。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的进一步分化
可以通过本领域的任何方法，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
无意于进行限制，下面的部分包括获得细胞的方法的例子，所述细胞是适于形成根据本发明方法的表达多潜能标志物和定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的起始材料。
人胚胎干细胞的分离、扩增和培养
人胚胎干细胞的表征：人胚胎干细胞可表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种(Thomson等人，Science 282：1145，1998)。人胚胎干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的人胚胎干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶活性可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物显影来检测，如制造商(Vector Laboratories，Burlingame Calif)所描述的。未分化的多能干细胞通常还表达Oct-4和TERT，这可由RT-PCR检测。
增殖的人胚胎干细胞的另一理想表型是分化成所有三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞的潜能。可例如通过如下方式来确定人干细胞的多潜能性：将细胞注射入SCID小鼠，用4％的多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后对其进行组织学检验，找出来自三个胚层的细胞类型的证据。或者，可通过产生拟胚体并评估拟胚体的与三个胚层相关的标志物的存在来确定多能性。
可使用标准G带显带技术并与相应灵长类物种的已公开的核型进行比较来分析增殖的人胚胎干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”(其意指细胞是整倍体的)的细胞，其中所有人染色体都存在并且无明显的改变。
人胚胎干细胞的来源：可以使用的人胚胎干细胞的类型包括已建立的衍生自妊娠后形成的组织的人胚胎细胞系，这些组织包括在妊娠期任何时间(通常但不是必须在妊娠前大约10-12周)采集的胚前组织(例如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织。非限制性的例子是已建立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。还可设想的是，在此类细胞的初始建立或稳定期间使用本公开的组合物，在此情况下，源细胞将是直接取自源组织的原代多潜能细胞。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。同样合适的是突变型人胚胎干细胞系，例如BG01v(BresaGen，Athens，GA)。
在一个实施例中，人胚胎干细胞是如Thomson等人(美国专利No.5,843,780；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133 ff.，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：7844，1995)所描述制备。
人胚胎干细胞的培养：在一个实施例中，将人胚胎干细胞在基本上不含饲养细胞、但仍支持人胚胎干细胞增殖而不进行大量分化的培养***中培养。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持人胚胎干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定的培养基来支持人胚胎干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。
在一个替代实施例中，将人胚胎干细胞最初在饲养细胞层上培养，该饲养细胞可以多种方式支持人胚胎干细胞。然后将人胚胎转移至基本上无饲养细胞、但仍支持人胚胎干细胞增殖而不进行大量分化的培养***中培养。
适用于本发明的调理培养基的例子在US20020072117、US6642048、WO2005014799和Xu等人(Stem Cells 22：972-980，2004)中有所公开。
适用于本发明的化学成分确定的培养基的例子可在US20070010011找到。
合适的培养基可用如下组分制备，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco#11965-092；Knockout达尔伯克氏改良伊格尔培养基(KODMEM)，Gibco#10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mML-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。
在一个实施例中，将人胚胎干细胞接种在合适的培养基材上，该培养基材在根据本发明方法处理前进行过处理。在一个实施例中，处理物是细胞外基质组分，例如衍生自基底膜或可形成粘附分子受体-配体配偶体的部分的那些。在一个实施例中，合适的培养基材是MATRIGEL(BectonDickenson)。MATRIGEL是来自于Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂，其在室温下会发生胶化从而形成重组基底膜。
其他的细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。这可包括层粘连蛋白、纤粘蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等等，它们可以单独使用或多种组合使用。
可在存在促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基材上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。
然后在根据本发明方法处理之前，从处理过的组织培养基材移出人胚胎干细胞并接种于未处理的组织培养基材以形成表达多潜能标志物和定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞
可通过本领域的任何方法，使人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞适于根据本发明的方法进行处理。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中公开的方法，使人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据Shinozaki等人，Development 131，1651-1662(2004)中公开的方法，使人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据McLean等人，Stem Cells 25，29-38(2007)中公开的方法，使人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在细胞外基质上培养的人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征
性标志物的细胞
在一个实施例中，本发明提供了使表达定形内胚层谱系特征性标志物的人胚胎干细胞分化的方法，该方法包括如下步骤：
a.将人胚胎干细胞接种在包被有细胞外基质的组织培养基材上，以及
b.用激活素-A和Wnt配体培养所述人胚胎干细胞。
然后通过本发明方法处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞以形成表达多潜能标志物和定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
用激活素A和Wnt配体培养所述人胚胎干细胞可在单种培养基中进行。作为另一种选择，用激活素A和Wnt配体培养人胚胎干细胞可在不止一种培养基中进行。在一个实施例中，用激活素A和Wnt配体培养人胚胎干细胞可在两种培养基中进行。
细胞外基质：在本发明的一个方面中，将人胚胎干细胞在包被有细胞外基质的组织培养基材上培养和分化。细胞外基质可以是从小鼠肉瘤细胞提取的可溶性基底膜制剂(其可由BD Biosciences以商品名MATRIGEL销售)。作为另一种选择，细胞外基质可以是低生长因子MATRIGEL。作为另一种选择，细胞外基质可以是纤粘蛋白。在一个替代实施例中，将人胚胎干细胞在包被有人血清的组织培养基材上培养和分化。
可在对组织培养基底进行涂覆前，将细胞外基质进行稀释。用于稀释细胞外基质以及用于包被组织培养基材的合适方法的例子可在如下文献中找到：Kleinman，H.K.等人，Biochemistry 25：312(1986)和Hadley，M.A.等人，J.Cell.Biol.101：1511(1985)。
在一个实施例中，细胞外基质是MATRIGEL。在一个实施例中，组织培养基材包被有以1∶10稀释的MATRIGEL。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶15稀释的MATRIGEL。在一个实施例中，组织培养基材包被有以1∶30稀释的MATRIGEL。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶60稀释的MATRIGEL。
在一个实施例中，细胞外基质是低生长因子MATRIGEL。在一个实施例中，组织培养基材包被有以1∶10稀释的低生长因子MATRIGEL。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶15稀释的低生长因子MATRIGEL。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶30稀释的低生长因子MATRIGEL。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶60稀释的低生长因子MATRIGEL。
使用单种培养基，使人胚胎干细胞在细胞外基质上分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞：在一个实施例中，本发明提供了使表达定形内胚层谱系特征性标志物的人胚胎干细胞分化的方法，所述方法包括如下步骤：
a.将人胚胎干细胞接种在包被有细胞外基质的组织培养基材上，以及
b.用激活素-A和Wnt配体培养所述人胚胎干细胞。
培养基应含有足够低浓度的某些因子以使人胚胎干细胞向定形内胚层分化，这些因子例如为胰岛素和IGF(如WO2006020919中所公开的)。这可通过降低血清的浓度来实现，或作为另一种选择，通过使用缺少胰岛素和IGF的化学成分确定的培养基来实现。化学成分确定的培养基的例子在Wiles等人(Exp Cell Res.1999 Feb 25；247(1)：241-8.)中有所公开。
所述培养基可具有在约0％至约10％范围内的血清浓度。在一个替代实施例中，该浓度可在约0％至约5％的范围内。在一个替代实施例中，该浓度可在约0％至约2％的范围内。在一个替代实施例中，该浓度可以为约2％。
用激活素A和Wnt配体培养的时间可以在约1天至约7天的范围内。在一个替代实施例中，该培养时间可以在约1天至约3天的范围内。在一个替代实施例中，该培养时间可以为约3天。
激活素A可以任何适于引起人胚胎干细胞分化的浓度使用。该浓度可以为约1pg/ml至约100μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约1μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约50ng/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约100ng/ml。
可对Wnt配体的选择进行优化以提高分化方法的效率。Wnt配体可选自Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一个实施例中，Wnt配体为Wnt-1。在一个替代实施例中，Wnt配体为Wnt-3a。
Wnt配体可以是约1ng/ml至约1000ng/ml的浓度。在一个替代实施例中，该浓度可以为约10ng/ml至约100ng/ml。
所述的单种培养基还可以含有GSK-3B抑制剂。GSK-3B抑制剂可选自GSK-3B抑制剂IX和GSK-3B抑制剂XI。在一个实施例中，GSK-3B抑制剂是GSK-3B抑制剂IX。
当用GSK-3B抑制剂培养人胚胎干细胞时，GSK-3B抑制剂的浓度可以为约1nM至约1000nM。在一个替代实施例中，将人胚胎干细胞用浓度为约10nM至约100nM的GSK-3B抑制剂培养。
单种培养基还可含有至少一种其他额外的因子，这些因子可增强从人胚胎干细胞形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和-BB、富血小板血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)、胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体、Exendin-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂(例如三亚乙基五胺)、毛喉素、丁酸-Na、激活素、β细胞素、ITS、成头蛋白、神经突生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27添加剂(Gibco，CA)、甾体类生物碱(例如环巴胺(EMD，CA))、角质细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体提取物、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印第安豪猪蛋白、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。
所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No：HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)获得的调理培养基提供。
使用两种培养基，在细胞外基质上人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞：人胚胎干细胞分化成定形内胚层谱系细胞可通过使用两种培养基与激活素-A和Wnt配体一起培养来完成。因而，人胚胎干细胞的分化可如下完成：
a.将人胚胎干细胞接种在包被有细胞外基质的组织培养基材上，
b.将人胚胎干细胞与激活素A和Wnt配体在第一培养基中培养，并且
c.将人胚胎干细胞与激活素A在第二培养基中培养。
第一培养基可含有低浓度的血清，而第二培养基可含有浓度比第一培养基高的血清。
第二培养基可含有Wnt配体。
第一培养基：第一培养基应该含有足够低浓度的某些因子以使人胚胎干细胞能分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，所述因子为例如胰岛素和IGF(如WO2006020919中所公开的)。这可通过降低血清的浓度来实现，或作为另一种选择，通过使用缺少胰岛素和IGF的化学成分确定的培养基来实现。化学成分确定的培养基的例子在Wiles等人(Exp Cell Res.1999 Feb 25；247(1)：241-8.)中有所公开。
相对于第二培养基，在第一培养基中可存在较低浓度的血清。在第二培养基中增加血清浓度可增加细胞的存活率，或者可增强细胞的增殖。第一培养基的血清浓度可以在约0％至约10％的范围内。或者，第一培养基的血清浓度可以在约0％至约2％的范围内。或者，第一培养基的血清浓度可以在约0％至约1％的范围内。或者，第一培养基的血清浓度可以为约0.5％。
当使用至少两种培养基将人胚胎干细胞与激活素A和Wnt配体一起培养时，在第一培养基中的培养时间可在约1天至约3天的范围内。
激活素A可以任何适于引起人胚胎干细胞分化的浓度使用。该浓度可以为约1pg/ml至约100μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约1μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约50ng/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约100ng/ml。
可对Wnt配体的选择进行优化以提高分化方法的效率。Wnt配体可选自Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一个实施例中，Wnt配体为Wnt-1。在一个替代实施例中，Wnt配体为Wnt-3a。
Wnt配体可以是约1ng/ml至约1000ng/ml的浓度。在一个替代实施例中，该浓度可以为约10ng/ml至约100ng/ml。
所述的第一培养基还可以含有GSK-3B抑制剂。可将GSK-3B抑制剂加入第一培养基中、加入第二培养基中，或加入第一和第二培养基两者中。
GSK-3B抑制剂可选自GSK-3B抑制剂IX和GSK-3B抑制剂XI。在一个实施例中，GSK-3B抑制剂是GSK-3B抑制剂IX。
当用GSK-3B抑制剂培养人胚胎干细胞时，GSK-3B抑制剂的浓度可以为约1nM至约1000nM。在一个替代实施例中，将人胚胎干细胞用浓度为约10nM至约100nM的GSK-3B抑制剂培养。
第一培养基也可含有至少一种其他额外的可增强从人胚胎干细胞形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的因子。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和-BB、富血小板血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)、胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体、Exendin-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂(例如三亚乙基五胺)、毛喉素、丁酸-Na、激活素、β细胞素、ITS、成头蛋白、神经突生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27添加剂(Gibco，CA)、甾体类生物碱(例如环巴胺(EMD，CA))、角质细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体提取物、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印第安豪猪蛋白、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。
所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No：HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)获得的调理培养基提供。
第二培养基：第二培养基应含有某些因子，例如胰岛素和IGF(如WO2006020919中所公开的)，其浓度足以促进所培养的细胞的存活。这可通过增加血清浓度，或作为另一种选择，通过使用化学成分确定的培养基(其中胰岛素和IGF的浓度相对于第一培养基有所增加)来实现。化学成分确定的培养基的例子在Wiles等人(Exp Cell Res.1999 Feb 25；247(1)：241-8.)中有所公开。
在具有较高浓度血清的第二培养基中，第二培养基的血清浓度可以在约0.5％至约10％的范围内。或者，第二培养基的血清浓度可以在约0.5％至约5％的范围内。或者，第二培养基的血清浓度可以在约0.5％至约2％的范围内。或者，第二培养基的血清浓度可以为约2％。当用第二培养基培养人胚胎干细胞时，培养时间可以为约1天至约4天。
与第一培养基类似，激活素A可以适于引起人胚胎干细胞分化的任何浓度使用。该浓度可以为约1pg/ml至约100μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约1μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约50ng/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约100ng/ml。
Wnt配体可以是约1ng/ml至约1000ng/ml的浓度。在一个替代实施例中，该浓度可以为约10ng/ml至约100ng/ml。
Wnt配体可选自Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一个实施例中，Wnt配体为Wnt-1。在一个替代实施例中，Wnt配体为Wnt-3a。
第二培养基还可以含有GSK-3B抑制剂。可将GSK-3B抑制剂加入第一培养基中、加入第二培养基中，或加入第一和第二培养基两者中。
GSK-3B抑制剂可选自GSK-3B抑制剂IX和GSK-3B抑制剂XI。在一个实施例中，GSK-3B抑制剂是GSK-3B抑制剂IX。
当用GSK-3B抑制剂培养人胚胎干细胞时，GSK-3B抑制剂的浓度可以为约1nM至约1000nM。在一个替代实施例中，将人胚胎干细胞用浓度为约10nM至约100nM的GSK-3B抑制剂培养。
与第一培养基类似，第二培养基还可含有至少一种其他额外的可增强从人胚胎干细胞形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的因子。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和-BB、富血小板血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)、胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体、Exendin-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂(例如三亚乙基五胺)、毛喉素、丁酸-Na、激活素、β细胞素、ITS、成头蛋白、神经突生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27添加剂(Gibco，CA)、甾体类生物碱(例如环巴胺(EMD，CA))、角质细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体提取物、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印第安豪猪蛋白、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。
所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No：HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)获得的调理培养基提供。
本发明通过(但不限于)以下实例进一步说明。
实例1
人胚胎干细胞培养物
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞的能力、移植后产生多种胚层的组织的能力以及注射入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。
从WiCell Research Institute，Inc.，(Madison，WI)获得人胚胎干细胞系H1、H7和H9，并根据该来源公司提供的说明进行培养。简而言之，在ES细胞培养基中，在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养细胞，所述培养基由补充有20％的Knockout血清替代品、100nM的MEM非必需氨基酸、0.5mM的β-巯基乙醇、2mM的L-谷氨酰胺和4ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(全部得自Invitrogen/GIBCO)的DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO)组成。衍生自E13至13.5小鼠胚胎的MEF细胞从Charles River购得。将MEF细胞在补充有10％FBS(Hyclone)、2mM谷氨酰胺和100mM MEM非必需氨基酸的DMEM培养基中扩增。用10μg/mL丝裂霉素C(Sigma，St.Louis，MO)处理亚汇合的MEF细胞3小时以使细胞***停滞，然后用胰蛋白酶进行处理并以2×104/cm2接种于0.1％牛明胶包被的培养皿上。将传代两次至四次的MEF细胞用作饲养层。将接种于MEF细胞饲养层上的人胚胎干细胞在37℃的5％CO2气氛中，在增湿的组织培养箱内进行培养。当汇合时(接种后大约5-7天)，用1mg/ml IV型胶原酶(Invitrogen/GIBCO)处理人胚胎干细胞5-10分钟，然后用5ml吸管轻轻刮落。将细胞以900rpm离心5分钟，将沉淀颗粒在新鲜培养基中重新悬浮并以1∶3至1∶4的细胞比率重新铺板。
同时，将H1、H7和H9人胚胎干细胞也接种于包被有低生长因子MATRIGEL(BD Biosciences)的1∶30稀释物的板上并在补充有8ng/mL的bFG的FMEF调理培养基中培养。将在MATRIGEL上培养的细胞用胶原酶IV(Invitrogen/GIBCO)、分散酶(BD Biosciences)或LIBERASE酶进行常规的传代。将该人胚胎干细胞培养中的一些在低氧条件(大约3％的O2)下孵育。
实例2
荧光激活细胞分选(FACS)分析
通过与TrypLETM Express溶液(Invitrogen，CA)孵育五分钟将粘附的人胚胎干细胞从培养平板移出。将脱离的细胞再悬浮于人胚胎干细胞培养基中并通过离心回收，随后将细胞在由PBS(Sigma，MO)中的2％BSA、0.05％叠氮化钠组成的染色缓冲液中进行洗涤和再悬浮。在适当时，用0.1％γ-球蛋白(Sigma)溶液对细胞进行Fc-受体封闭15分钟。将等分试样(大约1×105个细胞)与藻红蛋白(PE)或别藻蓝蛋白(APC)缀合的单克隆抗体(每1×106个细胞5μl抗体)一起孵育，如表IA中所标明的，或与未缀合的一抗一起孵育。对照包括合适的同型匹配抗体、未染色的细胞和仅用缀合的二抗染色的细胞。所有与抗体一起进行的孵育均在4℃下进行30分钟，之后用染色缓冲液洗涤细胞。将用未缀合的一抗染色的样品在4℃下与缀合的PE或-APC标记的二抗一起另外孵育30分钟。所用二抗的列表参见表IB。将洗涤过的细胞离心并将沉淀物再悬浮于染色缓冲液中，用FACS Array(BDBiosciences)仪器，收集至少10,000次事件，来鉴别细胞表面分子。
实例3
免疫细胞化学分析
在室温下将贴壁细胞用4％多聚甲醛固定20分钟。将固定的细胞在室温下用PBS/0.1％BSA/10％正常鸡血清/0.5％Triton X-100封闭1小时，然后在4℃下与一抗在PBS/0.1％BSA/10％正常鸡血清中孵育过夜。一抗及其使用稀释度的列表示于表IA中。在PBS/0.1％的BSA中洗涤三次后，将在PBS中以1∶100稀释的荧光二抗(表IB)与细胞在室温下孵育1小时使之结合。对照样品包括其中忽略了一抗或其中一抗替换为相同浓度的对应匹配阴性对照免疫球蛋白作为一抗的反应物。冲洗染色的样品；将一滴含有二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)的
(Invitrogen，CA)加入各样品中以对细胞核进行复染以及用作抗褪色试剂。用Nikon Confocal Eclipse C-1倒置显微镜(Nikon，Japan)和10-60倍物镜获取图像。
实例4
ES衍生的细胞的PCR分析
RNA提取、纯化和cDNA合成：通过在存在含乙醇的高盐缓冲液的情况下与硅胶膜(Rneasy Mini Kit，Qiagen，CA)结合，随后通过洗涤来除去污染物来对RNA样品进行纯化。用TURBO DNA-free试剂盒(Ambion，INC)使RNA进一步纯化，并随后将高质量的RNA在水中稀释。通过在分光光度计上读取A260和A280读数来评估产率和纯度。用ABI(ABI，CA)大容量cDNA库试剂盒从纯化的RNA制备cDNA拷贝。
实时PCR扩增和定量分析：除非另外说明，否则所有试剂均购自Applied Biosystems。实时PCR反应用ABI
7900序列检测***来进行。将
UNIVERSAL PCR MASTER
(ABI，CA)用于20ng的逆转录RNA，总反应体积为20μl。每种cDNA样品重复运行两次以校正吸量误差。引物和FAM标记的TAQMAN探针以200nm的浓度使用。使用此前由Applied Biosystems开发的人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)内源性对照对每一个靶标基因的表达水平进行归一化。引物和探针组在表II中列出。SOX-17引物用PRIMERS程序(ABI，CA)设计，为如下序列：SOX-17：TGGCGCAGCAGATACCA、AGCGCCTTCCACGACTTG和CCAGCATCTTGCTCAACTCGGCG。在50℃下2分钟，然后在95℃下10分钟的初始孵育后，将样品进行40次分两个阶段的循环-在95℃进行15秒的变性步骤，然后在60℃下进行1分钟的退火/延伸步骤。用序列检测***软件进行数据分析。对于每个引物/探针组，Ct值确定为荧光强度达到扩增指数区中部中的特定值时的循环数。用比较性Ct方法来计算相对基因表达水平。简而言之，对于每种cDNA样品，从所关注基因的Ct值减去内源对照Ct值而得到改变的Ct值(ΔCt)。靶标的归一化量计算为2-ΔCt，假设扩增为100％的效率。最终的数据是相对于校准样品表示的。
实例5
在包被有MATRIGEL的组织培养基材上培养的人胚胎干细胞向定形内
胚层(DE)的分化
将来自第54代人胚胎干细胞系H9的细胞在在低氧条件(大约3％O2)下培养并接种于包被有MATRIGEL(1∶30稀释物)的培养皿上，暴露于补充有0.5％FBS、20ng/mL WNT-3a(目录号1324-WN-002，R&DSystems，MN)和100ng/mL激活素-A(R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/mL激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理3-4天。图1示出了在第4天通过FACS测定的CXCR4的表达。图2示出了在第4天和第6天，来自用低血清+AA+WNT3A处理的人胚胎干细胞系H9的细胞的培养物的实时PCR数据。该方案导致定形内胚层标志物显著上调。将该程序另外称为DE(定形内胚层)方案。
实例6
向定形内胚层阶段分化的人胚胎干细胞衍生细胞的分离和扩增
将来自人胚胎干细胞系H1和H9多个传代(第30-54代)的细胞在低氧条件(大约3％的O2)下培养至少三代。根据实例1将细胞在补充有8ng/mL bFGF的MEF-CM中培养并接种于包被有MATRIGEL的板上。使细胞暴露于实例5中描述的DE方案。在第3天至第6天，使培养物暴露于TrypLETM Express溶液(Invitrogen，CA)5分钟。将脱离的细胞再悬浮于DMEM-F12+2％FBS培养基中，离心回收，并用血球计进行计数。将脱离的细胞以1000-10,000个细胞/cm2接种于组织培养聚苯乙烯(TCPS)处理过的培养瓶上并在标准组织培养箱中，于37℃在低氧条件(大约3％的O2)下在DMEM-F12+2％FBS+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT-3A中培养。该TCPS培养瓶未用MATRIGEL或其他细胞外基质蛋白包被。每日更换培养基。在某些培养物中，该培养基还补充有10-50ng/mL IGF-I(胰岛素生长因子-I，购自R&D Systems，MN)或1X ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒，购自Invitrogen，Ca)。在某些培养条件下，基础培养基(DM-F12+2％FBS)还补充有0.1mM的巯基乙醇(Invitrogen，CA)和非必需氨基酸(1X，NEAA，购自Invitrogen，CA)。将第一代细胞称为P1。与之平行进行，在常氧条件(大约21％的O2)下建立相似的培养物。该分离程序的略图示于图3中。
在培养5至15天后，明显的细胞集落呈现出被大量扩大的细胞围绕，这些扩大的细胞看起来处于衰老状态(图4a-b)。在大约50至60％汇合时，通过在室温下暴露于TrypLETM Express溶液5分钟来对培养物进行传代。将脱离的细胞再悬浮于DMEM-F12+2％FBS培养基中，离心回收，在组织培养聚苯乙烯(TCPS)处理过的培养瓶上以10,000个细胞/cm2接种于DMEM-F12+2％FBS+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT-3A+/-50ng/mLIGF-I中。将该培养基另外称为“生长培养基”。图4c示出了以10,000个细胞/cm2接种的第3代细胞的形态。在第3代(分图c)初次分离后，细胞看起来具有一致的上皮样形态，细胞核与细胞质的比例大。
在一些培养物中，生长培养基另外补充有1X NEAA加0.1mM巯基乙醇。在第三代至***后，贴壁细胞看起来具有一致的形态，细胞核与细胞质的比例大。在常氧条件下建立的平行培养物未能显示出由贴附细胞形成强健的集落。在第2-3代后，在常氧条件下建立的培养物由于生长速率低而被废弃。
实例7
激活素-A、WNT3A和IGF-I在多次传代后的扩增和DE标志物维持中
的作用
将根据实例6中描述的方法衍生自亲本人胚胎干细胞系H9的培养物每4-7天传代一次。图5示出了在2％FBS+DMEM-F12+100ng/mL激活素-A+20WNT3A中培养三代的扩增细胞的实时PCR结果。该数据是针对在实例5中所述DE方案的第6天分离的细胞系。在每次传代后，DE标志物(例如SOX-17和HNF-3β)有明显降低。如图6所示，向含有激活素-A的生长培养基添加WNT3A导致DE标志物的表达有显著增强。然而，添加50ng/mL IGF-I以及取消激活素-A和WNT-3A(图7a-c)导致DE标志物连同OCT-4的表达有急剧下降，并且内脏内胚层标志物(例如SOX-7和AFP)的表达增加。图8a-c示出了衍生自第5代H9p54的扩增细胞的形态，所述细胞在a)2％ FBS+DMF12+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT-3A、b)2％FBS+DM-F12+100ng/mL激活素-A、c)2％FBS+DM-F12+50ng/mL IGF-I中培养。在存在激活素-A或激活素-A+WNT3A的情况下培养的细胞的形态十分相似并且与在2％FBS+IGF-I中培养的细胞的形态截然不同。
实例8
向定形内胚层阶段分化的人胚胎干细胞衍生细胞的扩增潜能
当生长培养基含有50ng/mL IGF-I或ITS时，将根据实例6中描述的方法从亲本人胚胎干细胞系H9建立的培养物每4-5天传代一次。然而，供给缺少IGF或ITS补充剂的生长培养基的培养物显示出较慢的生长速率，将其每5-7天传代一次。供给生长培养基+50ng/mL IGF-I的细胞的群体倍增时间为大约55小时，而仅供给生长培养基的培养物的群体倍增时间为大约75小时。将根据实例6扩增的细胞群体称为EXPRES细胞(可扩增的前原条细胞)。表III列出了根据实例6所述方法建立的多种EXPRES细胞。在图9中示出了两种细胞系(EXPRES 01和02)的扩增潜能。
实例9
从单个人胚胎干细胞的悬浮液衍生EXPRES细胞
将来自第33代的人胚胎干细胞系H1和第45代的细胞系H9的细胞在低氧条件(大约3％的O2)下培养至少三代。根据实例1将细胞在补充有8ng/mL bFGF的MEF-CM中培养并接种于包被有MATRIGEL的板上。在大约60％汇合时，使培养物暴露于TrypLETMExpress溶液(Invitrogen，CA)5分钟。将脱离的细胞再悬浮于DMEM-F12+2％FBS培养基中，离心回收，并用血球计进行计数。将脱离的细胞以1000至10,000个细胞/cm2接种于组织培养聚苯乙烯(TCPS)处理过的培养瓶上并在标准组织培养箱中，于37℃在低氧条件(大约3％的O2)下在DM-F12+2％FBS+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT-3A+50ng/mL IGF-I+0.1mM巯基乙醇(Invitrogen，CA)和非必需氨基酸(1X，NEAA，购自Invitrogen，CA)中培养。该TCPS培养瓶未用MATRIGEL或其他细胞外基质蛋白包被。每日更换培养基。将第一代称为P1。与之平行进行，在常氧条件(大约21％的O2)下建立相似的培养物。在大气条件下建立的培养物不形成集落，并且细胞增殖差。然而，在低氧条件下建立的培养物形成许多集落(图10)，类似在MATRIGEL或在MEF饲养细胞上培养的胚胎干细胞集落。这些培养物极类似于在ES向DE分化期间分离的EXPRES细胞的性质。
实例10
EXPRES细胞的细胞表面蛋白的表达
对细胞系EXPRES 01和EXPRES 02的多种细胞表面标志物(包括与多潜能相关的标志物)的表达进行了评价。在第9代至第24代对来自EXPRES 01的细胞进行评价。在第7代至第20代对来自EXPRES 02的细胞进行评价。两个细胞系均表现出通常归为未分化人胚胎干细胞的多潜能标志物的强表达。然而，与EXPRES 01系相比，EXPRES 02系显示分化标志物(例如CXCR4、LIF受体和NCAM)的表达百分比较高。图11示出了第24代EXPRES 01的代表性FACS图，图12示出了第21代EXPRES 02系的代表性FACS图。表IV列出了来自三个不同实验的所评价细胞表面标志物的平均表达水平以及范围(括号内)。
实例11
EXPRES细胞的多潜能性相关标志物的表达-免疫荧光(IF)染色
使用实例3中所述方法，针对多潜能性相关标志物对维持在它们各自生长培养基中的EXPRES 01和02细胞进行染色。图13示出了在2％FBS+DM-F12+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT3A+50ng/mL IGF-I中培养的EXPRES 01P10细胞的针对OCT-4、Nanog、SOX-2和HNF-3β的IF图像。图14示出了在2％FBS+DM-F12+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT3A中培养的第9代EXPRES 02细胞的针对OCT-4、Nanog、SOX-2和HNF-3β的IF图像。EXPRES 01细胞对OCT-4、Nanog和SOX-2是强染色阳性的，对HNF-3β是弱染色阳性。然而，EXPRES 02显示出较强的HNF-3β表达，而显示出较弱的OCT-4、NANOG和SOX-2表达。
实例12
通过实时PCR分析定形内胚层和未分化的胚胎干细胞的标志物的表达
对由在它们各自生长培养基中培养的第11代EXPRES 01和第7代EXPRES 02系表达的胚胎标志物(POU5F1、SOX-2、UTF1、ZFP42、连接蛋白43、连接蛋白45、FOXD3)、胚外标志物(AFP、KRT15)、外胚层标志物(SOX-1、TUBB3、NESTIN)、内胚层标志物(FOXA2、IPF1、KRT15、GATA-4)和中胚层标志物(GATA-4、GATA-2、MYOD、MSX1、CFC1、ABCG2)的实时PCR分析在图15a-h中示出。所有的数据均归一化为相对于来自在MEF-CM中在包被有MATRIGEL的板上培养的人胚胎干细胞系H9的未分化细胞的改变倍数。作为对照，采用胶原酶消化和在DMEM-F12+20％FBS中在未经处理的表面上接种大约10天的标准方法，从H9细胞形成拟胚体。与未分化的ES细胞细胞相比，拟胚体上调了多个胚层的基因表达。从在MEF-CM中在MATRIGEL上培养的未分化SA002系(Cellartis，Sweden)收集另一参照RNA。正如预期的，与EXPRES 01、EXPRES 02、SA002和H9系相比，拟胚体大大上调了多个胚层的基因表达。与未分化的SA002和H9系相比，EXPRES 01和02系两者均显示了FOXA2的表达。这两种EXPRES系均未显示出胚外、中胚层或外胚层标志物的强表达。此外，EXPRES细胞的胚胎标志物表达与SA002和H9参照细胞系相似。
实例13
可用于EXPRES细胞扩增的多种生长培养基
已成功地将EXPRES细胞在如下培养基组合物中培养了至少2-30代：
1.DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A
2.DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+50ng/mLIGF-I
3.DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+10ng/mLIGF-I
4.DM-F12+2％FBS+50ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+50ng/mLIGF-I
5.DM-F12+2％FBS+50ng/mL AA+10ng/mL WNT-3A+50ng/mLIGF-I
6.DM-F12+2％FBS+50ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+10ng/mLIGF-I
7.DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+10ng/mL WNT-3A+10ng/mLIGF-I
8.HEScGRO确定培养基(Chemicon，CA)
上面列出的培养基的基础组分可用类似的培养基例如RPMI、DMEM、CRML、KnockoutTMDMEM和F12替代。
实例14
在组织培养基材上培养的EXPRES细胞向定形内胚层(DE)细胞的分化
使在它们各自培养基中在TCPS上培养的第5代EXPRES 01细胞和第4代EXPRES 02细胞暴露于补充有0.5％FBS、20ng/mL WNT-3a和100ng/mL激活素-A(R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/mL激活素-A(M)的DMEM/F12培养基另外处理3-5天。图16示出了在第4天通过FACS测定的EXPRES 01细胞的CXCR4表达(图16a，大约17％CXCR4阳性)和EXPRES 02细胞的CXCR4表达(图16b，大约40％CXCR4阳性)。图17显示了在第2-5天，用低血清+AA+WNT3A处理的EXPRES 01细胞培养物的实时PCR数据(图17a)和EXPRES 02细胞培养物的实时PCR数据(图17b)。图18和19分别示出了用上述相同处理方法处理4天的EXPRES 01和02细胞的免疫荧光染色图像。与EXPRES 01细胞相比，总体的EXPRES 02细胞看起来显示出较强的DE标志物表达。从FACS、免疫染色和PCR数据可看出，降低血清浓度以及移除IGF的确增强了DE标志物的表达。然而，DE标志物(例如CXCR4和HNF-3β)的总体表达水平低于我们日常在向DE阶段分化的未分化人ES培养物中所观察到的。
为了增强DE标志物的表达，将DE分化方案改变为如下：使在它们各自培养基中在TCPS上培养的第19代EXPRES 01细胞和第14代EXPRES02细胞暴露于补充有0.5％FBS、20ng/mL WNT-3a、100ng/mL激活素-A和100nM GSK-3B抑制剂IX(目录号361550，Calbiochem，CA)的DMEM/F12培养基4至5天。图20示出了在第4天通过FACS测定的EXPRES 01的CXCR4表达(图20a，大约57％为CXCR4阳性)和EXPRES 02的CXCR4表达(图20b，大约86％为CXCR4阳性)。图21示出了在第5天向DE阶段分化的EXPRES 01细胞(分图a-f)和EXPRES 02细胞(分图g-l)的对应免疫荧光图像。图22示出了EXPRES 01的实时PCR数据(图22a)和EXPRES 02(图22b)的实时PCR数据。
实例15
接种密度对EXPRES 01细胞向DE分化的影响
在37℃下在标准组织培养箱中，将EXPRES 01P31细胞在低氧条件(大约3％的O2)以5000、10000、20000或40000个细胞/cm2接种于DM-F12+2％FBS+0.1mM巯基乙醇+1X，NEAA+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT3A中的TCPS板上。接种后的两天后，将培养基转换为DMEM-F12+0.5％FBS+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT3A+100nMGSK-3B抑制剂IX，在37℃低氧条件(大约3％的O2)下在标准组织培养箱中培养四天。图23示出了在分化的第4天定形内胚层标志物的实时PCR分析。看起来，接种密度为至少10000-20000个细胞/cm2是稳定形成定形内胚层所需的。
实例16
EXPRES细胞的端粒长度
通过使用Telo TAGGG端粒长度测定剂盒(Roche，IN)按照生产商的说明书分析了根据实例5分离的两种EXPRES系以及来自人胚胎干细胞系H1的未分化细胞的端粒长度图24示出了第24代EXPRES 01细胞、第17代EXPRES 02细胞、第40代H1细胞、试剂盒所提供的高端粒对照和低端粒对照连同标度标志物(scale marker)的端粒长度。两个细胞系均看起来具有比未分化的ES细胞短的端粒长度。
实例17
在组织培养基材上培养的EXPRES细胞向胰腺内胚层的进一步分化
通过在0.5％FBS、DMEM：F12培养基中用100ng/mL激活素-A、10ng/mL Wnt3a和100nM GSK3β抑制剂IX处理，使第21代EXPRES 01细胞进行5天的分化。通过FACS分析细胞，显示80％的细胞是CXCR4阳性的。然后将细胞在如下步骤中每一步中处理3天：用含有50ng/mL FGF-10和0.25mM KAAD-环巴胺(Calbiochem，CA)的2％FBS DMEM：F12处理；然后，用含有50ng/mL FGF-10、0.25mM KAAD-环巴胺和1mM视黄酸(Sigma，MO)的低葡萄糖1％B27 DMEM处理；接着，用含有1mM DAPT(Calbiochem，CA)加50ng/mL Exendin4(Sigma，MO)的低葡萄糖1％B27DMEM处理；最后，用含有每种50ng/mL的IGF、HGF和Exendin4的1％B27 DMEM CMRL处理。在每一步结束采集样品，提取细胞的RNA。针对示出的标志物进行Q-RT PCR。如图25所示，较于未处理细胞胰岛素水平增加100倍，PDX-1水平也增加1000倍。
实例18
在组织培养基材上培养的EXPRES细胞向前肠内胚层的进一步分化
通过在0.5％FBS、DMEM：F12培养基中用100ng/mL激活素-A、20ng/mL Wnt3a和100nM GSK3β抑制剂IX处理，使第35代EXPRES01细胞进行5天的分化。通过FACS分析细胞，显示大约70％的细胞是CXCR4阳性的。然后将细胞在如下步骤中每一步中处理：用含有50ng/mL FGF-10和0.25mM KAAD-环巴胺(Calbiochem，CA)的2％FBS DMEM：F12处理3天；步骤3，用含有50ng/mL FGF-10、0.25mM KAAD-环巴胺和1mM视黄酸(Sigma，MO)的低葡萄糖1％B27DMEM处理4天；步骤4，含有1mMDAPT(Calbiochem，CA)加50ng/mL Exendin4(Sigma，MO)的低葡萄糖1％B27DMEM处理4天。该方案是基于先前的出版物D’Amour等人(Nature Biotech，24，1392，2006)。在阶段4结束时固定细胞，针对PDX-1、HNF-3β、SOX-17、白蛋白、抗胰蛋白酶和CDX-2进行染色。如图26所示，可使EXPRES细胞容易地向前肠内胚层分化，这可通过PDX-1(大约20％的培养物染色阳性)、HNF-3β(大约90％阳性)、白蛋白(大约5％阳性)、抗1-胰蛋白酶(大约70％阳性)、SOX-17(大约70％)和CDX-2(大约5％阳性)的表达来度量。
实例19
EXPRES细胞与未分化的人胚胎干细胞相比较的微阵列分析
使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)从第44代人胚胎干细胞系H9、第11代EXPRES 01和第7代EXPRES 02分离总RNA：所有的组均含有一式三份生物样品并且每份相同生物样品在两个独立的基因芯片上进行重复试验。样品制备、杂交以及图像分析根据Affymetrix Human Genome U133Plus 2.0Array进行。在归一化和对数转换后，用
软件(MA)和GENESIFTER(VizXLabs，WA)进行数据分析。利用方差分析和采用小于或等于0.05的校正P值(Benjamini-Hochberg校正)的F检验评价样品之间的显著差异。仅将在至少一个组中具有存在响应(present call)的基因包括在内。表V列出了在不同组(未分化的ES、EXPRES 01和EXPRES 02细胞)之间显示至少5倍差异的基因的平均归一化的对数转换过的信号强度以及每种基因的校正P值。代表原条或定形内胚层的基因以黑体突出显示。表V中仅示出了受到上调或下调的前200种基因。
实例20
向DE阶段分化的EXPRES细胞与向DE阶段分化的人胚胎干细胞相比
较的微阵列分析
使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)从下述培养物分离总RNA：A)H9P33细胞，其在MATRIGEL(1∶30的稀释液)包被的板上培养并暴露于补充有0.5％的FBS和100ng/mL激活素A及20ng/mL wnt3A的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％的FBS和100ng/mL激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天；B)第24代EXPRES 01细胞，其在TCPS上培养并暴露于补充有0.5％的FBS和100ng/mL激活素A、20ng/mL WNT3A和100nmGSK-3B IX抑制剂(目录号361550，Calbiochem，CA)的DMEM/F12培养基五天；C)第17代EXPRES02细胞，其在TCPS上培养并暴露于补充有0.5％FBS、100ng/mL激活素-A、20ng/mL WNT3A和100nm GSK-3B IX抑制剂(目录号361550，Calbiochem，CA)的DMEM/F12培养基五天；D)H9P39细胞，其在MATRIGEL(1∶30稀释液)包被的板上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/mL激活素-A以及20ng/mL wnt3A的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/mL激活素-A(AA)的DMEM/F12培养基再处理两天。在第2小时、第6小时、第24小时、第30小时、第48小时、72小时和第96小时从D组收集RNA样品。还将在它们各自生长培养基中培养的EXPRES 01和02包括在内作为对照。所有的组均包括一式三份生物样品并且每份均在两个独立的基因芯片上进行重复实验。
样品制备、杂交以及图像分析根据Affymetrix Human Genome U133Plus2.0 Array进行。在归一化和对数转换后，用
软件(MA)和GENESIFTER(VizXLabs，WA)进行数据分析。利用方差分析和采用小于或等于0.05的校正P值(Benjamini-Hochberg校正)的F检验评价样品之间的显著差异。仅将在至少一个组中具有存在响应的基因包括在内。表VI列出了在各时间点在A组、B组、C组和D组之间显示至少5倍差异的基因的平均归一化的对数转换信号强度以及每种基因的校正P-值。表VI中仅示出了受到上调或下调的前200种基因。代表原条或定形内胚层的基因以黑体突出显示。表VII列出了每个比较组的相关系数。与相关系数对应的散点图在图27中示出。EXPRES 01细胞的总体表达谱看起来类似于DE阶段第30小时或更短时的样品的表达谱，而EXPRES 02细胞看起来类似于DE阶段超过48小时时的样品的表达谱。
实例21
拟胚体的形成和向多种谱系的分化
用TrypLETM Express溶液将第27代EXPRES 01培养物作为单细胞移出，以200g离心4分钟，并重新悬浮于DMEM-F12+20％FBS中。将该细胞悬浮液接种于低粘附力陪替培养皿上。接种后3-4天，形成了拟胚体(EB)样结构(图28)。用DMEM-F12+2％FBS+1微摩尔每升的视黄酸处理培养物诱导了外胚层标志物(例如NeuroD)的表达。
实例22
在NOD-SCID小鼠的肾囊中形成畸胎瘤
用TRYPLE使来自第42代人胚胎干细胞系H9的未分化细胞、第30代EXSPRES 01和第22代EXPRES 02细胞从培养物脱离，在基础培养基中洗涤，然后悬浮于DMEM-F12基础培养基中。将大约1×106个第42代未分化的H9细胞、一百五十万个EXPRES 01和02细胞注射进六周龄NOD-SCID小鼠的肾囊中。移植后五周，处死小鼠，切取肾并将其在***中固定或将其置于裂解缓冲液中以收集RNA用于后续的PCR分析。图29示出了所收集的样品的中胚层、外胚层、内胚层、胚外内脏内胚层特征性标志物和多潜能标志物的表达。与H9系类似，两种EXPRES系均显示所有胚层以及胚外内胚层都有强的表达。
实例23
EXPRES 03细胞的增殖和细胞周期分析
人胚胎干细胞具有与其他体细胞区别明显的独特细胞周期状态，表征为S-期细胞比例高，G期(G1期和G2期)缩短或截短。hES中的细胞周期控制机制可能在功能上与这些细胞的自我更新和多潜能能力相关，并且可能与它们分化的/定向的对应物中的控制机制不同。这些实验设计用于确定已显示可表达多潜能hES细胞的多种标志物的EXPRES细胞的细胞周期性质。
方法：将细胞以5,000-10,000个细胞/cm2接种于Cell Bind组织培养瓶(Corning)中并培养2-4天。将EXPRES 03细胞在含有2％FBS的生长培养基中或在DMEM/F12和激活素-A(100ng/mL)、wnt3a(10-20ng/mL)及IGF(50ng/mL)中培养。为了进行对比增殖分析，有时候将IGF从生长因子混合物中省去。使用APC BRDU Flow试剂盒根据生产商的推荐说明(BDBiosciences，San Diego，CA)分析细胞增殖。简而言之，在培养周期末将细胞用BRDU脉冲处理1-2小时，用Tryple E Express使之脱离并计数。将细胞在BD Cytofix/Cytosperm缓冲液中固定，孵育30分钟，然后在冰上用BDCytoperm缓冲液温育10分钟。然后在37℃下用DNA酶处理细胞1小时以暴露于掺入的BRDU，然后用APC缀合的抗BRDU抗体染色。为了进行细胞周期分析，将细胞用7AAD染色，并在FACS Array上分析。
结果：与高增殖速率的hES细胞相似，EXPRES 03细胞保持了高的增殖速率，如高百分比的S-期细胞所表明的，S-期细胞通过它们整合培养物中BRDU的能力确定。S-期细胞的频率通常高于45％(范围为40-60％)，与hES细胞类似(图30a-c)。尽管在3-4天后，在存在IGF的情况下培养的EXPRES 03细胞的数目为缺少IGF时培养的细胞数目的2-3倍，但在细胞暴露于BRDU 1小时或更久时，S-期细胞的频率仅有微小差别(图30f)。这种高频率的S-期细胞和细胞周期结构与在体细胞中所观察到的不相似，如本文针对人羊水细胞(AFDX002)所表明的(图30d)。此外，丝裂霉素处理过的细胞“小鼠胚胎成纤维细胞”(MEF，图30e)未进入S-期，而是显示出明显积聚在G2/M期(64％)，这可能与丝裂霉素处理过的细胞不能在有丝***时使DNA链分开有关。
实例24
ES细胞与EXPRES细胞的转染效率比较
遗传操纵hES的一个主要限制是其对转染和病毒转导的常规方法的相对抗性。除了它们的高增殖速率外，EXPRES细胞还易于进行体外转染。为了比较转染效率，将EXPRES和hES细胞在培养物中用EGFP转染并通过荧光显微镜法和流式细胞计数方法进行分析。
方法：将EXPRES 01细胞在包含DMEM/F12中的2％FBS、激活素-A(100ng/mL)、wnt3a(10-20ng/mL)和IGF(50ng/mL)的生长培养基中接种于人纤粘蛋白包被的(10ug/mL)6孔组织培养板上。对于细胞簇，将hES细胞用胶原酶通过常规方法传代进MATRIGEL包被的6孔培养板中，并在MEF调理过的hES培养基中培养。对于单个细胞，通过在37℃下使细胞暴露于TRYPLE 3分钟，然后接种于MATRIGEL包被的6孔培养板上而进行传代。当细胞实现所需的汇合度(70-80％)时，根据生产上的推荐说明用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)对细胞进行转染。简而言之，将4mg DNA稀释进250ml Opti-MEM I低血清培养基中。将五微升Lipofectamine 200混合进250ml Opti-MEM I培养基中5分钟，与稀释的DNA轻轻混合。让DNA/Lipofectamine复合物在室温下形成20分钟，然后将其加至各孔，使板具有轻轻地涡旋运动以用轻轻地混合。将细胞在存在复合物的情况下另外孵育24小时，然后全部更换培养基。转染后48小时，通过荧光显微镜法和流式细胞计数对细胞进行分析。
结果：通过转染作为单细胞分散体或细胞簇接种的EXPRES 01细胞和hES细胞来将eGFP的吸收和表达进行比较，在48小时后分析。EXPRES 01细胞显示出高水平的eGFP蛋白表达，通过流式细胞计数分析75％的细胞表达eGFP(图31)。相比之下，hES对转染更有抗性，当使用细胞簇时通过FACS分析仅3％的细胞表达eGFP蛋白。制备hES的单细胞分散体使DNA吸收水平和eGFP表达增强至约20％，但其仍少于EXPRES 01细胞表达约三倍。
实例25
EXPRES细胞作为用于筛选的多用途工具
将EXPRES细胞在含有2％FBS、100ng/mL重组人激活素-A(R&DSystems)和20ng/mL重组小鼠Wnt3a的DMEM：F12培养基(R&D Systems)中培养。用于EXPRES 01细胞的生长培养基还含有50ng/mL重组人IGF-1(R&D Systems)。将两种细胞系均在37℃下在低氧(3％)和5％CO2的气氛中进行常规培养。利用TrypLE酶消化(Invitrogen，CA)使EXPRES 01和EXPRES 02细胞作为单细胞悬浮液从培养物脱离，然后洗涤并计数以确定精确的细胞数目和生活力(＞95％)。将范围为1,250至80,000个细胞的等分试样分配至96孔板(Corning-Costar)的人纤粘蛋白包被的孔中的终体积100μl的培养基中。对照孔是也用纤粘蛋白包被的并且容纳有等同体积的无细胞培养基。让板在于37℃标准低氧、5％CO2条件下孵育的增湿室中平衡过夜。在这期间，细胞贴壁为单层培养物，取决于初始的接种密度而具有不同的汇合程度。在过夜培养后，将20μl MTS试剂(CellTiter 96 Aqueous Assay；Promega)加至每个孔中。MTS被还原成甲臜并且可用作脱氢酶活性的度量，脱氢酶的活性与活细胞的数目直接成比例。将一块板恢复为低氧培养而将同样的对比板在常氧(20％)下培养。在4小时后，在分光光度酶标仪(Molecular Devices)上读取490nm的吸光度。对每个板中的重复样品组确定平均OD、标准偏差和百分比变异系数(CV)的统计计算值，然后与两个板之间的相似孔进行比较。
标准偏差和百分比变异系数值表明，可将EXPRES细胞在孔之间均匀分布以获得高的接种效率和良好的孔之间可重复性(表VIII a-f)。从等同数目细胞的平均OD490读数可看出，EXPRES 01系的代谢活性比EXPRES02系高。对于每种EXPRES系，两个板之间的百分比CV值表明，不管该短期测定法中的气氛氧水平如何对于对比条件而言代谢活性没有差别。通过画出平均OD读数的曲线(图32)测定了处于该测定法的线性范围内的每孔的最佳细胞数：对于EXPRES 01为少于20,000个细胞/孔，对于EXPRES02为少于40,000个细胞/孔。同样，氧水平差异的气氛差异不影响该短期测定法中的最佳细胞数结果。这些结果表明，EXPRES细胞可适于可测量多种试剂对细胞增殖和/或代谢率的毒理学作用的筛选方案。
实例26
衍生自EXPRES细胞的DE样细胞的扩增
先前的实例确定EXPRES细胞可衍生自胚胎干细胞并且可容易地在TCPS上在多种生长培养基中扩增。这些培养基制剂大多数含有IGF作为补充剂或生长培养基中所使用的2％FBS中的胰岛素/IGF。已表明这些因子可通过PI-3激酶途径抑制DE相关基因(Stem cells，25：29-38，2007)。基于DM-F12+0.5％FBS+100ng/mL AA+20ng/mL WNT3A+100nM GSK-3B抑制剂IX配制了一种替代的培养基(另外称为“DE细胞生长培养基”)。在上述培养基中培养的第27代EXPRES 01细胞能够以与在DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+20ng/mL WNT3A+50ng/mL IGF-I中培养的细胞一样的速率增殖。此外，通过实时PCR表明(图33)，在用于DE细胞的生长培养基中培养的细胞表达强的DE标志物经历三次传代。大约72％的细胞表达CXCR4(图34)。
实例27
EXPRES细胞中的靶基因的siRNA抑制
利用siRNA对人胚胎干细胞中的靶基因进行有效抑制极大地受到在作为细胞簇集落培养的人胚胎干细胞中实现高水平转染的能力的限制。使用常规方法容易地用siRNA对EXPRES细胞进行了转染，因而提供了有价值的体系来筛选siRNA寡核苷序列，以及来评价靶基因所发挥的作用。
方法：将EXPRES 03细胞在包含DMEM/F12中的2％FBS、激活素-A(100ng/mL)、wnt3a(10-20ng/mL)和IGF(50ng/mL)的生长培养基中接种于纤粘蛋白包被(10mg/mL)的6孔组织培养板上。对于6孔板，将200,000个细胞接种24小时，然后用siRNA寡核苷酸序列转染。
为了评价靶基因抑制，用Lipofectamine 2000根据生产商推荐说明(Ambion(Applied Biosystems)，Foster City，CA)转染70-80％汇合度的细胞。简而言之，将适当量的siRNA稀释进250ml Opti-MEM I低血清培养基中以实现100nmol的终浓度。将5毫升Lipofectamine 2000稀释进250ml Opti-MEMI培养基中并孵育5分钟。将该复合物在室温下孵育15-20分钟，然后加至细胞同时使板保持轻轻涡旋运动以轻轻混合。将细胞在存在siRNA的情况下孵育另外24小时，然后全部更换培养基。在转染24-48小时后，用荧光显微镜使细胞显像，采集RNA用于通过RT-PCR方法分析靶基因抑制。测试了如下购自Ambion的预先验证过的siRNA寡核苷酸序列：β-连环蛋白(Id.No.42816)和GSK3b(Id.No.42839)。
结果：荧光显微镜法显示当使用荧光标记的SiRNA时EXPRES细胞的siRNA吸收水平非常高(＞80％)(图35)。通过RCR分析了从细胞采集的RNA的靶基因抑制，并与用对照siRNA寡核苷酸转染的细胞相比较。β-连环蛋白和GSK3b siRNA寡核苷酸在EXPRES细胞中实现了非常高水平的基因抑制，有大于93％的基因抑制。针对其他基因靶标例如Hes-1、Oct-4的其他非验证寡核苷酸序列实现的靶基因抑制水平较低且有变化。通过分析其他基因转录物证实了寡核苷酸的特异性，其未显示出任何可测量的抑制。
实例28
EXPRES 01和02系的细胞因子抗体阵列分析
将分别为第22代和第23代的EXPRES 01和02系在它们各自的培养基中培养至大约70％汇合，然后用哺乳动物细胞裂解试剂盒(Sigma-Aldrich，MO)收集细胞裂解物。细胞因子阵列分析用RayBiotech，GA(http://www.raybiotech.com/)提供的细胞因子阵列板(Cytokine Array panel)来完成。表IX a-c列出了在数据归一化和减除背景后的细胞因子、细胞因子和生长因子受体的表达。对于每个阵列板，还包括了阳性和阴性对照。对于每种细胞类型用板测试两份不同样品。
实例29
核型分析
通过G-带分析确定第20代的EXPRES 01细胞和第15代的EXPRES 02细胞的核型。对来自EXPRES 01的二十一个G-带显带的细胞和来自EXPRES 02的二十个G-带显带的细胞进行了细胞遗传学分析。半数G-带显带的EXPRES 01细胞显示出正常的46XX核型，而其他则显示出非正常的核型例如第17号染色体三体性。EXPRES 02系也显示出染色体重排，几乎所有的1号染色体短臂重复。
实例30
在存在Rho-激酶(ROCK)抑制剂的情况下从单人胚胎干细胞的悬浮液衍
生EXPRES细胞
将来自第35代的人胚胎干细胞系H9的细胞在低氧条件(大约3％的O2)下培养至少三代。根据实例1将细胞在补充有8ng/mL bFGF的MEF-CM中培养并接种于MATRIGEL包被的板上。在大约60％汇合时，使培养物暴露于TrypLETMExpress溶液(Invitrogen，CA)5分钟。将脱离的细胞再悬浮于DM-F12+2％FBS培养基中，离心回收，并用血球计进行计数。将脱离的细胞以1000至10,000个细胞/cm2接种于组织培养聚苯乙烯(TCPS)培养瓶上并在标准组织培养箱中，于℃在低氧条件(大约3％的O2)下在DM-F12+2％FBS+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT-3A+50ng/mL IGF-I+0.1mM巯基乙醇(Invitrogen，CA)、非必需氨基酸(1X，NEAA，购自Invitrogen，CA)+/-10μm ROCK抑制剂(Y-27632，Calbiochem，CA)中培养。该TCPS培养瓶未用MATRIGEL或其他细胞外基质蛋白包被。每日更换培养基。将第一代细胞称为P1。如图37中所示，接种后24小时，与在不存在ROCK抑制剂的情况下衍生的培养物相比添加ROCK抑制剂导致贴壁细胞的数量显著较大。将使用ROCK抑制剂衍生的EXPRES细胞(Y27632)称为EXPRES 15。
实例31
核型分析
通过G-带分析确定第5代和第12代EXPRES 15细胞的核型。对来自EXPRES 15的二十一个G-带显带的细胞进行了细胞遗传学分析，所有的细胞均显示出正常的46XX核型(图38)。对染色体12和17的FISH分析也显示，所有细胞的位于12号染色体上的ETV6BAP(TEL)基因表现出正常的信号模式，并且所有细胞的17号染色体上的Her2/neu基因和17号染色体着丝粒显示出正常的信号模式。
实例32
EXPRES细胞可维持于含有一定浓度范围的IGF、WNT3A、激活素-A
和GSK-3B抑制剂的培养基中
可将EXPRES 11细胞在含有2％FBS、100ng/mL激活素-A、20ng/mLWnt3a和50ng/mL IGF的DMEM/F12(Invitrogen)中培养。在80％汇合时，用TrypLE Express(Invitrogen)将细胞传代进96孔板中的含有2％FBS的DMEM/F12中，接种密度为4000个细胞/孔。让细胞在保持在37℃下具有5％CO2的增湿培养箱中粘附至基材1小时，然后添加范围为50至100ng/mL的激活素-A、范围为10至20ng/mL的Wnt3a、范围为10至50ng/mL的IGF以及50至100nM的GSK-3B抑制剂(IX)。在第24、48和96小时，用
96 AQueous单溶液细胞增殖测定试剂盒(Promega)测定细胞生活力。简而言之，将MTS试剂加至96孔板，让其与细胞孵育1-4小时，然后在酶标仪上读取490nm下的吸光度。吸光度读数与生活细胞的数目直接成比例。图39a-c示出了在接种后a)24小时、b)48小时和c)96小时时的吸光度读数。
藉此将整篇文档中引用的出版物全文以引用方式并入本文。尽管上文已结合实例和优选实施例描述了本发明的各个方面，但应当理解本发明的范围不受上述具体实施方式的限定，而受以下在专利法原则下正确解释的权利要求书的限定。
表IA：用于FACS和免疫染色分析的一抗的列表。
表IB：用于FACS和免疫染色分析的缀合的二抗的列表。
| 缀合的二抗 | 供应商 | 稀释度 |
| APC缀合的山羊抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch(PA) | 1∶200 |
| PE缀合的山羊抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch(PA) | 1∶200 |
| PE或APC缀合的驴抗兔抗体 | Jackson ImmunoResearch(PA) | 1∶200 |
| PE或APC缀合的驴抗山羊抗体 | Jackson ImmunoResearch(PA) | 1∶200 |
| PE缀合的山羊抗小鼠IgM | SouthernBiotech(AL) | 1∶200 |
| PE缀合的山羊抗大鼠IgM | SouthernBiotech(AL) | 1∶200 |
| PE缀合的山羊抗小鼠IgG3 | SouthernBiotech(AL) | 1∶200 |
表II用于采用
探针的实时PCR分析的引物的列表
引物/探针 目录号
18s 4310893E
ABCG2 Hs00184979_ml
AchE Hs00241307_ml
AFP Hs00173490_ml
ALB Hs00609411_ml
α-抗胰蛋白酶z Hs02384981_ml
淀粉酶 Hs00420710_gl
AP Hs00240993_ml
Atoh1 Hs00944192_sl
B2MG 4310886E
B3微管蛋白 Hs00964962_gl
B-连环蛋白 Hs99999168_ml
Barx1 Hs00222053_ml
Brachyury(T) Hs00610080_ml
CCK Hs00174937_ml
Cdx1 Hs00156451_ml
Cdx2 Hs00230919_ml
CEBPa Hs00269972_sl
CEBPb Hs00942496_sl
Cerberus Hs00193796_ml
CFC1(Cripto) Hs00414425_ml
CGA Hs00174938_ml
CK19(KRT19) Hs00761767_sl
CLDN4(claudin4) Hs00533616_sl
C-Myc结合蛋白 Hs00429315_gl
连接蛋白32(GJB-1) Hs00939759_sl
连接蛋白45 Hs00271416_sl
CTNNβ1 Hs00170025_ml
CXCR4 Hs00237052_ml
Cylcin-D1 Hs00277039_ml
Dapper1(DACT-1) Hs00420410_ml
DKK1 Hs00183740_ml
DKK4 Hs00205290_ml
Endoglin Hs00164438_ml
Exo1 Hs00243513_ml
F3 Hs00175225_ml
FAH Hs00164611_ml
FGF4 Hs00173564_ml
FGF10 Hs00610298_ml
FGFR1 Hs00241111_ml
FGFR3 Hs00179839_ml
FGFR4 Hs00242558_ml
Flk1 Hs00911705_gl
FOXA1 Hs00270129_ml
FOXA3 Hs00270130_ml
FOXD3 Hs00255287_sl
FOXF1 Hs00230962_ml
GAPDH(人) 4310884E
胃泌素 Hs00174945_ml
GATA1 Hs00231112_ml
gata4 Hs00171403_ml
GATA5 Hs00388359_ml
GATA6 Hs00232018_ml
GCK Hs00175951_ml
GFAP Hs00157674_ml
GIP Hs00175030_ml
Gli Hs01110766_ml
胰高血糖素 Hs00174967_ml
Glut-2 Hs00165775_ml
goosecoid Hs00418279_ml
GS Hs00374213_ml
Handy1 Hs00231848_ml
HB9 Hs00232128_ml
Hes1 Hs00172878_ml
Hex1 Hs00172696_ml
HEYL Hs00232718_ml
HHIP(Hedgehog相互作用蛋白) Hs01011009_ml
hHIF1α Hs00153153_ml
HNF1 Hs00167041_ml
HNF1α Hs00167041_ml
HNF1β Hs00172123_ml
HNF3β Hs00232764_ml
HNF4α Hs00230853_ml
HNF6(onecut) Hs00413554_ml
HoxB1 Hs00157973_ml
IBSP Hs00173720_ml
胰岛素II Hs00355773_ml
Islet-1 Hs00158126_ml
Jagged-1(JAG1) Hs00164982_ml
KDR Hs00176676_ml
KRT15 Hs00267035_ml
MafA Hs00999118_ml
MAML1 Hs00207373_ml
MAP2 Hs00159041_ml
MapK14 Hs00176247_ml
MapK8 Hs00177083_ml
MBP(髓鞘碱性蛋白) Hs00921945_ml
MIXL1 Hs00430824_gl
MMP1(基质金属蛋白酶1) Hs00233958_ml
MOX1 Hs00793059_ml
MSX1 Hs00427183_ml
粘蛋白1 Hs00904328_ml
粘蛋白2 Hs00159374_ml
Myf5 Hs00271574_ml
MyoD1 Hs00159528_ml
N-钙粘蛋白(CDH2) Hs00169953_ml
N-Cam1 Hs00169851_ml
NEFH Hs00606024_ml
NEFL Hs00196245_ml
Nestin Hs00707120_sl
NeuroD1 Hs00159598_ml
Ngn3 Hs00360700_ql
Nkx2.1 Hs00163037_ml
Nkx2.2 Hs00159616_ml
Nkx6.1 Hs00232355_ml
Notch1 Hs01062014_ml
NTS Hs00175048_ml
O2 Hs00377820_ml
Oct3/4 Hs00742896_sl
OTX2 Hs00222238_ml
Pax3 Hs00240950_ml
Pax4 Hs00173014_ml
Pax6 Hs00240871_ml
Pax8 Hs00247586_ml
Pax9 Hs00196354_ml
PDX-1(IPF1) Hs00236830_ml
Ptch (Patched) Hs00970985_ml
PTF1a Hs00603586_ql
PYY Hs01062281_ml
RA受体α亚基 Hs00230907_ml
RALDH Hs01125173_ml
RBPSUH Hs00794653_ml
Rex1(ZFP42) Hs00399279_ml
SCGB1 Hs00171092_ml
促胰液素 Hs00360814_ql
sFRP Hs00610060_ml
sFRP5 Hs00169366_ml
SHH Hs00179843_ml
SLC5A8 Hs01068911_ml
Snail Hs00195591_ml
Snai2 Hs00161904_ml
生长抑素 Hs00174949_ml
SOX1 Hs00534426_sl
Sox10 Hs00366918_ml
SOX17 见“Sox17”列表
SOX2 Hs00602736_sl
Sox3 Hs00271627_sl
SOX7 Hs00846731_sl
Sox9 Hs00165814_ml
Sparc Hs00234160_ml
SP-C Hs00161628_ml
TBX6 Hs00365539_ml
TERT Hs00162669_ml
THBD Hs00264920_sl
TWIST1 Hs00361186_ml
UtF1 Hs00747497_ql
Vim Hs00185584_ml
Wnt3a(人) Hs01055707_ml
Wnt3a(小鼠) Mm00437337_ml
WT1 Hs01103754_ml
ZIC1 Hs00604749_ml
Zic2 Hs00600845_ml
表III从H1和H9亲代系产生的EXPRES系的列表
表IV EXPRES 01和02系的细胞表面标志物的表达
| 标志物 | EXPRES 01-％表达 | EXPRES 02-％表达 |
| TRA1-60 | 100 | 100 |
| TRA1-81 | 100 | 100 |
| SSEA-3 | 100 | 86(85-88) |
| SSEA-4 | 100 | 87(83-88) |
| CD56(NCAM) | ＜1 | 38(35-40) |
| CXCR4 | ＜1 | 20(10-25) |
| SSEA-1 | ＜1 | 26(9-32) |
| E-钙粘蛋白 | 90(85-95) | 75(72-79) |
| CD9 | 99 | 66(62-68) |
| CD30 | 97(96-98) | 43(40-46) |
| LIF-受体 | ＜1 | 20(15-21) |
| CD117 | 92(90-95) | 73(67-75) |
表V在MATRIGEL
TM
上培养的未分化胚胎干细胞与在TCPS上培养的
EXPRES 01(a)和02(b)细胞之间的基因差异表达
A)ES对EXPRES 01-强度值为Log2形式。
B)ES对EXPRES 02-强度值为Log2形式。
表VI在MATRIGEL
TM
上培养的未分化胚胎干细胞与在TCPS上培养的
EXPRES 01(a)和02(b)细胞之间的基因差异表达
A)2小时DE阶段时的H9P39与EXPRES 01相比较--强度值为Log2形 式。
B)6小时DE阶段时的H9P39与EXPRES 01相比较--强度值为Log2形 式。
C)24小时DE阶段时的H9P39与EXPRES 01相比较--强度值为Log2 形式。
D)30小时DE阶段时的H9P39与EXPRES 01相比较--强度值为Log2 形式。
E)48小时DE阶段时的H9P39与EXPRES 01相比较--强度值为Log2 形式。
F)72小时DE阶段时的H9P39与EXPRES 01相比较--强度值为Log2形 式。
G)96小时DE阶段时的H9P39与EXPRES 01相比较--强度值为Log2 形式。
H)5天DE阶段时的H9P39与EXPRES 01相比较--强度值为Log2形 式。
表VII-分化的ES细胞、EXPRES01、EXPRES 02以及向DE分化过程
中多个时间点之间的相关系数
表VIII.在低O2或大气氧张力下培养4小时的EXPRES 01和02细胞 OD 490 读数。
a)
b) c)
d) e) f)
表IX.由蛋白质阵列测出的细胞因子、生长因子和受体的表达
a)
b)
c)
Claims (83)
1.一种用于衍生包含表达多潜能标志物的细胞的细胞群体的方法，所述方法包括如下步骤：
a.获得细胞，以及
b.在低氧条件下在组织培养基材上培养所述细胞，在培养所述细胞之前所述组织培养基材未用蛋白质或细胞外基质进行预处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是人胚胎干细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中用Rho激酶抑制剂处理所述人胚胎干细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在低氧条件下在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上培养所述细胞之前将所述人胚胎干细胞在常氧条件下培养。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在低氧条件下在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上培养所述细胞之前将所述人胚胎干细胞在低氧条件下培养。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在低氧条件下在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上培养所述细胞之前将表达定形内胚层谱系特征性标志物的所述细胞在常氧条件下培养。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在低氧条件下在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上培养所述细胞之前将表达定形内胚层谱系特征性标志物的所述细胞在低氧条件下培养。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述低氧条件是约1％至约20％的O2水平。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述低氧条件是约2％至约10％的O2水平。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述低氧条件是约3％的O2水平。
12.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约2％至约5％的血清的培养基中培养。
13.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约2％的血清的培养基中培养。
14.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约50ng/mL至约100ng/mL的激活素-A的培养基中培养。
15.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约100ng/mL的激活素-A的培养基中培养。
16.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约10ng/mL至约20ng/mL的Wnt配体的培养基中培养。
17.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约200ng/mL的Wnt配体的培养基中培养。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述Wnt配体是Wnt-3a。
19.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约25ng/mL至约50ng/mL的IGF-1的培养基中培养。
20.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约50ng/mL的IGF-1的培养基中培养。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达至少一种选自如下的多潜能标志物：ABCG2、cripto、FoxD3、连接蛋白43、连接蛋白45、Oct4、SOX-2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60和Tra1-81。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达前原条细胞特征性标志物。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达原条细胞特征性标志物。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达中内胚层细胞特征性标志物。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达定形内胚层细胞特征性标志物。
26.一种用于衍生包含表达多潜能标志物的细胞的细胞群体的方法，所述方法包括如下步骤：
a.培养人胚胎干细胞，
b.使所述人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层细胞特征性标志物的细胞，以及
c.移出所述细胞，随后将它们在低氧条件下在组织培养基材上培养，在培养所述细胞之前所述组织培养基材未用蛋白质或细胞外基质进行预处理。
27.根据权利要求26所述的方法，其中用Rho激酶抑制剂处理所述人胚胎干细胞。
28.根据权利要求26所述的方法，其中在使所述细胞分化之前将所述人胚胎干细胞在细胞外基质上培养。
29.根据权利要求26所述的方法，其中在使所述细胞分化之前将所述人胚胎干细胞在饲养细胞层上培养。
30.根据权利要求26所述的方法，其中在移出所述细胞之前使所述人胚胎干细胞在细胞外基质上分化。
31.根据权利要求26所述的方法，其中在移出所述细胞之前使所述人胚胎干细胞在饲养细胞层上分化。
32.根据权利要求26所述的方法，其中在移出所述细胞之前将所述人胚胎干细胞在常氧条件下培养和分化。
33.根据权利要求26所述的方法，其中在移出所述细胞之前将所述人胚胎干细胞在低氧条件下培养和分化。
34.根据权利要求26所述的方法，其中所述低氧条件是约1％至约20％的O2水平。
35.根据权利要求26所述的方法，其中所述低氧条件是约2％至约10％的O2水平。
36.根据权利要求26所述的方法，其中所述低氧条件是约3％的O2水平。
37.根据权利要求26所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约2％至约5％的血清的培养基中培养。
38.根据权利要求26所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约2％的血清的培养基中培养。
39.根据权利要求26所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约50ng/mL至约100ng/mL的激活素-A的培养基中培养。
40.根据权利要求26所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约100ng/mL的激活素-A的培养基中培养。
41.根据权利要求26所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约10ng/mL至约20ng/mL的Wnt配体的培养基中培养。
42.根据权利要求26所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约200ng/mL的Wnt配体的培养基中培养。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述Wnt配体是Wnt-3a。
44.根据权利要求26所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约25ng/mL至约50ng/mL的IGF-1的培养基中培养。
45.根据权利要求26所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约50ng/mL的IGF-1的培养基中培养。
46.根据权利要求26所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达至少一种选自如下的多潜能标志物：ABCG2、cripto、FoxD3、连接蛋白43、连接蛋白45、Oct4、SOX-2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60和Tra1-81。
47.根据权利要求26所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达前原条细胞特征性标志物。
48.根据权利要求26所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达原条细胞特征性标志物。
49.根据权利要求26所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达中内胚层细胞特征性标志物。
50.根据权利要求26所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达定形内胚层细胞特征性标志物。
51.一种用于衍生包含表达多潜能标志物的细胞的细胞群体的方法，所述方法包括如下步骤：
a.培养人胚胎干细胞，以及
b.移出细胞，随后将它们在低氧条件下在组织培养基材上培养，在培养所述细胞之前该组织培养基材未用蛋白质或细胞外基质进行预处理。
52.根据权利要求51所述的方法，其中用Rho激酶抑制剂处理所述人胚胎干细胞。
53.根据权利要求51所述的方法，其中在移出所述细胞之前将所述人胚胎干细胞在细胞外基质上培养。
54.根据权利要求51所述的方法，其中在移出所述细胞之前将所述人胚胎干细胞在饲养细胞层上培养。
55.根据权利要求51所述的方法，其中在移出所述细胞之前将所述人胚胎干细胞在常氧条件下培养。
56.根据权利要求51所述的方法，其中在移出所述细胞之前将所述人胚胎干细胞在低氧条件下培养。
57.根据权利要求51所述的方法，其中所述低氧条件是约1％至约20％的O2水平。
58.根据权利要求51所述的方法，其中所述低氧条件是约2％至约10％的O2水平。
59.根据权利要求51所述的方法，其中所述低氧条件是约3％的O2水平。
60.根据权利要求51所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约2％至约5％的血清的培养基中培养。
61.根据权利要求51所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约2％的血清的培养基中培养。
62.根据权利要求51所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约50ng/mL至约100ng/mL的激活素-A的培养基中培养。
63.根据权利要求51所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约100ng/mL的激活素-A的培养基中培养。
64.根据权利要求51所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约10ng/mL至约20ng/mL的Wnt配体的培养基中培养。
65.根据权利要求51所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约200ng/mL的Wnt配体的培养基中培养。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述Wnt配体是Wnt-3a。
67.根据权利要求51所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约25ng/mL至约50ng/mL的IGF-1的培养基中培养。
68.根据权利要求51所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约50ng/mL的IGF-1的培养基中培养。
69.根据权利要求51所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达至少一种选自如下的多潜能标志物：ABCG2、cripto、FoxD3、连接蛋白43、连接蛋白45、Oct4、SOX-2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60和Tra1-81。
70.根据权利要求51所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达前原条细胞特征性标志物。
71.根据权利要求51所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达原条细胞特征性标志物。
72.根据权利要求51所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达中内胚层细胞特征性标志物。
73.根据权利要求51所述的方法，其中所述表达多潜能标志物的细胞表达定形内胚层细胞特征性标志物。
74.一种扩增表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上培养。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞衍生自通过本发明方法形成的多潜能细胞。
76.根据权利要求74所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约0.2％至约5％的血清的培养基中培养。
77.根据权利要求74所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约0.5％的血清的培养基中培养。
78.根据权利要求74所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约50ng/mL至约100ng/mL的激活素-A的培养基中培养。
79.根据权利要求74所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约100ng/mL的激活素-A的培养基中培养。
80.根据权利要求74所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约10ng/mL至约20ng/mL的Wnt配体的培养基中培养。
81.根据权利要求74所述的方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有浓度为约200ng/mL的Wnt配体的培养基中培养。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述Wnt配体是Wnt-3a。
83.根据权利要求74所述方法，其中将所述细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预先处理过的组织培养基材上，在含有GSK-3B抑制剂的培养基中培养。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12/108,872 | 2008-04-24 | ||
| US12/108,872 US7939322B2 (en) | 2008-04-24 | 2008-04-24 | Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm |
| PCT/US2009/041348 WO2009132063A2 (en) | 2008-04-24 | 2009-04-22 | Pluripotent cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102083965A true CN102083965A (zh) | 2011-06-01 |
| CN102083965B CN102083965B (zh) | 2014-10-15 |
Family
ID=41129142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200980124667.XA Active CN102083965B (zh) | 2008-04-24 | 2009-04-22 | 多潜能细胞 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7939322B2 (zh) |
| EP (3) | EP2669366B1 (zh) |
| JP (1) | JP5763524B2 (zh) |
| KR (3) | KR102057056B1 (zh) |
| CN (1) | CN102083965B (zh) |
| AU (1) | AU2009239442B2 (zh) |
| BR (1) | BRPI0911599A2 (zh) |
| CA (2) | CA2948488A1 (zh) |
| ES (2) | ES2633455T3 (zh) |
| MX (1) | MX2010011739A (zh) |
| PL (2) | PL2283113T3 (zh) |
| RU (1) | RU2553538C2 (zh) |
| WO (1) | WO2009132063A2 (zh) |
| ZA (1) | ZA201008391B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109486751A (zh) * | 2012-02-14 | 2019-03-19 | 华盛顿州立大学 | 用于无饲养细胞培养牛和猪的精原干细胞的方法 |
| CN111213057A (zh) * | 2017-07-17 | 2020-05-29 | 美天施生物科技有限两合公司 | 用于底板中脑多巴胺能祖细胞的单细胞蛋白质表达谱分析的方法 |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090203141A1 (en) * | 2003-05-15 | 2009-08-13 | Shi-Lung Lin | Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents |
| US8017395B2 (en) | 2004-12-17 | 2011-09-13 | Lifescan, Inc. | Seeding cells on porous supports |
| US9080145B2 (en) | 2007-07-01 | 2015-07-14 | Lifescan Corporation | Single pluripotent stem cell culture |
| CN101952415B (zh) | 2007-07-31 | 2017-06-27 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
| CN107574142B (zh) | 2007-11-27 | 2021-07-06 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
| WO2009105570A2 (en) | 2008-02-21 | 2009-08-27 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Methods, surface modified plates and compositions for cell attachment, cultivation and detachment |
| JP5734183B2 (ja) | 2008-06-30 | 2015-06-17 | ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド | 多能性幹細胞の分化 |
| CA2742267C (en) | 2008-10-31 | 2019-06-04 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
| BRPI0919885A2 (pt) | 2008-10-31 | 2015-08-11 | Centocor Ortho Biotech Inc | Diferenciação de células-tronco embrionárias humanas para a linhagem endócrina pancreática |
| RU2555538C2 (ru) | 2008-11-20 | 2015-07-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Культура плюрипотентных стволовых клеток на микроносителях |
| AU2009316583B2 (en) | 2008-11-20 | 2016-04-21 | Janssen Biotech, Inc. | Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates |
| EP2456862A4 (en) | 2009-07-20 | 2013-02-27 | Janssen Biotech Inc | DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS |
| CN102741395B (zh) | 2009-12-23 | 2016-03-16 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
| RU2586506C2 (ru) * | 2009-12-23 | 2016-06-10 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток |
| AU2011223900A1 (en) | 2010-03-01 | 2012-09-13 | Janssen Biotech, Inc. | Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells |
| MX351515B (es) | 2010-05-12 | 2017-10-17 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
| AU2011296381B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-03-31 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| CA2809305C (en) | 2010-08-31 | 2019-06-11 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
| US9528090B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-12-27 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| ES2902650T3 (es) | 2011-06-21 | 2022-03-29 | Novo Nordisk As | Inducción eficiente de endodermo definitivo a partir de células madre pluripotentes |
| AU2012355698B2 (en) | 2011-12-22 | 2018-11-29 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells |
| WO2013131012A1 (en) * | 2012-03-01 | 2013-09-06 | University Of Miami | Isolation and use of pluripotent stem cell population from adult neural crest-derived tissues |
| KR20140131999A (ko) | 2012-03-07 | 2014-11-14 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 만능 줄기 세포의 증폭 및 유지를 위한 한정 배지 |
| WO2013151186A1 (ja) * | 2012-04-06 | 2013-10-10 | 国立大学法人京都大学 | エリスロポエチン産生細胞の誘導方法 |
| EP2847319A4 (en) * | 2012-05-07 | 2015-12-16 | Janssen Biotech Inc | DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS IN THE PANCREAS ENDODERM |
| CN108103006A (zh) | 2012-06-08 | 2018-06-01 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化 |
| BR112014031424A2 (pt) * | 2012-06-14 | 2017-06-27 | Janssen Biotech Inc | tratamento de células pluripotentes |
| GB2504996A (en) | 2012-08-17 | 2014-02-19 | Univ Keele | Embryonic stem cell culture method |
| US20150247123A1 (en) | 2012-09-03 | 2015-09-03 | Novo Nordisk A/S | Generation of pancreatic endoderm from Pluripotent Stem cells using small molecules |
| JP6529440B2 (ja) | 2012-12-31 | 2019-06-12 | ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド | 膵内分泌細胞への分化のためのヒト多能性細胞の懸濁及びクラスタリング |
| KR102036780B1 (ko) | 2012-12-31 | 2019-10-25 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 |
| US10370644B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
| KR102084561B1 (ko) | 2012-12-31 | 2020-03-04 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 췌장 내분비 세포로의 분화를 위한 공기-액체 계면에서의 인간 배아 줄기세포의 배양 |
| WO2014165663A1 (en) * | 2013-04-03 | 2014-10-09 | Cellular Dynamics International, Inc. | Methods and compositions for culturing endoderm progenitor cells in suspension |
| GB201317869D0 (en) * | 2013-10-09 | 2013-11-20 | Cambridge Entpr Ltd | In vitro production of foregut stem cells |
| CA2949056A1 (en) | 2014-05-16 | 2015-11-19 | Janssen Biotech, Inc. | Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells |
| JP6954711B2 (ja) | 2015-04-24 | 2021-10-27 | ユニバーシティ オブ コペンハーゲン | 真正膵臓前駆細胞の単離 |
| MA45479A (fr) | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
| NL2017670B1 (en) * | 2016-10-25 | 2018-05-04 | Stichting Het Nederlands Kanker Inst Antoni Van Leeuwenhoek Ziekenhuis | Molecular indicators for predicting response to hormonal therapy in breast cancer |
| US10767164B2 (en) | 2017-03-30 | 2020-09-08 | The Research Foundation For The State University Of New York | Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation |
| US10391156B2 (en) | 2017-07-12 | 2019-08-27 | Viacyte, Inc. | University donor cells and related methods |
| CA2983845C (en) | 2017-10-26 | 2024-01-30 | University Of Copenhagen | Generation of glucose-responsive beta cells |
| US20200080107A1 (en) | 2018-09-07 | 2020-03-12 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
| CA3139591C (en) | 2019-05-31 | 2024-01-16 | Timothy M. BRUHN | A biocompatible membrane composite |
| EP3975926A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | W.L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
| CN114401752B (zh) | 2019-05-31 | 2023-04-04 | W.L.戈尔及同仁股份有限公司 | 具有受控氧扩散距离的细胞封装装置 |
| CN114173837A (zh) | 2019-05-31 | 2022-03-11 | W.L.戈尔及同仁股份有限公司 | 生物相容性膜复合材料 |
| JP2022547505A (ja) | 2019-09-05 | 2022-11-14 | クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト | ユニバーサルドナー細胞 |
| CA3150233A1 (en) | 2019-09-05 | 2021-03-11 | Alireza Rezania | UNIVERSAL DONOR CELLS |
| WO2022144855A1 (en) | 2020-12-31 | 2022-07-07 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
Family Cites Families (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US583308A (en) * | 1897-05-25 | m miehle | ||
| US5834308A (en) | 1994-04-28 | 1998-11-10 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans |
| US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
| AU729377B2 (en) | 1997-10-23 | 2001-02-01 | Asterias Biotherapeutics, Inc. | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture |
| US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
| US6610540B1 (en) * | 1998-11-18 | 2003-08-26 | California Institute Of Technology | Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells |
| US6458593B1 (en) | 1999-01-21 | 2002-10-01 | Vitro Diagnostics, Inc. | Immortalized cell lines and methods of making the same |
| US20030082155A1 (en) | 1999-12-06 | 2003-05-01 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
| EP1240518A4 (en) | 1999-12-13 | 2006-05-17 | Scripps Research Inst | MARKERS FOR THE IDENTIFICATION AND INSULATION OF PRE-GENERIC CELLS OF A AND B PANCREAS ISOLATED CELLS |
| US7439064B2 (en) | 2000-03-09 | 2008-10-21 | Wicell Research Institute, Inc. | Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium |
| US7005252B1 (en) | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
| US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
| CA2456981C (en) | 2001-08-06 | 2012-02-28 | Bresagen, Inc. | Alternative compositions and methods for the culture of stem cells |
| KR101089591B1 (ko) | 2001-12-07 | 2011-12-05 | 제론 코포레이션 | 인간 배아 줄기세포 유래의 섬세포 |
| US20060003446A1 (en) | 2002-05-17 | 2006-01-05 | Gordon Keller | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
| JP2005527241A (ja) | 2002-05-28 | 2005-09-15 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | ｉｎｖｉｔｒｏにおけるヒト膵臓腺房細胞の増殖およびインスリン産生細胞への分化転換のための方法 |
| US6877147B2 (en) | 2002-07-22 | 2005-04-05 | Broadcom Corporation | Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison |
| US20040110287A1 (en) | 2002-07-29 | 2004-06-10 | Es Cell International Pte Ltd. | Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose responsive cells |
| WO2004090110A2 (en) | 2003-03-31 | 2004-10-21 | Bresagen Inc. | Compositions and methods for the control, differentiation and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway |
| ITRM20030395A1 (it) | 2003-08-12 | 2005-02-13 | Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz | Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero. |
| EA200601231A1 (ru) * | 2003-12-23 | 2007-06-29 | Китера, Инк. | Дефинитивная энтодерма |
| US20050266554A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
| US20050233446A1 (en) | 2003-12-31 | 2005-10-20 | Parsons Xuejun H | Defined media for stem cell culture |
| WO2005086845A2 (en) | 2004-03-10 | 2005-09-22 | Regents Of The University Of California | Compositions and methods for growth of embryonic stem cells |
| CN103103158B (zh) | 2004-04-27 | 2016-08-03 | 韦尔赛特公司 | 细胞培养基 |
| CA2966883A1 (en) | 2004-07-09 | 2006-02-16 | Cythera, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
| WO2006020919A2 (en) | 2004-08-13 | 2006-02-23 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells |
| CN101188942B (zh) | 2005-03-04 | 2011-11-30 | 生命扫描有限公司 | 成年胰衍生的基质细胞 |
| BRPI0617085A2 (pt) | 2005-09-02 | 2016-11-08 | Agency Science Tech & Res | método para obter uma célula-tronco mesenquimal (msc), célula ou linhagem celular, método para derivar uma cultura celular a partir de uma célula-tronco embrionária, método para tratamento de uma doença, uso de uma célula-tronco mesenquimal, linhagem diferenciada, composição farmacêutica, método para condicionar um meio de cultura celular, meio condicionado e uso do mesmo, mpetodo para obterum polipeptídeo, método para obtar uma cultura celular, cultura celular, célula-tronco mesenquimal, linhagem de célula-tronco mesenquimal ou uma célula mesenquimal diferenciada |
| WO2007030870A1 (en) | 2005-09-12 | 2007-03-22 | Es Cell International Pte Ltd | Cardiomyocyte production |
| WO2007082963A1 (es) | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad | Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas |
| AU2007224116B2 (en) | 2006-03-02 | 2013-11-07 | Viacyte, Inc. | Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production |
| GB2452186B (en) | 2006-05-02 | 2011-01-26 | Wisconsin Alumni Res Found | Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage |
| US7964402B2 (en) | 2006-05-25 | 2011-06-21 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells |
| US20080003676A1 (en) | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Millipore Corporation | Growth of embryonic stem cells |
| CN105176919A (zh) | 2007-07-18 | 2015-12-23 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
| CN101952415B (zh) * | 2007-07-31 | 2017-06-27 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
| US8623648B2 (en) * | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
-
2008
- 2008-04-24 US US12/108,872 patent/US7939322B2/en not_active Ceased
-
2009
- 2009-04-22 PL PL09734026T patent/PL2283113T3/pl unknown
- 2009-04-22 KR KR1020187005114A patent/KR102057056B1/ko active IP Right Grant
- 2009-04-22 AU AU2009239442A patent/AU2009239442B2/en active Active
- 2009-04-22 ES ES09734026.9T patent/ES2633455T3/es active Active
- 2009-04-22 WO PCT/US2009/041348 patent/WO2009132063A2/en active Application Filing
- 2009-04-22 JP JP2011506407A patent/JP5763524B2/ja active Active
- 2009-04-22 MX MX2010011739A patent/MX2010011739A/es active IP Right Grant
- 2009-04-22 EP EP13163321.6A patent/EP2669366B1/en active Active
- 2009-04-22 KR KR1020107025916A patent/KR101690773B1/ko active IP Right Grant
- 2009-04-22 PL PL13163321T patent/PL2669366T3/pl unknown
- 2009-04-22 ES ES13163321.6T patent/ES2663421T3/es active Active
- 2009-04-22 BR BRPI0911599-4A patent/BRPI0911599A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2009-04-22 CN CN200980124667.XA patent/CN102083965B/zh active Active
- 2009-04-22 KR KR1020167036048A patent/KR101832902B1/ko active IP Right Grant
- 2009-04-22 RU RU2010147817/10A patent/RU2553538C2/ru active
- 2009-04-22 CA CA2948488A patent/CA2948488A1/en not_active Abandoned
- 2009-04-22 EP EP09734026.9A patent/EP2283113B1/en active Active
- 2009-04-22 CA CA2722619A patent/CA2722619C/en active Active
- 2009-04-22 EP EP18150288.1A patent/EP3327114B1/en active Active
-
2010
- 2010-11-23 ZA ZA2010/08391A patent/ZA201008391B/en unknown
-
2012
- 2012-02-14 US US13/372,641 patent/USRE43876E1/en active Active
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109486751A (zh) * | 2012-02-14 | 2019-03-19 | 华盛顿州立大学 | 用于无饲养细胞培养牛和猪的精原干细胞的方法 |
| CN109486751B (zh) * | 2012-02-14 | 2022-04-26 | 华盛顿州立大学 | 用于无饲养细胞培养牛和猪的精原干细胞的方法 |
| CN111213057A (zh) * | 2017-07-17 | 2020-05-29 | 美天施生物科技有限两合公司 | 用于底板中脑多巴胺能祖细胞的单细胞蛋白质表达谱分析的方法 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102083965B (zh) | 多潜能细胞 | |
| CN102317443B (zh) | 用人饲养细胞进行的多能干细胞分化 | |
| EP2283114B1 (en) | Treatment of pluripotent cells | |
| EP2559756B1 (en) | Single pluripotent stem cell culture | |
| JP5769965B2 (ja) | ヒト胚性幹細胞の分化 | |
| US10487313B2 (en) | Efficient induction of definitive endoderm from pluripotent stem cells | |
| CN101861386A (zh) | 人胚胎干细胞的分化 | |
| CN102712902A (zh) | 人胚胎干细胞的分化 | |
| US20090325294A1 (en) | Single pluripotent stem cell culture |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |