CN110628778B - 一种加快水果成熟的基因、蛋白质、载体、重组基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种加快水果成熟的基因，所述基因为：编码区为SEQ ID NO.1所示的DNA分子；或者为：编码区为与SEQ ID NO.1所示的DNA分子具有90％及以上同源性的DNA分子。本发明首次在乙烯生物合成途径之外，挖掘出一种促进水果提早成熟的基因(FRA基因)，并构建了载体，实现了利用转基因方法将该基因应用于早熟水果新种质创新研发，过表达FRA基因能加快果实成熟。

Description

一种加快水果成熟的基因、蛋白质、载体、重组基因工程菌及 其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，尤其是一种加快水果成熟的基因(FRA基因)、蛋白质、载体、重组基因工程菌及其应用。

背景技术

水果成熟的现象主要由乙烯引发的一系列生理生化反应所控制。在水果果实成熟过程中，呼吸作用加强，淀粉水解为可溶性糖类，有机酸分解，使果实甜味增加、酸涩味减少；果胶水解使细胞壁变薄，果实硬度下降***，叶绿素类色素降解，花青苷和类胡萝卜素类色素大量合成，从而使果皮颜色由绿变红或黄色。EFE(乙烯形成酶)是乙烯生物合成中的关键酶。研究人员通过对乙烯形成酶活性的控制达到抑制果实***的目的。这方面典型的例子是转基因耐贮番茄。从1990年开始，华中农业大学的叶志彪教授开始研发转基因耐贮番茄，并成功研制了“华番一号”，该转基因番茄的特点是果实硬度大，不容易***、不容易腐烂，这就满足了番茄长时间存储和长距离运输的市场需求。1997年“华番一号”获得我国首例农业生物转基因安全评价“可商品化生产”审批书，商品名为“百日鲜”。“华番一号”是转反义 EFE基因的转基因番茄，它抑制果实***的原理是反义EFE基因转录后，与EFE基因的mRNA 通过碱基配对结合，使EFE基因表达量降低，从而使EFE蛋白减少。

水果的成熟期对于经济效益影响很大，早熟早上市的品种通常会有较高的市场售价，由此引发设施促成栽培方式被广泛应用。利用人工操纵基因来调控果实成熟，促进果实提早成熟，是一种颇具应用潜力和前景美好的研发途径。而挖掘和开发具有加快水果成熟作用的基因是实现这个途径的核心工作。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种加快水果成熟的基因(FRA基因)、蛋白质、载体、重组基因工程菌及其应用，本发明首次在乙烯生物合成途径之外，挖掘出一种促进水果提早成熟的基因(FRA基因)，并构建了载体，实现了利用转基因方法将该基因应用于早熟水果新种质创新研发，过表达FRA基因能加快果实成熟。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种加快水果成熟的基因，所述基因为：编码区为SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

或者为：编码区为与SEQ ID NO.1所示的DNA分子具有90％及以上同源性的DNA分子。

一种加快水果成熟的蛋白质，所述蛋白质为：SEQ ID NO.2所示氨基酸残基序列组成的蛋白质；

或者，为：具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的同源性90％及以上的氨基酸残基序列组成的蛋白质。

含有如上所述的加快水果成熟的基因的载体。

含有如上所述载体的重组基因工程菌。

而且，步骤如下：

构建含有加快水果成熟的基因的重组载体，将所述重组载体转化至农杆菌菌株EHA105 中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有加快水果成熟的基因的重组基因工程菌的菌体细胞。

而且，具体步骤如下：

⑴将加快水果成熟的基因转入大肠杆菌感受态细胞，将转化后的感受态细胞涂布在含有 500mM IPTG 8μL和20mg/ml X-gal 40μL的LB固体培养基上过夜培养；次日挑取白色菌落，接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养；次日取2-4ml 过夜培养菌液，提取质粒，将质粒进行PCR鉴定，用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，合格后即得重组质粒；

⑵将步骤⑴中获得的重组质粒和pRI 101-AN载体分别用NdeⅠ和SmaⅠ进行双酶切；酶切体系为：每25.0μL包含：质粒5.0μL，10×QuickCut Buffer 2.5μL，NdeⅠ和SmaⅠ各 1μL，灭菌水15.5μL，加SmaⅠ后先于30℃反应1h，再加NdeⅠ于37℃反应1h；酶切产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，回收目的条带，将其与pRI 101-AN载体的酶切产物用T4连接酶于16℃过夜连接，构建植物表达载体，将连接产物转化至大肠杆菌细胞中，通过蓝白斑筛选阳性克隆并进行PCR扩增、双酶切验证，并测序，合格即得表达载体质粒；

提取表达载体质粒后，使用电击法将连接产物转化至EHA105感受态农杆菌中，转化后的农杆菌接种到含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml链霉素的YEB固体培养基上培养2-3天，挑取单菌落于含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml链霉素YEB液体培养基中于28℃，200rpm 条件下摇菌48h，对菌液进行PCR法验证，验证合格后分离纯化，即得重组基因工程菌。

如上所述的加快水果成熟的基因在植物育种或加快水果成熟中的应用。

如上所述的加快水果成熟的蛋白质在植物育种或加快水果成熟中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明首次在乙烯生物合成途径之外，挖掘出一种促进水果提早成熟的基因(FRA 基因)，并构建了载体，实现了利用转基因方法将该基因应用于早熟水果新种质创新研发，过表达FRA基因能加快果实成熟。将该FRA基因应用在培育早熟水果新品种中，转FRA基因番茄植株果实成熟时间明显早于野生型材料。

2、本发明克服了原有技术造成的转基因新种质(如番茄等)所结果实平均单果重减小，果皮增厚，含糖量降低，种子数量减少，内在品质变劣等导致水果商品性下降的缺陷。本发明基因应用后，获得的转基因种质果实外观和内在品质都未发生变化，水果商品性很好。

3、本发明提供了一种通用的早熟水果种质创新方法和技术体系，可用于各种水果早熟品种的种质创新和新品种研发，在果树生物技术育种领域具有广阔和美好的应用前景。

4、本发明还利用FRA基因构建了植物表达载体，获得了含有该载体的重组基因工程菌。

附图说明

图1为本发明中利用本加快水果成熟的基因的转基因番茄的再生、生根和移栽照片；其中，图a为番茄抗性不定芽再生的状态图，图b为抗性芽生长得到的新梢生根的状态图，图 c为再生的抗性植株移栽到营养钵中的状态图；

图2为本发明中利用本加快水果成熟的基因的转基因番茄与野生型番茄果实对比照片；其中，上部果实为野生型，下部果实为转基因番茄。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种加快水果成熟的基因，所述基因为：编码区为SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

或者为：编码区为与SEQ ID NO.1所示的DNA分子具有90％及以上同源性的DNA分子。

本发明的目的在于提供一种加快水果成熟的基因(FRA基因，Fruit ripeningaccelerator)，由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.1所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％及以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

一种加快水果成熟的蛋白质，所述蛋白质为：SEQ ID NO.2所示氨基酸残基序列组成的蛋白质；

或者，为：具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的同源性90％及以上的氨基酸残基序列组成的蛋白质。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％及以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、***或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

含有如上所述的加快水果成熟的基因的载体。

含有如上所述载体的重组基因工程菌。

较优地，步骤如下：

构建含有加快水果成熟的基因的重组载体，将所述重组载体转化至农杆菌菌株EHA105 中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有加快水果成熟的基因的重组基因工程菌的菌体细胞。

较优地，具体步骤如下：

⑴将加快水果成熟的基因转入大肠杆菌感受态细胞，将转化后的感受态细胞涂布在含有 500mM IPTG 8μL和20mg/ml X-gal 40μL的LB固体培养基上过夜培养；次日挑取白色菌落，接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养；次日取2-4ml 过夜培养菌液，提取质粒，将质粒进行PCR鉴定，用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，合格后即得重组质粒；

⑵将步骤⑴中获得的重组质粒和pRI 101-AN载体分别用NdeⅠ和SmaⅠ进行双酶切；酶切体系为：每25.0μL包含：质粒5.0μL，10×QuickCut Buffer 2.5μL，NdeⅠ和SmaⅠ各 1μL，灭菌水15.5μL，加SmaⅠ后先于30℃反应1h，再加NdeⅠ于37℃反应1h；酶切产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，回收目的条带，将其与pRI 101-AN载体的酶切产物用T4连接酶于16℃过夜连接，构建植物表达载体，将连接产物转化至大肠杆菌细胞中，通过蓝白斑筛选阳性克隆并进行PCR扩增、双酶切验证，并测序，合格即得表达载体质粒；

提取表达载体质粒后，使用电击法将连接产物转化至EHA105感受态农杆菌中，转化后的农杆菌接种到含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml链霉素的YEB固体培养基上培养2-3天，挑取单菌落于含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml链霉素YEB液体培养基中于28℃，200rpm 条件下摇菌48h，对菌液进行PCR法验证，验证合格后分离纯化，即得重组基因工程菌。

如上所述的加快水果成熟的基因能够应用在植物育种或加快水果成熟中。

如上所述的加快水果成熟的蛋白质能够应用在植物育种或加快水果成熟中。

本发明的相关制备及检测如下：

一、一种加快水果成熟基因FRA的获得

使用试剂盒EASYspin Plus从普通桃果实中提取总RNA，使用Revert-Aid FirstStrand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，以此cDNA为模板，使用PCR序列特异性引物对：

F：GGAATTCCATATGGCTCTCTTTCTTTCTCTC，

R：TAACCCGGGACTACTCGATTTCTCCAC，

进行PCR扩增，反应体系(25.0μL)：cDNA模板1.0μL，5×PCRBuffer 2.5μL，2.5mMdNTPs 2.0μL，5U/μL rTaq酶0.2μL，10μmol/L正、反向引物各1.0μL，dd H₂O 17.3μL。扩增程序：94℃预变性3min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，进行30个循环；最后72℃延伸8min，4℃保存，PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测。使用San-Prep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段，取目的片段4μL与pEASY-Blunt Cloning Vector 1.0μL于25℃反应 15分钟进行连接，随后将连接片段转入大肠杆菌感受态细胞，将转化后的感受态细胞涂布在含有500mM IPTG8μL和20mg/ml X-gal 40μL的LB固体培养基上过夜培养。次日挑取白色菌落，接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。次日取2-4ml过夜培养菌液，用Takara Mini BEST PlasmidPurification Kit Ver 4.0提取质粒，将质粒进行PCR鉴定，用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

本发明中，FRA基因也可以通过基因合成途径获得。

二、含有加快水果成熟基因FRA的重组基因工程菌的制备

将步骤一中获得的重组质粒和pRI 101-AN载体分别用NdeⅠ和SmaⅠ进行双酶切。酶切体系(25.0μL)：质粒5.0μL，10×QuickCut Buffer 2.5μL，NdeⅠ和SmaⅠ各1μL，灭菌水15.5μL，加SmaⅠ后先于30℃反应1h，再加NdeⅠ于37℃反应1h。酶切产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，回收目的条带，将其与pRI 101-AN载体的酶切产物用T4连接酶于16℃过夜连接，构建植物表达载体，将连接产物转化至大肠杆菌细胞中，通过蓝白斑筛选阳性克隆并进行PCR扩增、双酶切验证，并将样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

提取表达载体质粒后，使用电击法将连接产物转化至EHA105感受态农杆菌中，转化后的农杆菌接种到含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml链霉素的YEB固体培养基上培养2-3天，挑取单菌落于含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml链霉素YEB液体培养基中于28℃，200rpm 条件下摇菌48h，对菌液进行PCR法验证。

三、加快水果成熟基因FRA在早熟水果新种质创新中的应用

采用农杆菌侵染法对番茄品种‘Micro-Tom’无菌下胚轴进行侵染，两天后用抗生物杀灭农杆菌，在筛选培养基上再生出抗性不定芽，再转移到生根培养基上诱导生根，经过炼苗，移栽到营养钵中栽培。结果见图1，图a展示了番茄抗性不定芽再生的状态，图b展示抗性芽生长得到的新梢生根的状态，图c展示了再生的抗性植株移栽到营养钵中的状态。采用PCR 方法验证外源基因的导入。开花结实后，比较转化体与野生型番茄的果实发育期，发现前者果实发育期缩短2至5天，成熟时间明显提早。结果见图2，图2展示了转基因番茄果实成熟时与相同生长期的野生型果实的状态比较，其中上部果实为野生型番茄，下部的为转基因番茄，可见，转基因番茄成熟度明显高于野生型。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110> 天津农学院

<120> 一种加快水果成熟的基因、蛋白质、载体、重组基因工程菌及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1206

<212> DNA

<213> 加快水果成熟的基因的编码区(Unknown)

<400> 1

ggaattccat atggctctct ttctttctct ctctctgttt catcttctcc tctgaaattt 60

tctgaattca catttcaagc tctgaaattt ttatcagaaa aaatgggtgt gccagaaacc 120

gacccacttt ctcagctaag cttgccaccg gggtttcgat tctatcccac agacgaagag 180

cttctggttc agtatctgtg ccgcaaggtt gctgggtacc aattcagtct gcaaattata 240

gctgaaattg atctctacaa gttcgatcca tgggttttac caagcaaagc aatatttggt 300

gaaaaagaat ggtacttctt tagtccgagg gaccggaaat acccaaatgg gtcacgaccc 360

aacagggtag ccgggtctgg gtactggaaa gccaccggca ctgataagat catcaccact 420

gaaggtcgaa aagttggaat aaaaaaagct ctggttttct atgtcggcaa agcccccaaa 480

ggcaccaaga ccaattggat tatgcatgag tatcgtctaa tcgaaccttc acgcaaaaat 540

ggcagctcca agttggatga atgggttttg tgtcgtattt acaagaagag ctcgagctca 600

gctgcgcaga aacccatgac gacgagcgtt tcgagcaaag agcacagcaa cggctcgtcg 660

tcttcctgct cgtctcagct tgacgacgtg ctcgagtggc tcccggatat tgacgaccgc 720

tgcttcactc tgccgcgcat aaactcgctc aaaacgctgc agcagcagca ggaggacagc 780

aagctcgggt ttcagatggg ttctggaaat ttcgactggg cgagtcttgc cgggctcaac 840

gtggtgcctg aactatgtcc caataaccag ccccaacaaa gccaagggca aatgaatgtg 900

aactatagca acaatgacat gtatgtccct tcgatcccgc cgctctgcca cgtggaatcg 960

ccgccggaga ggctcgcgaa gacggtggac gaggaggtgc agagcgggtt cagaactcag 1020

cgggttgata actcggggtt cttccagaac tcgaacgtta tgactcagaa cttttgcaac 1080

ccgaccgacc cgtacgggta cagtaaccga ctcggccggt cgggtttggg gtttggcggt 1140

gcggaaaagt gaaagtagaa ggggagtgca ttcatttcgg tggagaaatc gagtagtccc 1200

gggtta 1206

<210> 2

<211> 349

<212> PRT

<213> 加快水果成熟的蛋白质(Unknown)

<400> 2

Met Gly Val Pro Gly Thr Ala Pro Leu Ser Gly Leu Ser Leu Pro Pro

1 5 10 15

Gly Pro Ala Pro Thr Pro Thr Ala Gly Gly Leu Leu Val Gly Thr Leu

20 25 30

Cys Ala Leu Val Ala Gly Thr Gly Pro Ser Leu Gly Ile Ile Ala Gly

35 40 45

Ile Ala Leu Thr Leu Pro Ala Pro Thr Val Leu Pro Ser Leu Ala Ile

50 55 60

Pro Gly Gly Leu Gly Thr Thr Pro Pro Ser Pro Ala Ala Ala Leu Thr

65 70 75 80

Pro Ala Gly Ser Ala Pro Ala Ala Val Ala Gly Ser Gly Thr Thr Leu

85 90 95

Ala Thr Gly Thr Ala Leu Ile Ile Thr Thr Gly Gly Ala Leu Val Gly

100 105 110

Ile Leu Leu Ala Leu Val Pro Thr Val Gly Leu Ala Pro Leu Gly Thr

115 120 125

Leu Thr Ala Thr Ile Met His Gly Thr Ala Leu Ile Gly Pro Ser Ala

130 135 140

Leu Ala Gly Ser Ser Leu Leu Ala Gly Thr Val Leu Cys Ala Ile Thr

145 150 155 160

Leu Leu Ser Ser Ser Ser Ala Ala Gly Leu Pro Met Thr Thr Ser Val

165 170 175

Ser Ser Leu Gly His Ser Ala Gly Ser Ser Ser Ser Cys Ser Ser Gly

180 185 190

Leu Ala Ala Val Leu Gly Thr Leu Pro Ala Ile Ala Ala Ala Cys Pro

195 200 205

Thr Leu Pro Ala Ile Ala Ser Leu Leu Thr Leu Gly Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ala Ser Leu Leu Gly Pro Gly Met Gly Ser Gly Ala Pro Ala Thr Ala

225 230 235 240

Ser Leu Ala Gly Leu Ala Val Val Pro Gly Leu Cys Pro Ala Ala Gly

245 250 255

Pro Gly Gly Ser Gly Gly Gly Met Ala Val Ala Thr Ser Ala Ala Ala

260 265 270

Met Thr Val Pro Ser Ile Pro Pro Leu Cys His Val Gly Ser Pro Pro

275 280 285

Gly Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Gly Gly Val Gly Ser Gly Pro Ala

290 295 300

Thr Gly Ala Val Ala Ala Ser Gly Pro Pro Gly Ala Ser Ala Val Met

305 310 315 320

Thr Gly Ala Pro Cys Ala Pro Thr Ala Pro Thr Gly Thr Ser Ala Ala

325 330 335

Leu Gly Ala Ser Gly Leu Gly Pro Gly Gly Ala Gly Leu

340 345

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物F(Unknown)

<400> 3

ggaattccat atggctctct ttctttctct c 31

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物R(Unknown)

<400> 4

taacccggga ctactcgatt tctccac 27

Claims (1)

1.加快水果成熟的基因在番茄育种或加快番茄成熟中的应用，其中，所述加快水果成熟的基因为：编码区为SEQ ID NO.1所示的DNA分子。

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