KR101709255B1

KR101709255B1 - 사이코스를 함유하는 미생물 생육 저해제

Info

Publication number: KR101709255B1
Application number: KR1020150070992A
Authority: KR
Inventors: 서일; 김봉찬; 백경환; 임혜진; 전세희; 정일헌; 천희순; 한태철
Original assignee: 주식회사 삼양사
Priority date: 2015-05-21
Filing date: 2015-05-21
Publication date: 2017-03-08
Also published as: KR20160136861A

Abstract

본 발명은 사이코스를 함유하는 미생물 생육 저해제 및 이를 이용한 천연 보존제, 더욱 바람직하게는 수분활성도가 0.85이하인 조건에서 증식 가능한 미생물의 생육 저해제 및 이를 이용한 천연 보존제에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 미생물 생육 저해제는 천연 당류로서 수요자들의 건강에 무해하며 흡수가 되지 않아 칼로리이며, 적용 미생물의 범위가 넓고 수분활성도가 낮은 환경에서도 증식하는 미생물에도 적용할 수 있다.

Description

사이코스를 함유하는 미생물 생육 저해제{microbial growth inhibitor comprising psicose}

미생물을 이용한 발효 공업에 있어서, 세균 또는 곰팡이의 포자가 넓게 확산되어 발효공정에 여러 가지 악영향이 미치는 일이 있다. 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염에 의해 발효공정에서 목적 물질을 생성할 수 없거나, 환경을 오염시켜 종업원의 건강 피해가 발생하는 등의 문제가 있다. 예를 들면, 발효에 의해 식품류의 제조, 예를 들면, 된장, 간장, 주류를 제조하는 공정, 발효에 의해 의약품류, 예를 들면, 항생 물질의 제조 공정 등에서의 원하지 않는 미생물의 증식은 매우 중요한 문제이다.

식품을 장기간 보관하거나, 여름철과 같이 고온 다습한 환경에서는 각종 세균과 곰팡이가 쉽게 침투하여 번식하면서 식품의 변질과 영양소의 파괴 등의 심각한 문제를 일으킨다.

식품에서 미생물의 생육을 저해하여 장기간 안전하게 보존하기 위해, 다양한 합성 보존제 또는 방부제를 사용하고 있다. 합성 보존제는 가격이 저렴하고 물품의 보존기간을 연장시키는 등의 효과가 있으나, 이는 수요자들의 건강을 해칠 수 있다는 인식에 의하여 식품종류에는 사용이 극히 제한되었으며, 따라서 천연 보존제에 대한 사용이 증가하고 있는 추세이다.

그러나, 천연 보존제도 합성 보존제에 비해 항균성이 현저히 낮고 작용 미생물의 범위가 좁아 그 사용량이 많아지기 때문에 사용자의 원가부담과 다량 첨가에 따른 제품의 고유 물성을 변화시키는 등의 단점이 있어 실제 사용에 있어 많은 제한을 받아왔다.

본 발명은 미생물, 특히 수분활성도가 낮은 환경에서도 증식하는 미생물의 생육을 효과적으로 제어하거나, 생육을 방지하는 미생물의 생육 저해제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은, 미생물, 특히 수분활성도가 낮은 환경에서도 증식 가능한 미생물의 생육을 효과적으로 제어하거나 생육을 방지하여 식품의 보존성을 증가시킬 수 있는 천연 보존제를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은, 식품에서 미생물이 증식하지 않으며 상온에서 장시간 보관 시에도 부패되지 않도록 하여 식품의 품질저하속도를 제어하고, 장기간 보관할 수 있는 천연 식품 보존제를 제공하는 것이다.

본 발명은 사이코스를 함유하는 미생물 생육 저해제 및 이를 이용한 천연 보존제, 더욱 바람직하게는 낮은 수분활성도에서 증식 가능한 미생물의 생육 저해제 및 이를 이용한 천연 보존제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 미생물 생육 저해제는 천연 당류로서 수요자들의 건강에 무해하며, 흡수가 되지 않아 칼로리가 없고, 적용 미생물의 범위가 넓어 수분활성도가 낮은 환경에서 증식하는 미생물에도 적용할 수 있다. 본 발명에 따른 미생물 생육 저해제는 미생물의 생육을 저해 및 방지하며, 구체적으로 미생물의 콜로니 형성을 저해하고, 미생물의 포자 형성을 억제하고, 미생물의 생장 및 증식을 억제하는 기능을 수행할 수 있다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 사이코스를 함유하는 미생물 생육 저해제 및 이를 이용한 천연 보존제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 미생물은 세균, 곰팡이, 효모 등을 포함하며, 바람직하게는 낮은 수분활성도에서 증식 가능한 미생물이다.

수분은 음식물에 포함된 함수량을 의미하며, 식품 중의 수분은 주위의 환경조건에 따라 항상 변동하고 있어, 대기중의 상대습도까지 고려한 수분 활성도를 표시한다. 수분 활성도는 미생물의 생장과 식품의 풍미, 색, 향을 변화시키는 식품 내 화학적, 생물학적 및 물리적 반응들과 관계되어 있으므로 식품에 있어서 매우 중요한 특성이다. 따라서 수분 활성도는 전체 수분함량보다 식품안정성에 있어서 더 중요한 의미를 가진다. 식품이 나타내는 수중기압에 대한 순수한 수증기압이 수분활성도의 정의이다.

수분활성도와 식품의 저장성은 미생물 성장과 화학 반응 속도와 관련이 깊다. 미생물은 최소 수분활성도(minimum water activity)에서는 더 이상 성장할 수 없고, 균의 수가 증가할지라도 그 균수가 매우 미미하므로 수분활성도는 가장 쉽게 미생물을 제어할 수 있는 변수이다. 미생물의 종류에 따라서도 수분활성도에 대한 민감성에 상당한 차이가 있으며 곰팡이나 효모는 낮은 수분활성도에서도 주의를 기울여야 하는 미생물들이다.

본 발명의 생육 저해제는 최소 수분활성도 0.85 이하의 조건, 예를 들면 0.85~0.69인 조건에서 증식 가능한 미생물에 관한 것으로서, 구체적으로 수분활성도 0.85 이하의 환경조건은 염농도, 당농도, 및 수분함량이 낮은 조건 등을 포함하며, 이러한 낮은 수분활성도에서 증식 가능한 미생물은, 호염성 미생물, 호건성 또는 내건성 미생물, 내삼투압성 미생물 등을 포함한다.

수분이 미생물 증식에 사용될 수 없는 경우는 당, 당알코올 및 염분과 같은 용질을 포함하고 있는 경우와, 수분이 얼음 등으로 결정화된 경우, 수화된 상태로 존재하는 경우, 표면에 흡수된 채로 존재하는 경우 등을 포함하며, 통상 식품 등은 당이나 염분과 같은 용질을 포함하거나 건조되어 수분 함량이 낮은 경우에 해당된다.

본 발명의 생육 저해제가 적용 가능한 미생물의 예는 곰팡이가 바람직하며, 특히 수분활성도가 0.85~0.69조건에서 증식 가능한 곰팡이 일 수 있다. 예를 들면, 유로티움속 균주(Eurotium sp .), 아스퍼질러스 레스트리투스(Aspergillus restrictus), 크리소스포리움속 균주(Chrysosporium sp .) 및 왈레미아속 균주(Wallemia sp .) 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

유로티움(Eurotium sp)속 곰팡이는 낮은 수분활성도를 갖는 환경에서 생육이 가능하므로, 식품이나 사료 등 고농도의 소금 및 당을 포함하는 식품류에서 생육가능한 곰팡이이다. 유리티움속 균주는 미코톡신(mycotoxin)생산을 위해 사용되는 유용한 균주이기도 하다. 유로티움속 균주에 속하는 종은 E. amstelodami , E.chevalieri, Eurotium cristatum 등이 알려져 있다.

아스퍼질러스 레스트리투스는 대부분의 아스퍼질러스속 균주의 최소 수분활성도가 0.95 정도인 것을 감안하며 매우 낮은 수분활성도에서 증식 가능하다. 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)의 경우 0.90 내지 0.99이다 (Journal of Applied Microbiology, 2004, 97, pp429-438).

본 발명에 따른 미생물의 생육 저해제에 포함되는 사이코스의 함량은 상기 조성물의 전체 고형분 100 중량부 기준으로, 0.5 내지 50 중량부, 예컨대 1 내지 45 중량부, 2 내지 40 중량부, 또는 2 내지 30 중량부일 수 있다. 상기 사이코스를 포함하는 당류는 상기 조성물의 전체 고형분 100 중량부 기준으로, 0.5 내지 50 중량부일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 내지 30 중량부일 수 있다.

상기 사이코스는 단독 당류로 사용될 수 있으나, 다른 당류와 혼합하여 사용될 수도 있다. 상기 당류는 사이코스 이외에, 설탕, 물엿 및 고감미도 감미료로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면 설탕 및 물엿으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 사이코스의 혼합물일 수 있다.

상기 고감미도 감미료는 아스파탐, 아세설팜 K, 사이클라민산 나트륨, 사카린 나트륨, 수크랄로스, 스테비아 감미료(스테비올 배당체, 효소처리 스테비아), 둘신, 타우마틴, 토마틴, 네오탐, 리바우디오사이드 A 및 모넬린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

예를 들면, 당류로서 사이코스, 물엿 및 설탕을 포함하는 경우, 상기 조성물의 전체 고형분 100 중량부 기준으로, 사이코스 0.1 내지 50 중량부를 포함할 수 있으며, 추가로 물엿 0.5 내지 20 중량부, 예컨대 0.5 내지 15 중량부, 및 설탕 0.5 내지 60 중량부, 예를 들면 0.5 내지 40 중량부, 또는 0.5 내지 20 중량부로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 미생물의 생육 저해제에 포함되는 사이코스는 순도 90% 이상의 사이코스를 분말 또는 이를 이용하여 다양한 농도로 제조한 용액일 수 있다. 또한, 상기 사이코스는 사이코스 단독으로 사용하거나, 또는 추가의 다른 당류를 포함하는 혼합당일 수 있으며 혼합당의 예는 전체 혼합당의 고형분 100중량부를 기준으로 1 내지 99.9 중량부의 사이코스를 함유할 수 있으며, 추가적으로 과당, 포도당, 및 올리고당으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 사이코스 함유 혼합당의 구체적인 예는 혼합당의 전체 고형분 함량 100중량부를 기준으로, 사이코스 2 내지 55 중량부, 과당 30 내지 80 중량부 및 포도당 2 내지 60 중량부, 및 올리고당 0 내지 15 중량부를 포함하는 것일 수 있으며, 올리고당은 포함하지 않을 수도 있다. 상기 사이코스, 과당 및 포도당은 바람직하게는 모두 D형-이성질체인 것이다.

상기 사이코스는 혼합당의 총고형분 100 중량부 기준으로 사이코스와 포도당의 합계 고형분 함량이 5 내지 20 중량부, 및 과당의 고형분 함량이 75 내지 95 중량부로 포함하는 혼합당으로 제공되거나, 또는 사이코스와 포도당의 합계 고형분 함량이 70 내지 90 중량부, 과당의 고형분 함량이 2 내지 30 중량부 및 포도당 1내지 25 중량부로 포함하는 혼합당으로 제공될 수 있다

상기 사이코스는 화학적 합성, 또는 사이코스 에피머화 효소를 이용한 생물학적 방법으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 생물학적 방법으로 수행할 수 있다. 이에, 상기 사이코스는 사이코스 에피머화 효소, 상기 효소를 생산하는 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 사이코스 생산용 조성물을, 과당-함유 원료와 반응하여 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 일예에서, 생물학적 방법에 따라 사이코스를 제조하는 방법으로는 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주 또는 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 균주를 배양하고, 이로부터 얻어진 사이코스 에피머화 효소를 과당-함유 원료와 반응하여 생산할 수 있다. 상기 사이코스 에피머화 효소는 액상 반응 또는 고정화 효소를 이용한 고상 반응으로 수행될 수 있다.

또는, 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주 또는 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 균주를 얻고, 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 사이코스 생산용 조성물을, 과당-함유 원료와 반응하여 제조될 수 있다. 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주의 균체를 이용하여 사이코스를 제조하는 경우 액상 반응 또는 고정화 균체를 이용한 고상 반응으로 수행될 수 있다.

본 발명의 구체적 일예에서, 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주로는 높은 안정성을 가지면서도 고수율로 사이코스 에피머화 효소를 생산할 수 있는 균주일 수 있으며. 상기 재조합 균주는 다양한 숙주세포, 예컨대 대장균, 바실러스속 균주, 살모넬라속 균주 및 코리네박테리움속 균주 등을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 GRAS 균주인 코리네박테리움속 균주일 수 있으며, 코리네박테리움 글루타리쿰일 수 있다.

재조합 균주를 이용한 경우 사이코스 에피머화 효소는 다양한 균주에서 유래된 효소의 암호화 유전자를 사용할 수 있으며, 예를 들면 한국특허공개 2014-0021974에 기재된 트리포네마 프리미티아 유래 효소, 한국특허공개 2014-0080282에 기재된 루미노코코스 토르크 유래 효소 및 한국등록특허 10-1318422호에 기재된 클로스티리디움 신댄스 유래 효소일 수 있으며, 또한 엔시퍼 아드해렌스 유래 효소일 수 있다. 구체적인 일예에서, 본 발명에 따른 사이코스 에피머화 효소는 클로스티리디움 신댄스 유래 효소일 수 있으며, 예를 들면 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 8 또는 서열번호 9 핵산서열을 포함한다. 서열번호 8의 핵산서열은 대장균 최적화 핵산서열이고, 서열번호 9은 코리네박테리움에 적합하게 변형된 핵산서열이다.

본 발명의 일예에 따른 재조합 균주의 제조에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 핵산서열의 상부에 위치하는 조절 서열을 사용하여 효소의 발현을 조절할 수 있으며, 조절서열은 전사 프로모터를 필수적으로 포함하며, 추가로 리보솜 결합 영역 및/또는 스페이서 서열 등을 포함할 수 있다. 상기 조절 서열을 구성하는 요소들은 직접 연결되거나 1개 내지 100개의 염기, 예를 들면 5개 내지 80 염기를 가지는 핵산서열의 링커를 하나 이상 포함하여 연결될 수 있다.

일구체예에서, 상기 전사 프로모터는 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 핵산서열을 발현하는 핵산분자일 수 있으나, tac1, tac2, trc, sod 프로모터일 수 있다. sod 프로모터는 코리네박테리움 글루타리쿰에서 유래된 것이며, 바람직하게는 서열번호 1의 핵산서열을 코어영역으로 포함한다. trc 프로모터는 대장균 유래 프로모터로서 trp 프로모터과 lac UV5 프로모터의 조합으로 제조된 것이다. Tac1 프로모터는 대장균 유래 프로모터로서, trp 프로모터과 lac UV5 프로모터의 조합으로 제조된 것이다. Tac2 프로모터는 대장균 유래 프로모터로서, trp 프로모터과 lac UV5 프로모터의 조합으로 제조된 것으로서 상기 Tac1 프로모터의 서열을 변형하여 최적화한 형태이다.

상기 리보좀 결합 영역과 스페이서는 화학적으로 직접 연결되거나 그 중간에 링커 핵산서열을 개재하여 간적접으로 연결될 수 있다. 본 발명의 일예에서 리보좀 결합영역(ribosome binding region) 및 스페이서 서열은 5'부터 3'-말단으로 순차적으로 연결된 하나의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일예에 따른 프로모터 서열, 리보좀 결합 영역(ribosome binding region) 및 스페이서 서열의 핵산서열을 하기 표 1에 나타낸다. 표 1에서 이탤릭체 진하게 밑줄로 표시된 부분은 조절서열중, 리보솜 결합 영역, 스페이서 서열, 링커 서열등을 나타낸다.

서열 번호	서열(5'--> 3')	명명
1	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac *gaaagga* *ttttttaccc* *atggctg* *tatacgaact* *cccagaactc* *gactacgcat* *acgac* *gaaagga* *ttacaaa*	Sod promoter
2	tgacaattaatcatcggctcgtatattgt *gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaattcccggg* *gaaagga* *ttacaaa*	tac1 promoter
3	tgacaattaatcatccggctcgtataatgt *taacaatttgtggaattgtgagcggacacacaggaaacagaccatggaattcgagctcggtacccggg gaaagga* *ttacaaa*	Tac2 promoter
4	tgacaattaatcatcggcctcgtataatgt	trc promoter
5	gaaagga	Ribosome binding region
6	ttacaaa	Spacer sequence

본 발명에 따른 사이코스 에피머화 효소는 효소활성 및 열안정성이 우수한 것이 바람직하고, 이에 본 발명의 구체예에서, 전사 프로모터 또는 조절서열은 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자와의 조합이 중요하며, 본 발명에 사용된 사이코스 에피머화 효소와는 tac1, tac2, trc, sod 프로모터 모두 적정 이상의 단백질 발현을 제공할 수 있으며, sod 프로모터를 사용한 경우에는 단백질의 폴딩(folding)이 견고하여 열안정성이 높게 나타나는 결과를 얻을 수 있어 더욱 바람직하다.

재조합 균주를 이용한 사이코스 생산방법등은 한국특허공개 2014-0021974, 한국특허공개 2014-0080282 및 한국등록특허 10-1318422호에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있으나 특별히 한정되지 않는다. 상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 예컨대, 50 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 미생물 생육 저해제를 포함하는 천연 보존제, 예를 들면 천연 식품 보존제일 수 있다.

본 발명에 따른 미생물 생육 저해제는 수분활성도 0.85 이하의 환경조건에서 증식 가능한 미생물의 생육 저해에 특히 바람직하며, 이에 염장 식품, 당장 식품 또는 건조 식품일 수 있다.

상기 염장식품의 예로는,육류, 어패류, 채소류 등을 염장한 굴비, 자반, 젓갈류, 햄, 베이컨, 김치, 단무지, 짠지, 오이지, 김치류, 젓갈류, 치즈류 등이 있다.

상기 당장 식품의 예로는 당분이 많이 들어 있어 오래 저장할 수 있는 가공식품으로 식품에 설탕이나 전화당을 넣어 제조한 저장식품으로 양갱, 팥소제품, 잼, 젤리, 마멀레이드, 과일청류 또는 야채청류(유자, 생강, 귤, 사과, 오미자, 대추, 인삼 등의 과실류 또는 야채류에 당류를 첨가하여 저장식품 형태로 제조한 차 또는 요리에 활용 가능한 식품) 등이 있다. 상기 양갱은, 연양갱, 수양갱, 증양갱 등이 있으며 원료에 따라 팥양갱, 밤양갱, 녹두양갱, 완두양갱, 고구마양갱 등을 포함한다. 상기 팥소제품은 떡이나 빵 등의 속으로 사용되며 팥을 삶아서 으깨거나 갈은 후에 사이코스, 설탕 또는 시럽 등의 당류를 추가하여 제조할 수 있다.

상기 건조 식품의 예로는 곡류, 채소류, 과일류, 육류, 생선류, 해조류, 우유, 달걀, 인삼, 대추 등을 자연 건조 또는 인공 건조한 식품이 있다.

본 발명에 따른 천연 식품보존제로 사용하는 경우, 사이코스의 함량은 전체 고형분 100을 기준으로 0.5 내지 50 중량부, 바람직하게는 1 내지 30 중량부, 더욱 바람직하게는 2 내지 20 중량부, 예를 들면 3 내지 18 중량부, 또는 3 내지 17중량부이다.

본 발명의 일예에 따라, 사이코스를 식품보존제로 사용하는 경우, 해당 식품의 전체 고형분 함량 100 중량부를 기준으로, 사이코스를 0.5 내지 50, 바람직하게는 1 내지 30 중량부, 더욱 바람직하게는 2 내지 20 중량부, 예를 들면 3 내지 18 중량부, 또는 3 내지 17 중량부를 가하여 사용할 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 얻은 검체의 실체현미경으로 관찰한 사진을 나타낸다.
도 2a는 실시예 1에서 얻은 M40Y 배지에서 배양한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2b는 실시예 1에서 M40Y 배지에서 배양한 결과를 실체현미경을 이용하여 관찰한 자낭과를 보여주는 사진이다.
도 3a는 실시예 1에서 M40Y 배지에서 배양한 결과를 실체현미경으로 관찰한 자낭과의 사진이다.
도 3b는 실시예 1에서 M40Y 배지에서 배양한 결과를 실체현미경으로 관찰한 자낭포자의 사진이다.
도 4는 본 발명에 따른 미생물 생육저해제를 적용한 식품과 미적용 식품의 제조당시 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 미생물 생육저해제를 적용한 식품과 미적용 식품을 14일간 상온 보관한 후에 곰팡이 증식을 보여주는 사진이다.

본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

제조예 1: 사이코스의 제조

1-1: 사이코스 생산 균주의 제조

크로스트리디움 신댄스(Clostridiuim scindens ATCC 35704)로부터 유래된 사이코스 에피머화 효소의 암호화 유전자(DPE gene; Gene bank: EDS06411.1)를, 대장균에 최적화하여 변형한 형태의 폴리뉴클리오티드로 합성하고 CDPE라 명명하다. 대장균에 최적화된 폴리뉴클리오티드(서열번호 2)와 pET21a 벡터로부터 확보한 sod 프로모터와 T7 터미네이터를 PCR을 통해 각각의 주형으로 확보하였고, 이를 오버랩 피씨알(PCR) 법으로 하나의 주형으로 연결하여 T-vector cloning을 통해 pGEM T-easy vector에 클로닝하여, sod 프로모터(서열번호 1), 서열번호 8의 최적화 CDPE 서열 및 T7-터미네이터를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인하였다.

상기 확인된 전체 폴리뉴클레오티드를 제한효소 NotI과 XbaI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pCES208(J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pCES208/사이코스 에피머화 효소(pCES_sodCDPE)를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터(pCES_sodCDPE)의 개열지도를 도 1에 개시하였다.

상기 제조된 재조합 벡터(pCES_sodCDPE) 플라스미드를 전기천공법(electroporation)을 사용하여 코리네박테리움 글루타리쿰을 형질전환시켰다. 콜로니를 선택하여 카나마이신(Kanamycin)을 최종농도 15ug/ml로 첨가한 LB 배지(트립톤 10g/L, NaCl 10g/L, 효모 추출물 5g/L) 4ml에 접종한 후, 배양조건 30? 및 250rpm에서 약 16시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 상기 배양액 중 1ml을 수득하여 15ug/ml의 카나마이신을 포함하고 있는 100ml LB 배지에 접종하여 본 배양을 16시간 이상 진행하였다. Beadbeater를 이용하여 배양한 세포를 용해(lysis)시킨 후 상등액만 취득하여 샘플버퍼와 1 : 1로 혼합 후 100 ℃에서 5분간 가열한다. 준비한 샘플은 12% SDS-PAGE gel (조성: running gel - 3.3 ml H2O, 4.0 ml 30% acrylamide, 2.5 ml 1.5M Tris buffer(pH 8.8), 100 ㎕ 10% SDS, 100 ㎕, 10% APS, 4 ㎕ TEMED / stacking gel - 1.4 ml H2O, 0.33 ml 30% acrylamide, 0.25 ml 1.0M Tris buffer(pH 6.8), 20 ㎕ 10% SDS, 20 ㎕ 10% APS, 2 ㎕ TEMED)에 180V로 약 50 분 동안 전기영동하여 단백질 발현을 확인하였다. CDPE의 발현을 SDS-PAGE gel상에서 확인 후 정확한 발현량의 측정을 위해 Ni-NTA resin을 이용한 His-tag정제 진행하여, 계산식(발현율(%) = (Purified protein(mg) / Total soluble protein(mg)) * 100)을 이용하여 발현율 계산하였다. 상기 제조된 형질전환 코리네박테리움 글루타리쿰은 전체 수용성 단백질을 16.62 mg 및 정제된 효소 단백질 1.74 mg을 생산하였다.

1-2: 사이코스 시럽의 제조

제조예 1-1에서 얻어진 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 재조합 균주를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 제조하고자, 균주 배양에서 원심분리로 세포를 회수하였다.

그런 후에 상기 세포 현탁액에 최종 부피에 유화제(M-1695)를 0.05% (w/v) 처리하여 35℃(± 5℃)에서 60 분간 처리하였다. 반응이 완료된 균체는 다시 원심분리기를 이용하여 유화제가 포함된 상등액은 제거한 뒤 균체를 회수하였다.

고정화 비드 제조를 위하여, 상기 회수된 균체는 D.W.와 혼합하여 최종 균체 농도 5% (w/v)로 맞추고, 물에 용해된 4% (w/v) 알긴산과 회수된 균체 5%(w/v)를 1:1로 혼합하고, 혼합시 생성된 기포를 제거하기 위해 4℃에서 냉장 보관하였다. 상기 냉장 보관된 혼합액은 Neddle (내경 0.20~0.30mm)을 통해 혼합액이 사출되어 방울 형태로 형성되며 무게에 의해 낙하하게 되며, 낙하 된 혼합액은 미리 제조된 100mM 염화칼슘 (CaCl₂) 용액으로 떨어뜨려 경화시켜 구형 또는 타원형의 비드를(지름 2.0~2.2mm) 형성하였다. 상기 형성된 비드들은 100mM 염화칼슘 용액에 담그어 교반기에 의해 골고루 섞어지면서 더욱 경화되도록 하였다.

상기 혼합액이 모두 사출된 후에, 4~6시간 냉장 보관하면서 비드를 더욱 경화시킨 뒤에 새로운 100mM 염화칼슘 용액과 교체하여 냉장 상태에서 약 6시간 정도 경화를 시켰다. 경화가 완료된 비드는 걷어내 물기를 완전히 제거한 후, 비드 부피 대비 3배 부피의 물을 투입한 후 10분간 교반하고, 이러한 과정을 3회 처리하여 염화칼슘 용액을 제거하였다. 세척된 비드들은 망간 소킹(soaking)을 위하여 물기를 완전 제거한 후, 10mM 망간이 포함된 40 brix (%) 반응 기질을 비드 부피 대비 3 배 부피로 투입한 후 10분간 교반하고, 이러한 처리를 3회 이상 처리하여 10mM 망간이 포함된 반응 기질로 교체하였다. 반응 기질은 pH 6.8~7.2로 3N NaOH에 의해 조절되며, 생산물의 종류에 따라 액상 과당 또는 결정 과당이 반응 기질이 될 수 있다. 10mM 망간이 포함된 반응 기질로 교체된 비드들은 반응조로 옮겨진 뒤, 반응 온도 50?에서 약 30~60분간 반응하여 망간 및 과당으로 비드의 소킹 작업을 완료하였다. 소킹이 완료된 비드는 지름이 약 1.6~1.8mm로 줄어들며 강도 또한 증가하게 된다. 소킹이 완료된 비드들의 기질을 제거 후 고정화 반응 컬럼에 충진한 후에 사이코스 시럽 생산에 이용하였다.

<고정화 컬럼 반응조건>

반응 온도: 컬럼 자켓 내부 온도 50℃

기질 유속: 0.5 SV (space velocity L. h-1)

반응 기질: 결정 과당 40brix, pH 6.8~7.2

비드 제조: 2.5%(w/w) 균체, 2%(w/w) 알긴산 혼합 및 10mM Mn² ⁺ soaking

상기 고정화 반응 컬럼에, 원료 용액이 75 %의 고형분을 포함하고, 전체 고형분 함량이 100 중량부일 때, 과당의 함량이 92 중량부로 포함하는 원료를 제공하여 두 가지 조성의 혼합당인 사이코스 시럽을 제조하였다. 즉, 상기 반응액으로부터 포도당:과당:사이코스:올리고당의 중량비로 포도당:과당:사이코스:올리고당=6 :67 : 25: 2인 25(w/w)% 사이코스 시럽을 수득하였다.

1-3: 사이코스 분말의 제조

제조예 1-2에서 얻어진 사이코스 시럽을 유색 및 이온 성분 등의 불순물을 제거하기 위해 양이온 교환수지, 음이온 교환수지 및 양이온과 음이온교환수지가 6혼합된 수지로 충진된 상온의 컬럼에 시간당 이온교환수지 2배 부피의 속도로 통액 시켜 탈염시킨 후, 칼슘(Ca² ⁺) 타입의 이온교환수지로 충진된 크로마토그래피를 이용하여 고순도의 사이코스 용액으로 분리 수득하였다. 상기 고순도 사이코스 시럽을 82Bx 농도로 농축시키고, 과포화 상태가 되는 온도 35 ℃에서 서서히 온도 10 ℃까지 냉각시켜 결정을 생성시켰다. 상기 결정화 단계에서 수득된 사이코스 결정은 원심 탈수에 의해 모액을 제거하고 결정을 냉각수로 세척한 후, 건조하여 회수하였다.

실시예 1: 곰팡이 수득 및 동정

1-1: 곰팡이 수득

하기 표 2의 비교예 1의 배합조성으로 양갱을 제조하고 상온에서 보관하였다.

구체적으로, 용기에 물과 한천을 넣어 한천을 불린 후에, 설탕을 추가하여 용해하고 1분간 농축을 하였다. 상기 농축용액에 팥앙금을 투입하고 용기 바닥에 눌러 붙지 않도록 저어 주면서 약 3분간 가열하였다. 상기 용액에 물엿(82Bx) 혼합하고 1분간 농축하고, 배합물 성형틀에 부은 후에 3~5도℃ 냉장고에 30분간 냉각 후, 2시간 동안 상온에서 보관하고 나서 성형틀을 제거하고 포장지에 포장하여 상온에서 14일간 보관하였다. 14일 동안 보관 후 얻어진 양갱에는 노란색 곰팡이가 다수 뒤덮여 있었으며, 상기 노란색 곰팡이를 채취하여 동정을 의뢰하였다.

1-2: 곰팡이 동정

상기 1-2에서 수득한 곰팡이를 주식회사 한국식품정보원 식품안전연구소 곰팡이 연구센터에 의뢰하여 동정하였으며, 그 결과 상기 곰팡이는 Eurotium chevalieri로 확인하였다.

구체적으로, 시료에서 수득한 곰팡이 증식부위를 실체현미경으로 관찰한 후에 균주 시료를 채취하여, 각각 PDA, CYA, MEA, M40Y 배지에서 25℃에서 7-14일간 배양한 후에, 현미경 관찰을 통해 균주의 동정을 실시하였다. 검체를 실체현미경으로 관찰한 사진을 도 1에 나타내었다.

시료 균주의 분포 및 생육특성을 살펴보면, 일반 배지에서 생육이 매우 불량하나 M40Y 비재에서 성장이 양호하다. 육안으로 자낭과가 관찰되며 초기에는 백색이지만 점차 황색으로 변화한다. 확인된 Eurotium chevalieri는 독소를 생성하지 않는다.

현미경적 특징으로는 육안 관찰이 가능할 정도로 자낭이 가득차 자낭과가 대량 생성되며, 자낭내에는 표면이 매끈하여 렌즈형이며, 적도부에 물마루가 있는 특징적인 포자가 관찰되어 Eurotium chevalieri로 동정되었다.

M40Y 배지에서 배양한 결과를 도 2a에 나타냈으며, 실체현미경을 이용하여 관찰한 자낭과를 도 2b에 나타냈다. 더욱 확대하여 실체현미경으로 관찰한 자낭과와 자낭포자를 도 3a, 및 도 3b에 각각 나타냈다.

실시예 2: 사이코스 농도별 생육저해 활성 평가

하기 표 2의 비교예 1 및 실시예 1-3의 배합조성으로 양갱을 제조하고 상온에서 보관후 곰팡이의 생성 여부를 육안으로 관찰하였다.

구체적으로, 용기에 물과 한천을 넣어 한천을 불린 후에, 설탕을 추가하여 용해하고 1분간 농축을 하였다. 상기 농축용액에 팥앙금을 투입하고 용기 바닥에 눌러 붙지 않도록 저어 주면서 약 3분간 가열하였다. 상기 용액에 물엿(82Bx) 혼합하고 1분간 농축하고, 배합물 성형틀에 부은 후에 3~5도℃ 냉장고에 30분간 냉각 후, 2시간 동안 상온에서 보관하고 나서 성형틀을 제거하고 포장지에 포장하여 상온에서 14일간 보관하였다.

구분	비교예 1	실시예1	실시예2	실시예3
한천	1%	1%	1%	1%
설탕	5%	2%	0%	0%
사이코스(분말)	0%	2%	5%	10%
앙금(대두식품)	48%	48%	48%	49%
물엿(82Bx)	6%	6%	6%	0%
물	40%	40%	40%	40%
합계	100%	100%	100%	100%

성형틀을 제거한 후에 얻어진 양갱의 사진을 도 4에 나타냈으며, 14일간 보관후 양갱의 사진을 도 5에 나타냈다. 도 4에서 나타낸 바와 같이, 사이코스를 포함하지 않고 설탕만을 적용한 비교예 1의 경우 노란색 곰팡이로 뒤덮힌 것을 확인 할 수 있었다. 그러나, 사이코스를 포함하는 실시예 1 내지 3의 경우, 곰팡이의 생육이 억제된 것을 확인할 수 있었으며, 특히 실시예 1 내지 3의 방향으로 사이코스의 함유량이 증가할수록 곰팡이의 생육 억제가 더욱 우수한 것을 확인할 수 있다.

<110> SAMYANG GENEX CORPORATION <120> Microbial growth inhibitor comprising psicose <130> DPP20150659KR <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sod promoter (6) <400> 1 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggat tacaaa 356 <210> 2 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tac1 promoter (4) <400> 2 tgacaattaa tcatcggctc gtatattgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac 60 aggaaacaga attcccgggg aaaggattac aaa 93 <210> 3 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tac2 promoter (4) <400> 3 tgacaattaa tcatccggct cgtataatgt taacaatttg tggaattgtg agcggacaca 60 caggaaacag accatggaat tcgagctcgg tacccgggga aaggattaca aa 112 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trc promoter (1) <400> 4 tgacaattaa tcatcggcct cgtataatgt 30 <210> 5 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ribosome binding region <400> 5 gaaagga 7 <210> 6 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer sequence <400> 6 ttacaaa 7 <210> 7 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of an enzyme protein originated from Clostridium scindens <400> 7 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Ala Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Arg Tyr Val Glu Lys Ala Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Val Gly Ala Ala Pro Leu Pro Asp Tyr Ser Ala Gln Glu Val 35 40 45 Lys Glu Leu Lys Lys Cys Ala Asp Asp Asn Gly Ile Gln Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Tyr Gly Pro Ala Phe Asn His Asn Met Gly Ser Ser Asp Pro Lys 65 70 75 80 Ile Arg Glu Glu Ala Leu Gln Trp Tyr Lys Arg Leu Phe Glu Val Met 85 90 95 Ala Gly Leu Asp Ile His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Val Asp Phe Ala Thr Ala Asn Lys Glu Glu Asp Trp Lys His Ser 115 120 125 Val Glu Gly Met Gln Ile Leu Ala Pro Ile Ala Ser Gln Tyr Gly Ile 130 135 140 Asn Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Ser His Ile Leu Asn 145 150 155 160 Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Phe Val Thr Glu Val Gly Met Asp Asn 165 170 175 Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Ser Ser 180 185 190 Ile Gly Asp Ala Ile Arg His Ala Gly Lys Leu Leu Gly His Phe His 195 200 205 Thr Gly Glu Cys Asn Arg Met Val Pro Gly Lys Gly Arg Thr Pro Trp 210 215 220 Arg Glu Ile Gly Asp Ala Leu Arg Glu Ile Glu Tyr Asp Gly Thr Val 225 230 235 240 Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Gln Val Gly Ser Asp Ile 245 250 255 Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Lys Gly Ala Gly Glu Asp Arg Leu Asp 260 265 270 Glu Asp Ala Arg Arg Ala Val Glu Phe Gln Arg Tyr Met Leu Glu Trp 275 280 285 Lys <210> 8 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified nucleic acid sequence (1) of the enzyme protein of SEQ ID NO: 7 <400> 8 atgaaacacg gtatctacta cgcgtactgg gaacaggaat gggcggcgga ctacaaacgt 60 tacgttgaaa aagcggcgaa actgggtttc gacatcctgg aagttggtgc ggcgccgctg 120 ccggactact ctgcgcagga agttaaagaa ctgaaaaaat gcgcggacga caacggtatc 180 cagctgaccg cgggttacgg tccggcgttc aaccacaaca tgggttcttc tgacccgaaa 240 atccgtgaag aagcgctgca gtggtacaaa cgtctgttcg aagttatggc gggtctggac 300 atccacctga tcggtggtgc gctgtactct tactggccgg ttgacttcgc gaccgcgaac 360 aaagaagaag actggaaaca ctctgttgaa ggtatgcaga tcctggcgcc gatcgcgtct 420 cagtacggta tcaacctggg tatggaagtt ctgaaccgtt tcgaatctca catcctgaac 480 acctctgaag aaggtgttaa attcgttacc gaagttggta tggacaacgt taaagttatg 540 ctggacacct tccacatgaa catcgaagaa tcttctatcg gtgacgcgat ccgtcacgcg 600 ggtaaactgc tgggtcactt ccacaccggt gaatgcaacc gtatggttcc gggtaaaggt 660 cgtaccccgt ggcgtgaaat cggtgacgcg ctgcgtgaaa tcgaatacga cggtaccgtt 720 gttatggaac cgttcgttcg tatgggtggt caggttggtt ctgacatcaa agtttggcgt 780 gacatctcta aaggtgcggg tgaagaccgt ctggacgaag acgcgcgtcg tgcggttgaa 840 ttccagcgtt acatgctgga atggaaataa 870 <210> 9 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified nucleic acid sequence(2) of the enzyme protein of SEQ ID NO:7 <400> 9 atgaagcacg gcatctacta cgcatactgg gagcaggagt gggcagcaga ctacaagcgc 60 tacgttgaga aggcagcaaa gctgggcttc gacatcctgg aggttggcgc agcaccactg 120 ccagactact ccgcacagga ggttaaggag ctgaagaagt gcgcagacga caacggcatc 180 cagctgaccg caggctacgg cccagcattc aaccacaaca tgggctcctc cgacccaaag 240 atccgcgagg aggcactgca gtggtacaag cgcctgttcg aggttatggc aggcctggac 300 atccacctga tcggcggcgc actgtactcc tactggccag ttgacttcgc aaccgcaaac 360 aaggaggagg actggaagca ctccgttgag ggcatgcaga tcctggcacc aatcgcatcc 420 cagtacggca tcaacctggg catggaggtt ctgaaccgct tcgagtccca catcctgaac 480 acctccgagg agggcgttaa gttcgttacc gaggttggca tggacaacgt taaggttatg 540 ctggacacct tccacatgaa catcgaggag tcctccatcg gcgacgcaat ccgccacgca 600 ggcaagctgc tgggccactt ccacaccggc gagtgcaacc gcatggttcc aggcaagggc 660 cgcaccccat ggcgcgagat cggcgacgca ctgcgcgaga tcgagtacga cggcaccgtt 720 gttatggagc cattcgttcg catgggcggc caggttggct ccgacatcaa ggtttggcgc 780 gacatctcca agggcgcagg cgaggaccgc ctggacgagg acgcacgccg cgcagttgag 840 ttccagcgct acatgctgga gtggaagtaa 870

Claims

사이코스를 포함하며, 최소 수분활성도 0.85 이하의 환경조건에서 증식 가능한 곰팡이로서, 상기 곰팡이는 유로티움속 균주(Eurotium sp.) 및 크리소스포리움속 균주(Chrysosporium sp. )로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 곰팡이의 생육 저해제.
제1항에 있어서, 상기 곰팡이는 최소 수분활성도 0.85 내지 0.69의 환경조건에서 증식 가능한 것인 곰팡이의 생육 저해제.
제 1 항에 있어서, 상기 생육 저해제는 곰팡이의 포자형성 저해 및 증식 저해로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 저해활성을 갖는 것인 곰팡이의 생육 저해제.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 유로티움속 균주는 Eurotium.amstelodami, Eurotium.chevalieri, 또는 Eurotium cristatum인 곰팡이의 생육 저해제.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 사이코스는 곰팡이의 생육 저해제의 총중량 100 중량부 기준으로 0.5 내지 50 중량부로 포함되는 것인 곰팡이의 생육 저해제.
제 1 항에 있어서, 상기 사이코스는 시럽 또는 분말인 곰팡이의 생육저해제.
제 1 항에 있어서, 상기 사이코스는 혼합당의 총고형분 100 중량부 기준으로 사이코스 1 내지 99.9 중량부로 포함하고, 과당, 포도당 및 올리고당으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 당류를 추가로 포함하는 혼합당인 곰팡이의 생육 저해제.
제 10 항에 있어서, 상기 사이코스는 혼합당의 총고형분 100 중량부 기준으로 사이코스 2 내지 55 중량부, 과당 30 내지 80 중량부 및 포도당 2 내지 60 중량부로 포함하는 혼합당인 곰팡이의 생육 저해제.
제 10 항에 있어서, 상기 사이코스는 혼합당의 총고형분 100 중량부 기준으로 사이코스와 포도당의 합계 고형분 함량이 5 내지 20중량부, 및 과당의 고형분 함량이 75 내지 95 중량부로 포함하는 혼합당으로 제공되는 것인 곰팡이의 생육저해제.
제 10 항에 있어서, 상기 사이코스는 혼합당의 총고형분 100 중량부 기준으로 사이코스와 포도당의 합계 고형분 함량이 70 내지 90 중량부, 과당의 고형분 함량이 2 내지 30 중량부 및 포도당 1 내지 25 중량부로 포함하는 혼합당으로 제공되는 것인 곰팡이의 생육 저해제.
제 1 항에 있어서, 상기 생육 저해제는 설탕, 물엿 및 고감미도 감미료로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 곰팡이의 생육 저해제.
제1항 내지 제3항, 제6항 및 제8항 내지 제14항중 어느 한 항에 따른 곰팡이의 생육 저해제를 포함하는 식품 조성물.
제 15 항에 있어서, 상기 식품은 수분활성도가 0.85 이하인 식품인 식품 조성물.
제 15 항에 있어서, 염장 식품, 당장 식품 또는 건조 식품인 식품 조성물.
제 15 항에 있어서, 상기 식품은 팥소제품, 또는 양갱인 식품 조성물.
제 15 항에 있어서, 상기 식품 조성물은 사이코스를 포함하고,
추가로 설탕, 물엿 및 고감미도 감미료로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 식품 조성물.
제 19 항에 있어서, 상기 식품 조성물의 전체 고형분 100 중량부 기준으로, 물엿 0.5 내지 20 중량부, 및 설탕 0.5 내지 60 중량부로 포함하는 것인 식품 조성물.