KR101886983B1 - 2 개의 ｆａｂ 단편을 포함하는 fc-부재 항체 및 이용 방법 - Google Patents

2 개의 ｆａｂ 단편을 포함하는 fc-부재 항체 및 이용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Fc 도메인이 부재한, 하기의 2 개 이상의 fab 단편을 포함하는 이중특이적 항체로서, 제 1 의 Fab 단편은 제 1 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 의 Fab 단편은 제 2 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 이때 제 2 의 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된 이중특이적 항체; 그의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

2 개의 ＦＡＢ 단편을 포함하는 FC-부재 항체 및 이용 방법 {FC-FREE ANTIBODIES COMPRISING TWO FAB FRAGMENTS AND METHODS OF USE}
본 발명은 Fc 도메인이 결여되고, 하기 2 개 이상의 fab 단편을 포함하는 2중특이적 (bispecific) 항체로서, 제 1 의 Fab 단편은 제 1 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 의 Fab 단편은 제 2 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 이때 제 2 의 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된 이중특이적 항체; 그의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.
모노클로날 항체 (mAb) 는 점점 더 중요한 부류의 치료제이다. 실치수 형태의 IgG 로 이루어진 mAb 제품을 제외하고, 각종 다중특이적 재조합 항체 포맷, 예를 들어 IgG 항체 포맷과 단일의 쇄 도메인의 융합에 의한 4가 이중특이적 항체가 개발된 바 있다 (예, Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO　2001/077342; 및 Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234 참조).
또한, 항체 코어 구조 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 가 더 이상 유지되지 않는 여러 기타 새로운 포맷, 예컨대 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 디아- (dia-), 트리아- (tria-) 또는 테트라바디 (tetrabodies), 미니바디 (minibodies), 여러 단일 쇄 형태 (scFv, Bis-scFv) 가 개발되어 왔다 (Holliger, P., et al, Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297).
모든 이러한 형태는 항체 코어 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 를 추가의 결합 단백질 (예를 들어, scFv) 에 융합시키거나, 예를 들어, 2개의 Fab 단편 또는 scFv 에 융합시키기 위한 링커를 사용한다 (Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). 일렬 scFV (Tandem scFV) 는 여분의 펩티드 링커에 의해 연결된 2 개의 scFv 단편으로, 또한 (scFv)2 로 지칭된다. 가변 도메인들 사이의 펩티드 링커의 길이를 감소시킴으로써, 디아바디 (diabody) 가 제조된다. 2 개의 폴리펩티드들 사이에 여분의 펩티드 링커를 첨가해 소위 단일 쇄 디아바디를 제공한다. US　2007/0274985 는 단일 쇄 Fab (scFab) 단편을 포함하는 항체에 관한 것이다. 항체 단편은 실치수 모노클로날 항체와 비교시 치료제로서 장단점이 있다: 한 장점으로는 이들은 더 작아 조직 및 종양에 더 신속하게 침투가 가능하다는 점이다. 게다가, 소형 크기의 단편은 실치수 모노클로날 항체는 접근하기 쉽지 않은 에피토프와의 결합이 허용된다는 것이 제시된 바 있다. 단점으로, 단편은 아마도 신장 청소로 인해, 인간에 있어서 짧은 순환 반감기를 보여준다는 점이다. 짧은 반감기는 표적 부위에서 충분한 치료 취득을 막을 수 있다. 항체 단편은 응집물을 형성하기 쉽고 실치수 모노클로날 항체보다 덜 안정적일 수 있기 때문에 항체 단편의 제조는 평범하지 않다. 게다가, 동족이 아닌 중쇄 및 경쇄의 원하지 않는 짝지음으로, 비(非)활성 항원-결합 부위 및/또는 기타 비(非)작용성의 원하지 않는 부산물이 형성되고, 이는 항체 단편의 임상적 규모 제조 및 치료적 용도에 있어서 큰 문제점이 된다. 특히 2 개 이상의 Fab 가 서로 하나의 커넥터를 통해 연결된 Tandem-Fab 구축물은 두 경쇄의 무작위 연합으로 인해 실현가능하지 않으므로, 바람직하지 않은 불활성 부산물이 야기된다.
이러한 단점들은 이제 본 발명의 새로운 항체 포맷으로 극복된다. 여기에서는 당업계에 공지된 이중특이적 항체 단편보다 덜한 응집을 보이는, 잘못짝지음된 부산물의 감소로 인한, 증가된 수율로 용이하게 제조될 수 있는 새로운 이중특이적 항체 포맷이 제공된다. 교차 접근법을 이용해, 맞는 LC 연합이 통상의 경쇄 제조를 필요로 하지 않고 실시될 수 있다. 통상의 경쇄 접근법은 기존의 항체에 대해서는 가능하지 않다. 더욱이, 새로운 이중특이적 항체 포맷은 다수의 통상의 이중특이적 항체 단편보다 더 높은 분자량을 가지므로, 과도한 신장 청소를 방지하고 생체 내 개선된 반감기를 도모한다. 새로운 이중특이적 항체 포맷은 완전 작용성이고, 해당하는 통상의 이중특이적 항체만큼 필적하거나 또는 개선된 결합 및 활성을 갖는다.
본 발명의 개요
본 발명은 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 이때 제 1 의 Fab 단편은 제 1 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 의 Fab 단편은 제 2 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 이때 제 2 의 Fab 의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되고; 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 있다. 하나의 구현예에서, 제 1 및 제 2 Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 연결된다. 바람직하게 상기 펩티드 링커는 (G4S)2 링커이다.
하나의 구현예에서, 상기 항체는 추가적으로 제 3 의 Fab 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 제 3 의 Fab 단편은 제 1 또는 제 2 의 항원에 대해, 바람직하게는 제 1 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편은 제 1 의 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄에 연결된다. 또 다른 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편은 제 2 의 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄의 N 또는 C-말단에 연결된다. 한 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 제 1 또는 제 2 의 Fab 단편에 연결된다. 바람직하게 상기 펩티드 링커는 (G4S)2 링커이다.
본 발명에 따른 2중특이적 항체는 2가 이상이고, 3가 또는 다가, 예를 들어 4가일 수 있다. 한 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는, 제 1 의 항원 및 제 2 의 항원 각각을 표적하는 각 하나의 결합 부위를 갖는 2가 (1+1 포맷) 이다. 또 다른 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 하기 섹션에서 상세히 기재되는 바와 같이, 각각 제 1 의 항원을 표적하는 2 개의 결합 부위 및 제 2 의 항원을 표적하는 1 개의 결합 부위를 갖는 3가 (2+1 포맷) 이다.
제 2 의 목표로, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
제 3 의 목표로, 본 발명은 암 치료를 위한 본 발명의 이중특이적 항체에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 이중특이적 항체의 약제로서의 용도가 제공된다. 바람직하게, 상기 용도는 암 치료를 위한 것이다.
추가 목표로, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체의 중쇄를 인코딩하는 (encoding) 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 이중특이적 항체의 경쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 및 본 발명의 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 항체를 제조하도록 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법이 제공된다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체가 제공된다.
도 1: 본 발명의 예의 이중특이적 항체 포맷의 개략도. a) Fab-Crossfab 분자 C-말단, b) Fab-Crossfab 분자 N-말단 c) (Fab)2-Crossfab 분자 C-말단 d) (Fab)2-Crossfab 분자 N-말단 e) Fab-Crossfab-Fab 분자.
도 2: hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 제조 및 정제 분석: SDS-Page: 4-12 % Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; 쿠마시 염색): a) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 비(非)환원; b) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 환원.
도 3: Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 제조 및 정제 분석. 분석적 크기 배제 크로마토그래피, Chromatogram A280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02 % (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플을 주입했음).
도 4: hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 제조 및 정제 분석: SDS-Page: 4-12 % Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; 쿠마시 염색): a) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 비환원; b) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 환원.
도 5: hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) 제조 및 정제 분석. 분석적 크기 배제 크로마토그래피, Chromatogram A280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02 % (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플을 주입했음).
도 6: hu Fab(MCSP)- Crossfab(CD3) -Fab(MCSP) 제조 및 정제 분석. SDS-Page: 4-12 % Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; 쿠마시 염색): a) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)- Crossfab(CD3) -Fab(MCSP) 비환원; b) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)- Crossfab(CD3) -Fab(MCSP) 환원.
도 7: hu Fab(MCSP)- Crossfab(CD3) -Fab(MCSP) 제조 및 정제 분석. 분석적 크기 배제 크로마토그래피, Chromatogram A280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02 % (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플을 주입했음).
도 8: 쥣과동물 Crossfab(CD3) -Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 제조 및 정제 분석. SDS-Page: 4-12 % Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; 쿠마시 염색): a) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - 쥣과동물 Crossfab(CD3) -Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 비환원; b) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - 쥣과동물 Crossfab(CD3) -Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 환원.
도 9: 쥣과동물 Crossfab(CD3) -Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 제조 및 정제 분석. 분석적 크기 배제 크로마토그래피, Chromatogram A280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02 % (w/v) NaCl; 50 ㎍ 샘플을 주입했음).
도 10: 상이한 농도의 hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (="Fab-Crossfab"), hu Fab(MCSP)- Crossfab(CD3) -Fab(MCSP) (= "Fab-Crossfab-Fab"), hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (="(Fab)2-Crossfab") 뿐 아니라 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) (="(scFv)2") 이중특이적 분자에 의한 20 시간 동안의 활성화 및 인간 pan (췌장) T 세포로의 공동배양시 (E:T 비율 = 5:1) MDA-MB-435 종양 세포의 사멸 (LDH 방출로써 측정). 2가 MCSP-표적 구축물은 "(scFv)2" 구축물과 비교시 필적할만한 세포독성 활성을 보이는 반면에, 1가 MCSP 결합 "Fab-Crossfab" 구축물은 뚜렷하게도 세포독성 활성이 덜 강력하다.
도 11: hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (="(Fab)2-Crossfab") 와 (scFv)2 (항MCSP/항huCD3e) (="(scFv)2") 구축물의 비교. 상이한 농도의 이중특이적 구축물 및 상응하는 IgG 에 의한 21 시간 동안의 활성화, 및 인간 pan T 세포와의 공동-배양시 (E/T 비 = 5:1), MDA-MB-435 종양 세포로부터의 LDH 방출을 나타낸다. "(Fab)2-Crossfab" 은, (scFv)2 분자만큼 적어도 필적할 정도로 양호하게 표적 세포에 세포자멸사를 유도한다.
도 12: hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (="(Fab)2-Crossfab") 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) (="(scFv)2") 구축물의 비교. 상이한 농도의 이중특이적 구축물 및 상응하는 IgG 로써의 26 시간 동안 활성화 및 인간 PBMC 와의 공동-배양 (E/T 비 = 10:1) 시, MV-3 인간 흑색종 종양 세포로부터의 LDH 방출을 나타낸다. "(Fab)2-Crossfab" 는 (scFv)2 분자만큼 적어도 필적할 정도로 양호하게 표적 세포에 세포자멸사를 유도한다.
도 13: 쥣과동물 CD3 뿐 아니라, 인간 MCSP 를 표적하는, 쥣과동물 Crossfab(CD3) -Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 구축물 (=(Fab)2-CrossFab) 로의 주요 (primary) 쥣과동물 T 세포 활성화에 의해 유도된 B16/F10-huMCSP Fluc2, 클론 48 종양 세포로부터의 LDH 방출. 효과기 대 표적 세포 비율은 5:1 이었다. 37℃, 5 % CO2 에서 23.5 시간 동안 인큐베이션 이후 검정을 분석했다. 구축물은 인간 MCSP-발현 표적 세포의 농도-의존적, T 세포-매개 세포자멸사를 유도한다.
도 14: 쥣과동물 CD3 뿐 아니라, 인간 MCSP 를 표적하는, 50 nM 의 쥣과동물 Crossfab(CD3) -Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 구축물 (=(Fab)2-CrossFab) 로의 주요 쥣과동물 T 세포 활성화에 의해 유도된, B16/F10-huMCSP Fluc2, 클론 48 종양 세포로부터의 LDH 방출. 효과기 대 표적 세포 비율은 5:1 이었다. 검정을, 37℃, 5 % CO2 에서 23.5 시간 동안 인큐베이션 후 분석했다. 구축물은 인간 MCSP-발현 표적 세포의 T 세포- 매개된 세포자멸사를 유도한다. 상기 농도의 구축물에서 단지 T 세포의 약 (weak) 과활성화가 존재한다.
도 15: 24 시간 동안 Colo-38 종양 세포의 존재 (A, B) 또는 부재 (C, D) 에서 1 nM 의 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 (hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (="(Fab)2-Crossfab") 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) (="(scFv)2"))로의 처리 이후, 전혈의 상청액에서 측정된 상이한 사이토카인 수준. 96-웰 플레이트의 웰 당 280 ㎕ 전혈을 플레이팅하고, 30 000 Colo-38 세포를 지시한 대로 첨가했다. Colo-38 종양 세포의 존재 하 T 세포의 활성화 시 분비된 주된 사이토카인은 IL-6, 그 다음이 IFN감마이다. 게다가, 그랜자임 B 의 수준은 표적 세포의 존재 하 T 세포의 활성화시 크게 증가되었다. 일반적으로, "(scFv)2" 구축물은 기타 이중특이적 구축물과 비교시 조금 더 표적 세포의 존재 하에서 TNF 와 IFN감마의 수준뿐 아니라 그랜자임 B 도 증가시켰다 (A 및 B).
표적 세포의 존재 (또는 부재) 하 이중특이적 구축물에 의한 T 세포의 활성화 시, Th2 사이토카인 (IL-10 및 IL-4) 의 유의미한 분비는 존재하지 않았다. 상기 검정에서, 표적 세포의 부재 하, "(Fab)2-Crossfab" 구축물에 의해 유도된 IFN감마의 약 분비가 또한 존재하였다.
도 16: 비장세포에서 단리된, 쥣과동물 pan T 세포상 후기 (late) 활성화 마커 CD25 의 표면 발현 수준. 쥣과동물 pan T 세포를, 50 nM 의 쥣과동물 Crossfab(CD3) -Fab(MCSP)-Fab(MCSP) 구축물 (=(Fab)2-CrossFab) 이중특이적 구축물 (쥣과동물 CD3 및 인간 MCSP 를 표적) 과, 지시한 바와 같이 B16/F10-huMCSP Fluc2 클론 48 종양 표적 세포의 존재 또는 부재 하 (E:T 비율은 10:1) 인큐베이션하였다. CD8+ T 세포 상 70 시간 후 후기 활성화 마커 CD25 의 발현 수준을 나타낸다. (Fab)2-CrossFab 구축물로의 CD8+ T 세포 상 CD25 의 상향 조절은 오로지 표적 세포의 존재 하에서만 발생한다. 동일한 몰농도로 조절되어 사용된 기준 IgG 는 CD25 를 상향조절할 수 없었다.
도 17: Fab(CD33)-CrossFab (CD3) 제조 및 정제 분석. SDS-Page: a) 3-8% Tris/아세테이트 (NuPage [invitrogen]; 쿠마시 염색): a) 1 - HiMark (invitrogen), 2 - Fab(CD33)-CrossFab (CD3) 비환원; b) 4-12 % Bis/Tris (NuPage [invitrogen]: 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - Fab(CD33)-CrossFab (CD3) 환원.
도 18: Fab(CD33)-CrossFab (CD3) 제조 및 정제 분석. 분석적 크기 배제 크로마토그래피, Chromatogram A280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02 % (w/v) NaCl; 50㎍ 샘플을 주입했음).
도 19: 상이한 농도의 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 (hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3); "1+1 non-Fc" 로 표기, 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) (="(scFv)2") 기준 분자) 에 의한 24 시간 동안 활성화 및 인간 PBMC 와의 공동배양 시 (E:T 비 = 10:1) MV-3 종양 세포의 사멸 (LDH 방출로써 측정). "1+1 non-Fc" 구축물은 25.4 pM 의 산출 EC50 로, MV-3 표적 세포에서 세포자멸사를 유도하는 반면에, "(scFv)2" 기준 분자에 대한 산출 EC50 은 57 pM 이었는데, 이는 EC50 환산시, "1+1 non-Fc" 분자가 약간 더 양호한 역가 (potency) 를 나타냄을 시사한다.
도 20: CD3-MCSP 이중특이적 구축물 (각각, hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3); "1+1 non-Fc" 로서 표시, 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) (="(scFv)2") 기준 분자) 로 ~24 시간 동안 처리된, 인간 PBMC (E:T 비율 = 10:1) 과의 공동 배양 시 huMCSP-양성 MV-3 종양 세포의 존재 하에서, CD69-양성 세포의 각 증가률 (B), CD69 의 상향 조절에 의해 측정된, CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 활성화 (A). 일반적으로, CD69 중앙값은 CD4+ T 세포와 비교시 CD8+ T 세포 상에서 더 높다. 두 구축물에 대한 CD69 양성 세포의 백분율뿐 아니라 CD69 중앙값 측면 모두에서, 분명한 농도-의존적 증가가 존재한다.
도 21: (scFv)2 기준 분자의 도해
도 22: (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 제조 및 정제 분석. SDS-Page: 4-12 % Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; 쿠마시 염색): 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 환원; 3 - (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 비환원
도 23: (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 제조 및 정제 분석 분석적 크기 배제 크로마토그래피, Chromatogram A280 (Superdex 75 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 mM MOPS pH 7.3, 150 mM NaCl, 0.02 % (w/v) NaCl; 50㎍ 샘플 ((scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e)) 을 주입했음).
본 발명의 구현예의 상세한 설명
I. 정의
"골격부" 또는 "FR" 은 고가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 언급한다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 4 개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4 로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 에서 다음 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
본원의 목적을 위해 "수용체 인간 골격부"는 하기 정의된 바와 같이 인간 면역글로불린 골격부 또는 인간 공통 골격부로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 골격부 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 골격부의 아미노산 서열을 포함하는 골격부이다. 인간 면역글로불린 골격부 또는 인간 공통 골격부"로부터 유래된" 수용체 인간 골격부는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이것은 아미노산 서열 변경물을 포함할 수 있다. 일부 구현에에서, 아미노산 변경 개수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 일부 구현예에서, VL 수용체 인간 골격부는 VL 인간 면역글로불린 골격부 서열 또는 인간 공통 골격부 서열에 대한 서열에서 동일하다.
"인간 공통 골격부"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격부 서열의 선택에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격부이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열들의 서브그룹으로부터 행해진다. 일반적으로, 서열들의 서브그룹은 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3] 에서와 같은 서브그룹이다. 하나의 구현예에서, VL 에 있어서, 서브그룹은 [Kabat et al., supra.] 에서와 같은 서브그룹 카파 I 이다. 하나이 구현예에서, VH 에 있어서, 서브그룹은 [Kabat et al., supra] 에서와 같은 서브그룹 III 이다.
본원에서 사용시, 용어 "고가변 영역" 또는 "HVR" 란, 구조적으로 정의된 루프 ("고가변 루프") 를 형성하고/하거나 서열면에서 고가변적인 항체 가변 도메인의 영역 각각을 지칭한다. 일반적으로, 천연형 4-쇄 항체는 6 개의 HVR 을 포함한다: VH 에서 3 개 (H1, H2, H3) 및 VL 에서 3 개 (L1, L2, L3). HVR 은 일반적으로 고가변 루프 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR) 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는데, 후자는 서열 가변성이 가장 크고, 및/또는 항원 인지에 관여한다. 예시의 고가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3) 에서 발생한다. (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) 예시 CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 24-34, L2 의 아미노산 잔기 50-56, L3 의 아미노산 잔기 89-97, H1 의 아미노산 잔기 31-35B, H2 의 아미노산 잔기 50-65 및 H3 의 아미노산 잔기 95-102 에서 일어난다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) 용어 고가변 영역 (HVR) 및 상보성 결정 영역 (CDR) 은 본원에서 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 일부와 관련해 상호교환적으로 사용된다. 상기 특정 영역은 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 및 Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)] 에 의해 기술되었고, 상기 정의는 서로 비교될 때 아미노산 잔기를 오버랩하거나 또는 부분집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그의 변이체의 CDR 을 지칭하기 위한 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용된 용어의 범주 내에 있다. 상기 인용된 참조문 각각에서 정의된 CDR 을 포함하는 적절한 아미노산 잔기를 비교로서 하기 표 1 에 나타낸다. 특정 CDR 을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR 의 크기 및 서열에 따라 다양할 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여, 어떠한 잔기가 특정 CDR 을 포함하는지를 통상적으로 알아낼 수 있다.
Figure 112017030475775-pat00001
1표 1 의 모든 CDR 정의의 넘버링은 Kabat 등 (하기 참조) 에 나와 있는 넘버링 규정에 따른 것이다.
2"AbM" 은 Oxford Molecular 의 "AbM" 항체 모델링 소프트웨어에 의해 정의된 CDR 을 말한다.
Kabat 등은 또한 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체의 범위를 넘어서는 임의 실험 데이타에 의존하지 않고 이러한 "Kabat 넘버링" 시스템을 임의 가변 영역 서열에 명백하게 지정할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "Kabat 넘버링" 은 [Kabat 등, "U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)"] 에 나타낸 넘버링 시스템을 말한다. 달리 언급되지 않는 한, 항체 가변 영역에서 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 기준은 Kabat 넘버링 시스템에 따른 것이다.
VH 에서 CDR1 을 제외하고, CDR 은 일반적으로 고가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR 은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR" 을 포함한다. SDR 은 단축된-CDR, 또는 a-CDR 로 호칭되는 CDR 의 영역 내부에 함유되어 있다. 예시적 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 31-34, L2 의 50-55, L3 의 89-96, H1 의 31-35B, H2 의 50-58, 및 H3 의 95-102 에서 발생한다 (참조, Almagro, and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)). 다르게 언급되지 않으면, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 본원에서 상기 Kabat 등에 따라 넘버링된다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편 (원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다. 특히 용어 "항체"는 또한 Fc 도메인이 없는 2 개 이상의 fab 단편을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항체도 또한 포함한다.
용어 "인간 항체" 는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비(非)인간 출처에서 유래하는 항체의 아미노산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 생성되고, 발현되고, 제작되거나 단리되는 모든 인간 항체, 예컨대 NS0 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터, 또는 숙주 세포 내로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 인간 면역글로불린 유전자 또는 항체에 대한 트랜스제닉 (transgenic) 동물 (예를 들어 마우스) 로부터 단리된 항체가 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 가변 및 불변 영역을 재배열된 형태로 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체 내 체세포 과돌연변이 (hypermutation) 된다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되는 서열인 반면, 생체 내 인간 항체 생식선 목록 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
"인간화" 항체는 비인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 언급한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 실질적으로 모든 하나 이상, 전형적으로 2 개의, 가변 도메인을 포함할 것이고, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR) 은 비-인간 항체의 그것에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 항체의 그것에 해당한다. 인간화 항체는 인간 항체에서 유래하는 항체 불변 영역의 일부 이상을 임의로 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태" 는 인간화를 겪은 항체를 언급한다. 본 발명에 포함되는 "인간화 항체"의 기타 형태는 불변 영역이 본래 항체의 불변 영역으로부터 추가적으로 개질되거나 변화되어, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합과 관련된 본 발명에 따른 특성을 발생시키는 형태들이다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 출처 또는 종에서 유래하지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종에서 유래하는 재조합 DNA 기술에 의해 통상 제조되는 항체를 언급한다. 쥣과동물 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 바람직하다. 본 발명에 포함되는 "키메라 항체"의 기타 바람직한 형태는 불변 영역이 본래 항체의 불변 영역으로부터 개질되거나 변화되어, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합과 관련된 본 발명에 따른 특성을 발생시키는 형태들이다. 이러한 키메라 항체는 또한 "클래스-전환 항체"로서 언급된다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 DNA 분절 및 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 키메라 항체의 생성 방법에는 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 트랜스펙션 기술이 포함되고, 이는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, [Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; US　 5,202,238 호 및 US　5,204,244 호를 참조한다.
본원에 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 언급하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체들은 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합하며, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 발생하는 일반적으로 소량으로 존재하는 가능한 변이체 항체는 제외한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프) 로 향해지는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자로 향해진다. 따라서, "모노클로날" 이란 수식어는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득되는 항체의 특질을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 모노클로날 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 기타 예시적 방법들은 본원에 기재되어 있다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원을 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자이다. 항체 단편의 예에는 이에 제한되는 것은 아니나 항체 단편으로부터 형성된 Fv, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디 (diabody); 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예, scFv); 및 다중특이적 항체가 포함된다. scFv 항체가, 예를 들어, 문헌 [Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-52] 에 기술되어 있다. 또한, 항체 단편은, VH 도메인의 특성, 즉 VL 도메인과 함께 어셈블링 가능한 특성, 또는 VL 도메인의 특성, 즉 VH 도메인과 함께 기능적 항원 결합 부위에 어셈블링 가능한 특성을 가져, 이로 인해 전장의 항체의 항원 결합 특성을 제공하는 단일 쇄 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에서 사용된 바, "Fab 단편"은 VL 도메인 및 경쇄의 불변 도메인 (CL) 을 포함하는 경쇄 단편, 및 VH 도메인 및 중쇄의 제 1 의 불변 도메인 (CH1) 을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하며, 여기서, 제 2 의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다. 상기 가변 영역 또는 불변 영역 둘 중 하나의 교환으로 인해, 상기 제 2 의 Fab 단편은 또한 "cross-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "crossover Fab 단편" 으로서 지칭된다. crossover Fab 분자의 2 개의 상이한 쇄 조성이 가능하고, 이는 본 발명의 이중특이적 항체에 포함된다: 한편으로는, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 교환되고, 다시 말해 crossover Fab 분자가 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 불변 영역 (CH1) 으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 불변 영역 (CL) 으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 crossover Fab 분자는 또한 CrossFab (VLVH) 로 지칭된다. 다른 한편으로, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이 교환되는 경우, crossover Fab 분자는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 불변 영역 (CL) 으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 불변 영역 (CH1) 으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 crossover Fab 분자는 또한 CrossFab (CLCH1) 로 지칭된다.
하나의 구현예에서, 상기 Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 연결딘다. "연결된다"라는 의미는, Fab 단편들이 펩티드 결합에 의해, 직접 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 결합되는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "펩티드 링커" 는, 바람직하게는 합성 기원의 것인 아미노산 서열을 가진 펩티드를 지칭한다. 이들 본 발명에 따른 펩티드 링커는 Fab 단편들 중 하나를 다른 Fab 단편의 C- 또는 N-말단에 연결시켜 본 발명에 따른 다중특이적 항체를 형성하게 하는데 사용된다. 바람직하게는, 상기 펩티드 링커는 5 개 이상의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 100 개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 10 내지 50 개의 아미노산의 길이를 가진 아미노산 서열의 펩티드이다. 하나의 구현예에서, 상기 펩티드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm [식 중, G = 글리신, S = 세린이고, (x = 3, n= 3, 4, 5 또는 6, 및 m= 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4,n= 2, 3, 4 또는 5, 및 m= 0, 1, 2 또는 3), 바람직하게 x = 4 및 n= 2 또는 3, 더욱 바람직하게 x = 4, n= 2 임] 이다. 추가적으로, 링커는 면역글로불린 힌지 영역 (일부) 을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 펩티드 링커는 (G4S)2 (SEQ ID: NO 28) 이다. Fab 단편을 연결하는데 적합한 다른 펩티드 링커는, 예를 들어 (G4S)6-GG (SEQ ID NO: 147) 또는 (SG3)2-(SEG3)4-(SG3)-SG (SEQ ID NO: 148), 또는 EPKSC(D)-(G4S)2 (SEQ ID NO 145 및 146) 이다.
용어 "항원 결합 도메인"은, 항원의 일부 또는 전체에 대해 상보적이고 이에 특이적으로 결합하는 부위를 포함하는 항원 결합 분자의 일부를 지칭한다. 항원이 대형인 경우, 항원 결합 분자는 오로지 특정 부위의 항원에 결합할 수 있으며, 이 부위를 에피토프라고 칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 항체 가변 도메인 (또한 항체 가변 영역으로 지칭) 에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH) 을 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항체를 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 언급한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 보존된 골격 영역 (FR) 및 3개의 고가변 영역 (HVR) 을 포함한다 (예를 들어, Kindt, et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co. (2007) 페이지 91 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원과 결합하는 항체는, 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원과 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 참조.
용어 "항체의 항원 결합 부위"는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 항원-결합부는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격부" 또는 "FR" 영역은, 본원에서 정의된 바와 같은 고가변 영역 잔기 외의 상기 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 N- 내지 C-말단 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3 는 항원 결합에 가장 많이 기여하고, 항체의 특성을 정의하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 의 표준 정의 및/또는 "고가변 루프" 유래의 잔기에 따라 결정될 수 있다.
용어 "에피토프"란 특이적으로 항체에 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 특정 구현예에서는, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 술포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 분류를 포함하며, 특정 구현예에서는 특이적 3차원 구조 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 부위이다.
용어 "Fc 도메인"은 본원에서 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의내리는데 사용된다. 예를 들어, 천연 항체에서, Fc 도메인은 IgG, IgA 및 IgD 아이소타입(isotype) 에서 항체의 두 중쇄의 제 2 및 제 3 불변 도메인으로부터 유래된, 2 개의 동일한 단백질 단편들로 이루어진다; IgM 및 IgE Fc 도메인은 각 폴리펩티드 쇄에서 3 개의 중쇄 불변 도메인 (CH 도메인 2-4) 을 포함한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 있다. 본원에서 사용된 바 "Fc 도메인이 결여된" 이란, 본 발명의 이중특이적 항체가 CH2, CH3 또는 CH4 도메인을 포함하지 않는 것, 즉 불변 중쇄는 단지 1 개 이상의 CH1 도메인으로 이루어진 것을 의미한다.
"친화도" 는 분자 (예를 들어, 항체) 의 단일 결합 자리와 그것의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 언급한다. 다르게 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 "결합 친화도" 는 결합 쌍 (예를 들어, 항체와 항원) 의 일원들 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 언급한다. 분자 X 의 그 파트너 Y 에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (KD) 로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 포함하여, 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 설명적이고 예시적인 특정 구현예들이 하기에 기재된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "결합" 또는 "특이적 결합" 이란, 그 결합이 항원에 대해 선택적이고, 원치 않거나 또는 비특이적 상호작용과는 구별될 수 있다는 점을 의미한다. 특이적 항원 결합인자와 결합하는 항원 결합 모이어티 (moiety) 의 능력은 효소-결합 면역흡수 검정 (ELISA) 또는 당업자에게 익숙한 기타 기술, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기법 (BIAcore 장치 상에서 분석) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), 및 전통적인 결합 검정 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)) 을 통해 측정될 수 있다. 하나의 구현예에서, 관련이 없는 단백질과의 항원 결합 모이어티의 결합 정도는, 예를 들어 SPR 로써 측정시, 약 10% 미만의 항원과의 항원 결합 모이어티의 결합이다. 특정 구현예에서, 항원과 결합하는 항원 결합 모이어티, 또는 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예, 10-8 M 이하, 예 10-8 M 내지 10-13 M, 예 10-9 M 내지 10-13 M) 의 해리 상수 (KD) 를 갖는다.
"친화도 성숙된" 항체는, 변경을 보유하지 않는 부모 항체와 비교되게, 하나 이상의 고가변 영역 (HVR) 내에 하나 이상의 변경이 있는 항체를 언급하며, 그러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화도에 개선을 초래한다.
하나의 구현예에서, 관련 없는 단백질에, 제 1 항원 및 제 2 항원을 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체의 결합도는 예를 들어 방사면역검정 (RIA) 또는 유세포분석 (FACS) 으로써 측정시, 약 10% 미만의 항체의 제 1 또는 제 2 항원과의 결합도이다. 특정 구현예에서, 제 1 항원 및 제 2 항원과 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 ≤　1μM, ≤　100 nM, ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM (예, 10-8 M 이하, 예 10-8 M 내지 10-13 M, 예 10-9 M 내지 10-13 M) 의 해리 상수 (KD) 를 갖는다. 특정 구현예에서, 제 1 항원 및 제 2 항원과 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는, 상이한 종들로부터 제 1 또는 제 2 항원 중에서 보존된 제 1 항원 또는 제 2 항원의 에피토프에 결합한다.
항체 특이성이란, 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적인 인지를 지칭한다. 천연 항체는 예를 들어 단일특이성이다. 본 발명에 따른 "이중특이적 항체"는, 2 개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 항체이다. 본 발명의 항체는 2 개의 상이한 항원에 대해 특이적, 즉 제 1 항원 및 제 2 항원에 대해 특이적이다.
본원에서 사용된 바 용어 "단일특이적 항체"란, 각각 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바 "이중특이적 항체"란, 각각 동일한 항원 또는 상이한 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 2 개 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에서 제공된 항체는, 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 제 1 항원 및 제 2 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 이중특이적 항체가 본원에서 제공된다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 제 1 의 항원 또는 제 2 의 항원의 2 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
이중특이적 항체는 또한 제 1 의 항원 또는 제 2 의 항원을 발현하는 세포에 세포독성제를 국한시키는데 사용될 수 있다.
본 출원에서 사용된 용어 "가 (valent)" 는 항체 분자 내 특정화된 갯수의 결합 부위의 존재성을 지칭한다. 이로써, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 각각 항체 분자에서 2 개의 결합 부위, 4 개의 결합 부위 및 6 개의 결합 부위의 존재성을 나타낸다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 적어도 "2가"이고, "3가" 또는 "다중가" (예를 들어, "4가" 또는 "6가") 일 수 있다.
본 발명의 항체는 2 개 이상의 결합 부위를 갖고 이중특이적이다. 즉, 본 항체는 2 개 초과의 결합 부위 (즉, 항체가 3가 또는 다중가임) 인 경우에서도 이중특이적일 수 있다.
기준 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는, 기준 항체의 그의 항원과의 결합을 경쟁 검정에서 50% 이상 블로킹하는 항체를 지칭하고, 역으로 기준 항체는 항체의 그의 항원과의 결합을 경쟁 검정에서 50% 이상 블로킹한다. 예의 경쟁 검정이 본원에 제시된다.
"실질적 교차-반응성 부재"란, 특히, 표적 항원과 비교시, 한 분자 (예, 항체) 가 그 분자의 실제 표적 항원과 상이한 항원 (예, 표적 항원과 밀접한 항원) 을 인지 또는 특이적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체는 실제 표적 항원과 상이한 항원에 약 10% 미만 내지 약 5% 미만 결합할 수 있거나 또는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 양으로 실제 표적 항원과는 상이한 상기 항원에 결합할 수 있다: 약 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만, 바람직하게 2%, 1%, 또는 0.5% 미만, 가장 바람직하게 약 0.2% 또는 0.1% 미만의 실제 표적 항원과는 상이한 항원.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 상동성" 이란, 서열을 정렬시키고 필요하다면 최고 퍼센트 서열 상동성을 달성하도록 갭을 도입한 후, 기준 폴리펩티드 서열 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로 정의되는데, 임의의 보존성 치환을 서열 상동성의 일부로서 고려하지 않는다. 퍼센트 아미노산 서열 상동성을 측정하기 위한 정렬은 당해 기술 내 다양한 방식으로, 예를 들면 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 전장의 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 이를 위해, 본원에서는, %아미노산 서열 상동성 값을, 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2 를 이용하여 만들어냈다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은, Genentech, Inc.에 의해 저술되어 있으며, 소스 코드는 U.S. Copyright Registration No. TXU510087 로 등록되어진 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559 에 사용자 문헌과 함께 제출된 바 있다. ALIGN-2 프로그램은 공공연하게 Genentech, Inc., South San Francisco, California 에서 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은, 디지탈 UNIX V4.0D 를 비롯한 UNIX 작동 시스템 상에서 사용되도록 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 세팅되고 변경하지 않는다.
ALIGN-2 가 아미노산 서열 비교에 활용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B 에 대한, B 와의, 또는 B 에 대항하는 주어진 아미노산 서열 A 의 % 아미노산 서열 상동성 (이는, 대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B 에 대한, B 와의, B 에 대항하는 특정 % 아미노산 서열 상동성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A 로서 표현될 수 있음) 은 하기와 같이 산출된다:
100 * 분수 X/Y
(식 중, X 는 A 및 B 의 프로그램 정렬에서, 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 개수이고, Y 는 B 에서 아미노산 잔기의 총 개수이다). 아미노산 서열 A 의 길이가 아미노산 서열 B 의 길이와 동일하지 않는 경우, B 에 대한 A 의 % 아미노산 서열 상동성은 A 에 대한 B 의 % 아미노산 서열 상동성과 동일하지 않을 것이라는 점은 이해될 것이다. 특별히 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 %　아미노산 서열 상동성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하는 바로 앞의 문단에 기재된 바와 같이 수득된다.
"단리된" 항체는 그것의 자연 환경의 한 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는, 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 에 의해 측정할 때 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 리뷰에 대해, 예를 들어, [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)] 참조.
"단리된" 핵산은 그것의 자연 환경의 한 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 언급한다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"본 발명의 이중특이적 항체를 인코딩하는 단리된 핵산"은 단일 벡터 또는 별도의 벡터들 내의 핵산 분자(들), 및 숙주 세포내 하나 이상의 위치에 존재하는 핵산 분자 (들)을 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 상기 하나 이상의 핵산 분자 (또는 그의 단편) 을 언급한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "아미노산" 은, 알라닌 (3 자리 문자 코드: ala, 1 자리 문자 코드: A), 아르기닌 (arg, R), 아스파라긴 (asn, N), 아스파르트산 (asp, D), 시스테인 (cys, C), 글루타민 (gln, Q), 글루탐산 (glu, E), 글리신 (gly, G), 히스티딘 (his, H), 이소류신 (ile, I), 류신 (leu, L), 리신 (lys, K), 메티오닌 (met, M), 페닐알라닌 (phe, F), 프롤린 (pro, P), 세린 (ser, S), 트레오닌 (thr, T), 트립토판 (trp, W), 티로신 (tyr, Y), 및 발린 (val, V) 을 포함하는 천연 발생 카르복시 α-아미노산의 군을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터" 는 연결되어 있는 또다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 언급한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라, 숙주 세포의 게놈 내로 상기가 도입된 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결되어 있는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터" 로 언급된다.
본원에서 사용되는 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물" 은 호환되게 사용되고, 모든 그러한 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 는 1차 대상 세포 및 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 모든 자손이 인위적 또는 비인위적 돌연변이로 인해 DNA 내용에서 정확히 일치하지는 않을 수 있다는 것이 또한 이해된다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물" 은 호환되게 사용되고, 그러한 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 내부에 도입된 세포를 언급한다. 숙주 세포는, 1차 형질전환된 세포 및 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함하여, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 를 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 내용에서 완전히 일치하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝 또는 선별된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다.
"네이키드 (naked) 항체" 는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 언급한다. 네이키드 항체는 약학적 제형물 중에 존재할 수 있다.
"면역접합체"는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체로, 이에는 세포독성제가 포함되나 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제" 는 세포 기능을 저해 또는 방지하고/거나 세포 죽음 또는 파괴를 야기하는 물질을 언급한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu 의 방사성 동위원소); 화학치료적 작용제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 중격제); 성장 저해제; 효소 및 그의 단편 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소 예컨대 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적으로 활성인 독소 (그의 단편 및/또는 변이체를 포함); 및 다양한 하기 항종양 또는 항암제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "N-말단" 은, N-말단의 마지막 아미노산을 지칭하고, 용어 "C-말단"은 C-말단의 마지막 아미노산을 나타낸다.
용어 "약학적 제형물"이란, 그 내부에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하도록 허용하는 형태로서의 제제 및 그 제형물이 투여되는 대상에 불허하는 독성인 추가의 성분은 어떤 것도 포함하지 않는 제제를 나타낸다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는, 대상에 무독성인 활성 성분 이외의 약학적 제형물 내 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제가 포함된다.
본원에서 사용되는 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는" 과 같은 그의 문법적 변형) 는 치료되는 개인의 자연적 경과를 변경시키기 위한 시도에서의 임상적 개입을 언급하고, 예방을 위해 또는 임상 병리의 과정 동안 실시될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리 결과의 감소, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키기 위해 또는 질환의 진행을 둔화시키기 위해 사용된다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 가축 (예, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예, 마우스 및 래트) 가 포함된다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
약제, 예를 들어, 약학적 제형물의 "유효량" 은 필수적인 투여량에서 및 시간 동안 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 성취하기에 효과적인 양을 언급한다.
본원에서 사용된 바 용어 "암" 은 증식성 질병, 예컨대 림프종, 림프성 백혈병, 폐암, 비소세포 폐암 (NSCL), 기관지 세포 폐암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁 암, 난소 암, 직장 암, 항문 암, 위 암, 위장 암, 결장 암, 유방 암, 자궁 암, 난관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨스병, 식도암, 소장 암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선 암, 부신 암, 연조직의 육종, 요도 암, 음경암, 전립선 암, 방광 암, 신장 또는 수뇨관 암, 신 세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포 암, 담관 암, 중추계 (CNS) 신생물, 척추 종양, 뇌줄기 신경아교종, 다형성 아교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 뇌실막세포종, 속질모세포종, 수막종, 편평세포암종, 뇌하수체샘종 및 유잉 육종, 상기 암들 중 임의의 불응 버젼, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 조합을 포함해 들 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은, 치료용 제품의 사용에 관한 지시, 용법, 투여량, 투여법, 병용 요법, 금기사항 및/또는 주의사항에 관한 정보를 함유하는, 치료용 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 칭하기 위해 사용된다.
II. 조성물 및 방법
A. 예의 이중특이적 항체
본 발명은 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 이때 제 1 의 Fab 단편은 제 1 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 의 Fab 단편은 제 2 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 이때 제 2 의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되고; 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 있다. 하나의 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 연결된다. 바람직하게, 상기 펩티드 링커는 5 개 이상의 아미노산, 바람직하게 5 내지 100 개, 더욱 바람직하게 10 내지 50 개의 아미노산 길이를 가진 아미노산 서열의 펩티드이다. 하나의 구현예에서, 상기 펩티드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm [식 중, G = 글리신, S = 세린이고, (x = 3, n= 3, 4, 5 또는 6, 및 m= 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4, n= 2, 3, 4 또는 5 및 m= 0, 1, 2 또는 3), 바람직하게 x = 4 및 n= 2 또는 3, 더욱 바람직하게 x = 4, n= 2 임] 이다. 하나의 구현예에서, 상기 펩티드 링커는 (G4S)2 이다. 펩티드 링커는 제 1 및 제 2 의 Fab 단편을 연결하는데 사용된다. 하나의 구현예에서, 제 1 의 Fab 단편은 제 2 의 Fab 단편의 C- 또는 N-말단에 연결된다.
하나의 구현예에서, 제 1 의 Fab 단편은 제 2 의 Fab 단편의 N-말단에 연결된다. 제 2 의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환되는 지 여부에 따라, 제 1 의 Fab 단편이 제 2 의 Fab 단편의 N-말단에 연결되는 경우에 상이한 이중특이적 항체 분자가 가능하다.
하나의 구현예에서, 제 2 의 Fab 단편의 가변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 의 Fab 단편은 CrossFab (VHVL) 임), 제 1 의 Fab 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 제 2 의 Fab 단편의 VLCH1 쇄의 N-말단에 연결된다. 바람직하게, 제 1 의 Fab 단편의 C-말단 중쇄는 제 2 의 Fab 단편의 VLCH1 의 N-말단에 연결된다. 따라서, 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 3 개의 쇄를 포함한다: 제 1 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 펩티드 링커를 통해 제 2 의 Fab 단편의 VLCH1 쇄에 연결된 제 1 의 Fab 단편의 중쇄 (VHCH1-링커-VLCH1) 및 제 2 의 Fab 단편의 VHCL 쇄.
또 다른 구현예에서, 제 2 의 Fab 단편의 불변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 의 Fab 단편은 CrossFab (CLCH1)임), 제 1 의 Fab 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 제 2 의 Fab 단편의 VHCL 쇄의 N-말단에 연결된다. 바람직하게, 제 1 의 Fab 단편의 중쇄의 C-말단은 제 2 의 Fab 단편의 VHCL 쇄의 N-말단에 연결된다. 따라서, 한 구현예에서, 이중특이적 항체는 3 개의 쇄를 포함한다: 제 1 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 펩티드 링커를 통해 제 2 의 Fab 단편의 VHCL 쇄에 연결된 제 1 의 Fab 단편의 중쇄 (VHCH1-링커-VHCL) 및 제 2 의 Fab 단편의 VLCH1 쇄.
하나의 구현예에서, 제 1 의 Fab 단편은 제 2 의 Fab 단편의 C-말단에 연결된다. 제 2 의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환되는 지 여부에 따라, 상이한 이중특이적 항체 분자가 제 1 의 Fab 단편이 제 2 의 Fab 단편의 C-말단에 연결되는 경우에 가능하다.
하나의 구현예에서, 제 2 의 Fab 단편의 가변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 의 Fab 단편은 CrossFab (VHVL) 임), 제 2 의 Fab 단편의 CH1 도메인은 제 1 의 Fab 단편의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 연결된다. 바람직하게, 제 2 의 Fab 단편의 CH1 도메인은 제 1 의 Fab 단편의 중쇄의 N-말단에 연결된다. 따라서, 한 구현예에서, 이중특이적 항체는 3 개의 쇄를 포함한다: 제 1 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 펩티드 링커를 통해 제 1 의 Fab 단편의 중쇄에 연결된 제 2 의 Fab 단편의 VLCH1 쇄 (VLCH1-링커-VHCH1) 및 제 2 의 Fab 단편의 VHCL 쇄.
또 다른 구현예에서, 제 2 의 Fab 단편의 불변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 의 Fab 단편은 CrossFab (CLCH1) 임), 제 2 의 Fab 단편의 CL 도메인은 제 1 의 Fab 단편의 중 또는 경쇄의 N-말단에 연결된다. 바람직하게, 제 2 의 Fab 단편의 CL 도메인은 제 1 의 Fab 단편의 중쇄의 N-말단에 연결된다. 따라서, 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 3 개의 쇄를 포함한다: 제 1 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 펩티드 링커를 통해 제 1 의 Fab 단편의 중쇄에 연결된 제 2 의 Fab 단편의 VHCL 쇄 (VLCH1-링커-VHCH1) 및 제 2 의 Fab 단편의 VLCH1 쇄.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 2가 이상이고, 3가 또는 다중가, 예를 들어 4가일 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는 제 1 의 항원 및 제 2 의 항원 각각을 표적하는 각 하나의 결합 부위를 갖는 2가 (1+1 포맷) 이다. 또 다른 구현예에서, 상기 이중특이적 항체는, 하기 섹션에서 보다 상세히 기재되는 바와 같이, 각각 제 1 의 항원을 표적하는 2 개의 결합 부위와 제 2 의 항원을 표적하는 하나의 결합 부위를 갖는 3가 (2+1 포맷) 이다.
하나의 구현예에서, 상기 항체는 추가적으로 제 3 의 Fab 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 제 3 의 Fab 단편은 제 1 또는 제 2 의 항원, 바람직하게 제 1 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편은 제 1 의 Fab 단편의 N 또는 C-말단에 연결된다. 하나의 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 제 1 의 fab 단편에 연결된다. 바람직하게, 상기 펩티드 링커는 (G4S)2 링커이다.
하나의 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편은 제 1 의 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄의 N 또는 C-말단에 연결된다. 제 1 의 Fab 단편의 말단이 (상기 상세히 기재된 바와 같이) 제 2 의 Fab 단편에 연결되는지 여부에 따라, 제 3 의 Fab 단편은 제 1 의 단편의 반대쪽 (자유) 말단 상에 연결된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 3 개의 Fab 단편을 포함하고, 이때 상기 Fab 단편 및 상기 링커는 하기의 순서로 N-말단에서 C-말단 방향으로 연결된다: Fab 단편 3- 링커- Fab 단편 1- 링커- Fab 단편 2 (이때, 제 2 의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환됨). 상기 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편의 C-말단은 제 1 의 Fab 단편의 N-말단에 연결된다. 상기 기재된 바, Fab 단편은 서로 중쇄 또는 경쇄를 통해 연결될 수 있다. 하나의 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편의 중쇄의 C-말단은 펩티드 링커를 통해 제 1 의 Fab 단편의 중쇄의 N-말단에 연결되고; 및 제 1 의 Fab 단편의 C-말단은 제 2 의 Fab 단편의 N-말단에 연결되고, 이때 제 2 의 Fab 단편의 중 및 경 쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된다. 제 2 의 Fab 단편의 중 및 경쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환되는지 여부에 따라, 상이한 이중특이적 항체 분자가 가능하다.
하나의 구현예에서, 제 2 의 Fab 단편의 가변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 의 Fab 단편은 CrossFab (VHVL)임), 3 개의 Fab 단편의 쇄는 하기의 순서대로 N-말단에서 C-말단 방향으로 연결된다: VHCH1-링커-VHCH1-링커-VLCH1. 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 4 개의 쇄를 포함한다: 제 3 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 제 1 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 펩티드 링커를 통해 제 2 의 Fab 단편의 VLCH1 쇄에 연결된, 제 1 의 Fab 단편의 중쇄에 연결된 제 3 의 단편의 중쇄 (VHCH1-링커-VHCH1-링커-VLCH1) 및 제 2 의 Fab 단편의 VHCL 쇄.
하나의 구현예에서, 제 2 의 Fab 단편의 불변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 의 Fab 단편은 CrossFab (CLCH1) 임), 3 개의 Fab 단편의 쇄가 하기의 순서대로 N-말단에서 C-말단 방향으로 연결된다: VHCH1-링커-VHCH1-링커-VHCL. 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 4 개의 쇄를 포함한다: 제 3 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 제 1 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 펩티드 링커를 통해 제 2 의 Fab 단편의 VHCL 쇄에 연결된, 제 1 의 Fab 단편의 중쇄에 연결된 제 3 의 단편의 중쇄 (VHCH1-링커-VHCH1-링커-VHCL) 및 제 2 의 Fab 단편의 VLCH1 쇄.
하나의 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 3 개의 Fab 단편을 포함하고, 상기 Fab 단편 및 상기 링커는 하기의 순서대로 N-말단에서 C-말단 방향으로 연결된다: Fab 단편 2- 링커- Fab 단편 1- 링커- Fab 단편 3, 이때 제 2 의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다. 상기 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편의 N-말단은 제 1 의 Fab 단편의 C-말단에 연결된다. 상술된 바, Fab 단편은 중쇄 또는 경쇄를 통해 서로 연결될 수 있다. 하나의 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편의 중쇄의 N-말단은 펩티드 링커를 통해 제 1 의 Fab 단편의 중쇄의 C-말단에 연결되고; 제 1 의 Fab 단편의 N-말단은 제 2 의 Fab 단편의 C-말단에 연결되며, 이때 제 2 의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다. 제 2 의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환되는지 여부에 따라, 상이한 이중특이적 항체 분자가 가능하다.
하나의 구현예에서, 제 2 의 Fab 단편의 가변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 의 Fab 단편은 CrossFab (VHVL) 임), 3 개의 Fab 단편의 쇄는 하기의 순서대로 N-말단에서 C-말단 방향으로 연결된다: VLCH1-링커-VHCH1-링커-VHCH1. 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 4 개의 쇄를 포함한다: 제 3 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 제 1 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 펩티드 링커를 통해 제 1 의 Fab 단편의 중쇄에 연결된, 제 1 의 단편의 중쇄에 연결된 제 2 의 Fab 단편의 VLCH1 쇄 (VLCH1-링커-VHCH1-링커-VHCH1) 및 제 2 의 Fab 단편의 VHCL 쇄.
하나의 구현예에서, 제 2 의 Fab 단편의 불변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 의 Fab 단편은 CrossFab (CLCH1) 임), 3 개의 Fab 단편의 쇄는 하기의 순서대로 N-말단에서 C-말단 방향으로 연결된다: VHCL-링커-VHCH1-링커-VHCH1. 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 4 개의 쇄를 포함한다: 제 3 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 제 1 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 펩티드 링커를 통해 제 1 의 Fab 단편의 중쇄에 연결된, 제 1 단편의 중쇄에 연결된 제 2 의 Fab 단편의 VHCL 쇄 (VHCL-링커-VHCH1-링커-VHCH1) 및 제 2 의 Fab 단편의 VLCH1 쇄.
또 다른 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편은 제 2 의 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄의 N 또는 C 말단에 연결된다. 하나의 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 제 2 의 Fab 단편에 연결된다. 바람직하게, 상기 펩티드 링커는 (G4S)2 링커이다. 상술된 바와 같이, Fab 단편은 중쇄 또는 경쇄를 통해 서로 연결될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 3 개의 Fab 단편을 포함하고, 상기 Fab 단편 및 상기 링커는 하기의 순서대로 N-말단에서 C-말단 방향으로 연결된다: Fab 단편 1- 링커- Fab 단편 2- 링커- Fab 단편 3, 이때 제 2 의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다. 하나의 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편의 N-말단은 제 2 의 Fab 단편의 C-말단에 연결된다.
또 다른 구현예에서, 제 3 의 Fab 단편의 중쇄의 C-말단은 제 2 의 Fab 단편의 N-말단에 펩티드 링커를 통해 연결되고; 제 1 의 Fab 단편의 N-말단은 제 2 의 fab 단편의 C-말단에 연결되고, 이때 제 2 의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
제 2 의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환되는지 여부에 따라, 상이한 이중특이적 항체 분자가 가능하다.
하나의 구현예에서, 제 2 의 Fab 단편의 가변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 의 Fab 단편은 CrossFab (VHVL) 임), 3 개의 Fab 단편의 쇄는 하기의 순서대로 N-말단에서 C-말단 방향으로 연결된다: VHCH1-링커-VLCH1-링커-VHCH1. 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 4 개의 쇄를 포함한다: 제 3 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 제 1 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 제 2 의 Fab 단편의 VLCH1 쇄의 N-말단에 연결된 제 3 의 단편의 중쇄 및 상기 VLCH1 쇄의 C-말단은 펩티드 링커를 통해 제 1 의 Fab 단편의 중쇄의 N-말단에 연결됨 (VHCH1-링커-VLCH1-링커-VHCH1), 및 제 2 의 Fab 단편의 VHCL 쇄.
하나의 구현예에서, 제 2 의 Fab 단편의 불변 도메인은 교환되고 (즉, 제 2 의 Fab 단편은 CrossFab (CLCH1) 임), 3 개의 Fab 단편의 쇄는 하기의 순서대로 N-말단에서 C-말단 방향으로 연결된다: VHCH1-링커-VHCL-링커-VHCH1. 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 4 개의 쇄를 포함한다: 제 3 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 제 1 의 Fab 단편의 경쇄 (VLCL), 제 2 의 Fab 단편의 VHCL 쇄의 N-말단에 연결된 제 3 의 단편의 중쇄, 및 펩티드 링커를 통해 제 1 의 Fab 단편의 중쇄의 N-말단에 연결된 상기 VHCL 쇄의 C-말단 (VHCH1-링커-VHCL-링커-VHCH1) 및 제 2 의 Fab 단편의 VLCH1 쇄.
본 발명의 한 구현예에서, 이중특이적 항체는 하기 기술된 바와 같이 인간화 항체이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 이중특이적 항체는 하기 기술된 바와 같이 인간 항체이다.
제 2 의 목적에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
제 3 의 목적에서, 본 발명은 암 치료를 위한 본 발명의 이중특이적 항체에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 이중특이적 항체의 약제로서의 용도가 제공된다. 바람직하게, 상기 용도는 암 치료용이다.
추가 목적에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체의 중쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 이중특이적 항체의 경쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 및 본 발명의 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 항체를 제조하도록 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법이 제공된다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체가 제공된다.
추가의 측면에서, 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 이중특이적 항체는 임의이 특징들을 단독으로 또는 조합해서 하기 섹션 1-5 에 기재된 바와 같이 혼입할 수 있다:
1. 항체 친화도
표적 항원에 대한 본원에서 제공된 이중특이적 항체의 친화도는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 에 의해, 표준 장치, 예를 들어 BIAcore 장치 (GE Healthcare) 를 이용해 실시예에 나타낸 방법에 준수하여 측정할 수 있고, 수용체 또는 표적 단백질은 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 다르게는, 상이한 수용체 또는 표적 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합을 특정 수용체 또는 표정 항원을 발현하는 세포주를 이용해 예를 들면 유세포분석 (FACS) 을 통해 평가할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 이중특이적 항체는 하기의 해리 상수 (KD) 를 갖는다: ≤　1μM, ≤　100 nM, ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM (예 10-8 M 이하, 예, 10-8 M 내지 10-13 M, 예 10-9 M 내지 10-13 M).
한 구현예에 따르면, KD 는 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 을 사용하여 25℃ 에서 고정된 항원 CM5 칩으로 ~10 반응 유닛 (RU) 에서 측정된다. 간략히, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.) 을 공급사의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 로 활성화한다. 항원을 5 ㎕/분의 유속에서의 주사 전에 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8 로, 5 ㎍/㎖ (~0.2 μM) 까지 희석하여 대략 10 반응 유닛 (RU) 의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원의 주사 후에, 1 M 에탄올아민을 주사하여 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, Fab 의 2-배 연속 희석물 (0.78 nM ~ 500 nM) 을 대략 25 ㎕/분 의 유속으로 25℃ 에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제 (PBST) 함유 PBS 중에서 주사한다. 연합 속도 (ka 또는 kon) 및 해리 속도 (kd 또는 koff) 는, 단순한 일대일 랭뮤어 (Langmuir) 결합 모델 (BIACORE ® Evaluation Software version 3.2) 을 사용하여 연합 및 해리 센소그램을 동시에 적합 (fitting) 시킴으로써 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd) 는 비 koff/kon 로서 계산한다. 예를 들어, Chen, et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999) 참조. 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의한 연합-속도 (on-rate) 가 106 M-1 s-1 을 초과하는 경우에는, 분광계, 예컨대 정지-유동 장비를 갖춘 분광광도계 (stop-flow equipped spectrophotometer) (Aviv Instruments) 또는 교반되는 큐벳이 달린 8000-시리즈 SLM-AMINCO TM 분광광도계 (ThermoSpectronic) 에서 측정되는, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS, pH 7.2 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태) 의 25℃ 에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 ㎚; 방출 = 340 ㎚, 16 ㎚ 대역 (band-pass)) 의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 (quenching) 기술을 사용함으로써, 연합-속도를 측정할 수 있다.
2. 키메라 및 인간화 항체
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 이중특이적 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 US 특허 제 4,816,567 호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 키메라 항체는 비(非)인간 가변 영역 (예, 마우스, 래트, 햄스터, 래빗, 비인간 영장류, 예컨대 원숭이에서 유래된 가변 영역) 과 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 부모 항체의 그것으로부터 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성은 감소되지만, 여전히 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 보유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 내부의 HVR, 예를 들어, CDR (또는 그의 일부) 은 비-인간 항체에서 유래하고, FR (또는 그의 일부) 은 인간 항체 서열에서 유래하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의로 인간 불변 영역의 일부 이상을 또한 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도를 회복 또는 개선하도록, 인간화 항체 내의 일부 FR 잔기가 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체) 로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법이, 예를 들어, Almagro, and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008) 에서 리뷰되어 있고, 예를 들어, Riechmann, et al., Nature 332: 323-329 (1988); Queen, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri, et al., Methods 36: 25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 그래프팅을 기재함); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) ("재포장 (resurfacing)" 을 기재함); Dall'Acqua, et al., Methods 36: 43-60 (2005) ("FR 셔플링" 을 기재함); 및 Osbourn, et al., Methods 36 : 61-68 (2005) 및 Klimka, et al., Br. J. Cancer, 83 : 252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "인도되는 선별 (guided selection)" 접근을 기재함) 에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 골격 영역은 하기를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: "최적-적합 (best-fit)" 방법을 사용하여 선별된 골격 영역 (예를 들어, Sims, et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993) 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 서브그룹의 인간 항체의 공통 서열에서 유래하는 골격 영역 (예를 들어, Carter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 4285 (1992); 및 Presta, et al., J. Immunol., 151 : 2623 (1993) 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 골격 영역 또는 인간 생식선 골격 영역 (예를 들어, Almagro, and Fransson, Front. Biosci. 13 : 1619-1633 (2008) 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝에서 유래하는 골격 영역 (예를 들어, Baca, et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) 및 Rosok, et al., J. Biol. Chem. 271 : 22611-22618 (1996) 참조).
3. 인간 항체
특정 구현예에서 본원에서 제공되는 이중특이적 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)] 에 일반적으로 기술되어 있다.
인간 항체는 항원 공격에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 온전한 인간 항체 또는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 그러한 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대신하거나 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체 내로 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 그러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 리뷰에 대해, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005) 참조. 또한, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (XENOMOUSETM 기술을 기재함); 미국 특허 번호 5,770,429 (HUMAB® 기술을 기재함); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M MOUSE ® 기술을 기재함), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (VELOCIMOUSE® 기술을 기재함) 참조. 그러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과의 조합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 인간 미엘로마 및 마우스-인간 헤테로미엘로마 세포주가 기재된 바 있다 (예를 들어, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991) 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술에 의해 생성된 인간 항체도 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)] 에 기술되어 있다. 부가적 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 기재함) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 기재함) 에 기재된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology) 은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)] 에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 그러한 가변 도메인 서열은 그 후 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술이 아래 기재되어 있다.
4. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 이중특이적 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 상기 라이브러리를 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 방법은, 예를 들어, [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., 인간 Press, Totowa, NJ, 2001)] 에서 리뷰되어 있고, 예를 들어 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)] 에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리가 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 에 의해 별도로 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 이것이 그 후 Winter, et al., Ann. Rev. Immunol., 12 : 433-455 (1994) 에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터 얻은 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 높은-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, Griffiths, et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993) 에 기재된 바와 같이 순 (naive) 레퍼토리를 클로닝하여 (예를 들어, 인간으로부터) 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원의 항체를 제공할 수 있다. 마지막으로, Hoogenboom, and Winter, J. Mol. Biol., 227 : 381-388 (1992) 에 기재된 바와 같이 순 라이브러리도 또한 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 고도 가변 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내 재배열을 달성하기 위해 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공개공보는, 예를 들어: 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360 을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
5. 항체 변이체
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 이중특이적 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 이중특이적 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 이중특이적 항체의 아미노산 서열 변이체는 이중특이적 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 적절한 개질을 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 개질은 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 상기 서열 내로의 삽입, 및/또는 상기 서열 내의 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구축물에 도달할 수 있으나, 단, 최종 구축물은 원하는 특성, 예를 들어, 항원-결합 특성을 보유해야 한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심의 자리에는 HVR 및 FR 이 포함된다. 보존적 치환은 표 2 에서 "보존적 치환" 의 제목 하에 제시되어 있다. 더 많은 실질적 변화들이 표 2 에서 "예시 치환" 의 제목 하에 제공되어 있고, 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 아래 추가로 기재되어 있다. 아미노산 치환이 관심의 항체 내로 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합, 또는 감소된 면역원성에 대해 스크리닝될 수 있다.
Figure 112017030475775-pat00002
통상적인 측쇄 특성에 따라 아미노산은 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 클래스 중 하나의 일원을 또다른 클래스로 교환하는 것을 포함할 것이다.
치환 변이체의 한 유형은 부모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체) 의 하나 이상의 과가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선별된 결과로서 얻어지는 변이체(들)은 부모 항체에 대해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성) 에서 개질 (예를 들어, 개선) 을 갖고/갖거나 부모 항체의 실질적으로 유지된 특정 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적 치환 변이체는 친화도 성숙된 항체이며, 이것은, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 파지-디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략히, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고 특정 생물 활성 (예를 들어, 결합 친화도) 에 대해 스크리닝된다.
예를 들어, 항체 친화도를 개선하기 위해, HVR 에서 변경 (예를 들어, 치환) 이 일어날 수 있다. 그러한 변경은 HVR "핫스팟 (hotspot)", 즉, 체세포 돌연변이 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기 (예를 들어, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) 참조), 및/또는 SDR (a-CDR) 에서 일어날 수 있으며, 결과로서 얻어지는 변이체 VH 또는 VL 은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리의 구축 및 그로부터의 재선별에 의하는 친화도 성숙이, 예를 들어, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) 에서 기재된 바 있다. 친화도 성숙의 일부 구현예에서, 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발) 에 의해 성숙을 위해 선택된 다양한 유전자 내로 다양성이 도입된다. 그 후, 2차 라이브러리가 생성된다. 그 후, 상기 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하기 위한 또다른 방법은 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한번에 4 내지 6 개의 잔기) 가 무작위화되는 HVR-지정 접근방법을 포함한다. 항원 결합에 관여되는 HVR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모형화를 사용하여 특이적으로 식별될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3 이 특히 흔히 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은, 그러한 변경이 그 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환) 이 HVR 에서 일어날 수 있다. 그러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR 바깥에서 일어날 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR 은 변경되지 않거나, 1, 2 또는 3 개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역들을 식별하기에 유용한 방법은 Cunningham, and Wells (1989) Science 244 : 1081-1085 에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발" 로 호칭된다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 그룹 (예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu 와 같은 하전된 잔기들) 이 식별되고, 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 확인하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌) 으로 대체된다. 추가의 치환이 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치들에서 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 식별하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환에 대한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 특성을 갖는지 여부를 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1 개의 잔기로부터 100 개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합물, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 기타 삽입 변이체는 효소 (예를 들어 ADEPT 을 위한) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.
b) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 구현예에서, 이중특이적 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있는 시스테인 조작된 이중특이적 항체, 예를 들어, "thioMAb" 를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 구현예에서, 치환된 잔기는 이중특이적 항체의 접근가능한 자리에서 발생한다. 그러한 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 그에 의해 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 자리에 위치하고, 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜, 본원에 추가로 기재된 바와 같은 면역접합체를 생성하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 임의의 하나 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링) 및 중쇄의 A118 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,521,541 에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
c) 항체 유도체
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 이중특이적 항체는 당해 분야에서 공지되어 있고 용이하게 입수가능한 부가적 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 개질될 수 있다. 이중특이적 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 수용성 중합체의 비-제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그것의 물 중에서의 안정성으로 인해 제조시 유리할 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 다양할 수 있고, 1 개 초과의 중합체가 부착되는 경우, 그들은 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특별한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 제한된 조건 하의 요법에서 사용될지 여부 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 고려에 기초하여 결정될 수 있다.
또다른 구현예에서, 방사선에의 노출에 의해 선별적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티와 이중특이적 항체의 접합체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고, 보통의 (ordinary) 세포는 해치지 않지만, 항체-비단백질성 모이어티 가까이에 있는 세포는 죽게 되는 온도까지 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
B. 재조합 방법 및 조성물
본 발명의 이중특이적 항체는 예를 들어 고체-상태 펩티드 합성 (예, Merrifield 고체 상 합성) 또는 재조합 제조를 통해 수득될 수 있다. 재조합 방법에 있어서, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 이중특이적 항체 (단편) 를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 단리해 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 통상의 절차를 이용해 용이하게 단리 및 시퀀싱될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법을 이용해 적절한 전사/번역 제어 신호와 함께 이중특이적 항체 (단편)의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터가 구축될 수 있다. 이들 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 재조합/유전학적 재조합을 포함한다. 예를 들어 [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)] 에 기재된 기술을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 일부일 수 있거나, 또는 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터에는, 이중특이적 항체 (단편) 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 (즉, 코딩 영역) 가 프로모터 및/또는 기타 전사 또는 번역 제어 요소로 작동가능하게 연합되어 클로닝되는 발현 카세트가 포함된다. 본원에서 사용된 바, "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어진 핵산 부분이다. "정지 코돈" (TAG, TGA, 또는 TAA) 은 아미노산으로 번역되지 않지만, 존재하는 경우 코딩 영역의 일부로 고려될 수 있으나, 임의의 인접 (flanking) 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론, 5' 및 3' 미번역 영역 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 2 개 이상의 코딩 영역은 단일의 폴리뉴클레오티드 구축물, 예를 들어 단일의 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 구축물, 예를 들어 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 더욱이, 임의의 벡터는 단일의 코딩 영역을 포함할 수 있거나, 또는 2 개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있고, 예를 들어 본 발명의 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있으며, 이는 단백질분해 절단을 통해 최종적인 단백질 내로 번역과 동시에 또는 번역 후에 분리된다. 게다가, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 발명의 이중특이적 항체 (단편) 을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 변이체 또는 유도체와 융합 또는 비(非)융합된 이종 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종 코딩 영역에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 전문적인 요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩티드 또는 이종 작용성 도메인이 포함된다. 작동가능한 연합이란, 유전자 생성물, 예를 들어 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이, 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 생성물의 발현을 일으키는 방식으로, 하나 이상의 조절 서열들과 연합되는 경우이다. 2 개의 DNA 단편들 (예, 폴리펩티드 코딩 영역 및 이와 함께 연합된 프로모터) 은, 프로모터 기능의 유도 결과, 원하는 유전자 생성물을 인코딩하는 mRNA 가 전사되는 경우에, 및 2 개의 DNA 단편들 간 연결 성질이 유전자 생성물의 발현을 지휘하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 또는 전사되도록 하는 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우에, "작동적으로 연합된다". 따라서, 프로모터 영역은, 그 프로모터가 핵산의 전사를 도모할 수 있다면 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 작동적으로 연합될 것이다. 프로모터는 오로지 소정의 세포에서 DNA 의 실질적 전사를 지휘하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 기타 전사 제어 요소, 예를 들어 증강자 (inhancer), 작동자 (operator), 억제자 (repressor), 및 전사 종료 신호가 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연합되어 세포-특이적 전사를 지휘할 수 있다. 적절한 프로모터 및 기타 전사 제어 영역은 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 제어 영역이 당업자에게 공지되어 있다. 이들에는, 비제한적으로 척추동물 세포에서 작용하는 전사 제어 영역, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나 시토메갈로바이러스 유래의 프로모터 및 증강자 (예, 최조기 (immediate early) 프로모터, 인트론-A 와 결합됨), 원숭이 바이러스 40 (예, 조기 프로모터), 및 레트로바이러스 (예, 라우스 육종 바이러스) 가 포함된다. 기타 전사 제어 영역은, 액틴, 열 쇼크 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 알파 글로빈 등의 척추동물 유전자로부터 유래된 것뿐 아니라 진핵 세포 내 유전자 발현을 제어할 수 있는 기타 서열을 포함한다. 추가의 적절한 전사 제어 영역에는 조직-특이적 프로모터 및 증강자뿐 아니라 유도성 프로모터 (예, 프로모터 유도성 테트라사이클린) 가 포함된다. 마찬가지로, 각종 번역 제어 요소가 당업자에게 공지되어 있다. 이들에는 이에 제한되는 것은 아니나 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종료 코돈 및 바이러스 시스템 유래의 요소 (특히, 내부 리보솜 입장 부위, 또는 IRES, 나아가 CITE 서열로 지칭) 가 포함된다. 발현 카세트는 또한 기타 특징, 예컨대 복제 기원, 및/또는 염색체 혼입 요소, 예컨대 레트로바이러스 장 말단 반복부 (LTR) 또는 아데노-연합 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복부 (ITR) 을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 분비를 안내하는 분비 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 추가의 코딩 영역과 연합될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항원 결합 분자의 분비가 바람직한 경우, 신호 서열을 인코딩하는 DNA 는 본 발명의 이중특이적 항체를 인코딩하는 핵산 또는 그 단편의 상향에 놓일 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖고, 이는 조면 소포체를 건너는 성장 단백질 쇄의 수출이 개시되면 성숙 단백질로부터 절단된다. 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드는 일반적으로 그 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있는 신호 펩티드를 가지며, 이 신호 펩티드는 분비된 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생성하도록 번역된 폴리펩티드로부터 절단된다는 점을 당업자는 알고 있다. 특정 구현예에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들어 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 이와 작동적으로 연합되는 폴리펩티드의 분비를 지휘하는 능력을 보유하는 서열의 작용 유도체가 사용된다. 대안적으로, 이종 포유동물 서열 펩티드 또는 그의 작용 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열은 마우스 β-글루쿠로니다아제 또는 인간 조직 플라스미노겐 활성자 (TPA) 의 리더 서열로 치환될 수 있다.
후기 정제 (예, 히스티딘 태그) 를 촉진하거나 또는 이중특이적 항체를 표지하는데 보조하는데 사용될 수 있는 단 (short) 단백질 서열을 인코딩하는 DNA 가 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 이중특이적 항체 (단편) 의 말단에서 또는 그 내부에 포함될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 폴리뉴클레오티드 및 벡터는, 각각 폴리뉴클레오티드 및 벡터와 관련해 본원에서 기술된 특징들 중 임의의 특징들을 단독으로 또는 조합해 혼입할 수 있다. 그러한 한 구현예에서, 숙주 세포는 본 발명의 이중특이적 항체 (일부) 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이로 형질전환 또는 트랜스펙션된다). 본원에서 이용된 바, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 이중특이적 항체 또는 그 단편을 제조하는데 조작될 수 있는 임의 유형의 세포 시스템을 지칭한다. 이중특이적 항체의 발현을 복제 및 지지하는데 적합한 숙주 세포는 당업계에 익히 공지되어 있다. 상기 세포는 적절하게 특정 발현 벡터로 트랜스펙션 또는 형질도입될 수 있고, 다량의 벡터 포함 세포를 시딩을 위한 대규모 발효조에서 성장시켜, 임상 적용을 위해 충분량의 이중특이적 항체를 수득할 수 있다. 적합한 숙주 세포에는 원핵 미생물, 예컨대 대장균 또는 각종 진핵 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), 곤충 세포 등을 들 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 요구되지 않는 경우 박테리아에서 제조될 수 있다. 발현 후, 폴리펩티드는 가용분으로 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가 정제될 수 있다. 글리코실화 경로를 "인간화"시켜 부분 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 제조를 도모하는 진균 및 효모 균주를 비롯해, 사상균 또는 효모 등의 진핵 미생물도, 원핵생물에 더하여, 폴리펩티드-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌 [Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)] 참조. (글리코실화된) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다. 식물 세포 배양물도 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생성하기 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기재함) 참조. 척추동물 세포도 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응시킨 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 태아 신장 세포주 (293 또는 293T 세포, Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977) 에 기재); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980) 에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 초록 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부암 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 랫트 간세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방암 세포 (MMT 060562); 예를 들어, Mather, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982) 에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는, dhfr- CHO 세포 (Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216) 를 포함하여, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 미엘로마 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 를 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 리뷰에 대해, 예를 들어, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) 참조. 숙주 세포에는, 배양된 세포, 예를 들어 몇 가지만 언급하자면, 포유동물 배양 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포 및 식물 세포, 또한 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물 또는 배양 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포가 포함된다. 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게 포유동물 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 세포 또는 림프계 세포 (예, Y0, NS0, Sp20 세포) 이다. 이들 시스템에 외래의 유전자를 발현시키는 표준 기술이 당업계에 공지되어 있다. 항체와 같은 항원 결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드 발현 세포는, 발현된 생성물이 중쇄와 경쇄 모두를 갖는 항체가 되도록 항체 쇄의 다른쪽을 발현하기 위해 조작될 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 제조 방법이 제공되는데, 이때 상기 방법은 본원에서 제공된 바 이중특이적 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고, 그 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 이중특이적 항체를 회수하는 것을 포함한다.
이중특이적 항체의 성분들은 유전적으로 서로 융합된다. 이중특이적 항체는 그 성분들이 직접 서로 또는 간접적으로 링커 서열을 통해 융합되도록 고안될 수 있다. 링커의 조성 및 길이는 당업계에 익히 공지된 방법에 준수되어 결정될 수 있고, 그 효능에 대해 시험될 수 있다. 이중특이적 항체의 상이한 성분들 간 링커 서열의 예는 본원에서 제공된 서열에서 발견된다. 추가의 서열들, 예를 들어 엔도펩티다아제 인지 서열도 또한, 필요한 경우 각 융합 성분들을 분리하는 절단 부위를 통합하는데 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 이중특이적 항체의 하나 이상의 항원 결합 모이어티는 항원 결정인자를 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 천연 발생 또는 비(非)천연 발생 항체 및 그 단편의 일부 또는 이로부터 유래될 수 있다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체의 제조 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다 (예, Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 참조). 비천연 발생 항체는 또한 고체 상-펩티드 합성을 이용해 구축될 수 있거나, 재조합적으로 제조될 수 있거나 (예, U.S. 특허 제 4,186,567 호 에 기재된 바와 같음) 또는 예를 들어 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다 (예, U.S. 특허 제 No. 5,969,108 호, McCafferty).
항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역의 임의의 동물 종이 본 발명의 이중특이적 항체에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 비제한적인 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 쥣과동물, 영장류 또는 인간 기원의 것일 수 있다. 항체가 인간 용으로 사용되는 경우, 항체의 불변 영역이 인간 유래의 것인 키메라 형태의 항체가 이용될 수 있다. 인간화 또는 완전 인간 형태의 항체가 또한 당업계에 익히 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다 (예, U.S. 특허 No. 5,565,332, Winter 참조). 인간화는 이에 제한되는 것은 아니나 (a) 비인간 (예, 공여 항체) CDR 을, 중요 골격부 잔기 (예, 양호한 항원 결합 친화도 또는 항체 작용을 보유하는데 중요한 것) 를 보유하거나 보유하지 않는 인간 (예, 수여 항체) 골격부 및 불변 영역 상에 그라프팅하는 것, (b) 오로지 비인간 특이성-결정 영역 (SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기) 을 인간 골격부 및 불변 영역 상으로 그라프팅하는 것, 또는 (c) 전체의 비인간 가변 도메인을 이식하는 것, 그러나 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 섹션으로 이들을 "클로킹 (cloaking)" 하는 것을 비롯한 각종 방법에 의해 달성될 수 있다. 인간화 항체 및 이들의 제조 방법은, 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)] 에서 검토되어 있고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) ("재표면화" 기재); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) ("FR 셔플링" 기재); 및 Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "가이딩 선택" 접근법 기재) 에 추가로 기술되어 있다. 인간 항체 및 인간 가변 영역은 당업계에 공지된 각종 기술을 이용해 제조될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로, [van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)] 에 기재되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 모노클로날의 일부를 형성할 수 있거나 또는 이로부터 유래될 수 있다 (예, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 항원 챌린지에 응답하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 인간 항체를 제조하도록 개질된 바 있는 트랜스제닉 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다 (예, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005) 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리함으로써 제조될 수 있다 (예, Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); 및 McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) 참조). 파지는 전형적으로 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 전시한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 예를 들어 본원에서 참조로 그 전문이 인용된 U.S. Pat. Appl. Publ. No. 2004/0132066 에 개시된 방법에 따라 증강된 결합 친화도를 갖도록 조작된다. 본 발명의 이중특이적 항체의 특이적 항원 결정인자와의 결합 능력은 효소-결합 면역흡수 검정 (ELISA) 또는 당업자에게 익숙한 기타 기술, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 기법 (BIACORE T100 시스템 상에서 분석) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) 및 전통적인 결합 검정 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)) 을 통해 측정될 수 있다. 경쟁 검정은, 특정 항원과의 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인, 예를 들어, CD3 과의 결합에 대해 V9 항체와 경쟁하는 항체를 동정하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피트프 (예, 선형 또는 입체구조적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프의 예시 맵핑 방법은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)] 에 기재되어 있다. 예의 경쟁 검정에서, 고정화 항원 (예, CD3) 은, 그 항원에 결합하는 제 1 의 표지된 항체 (예, V9 항체) 및 상기 항원과의 결합에 대해 제 1 의 항체와의 경쟁 능력이 테스트되는 제 2 의 비(非)표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션된다. 제 2 의 항체는 하이브리도마 상청액에서 존재될 수 있다. 대조군으로서, 고정화 항원이 제 1 의 표지된 항체는 포함하나 제 2 의 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 인큐베이션된다. 제 1 의 항체의 항원과의 결합에 관대한 조건 하에서 인큐베이션 후, 과량의 비(非)결합된 항체는 제거되고, 고정화 항원과 연합된 표지량이 측정된다. 고정화 항원과 연합된 표지량은 대조군 샘플과 비교시 테스트 샘플에서 실질적으로 감소되는데, 이는 제 2 의 항체가 항원과의 결합에 있어서 제 1 의 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 참조.
본원에서 기재된 바와 같이 제조된 이중특이적 항체는 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등과 같은 당업계에 공지된 기술로써 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하는데 사용되는 실제의 조건은 부분적으로 순 (net) 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 따라 좌우될 것이며, 당업자에게는 자명할 것이다. 친화도 크로마토그래피 정제에 있어서, 이중특이적 항체가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체의 친화도 크로마토그래피 정제에 있어서, 단백질 A 또는 단백질 G 를 갖는 매트릭스가 사용될 수 있다. 순차적인 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피가 실시예에서 기재된 바 본질적으로 이중특이적 항체를 단리하는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체의 순도는 젤 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 비롯해 익히 공지된 다양한 분석 방법 중 임의의 방법으로써 측정할 수 있다.
C. 검정
본원에서 제공된 이중특이적 항체는, 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 당업계에 공지된 각종 검정을 통해 동정, 스크리닝 또는 특성평가 될 수 있다.
1. 결합 검정 및 기타 검정
하나의 양상에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 예를 들어, 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 (Western blot) 등에 의해 그것의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
또 다른 양상에서, 경쟁 검정이 제 1 또는 제 2 항원과의 결합에 대해 특이적 항체와 경쟁하는 항체를 동정하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 경쟁 항체는 특이적 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일 에피토프 (예, 선형 또는 입체형태적 에피토프) 에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프의 상세한 예의 맵핑 방법은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)] 에 제공된다.
2. 활성 검정
한 양상에서, 생물학적 활성을 갖는 이중특이적 항체를 동정하는 검정이 제공된다. 생물학적 활성에는, 예를 들어 표적화 세포의 분해, 또는 세포자멸사 유도가 포함될 수 있다. 생체 내 및/또는 시험관 내 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 상기 생물학적 활성에 대해 테스트된다. 세포 분해 탐지를 위한 검정 (예, LDH 방출 측정에 의함) 또는 세포자멸사 (예, TUNEL 검정 이용) 가 당업계에 익히 공지되어 있다.
D. 면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학치료제 또는 약물, 성장 저해제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적 활성인 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소와 접합된 본원의 이중특이적 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
하나의 구현예에서, 면역접합체는 그 안의 항체가 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; Hinman, et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; 및 Lode, et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928 참조); 안트라사이클릭 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); 및 U.S. 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065 를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 약물에 접합되어 있는 항체-약물 접합체 (ADC) 이다.
또다른 구현예에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 A 쇄 (녹농균에서 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 저해인자, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 저해인자, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지 않는 효소적 활성 독소 또는 그의 단편에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체를 포함한다.
또다른 구현예에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사접합체 (radioconjugate) 를 형성하고 있는 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사접합체의 제조에 이용가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu 의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사접합체가 탐지에 사용될 때, 그것은 신티그래피 연구용 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri 로도 알려짐) 용 스핀 표지 (spin label), 예컨대 요오드-123 다시, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
이중특이적 항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠) 을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 [Vitetta, et al., Science 238: 1098 (1987)] 에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA) 은 항체에 대한 라디오뉴클레오티드 (radionucleotide) 의 접합을 위한 예시적 킬레이트화제이다. WO 94/11026 참조. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단가능 링커" 일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커 (Chari, et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992); 미국 특허 번호 5,208,020) 가 사용될 수 있다.
본원에서 면역접합체 또는 ADC 는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (이들은, 예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A 에서 상업적으로 입수가능함) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 가교결합제 시약으로 제조된 그러한 접합체를 명백히 고려하나 그에 한정되지 않는다.
E. 진단 및 탐지를 위한 방법 및 조성물
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 임의의 이중특이적 항체는 생물학적 샘플 중 제 1 및/또는 제 2 항원의 존재를 탐지하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "탐지" 는 정량적 또는 정성적 탐지를 포괄한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
하나의 구현예에서, 진단 또는 탐지 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체가 제공된다. 추가의 양상에서, 생물학적 샘플 중 제 1 및/또는 제 2 항원의 존재를 탐지하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 제 1 및/또는 제 2 항원에 대한 이중특이적 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플과 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체를 접촉시키고, 이중특이적 항체와 제 1 및/또는 제 2 항원 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 탐지하는 것을 포함한다. 그러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 이중특이적 항체를 이용한 요법에 적격인 대상을 선별하기 위해 사용되며, 예를 들어 이 경우 제 1 및/또는 제 2 항원은 환자의 선별을 위한 바이오마커이다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적 장애는 암을 포함한다.
특정 구현예에서, 표지된 이중특이적 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 탐지되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광, 발색, 전자-밀도, 화학발광, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해, 간접적으로 탐지되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그것의 유도체, 로다민 및 그것의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시퍼라제, 예를 들어, 반딧불 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 헤테로시클릭 옥시다제 예컨대 유리카제 및 잔틴 옥시다제 (수소 퍼옥시다제를 이용하여 염료 전구체를 산화시키는 효소 예컨대 HRP 와 커플링됨), 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정적 자유 라디칼 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
F. 약학적 제형물
본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체의 약학적 제형물은 원하는 정도의 순도를 갖는 그러한 이중특이적 항체를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성이며, 하기를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 겔라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 간질성 (intersitial) 약물 분산제 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 을 추가로 포함한다. rHuPH20 을 포함하여, 특정한 예시적 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968 에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP 는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제와 조합된다.
예시적 동결건조된 항체 제형물은 미국 특허 번호 6,267,958 에 기재되어 있다. 수성 항체 제형물은 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제형물은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원에서의 제형물은 치료되는 특정한 징후 (indication) 에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로에게 유해하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 성분들을 또한 함유할 수 있다. 상기 활성 성분들은 적합하게는 의도되는 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다.
활성 성분은, 예를 들어, 코아세르베이션 (coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸 셀룰로스 또는 겔라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀전, 나노-입자 및 나노캡슐) 에 또는 마크로에멀전에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)] 에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제형물은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들어, 멸균 여과 막을 통하는 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공되는 임의의 이중특이적 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 양상에서, 약제로서 사용하기 위한 이중특이적 항체가 제공된다. 추가 양상에서, 암 치료에 사용되기 위한 이중특이적 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 치료 방법에서 사용되기 위한 이중특이적 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 유효량의 이중특이적 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체를 제공한다. 하나의 상기 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 하나 이상의 추가적인 치료제, 예를 들어 하기에 기술된 바와 같은 추가적인 치료제를 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 구현예 중 임의의 구현예에 따르면 "개체"는 바람직하게 인간이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 약제 제작 또는 제조에서 이중특이적 항체의 용도를 제공한다. 하나의 구현예에서, 약제는 암 치료용이다. 추가의 구현예에서, 약제는 유효량의 약제를 암을 앓는 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 그러한 한 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료제를 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 구현예 중 임의의 구현예에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 암 치료 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 당해 방법은 유효량의 이중특이적 항체를 암을 앓는 개체에 투여하는 것을 포함한다. 이러한 하나의 구현예에서, 당해 방법은 유효량의 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료제를 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 구현예 중 임의의 구현예에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은, 예를 들어, 임의의 상기 치료 방법에서 사용하기 위한, 본원에서 제공되는 임의의 이중특이적 항체를 포함하는 약학적 제형물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 약학적 제형물은 본원에서 제공되는 임의의 이중특이적 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또다른 구현예에서, 약학적 제형물은 본원에서 제공되는 임의의 이중특이적 항체 및, 예를 들어, 아래 기재된 바와 같은, 하나 이상의 부가적 치료제를 포함한다.
본 발명의 이중특이적 항체는 요법에서 단독으로 또는 다른 약제와의 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체는 하나 이상의 부가적 치료제와 동시-투여될 수 있다.
상기 조합 요법은 조합된 투여 (이 경우, 2 개 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제형에 포함됨), 및 별도의 투여 (이 경우, 발명의 항체의 투여는 부가적 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 그와 동시에, 및/또는 후에 실시될 수 있음) 를 포괄한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 또한 방사선 요법과의 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항체 (및 임의의 부가적 치료제) 는 비경구, 폐내, 및 비강내, 및 비강내, 및, 국소 치료를 위해 바람직한 경우, 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 부분적으로 투여가 단기인지 또는 장기인지 여부에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 일시 (bolus) 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 이중특이적 항체는 우수한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제형화되고 투약되고 투여된다. 이와 관련하여 고려할 요인들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 약제의 전달 자리, 투여 방법, 투여 일정, 및 의사에게 알려진 기타 요인들을 포함한다. 이중특이적 항체는 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제형화될 필요는 없지만 임의로 함께 제형화된다. 상기 다른 약제의 유효량은 제형물에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료 유형, 및 상기 논의된 다른 요인들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량으로 및 동일한 투여 경로에 의해, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 ~ 99% 의 양으로, 또는 실험적/임상적으로 적절하다고 확인된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 이중특이적 항체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 부가적 치료제와의 조합으로 사용될 때) 은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 이중특이적 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 요법, 환자의 임상적 병력 및 이중특이적 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료과정 동안 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/㎏ ~ 15 ㎎/㎏ (예를 들어 0.1 ㎎/㎏ ~ 10 ㎎/㎏) 의 이중특이적 항체가, 예를 들어, 한번 이상의 별도의 투여에 의하든지, 또는 연속적 주입에 의하든지간에, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 하나의 전형적인 일일 투여량은 상기 언급한 요인들에 따라서 약 1 ㎍/㎏ ~ 100 ㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복된 투여 동안, 상태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 이중특이적 항체의 하나의 예시적 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ ~ 약 10 ㎎/㎏ 의 범위일 수 있다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏ (또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 3주마다 (예를 들어, 환자가 약 2 개 ~ 약 20 개, 또는 예를 들어, 약 6 개 용량의 이중특이적 항체를 투여받도록) 투여될 수 있다. 초기의 더 많은 투입 용량에 이어, 하나 이상의 더 적은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 섭생법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 과정은 종래의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제형물 또는 치료 방법은 본 발명의 이중특이적 항체 대신에 또는 그에 더하여 발명의 면역접합체를 사용하여 실시될 수 있다고 이해된다.
H. 제품
본 발명의 또 다른 양상에서, 전술한 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 연합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는, 단독으로 존재하거나 또는 증상의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또다른 조성물과 조합되고, 멸균 진입 포트를 가질 수 있는 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있음) 조성물을 보유한다. 조성물 중 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 이중특이적 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택의 상태를 치료하기 위해 사용되는 것을 지시한다. 더욱이, 제품은 (a) 본 발명의 이중특이적 항체를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제 1 용기, 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 경우에는 치료제를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 구현예에서 제품은 조성물이 특정 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 제품은 약학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질들을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제품은 본 발명의 이중특이적 항체 대신에 또는 그에 더하여 본 발명의 면역접합체르 포함할 수 있다고 이해된다.
III. 실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 구현예들이 실시될 수 있다고 이해된다.
전술한 본 발명은 명확한 이해를 목적으로 설명 및 예를 이용하여 얼마간 상세히 기술되었지만, 설명 및 예는 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되면 안된다. 본원에서 언급된 모든 특허 및 과학 문헌의 공개물은 그의 전문이 본원에 참조로 명백히 포함된다.
실시예 1: Fab ( MCSP )- CrossFab (CD3) 의 제조
수득한 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을, 각 수용 포유동물 발현 벡터 내 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄로 프레임 내 서브클로닝하였다. CDS 의 3 말단에 합성 polyA 신호 서열을 갖고, MPSV 프로모터로 구동해 항체를 발현한다. 나아가, 각 벡터는 EBV OriP 서열을 포함한다.
상기 분자는 칼슘 포스페이트-트랜스펙션을 이용해 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 공동-트랜스펙션함으로써 제조한다. 기하급수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포는, 칼슘 포스페이트 방법으로써 트랜스펙션한다. 다르게는, 현탁액 중에서 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민으로써 트랜스펙션한다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 1:1:1 비율로 트랜스펙션한다 ("벡터 CH1-VH - CK-VH": "벡터 경쇄": "벡터 경쇄 CH1-VL").
칼슘 포스페이트를 이용하는 트랜스펙션에 있어서, 10　% (v/v) FCS 로 보충된 DMEM 배양 배지를 이용해 T-플라스크에서 부착 단층 배양물로서 세포를 성장시키고, 상기 세포를 50 내지 80% 포화도 (confluent) 가 될 때 트랜스펙션한다. T150 플라스크의 트랜스펙션에 있어서, 1500 만 세포를 FCS (최종 10% v/v) 로 보충된 25 ml DMEM 배양 배지에서 트랜스펙션하기 24 시간 전에 시딩하고, 세포를 5% CO2 분위기 하, 하룻밤 동안 37　℃ 인큐베이터에 배치한다. 트랜스펙션될 각 T150 플라스크에 있어서, DNA, CaCl2 및 물의 용액을, 해당 비율로 나뉜 94　㎍ 전체 플라스미드 벡터 DNA, 최종 부피 469　㎕ 로의 물 및 469　㎕ 의 1　M CaCl2 용액을 혼합함으로써 제조한다. 상기 용액에, 938　㎕ 의 50　mM HEPES, 280　mM NaCl, 1.5　mM Na2HPO4 용액, pH 7.05 을 첨가하고, 10 초 동안 즉시 혼합한 다음 실온에서 20 초 동안 정치한다. 현탁액을 2　% (v/v) FCS 로 보충된 10 ml 의 DMEM 으로 희석하고, 기존의 배지 대신 T150 에 첨가했다. 이어서, 추가 13 ml 의 트랜스펙션 배지를 첨가한다. 세포를 37　℃, 5　% CO2 에서 약 17 내지 20 시간 동안 인큐베이션한 다음, 배지를 25 ml DMEM, 10% FCS 로 대체한다. 조건화 배양 배지를 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리로써 약 7 일 배지-교환후 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22 ㎛ 필터), 0.01 % (w/v) 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지한다.
폴리에틸렌이민을 이용한 트랜스펙션에 있어서, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 무혈청 배양 배지 내 현탁액에서 배양한다. 500 ml 진탕 플라스크에서 제조하기 위해, 400,000,000 개의 HEK293 EBNA 세포를 트랜스펙션 24 시간 이전에 시딩한다. 트랜스펙션을 위해, 세포를 5 분 동안 210 x g 로 원심분리하고, 상청액을 예열된 20 ml CD CHO 배지로써 대체한다. 발현 벡터를 20 ml CD CHO 배지에서 총량 200 ㎍ DNA 로 혼합한다. 540　㎕ PEI 첨가 후, 용액을 15 초 동안 보르텍스 교반하고, 후속해서 10 분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 그후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37　℃ 로써 인큐베이터에서 5% CO2 분위기 하에서 인큐베이션한다. 상기 인큐베이션 시간 후 160 ml F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양한다. 트랜스펙션 후 1 일 후에, 1 mM 발포르산 및 7% Feed 1 (Lonza) 를 첨가한다. 7 일 후, 배양 상청액을 15 분 동안 210 x g 에서의 원심분리에 의한 정제를 위해 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22　㎛ 필터), 0.01 % w/v 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지한다.
분비된 단백질을, 단백질 A 및 단백질 G 친화도 크로마토그래피를 이용한 친화도 크로마토그래피 후, 크기 배제 크로마토그래피 단계로써 세포 배양 상청액으로부터 정제한다. 친화도 크로마토그래피를 위해, 상청액을, 30 ml 20　mM 나트륨 포스페이트, 20　mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5 로 각각 평형화된, HiTrap Protein　G HP 컬럼 (CV　=　5 ml, GE Healthcare) 과 커플링된 HiTrap Protein　A HP 컬럼 (CV　=　5 ml, GE Healthcare) 상에 로딩한다. 비결합된 단백질은, 두 컬럼들을 6 컬럼 부피 20　mM 나트륨 포스페이트, 20　mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5 로 세정함으로써 제거한다. 후속해서, 적어도 8 컬럼 부피 20　mM 나트륨 포스페이트, 20　mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5 를 이용해 HiTrap Protein　G HP 컬럼만을 세정하기 위해서, 추가의 세정 단계가 필수적이다. 표적 단백질은, 7 컬럼 부피 8.8　mM 포름산, pH 3.0 으로의 단계 구배를 이용하는 HiTrap Protein　G HP 컬럼으로부터 용리한다. 단백질 용액을 1/10 의 0.5　M 나트륨 포스페이트, pH　8.0 을 첨가함으로써 중화한다. 표적 단백질은 25 mM 칼륨 포스페이트, 125 mM 나트륨 클로라이드, 100 mM 글리신 용액, pH 6.7 으로 평형화된 HiLoad Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 상에 로딩 이전에 농축 및 여과한다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는, 280 nm 에서의 흡광도 (OD) 를 아미노산 서열 기반으로 해 산출된 몰 흡광 계수를 이용해 측정함으로써 결정한다. 항체의 순도 및 분자량은 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에서 쿠마시 염색 (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen) 의 SDS-PAGE 로써 분석한다. NuPAGE®Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 은 제조사 지침 (4-12　% Tris-아세테이트 겔 또는 4-12　% Bis-Tris) 에 따라 이용된다. 항체 샘플의 응집 함량은 Superdex 200 10/300GL 분석적 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 2 mM MOPS, 150　mM NaCl, 0.02　% (w/v) NaN3, pH 7.3 작동 완충제, 25℃ 를 이용해 분석한다.
예의 Fab-Crossfab 분자 (도 1 a) 에 나타낸 바 대로의 방향으로, 3 개의 쇄: VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3V9) = SEQ ID NO:25, VLCL(MCSP) = SEQ ID NO:17 및 VHCL(CD3V9) = SEQ ID NO:23 로 이루어짐) 의 제조 및 정제 분석은 도 2 및 3 에 나타낸다. 상기 분자는 추가로 Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 또는 hu Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 로서 지칭된다.
실시예 2: Fab ( MCSP )- Fab ( MCSP )- CrossFab (CD3) 및 Fab ( MCSP )- CrossFab(CD3)- Fab ( MCSP ) 의 제조
수득한 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을, 각 수용 포유동물 발현 벡터 내 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄로 프레임 내 서브클로닝하였다. CDS 의 3 말단에 합성 polyA 신호 서열을 갖고, MPSV 프로모터로 구동해 항체를 발현한다. 나아가, 각 벡터는 EBV OriP 서열을 포함한다.
상기 분자는 칼슘 포스페이트-트랜스펙션을 이용해 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 공동-트랜스펙션함으로써 제조한다. 기하급수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포는, 칼슘 포스페이트 방법으로써 트랜스펙션한다. 다르게는, 현탁액 중에서 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민으로써 트랜스펙션한다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 1:2:1 비율로 트랜스펙션한다 ("벡터 CH1-VH - CH1-VH - CK-VH": "벡터 경쇄": "벡터 경쇄 CH1-VL").
칼슘 포스페이트를 이용하는 트랜스펙션에 있어서, 10　% (v/v) FCS 로 보충된 DMEM 배양 배지를 이용해 T-플라스크에서 부착 단층 배양물로서 세포를 성장시키고, 상기 세포를 50 내지 80% 포화도가 될 때 트랜스펙션한다. T150 플라스크의 트랜스펙션에 있어서, 1500 만 세포를 FCS (최종 10% v/v) 로 보충된 25 ml DMEM 배양 배지에서 트랜스펙션하기 24 시간 전에 시딩하고, 세포를 5% CO2 분위기 하, 하룻밤 동안 37　℃ 인큐베이터에 배치한다. 트랜스펙션될 각 T150 플라스크에 있어서, DNA, CaCl2 및 물의 용액을, 해당 비율로 나뉜 94　㎍ 전체 플라스미드 벡터 DNA, 최종 부피 469　㎕ 로의 물 및 469　㎕ 의 1　M CaCl2 용액을 혼합함으로써 제조한다. 상기 용액에, 938　㎕ 의 50　mM HEPES, 280　mM NaCl, 1.5　mM Na2HPO4 용액, pH 7.05 을 첨가하고, 10 초 동안 즉시 혼합한 다음 실온에서 20 초 동안 정치한다. 현탁액을 2　% (v/v) FCS 로 보충된 10 ml 의 DMEM 으로 희석하고, 기존의 배지 대신 T150 에 첨가했다. 이어서, 추가 13 ml 의 트랜스펙션 배지를 첨가한다. 세포를 37　℃, 5　% CO2 에서 약 17 내지 20 시간 동안 인큐베이션한 다음, 배지를 25 ml DMEM, 10% FCS 로 대체한다. 조건화 배양 배지를 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리로써 배지-교환후 약 7 일 후에 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22　㎛ 필터), 0.01 % (w/v) 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지한다. 폴리에틸렌이민을 이용한 트랜스펙션에 있어서, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 무혈청 배양 배지 내 현탁액에서 배양한다. 500 ml 진탕 플라스크에서 제조하기 위해, 400,000,000 개의 HEK293 EBNA 세포를 트랜스펙션 24 시간 이전에 시딩한다. 트랜스펙션을 위해, 세포를 5 분 동안 210 x g 로 원심분리하고, 상청액을 예열된 20 ml CD CHO 배지로써 대체한다. 발현 벡터를 20 ml CD CHO 배지에서 총량 200 ㎍ DNA 로 혼합한다. 540　㎕ PEI 첨가 후, 용액을 15 초 동안 보르텍스 교반하고, 후속해서 10 분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 그후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37　℃ 로써 인큐베이터에서 5% CO2 분위기 하에서 인큐베이션한다. 상기 인큐베이션 시간 후 160 ml F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양한다. 트랜스펙션 후 1 일 후에, 1 mM 발포르산 및 7% Feed 1 (Lonza) 를 첨가한다. 7 일 후, 배양 상청액을 15 분 동안 210 x g 에서의 원심분리에 의한 정제를 위해 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22　㎛ 필터), 0.01 % w/v 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지한다.
분비된 단백질을, 단백질 A 및 단백질 G 친화도 크로마토그래피를 이용한 친화도 크로마토그래피 후, 크기 배제 크로마토그래피 단계로써 세포 배양 상청액으로부터 정제한다.
친화도 크로마토그래피를 위해, 상청액을, 30 ml 20　mM 나트륨 포스페이트, 20　mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5 로 각각 평형화된, HiTrap Protein　G HP 컬럼 (CV　=　5 ml, GE Healthcare) 과 커플링된 HiTrap Protein　A HP 컬럼 (CV　=　5 ml, GE Healthcare) 상에 로딩한다. 비결합된 단백질은, 두 컬럼들을 6 컬럼 부피 20　mM 나트륨 포스페이트, 20　mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5 로 세정함으로써 제거한다. 후속해서, 적어도 8 컬럼 부피 20　mM 나트륨 포스페이트, 20　mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5 를 이용한 HiTrap Protein　G HP 컬럼만을 세정하기 위해서, 추가의 세정 단계가 필수적이다. 표적 단백질은, 7 컬럼 부피 8.8　mM 포름산, pH 3.0 으로의 단계 구배를 이용하는 HiTrap Protein　G HP 컬럼으로부터 용리한다. 단백질 용액을 1/10 의 0.5　M 나트륨 포스페이트, pH　8.0 을 첨가함으로써 중화한다. 표적 단백질은 25 mM 칼륨 포스페이트, 125 mM 나트륨 클로라이드, 100 mM 글리신 용액, pH 6.7 으로 평형화된 HiLoad Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 상에 로딩 이전에 농축 및 여과한다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는, 280 nm 에서의 흡광도 (OD) 를 아미노산 서열 기반으로 해 산출된 몰 흡광 계수를 이용해 측정함으로써 결정한다. 항체의 순도 및 분자량은 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에서 쿠마시 염색 (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen) 의 SDS-PAGE 로써 분석한다. NuPAGE®Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 은 제조사 지침 (4-12　% Tris-아세테이트 겔 또는 4-12　% Bis-Tris) 에 따라 이용된다. 항체 샘플의 응집 함량은 Superdex 200 10/300GL 분석적 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 2 mM MOPS, 150　mM NaCl, 0.02　% (w/v) NaN3, pH 7.3 작동 완충제, 25℃ 를 이용해 분석하고, 종래 기술의 항체 단편 (scFv)2 와 비교한다 (결과: 하기 표 참조).
Figure 112017030475775-pat00003
예의 Fab-Fab-Crossfab 분자 (도 1 c) 에 나타낸 바와 같은 방향으로, 4 개의 쇄: VHCH1(MCSP)-VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3V9) = SEQ ID NO:26, 2 개의 VLCL(MCSP) 쇄 = SEQ ID NO:17 및 하나의 VHCL(CD3V9) 쇄 = SEQ ID NO:23 로 이루어짐) 의 제조 및 정제 분석을 도 4 및 5 에 나타낸다. 상기 분자는 추가로 Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 또는 hu Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 로서 지칭된다.
예의 Fab-Crossfab-Fab 분자 (도 1 e) 에 나타낸 바와 같은 방향으로, 4 개의 쇄: VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3V9)- VHCH1(MCSP)= SEQ ID NO:27, 2 개의 VLCL(MCSP) 쇄 = SEQ ID NO:17 및 하나의 VHCL(CD3V9) 쇄 = SEQ ID NO:23 으로 이루어짐) 의 제조 및 정제 분석은 도 6 및 7 에 나타낸다. 상기 분자는 추가로 Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 또는 hu Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 로서 지칭된다.
예의 Crossfab-Fab-Fab 분자 (도 1 d) 에 나타낸 방향으로, 4 개의 쇄: VLCH1(CD32C11)- VHCH1(MCSP)- VHCH1(MCSP)= SEQ ID NO:42, 2 개의 VLCL(MCSP) 쇄 = SEQ ID NO:17 및 1 개의 VHCL(CD32C11) 쇄 = SEQ ID NO:43) 의 제조 및 정제 분석은도 8 및 9 에 나타낸다. 상기 분자는 쥣과동물 Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)- Fab (MCSP) 로서 추가 지칭된다.
실시예 3: Fab (CD33)- CrossFab (CD3) 의 제조
수득한 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을, 각 수용 포유동물 발현 벡터 내 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄로 프레임 내 서브클로닝하였다. CDS 의 3 말단에 합성 polyA 신호 서열을 갖고, MPSV 프로모터로 구동해 항체를 발현한다. 나아가, 각 벡터는 EBV OriP 서열을 포함한다.
상기 분자는 칼슘 포스페이트-트랜스펙션을 이용해 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 공동-트랜스펙션함으로써 제조한다. 기하급수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포는, 칼슘 포스페이트 방법으로써 트랜스펙션한다. 다르게는, 현탁액 중에서 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민으로써 트랜스펙션한다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 1:1:1 비율로 트랜스펙션한다 ("벡터 CH1-VH - CK-VH": "벡터 경쇄": "벡터 경쇄 CH1-VL").
칼슘 포스페이트를 이용하는 트랜스펙션에 있어서, 10　% (v/v) FCS 로 보충된 DMEM 배양 배지를 이용해 T-플라스크에서 부착 단층 배양물로서 세포를 성장시키고, 상기 세포를 50 내지 80% 포화도가 될 때 트랜스펙션한다. T150 플라스크의 트랜스펙션에 있어서, 1500 만 세포를 FCS (최종 10% v/v) 로 보충된 25 ml DMEM 배양 배지에서 트랜스펙션하기 24 시간 전에 시딩하고, 세포를 5% CO2 분위기 하, 하룻밤 동안 37　℃ 인큐베이터에 배치한다. 트랜스펙션될 각 T150 플라스크에 있어서, DNA, CaCl2 및 물의 용액을, 해당 비율로 나뉜 94　㎍ 전체 플라스미드 벡터 DNA, 최종 부피 469　㎕ 로의 물 및 469　㎕ 의 1　M CaCl2 용액을 혼합함으로써 제조한다. 상기 용액에, 938　㎕ 의 50　mM HEPES, 280　mM NaCl, 1.5　mM Na2HPO4 용액, pH 7.05 을 첨가하고, 10 초 동안 즉시 혼합한 다음 실온에서 20 초 동안 정치한다. 현탁액을 2　% (v/v) FCS 로 보충된 10 ml 의 DMEM 으로 희석하고, 기존의 배지 대신 T150 에 첨가했다. 이어서, 추가 13 ml 의 트랜스펙션 배지를 첨가한다. 세포를 37　℃, 5　% CO2 에서 약 17 내지 20 시간 동안 인큐베이션한 다음, 배지를 25 ml DMEM, 10% FCS 로 대체한다. 조건화 배양 배지를 15 분 동안 210 x g 에서 원심분리로써 배지-교환후 약 7 일 후에 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22 ㎛ 필터), 0.01 % (w/v) 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지한다.
폴리에틸렌이민을 이용한 트랜스펙션에 있어서, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 무혈청 배양 배지 내 현탁액에서 배양한다. 500 ml 진탕 플라스크에서 제조하기 위해, 400,000,000 개의 HEK293 EBNA 세포를 트랜스펙션 24 시간 이전에 시딩한다. 트랜스펙션을 위해, 세포를 5 분 동안 210 x g 로 원심분리하고, 상청액을 예열된 20 ml CD CHO 배지로써 대체한다. 발현 벡터를 20 ml CD CHO 배지에서 총량 200 ㎍ DNA 로 혼합한다. 540　㎕ PEI 첨가 후, 용액을 15 초 동안 보르텍스 교반하고, 후속해서 10 분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 그후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37　℃ 로써 인큐베이터에서 5% CO2 분위기 하에서 인큐베이션한다. 상기 인큐베이션 시간 후 160 ml F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양한다. 트랜스펙션 후 1 일 후에, 1 mM 발포르산 및 7% Feed 1 (Lonza) 를 첨가한다. 7 일 후, 배양 상청액을 15 분 동안 210 x g 에서의 원심분리에 의한 정제를 위해 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22　㎛ 필터), 0.01 % w/v 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지한다.
분비된 단백질을, 단백질 A 및 단백질 G 친화도 크로마토그래피를 이용한 친화도 크로마토그래피 후, 크기 배제 크로마토그래피 단계로써 세포 배양 상청액으로부터 정제한다.
친화도 크로마토그래피를 위해, 상청액을, 30 ml 20　mM 나트륨 포스페이트, 20　mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5 로 각각 평형화된, HiTrap Protein　G HP 컬럼 (CV　=　5 ml, GE Healthcare) 과 커플링된 HiTrap Protein　A HP 컬럼 (CV　=　5 ml, GE Healthcare) 상에 로딩한다. 비결합된 단백질은, 두 컬럼들을 6 컬럼 부피 20　mM 나트륨 포스페이트, 20　mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5 로 세정함으로써 제거한다. 후속해서, 적어도 8 컬럼 부피 20　mM 나트륨 포스페이트, 20　mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5 를 이용한 HiTrap Protein　G HP 컬럼만을 세정하기 위해서, 추가의 세정 단계가 필수적이다. 표적 단백질은, 7 컬럼 부피 8.8　mM 포름산, pH 3.0 으로의 단계 구배를 이용하는 HiTrap Protein　G HP 컬럼으로부터 용리한다. 단백질 용액을 1/10 의 0.5　M 나트륨 포스페이트, pH　8.0 을 첨가함으로써 중화한다. 표적 단백질은 25 mM 칼륨 포스페이트, 125 mM 나트륨 클로라이드, 100 mM 글리신 용액, pH 6.7 으로 평형화된 HiLoad Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 상에 로딩 이전에 농축 및 여과한다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는, 280 nm 에서의 흡광도 (OD) 를 아미노산 서열 기반으로 해 산출된 몰 흡광 계수를 이용해 측정함으로써 결정한다. 항체의 순도 및 분자량은 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에서 쿠마시 염색 (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen) 의 SDS-PAGE 로써 분석한다. NuPAGE®Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 은 제조사 지침 (4-12　% Tris-아세테이트 겔 또는 4-12　% Bis-Tris) 에 따라 이용된다. 항체 샘플의 응집 함량은 Superdex 200 10/300GL 분석적 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 2 mM MOPS, 150　mM NaCl, 0.02　% (w/v) NaN3, pH 7.3 작동 완충제, 25℃ 를 이용해 분석한다.
예의 Fab-Crossfab 분자 (도 1 a) 에 나타낸 바와 같은 방향으로, 3 개의 쇄: VHCH1(CD33)- VLCH1(CD3V9) = SEQ ID NO:102, VLCL(CD33) = SEQ ID NO:100 및 VHCL(CD3V9) = SEQ ID NO:23 또는 SEQ ID NO:101 로 이루어짐) 의 제조 및 정제 분석은 도 17 및 18 에 나타낸다. 상기 분자는 Fab(CD33)-CrossFab (CD3) 또는 hu Fab(CD33)-CrossFab (CD3) 로서 추가 지칭된다.
실시예 4: 기준 분자 (scFv)2 의 제조
클로닝 및 제조
수득한 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을, 각 수용 포유동물 발현 벡터 내로 프레임 내에서 서브클로닝하였다. CDS 의 3 말단에 합성 polyA 신호 서열을 갖고, MPSV 프로모터로 구동해 항체를 발현한다. 더욱이, 각 벡터는 EBV OriP 서열을 포함한다.
상기 분자는 폴리에틸렌이민을 이용해 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 트랜스펙션함으로써 제조한다. HEK293 EBNA 세포를, 무혈청 CD CHO 배양 배지 중 현탁액에서 배양한다. 500 ml 진탕 플라스크에서 제조하기 위해, 400,000,000 개의 HEK293 EBNA 세포를 트랜스펙션 24 시간 이전에 시딩한다. 트랜스펙션을 위해, 세포를 5 분 동안 210 x g 로 원심분리하고, 상청액을 예열된 20 ml CD CHO 배지로써 대체한다. 발현 벡터를 20 ml CD CHO 배지에서 총량 200 ㎍ DNA 로 혼합한다. 540　㎕ PEI 첨가 후, 용액을 15 초 동안 보르텍스 교반하고, 후속해서 10 분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 그후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ml 진탕 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37　℃ 로써 인큐베이터에서 5% CO2 분위기 하에서 인큐베이션한다. 상기 인큐베이션 시간 후 160 ml F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양한다. 트랜스펙션 후 1 일 후에, 1 mM 발포르산 및 7% Feed 1 (Lonza) 를 첨가한다. 7 일 후, 배양 상청액을 15 분 동안 210 x g 에서의 원심분리에 의한 정제를 위해 수집하고, 용액을 멸균 여과하고 (0.22　㎛ 필터), 0.01 % w/v 의 최종 농도로 나트륨 아지드를 첨가하고, 4　℃ 에서 유지한다.
( scFv )2 (항 MCSP /항 huCD3 ) 의 정제
분비된 단백질을, 고정화 금속 이온 친화도 크로마토그래피 (IMAC) 를 이용한 친화도 크로마토그래피 후 크기 배제 크로마토그래피 단계로써 세포 배양 상청액으로부터 정제한다.
제 1 정제 단계 이전에, 상청액으로부터 방해 성분들을 5.000　MWCO 막 (Sartocon Slice Cassette, Hydrosart; Sartorius) 이 장착된 접선 유동 여과 시스템 Sarcojet (Sartorius) 을 이용해 정용여과 (diafiltration) 로써 제거한다. 상청액을 210 ml 로 농축하고, 후속해서 1　l 20　mM 나트륨 포스페이트, 500　mM 나트륨 클로라이드, pH　6.5 중에서 희석한다. 단백질 용액을 210 ml 로 다시 농축한다. 상기 프로세스를 2 회 반복해 완전한 완충제 교환을 보장한다.
친화도 크로마토그래피를 위해 정용여과 프로세스의 농축물을, 25　ml 20　mM 나트륨 포스페이트, 500　mM 나트륨 클로라이드, 15　mM 이미다졸, pH 6.5 로 평형화된 NiNTA Superflow Cartridge (CV=5 mL, Qiagen) 상에 로딩한다. 비결합 단백질은 적어도 2 컬럼 부피 20　mM 나트륨 포스페이트, 500　mM 나트륨 클로라이드, 15　mM 이미다졸, pH　6.5 로의 세정 후, 3 컬럼 부피 20　mM 나트륨 포스페이트, 500　mM 나트륨 클로라이드, 62.5　mM 이미다졸, pH　6.5 를 이용한 추가적인 세정 단계로써 제거한다. 표적 단백질은 2 컬럼 부피 20　mM 나트륨 포스페이트, 500　mM 나트륨 클로라이드, 125　mM 이미다졸, pH　6.5 에서 용리한다. 컬럼을 20　mM 나트륨 포스페이트, 500　mM 나트륨 클로라이드, 250　mM 이미다졸, pH 6.5 로 후속해서 세정한다.
표적 단백질을, 25　mM KH2PO4, 125　mM NaCl, 200　mM 아르기닌, pH　6.7 로 평형화된 HiLoad Superdex 75 컬럼 (GE Healthcare) 상에 로딩하기 전에 농축한다.
수율, 제 1 정제 단계 후 응집 함량 및 최종 단량체 함량을 상기 표에 나타낸다. 제 1 정제 단계 후 응집 함량을 비교하면, (scFv)2 와 대조적으로 Fab-Crossfab 구축물의 안정성이 더 우수하다는 점이 지시된다.
(scFv)2 의 특성평가
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는, 280 nm 에서의 흡광도 (OD) 를 아미노산 서열 기반으로 해 산출된 몰 흡광 계수를 이용해 측정함으로써 결정한다. 항체의 순도 및 분자량은 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에서 쿠마시 염색 (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen) 의 SDS-PAGE 로써 분석한다. NuPAGE®Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 은 제조사 지침 (4-12　% Tris-아세테이트 겔 또는 4-12　% Bis-Tris) 에 따라 이용된다. 항체 샘플의 응집 함량은 Superdex 75 10/300GL 분석적 크기-배제 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 2 mM MOPS, 150　mM NaCl, 0.02　% (w/v) NaN3, pH 7.3 작동 완충제, 25℃ 를 이용해 분석한다.
(scFv)2 분자의 개략도는 도 21 에 나타낸다.
예의 (scFv)2 분자 (항MCSP/항 huCD3; 2 개의 단일 쇄 Fvs: VL-VH (MCSP) 및 VH-VL (CD3V9) = SEQ ID NO:149 로 이루어짐) 의 제조 및 정제 분석은 도 22 및 23 에 나타낸다. 상기 분자는 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 로서 추가 지칭된다.
실시예 5: PBMC 로부터의 주요 인간 pan T 세포의 단리
말초혈 단핵 세포 (PBMCs) 를, 현지 혈액 은행에서 또는 건강한 인간 기증자의 신선한 혈액에서 수득한 풍부한 림프구 준비물 (백혈구 연층) 로부터, Histopaque 밀도 원심분리에 의해 제조하였다.
PBMC 로부터의 T-세포 강화 (enrichment) 를, Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec #130-091-156) 를 이용해, 제조사 지침에 따라 수행하였다. 요약컨대, 세포 펠릿을 10 Mio 세포 당 40㎕ 냉 완충제에서 (멸균 여과된, 0.5 % BSA, 2 mM EDTA 함유 PBS) 희석하고, 10 분 동안 4 ℃ 에서 10 Mio 세포 당 10㎕ 바이오틴-항체 칵테일 (Biotin-Antibody Cocktail) 로 인큐베이션하였다.
10 Mio 세포 당 20㎕ 항-바이오틴 자기 비즈 (magnetic beads) 및 30㎕ 냉 완충제를 첨가하고, 그 혼합물을 추가 15 분 동안 4 ℃ 에서 인큐베이션하였다.
세포를, 10-20x 의 표지 부피로의 첨가 후 10 분간 300g 로의 원심분리에 의해 세정했다. 100 이하의 Mio 세포를 500 ㎕ 완충제 중 재현탁하였다.
비(非)표지된 인간 pan T 세포의 자기 (magnetic) 분리를, 제조사 지침에 따라 LS 컬럼 (Miltenyi Biotec #130-042-401) 을 이용해 수행했다. 수득한 T 세포 모집단을, 자동 계수하고 (ViCell) AIM-V 배지에, 37℃, 5 % CO2, 인큐베이터에서 검정 시작까지 (24 시간 이하) 보관했다.
실시예 6: 비장세포로부터 쥣과동물 pan T 세포의 단리
비장을, C57BL/6 마우스로부터 단리해, MACS 완충제 (PBS + 0.5 % BSA + 2 mM EDTA) 함유 GentleMACS C-튜브 (Miltenyi Biotech #130-093-237) 에 옮기고, 제조사 지침에 따라 GentleMACS Dissociator 로 분리해 단일-세포 현탁액을 수득했다.
세포 현탁액을 예비-분리 필터를 통과시켜 잔존하는 분리되지 않은 조직 입자들을 없앴다. 4 분 동안 4℃ 에서 400 g 원심분리 후, ACK 분해 완충제를 첨가해 적혈구 세포를 분해했다 (5 분 동안 실온에서 인큐베이션). 잔존 세포들은 MACS 완충제로 2 회 세정하고, 계수한 다음 쥣과동물 pan T 세포의 단리에 사용했다. 음성 (자기; magnetic) 선택을, Miltenyi Biotec 사의 Pan T Cell Isolation Kit (#130-090-861) 를 이용해 제조사 지침에 따라 수행하였다. 수득한 T 세포 모집단을 자동 계수하고 (ViCell) 추가 검정을 위해 바로 사용했다.
실시예 7: 종양 세포 상 MCSP 및 T 세포 상 CD3 을 표적하는 가교 이중특이적 구축물에 의해 매개된 전용된 (re-directed) T 세포 세포독성 ( LDH 방출 검정).
인간 또는 마우스 T 세포 상 CD3 및 종양 세포 상 인간 MCSP 를 표적하는 이중특이적 구축물을, 표적세포의 T-세포 매개 세포자멸사를 유도하는 그의 잠재력에 관해 LDH 방출 검정으로써 분석한다.
간략히, 표적 세포 (인간 Colo-38, 인간 MDA-MB-435, 인간 흑색종 MV-3 또는 쥣과동물 B16/F10-huMCSP Fluc 2 클론 48 세포, 모두 인간 MCSP 를 발현함) 를, 세포 분리 완충제 (Cell Dissociation Buffer; MCSP 는 트립신-민감성임) 또는 트립신 (그 전날 플레이팅됨) 으로 수확하고, 세정 및 적절 세포 배양 배지에서 재현탁한다 (상이한 도면들의 상세한 설명 참조). 웰 당 20 000 ~ 30 000 세포를, 환저 96 웰-플레이트에 플레이팅하고, 각 항체 희석물을 지시된 대로 (3 세트; triplicate) 첨가한다. 효과기 세포를 첨가해, 5:1 (인간 pan T 세포), 10:1 (인간 PBMC) 의 최종 E:T 비를 수득하였다.
더욱이, 1-10 ㎍/ml PHA-M (Sigma #L8902), 즉 강탕콩에서 단리된 이소렉틴 (isolectin) 혼합물을 인간 또는 원숭이 (cynomolgus) T 세포 활성화를 유도하기 위한 분열유발성 (mitogenic) 자극으로서 이용했다. 쥣과동물 T 세포에 있어서, "rat T-Stim with ConA" (BD #354115) 의 5% 용액을 T 세포 활성화를 위한 양성 대조군으로서 사용했다.
정규화에 있어서, 표적 세포의 최고 분해 (= 100%) 는 최종 농도 1 % Triton-X-100 로의 표적 세포의 인큐베이션에 의해 달성된다. 최저 분해 (= 0 %) 는, 효과기 세포와, 그러나 어떠한 구축물 또는 항체는 없이 공동-인큐베이션된 표적 세포를 지칭한다.
18 시간 이상 37℃, 5 % CO2 의 하룻밤 인큐베이션 후, 상청액으로의 세포자멸사/괴사 표적 세포의 LDH 방출을, LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, # 11 644 793 001) 로, 제조사 지침에 따라 측정한다.
Fab ( MCSP )- Crossfab (CD3) 및 Fab ( MCSP )- Fab ( MCSP )- Crossfab (CD3) 이중특이적 구축물로의 LDH 방출 검정
정제된 Fab (MCSP)-Crossfab (CD3), Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 기준 분자를, 세포 상 각 항원에 대한 표적 모이어티 양자 모두의 결합을 통한 구축물의 가교시, 종양 표적 세포에서의 T 세포-매개 세포자멸사의 유도 잠재능에 대해 분석했다. 요약하면, huMCSP-발현 MDA-MB-435 인간 흑색종 표적 세포를, 세포 분해 완충제로 수확하고, 세정한 다음 AIM-V 배지 (Invitrogen # 12055-091) 중에서 재현탁했다. 웰 당 30 000 세포를 환저 96-웰-플레이트에서 플레이팅하고, 각 항체 희석물을 지시된 농도로 첨가했다. 모든 구축물 및 대조군을 동일 몰농도로 조절했다.
인간 pan T 효과기 세포를 첨가해, 최종 E:T 비율 5:1 을 수득했다. 인간 pan T 세포의 활성화를 위한 양성 대조군으로서, 1 ㎍/ml PHA-M (Sigma #L8902) 을 이용했다. 정규화에 있어서, 표적 세포의 최고 분해 (= 100 %) 를, 최종 농도 1 % Triton-X-100 로의 표적 세포의 인큐베이션에 의해 측정하였다. 최저 분해 (= 0 %) 는, 효과기 세포와, 그러나 어떠한 구축물 또는 항체는 없이, 공동 인큐베이션된 표적 세포를 지칭한다.
20 시간 37℃, 5 % CO2 의 하룻밤 인큐베이션 후, 세포자멸사/괴사 표적 세포의 상청액으로의 LDH 방출을, LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, # 11 644 793 001) 로, 제조사 지침에 따라 측정하였다.
도 10 에 나타낸 바와 같이, 2가 MCSP-표적 구축물은, (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 구축물과 비교시 필적할만한 세포독성 활성을 보이는 반면에, 1가 MCSP 결합 Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 구축물은 분명하게도 덜 강력하다.
MDA -MB-435 인간 흑색종 표적 세포와 Fab ( MCSP )- Fab ( MCSP )- Crossfab (CD3) 이중특이적 구축물을 이용한 LDH 방출 검정
정제된 Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 기준 분자를, 세포 상 각 항원에 대한 표적 모이어티 양자 모두의 결합을 통한 구축물의 가교시, 종양 표적 세포에서의 T 세포-매개 세포자멸사의 유도 잠재능에 대해 분석했다.
요약하면, huMCSP-발현 MDA-MB-435 인간 흑색종 표적 세포를, 세포 분해 완충제로 수확하고, 세정한 다음 AIM-V 배지 (Invitrogen # 12055-091) 중에서 재현탁했다. 웰 당 30 000 세포를 환저 96-웰-플레이트에서 플레이팅하고, 각 항체 희석물을 지시된 농도로 첨가했다. 모든 구축물 및 대조군을 동일 몰농도로 조절했다.
인간 pan T 효과기 세포를 첨가해, 최종 E:T 비율 5:1 을 수득했다. 인간 pan T 세포의 활성화를 위한 양성 대조군으로서, 5 ㎍/ml PHA-M (Sigma #L8902) 을 이용했다. 정규화에 있어서, 표적 세포의 최고 분해 (= 100 %) 를, 최종 농도 1 % Triton-X-100 로의 표적 세포의 인큐베이션에 의해 측정하였다. 최저 분해 (= 0 %) 는, 효과기 세포와, 그러나 어떠한 구축물 또는 항체는 없이, 공동 인큐베이션된 표적 세포를 지칭한다.
21 시간 37℃, 5 % CO2 의 하룻밤 인큐베이션 후, 세포자멸사/괴사 표적 세포의 상청액으로의 LDH 방출을, LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, # 11 644 793 001) 로, 제조사 지침에 따라 측정하였다.
도 11 에 나타낸 바와 같이, Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 는 표적 세포에서 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 분자만큼 적어도 필적할 정도로 양호하게 세포자멸사를 유도한다.
MV-3 인간 흑색종 표적 세포와 Fab ( MCSP )- Fab ( MCSP )- Crossfab (CD3) 이중특이적 구축물로의 LDH 방출 검정
정제된 Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 분자를, 세포 상 각 항원에 대한 표적 모이어티 양자 모두의 결합을 통한 구축물의 가교시, 종양 표적 세포에서의 T 세포-매개 세포자멸사의 유도 잠재능에 대해 분석했다.
요약하면, huMCSP-발현 MV-3 인간 흑색종 표적 세포를, LDH 방출 검정을 시작하기 전일에 트립신으로 수확한다. 세포를 세정하고 적절한 세포 배양 배지에서 재현탁하였다. 웰 당 30 000 세포를 환저 96-웰-플레이트에서 플레이팅하였다. 익일, 상청액을 버리고, 100 ㎕/웰 AIM-V 배지 (Invitrogen # 12055-091) 뿐 아니라, 각 항체 희석물을 지시된 농도로 첨가했다. 모든 구축물 및 대조군을 동일 몰농도로 조절했다.
인간 PBMC 효과기 세포를 첨가해, 최종 E:T 비율 10:1 을 수득했다. 인간 pan T 세포의 활성화를 위한 양성 대조군으로서, 5 ㎍/ml PHA-M (Sigma #L8902) 을 이용했다. 정규화에 있어서, 표적 세포의 최고 분해 (= 100 %) 를, 최종 농도 1 % Triton-X-100 로의 표적 세포의 인큐베이션에 의해 측정하였다. 최저 분해 (= 0 %) 는, 효과기 세포와, 그러나 어떠한 구축물 또는 항체는 없이, 공동 인큐베이션된 표적 세포를 지칭한다.
26 시간 37℃, 5 % CO2 의 하룻밤 인큐베이션 후, 세포자멸사/괴사 표적 세포의 상청액으로의 LDH 방출을, LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, # 11 644 793 001) 로, 제조사 지침에 따라 측정하였다.
도 12 에 나타낸 바와 같이, Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 는 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 분자만큼 적어도 필적할 정도로 양호하게 세포자멸사를 유도한다.
MV-3 인간 흑색종 표적 세포와 Fab ( MCSP )- Crossfab (CD3) 이중특이적 구축물로의 LDH 방출 검정
LDH 방출 검정을 상기 개괄한 대로 수행했다. 도 19 는, ~ 24 시간 동안 각 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 기준분자, Fab (MCSP)- Crossfab (CD3) 로 처리된 인간 PBMC (E:T 비 = 10:1) 와의 공동 배양시, huMCSP-양성 MV-3 종양 세포의 사멸을 보여준다.
쥣과동물 Crossfab (CD3)- Fab ( MCSP )- Fab ( MCSP ) 이중특이적 구축물로의 LDH 방출 검정
쥣과동물 CD3 뿐 아니라 인간 MCSP 를 표적하는, 정제된 쥣과동물 Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)- Fab (MCSP) 을, 세포 상 각 항원에 대한 표적 모이어티 양자 모두의 결합을 통한 구축물의 가교시, 종양 표적 세포에서의 T 세포-매개 세포자멸사 유도 잠재능에 대해 분석했다.
간략히, huMCSP-발현 B16/F10-huMCSP Fluc2 클론 48 종양 표적 세포를, 세포 분해 완충제로 수확하고, 세정 및 1x NEAA, 10 mM Hepes, 50 μm 2-b-ME 및 1 mM 나트륨 피루베이트 포함 RPMI1640 배지에서 재현탁했다.
웰 당 20 000 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 각 항체 희석물을 지시된 농도로 첨가했다. 이중특이적 구축물 및 상이한 IgG 대조군을 동일한 몰농도로 조절했다. 쥣과동물 T 세포의 활성화에 대한 추가 대조군으로서, "T Cell Stim with ConA" (BD #354115) 를 이용하고, 검정 배지로 1:160 희석했다.
비장세포 (C57BL/6 마우스) 에서 단리된, 쥣과동물 pan T 효과기 세포를 첨가해, 10:1 의 최종 E:T 비율을 수득했다. 정규화에 있어서, 표적 세포의 최고 분해 (= 100 %) 를, 최종 농도 1 % Triton-X-100 로의 표적 세포의 인큐베이션에 의해 측정하였다. 최저 분해 (= 0 %) 는, 효과기 세포와, 그러나 어떠한 구축물 또는 항체는 없이, 공동 인큐베이션된 표적 세포를 지칭한다.
70 시간 37℃, 5 % CO2 의 인큐베이션 후, 세포자멸사/괴사 표적 세포의 상청액으로의 LDH 방출을, LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, # 11 644 793 001) 로, 제조사 지침에 따라 측정하였다.
도 13 에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 구축물은 "T Cell Stim with ConA" 로의 양성 대조군과 필적할 정도로 표적 세포로부터 농도-의존적 LDH 방출을 유도한다.
쥣과동물 Crossfab (CD3)- Fab ( MCSP )- Fab ( MCSP ) 이중특이적 구축물로의 LDH 방출 검정
쥣과동물 CD3 뿐 아니라 인간 MCSP 를 표적하는 정제된 쥣과동물 Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)- Fab (MCSP) 을, 세포 상 각 항원에 대한 표적 모이어티 양자 모두의 결합을 통한 구축물의 가교시, 종양 표적 세포에서의 T 세포-매개 세포자멸사 유도 잠재능에 대해 분석했다.
간략히, huMCSP-발현 B16/F10-huMCSP Fluc2 클론 48 종양 표적 세포를, 세포 분해 완충제로 수확하고, 세정 및 1x NEAA, 10 mM Hepes, 50 μm 2-b-ME 및 1 mM 나트륨 피루베이트 포함 RPMI1640 배지에서 재현탁했다.
웰 당 20 000 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 각 항체 희석물을 최종 농도 50 nM 을 수득하도록 첨가했다. 이중특이적 구축물 및 상이한 IgG 대조군을 동일 몰농도로 조절했다.
비장세포 (C57BL/6 마우스) 에서 단리된, 쥣과동물 pan T 효과기 세포를 첨가해, 10:1 의 최종 E:T 비율을 수득했다. 표적 세포의 부재 하에서 쥣과 동물 T 세포의 과활성화 수준을 평가하기 위해, 50 nM 이중특이적 구축물 및 T 세포를 갖는 대조군 웰을 그에 따라 플레이팅하였다.
정규화에 있어서, 표적 세포의 최고 분해 (= 100 %) 를, 최종 농도 1 % Triton-X-100 로의 표적 세포의 인큐베이션에 의해 측정하였다. 최저 분해 (= 0 %) 는, 효과기 세포와, 그러나 어떠한 구축물 또는 항체는 없이, 공동 인큐베이션된 표적 세포를 지칭한다.
70 시간 37℃, 5 % CO2 의 인큐베이션 후, 세포자멸사/괴사 표적 세포의 상청액으로의 LDH 방출을, LDH 탐지 키트 (Roche Applied Science, # 11 644 793 001) 로, 제조사 지침에 따라 측정하였다.
도 14 에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 구축물은 표적 세포로부터 강한 LDH 방출을 유도한다. 표적 세포의 부재 하에서는, 표적 세포와 공동 인큐베이션된 비(非)처리 쥣과동물 T 세포와 비교시, 단지 약간 LDH 가 증가되어 존재한다 (이는 T 세포의 과활성화를 반영함). 대조군 IgG 의 어떤 것도 표적 세포의 LDH 방출을 유도한다.
실시예 8: 사이토카인 방출 검정 ( CBA 분석)
표적 세포의 존재 또는 부재 하, CD3-이중특이적 구축물로의 T 세포 활성화 때, 상이한 사이토카인의 데노보 (de novo) 분비를 평가하기 위해, 인간 PBMC 를 백혈구 연층에서 단리하고, 웰 당 0.3 Mio 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다르게는, 건강한 기증자의 280 ㎕ 전혈을 딥-웰 96-웰 플레이트의 웰마다 플레이팅했다.
종양 표적 세포 (예, CD3-MCSP-이중특이적 구축물을 위한 MDA-MB-435 세포) 를, 첨가해 최종 E/T-비 10:1 을 수득했다. 이중특이적 구축물 및 대조군을 지시한 대로 첨가했다. 24 시간 이하 37℃, 5 % CO2 에서 인큐베이션 후, 검정 플레이트를 5 분 동안 350 g 에서 원심분리하고, 상청액을 후속의 분석을 위해 새로운 딥-웰 96 웰에 후속 분석을 위해 옮겼다.
CBA 분석을, 하기 CBA Flex 세트 조합을 이용해 FACS CantoII 에 대한 제조사 지침에 따라 수행했다: 인간 그랜자임 B (BD 560304), 인간 IFN-γ Flex Set (BD 558269), 인간 TNF Flex Set (BD 558273), 인간 IL-10 Flex Set (BD 558274), 인간 IL-6 Flex Set (BD 558276), 인간 IL-4 Flex Set (BD 558272).
MCSP-CD3 이중특이적 구축물로의 사이토카인 방출 탐지
인간 MCSP 및 인간 CD3 을 표적하는 하기의 정제된 이중특이적 구축물을, 종양 표적 세포의 존재 (A, B) 대 부재 (C, D) 하에서, T-세포 매개된 사이토카인의 데노보 분비를 유도하는 능력에 대해 분석했다: "Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 기준 분자.
간략히, 건강한 기증자의 280 ㎕ 전혈을, 딥-웰 96-웰 플레이트의 웰 마다 플레이팅했다. IgG 대조군 및 상이한 이중특이적 구축물들뿐 아니라 인간 MCSP 를 발현하는 30 000 Colo-38 종양 표적 세포를 1 nM 최종 농도로 첨가했다. 세포를 24 시간 동안 37℃, 5 % CO2 에서 인큐베이션한 다음 5 분 동안 350 x g 로 원심분리하였다. 상청액을 후속 분석을 위해 새로운 딥-웰 96-웰-플레이트에 옮겼다.
CBA 분석을, 하기의 CBA Flex 세트 조합을 이용해 FACS CantoII 에 대한 제조사 지침에 따라 수행했다: 인간 그랜자임 B (BD 560304), 인간 IFN-γ Flex Set (BD 558269), 인간 TNF Flex Set (BD 558273), 인간 IL-10 Flex Set (BD 558274), 인간 IL-6 Flex Set (BD 558276), 인간 IL-4 Flex Set (BD 558272).
도 15 는 상이한 사이토카인 수준을 나타내고, 이는 24 시간 동안 30000 Colo-38 종양 세포의 존재 (A, B) 또는 부재 (C, D) 하에서 1 nM 의 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 (Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e)) 로의 처리 후 전혈 상청액에서 측정되었다. 280 ㎕ 전혈을 96-웰 플레이트의 웰 마다 플레이팅하고, 30 000 Colo-38 세포를 지시한 대로 첨가했다.
Colo-38 종양 세포의 존재 하에서 T 세포의 활성화 때 분비된 주요 사이토카인은 IL-6, 그 다음이 IFN감마이다. 게다가, 또한 그랜자임 B 의 수준이 표적 세포의 존재 하에서 T 세포의 활성화 때 크게 증가하였다. 일반적으로, (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 구축물은, 다른 이중특이적 구축물과 비교시 조금 더 표적 세포의 존재 하에서, TNF 와 IFN 감마뿐 아니라, 그랜자임 B 수준을 상승시켰다 (A 및 B).
표적 세포의 존재 (또는 부재) 하, 이중특이적 구축물에 의한 T 세포의 활성화시, Th2 사이토카인 (IL-10 및 IL-4) 의 유의미한 분비는 없었다.
상기 검정에서, 표적 세포의 부재 하, Fab (MCSP)- Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) 구축물에 의해 유도된 IFN 감마의 분비가 약하게 또한 존재했다.
MCSP - 쥣과동물CD3 이중특이적 구축물로의 사이토카인 방출 검정
쥣과동물 Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)- Fab (MCSP) 로서 정제된 huMCSP-muCD3-표적 이중특이적 분자를, 인간 MCSP-발현 종양 세포의 존재 하 CD8+ T 세포 상 후기 활성화 마커 CD25 를 상향-조절하는 그의 잠재력에 대해 유세포분석에 의해 테스트하였다.
간략히, MCSP-양성 B16/F10-huMCSP Fluc2 클론 48 종양 세포를, 세포 분해 완충액으로 수확하고, 계수하고, 생존력에 대해 체크했다. 세포를 RPMI1640 배지 (1x NEAA, 10 mM Hepes, 50 ㎛ 2-b-ME, 1 mM 나트륨 피루베이트 포함) 에서 ml 당 0.3 x 106 (생) 세포로 조절하고, 100 ㎕ 의 상기 세포 현탁액을 환저 96-웰 플레이트 내로 (지시한 대로) 웰 당 피펫팅하였다. 50 ㎕ 의 (희석된) 이중특이적 구축물을 세포-포함 웰에 첨가해, 최종 농도 50 nM 을 얻었다. 인간 쥣과동물 T 효과기 세포를, 비장세포 (C57BL/6 마우스) 에서 단리하고, AIM-V 배지에서 ml 당 3 x 106 (생) 세포로 조절했다. 50 ㎕ 의 상기 세포 현탁액을 검정 플레이트 (상기 참조) 웰 당 첨가해, 최종 E:T 비 10:1 를 얻었다. 이중특이적 구축물이 huMCSP 를 발현하는 표적 세포의 존재 하에서만 T 세포를 활성화할 수 있다면, 50 nM 의 각 이중특이적 분자뿐 아니라 T 효과기를 포함하나 표적 세포는 포함하지 않는 웰을 분석하는 것을 포함하였다.
70 시간 동안 37℃, 5 % CO2 에서 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고 (5 분, 350 x g), 2 회 150 ㎕/웰 PBS (0.1 % BSA 포함) 으로 세정했다.
CD8a (래트 IgG2a; 클론 53-6.7; BioLegend #100712) 및 CD25 (래트 IgG2b; 클론 3C7; BD #553075) 에 대한 표면 염색을, 공급자 제시에 따라 수행했다. 세포를 2 회 150 ㎕/웰 PBS (0.1 % BSA 포함) 로 세정하고, 15 분 동안 4℃ 에서 100 ㎕/웰 고정 완충제 (BD ##554655) 를 이용해 고정했다.
원심분리 후, 샘플을 200 ㎕/웰 PBS, 0.1 % BSA 중에서 재현탁하고, FACS CantoII 장치 (Software FACS Diva) 를 이용해 분석했다.
도 16 은, 쥣과동물 Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)- Fab (MCSP) 구축물이 오직 표적 세포의 존재 하에서 CD25 의 상향-조절을 유도한다는 점을 나타낸다.
실시예 9: 이중특이적 구축물의 교전시 주요 인간 T 세포 상 표면 활성화 마커의 발현
오로지 종양 표적 세포의 존재 하에서만, CD3 이중특이적 구축물의 결합시, T 세포의 특이적 활성화에 대해 체크하기 위해, 주요 인간 PBMC (상기에 기재된 바와 같이 단리함) 를 종양 항원-양성 표적 세포의 존재 또는 부재 하 24 시간 이상 동안 지시된 농도의 이중특이적 구축물과 함께 인큐베이션하였다.
간략히, 30 만 주요 인간 PBMC 를, 배지 또는 huMCSP-양성 표적 세포 (MV-3 종양 세포) 함유 평저 96 웰 플레이트의 웰 마다 플레이팅했다. 효과기 대 표적 세포 (E:T) 의 최종 비율은 10:1 이었다. 세포를, 지시된 농도의 CD3-MCSP 이중특이적 구축물 (Fab (MCSP)-Crossfab (CD3); "1+1 non-Fc" 로서 표기, 및 (scFv)2 (항MCSP/항 huCD3e) 기준 분자 ("(scFv)2" 로서 표기) 과, 지시된 인큐베이션 시간 동안 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션하였다. 효과기 세포를 CD8, 초기 활성화 마커 CD69 또는 후기 활성화 마커 CD25 을 위해 염색하고, FACS CantoII 로써 분석했다.
도 20 은 상기 실험 결과를 나타낸다.
본 발명의 당해 바람직한 구현예를 보여주고 기술하였으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 하기 청구항의 범위 내에서 다르게 다양히 구현 및 실시될 수 있음은 분명히 이해된다.
서열
본 발명의 당해 바람직한 구현예를 보여주고 기술하였으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 하기 청구항의 범위 내에서 다르게 다양히 구현 및 실시될 수 있음은 분명히 이해된다. 범례: GA201= EGFR 결합제, 3F2= FAP 결합제, CH1A1A=CEA 결합제.
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본 발명의 당해 바람직한 구현예를 보여주고 기술하였으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 하기 청구항의 범위 내에서 다르게 다양히 구현 및 실시될 수 있음은 분명히 이해된다.
SEQUENCE LISTING <110> Roche Glycart AG <120> FC FREE ANTIBODIES COMPRISING TWO FAB FRAGMENTS AND METHODS OF USE <130> 30600 <150> EP11178391.6 <151> 2011-08-23 <160> 162 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 VL MCSP <400> 1 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 VL MCSP <400> 2 Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 VL MCSP <400> 3 Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 VH MCSP <400> 4 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 VH MCSP <400> 5 Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 1 5 10 15 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 VH MCSP <400> 6 Phe Asp Tyr 1 <210> 7 <211> 11 <212> PRT 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Sequence <220> <223> CL MCSP <400> 15 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 16 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 MCSP <400> 16 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys 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aaatcaaggg cggaggcgga tccggcggag gtggaagtgg cggcggaggc 420 tctgaggtgc aattgcagga aagcggccct ggcctggtga aacccagcca gagcctgagc 480 ctgacctgca gcgtgaccgg ctactccatc accagcggct actactggaa ctggatcaga 540 cagttccccg gaaacaagct ggaatggatg ggctacatca cctacgacgg cagcaacaac 600 tacaacccca gcctgaagaa ccggatcagc atcacccggg acaccagcaa gaaccagttc 660 ttcctgaagc tgaacagcgt gaccaccgag gataccgcca cctattactg tgccgacttc 720 gactactggg gccagggcac caccctgacc gtgtcatccg gtggcggcgg atccgaagtg 780 cagctggtgg agtctggcgg tggactggtg cagccaggcg gctccctgag actgagctgc 840 gccgcctccg gctacagctt caccggctac accatgaatt gggtccgcca ggcccctgga 900 aagggactgg aatgggtggc cctgatcaac ccctacaagg gcgtgagcac ctacaaccag 960 aagttcaagg accggttcac catcagcgtg gacaagagca agaacacagc ctacctgcag 1020 atgaactccc tgagagccga ggataccgcc gtgtattact gtgcccgcag cggctactac 1080 ggcgactccg actggtactt cgacgtgtgg gggcagggaa ccctggtcac cgtgtccagc 1140 gtggaaggcg gcagcggagg atctggcggc tctggcggaa gcggcggagt ggacgatatc 1200 cagatgacac agtcccccag 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105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 152 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain V9 (VL-CH1) <400> 152 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr 100 105 110 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 115 120 125 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 130 135 140 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 145 150 155 160 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 180 185 190 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 195 200 205 Pro Lys Ser Cys 210 <210> 153 <211> 459 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab-Crossfab (VH-CH1(CD33 Myelotarg) -VH-CL [V9]) <400> 153 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser 20 25 30 Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly 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Light Chain VL(Myelotarg) DNA <400> 154 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgac 60 atccagctga cccagagccc ctccacactc tctgcctcag tgggcgatag ggtcaccatt 120 acttgcagag ctagcgagtc cctggacaac tacggaatcc gcttccttac atggtttcag 180 cagaagcctg gaaaagcacc aaagctgctc atgtatgccg cttctaatca aggcagtggt 240 gtgcccagcc ggttctccgg gtctggctca ggaaccgaat ttactctgac cattagctcc 300 ttgcagcctg atgacttcgc aacatactat tgtcagcaga ccaaggaggt cccatggtct 360 tttggtcaag gcacaaaagt ggaggttaag cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420 ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600 accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttag 714 <210> 155 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain V9 (VL-CH1) DNA <400> 155 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgat 60 attcagatga cccagagccc cagctctctg agcgccagcg tgggcgacag agtgaccatc 120 acctgtcggg ccagccagga catcagaaac tacctgaact ggtatcagca gaagcccggc 180 aaggccccca agctgctgat ctactacacc agcagactgg aaagcggcgt gccctccaga 240 ttttccggca gcggctccgg caccgactac accctgacca tcagcagcct gcagcccgag 300 gatttcgcca catattactg ccagcagggc aataccctgc cctggacctt cggacagggc 360 acaaaagtgg aaatcaagag cagcgcttcc accaaaggcc cttccgtgtt tcctctggct 420 cctagctcca agtccacctc tggaggcacc gctgctctcg gatgcctcgt gaaggattat 480 tttcctgagc ctgtgacagt gtcctggaat agcggagcac tgacctctgg agtgcatact 540 ttccccgctg tgctgcagtc ctctggactg tacagcctga gcagcgtggt gacagtgccc 600 agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc 660 aaggtggaca agaaggtgga acccaagtct tgttga 696 <210> 156 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab-Crossfab (VH-CH1(CD33 Myelotarg)-VH-CL [V9]) <400> 156 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacccg gcagcagcgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcca gcggctacac catcaccgac agcaacatcc actgggtgcg ccaggcccct 180 ggccagtctc tggaatggat cggctacatc tacccctaca acggcggcac cgactacaac 240 cagaagttca agaaccgggc caccctgacc gtggacaacc ccaccaatac cgcctacatg 300 gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccttctact actgcgtgaa cggcaacccc 360 tggctggcct attggggcca gggaacactc gtgaccgtgt ccagcgctag caccaagggc 420 cctagcgtgt tccctctggc ccctagcagc aagagcacct ctggcggaac agccgccctg 480 ggctgcctcg tgaaggacta ctttcccgag cccgtgacag tgtcctggaa ctctggcgcc 540 ctgacaagcg gcgtgcacac ctttccagcc gtgctgcagt ctagcggcct gtacagcctg 600 agcagcgtcg tgactgtgcc cagcagcagc ctgggaaccc agacctacat ctgcaacgtg 660 aaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaggtgg aacccaagag ctgcgacggc 720 ggaggcggat ccgggggagg gggatctgaa gtgcagctgg tggaaagcgg cggaggcctg 780 gtgcagcctg ggggatctct gagactgagc tgtgccgcct ccggctacag cttcaccggc 840 tacacaatga attgggtgcg gcaggctccc ggcaagggcc tggaatgggt ggccctgatc 900 aacccttaca agggcgtgtc cacctataat cagaagttta aggaccgctt caccatcagc 960 gtggacaagt ccaagaacac cgcctacctg cagatgaact ccctgcgggc cgaggataca 1020 gccgtgtact actgtgccag aagcggctac tacggcgaca gcgactggta cttcgacgtg 1080 tggggacagg gcaccctggt gaccgtgtct agtgcctctg tggccgctcc cagcgtgttc 1140 atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcaccg cttctgtcgt gtgcctgctg 1200 aacaacttct acccccgcga ggccaaggtg cagtggaaag tggacaatgc cctgcagagc 1260 ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgtcc 1320 agcaccctga cactgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 1380 acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgctga 1437 <210> 157 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 VL <400> 157 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 158 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 VH <400> 158 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 125 <210> 159 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CEA VH <400> 159 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 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Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (14)

  1. 2 개 이상의 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항체로서,
    제 1 의 Fab 단편은 제 1 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고; 제 2 의 Fab 단편은 제 2 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 이때 제 2 의 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 제 2 의 Fab 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역과 서로 교환되며; 상기 이중특이적 항체는 Fc 도메인이 결여되어 불변 중쇄가 하나 이상의 CH1 도메인 단독으로 이루어지고, Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 연결되는, 이중특이적 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 3 의 Fab 단편을 추가적으로 포함하는 이중특이적 항체.
  3. 제 2 항에 있어서, 제 3 의 Fab 단편은 제 1 또는 제 2 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체.
  4. 제 2 항에 있어서, 제 3 의 Fab 단편은 제 1 의 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 의 Fab 단편은 제 1 의 Fab 단편에 연결되는 이중특이적 항체.
  6. 제 5 항에 있어서, 제 3 의 Fab 단편의 C-말단은 제 1 의 Fab 단편의 N-말단에 연결되는 이중특이적 항체.
  7. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 의 Fab 단편은 제 2 의 Fab 단편에 연결되는 이중특이적 항체.
  8. 제 7 항에 있어서, 제 3 의 Fab 단편의 N-말단은 제 2 의 Fab 단편의 C-말단에 연결되는 이중특이적 항체.
  9. 삭제
  10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  11. 항체가 제조되도록 제 10 항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
  13. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 핵산.
  14. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 이중특이적 항체.
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