JP2002017391A - ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｖの大量製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 新規レバンフルクトトランスフェラーゼ
（ＬＦＴａｓｅ）をレバンに作用させて、ジフルクトー
ス・ジアンヒドリド ＩＶ（ＤＦＡ ＩＶ）を効率的に
大量生産する。 【効果】 ＬＦＴａｓｅ遺伝子は新たな設計に基づいて
作成された新規遺伝子であって、活性の高い酵素を高発
現するため、機能性オリゴ糖であるＤＦＡ ＩＶを効率
的に大量生産できる。また、一方のレバンも、セラチア
属菌（Serratia levanicum）を蔗糖含有培地で培養する
ことにより、効率的に大量生産できる。そのうえ、本発
明によれば、蔗糖→レバン→ＤＦＡ ＩＶの生成を連続
工程で実施することも可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ジフルクトース・
ジアンヒドリドＩＶ（以下、ＤＦＡ ＩＶということも
ある）の製造方法に関するものであり、更に詳細には、
新規レバンフルクトトランスフェラーゼを用いることに
よりレバンからＤＦＡ ＩＶを効率的に大量製造する新
規にして有用な方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＤＦＡ ＩＶは、６，２’：２，６’型
のフラクトシド結合を有する難消化性の二糖類であっ
て、低カロリーで且つフルクトース系の冷涼感のある甘
味を有し、またカルシウム吸収促進作用も有する等、甘
味料のほか機能性食品としても有用であることが確認さ
れているが、更に新たに有用な用途の開発も期待され、
その量産が希求されている。そして、ＤＦＡ ＩＶは、
レバンにレバンフルクトトランスフェラーゼ（以下、Ｌ
ＦＴａｓｅということもある）を作用させて製造されて
いるが、レバン及びＬＦＴａｓｅのいずれについても、
生産量が不足しており、十分に満足できる効率的な製造
方法は未だ開発されていないのが現状であり、ＤＦＡ
ＩＶの量産のため、高純度のレバン及び高純度のＬＦＴ
ａｓｅを大量に工業生産する方法の確率が強く要望され
ている。また、効率的なＤＦＡ ＩＶの回収、分離精製
法の開発も希求されている。

【０００３】レバンに作用させてＤＦＡ ＩＶを製造す
るのにＬＦＴａｓｅは、アルスロバクター・ニコチノボ
ランスＧＳ−９株（Arthrobacter nicotinovorans GS-9
（以下、ＧＳ−９菌ということもある）を培養中、培地
中のレバンにより誘導発現される誘導酵素である。しか
しながら、この酵素の発現量は微量であって、工業的応
用は困難であるし、更にＬＦＴａｓｅ酵素溶液の生産に
はレバンを必須とするため、工程が複雑となり、工業生
産上大きな障害となっているだけでなく、現時点におい
ては、レバン自体の工業的大量生産が確立されておら
ず、この方法によるＬＦＴａｓｅ生産性の低下は否めな
い。

【０００４】また、上記したような天然型ＬＦＴａｓｅ
の製造のほかに、遺伝子組換え型ＬＦＴａｓｅの製造に
ついても検討された。すなわち、ＧＳ−９由来のＬＦＴ
ａｓｅ遺伝子がＳａｉｔｏら（Saito et al.; Biosci.
Biotech. Biochem., 1997, 61(12), 2076-2079)によっ
てクローン化されており、その１次配列が解明されると
ともに、ｐＵＣプラスミドベクター系を利用し、大腸菌
を宿主とした発現系が構築されている。しかしながら、
その発現量は充分に満足できるものとはいえず、未だ改
良の余地が残されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した技
術の現状に鑑み、上記した欠点を解決して、高純度ＤＦ
Ａ ＩＶを効率的に製造する方法を新たに開発する目的
でなされたものであって、新規ＬＦＴａｓｅの開発、Ｄ
ＦＡ ＩＶ製造法自体の効率化、その効率的精製工程の
開発を目的としてなされたものである。また、ＤＦＡ
ＩＶは、レバンをＬＦＴａｓｅで処理することによって
製造することができるのであるが、その原料ないし基質
であるレバン自体について、その効率的大量製法が確立
していないため、ＤＦＡ ＩＶの効率的大量製法を確立
するには、レバンの量産も必要であるし、蔗糖の新規用
途の開発が待望されている製糖業界ににあっては、蔗糖
を利用するレバンの大量製造法が開発されればなおさら
好都合である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、微生物工学、遺伝
子工学、クロマトグラフィー論等すべての面から検討し
た結果、活性の高い新規組換えＬＦＴａｓｅ、これを使
用するＤＦＡ ＩＶの効率的製造方法及び精製方法を新
たに開発するに至り、遂に本発明の完成に至った。

【０００７】また、原料として用いるレバンについて
も、その効率的大量生産方法を新たに開発するのに成功
しただけでなく、蔗糖を用いる新規なレバンの製造方法
を新たに開発するのに成功し、しかも全く予期せざるこ
とに、レバンを生成した後、培養液からレバンを単離す
ることなく、次のＬＦＴａｓｅ処理に移行することがで
き、引き続いて、粗ＤＦＡ ＩＶの精製、単離、結晶化
ができるというきわめて有用な知見が得られ、蔗糖を原
料とし、途中で中断することなく連続して高純度ＤＦＡ
ＩＶを大量に製造することにもはじめて成功し、本発
明を完成するに至った。

【０００８】このように、一連の工程で、しかも複数の
微生物、酵素を使用するとともに各種の複雑な処理を行
うにもかかわらず、相互の干渉をひき起すことなく、反
応がスムーズに進行し、高純度ＤＦＡ ＩＶがきわめて
効率的に大量生産できることは、まさに驚異的なことで
ある。

【０００９】以下、本発明を、蔗糖を出発原料として一
連の操作によりＤＦＡ ＩＶを製造する方法を例にとっ
て説明するが（図８）、一連の操作の途中で反応生成物
を一部取り出し、これを用いて次の反応を行う断続操作
も可能であるし、例えば市販されているレバンを用い、
これにＬＦＴａｓｅを作用させてＤＦＡ ＩＶを製造す
ることも、もちろん可能である。以下、本発明を、連続
処理を例にとり、このフローにしたがって説明する。

【００１０】レバンは、β−２，６結合型のポリフラク
タン（フルクトフラノースのβ−２，６結合による連鎖
からなる多糖類）であって、試薬や代用血液に添加する
といった医薬的用途のほか、フルクトースの連鎖からな
る多糖類であることから、飲食品の分野においても有効
利用が期待されている。そして、レバンは、Bacillussu
btilis. Bacillus megatherium. Streptococcus saliva
rius等の培養によって製造されているが、本発明は更に
効率的な製法を開発したものである。

【００１１】すなわち本発明は、セラチア属に属するレ
バン生成菌を砂糖含有液中で培養することにより、レバ
ンを生成することによりレバンの効率的に製造するもの
である。

【００１２】本発明においては、セラチア属に属するレ
バン生成菌であればすべての微生物が使用でき、その１
例としてセラチア・レバニカム（Serratia levanicum）
（以下、セラチア菌ということもある）が例示される。
そして更にセラチア菌の中から好適株をスクリーニング
するのに成功し、その内の１株をＳｅｒｒａｔｉａｌｅ
ｖａｎｉｃｕｍ ＮＮ株と命名し（以下、セラチアＮＮ
菌ということもある）、工業技術院生命工学工業技術研
究所にＦＥＲＭ Ｐ−１７８９５として寄託した。

【００１３】本発明を実施するには、蔗糖とセラチア菌
とを接触させる必要があり、例えば、１〜３５％砂糖含
有液中でセラチア菌を培養すればよい。本発明における
セラチア菌の培養は、培地に砂糖を含有せしめた点を除
き、常法にしたがって行うことができ、常用される炭素
源、窒素源、ミネラル等に蔗糖を加え、セラチア菌の培
養に適したｐＨ（６〜７．５）、温度（２５〜３５℃）
に調整して培養すればよい。蔗糖の含有量は、培地１Ｌ
当たり、１０〜４００ｇ、好適には１００〜３００ｇ、
更に好適には１５０〜２５０ｇとするが、上記範囲より
少なくても、培養時間を延長すればよく、上記範囲のみ
に限定されるものではない。

【００１４】このようにして本発明者らは、セラチア菌
を蔗糖含有培養液中で培養することによりレバンが生成
するので、これを分離、採取することによってレバンを
製造する方法を開発するのにはじめて成功した。そして
更に特徴的なことに、本発明者らが開発したセラチア属
に属する細菌によって生成するレバンは、他の微生物に
よって生成するレバンに比較して、β−２、１結合が少
ない直鎖型のレバンである。そのため、セラチア属に属
する細菌によって生成するレバンは、オリゴ糖製造原料
として適しており、高収率でオリゴ糖を得ることができ
る点でも優れている。したがって、この方法で得たレバ
ンを使用すれば、オリゴ糖の一種であるＤＦＡ ＩＶを
製造する本発明にあっては、その製造効率を更に高める
ことができるという著効が奏される。そして、本発明者
らは、これに満足することなく、更にレバンの生成効率
を高めるために研究を行った結果、前培養法及び冷却熟
成法を新たに開発し、これらの方法の少なくともひとつ
を上記した蔗糖含有培地を用いる方法と結合したとこ
ろ、レバンの生成効率を大幅に高めることにも成功し
た。本発明は、これらも包含するものである。

【００１５】前培養法は、蔗糖含有培地で行う培養法
（本培養法ということもある）に先立ち、セラチア菌を
少量の培地で培養するものであって、場合によっては蔗
糖を添加してもよいが、通常は蔗糖を添加しない培地
（本培養法で使用する培地と同じ組成のものでもよい
し、相違するものであってもよい）で培養するものであ
る。一定期間（１０〜３０時間程度）培養した後、菌体
を分離又は分離することなく培養物（菌体＋培地）全体
をそのまま本培養液に接種する。蔗糖含有液で前培養し
た場合、培養物中にはレバンが既に生成している場合も
ある。

【００１６】冷却熟成法は、本培養終了後ないし一定期
間経過後、低下したｐＨを上げるとともに低温に維持す
る方法であって、本発明者らが創製した方法であって、
これを冷却熟成法と新たに命名したものである。本培養
の終了は、レバン生成量がピークに達したときとする
が、レバン生成量はこれを実際の測定により求めること
ができることは当然のことであるが、培養液の粘度測定
によって求めてもよいし、及び／又は、ｐＨを測定して
ｐＨが３．５〜５．３付近にまで低下したときとしても
よい。また、本培養は、通常、５〜２０時間経過後に終
了する場合が多いので、培養時間で本培養の終了を決定
してもよいし、上記培養時間を目安として、レバン生成
量、粘度、ｐＨの少なくともひとつを測定して、培養終
了時を決定してもよい。

【００１７】このようにして培養を中止ないし終了した
後、低下したｐＨを上げ（ｐＨ４．５〜７．０）、低温
（２０℃以下、好ましくは１５℃以下、更に好ましくは
１〜１０℃）に維持する。その期間は、上記と同様にし
てレバンの生成量を測定してピークになったときまでと
すればよく、通常３日〜１０日以上であるが、１週間〜
２週間程度が一応の目安となる。

【００１８】このようにして冷却熟成した後は、常法に
したがってレバンを回収すればよく、例えば、培養物の
固液分離を行い（濾過、遠心分離、デカンテーション等
常法による）、得られた培養液に４０〜１００％、好ま
しくは５０〜７０％アルコールを加えてレバンを沈澱せ
しめて、レバンを白色沈澱として得る。そして必要あれ
ば、これを乾燥して白色無定形粉末状のレバンを得る。
アルコールとしては、メタノール、プロパノール、イソ
プロパノール、エタノール、ブタノール、ｓｅｃ（又は
ｔｅｒｔ）ブタノール、アミルアルコール、イソアミル
アルコール、アリルアルコール等の脂肪族の飽和又は不
飽和アルコールその他各種アルコールが１種又は２種以
上併用できる。沈澱したレバンは、これを分離し、通風
乾燥、減圧乾燥、デシケーター乾燥その他の方法で乾燥
する。

【００１９】このようにして一旦単離した精製レバンを
用いて、これを緩衝液に再溶解し得られた溶液にＬＦＴ
ａｓｅ（又は酵素液）を添加し、レバンを分解してＤＦ
ＡＩＶを合成することができるが、本発明においては、
レバンを単離することなく、例えば冷却熟成後、溶液の
温度を３０〜４０℃に調節し、５０〜２００ｒｐｍで撹
拌しながら、ｐＨを５〜７に調整し、ＬＦＴａｓｅ（又
はその酵素溶液）を添加して、例えば１２〜３６時間合
成反応を行い、レバンからＤＦＡ ＩＶを製造してもよ
い。

【００２０】次に、ＤＦＡ ＩＶ合成反応に使用するＬ
ＦＴａｓｅについて述べる。本発明においては、前記し
たような欠点を有しない、活性の高いすぐれたＬＦＴａ
ｓｅを使用する必要があるため、各方面から検討の結
果、遺伝子工学的手法に着目し、更に発現効率を高める
ためにシステムの設計を行うこととした。

【００２１】すなわち本発明者らは、Ｓａｉｔｏらが構
築するのに成功したＬＦＴａｓｅ遺伝子の発現系を大幅
に改良して発現効率を高めるため、そしてそれと同時に
従来未知の新規にして活性の高い酵素を新規に開発する
ため、ＬＦＴａｓｅ遺伝子のオープンリーディングフレ
ーム（以下、ＯＲＦということもある）のみの新規作成
を試み、各種設計の結果、遂にＯＲＦの塩基配列の決定
に成功した。そして、ＰＣＲ法によってそのＯＲＦの作
成を行うこととし、それを実施するため、検討の結果、
センスプライマー及びアンチセンスプライマーの塩基配
列の決定及びそれらの人工合成を試みそれらにも成功し
た。そしてＧＳ−９の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ
を行うことにより、ＯＲＦのみの調製に成功した。

【００２２】これを、ｐＥＴ系プラスミドベクター、例
えばｐＥＴ−３ａプラスミドベクターのマルチクローニ
ングサイトに連結して、新たな発現プラスミドｐＥＴ／
ＬＦＴｓａを構築した。ＯＲＦの切り出しは、ＬＦＴａ
ｓｅ遺伝子の開始および終止コドン部に、部位特異的変
換法で制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位を作製す
ることで行い、特にＯＲＦのフレームを合わせた。この
プラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連
結された遺伝子を効率的に転写、翻訳できる、Ｔ７Ｌａ
ｃプロモーターが導入されており、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ
−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ
ｅ（ＩＰＴＧということもある）により高発現が可能と
なり、簡易的な操作で部分精製が行えるように工夫し
た。

【００２３】このプラスミドベクターを大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株に形質転換した形質転換体をＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ／
ＬＦＴｓａと命名し、工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭ Ｐ−１７８９６として寄託した。このよ
うにして創製した形質転換体は、非常に高いＬＦＴａｓ
ｅ活性を取得しており、本発明によれば、元株（ＧＳ−
９菌）の５〜５０倍、Ｓａｉｔｏらが構築するのに成功
した、ＤＮＡ分子ｐＢＢ−１を導入した大腸菌ＪＭ１０
９株（大腸菌ＪＭ１０９／ｐＬＦＴ−ＢＢＩ：特開平１
１−６９９７８、ＦＥＲＭ Ｐ−１６３１６）の２〜２
０倍もの高活性を取得できるようになり、更にスクリー
ニングすれば、これら以上の数十倍の活性を取得するこ
とも可能である。また、本発明によれば、酵素製造に従
来必要であったレバンが不必要になるという著効が得ら
れることも確認された。

【００２４】このようにして創製した形質転換体を培養
することにより、ＬＦＴａｓｅの大量発現が可能となっ
た。なお、本形質転換体は、ＬＦＴａｓｅを菌体内に生
産したため、培養終了後、菌体を破砕し、上清を無細胞
抽出液とし、この無細胞抽出液から酵素精製の常法にし
たがい、透析、クロマト処理、濃縮、限外濾過処理等を
適宜組み合わせて行い、精製酵素を得る。

【００２５】本発明に係るＬＦＴａｓｅは、遺伝子設計
によりきわめて綿密な計算の結果、人工的に創製された
ものであって、下記する理化学的性質を有する新規酵素
であり、しかもその活性はきわめて高く、その生成にレ
バンの存在を必須とする誘導酵素ではない等すぐれた効
果も有するものである。このようにして調製したＬＦＴ
ａｓｅは、これをレバンに作用させることにより、ＤＦ
Ａ ＩＶを効率的に製造することができる。その際ＬＦ
Ｔａｓｅは、単離精製したもののほか、部分精製したも
の、あるいは上記した無細胞抽出液（又はその濃縮液）
を使用することもできる。

【００２６】（１）作用 本酵素は、β−２，６フラクトシド結合を有する、ポリ
フラクタンのレバンを分解し、ＤＦＡ ＩＶを合成する
作用を有する。

【００２７】（２）力価の測定法 本酵素活性は、Ｓａｉｔｏら（Saito et al. ; Biosci.
Biotech. Biochem.,1997, 61(12), 2076-2079）の方法
に準じて行った。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）中で、終濃度が１０ｇ／Ｌとなる様にレバン
を溶解させた基質溶液に、酵素溶液を混合して、３７℃
で１０分間反応した。その後、反応溶液を沸騰水中で５
分間保持することで反応停止とした。生成したＤＦＡ
ＩＶをＨＰＬＣにより定量し、活性値を算出した。ここ
で、酵素１単位は、本酵素反応条件下で、１分間当たり
に１μｍｏｌの反応生成物を生じる酵素量とした。

【００２８】（３）基質特異性 本酵素の触媒可能な糖質関連物質を調査した。その結
果、本酵素は、レバンと、鎖長が３から７のレバンオリ
ゴ糖に作用することが判明した。その他の各種糖質には
作用しなかった。

【００２９】（４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 本酵素のｐＨに対する影響を調査した。安定性の検討
は、酵素溶液を各ｐＨの緩衝液中で２４時間、４℃で保
持した後、溶液をｐＨ６．０の緩衝液で置換し、定法に
従い酵素活性を測定した。その結果、本酵素の至適ｐＨ
は６．０であり、ｐＨ４．０から１２．０の幅広い範囲
で安定であった。

【００３０】（５）至適温度及び安定温度範囲 本酵素の温度に対する影響を調査した。安定性の検討
は、酵素溶液を各温度で２０分間保持した後、素早く４
℃に冷却し、定法に従い酵素活性を測定した。その結
果、至適温度は５０℃であり、４０℃まで安定であっ
た。

【００３１】（６）ｐＨ、温度等による失活の条件 （４）及び（５）に記載のｐＨ及び温度の条件、特に安
定性において、相対活性が低下している範囲以上が失活
の条件であると考察される。また、酵素溶液を沸騰水中
に５分間保持した後の酵素活性消失は確認している。

【００３２】（７）阻害、活性化及び安定化 Ｈｇ²⁺イオン、およびＡｇ²⁺イオン存在下で、著しく活
性が阻害された。

【００３３】（８）精製方法 形質転換大腸菌の無細胞抽出液を調製した後、ＤＥＡＥ
−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ（東ソ社製）陰イオン交
換樹脂などで、効率的に部分精製できる。

【００３４】（９）分子量及び分子量の測定方法 ＬＦＴａｓｅタンパク質の分子量測定は、タンパク質の
精製純度検定と同時に、Ｌａｅｍｍｌｉ（Laemmli : Na
ture(London), 1970, 227, 680-685）の方法に従いＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより行った。ゲルの濃度は７．５％とし
た。タンパク質の染色はＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌ
ｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅを用いた。その結果、分子量は、
およそ５０，０００Ｄａと測定された。この値は、遺伝
子のＤＮＡ塩基配列から推定されるアミノ酸配列から算
出される分子量５３，１５３Ｄａと類似しており、信頼
性がある。

【００３５】（１０）反応生産物の同定 本酵素により生産されたオリゴ糖を精製後、Ｃ¹³−ＮＭ
Ｒにより、スペクトル分析をした。その結果、反応生成
物は、ＤＦＡ ＩＶと同定された。

【００３６】（１１）酵素の誘導性 本酵素の誘導発現にはレバンを要しない。

【００３７】本発明に係る新規酵素は、上記した理化学
的性質を有する酵素であればすべてのものが包含され、
例えば配列番号１のアミノ酸配列（図１）で示されるタ
ンパク質もその１例として例示される。その製造方法に
しても、その遺伝子（その塩基配列を配列番号２、図２
に示す）を含有した新規形質転換体（ＦＥＲＭ Ｐ−１
７８９６）を培養することにより本発明に係る新規酵素
を得ることができるし、その新規アミノ酸配列の１例が
明らかにされたので（配列番号１）、合成によっても本
酵素を得ることができる。

【００３８】このようにして調製した新規ＬＦＴａｓｅ
は、それ自体又は酵素溶液（例えは、前記した無細胞抽
出液）を、前記した冷却熟成後のレバン溶液（ｐＨ５〜
６．５付近に調整）に添加して、レバンを分解してＤＦ
Ａ ＩＶを合成せしめる。

【００３９】ＤＦＡ ＩＶを結晶化するためにはその含
有量を高める必要がある。まず、ＤＦＡ ＩＶ含有液に
含有される糖を資化又は／及び除去し、可能な限り少な
くし、ＤＦＡ ＩＶの含有率を高める。次に、そのＤＦ
Ａ ＩＶ含有液を脱塩するために、強塩基性イオン交換
樹脂及び強酸性イオン交換樹脂、又は、強塩基性イオン
交換樹脂を用いて、それぞれ充填したカラムに通液す
る。その流出液を集めて濃縮した液を、塩型陽イオン交
換樹脂のクロマト塔に通液し、流出するＤＦＡＩＶ画分
をクロマトフラフィーで分離、採取し、純度の高いＤＦ
Ａ ＩＶ液を得る。そして、このＤＦＡ ＩＶ画分を濃
縮し、それを煎糖または冷却すればＤＦＡ ＩＶの結晶
を析出させることができ、ＤＦＡ ＩＶ結晶を製造する
ことができる。ＤＦＡ ＩＶを効率的に結晶化させるに
は、その純度（ＤＦＡ ＩＶ／固形分Ｗ／Ｗ％）を６０
％以上にする必要がある。

【００４０】ＤＦＡ ＩＶ含有液中の糖の資化に用いら
れるイーストはSaccharomyces cerevisiaeに属するもの
であれば良く、生イースト、乾燥イーストが利用され
る。イースト通気培養処理に供されるＤＦＡ ＩＶ含有
液の濃度は高ければ高いほど、後工程のクロマトグラフ
ィー分離に供される原液の濃度が上がり、濃縮費用が少
なくなるので好ましい。イーストを生産する場合には、
通常、培養槽の濃度は固形分０．０１Ｗ／Ｗ％度に保持
されるが、本発明の場合、培養槽のＤＦＡ ＩＶ含有液
の濃度は固形分１０から６０Ｗ／Ｗ％の範囲でイースト
処理されること、好ましくは、３０〜５０Ｗ／Ｗ％が良
く、イースト処理の差異の濃度を高くすることができ
る。

【００４１】尚、ＤＦＡ ＩＶ含有液のイースト処理の
温度は、３０〜３７℃で行われ、ＤＦＡ ＩＶ含有液へ
のイースト添加量とその処理時間は大略比例関係にあ
り、その添加量と処理時間は適宜選択されるものであ
る。又、クロマトグラフィーの処理に使用する塩型陽イ
オン交換樹脂として、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ型の樹脂が用いら
れる。クロマト分離法としては、モノベット方式、疑似
移動方式、前記の中間の方法等があるがいずれの方法で
も使用することができる。

【００４２】以上、これらの技術を駆使し、砂糖からの
ＤＦＡ ＩＶ生産を効率・連続化した。砂糖１０００グ
ラムからおよそ１５０〜２００グラム以上の高純度（９
０％以上）のＤＦＡ ＩＶ単一画分を製造することが可
能となった。

【００４３】なお、イースト処理後、所望するのであれ
ば、凝集剤（例えば、三菱化学製ＰＡＣ）を添加した
後、遠心分離処理等により菌体を回収した後、加熱処理
し（８０〜１００℃）、濃縮し、脱塩処理に移行しても
よい。

【００４４】以下、本発明の実施例について述べる。

【００４５】

【実施例１】セラチアＮＮ菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７８９
５）を用いてレバンの製造を行った。セラチア菌の培養
は、Ｙｏｋｏｔａら（Yokota et al. : Biosci. Biotec
h. Biochem., 1993, 57, 745-749）、およびＫｏｊｉｍ
ａら（Kojima et al. : J. Ferment. Bioeng., 1993, 7
5, 9-12）の方法を参考に、これに改良を施した。以
下、詳細を記述する。

【００４６】前培養法 ５．０ｇ／Ｌ 酵母エキス、１
０．０ｇ／Ｌ ポリペプトン、１０．０ｇ／Ｌ 塩化ナ
トリウム（ｐＨ７．０）の組成である培地（培地１とい
うことがある）を、３Ｌ容三角フラスコに１Ｌ調製し、
セラチア菌を１白金耳接種し、３０℃で、２４時間、ロ
ータリー振とう培養した。

【００４７】本培養法 ２００ｇ／Ｌ 蔗糖、ｇ／Ｌ
酵母エキス、８．５ｇ／Ｌ ポリペプトン、０．３ｇ／
Ｌ グルコース（ｐＨ７．０）の組成である培地（培地
２ということがある）を、２００Ｌ容ステンレス製ジャ
ーファメンター（日立製作所製、モデルＦ−０２）に調
製し、前培養したセラチア菌の培養液を全量接種した。
培地２の酵母エキス、およびポリペプトン量は、半量に
しても問題はない。そして、温度３０℃、攪拌８０ｒｐ
ｍ、通気１ｖｖｍで培養を行った。温度、ｐＨ、粘度を
経時的に測定した。

【００４８】培養終了と冷却熟成法 培養１０時間後を
目安とし、培養液粘度が最も増加して、ｐＨが４．０付
近まで低下した時に培養を中止し、ｐＨを５．５に調整
し、温度を４℃に冷却した。この条件は１週間以上保持
される様に制御した。

【００４９】上記したように、培地１と培地２を用い、
２００Ｌ容のファーメンターでセラチア菌を培養し、レ
バンを合成させた。その時の経過を図９に示した。１０
時間経過時にｐＨを調整し、冷却熟成すると、レバン合
成は減少することなく、増加した。レバン合成と培地中
の粘度には高い相関があり、レバン合成の程度は粘度で
モニターしている。フラスコ試験の粘度の最高値は３０
であるので、本実施例では４０の値となり、十分に効率
化できた。

【００５０】６５％エタノールでレバンを沈澱せしめ
た。これを遠心分離処理してレバンを分離、回収した。
次いでこれを電気乾燥機中で５０℃に１時間乾燥せし
め、白色粉末状のレバン６０ｇを得た。

【００５１】

【実施例２】（１）Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃ
ｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ ＧＳ−９株のレバンフルクト
トランスフェラーゼ（ＬＦＴａｓｅ）遺伝子のオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦ）のみの調製 本明細書において多用する遺伝子組み換え操作実験の基
礎技術は、斯界において公知のものであり、特に断らな
い限りＳａｍｂｒｏｏｋらの方法（Sambrook et al. :
モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニ
ュアル、第２版、1989年）に従って行った。

【００５２】ＬＦＴａｓｅ遺伝子の発現と活性に必要な
部分のみを調製する目的で、遺伝子組み換えを行った。
ここで指す「必要な部分のみ」とは、「成熟ＬＦＴａｓ
ｅに相当する遺伝子のみ」という意味である。Ｓａｉｔ
ｏら（Saito et al. : Biosci. Biotech. Biochem., 19
97, 61, 2076-2079）が解明した遺伝子情報を基に設計
した。ＬＦＴａｓｅ遺伝子を含む遺伝子ＤＮＡの塩基配
列を配列番号４（図４）に示し（塩基配列９１番目から
塩基配列１６４４番目までがＬＦＴａｓｅ遺伝子のＯＲ
Ｆ）、それから推定されるＬＦＴａｓｅのアミノ酸配列
を配列番号３（図３）に示した。

【００５３】まず設計は、配列表の配列番号４におい
て、塩基配列１番目から９０番目までと、ＬＦＴａｓｅ
の構造遺伝子の一部である塩基配列９１番目から１８９
番目までを除去する。塩基配列９１番目から１８９番目
までは、ＬＦＴａｓｅの最初のシグナルペプチド配列に
相当するカ所（アミノ酸配列１番目から３３番目）で、
除去されても成熟部が機能し、酵素活性には全く問題が
ない。そしてさらに、新たに開始コドンを付加する。ま
た、開始コドンの直前、および終始コドンの直後で、遺
伝子が任意に切断できる様に、塩基配列を強制的に置換
して、適当な制限酵素部位を設定する。

【００５４】実際には、塩基配列１８７番目から１８９
番目に開始コドン配列（ａｔｇ）を付加し、直前を切断
できる様に、制限酵素ＮｄｅＩ（ｃａｔａｔｇ）部位
を、そして終始コドン部にＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｃ）
部位を設計した。置換予定の塩基配列を含む２０塩基ほ
どのプライマーを作製し、ＧＳ−９菌の染色体ＤＮＡを
鋳型にＰＣＲ反応を行った。Ｔａｑポリメラーゼは宝酒
造製を用いた。ＰＣＲ反応後、産物を回収・精製し、制
限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理後、適当なプラスミ
ドベクターに連結し、塩基配列の置換具合をＤＮＡシー
ケンスにより確認した。なお、ＬＦＴａｓｅの構造遺伝
子中には、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩ部位は存在し
ないので、途中で切断されない。

【００５５】まとめると、置換された塩基は、次のよう
になった。配列番号１８６番をｃからＴへ、配列番号１
８７番をｇからＡへ、配列番号１８８番をｃからＴへ、
配列番号１８９番をｃからＧへ、

【００５６】配列番号１６４６番をｃからＧへ、配列番
号１６４７番をｃからＡへ、配列番号１６４９番をｇか
らＣへ、変換した。配列番号２（図２）に示すように、
本発明で使用する重要な個所を切り出したものであっ
て、制限酵素ＮｄｅＩ（ｃａｔａｔｇ）とＢａｍＨＩ
（ｇｇａｔｃｃ）部位を強制的に作り出した。あとの配
列（ハイフン部）は、使用しない。

【００５７】上記した設計の実施は、ＰＣＲ法で行っ
た。ＬＦＴａｓｅのＯＲＦのみを調製するために、Ｓａ
ｉｔｏら（Saito et al. : Biosci. Biotech. Bioche
m., 1997, 61(12), 2076-2079）の解析したＤＮＡ塩基
配列を参考にして、下記のＤＮＡ塩基配列を有する、２
７塩基の２種類の合成オリゴヌクレオチドプライマーを
作製した。これらのプライマーは、ＤＮＡ合成装置（ア
プライド・バイオシステムズ社製）を用いて人工的に合
成した。

【００５８】増幅されたＰＣＲ産物（ＬＦＴａｓｅのＯ
ＲＦのみを指す）の両端が、制限酵素処理で切断でき、
プラスミドベクターに連結可能とするために、強制的に
塩基配列を置換し、制限酵素部位を作製した。制限酵素
部位も開始コドン側と終止コドン側が識別できる様に、
ＮｄｅＩとＢａｍＨＩの２種類を設定した。センスプラ
イマー、アンチセンスプライマーを配列番号５、６（図
５、６）に示し、図中、置換された塩基は下線表示し
た。

【００５９】これとは別にＳａｉｔｏらの手法により調
製したＧＳ−９菌の染色体ＤＮＡと、上記２種類のプラ
イマー、およびＰＣＲ反応用試薬とを混合し、ＰＣＲ反
応を行った。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは宝酒造製の標
準品を用いた。ＰＣＲ反応条件は、総液量が１００マイ
クロリットル、サイクル数が３５回、１サイクルが９８
℃の１分間、６８℃の３分間とした。増幅されたＬＦＴ
ａｓｅのＯＲＦ断片、約１，５００塩基対のＤＮＡ塩基
配列、特に置換された部位のＤＮＡ塩基配列の確認は、
シーケンスレベルで行った。得られたＤＮＡ塩基配列を
配列番号２（図２）に示す。

【００６０】（２）ＬＦＴａｓｅのＯＲＦとプラスミド
ベクターの連結 （１）のＰＣＲ反応液（ＬＦＴａｓｅのＯＲＦ断片を含
む）をエタノール沈殿法で回収・精製後、制限酵素Ｎｄ
ｅＩとＢａｍＨＩで２重消化した。これを更にエタノー
ル沈殿法で回収・精製した。これとは別にｐＥＴ−３ａ
プラスミドベクター（宝酒造製）を制限酵素ＮｄｅＩと
ＢａｍＨＩで２重消化し、エタノール沈殿法で回収・精
製したものを調製し、先に精製されたＰＣＲ産物とライ
ゲーション反応により連結した。ここで作製されたプラ
スミドベクターを、ｐＥＴ／ＬＦＴｓａと命名した（図
７）。なお、従来のｐＬＦＴ−ＢＢ１の構築も示した。

【００６１】（３）プラスミドベクターｐＥＴ／ＬＦＴ
ｓａの形質転換 （２）で作製した、プラスミドベクターｐＥＴ／ＬＦＴ
ｓａはＨａｎａｈａｎ（D. Hanahan : Techniques for
transformation of E. coli, in DNA Cloning: A Pract
ical Approach, Vol.1, ed. by D. M. Glover, IRL Pre
ss, Oxford, 1985, 109-135）の手法に従い、ヒートシ
ョック法で、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテン
ト細胞（宝酒造製）に形質転換した。選択培地で培養
し、単一化された遺伝子組換え大腸菌をEscherichia co
li BL21(DE3)-pET/LFTsaと命名し、これを工業技術院生
命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１７８９６と
して寄託した。

【００６２】（４）Escherichia coli BL21(DE3)-pET/L
FTsaによるＬＦＴａｓｅの生産 Escherichia coli BL21(DE3)-pET/LFTsa（FERM P-1789
6）を、１００マイクログラム／ｍｌのアンピシリンを
含む５ｍｌのＬＢ培地で、対数増殖中期まで培養した
（３７℃）。この菌液０．２ｍｌを、終濃度で１ｍＭと
なる様にIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)
を含む１００ｍｌの同培地に接種し、３７℃で２４時間
振とう培養した。培養後、大腸菌菌体を遠心分離し培養
上清とに分けた。菌体は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６．０）で２回洗浄後、同緩衝液に再懸濁し、
超音波破砕機で破砕した。破砕液を遠心分離し、この上
清を無細胞抽出液とした。この溶液が、ＬＦＴａｓｅ溶
液である。

【００６３】このようにして調製した大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）−ＰＥＴ／ＬＦＴｓａの無細胞抽出液のＬＦ
Ｔａｓｅ活性を定法にしたがい測定したところ、１０
５．１単位／培養液（ｍｌ）であった。本発明によれ
ば、元株（ＧＳ−９菌）の約３０倍、Ｓａｉｔｏらの系
の約５倍と非常に高い生産性が得られた。なお、遺伝子
組換え体は菌体内に酵素を生産したため（ＧＳ−９菌は
菌体外に分泌発現）、酵素単位は培養液１ｍｌ当りの数
値に換算して比較した（表１）。

【００６４】 （表１） 表１：レバンフルクトトランスフェラーゼ活性の比較 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 株 名 所 在 ＬＦＴａｓｅ活性 （Ｕ／ｍｌ培養液） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 元株A. nicolinovorans GS-9 菌体外 ３．３ pLTF-BB1/大腸菌JM109 菌体内 １７．６ pET/LFTsa/大腸菌BL-21(DE3) 菌体内 １０５．１ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００６５】この無細胞抽出液から発現ＬＦＴａｓｅの
部分精製を行った。この無細胞抽出液を１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に対し一晩透析した。
そして担体として緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ Ｂｉｏ
−Ｇｅｌ Ａ（バイオ−ラッド製）を用いた陰イオン交
換カラムクロマトグラフィーに供した。吸着したタンパ
ク質の溶出は緩衝液中に含まれる塩化ナトリウム濃度を
０−０．４Ｍまで直線的に変化させて行った。定法に従
い、ＬＦＴａｓｅ活性画分を測定し、活性画分を遠心限
外ろ過膜で濃縮した。この粗酵素液を１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に対し一晩透析した。こ
の溶液を組み換え酵素の部分精製液とした。

【００６６】

【実施例３】ＬＦＴａｓｅを用いてレバンよりＤＦＡ
ＩＶを製造した。

【００６７】（１）先に製造したセラチア菌培養液の冷
却熟成後の溶液を、アルコールによるレバン沈澱を行う
ことなく、３７℃に調節し、１００ｒｐｍで撹拌しなが
ら、ｐＨを６．０付近に調節した。このようにして得た
レバン含有液２００Ｌに、上記で調整したＬＦＴａｓｅ
溶液（１００Ｕ／ｍｌ）１０ｍｌを添加して、２４時
間、４０℃でインキュベートし、レバンからのＤＦＡ
ＩＶ合成反応を行った。

【００６８】セラチア菌の培養液中からレバンを分離回
収することは、レバンと培地中の余剰糖分、不純物、及
び菌体とを分離するという意味、そして次反応のＤＦＡ
ＩＶ合成反応時に至適緩衝液中にレバンを溶解できる
という意味で重要であると考えられてきた。しかし、冷
却熟成終了時に、酵素反応時の至適ｐＨにｐＨを調整す
る操作のみで、その後の効率に何の問題も生じないこと
が明らかとなった。このことでエタノール沈澱によるレ
バンの回収が不必要になり、エタノール沈澱に使用する
資材と時間を大幅に省略することが可能となった。

【００６９】また、この後の操作でイースト菌を添加し
て、余剰の糖分を除去する工程が存在するが（この操作
を、イースト処理ということがある）、これも同タンク
内で行なうことが可能であった。イーストで通気培養処
理する酵素反応液の濃度は、１〜４０重量％、好ましく
は５〜３０重量％であった。

【００７０】（２）上記により得られた酵素反応液（Ｄ
ＦＡ ＩＶ３２０ｇを含有）１０Ｌにパン酵母（ニッテ
ンイースト、商品名）３００ｇ（水分６６％）を添加
し、３０℃で２４時間通気培養した。その培養液を濾過
した後、濃縮してＢｘ５０に調整した。内径１２ｃｍ高
さ７９ｃｍの樹脂製カラムにＮａ型とした強酸性陽イオ
ン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＣＲ−１３１０（商品
名）７．６Ｌを充填し、これに前記濃縮液を０．０２か
ら０．１０Ｌ／Ｌ−Ｒ／１サイクル、空間速度０．１３
〜０．５３、温度８０℃の条件で通液し、温水で押し出
した。ＤＦＡ ＩＶ純度の高い画分を採取し、ＤＦＡ
ＩＶ画分とした。この操作を１０回実施して得られたＤ
ＦＡ ＩＶ画分を混合し、混合液０．６ｋｇに活性炭を
加えて脱色した。珪藻土濾過によって活性炭を除去し、
ろ液を７０℃で減圧濃縮した。その後、冷却結晶化（７
０→２５℃）を行い、その結晶化物を遠心分離器で分離
し、純度９９．９％のＤＦＡ ＩＶ結晶１２０ｇを得
た。

【００７１】（３）また、上記したイースト処理後の粗
ＤＦＡ ＩＶ溶液を、図１０に示した条件で、カチオン
交換樹脂次いでアニオン交換樹脂に通液して、脱塩及び
クロマトグラフィーの効果を生起させる処理を行なっ
た。精製処理後のＤＦＡ ＩＶ溶液のＨＰＬＣによる分
析結果を図１０に示した。なお対照として精製処理前の
粗ＤＦＡ ＩＶ溶液のＨＰＬＣによる分析結果も図１０
に示した。その結果から明らかなように、脱塩効果によ
って不純物を吸着除去できるとともに、クロマト効果に
よってＤＦＡ ＩＶと不純物（主に、図中、点線の右か
ら１番目及び２番みのピーク）を分離できることがわか
る。

【００７２】その精製メカニズムは、現時点において
は、次のとおりである。図１１に示すように、カチオン
交換樹脂を充填したカラムとアニオン交換樹脂を充填し
たカラムを直結し、そこに粗ＤＦＡ ＩＶ溶液を通液し
て脱塩している。本法によって粗ＤＦＡ ＩＶ溶液中の
カチオンおよびアニオンが除去されるのは当然である
が、さらにアニオン交換樹脂によるクロマトグラフィー
効果も大きく、高純度のＤＦＡ ＩＶ溶液を得ることに
成功している。（図１１、図１２）

【００７３】アニオン交換樹脂から出てきた液を回収す
るタイミングを調整する（遅らせる）ことによって、図
中ＡだけでなくＢ（イースト処理時に生成したグリセロ
ールなど）も除去することが可能となる。本法を用いる
ことによって、純度９０％以上のＤＦＡ ＩＶ溶液を回
収率７０〜８０％で得ることが可能である。

【００７４】

【発明の効果】本発明に係る新規ＬＦＴａｓｅをレバン
に作用させることにより、効率的にＤＦＡ ＩＶを製造
することが可能となった。また、その精製法も開発さ
れ、高純度のＤＦＡ ＩＶの製造が可能となった。

【００７５】本発明に係るＬＦＴａｓｅは（同酵素遺伝
子も同様）、従来未知の新規物質である。本酵素は、β
−２，６−ポリフラクタンを還元末端から二糖単位で切
断する作用を有する。本酵素は非常に活性が高く、これ
をレバンに作用させることにより、各種機能性を有する
ＤＦＡ ＩＶを効率的に製造することができる。しかも
本酵素は、遺伝子組換え型であり、活性が高いだけでな
く、工業的に大量生産できるという特徴も有する。

【００７６】また、本発明によって、セラチア属菌を使
用する従来未知の新しいレバンの製造方法が開発され、
効率的にレバンを製造することが可能となった。そのう
え、本発明によれば、更に、前培養法及び／又は冷却熟
成法を新たに併用することにより、レバンの生成効率を
更に大幅に高めることがはじめて可能となり、レバンの
工業的製造にはじめて成功したものである。

【００７７】このように、本発明によって、原料である
レバン及びＬＦＴａｓｅの大量生産が可能となったの
で、従来なし得なかったＤＦＡ ＩＶの大量生産がはじ
めて可能となり、そのうえ、その効率的精製法も開発さ
れたので、高純度のＤＦＡ ＩＶを大量に製造すること
がはじめて可能となった。したがって、ＤＦＡ ＩＶの
機能性食品や医薬等への更なる工業的応用が可能となっ
た。

【００７８】そのうえ、本発明は、蔗糖からＤＦＡ Ｉ
Ｖの結晶化までの一連の工程を中断することなく連続し
て実施できるという画期的な特徴を有し、単離操作、他
のタンクへの移送その他の作業が省略され、低コストで
ＤＦＡ ＩＶを製造することが可能となるとともに、蔗
糖の有効利用にも新たに途を拓くものであって、製糖業
界に対して大きな貢献をなすものである。

【００７９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Nippon Tensaiseito Kabushiki Kaisha <120> Production Method of DFA IV in Large Amount <130> 6337 <141> 2000-7-6 <160> 6 <210> 1 <211> 485 <212> PRT <213> Arthrobacter nicotinovorans <400> 1 MET Gln Ala Ser Leu Arg Ala Ile Tyr His MET Thr Pro Pro Ser 5 10 15 Gly Trp Leu Cys Asp Pro Gln Arg Pro Val His Thr Asn Gly Ala 20 25 30 Tyr Gln Leu Tyr Tyr Leu His Ser Gly Gln Asn Asn Gly Pro Gly 35 40 45 Gly Trp Asp His Ala Thr Thr Gly Asp Gly Val Ser Tyr Thr His 50 55 60 His Gly Val Val MET Pro MET Gln Pro Asp Phe Pro Val Trp Ser 65 70 75 Gly Ser Ala Val Val Asp Thr Ala Asn Thr Ala Gly Phe Gly Ala 80 85 90 Gly Ala Val Ile Ala Leu Ala Thr Gln Pro Thr Asp Gly Lys Phe 95 100 105 Gln Glu Gln Tyr Leu Tyr Trp Ser Thr Asp Gly Gly Tyr Ser Phe 110 115 120 Thr Ala Leu Pro Asp Pro Val Ile Val Asn Thr Asp Gly Arg Thr 125 130 135 Ala Thr Thr Pro Ala Glu Val Glu Asn Ala Glu Trp Phe Arg Asp 140 145 150 Pro Lys Ile His Trp Asp Ala Thr Arg Asn Glu Trp Val Cys Val 155 160 165 Ile Gly Arg Ala Arg Tyr Ala Ala Phe Tyr Thr Ser Pro Asn Leu 170 175 180 Arg Asp Trp Gln Trp Lys Ser Asn Phe Asp Tyr Pro Asn His Ala 185 190 195 Leu Gly Gly Ile Glu Cys Pro Asp Leu Phe Glu MET Thr Ala Gly 200 205 210 Asp Gly Thr Arg His Trp Val Phe Gly Ala Ser MET Asp Ala Tyr 215 220 225 Ser Ile Gly Leu Pro MET Thr Phe Ala Tyr Trp Thr Gly Ser Trp 230 235 240 Asn Gly Thr Ala Phe Ile Ala Asp Asn Leu Thr Pro Gln Trp Leu 245 250 255 Asp Trp Gly Trp Asp Trp Tyr Ala Ala Val Thr Trp Pro Ala Val 260 265 270 Glu Ala Pro Glu Thr Lys Arg Leu Ala Thr Ala Trp MET Asn Asn 275 280 285 Trp Lys Tyr Ala Ala Arg Asn Val Pro Thr Asp Ala Ser Asp Gly 290 295 300 Tyr Asn Gly Gln Asn Ser Ile Thr Arg Glu Leu Arg Leu Glu Arg 305 310 315 Gln Ser Gly Gly Trp Tyr Thr Leu Leu Ser Thr Pro Val Pro Ala 320 325 330 Leu Ser Asn Tyr Ala Thr Ser Ser Thr Thr Leu Pro Asp Arg Thr 335 340 345 Val Asn Gly Ser Phe Val Leu Pro Trp Ser Gly Arg Ala Tyr Glu 350 355 360 Leu Glu Leu Asp Ile Ser Trp Asp Thr Ala Ala Asn Val Gly Val 365 370 375 Ser Val Gly Arg Ser Ser Asp Gly Ser Arg His Thr Asn Ile Gly 380 385 390 Lys Tyr Gly Asp Glu Leu Tyr Val Asp Arg Ala Ser Ser Glu Gln 395 400 405 Ser Gly Tyr Ala Leu Ala Pro Tyr Thr Arg Ala Ala Ala Pro Ile 410 415 420 Asp Ala Asn Ala Arg Ser Val His Leu Arg Ile Phe Val Asp Thr 425 430 435 Gln Ser Val Glu Val Phe Val Asn Ser Gly His Thr Val Val Ser 440 445 450 Gln Gln Val His Phe Ala Ala Gly Asp Thr Gly Ile Ser Leu Tyr 455 460 465 Ala Asp Gly Gly Pro Ala Asn Phe Thr Gly Ile Thr Ile Arg Glu 470 475 480 Phe Gly Asn Pro Ile 485 <210> 2 <211> 1467 <212> DNA <213> Arthrobacter nicotinovorans <400> 2 caTATGcagg catccctccg ggcgatctac cacatgaccc cgccctcggg ctggctatgt 60 gatccgcagc gacccgtaca tacaaacggc gcctaccagc tctactacct ccactccggc 120 cagaacaacg gaccgggcgg atgggaccac gcgaccaccg gcgacggagt gtcttacacc 180 caccatggag tggtgatgcc aatgcaaccg gacttccccg tgtggtcggg atcggcagta 240 gtggacaccg ccaacaccgc cggcttcggc gccggcgcag tcatcgcgct cgccacccaa 300 cccaccgacg gaaaattcca ggaacagtac ctttactggt ccacggatgg cggctactcc 360 ttcaccgcat tgcctgaccc ggtcattgtg aacactgatg gacggacggc caccaccccc 420 gccgaggtgg agaacgcaga atggttccgc gacccgaaaa ttcactggga cgcgacgcgc 480 aacgagtggg tctgtgtcat cggcagggcc cgctacgctg ccttctacac ctctcccaac 540 ctgcgggatt ggcaatggaa gtccaacttc gactacccca accacgccct cggcggtatc 600 gaatgcccgg atctgttcga aatgaccgca ggagacggaa cccggcactg ggtgttcggg 660 gcgagcatgg acgcctacag catcggcttg cccatgacct ttgcctactg gacaggttca 720 tggaacggca cagcattcat cgccgacaac ctcacaccac agtggcttga ctggggatgg 780 gactggtacg ccgccgtgac ctggccggcc gtggaagcac ctgagaccaa gcggcttgcc 840 acagcgtgga tgaacaactg gaaatatgcc gcccgcaacg tgcccacgga cgcgtccgat 900 ggctataacg ggcaaaattc catcacgcgc gagctcaggc tcgagcgcca atcgggcggc 960 tggtacacct tgctcagcac gcccgttccg gcgctttcga actatgccac ctccagcacc 1020 acccttccgg accgcacagt caacggcagt ttcgtacttc cgtggagcgg ccgggcgtat 1080 gaactggaac tcgatatttc atgggacacg gcagcgaacg tgggagtctc ggtgggccgc 1140 tcgtccgatg gcagccgcca tacgaacatc ggcaaatacg gtgacgagtt gtacgtcgat 1200 cgcgcatcct cggagcaaag cggttatgcg ctggcaccct acacccgcgc cgccgcgccc 1260 atcgatgcga acgccagatc cgtccacctg cgcatctttg tagacaccca aagtgttgag 1320 gtgttcgtaa attccgggca cacggtggtt tcgcagcagg tgcacttcgc ggccggggac 1380 acggggatct ccctctatgc ggacggcggt ccggccaact tcaccggcat caccatccgc 1440 gagttcggga accccatcta agGAtCc <210> 3 <211> 517 <212> PRT <213> Arthrobacter nicotinovorans <400> 3 MET Thr Tyr Asp Ile Ser Arg Arg Thr Ala Leu Gln Gly Ala Gly 5 10 15 Val Gly Ala Leu Ala Leu Phe MET Ser Asn Ala Ile Pro Val Ala 20 25 30 Ala His Ala Gln Ala Ser Leu Arg Ala Ile Tyr His MET Thr Pro 35 40 45 Pro Ser Gly Trp Leu Cys Asp Pro Gln Arg Pro Val His Thr Asn 50 55 60 Gly Ala Tyr Gln Leu Tyr Tyr Leu His Ser Gly Gln Asn Asn Gly 65 70 75 Pro Gly Gly Trp Asp His Ala Thr Thr Gly Asp Gly Val Ser Tyr 80 85 90 Thr His His Gly Val Val MET Pro MET Gln Pro Asp Phe Pro Val 95 100 105 Trp Ser Gly Ser Ala Val Val Asp Thr Ala Asn Thr Ala Gly Phe 110 115 120 Gly Ala Gly Ala Val Ile Ala Leu Ala Thr Gln Pro Thr Asp Gly 125 130 135 Lys Phe Gln Glu Gln Tyr Leu Tyr Trp Ser Thr Asp Gly Gly Tyr 140 145 150 Ser Phe Thr Ala Leu Pro Asp Pro Val Ile Val Asn Thr Asp Gly 155 160 165 Arg Thr Ala Thr Thr Pro Ala Glu Val Glu Asn Ala Glu Trp Phe 170 175 180 Arg Asp Pro Lys Ile His Trp Asp Ala Thr Arg Asn Glu Trp Val 185 190 195 Cys Val Ile Gly Arg Ala Arg Tyr Ala Ala Phe Tyr Thr Ser Pro 200 205 210 Asn Leu Arg Asp Trp Gln Trp Lys Ser Asn Phe Asp Tyr Pro Asn 215 220 225 His Ala Leu Gly Gly Ile Glu Cys Pro Asp Leu Phe Glu MET Thr 230 235 240 Ala Gly Asp Gly Thr Arg His Trp Val Phe Gly Ala Ser MET Asp 245 250 255 Ala Tyr Ser Ile Gly Leu Pro MET Thr Phe Ala Tyr Trp Thr Gly 260 265 270 Ser Trp Asn Gly Thr Ala Phe Ile Ala Asp Asn Leu Thr Pro Gln 275 280 285 Trp Leu Asp Trp Gly Trp Asp Trp Tyr Ala Ala Val Thr Trp Pro 290 295 300 Ala Val Glu Ala Pro Glu Thr Lys Arg Leu Ala Thr Ala Trp MET 305 310 315 Asn Asn Trp Lys Tyr Ala Ala Arg Asn Val Pro Thr Asp Ala Ser 320 325 330 Asp Gly Tyr Asn Gly Gln Asn Ser Ile Thr Arg Glu Leu Arg Leu 335 340 345 Glu Arg Gln Ser Gly Gly Trp Tyr Thr Leu Leu Ser Thr Pro Val 350 355 360 Pro Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Thr Ser Ser Thr Thr Leu Pro Asp 365 370 375 Arg Thr Val Asn Gly Ser Phe Val Leu Pro Trp Ser Gly Arg Ala 380 385 390 Tyr Glu Leu Glu Leu Asp Ile Ser Trp Asp Thr Ala Ala Asn Val 395 400 405 Gly Val Ser Val Gly Arg Ser Ser Asp Gly Ser Arg His Thr Asn 410 415 420 Ile Gly Lys Tyr Gly Asp Glu Leu Tyr Val Asp Arg Ala Ser Ser 425 430 435 Glu Gln Ser Gly Tyr Ala Leu Ala Pro Tyr Thr Arg Ala Ala Ala 440 445 450 Pro Ile Asp Ala Asn Ala Arg Ser Val His Leu Arg Ile Phe Val 455 460 465 Asp Thr Gln Ser Val Glu Val Phe Val Asn Ser Gly His Thr Val 470 475 480 Val Ser Gln Gln Val His Phe Ala Ala Gly Asp Thr Gly Ile Ser 485 490 495 Leu Tyr Ala Asp Gly Gly Pro Ala Asn Phe Thr Gly Ile Thr Ile 500 505 510 Arg Glu Phe Gly Asn Pro Ile 515 <210> 4 <211> 1752 <212> DNA <213> Arthrobacter nicotinovorans <400> 4 cccgggacct ttcccgacgg tctcacacac ccatcaccat gacgtttggc gtgtcgtcgc 60 gcccgccgaa cactgagagg aaacgaatcg atgacgtatg acatctctcg ccgcactgcc 120 ctgcaaggtg caggggttgg tgccttggca cttttcatga gcaatgccat tcccgtggcc 180 gcccacgccc aggcatccct ccgggcgatc taccacatga ccccgccctc gggctggcta 240 tgtgatccgc agcgacccgt acatacaaac ggcgcctacc agctctacta cctccactcc 300 ggccagaaca acggaccggg cggatgggac cacgcgacca ccggcgacgg agtgtcttac 360 acccaccatg gagtggtgat gccaatgcaa ccggacttcc ccgtgtggtc gggatcggca 420 gtagtggaca ccgccaacac cgccggcttc ggcgccggcg cagtcatcgc gctcgccacc 480 caacccaccg acggaaaatt ccaggaacag tacctttact ggtccacgga tggcggctac 540 tccttcaccg cattgcctga cccggtcatt gtgaacactg atggacggac ggccaccacc 600 cccgccgagg tggagaacgc agaatggttc cgcgacccga aaattcactg ggacgcgacg 660 cgcaacgagt gggtctgtgt catcggcagg gcccgctacg ctgccttcta cacctctccc 720 aacctgcggg attggcaatg gaagtccaac ttcgactacc ccaaccacgc cctcggcggt 780 atcgaatgcc cggatctgtt cgaaatgacc gcaggagacg gaacccggca ctgggtgttc 840 ggggcgagca tggacgccta cagcatcggc ttgcccatga cctttgccta ctggacaggt 900 tcatggaacg gcacagcatt catcgccgac aacctcacac cacagtggct tgactgggga 960 tgggactggt acgccgccgt gacctggccg gccgtggaag cacctgagac caagcggctt 1020 gccacagcgt ggatgaacaa ctggaaatat gccgcccgca acgtgcccac ggacgcgtcc 1080 gatggctata acgggcaaaa ttccatcacg cgcgagctca ggctcgagcg ccaatcgggc 1140 ggctggtaca ccttgctcag cacgcccgtt ccggcgcttt cgaactatgc cacctccagc 1200 accacccttc cggaccgcac agtcaacggc agtttcgtac ttccgtggag cggccgggcg 1260 tatgaactgg aactcgatat ttcatgggac acggcagcga acgtgggagt ctcggtgggc 1320 cgctcgtccg atggcagccg ccatacgaac atcggcaaat acggtgacga gttgtacgtc 1380 gatcgcgcat cctcggagca aagcggttat gcgctggcac cctacacccg cgccgccgcg 1440 cccatcgatg cgaacgccag atccgtccac ctgcgcatct ttgtagacac ccaaagtgtt 1500 gaggtgttcg taaattccgg gcacacggtg gtttcgcagc aggtgcactt cgcggccggg 1560 gacacgggga tctccctcta tgcggacggc ggtccggcca acttcaccgg catcaccatc 1620 cgcgagttcg ggaaccccat ctaagcctgc gtcccacggc tggaaaggac gacggcgacg 1680 ctgcagcagg cgggtgcgtc gccgtcgttc ttccgggtcc gttgggcagt tcgcatctga 1740 caagcacccg gg <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 5 ccgcccatat gcaggcatcc ctccggg 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 6 gggacggatc cttagatggg gttcccg 27

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係るＬＦＴａｓｅのアミノ酸配列を示
す。

【図２】本発明に係るＬＦＴａｓｅ遺伝子ＤＮＡの塩基
配列を示す。

【図３】ＧＳ−９由来のＬＦＴａｓｅのアミノ酸配列を
示す。

【図４】ＧＳ−９由来のＬＦＴａｓｅ遺伝子ＤＮＡの塩
基配列を示す。

【図５】センスプライマーの塩基配列を示す。

【図６】アンチセンスプライマーの塩基配列を示す。

【図７】ＬＦＴａｓｅの大量発現系の構築図である。

【図８】蔗糖からのＤＦＡ ＩＶの大量製造法のフロー
チャートを示す。

【図９】実施例１におけるSerratia levanicumのファー
メンターによるレバン合成を示す。なお、粘度は、Ｂ型
粘度計（Ｎｏ．２回転軸、２０℃）の実測値である。

【図１０】ＤＦＡ ＩＶ含有液の脱塩前及び脱塩後のＨ
ＰＬＣクロマトグラムである。

【図１１】ＤＦＡ ＩＶの精製図である。

【図１２】粗ＤＦＡ ＩＶ溶液のＨＰＬＣクロマトグラ
ムである。なお、縦軸はｍＶ、横軸は保持時間（分）を
表わす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） 1:06） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:06） Ｃ１２Ｒ 1:06） (72)発明者 櫻井 博章 北海道帯広市稲田町南９線西13番地 日本 甜菜製糖株式会社総合研究所内 (72)発明者 佐山 晃司 北海道帯広市稲田町南９線西13番地 日本 甜菜製糖株式会社総合研究所内 (72)発明者 有塚 勉 北海道帯広市稲田町南９線西13番地 日本 甜菜製糖株式会社総合研究所内 (72)発明者 冨田 房男 北海道札幌市北区北９条西９丁目 北海道 大学農学部内 (72)発明者 浅野 行蔵 北海道札幌市北区北９条西９丁目 北海道 大学農学部内 (72)発明者 横田 篤 北海道札幌市北区北９条西９丁目 北海道 大学農学部内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA80 CA04 DA06 GA11 GA19 HA01 4B050 CC01 CC03 DD02 LL02 4B064 AF03 CA19 CB07 CC24 CD19 CE10 CE11 DA10

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するレバンフル
   クトトランスフェラーゼ（ＬＦＴａｓｅ）をレバンに作
   用させてジフルクトース・ジアンヒドリドＩＶ（ＤＦＡ
   ＩＶ）を製造すること、を特徴とするＤＦＡ ＩＶの
   製造方法。 （１）作用 β−２，６フラクトシド結合を有する、ポリフラクタン
   のレバンを分解し、ジフルクトース・ジアンヒドリドＩ
   Ｖ（ＤＦＡ ＩＶ）を合成する作用を有する。 （２）基質特異性 レバン及び鎖長が３から７のレバンオリゴ糖に作用す
   る。 （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨ：６．０ 安定ｐＨ範囲：４．０〜１２．０ （４）至適温度及び安定温度範囲 至適温度：５０℃ 安定温度範囲：本酵素は、４０℃まで安定であった。 （５）分子量 分子量：約５０，０００Ｄａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル
   温度７．５％） （６）酵素の誘導性 本酵素の誘導発現にはレバンを要しない。
2. 【請求項２】 配列番号１のアミノ酸配列で示されるＬ
   ＦＴａｓｅをレバンに作用させてＤＦＡ ＩＶを製造す
   ること、を特徴とするＤＦＡ ＩＶの製造方法。
3. 【請求項３】 配列番号２の塩基配列で示されるＬＦＴ
   ａｓｅ遺伝子に対応するアミノ酸配列を有するＬＦＴａ
   ｓｅをレバンに作用させてＤＦＡ ＩＶを製造するこ
   と、を特徴とするＤＦＡ ＩＶの製造方法。
4. 【請求項４】 配列番号２の塩基配列で示されるＬＦＴ
   ａｓｅ遺伝子のＤＮＡを含有するプラスミドで形質転換
   してなる形質転換体を培養し、得られた培養物由来のＬ
   ＦＴａｓｅを使用すること、を特徴とする請求項１に記
   載のＤＦＡＩＶの製造方法。
5. 【請求項５】 形質転換体としてエシエリヒア・コリ
   （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ
   ３）−ｐＥＴ／ＬＴＦｓａ（ＦＥＲＭ Ｐ−１７８９
   ６）を使用すること、を特徴とする請求項４に記載のＤ
   ＦＡ ＩＶの製造方法。
6. 【請求項６】 酵素反応液中の糖を資化及び／又は除去
   する処理、脱塩処理、クロマトグラフィー分離処理の少
   なくともひとつの処理によりＤＦＡ ＩＶ画分を精製、
   回収すること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１
   項に記載の方法。
7. 【請求項７】 イーストで通気培養処理することにより
   酵素反応液中の糖を資化及び／又は除去すること、を特
   徴とする請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 強塩基性イオン交換樹脂及び強酸性イオ
   ン交換樹脂、又は、強塩基性イオン交換樹脂を用いて脱
   塩処理すること、を特徴とする請求項６又は７に記載の
   方法。
9. 【請求項９】 クロマトグラフィー分離の担体として、
   Ｎａ型またはＣａ型の強酸性イオン交換樹脂を使用する
   こと、を特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載
   の方法。