KR20180020814A - 아밀로수크라제 효소의 발현 시스템 및 이를 이용한 투라노스의 생산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아밀로수크라제 효소를 높은 발현율로 생산할 수 있는 유전자 발현 시스템, 이를 이용한 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물, 상기 형질전환 GRAS 미생물 또는 얻어진 효소를 이용한 투라노스 생산방법에 관한 것이다.

Description

아밀로수크라제 효소의 발현 시스템 및 이를 이용한 투라노스의 생산{Expression system for amylosucrase and production for turanose using the same}

본 발명은 높은 발현율과 안정성으로 아밀로수크라제 효소를 생산할 수 있는 발현 시스템, 이를 이용한 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물, 및 상기 발현 시스템을 이용한 미생물 및 효소를 포함하는 투라노스 생산방법에 관한 것이다.

다양한 생합성 산물이 자연 대상 과정에 의해 세포에서 생산되며, 식료품, 사료, 화장품, 먹이, 식품 및 제약 산업을 비롯한 수많은 산업 분야에서 사용되고 있다. 이들은, 가장 편리하게는, 각각의 경우에 요구되는 특정 물질을 다량으로 생산 및 분비하도록 개발된 세균 균주 또는 다른 미생물의 성장에 의해 대규모로 생산된다. 현재 코리네박테리움 균주는 산업적으로 아미노산 생산에 가장 많이 이용되는 미생물로 1950년대 중반에 글루탐산을 효율적으로 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰이 발견되어 산업화가 이루어졌고, 코리네박테리움 글루타미쿰의 영양 요구성 변이주를 이용하여 발효법을 통해 산업적으로 다양한 아미노산을 생산하고 있다.

세포를 엔지니어링하는 데에는 다양한 관련 유전자의 발현 정도를 확실히 조절할 필요가 있고, 이러한 유전자 발현 조절은 다양한 효율적인 발현 시스템을 요구한다. 세포의 조절서열의 다양한 구성 성분은 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 오퍼레이터(operator)라고도 지칭되는 조절인자(regulator)에 대한 결합 부위, -35 및 -10 영역으로 지칭되는 RNA 폴리머라제 전효소에 대한 결합 부위, 및 리보좀 결합 부위 또는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열로 지칭되는 리보좀 16S RNA에 대한 결합 부위로 구분되어 있다.

발현 시스템을 개발하는 데에는 프로모터의 선택이 가장 중요하게 여겨지는데 프로모터가 유전자의 발현정도와 발현조절에 상당히 크게 관여하기 때문이다. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 이용가능한 프로모터로는 몇 가지가 보고되어 있는데 주로 코리네박테리움 유래 또는 대장균 유래의 프로모터들이다 (J. Biotechnol., 104:311-323, 2003).

그러나, 대장균 유래의 프로모터는 발현유도인자의 낮은 투과성과 유전자 발현 억제 물질의 부재 등의 이유로 코리네박테리움에서 상대적으로 낮은 활성을 나타낸다. 또한 같은 프로모터라 하더라도 목적단백질을 코딩하는 유전자에 따라 발현 효율이 제각각이며, 코리네박테리움에서 사용할 수 있는 프로모터들의 세기 또한 선택의 폭이 작아서 목적에 맞게 발현시스템을 제작하는 것이 용이하지 않다. 특히 대사경로의 구축과 같이 다양한 유전자들의 발현을 함께 조절해야 할 경우에 코리네박테리움에서는 대장균에서와 같이 다양한 선택을 할 수 있지 못한 것이 현실이다.

투라노스는 자연적으로 벌에서 생기는 환원성 이당류로서 수크로스 단맛의 약 반에 해당하는 단맛을 나타내며, 수크로스의 유사체이며 3-0-α-글루코피라실-D-프럭토스의 화학적 구조를 지닌다. 투라노스는 치아 우식 유발 미생물에 의해 발효되지 않기 때문에 칼로리 없는 감미료로서 사용될 수 있으며, 따라서 음식, 화장품 및 약학 산업계에서 중요한 역할을 수행할 수 있다.

이처럼 투라노스는 여러 산업에 유용하게 쓰일 수 있지만 자연계에 극히 드물게 존재하는 희소당에 속하기 때문에, 다양한 산업적 적용을 위해서는 투라노스를 효율적으로 대량 생산하는 기술의 개발이 필요하다. 종래의 투라노스 제조 방법은 주로 화학적 합성보다는 효소적 방법에 의한 투라노스 제조방법이 알려져 있으며, 한국등록특허 10-1177218호에서 형질전환 대장균을 이용하여 Neisseria polysaccharea, Deinococcus geothermalis 및 Alteromonas macleodii로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 미생물로부터 유래한 아밀로수크라제 효소를 대량 생산하고, 생산된 효소를 이용하여 수크로스 및 프럭토스를 포함한 기질 용액으로부터 투라노스를 제조하는 방법을 기재하고 있다.

상기 한국등록특허 10-1177218호에 기재된 기술은 미생물로부터 효소를 정제하는 과정에서 많은 비용과 시간이 소요되며, 대장균을 균주로 사용하여 산업적으로 사용하고자 할 때 배양이 어려우며 일반적으로 안전하다고 인증받은 균주(GRAS, Generally Recognized As Safe) 가 아니기 때문에 식품 소재를 생산하는 균주로서 사용하기에 적합하지 않다는 문제점이 있다.

따라서, 투라노스 생산 효소를, GRAS 균주에서, 고수율로 생산하는 발현 시스템, 이를 이용한 아밀로수크라제 효소의 생산방법, 및 상기 생산된 효소 또는 형질전환 GRAS 균주를 이용한 투라노스 생산방법이 여전히 필요한 실정이다.

본 발명의 일예는 GRAS 균주에서, 고수율로 아밀로수크라제 효소를 생산할 수 있는 전사 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 예는 상기 코리네박테리움속 균주 발현용 전사 프로모터와 아밀로수크라제 효소의 코딩 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 예는 상기 코리네박테리움속 균주 발현용 전사 프로모터와 아밀로수크라제 효소의 코딩 서열을 포함하는, 코리네박테리움속 균주용 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 예는 상기 발현 카세트로 형질전환되거나, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 아밀로수크라제 효소를 발현하는 코리네박테리움속 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 다른 예는 상기 코리네박테리움속 균주를 이용하여 얻어진 아밀로수크라제 효소, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 투라노스 생산용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 코리네박테리움속 균주를 이용하여 얻어진 아밀로수크라제 효소, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여, 과당-함유 원료로부터 투라노스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 아밀로수크라제 효소를 높은 발현율로 생산할 수 있는 발현 시스템, 이를 이용한 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물, 상기 형질전환 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물을 이용한 효소의 제조방법, 및 상기 발현 시스템을 이용한 미생물 및 효소를 포함하는 투라노스 생산방법에 관한 것이다.

대장균 유래의 프로모터는 발현유도인자의 낮은 투과성과 유전자 발현 억제 물질의 부재 등의 이유로 코리네박테리움속 균주에서 상대적으로 낮은 활성을 나타내며, 또한 코리네박테리움속 균주에서 생산하고자 하는 투라노스 생산 효소의 발현에 적합한 발현 시스템을 제공하자 한다.

본 발명은 코리네박테리움속 균주에서 높은 발현율로 안정적으로 아밀로수크라제 효소를 발현할 수 있는 프로모터, 및 상기 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 제공하여, 코리네박테리움속 균주에서 아밀로수크라제 효소를 높은 발현율로 안정적으로 대량으로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 식품에 적용 가능한 투라노스를 대량 생산을 하기 위해, GRAS (Generally recognized as safe) 균주에서 안정적이고 높은 효소 생산활성을 갖는 아밀로수크라제 효소를 다량 발현하기 위하여, 상기 프로모터와 조합시 더욱 우수한 발현율을 나타내는 아밀로수크라제 효소 및 이의 코딩 핵산서열을 제공하고자 한다.

본 발명은 투라노스를 GRAS 균주에서 발현하여 안전한 식품원료로 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 높은 반응 안정성을 가지고 장기간 반응을 지속적으로 가능한 것은 산업의 대량생산에 매우 유리하다는 장점이 있다.

본 명세서에서, "프로모터", "전사 프로모터", "프로모터 활성을 갖는 핵산분자" 또는 "프로모터 서열"은 전사대상의 목적 핵산서열에 기능적으로 연결되어 상기 목적 핵산서열의 전사를 조절하는 핵산을 의미한다.

전사대상 핵산서열은 화학적 의미에서 반드시 프로모터에 직접 연결을 필요로 하는 것은 아니며, 추가적인 유전자 조절서열 및/또는 링커 핵산서열 등을 포함할 수 있다. 전사대상 목적 핵산서열이 프로모터 서열의 하부에 (즉, 프로모터 서열의 3' 말단에) 위치하는 배열이 바람직하다. 프로모터 서열과 전사대상 핵산서열 사이의 거리는 바람직하게는 200개 염기 미만, 특히 바람직하게는 100개 염기 미만이다.

본 발명에 따라 "리보좀 결합 부위" (RBS)의 서열 (또는 샤인-달가노 서열로도 칭함)은 A/G 풍부 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 명세에서 "조절서열"은 프로모터를 포함하고 발현대상 핵산서열 또는 유전자에 기능적으로 연결된 후에 상기 핵산 또는 상기 유전자의 발현, 즉 전사 및 번역을 조절하는 발현 활성을 갖는 핵산을 의미한다. 따라서, 이와 관련하여 상기 핵산 서열은 "조절 핵산 서열"로도 불린다.

"발현 카세트"는 발현대상 핵산서열, 예를 들면 아밀로수크라제 효소의 코딩 핵산서열에 기능적으로 연결된 조절서열을 의미한다. 따라서, 발현 유닛과 달리, 발현 카세트는 전사 및 번역을 조절하는 핵산 서열뿐만 아니라 전사 및 번역의 결과로서 단백질로서 발현되는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 모든 핵산 분자는 바람직하게는 자연에 존재하지 않는 형태이며(non-naturally occurring), 단리된 핵산 분자의 형태 또는 합성된 또는 재조합 방법에 의해서 제조되는 핵산분자이다. "단리된" 핵산 분자는 상기 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 제거되고, 추가로, 재조합 기술에 의해 제조될 경우 본질적으로 다른 세포성 물질 또는 배양 배지가 존재하지 않거나, 화학적으로 합성될 경우에는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 존재하지 않을 수 있다.

본 발명의 일예는 코리네박테리움속 균주 발현용 전사 프로모터의 핵산분자에 관한 것으로서, 아밀로수크라제 효소를, GRAS 균주에서 고수율로 생산할 수 있도록 한다.

본 발명의 또 다른 일예는 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열과, 그 상류(upstream)에 작동 가능하도록 연결되며 코리네박테리움속 균주에서 상기 아밀로수크라제 효소의 발현을 조절하는 조절서열을 포함하는, 코리네박테리움속 균주에서 아밀로수크라제 효소를 발현하는 유전자 발현 카세트(gene expression cassette)를 제공한다. 본 발명에 따른 조절서열은, GRAS 균주, 예를 들면 코리네박테리움속 균주에서 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열을 발현하는 전사 프로모터를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 전사 프로모터는 코리네박테리움속 균주에서 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열을 발현하는 핵산분자일 수 있으나, s1, t2, t1, h1 프로모터일 수 있다. s1 프로모터는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래된 것이며, 바람직하게는 서열번호 1의 핵산서열을 코어영역으로 포함한다. t2 프로모터는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래된 것이다. t1 프로모터는 대장균 유래 프로모터로서, trp 프로모터와 lac UV5 프로모터의 조합으로 제조된 것이다. h1 프로모터는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래된 것이다.

본 발명에 따른 전사 프로모터의 예는 서열번호 1의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 서열번호 8의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 서열번호 12의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 및 서열번호 16의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 전사 프로모터(transcription promoter)를 포함할 수 있다.

상기 조절서열은 리보좀 결합 영역(ribosome binding site) 및 스페이서(spacer)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 핵산분자를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조절서열에서 전사프로모터에 더하여 RBS, 스페이서 서열, 및 링커 서열로 이루어지는 군에서 1종 이상을 추가로 포함함으로써 투라노스 전환 효소의 발현이 향상될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 조절서열은 다음과 같은 조합으로 구성될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

(1) 프로모터 핵산서열을 포함하는 것,

(2) 프로모터 핵산서열의 3'-말단에 연결된 제1 링커 서열을 포함하는 것 (예, 프로모터-제1 링커),

(3) 프로모터 핵산서열의 3'-말단에 직접 또는 제1 링커 서열을 통해 연결된 1개 이상의 리보좀 결합영역을 포함하는 것(예, 프로모터-제1링커-리보좀 결합영역 또는 프로모터-리보솜 결합영역),

(4)프로모터 핵산서열의 3'-말단에 직접 또는 제1 링커 서열을 통해 연결된리보좀 결합영역과 제 2 링커 서열을 포함하는 것(예, 프로모터-제1링커-리보좀 결합영역-제2링커, 또는 프로모터-리보솜 결합영역-제2링커),

(5) 프로모터 핵산서열의 3'-말단에 직접 또는 링커를 통해 연결된 리보좀 결합영역과 스페이서 서열을 포함하는 것(예, 프로모터-제1링커-리보좀 결합영역-스페이서, 또는 프로모터-리보솜 결합영역-스페이서), 및(6) 프로모터 핵산서열의 3'-말단에 직접 또는 링커를 통해 연결된 리보좀 결합영역과 스페이서 서열을 2회 이상 반복하여 포함하는 것(예, 프로모터-제1링커-리보좀 결합영역-스페이서--리보좀 결합영역-스페이서, 또는 프로모터-리보솜 결합영역-스페이서-리보솜 결합영역-스페이서), 또는 2회 이상 반복되는 리보좀 결합영역과 스페이서 서열 사이에 제3 링커를 추가로 포함하는 것(예, 프로모터-제1링커-리보좀 결합영역-스페이서-제3링커 서열-리보좀 결합영역-스페이서, 또는 프로모터-리보솜 결합영역-스페이서-제3 링커서열-리보좀 결합영역-스페이서).

상기 리보좀 결합 영역과 서는 화학적으로 직접 연결되거나 그 중간에 링커 핵산서열을 개재하여 간적접으로 연결될 수 있다. 본 발명의 일예에서 리보좀 결합 영역(ribosome binding site) 및 스페이서 서열은 5'에서 3'방향으로 순차적으로 연결된 하나의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

상기 리보좀 결합 영역, 스페이서 서열 및 링커서열로 이루어지는 군에서 선택된 것은, 조절서열 내에 동일한 또는 상이한 서열이 1회 또는 2회 이상 반복하여 포함될 수 있다. 예를 들면, 리보좀 결합 영역, 스페이서 서열 및 링커 서열로 이루어지는 군에서 선택된 것이 조절서열 내에 동일한 또는 상이한 서열이 1회 또는 2회 이상 반복하여 포함될 수 있으며, 추가 핵산서열은 화학적으로 직접 연결되거나 그 중간에 링커 핵산서열을 개재하여 간접적으로 연결될 수 있다.

상기 조절서열에 포함되는 제1 링커서열, 제2 링커서열 및 제3 링커서열은 1개 내지 100개의 염기, 예를 들면 5개 내지 80 염기를 가지는 핵산서열일 수 있으며, 상기 조절서열의 예는 서열번호 17의 핵산서열을 포함하는 핵산분자일 수 있다. 상기 제1 링커서열은 상기 조절서열의 전사 프로모터의 3'-말단에 연결되며 리보좀 결합 영역의 5'-말단에 연결되며, 1개 내지 100개 염기, 예를 들면 5 내지 80개 염기를 가지는 핵산서열일 수 있으며, 구체적인 예로서, 서열번호 10 내지 서열번호 11의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 및 서열번호 14 내지 서열번호 15의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일예에서, 상기 조절서열에 포함되는 스페이서 서열은 리보좀 결합 영역과 유전자 코딩 서열의 사이에 위치하며, 통상 3 내지 15 염기를 가지는 핵산분자이며 다양한 종류의 염기 및 길이로 제조될 수 있으며, 스페이서 서열을 조절서열에 포함시켜 하부에 위치하는 유전자의 발현효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 발현하고자 하는 단백질의 코딩서열과 대상 숙주세포의 종류 등을 고려하여 다양한 종류의 핵산조성 및 크기로 제조하여 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 스페이서 서열의 예는 바람직하게는 TTACAAA(서열번호 21)일 수 있으나 이에 한정되는 의도는 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 프로모터 서열은 서열번호 1의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 서열번호 8의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 서열번호 12의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 및 서열번호 16의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 전사 프로모터(transcription promoter)일 수 있다.

본 발명에 있어서, 발현적 폴리뉴클레오타이드 전사를 시키는 것이 가능한 폴리뉴클레오타이드를 포함한 단리핵산 분자를 제공한다. 상기 단리된 핵산 분자는 서열번호 1, 8, 12, 및 16의 핵산서열을 포함하는 핵산분자와 기능 변이체에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 다른 예에서, 상기 기능 변이체는, 서열번호 1, 8, 12, 및 16의 핵산서열과의 서열 동일성이, 적어도 90%, 즉, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90% 이상이다.

상기 프로모터와 그 하부에 위치하는 리보솜 결합 영역을 포함하는 조절서열은 서열번호 2 내지 서열번호 7의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 서열번호 9 내지 서열번호 11의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 서열번호 13 내지 서열번호 15의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 및 서열번호 17 내지 서열번호 19을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 일구체예에 따른 리보좀 결합 영역은 서열번호 20의 핵산서열을 포함하는 핵산분자일 수 있고, 상기 스페이서 서열은 서열번호 21의 핵산서열을 포함하는 핵산분자일 수 있다. 상기 조절서열은, 5'에서 3'방향으로 순차적으로 연결된 서열번호 8의 핵산서열을 갖는 리보좀 결합 영역과 서열번호 9의 핵산서열을 갖는 스페이서 서열로 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조절서열은 서열번호 6 내지 서열번호 7의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 서열번호 11의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 서열번호 15의 핵산서열을 포함하는 핵산분자 및 서열번호 19를 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 구체적인 전사 프로모터를 하기 표 1에 예시적으로 기재한다. 서열번호 1 내지 서열번호 21의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 코리네박테리움속 균주에서 아밀로수크라제 효소를 발현하는 전사 프로모터일 수 있다.

서열 번호	서열(5'-->3')	명명
1	aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tac	S1 promoter (1)
2	aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tac gaaagga	S1 promoter (2)
3	aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tac gaaagga ttttttaccc	S1 promoter (3)
4	aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tac gaaagga ttttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac	S1 promoter (4)
5	aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tac gaaagga ttttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga	S1 promoter (5)
6	aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tac gaaagga ttttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga ttacaaa	S1 promoter (6)
7	tcagaattg gttaattgg ttgtaacac tggcagtga attctcaag tctccacacc accattcgaa acttacaagt gtgaactctg gcggatcaac tagtgaaaag cgtaactaca tggtccttct tgagtatcta ctacgcgtac tgggaacaat cactagtgaat tcgcggccgc gc aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tac gaaagga ttttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga ttacaaa	S1 promoter (7)
8	gagcctgcgg aaactacgca agaacccaaa aatgattaat aattgagaca agcttcccac ttatgtgata aagtcccatt ttgtgaataa ctcttgtctc agtcaaagca cccagtggtg gtgacgcgct aactaagcga cctgacacct caagttgttt tcactttgat gaatttttta aggctc	t2 promoter(1)
9	gagcctgcgg aaactacgca agaacccaaa aatgattaat aattgagaca agcttcccac ttatgtgata aagtcccatt ttgtgaataa ctcttgtctc agtcaaagca cccagtggtg gtgacgcgct aactaagcga cctgacacct caagttgttt tcactttgat gaatttttta aggctc gaaagga	t2 promoter (2)
10	gagcctgcgg aaactacgca agaacccaaa aatgattaat aattgagaca agcttcccac ttatgtgata aagtcccatt ttgtgaataa ctcttgtctc agtcaaagca cccagtggtg gtgacgcgct aactaagcga cctgacacct caagttgttt tcactttgat gaatttttta aggctc gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaattcccggg gaaagga	t2 promoter (3)
11	gagcctgcgg aaactacgca agaacccaaa aatgattaat aattgagaca agcttcccac ttatgtgata aagtcccatt ttgtgaataa ctcttgtctc agtcaaagca cccagtggtg gtgacgcgct aactaagcga cctgacacct caagttgttt tcactttgat gaatttttta aggctc gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaattcccggg gaaagga ttacaaa	t2 promoter (4)
12	tgacaattaa tcatcggctc gtataatgt	t1 promoter (1)
13	tgacaattaa tcatcggctc gtataatgt gaaagga	t1 promoter (2)
14	tgacaattaa tcatcggctc gtataatgt gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaattcccggg gaaagga	t1 promoter (3)
15	tgacaattaa tcatcggctc gtataatgt gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaattcccggg gaaagga ttacaaa	t1 promoter (4)
16	aggataagga ttcttagtgt cggtgcactt ttactgatgt ttcactgtgg aggtcaacga ctcaaagtcg agaattggtg gcgcgtgtca ctggaattga cgcgtgaatg gggtggaagt ggacgtcgaa aagcattttt gagacgttta tgtgagcaat gtcccatttt ccctgctcac ctgtatgggc acccgcggcg gaagtggaat tgcatatgga gttttgatga tatttagcgt aacttaaagg aaca	h1 promoter (1)
17	aggataagga ttcttagtgt cggtgcactt ttactgatgt ttcactgtgg aggtcaacga ctcaaagtcg agaattggtg gcgcgtgtca ctggaattga cgcgtgaatg gggtggaagt ggacgtcgaa aagcattttt gagacgttta tgtgagcaat gtcccatttt ccctgctcac ctgtatgggc acccgcggcg gaagtggaat tgcatatgga gttttgatga tatttagcgt aacttaaagg aaca gaaagga	h1 promoter (2)
18	aggataagga ttcttagtgt cggtgcactt ttactgatgt ttcactgtgg aggtcaacga ctcaaagtcg agaattggtg gcgcgtgtca ctggaattga cgcgtgaatg gggtggaagt ggacgtcgaa aagcattttt gagacgttta tgtgagcaat gtcccatttt ccctgctcac ctgtatgggc acccgcggcg gaagtggaat tgcatatgga gttttgatga tatttagcgt aacttaaagg aaca gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaattcccggg gaaagga	h1 promoter (3)
19	aggataagga ttcttagtgt cggtgcactt ttactgatgt ttcactgtgg aggtcaacga ctcaaagtcg agaattggtg gcgcgtgtca ctggaattga cgcgtgaatg gggtggaagt ggacgtcgaa aagcattttt gagacgttta tgtgagcaat gtcccatttt ccctgctcac ctgtatgggc acccgcggcg gaagtggaat tgcatatgga gttttgatga tatttagcgt aacttaaagg aaca gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaattcccggg gaaagga ttacaaa	h1 promoter (4)
20	gaaagga	Ribosome binding site
21	ttacaaa	Spacer sequence

상기 표 1에서 박스로 표시된 부분은 조절서열 중, 리보솜 결합 영역, 스페이서 서열, 링커 서열 등을 나타낸다.

본 발명에 따른 코리네박테리움속 균주 발현용 프로모터는 그 하부에 연결된 아밀로수크라제 효소를 코리네박테리움속 균주에서 발현할 수 있도록 조절하는 것이다. 대장균 유래의 프로모터는 발현유도인자의 낮은 투과성과 유전자 발현 억제 물질의 부재 등의 이유로 코리네박테리움에서 상대적으로 낮은 활성을 나타낸다. 또한 같은 프로모터라 하더라도 목적단백질을 코딩하는 유전자에 따라 발현 효율이 상이하며, 코리네박테리움에서 사용할 수 있는 프로모터들의 세기 또한 선택의 폭이 작아서 목적에 맞게 발현시스템을 제작하는 것이 용이하지 않다. 또한, 코리네박테리움속 균주 발현용 전사 프로모터일 지라도 특정 목적 단백질에 따라 그 전사조절 활성이 상이할 수 있으며, 이에 본 발명에 따른 전사 프로모터, 조절서열 또는 유전자 발현 카세트는 코리네박테리움속 균주에서 아밀로수크라제 효소를 발현하는 것이 적합하다.

상기 목적 단백질은 코리네박테리움속 균주 발현용 핵산분자의 3'말단에 직접 연결되거나, 링커를 통해 연결될 수 있다.

본 발명에 따른 아밀로수크라제 효소는 효소 발현 및 활성이 우수한 것이 바람직하고, 이에 본 발명의 구체예에서, 전사 프로모터 또는 조절서열은 아밀로수크라제 효소를 코딩하는 유전자와의 조합이 중요하며, 본 발명에 사용된 아밀로수크라제 효소와는 s1, t2, t1, h1 프로모터 모두 적정 이상의 단백질 발현을 제공할 수 있으며, 특히 t2, h1 프로모터의 경우 대장균과 거의 비슷한 수준의 발현을 제공하기 때문에 더욱 바람직하다.

본 발명의 일예에서, 상기 아밀로수크라제 효소는 Neisseria subflava 또는 Neisseria sicca에서 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 Neisseria subflava 유래 펩타이드, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 Neisseria sicca 유래 펩타이드를 포함하는 아밀로수크라제 효소일 수 있다.

상기 아밀로수크라제 효소의 투라노스 전환활성이 유지되는 한, 서열번호 22, 또는 서열번호 24의 아미노산 중 일부가 치환, 삽입 및/또는 결실된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 단백질은 서열번호 22 또는 서열번호 24 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열은 Neisseria subflava 또는 Neisseria sicca에서 얻어진 아밀로수크라제 효소의 암호화 핵산서열일 수 있다.

예를 들면, 상기 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열은, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 핵산서열, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 핵산서열일 수 있다. 구체적으로, 상기 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열은, 서열번호 23 및 서열번호 25로 이루어지는 군에서 선택된 핵산서열을 포함하는 핵산분자일 수 있다. 또는 상기 핵산서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은 서열번호 23 또는 25의 핵산서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 서열이 서열번호 23 또는 25의 핵산서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명의 일예에서, 상기 유전자 발현 카세트는 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열과, 그 상류(upstream)에 작동 가능하도록 연결되며 코리네박테리움속 균주에서 상기 아밀로수크라제 효소의 발현을 조절하는 조절서열을 포함하며, 상기 조절서열은 s1, t2, t1, h1 프로모터를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1 내지 서열번호 19의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드이고, 상기 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열은 서열번호 22 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 핵산서열일 수 있다.

일예로서, 상기 조절서열이 s1 프로모터를 포함하는 경우, 상기 유전자 발현 카세트는 서열번호 1 내지 서열번호 7의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드이고,

상기 조절서열이 t2 프로모터를 포함하는 경우, 상기 유전자 발현 카세트는 서열번호 8 내지 서열번호 11의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드이고,

상기 조절서열이 t1 프로모터를 포함하는 경우, 상기 유전자 발현 카세트는 서열번호 12 내지 서열번호 15의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드이고,

상기 조절서열이 h1 프로모터를 포함하는 경우, 상기 유전자 발현 카세트는 서열번호 16 내지 서열번호 19의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드이다.

당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드의 핵산서열 중 하나 또는 그 이상의 염기를 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 실질적 상동성을 갖는 범위에서 동일한 활성을 갖는 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일 예에서, Neisseria subflava에서 유래한 것으로, 수크로스 단독 또는 수크로스와 프럭토스의 혼합 원료로부터 투라노스를 생산하는 활성을 가지는 단백질(NsAS)이 제공된다. 예컨대, 상기 단백질은 서열번호 22 의 아미노산 서열을 가지며 수크로스 단독 또는 수크로스와 프럭토스의 혼합 원료로부터 투라노스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 핵산서열, 또는 서열번호 23의 핵산서열을 포함할 수 있다.

상기 단백질의 최적 온도는 효소를 불활성화하지 않는 온도이면 어떠한 온도이든 상관없지만, 특히 약 40℃의 온도까지, 바람직하게는 20 내지 40℃의 온도가 바람직하다. 또한 상기 단백질의 최적 pH는 약 6.0 내지 9.0일 수 있지만, 바람직하게는 6.5 내지 7.5일 수 있다. 효소반응 시 반응시간은 효소반응 조건 하에서 달라질 수 있지만, 100-400 units/L의 정제 아밀로수크라제를 사용할 경우 24 내지 120 시간에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일 예에서, Neisseria sicca에서 유래한 것으로, 과당으로부터 투라노스를 생산하는 활성을 가지는 단백질(NsiAS)이 제공된다. 예컨대, 상기 단백질은 서열번호 24의 아미노산 서열을 가지며 수크로스 단독 또는 수크로스와 프럭토스의 혼합 원료로부터 투라노스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다.

상기 아밀로수크라제를 암호화하는 핵산서열은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 핵산서열 또는 서열번호 25의 핵산서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 발현 카세트는 복제 기점, 리더(leader), 선택 가능한 마커, 클로닝 부위 및 제한효소 인식부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 추가 예는, 본 발명에 따른 코리네박테리움속 균주 발현용 전사 프로모터, 이를 포함하는 조절서열, 또는 상기 조절서열과 및 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 코리네박테리움속 균주용 유전자 발현 카세트를 제공한다.

상기 코리네박테리움속 균주 발현용 핵산분자, 및 조절서열과 아밀로수크라제 효소는 상술한 바와 같다.

본 발명의 일예에서, 상기 발현 카세트는 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 서열로서, 복제 기점, 리더(leader), 선택 가능한 마커, 클로닝 부위 및 제한효소 인식부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 상기한 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 특히 바람직하게는 본 발명의 적어도 하나의 발현 카세트를 운반하는 벡터, 특히 셔틀 벡터 또는 플라스미드 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 미생물, 특히 코리박테리움속 균주에 관한 것이다.

상기 재조합 벡터는 당업계에 널리 알려진 방법을 통해 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다(Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:411-421). 상기 재조합 벡터는 유전자 재조합에 이용되어온 벡터라면 모두 사용이 무방하며, 예컨대, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

예컨대, 상기 재조합 벡터는 pET, pKK223-3, pTrc99a, pKD, pXMJ19, pCES208 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것으로부터 제작된 것일 수 있으며, 바람직하게는 E.coli-corynebacterium shuttle vector (pCES208, J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체로, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터란 작동 가능하도록 연결된 목적 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 목적 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 및 전사 종결인자 등으로 이루어지는 하나 이상의 전사 조절 요소와 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다.

상기 전사 종결인자는 rrnB, rrnB_T1, rrnB_T2, T7 terminator 등 일수 있으며, 바람직하게는 pET21a vector로부터 PCR된 T7 전사 종결인자일 수 있다.

본 발명의 일예는 상기 유전자 발현 카세트를 포함하거나, 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움속 숙주세포일 수 있다.

상기 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 모든 형질전환 방법 특별한 제한 없이 선택하여 사용할 수 있으며, 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기 천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등 선택된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환 코리네박테리움속 균주는 높은 안정성을 가지며, 도입된 아밀로수크라제 효소를 과발현할 수 있으며, 따라서 장기간 안정적으로 높은 투라노스 전환능을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 코리네박테리움속 균주는 투라노스 제조에 유용하게 적용될 수 있으며, 투라노스 생산 수율을 보다 증진시킬 수 있다.

바람직한 코리박테리움속 균주는 코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스 (thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라쎄콜라 (melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스 (efficiens) 종 세균이다.

본 발명에 따른 형질전환된 재조합 코리네박테리움속 숙주세포는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

상기 코리네박테리움속 균주의 배양은 적당한 배지에서 당업계에서 알려진 다양한 배양 방법으로 수행될 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함된다. 상기 유가식 배양에는 주입 배치 및 반복 주입 배치 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및(또는) 미량 원소를 포함한다. 바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당류이다. 질소 공급원은 일반적으로 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 이들 화합물을 포함하는 물질이다. 질소 공급원의 예로는 암모니아 기체 또는 암모늄 염, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄, 니트레이트, 우레아, 아미노산, 또는 복합 질소 공급원, 예컨대 옥수수 침지액, 대두 분말, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등이 있다. 질소 공급원은 단독으로 또는 혼합물로 사용할 수 있다. 배지에 존재할 수 있는 무기염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브데늄, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화물, 인산염 또는 황산염을 포함한다. 인 공급원으로서, 인산, 인산2수소 칼륨 또는 인산수소 2칼륨, 또는 대응하는 나트륨-함유 염을 사용할 수 있다. 용액 중 금속 이온을 유지시키기 위해 배지에 킬레이팅제를 첨가할 수 있다. 배지의 모든 성분은 가열 (1.5 bar 및 121 ℃에서 20분) 또는 멸균 여과에 의해 멸균시킨다. 이 성분들은 함께, 또는 필요에 따라 개별적으로 멸균시킬 수 있다. 배지의 모든 성분은 배양 시작 시에 존재할 수 있거나, 임의로는 연속 또는 배치식으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예는, 형질전환 코리네박테리움속 균주를 이용하여 얻어진 아밀로수크라제 효소, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 투라노스 생산용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 재조합 코리네박테리움속 숙주세포를 이용하여 얻어진 아밀로수크라제 효소, 상기 세포의 균체, 상기 세포의 배양물, 상기 세포의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 투라노스 생산용 조성물을 수크로스 단독 또는 수크로스와 프럭토스의 혼합물과 접촉하여 투라노스를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 배양물은 상기 코리네박테리움속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주의 상기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 무세포(cell-free) 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 코리네박테리움속 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 코리네박테리움속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 투라노스의 제조에 사용되는 코리네박테리움속 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.

상기 투라노스 생산 방법은 상기 아밀로수크라제 효소, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 수크로스 단독, 또는 수크로스 및 프럭토스 혼합물 원료와 반응시키는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 상기 코리네박테리움속 균주를 기질과 반응시키는 단계는 상기 코리네박테리움속 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 코리네박테리움속 균주를 과당과 반응시키는 단계는 상기 균주(균체, 균주의 배양물, 및/또는 균주의 파쇄물)를 과당과 접촉시키는 단계, 예컨대, 상기 균주를 기질과 혼합하는 단계 또는 상기 균주가 고정화된 담체에 기질을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 코리네박테리움속 균주를 수크로스와 프럭토스 용액과 반응시킴으로써 수크로스를 투라노스로 전환하여 수크로스로부터 투라노스를 생산할 수 있다.

상기 아밀로수크라제 효소를 반응시키는 단계는 상기 효소, 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 수크로스 단독, 또는 수크로스 및 프럭토스 혼합물 원료와 혼합하거나, 상기 효소가 고정화된 담체에 원료를 접촉시켜 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 투라노스 제조방법에서, 기질로서 수크로스 단독으로 사용 시에 전화율과 투라노스 생산량을 고려하면 수크로스 기질의 농도가 높을수록 유리하지만 수크로스의 용해도를 고려하여 적절한 범위로 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 일예에서, 기질인 수크로스 기질의 농도는 1.0M 내지 2.5M 범위로 사용할 수 있다. 수크로스와 프럭토스의 혼합 원료를 사용하는 경우, 적절한 혼합농도는 수크로스 농도가 바람직하게는 1.5 M 내지 2.5 M, 예를 들면 1.5M, 1.6M, 1.7M, 1.8M, 1.9M, 2.0M,2.1M, 2.2M, 2.3M, 2.4M 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2.0M 일 수 있고, 프럭토스 농도가 바람직하게는 0.5 M 내지 1.5 M , 예를 들면 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M, 0.9M, 1.0M, 1.1M, 1.2M, 1.3M, 1.4M, 1.5M, 더욱 바람직하게는 0.75M일 수 있다. 본 발명의 구체적 일예에서, 수크로스와 프럭토스의 혼합원료는, 수크로스 2.5M stock 800ul와 5M 프럭토스 stock 150ul를 혼합하여 기질을 만든 후 50ul 용량의 효소를 첨가하여 total 1ml의 반응액을 사용할 수 있다.

수크로스와 프럭토스의 혼합비는 바람직하게는 5:1 내지 1:1 중량비일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3:1 내지 2:1 중량비일 수 있다. 상기 범위보다 프럭토스의 혼합비가 낮으면 투라노스 이외의 부산물이 과잉 생산될 수 있는 문제가 있을 수 있고, 높으면 투라노스의 생산을 위한 효소 활성에 영향을 미쳐서 생산성이 낮아질 수 있어서, 상기 범위가 바람직하다.

상기 투라노스 생산 방법에 있어서, 효율적인 투라노스 생산을 위하여, 사용되는 기질은 수크로스 단독 또는 상기 수크로스에 프럭토스를 추가적으로 보강하여 사용할 수 있다. 사용된 수크로스 및 프럭토스의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 기질로서 0.25M 또는 0.75M 프럭토스로 보강된 1.0M 또는 2.5M 수크로스 용액 상에서 작용될 때에도 상기 효소는 반응하여 투라노스를 생산할 수 있다. 또한, 상당히 고농도의 기질 또는 용해되지 않은 기질을 지닌 용액을 사용할 수도 있다. 상기 기질용액은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

상기 투라노스 생산방법에 있어서, 상기 반응은 pH 6.0 내지 9.0, pH 6.0 내지 8.0, 또는 pH 8.0 내지 9.0의 조건 하에서 수행될 수 있지만, 바람직하게는 6.5 내지 7.5일 수 있다. 또한, 상기 반응은 20℃ 이상, 예컨대 40℃ 이상의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다. 온도가 높아질수록 기질의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반응은 40 내지 80℃, 예컨대, 50 내지 75℃, 60 내지 75℃, 또는 68 내지 75℃의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한 상기 반응 시간이 길수록 투라노스 전환률이 높아진다. 예컨대, 상기 반응 시간은 24시간 이상, 예컨대 48시간 이상, 72시간 이상, 96시간 이상, 120시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반응시간이 144시간을 넘어가면 투라노스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반응시간은 144 시간을 넘기지 않는 것이 좋다. 상기 조건은 투라노스 전환 효율이 최대화되는 조건으로서 선정된 것이다.

또한, 상기 투라노스 생산 방법에 있어서, 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반응물 기준으로 5 mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 5 내지 100mg(dcw)/ml, 10 내지 90mg(dcw)/ml, 20 내지 80mg(dcw)/ml, 30 내지 70 mg(dcw)/ml, 40 내지 60 mg(dcw)/ml, 또는 45 내지 55 mg(dcw)/ml일 수 있다. 균체 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 투라노스 전환 활성이 낮거나 거의 없고, 상기 범위를 초과하면 균체가 너무 많아져서 투라노스 전환 반응의 전체적인 효율이 낮아지므로, 균체 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다.

상기 담체는 고정된 균주, 또는 상기 균주로부터 생산되는 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체일 수 있다. 예컨대, 상기 담체로서 알긴산나트륨(soduim alginate)을 사용할 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량 면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되어, 균주 또는 효소가 안정적으로 고정되어 우수한 투라노스 수율을 나타내는 데 유리할 수 있다.

일 구체예에서, 투라노스의 수율을 보다 증진시키기 위하여 1.5 내지 4.0%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액(예컨대, 알긴산나트륨 수용액), 예컨대 약 2.5%의 (w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액을 균주의 고정화에 사용할 수 있다. 예컨대, 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양액, 또는 상기 균주의 파쇄물의 1 내지 2 부피배의 알긴산나트륨 수용액에 상기 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물을 첨가하여 혼합한 후, 상기 얻어진 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 약 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 함으로써, 알긴산나트륨 담체에 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물이 고정화시킬 수 있다. 상기 효소는 상기 균주, 균주 배양물 또는 상기 균주의 파쇄물로부터 통상의 방법, 예컨대 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 친화 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등의 방법에 의하여 정제된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계는 상기 효소 단백질을 과당과 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 접촉시키는 단계는, 예컨대, 상기 효소 단백질 등을 기질과 혼합하는 단계 또는 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담 체에 기질을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서 상기 효소 단백질 등을 기질과 반응시키는 단계는 상기 재조합 균주의 균체를 기질-함유 원료화 접촉하여 적정온도에서 반응을 시켜 수행할 수 있다. 이와 같이 상기 효소 단백질 등을 수크로스 단독 또는 수크로스와 프럭토스의 혼합 원료와 반응시킴으로써 수크로스를 투라노스로 전환하여 수크로스로부터 투라노스를 생산할 수 있다.

상기 효율적인 투라노스 생산을 위하여, 사용되는 효소 단백질의 양은 전체 반응물 기준으로 100-400 units/L일 수 있다. 효소의 사용량이 상기 농도보다 낮으면 투라노스 전환 효율이 낮아 질 수 있고, 상기 농도보다 높으면 산업에서의 경제성이 낮아지므로 상기 범위가 적당하다.

상기 효율적인 투라노스 생산을 위하여, 기질로서 사용하는 용액은 0.25M 또는 0.75M 프럭토스로 보강된 1.0M 또는 2.5M 수크로스 용액일 수 있다. 상기 과당은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

상기 효소 단백질의 최적 조건을 고려하여 반응 pH, 반응온도 및 효소의 농도 등을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예컨대, 상기 반응 pH는 pH 6 내지 9, 반응온도는 온도가 60℃을 넘으면 기질의 갈변 현상 및 효소의 활성저해 현상이 일어날 수 있으므로, 20℃ 내지 60℃, 예컨대 더욱 바람직하게는 35℃ 내지 50℃의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한, 효소 농도에 따라서 달라지지만, 대체적으로 반응시간이 길수록 투라노스 전환률이 높아진다. 예컨대, 효소의 열안정성(예컨대, 35 ℃에서의 열안정성)을 고려하여, 상기 반응 시간은 24시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반응시간이 144시간을 넘어가면 투라노스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반응시간은 144시간을 넘기지 않는 것이 좋다.

또한, 상기 투라노스 생산 방법에 있어서, 재조합 균주를 사용하는 경우, 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반응물을 기준으로 0.1 mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상일 수 있다.

다른 일 구현 예에 있어서, 상기 투라노스의 생산 방법은 아밀로수크라제 효소를 발현하는 재조합 균주 또는 상기 재조합 균주로부터 분리된 효소 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 투라노스 생산 방법은 상기 반응 단계 이전에 아밀로수크라제 효소를 발현하는 재조합 균주를 배양 및 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여 수크로스으로부터 수득된 투라노스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명은 수크로스 단독 또는 수크로스와 프럭토스의 혼합 원료를 이용하여 투라노스를 대량 제조하여 식품소재로 사용할 수 있도록 GRAS 균주인 코리네박테리움속 균주에서 아밀로수크라제 효소를 발현하는 유전자 발현 시스템, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 코리네박테리움속 균주를 제공하며, 상기 유전자 발현 시스템를 이용하여 생산된 아밀로수크라제 효소를 이용하여 수크로스 단독 또는 수크로스와 프럭토스의 혼합 원료를 이용하여 투라노스를 생산할 수 있다.

도 1a 내지 1d, 또는 2a 내지 2d는 본 발명의 일 실시예의 아밀로수크라제 효소 단백질을 corynebacterium glutamicum에서 발현하기 위한 재조합 벡터의 개열 지도로서, 도 1a는 재조합 벡터(pCES_s1NsAS), 도 1b는 재조합 벡터(pCES_t2NsAS), 도 1c는 재조합 벡터(pCES_t1NsAS), 도 1d는 재조합 벡터(pCES_h1NsAS), 도 2a는 재조합 벡터(pCES_s1NsiAS), 도 2b는 재조합 벡터(pCES_t2NsiAS), 도 2c는 재조합 벡터(pCES_t1NsiAS), 도 2d는 재조합 벡터(pCES_h1NsiAS)를 각각 나타낸 것이다.
도 3은 일 실시예의 Bead beater를 이용하여 배양한 세포를 용해시킨 후 SDS-PAGE를 통해 단백질의 발현량을 비교한 사진이다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정된 것이 아니다.

실시예 1. 플라스미드의 제조

실시예 1-1: s1 프로모터를 이용한 벡터제조

Neisseria subflava로부터 유래된 아밀로수크라제 효소의 암호화 유전자를 합성하여 NsAS라 명명하였다. 합성 유전자 NsAS와 pET21a 벡터로부터 확보한 T7 터미네이터를 피씨알(PCR)을 통해 각각의 주형으로 확보하였고, 이를 오버랩 피씨알(PCR) 법으로 하나의 주형으로 연결하여 T-vector cloning을 통해 pGEM T-easy vector에 클로닝하여 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인하였으며, 구체적으로 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 23의 NsAS 서열 및 T7-터미네이터를 포함한다.

상기 확인된 전체 폴리뉴클레오티드를 제한효소 BglII와 SalI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pCES208(J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pCES208/아밀로수크라제 효소(pCES_s1NsAS)를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터(pCES_s1NsAS)의 개열지도를 도 1a에 개시하였다.

실시예 1-2: t2 프로모터를 이용한 벡터제조

pCES_s1NsAS 이외 목적단백질의 발현 및 활성 비교를 위해 클로닝을 진행하기 위해 다음과 같은 플라스미드 역시 제조하였다:

코리네박테리움 gDNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 t2 promoter를 PCR로 유전자 삽입체(insert-서열번호 8)를 확보하여, 실시예 1에서 확보한 pCES_s1NsAS에 XbaI, BglII site로 클로닝하여 pCES_t2NsAS를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터(pCES_t2NsAS)의 개열지도를 도 1b에 개시하였다.

실시예 1-3: t1 프로모터를 이용한 벡터제조

pKK223-3 벡터를 주형으로 하여 t1 promoter를 PCR로 유전자 삽입체(insert-서열번호 12)를 확보하여, 실시예 1에서 확보한 pCES_s1NsAS에 XbaI, BglII site로 클로닝하여 pCES_t1NsAS를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터(pCES_t1NsAS)의 개열지도를 도 1c에 개시하였다.

실시예 1-4: h1 프로모터를 이용한 벡터제조

코리네박테리움 gDNA를 주형으로 하여 h1 promoter를 PCR로 유전자 삽입체(insert-서열번호 16)를 확보하여, 실시예 1에서 확보한 pCES_s1NsAS에 XbaI, BglII site로 클로닝하여 pCES_h1NsAS를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터(pCES_h1NsAS)의 개열지도를 도 1d에 개시하였다.

실시예 2. 플라스미드의 제조

실시예 2-1: s1 프로모터를 이용한 벡터제조

Neisseria sicca로부터 유래된 아밀로수크라제 효소의 암호화 유전자를 합성하여 NsiAS라 명명하였다. 합성 유전자 NsiAS와 pET21a 벡터로부터 확보한 T7 터미네이터를 피씨알을 통해 각각의 주형으로 확보하였고, 이를 오버랩 피씨알(PCR) 법으로 하나의 주형으로 연결하여 T-vector cloning을 통해 pGEM T-easy vector에 클로닝하여 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인하였으며, 구체적으로 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 25의 NsiAS 서열 및 T7-터미네이터를 포함한다.

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상기 확인된 전체 폴리뉴클레오티드를 제한효소 BglII와 SalI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pCES208(J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pCES208/아밀로수크라제 효소(pCES_s1NsiAS)를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터(pCES_s1NsiAS)의 개열지도를 도 2a에 개시하였다.

실시예 2-2: t2 프로모터를 이용한 벡터제조

pCES_s1NsiAS 이외 목적단백질의 발현 및 활성 비교를 위해 클로닝을 진행하기 위해 다음과 같은 플라스미드 역시 제조하였다:

코리네박테리움 gDNA를 주형으로 하여 t2 promoter를 PCR로 insert(서열번호 8)를 확보하여, 실시예 1에서 확보한 pCES_s1NsiAS에 XbaI, BglII site로 클로닝하여 pCES_t2NsiAS를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터(pCES_t2NsiAS)의 개열지도를 도 2b에 개시하였다.

실시예 2-3: t1 프로모터를 이용한 벡터제조

pKK223-3 벡터를 주형으로 하여 t1 promoter를 PCR로 insert(서열번호 12)를 확보하여, 실시예 1에서 확보한 pCES_s1NsiAS에 XbaI, BglII site로 클로닝하여 pCES_t1NsiAS를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터(pCES_t1NsiAS)의 개열지도를 도 2c에 개시하였다.

실시예 2-4: h1 프로모터를 이용한 벡터제조

코리네박테리움 gDNA를 주형으로 하여 h1 promoter를 PCR로 insert(서열번호 16)를 확보하여, 실시예 1에서 확보한 pCES_s1NsiAS에 XbaI, BglII site로 클로닝하여 pCES_h1NsiAS를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터(pCES_h1NsiAS)의 개열지도를 도 2d에 개시하였다.

실시예 3. 숙주세포 형질전환

실시예 1 및 2에서 제작한 8 종류의 플라스미드를 전기천공법(electroporation)을 사용하여 코리네박테리움 글루타리쿰을 형질전환시켰다. 콜로니를 picking하여 카나마이신(Kanamycin)을 최종농도 15ug/ml로 첨가한 LB 배지(트립톤 10g/L, NaCl 10g/L, 효모 추출물 5g/L) 4ml에 접종한 후, 배양조건 30? 및 250rpm에서 약 16시간 동안 배양하였다.

그리고 나서 상기 배양액 중 1ml을 수득하여 15ug/ml의 카나마이신을 포함하고 있는 100ml LB 배지에 접종하여 본 배양을 16시간 이상 진행하였다.

실시예 4. 목적단백질 발현 확인

균질기(Beadbeater)를 이용하여 배양한 세포를 용해(lysis)시킨 후 상등액만 취득하여 샘플버퍼와 1 : 1 부피비로 혼합 후 100 ℃에서 5분간 가열한다. 준비한 샘플은 12% SDS-PAGE gel (조성 : running gel - 3.3 ml H₂O, 4.0 ml 30% acrylamide, 2.5 ml 1.5M Tris buffer(pH 8.8), 100 ㎕ 10% SDS, 100 ㎕, 10% APS, 4 ㎕ TEMED / stacking gel - 1.4 ml H₂O, 0.33 ml 30% acrylamide, 0.25 ml 1.0M Tris buffer(pH 6.8), 20 ㎕ 10% SDS, 20 ㎕ 10% APS, 2 ㎕ TEMED)에 180V로 50분 가량 전기영동하여 단백질 발현을 확인한다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 일 실시예의 균질기(Bead beater)를 이용하여 배양한 세포를 용해시킨 후 SDS-PAGE를 통해 단백질의 발현량을 비교한 사진이다.

NsAS 및 NsiAS의 발현을 SDS-PAGE gel상에서 확인 후 정확한 발현량의 측정을 위해 Ni-NTA resin을 이용한 His-tag정제 진행하여, 계산식(발현율(%) = (Purified protein(mg) / Total soluble protein(mg)) * 100)을 이용하여 발현율 계산하여 다음 표 2에 나타내었다. 상기 표 2에서, 균주 내 전체 단백질은 아밀로수크라제 효소를 발현하는 코리네박테리움 균주 내부에 포함된 전체 단백질이고, 아밀로수크라제 효소는 그 중 아밀로수크라제 효소만을 정제하여 확보한 것이다. 따라서 발현율은 코리네박테리움 균주에 존재하는 전체 단백질에서 목적단백질이 어느 정도 비율로 발현되는지 계산한 값이다.

목적 단백질	Promoter 유래	균주내 전체 단백질 (mg)	아밀로수크라제 효소(mg)	발현율 (%)
NsAS	s1	9.54	0.93	9.7
	t2	8.55	1.91	22.3
	t1	9.81	2.27	23.1
	h1	7.53	1.67	22.1
NsiAS	s1	8.42	0.47	5.54
	t2	9.43	1.28	13.63
	t1	8.95	1.15	12.84
	h1	8.51	1.18	13.85

실시예 5. 세포 파쇄물을 이용한 투라노스 생산

2M 수크로스와 0.75M 프럭토스를 함유하는 원료에, 실시예 3에서 얻어진 아밀로수크라제 효소 발현 세포 중 pCES_h1NsiAS를 발현시킨 세포를 2mg/ml의 농도로 pH 7.0 Tris-HCl 50mM에 혼탁한 후 균질기(Beadbeater)를 이용하여 배양한 세포를 용해(lysis)시켜 상등액만 취득하여 35℃ 조건에서 반응을 진행한 후에 100 ℃에서 5분간 끓여서 반응 중지하였다. 각각의 세포 상등액을 이용하여 상기 조건에서 전환반응을 진행하고, 반응시간 별로 샘플링 한 후에 투라노스 생산을 확인하였다.

상기 얻어진 생산물을 확인하고자, 액체 크로마토그래피 (LC) 분석을 통해 기질(수크로스, 프럭토스)과 생산물질(투라노스)의 피크를 확인하였다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하여 (Agilent 1260 RID) 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80℃, 유속은 0.6ml/min로 하였다.

상기 얻어진 결과로써 반응시간 별 시료 분석 결과를 표 3 에 나타내었다.

반응시간 (hr)	당조성 (%)
	수크로스	투라노스	트레할룰로스	프럭토스	그 외 당류
24	78.3	-	1.7	18.9	1.1
48	59.3	14.8	3.3	19.7	2.9
72	37.7	29.5	4.3	20.9	7.6
96	18.7	43.2	4.9	22.3	10.9
192	-	54.5	5.8	25.1	14.6

상기 표 3에 나타난 것과 같이, 시간이 지날수록 기질로 사용된 수크로스는 줄어들고 생산물로서 투라노스가 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 표3과 같이 상등액 반응을 했을 때 '반응 안정성'이 높은 효과가 있었다. 따라서, 본 발명은 투라노스를 GRAS 균주에서 발현하여 안전한 식품원료로 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 높은 반응 안정성을 가지고 장기간 반응을 지속적으로 가능한 것은 산업의 대량생산에 매우 유리하다.

<110> SAMYANG GENEX CORPORATION <120> Expression system for amylosucrase and production for turanose using the same <130> DPP20163019KR <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 283 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> s1 promoter (1) <400> 1 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tac 283 <210> 2 <211> 290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> s1 promoter (2) <400> 2 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc 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Sequence <220> <223> s1 promoter (5) <400> 5 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaagga 349 <210> 6 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> s1 promoter (6) <400> 6 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggat tacaaa 356 <210> 7 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> s1 promoter (7) <400> 7 tcagaattgg ttaattggtt gtaacactgg cagtgaattc tcaagtctcc acaccaccat 60 tcgaaactta caagtgtgaa ctctggcgga tcaactagtg aaaagcgtaa ctacatggtc 120 cttcttgagt atctactacg cgtactggga acaatcacta gtgaattcgc ggccgcgcaa 180 gcgcctcatc agcggtaacc atcacgggtt cgggtgcgaa aaaccatgcc ataacaggaa 240 tgttcctttc gaaaattgag gaagccttat gcccttcaac cctacttagc tgccaattat 300 tccgggcttg tgacccgcta cccgataaat aggtcggctg aaaaatttcg ttgcaatatc 360 aacaaaaagg cctatcattg ggaggtgtcg caccaagtac ttttgcgaag cgccatctga 420 cggattttca aaagatgtat atgctcggtg cggaaaccta cgaaaggatt ttttacccat 480 ggctgtatac gaactcccag aactcgacta cgcatacgac gaaaggatta caaa 534 <210> 8 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> t2 promoter (1) <400> 8 gagcctgcgg aaactacgca agaacccaaa aatgattaat aattgagaca agcttcccac 60 ttatgtgata aagtcccatt ttgtgaataa ctcttgtctc agtcaaagca cccagtggtg 120 gtgacgcgct aactaagcga cctgacacct caagttgttt tcactttgat gaatttttta 180 aggctc 186 <210> 9 <211> 193 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> t2 promoter (2) <400> 9 gagcctgcgg aaactacgca agaacccaaa aatgattaat aattgagaca agcttcccac 60 ttatgtgata aagtcccatt ttgtgaataa ctcttgtctc agtcaaagca cccagtggtg 120 gtgacgcgct aactaagcga cctgacacct caagttgttt tcactttgat gaatttttta 180 aggctcgaaa gga 193 <210> 10 <211> 243 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> t2 promoter (3) <400> 10 gagcctgcgg aaactacgca agaacccaaa aatgattaat aattgagaca agcttcccac 60 ttatgtgata aagtcccatt ttgtgaataa ctcttgtctc agtcaaagca cccagtggtg 120 gtgacgcgct aactaagcga cctgacacct caagttgttt tcactttgat gaatttttta 180 aggctcgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagaatt cccggggaaa 240 gga 243 <210> 11 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> t2 promoter (4) <400> 11 gagcctgcgg aaactacgca agaacccaaa aatgattaat aattgagaca agcttcccac 60 ttatgtgata aagtcccatt ttgtgaataa ctcttgtctc agtcaaagca cccagtggtg 120 gtgacgcgct aactaagcga cctgacacct caagttgttt tcactttgat gaatttttta 180 aggctcgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagaatt cccggggaaa 240 ggattacaaa 250 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> t1 promoter (1) <400> 12 tgacaattaa tcatcggctc gtataatgt 29 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> t1 promoter (2) <400> 13 tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg aaagga 36 <210> 14 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> t1 promoter (3) <400> 14 tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatcacacag 62 gaaacagaat tcccggggaa agga 84 <210> 15 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> t1 promoter (4) <400> 15 tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatcacacag 62 gaaacagaat tcccggggaa aggattacaa a 93 <210> 16 <211> 254 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h1 promoter (1) <400> 16 aggataagga ttcttagtgt cggtgcactt ttactgatgt ttcactgtgg aggtcaacga 60 ctcaaagtcg agaattggtg gcgcgtgtca ctggaattga cgcgtgaatg gggtggaagt 120 ggacgtcgaa aagcattttt gagacgttta tgtgagcaat gtcccatttt ccctgctcac 180 ctgtatgggc acccgcggcg gaagtggaat tgcatatgga gttttgatga tatttagcgt 240 aacttaaagg aaca 254 <210> 17 <211> 261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h1 promoter (2) <400> 17 aggataagga ttcttagtgt cggtgcactt ttactgatgt ttcactgtgg aggtcaacga 60 ctcaaagtcg agaattggtg gcgcgtgtca ctggaattga cgcgtgaatg gggtggaagt 120 ggacgtcgaa aagcattttt gagacgttta tgtgagcaat gtcccatttt ccctgctcac 180 ctgtatgggc acccgcggcg gaagtggaat tgcatatgga gttttgatga tatttagcgt 240 aacttaaagg aacagaaagg a 261 <210> 18 <211> 311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h1 promoter (3) <400> 18 aggataagga ttcttagtgt cggtgcactt ttactgatgt ttcactgtgg aggtcaacga 60 ctcaaagtcg agaattggtg gcgcgtgtca ctggaattga cgcgtgaatg gggtggaagt 120 ggacgtcgaa aagcattttt gagacgttta tgtgagcaat gtcccatttt ccctgctcac 180 ctgtatgggc acccgcggcg gaagtggaat tgcatatgga gttttgatga tatttagcgt 240 aacttaaagg aacagtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaattcc 300 cggggaaagg a 311 <210> 19 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h1 promoter (4) <400> 19 aggataagga ttcttagtgt cggtgcactt ttactgatgt ttcactgtgg aggtcaacga 60 ctcaaagtcg agaattggtg gcgcgtgtca ctggaattga cgcgtgaatg gggtggaagt 120 ggacgtcgaa aagcattttt gagacgttta tgtgagcaat gtcccatttt ccctgctcac 180 ctgtatgggc acccgcggcg gaagtggaat tgcatatgga gttttgatga tatttagcgt 240 aacttaaagg aacagtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaattcc 300 cggggaaagg agaaaggatt acaaa 325 <210> 20 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ribosome binding site <400> 20 gaaagga 7 <210> 21 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer sequence <400> 21 ttacaaa 7 <210> 22 <211> 636 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of amyloscurase from Neisseria subflava <400> 22 Met Leu Thr Gln Thr Gln Gln Val Asp Leu Thr Leu His His Leu Lys 1 5 10 15 Glu Arg Thr Leu Ser Ile Tyr Thr Pro Glu Gln Arg Ala Ser Ile Glu 20 25 30 Thr Ser Glu Asp Trp Lys Gln Phe Asp Arg Arg Leu Glu Glu His Phe 35 40 45 Pro Lys Leu Met His Glu Leu Asp Asn Val Tyr Asn Asn Asn Glu Ala 50 55 60 Val Leu Pro Met Leu Glu Gln Leu Ile Ala Gln Ala Trp Gln Ser Tyr 65 70 75 80 Ser Gln Arg Asn Ser Ser Leu Lys Asp Ile Asp Ile Ala Arg Glu Asn 85 90 95 Asp Pro Asp Trp Ile Leu Ser Asn Lys Gln Val Gly Gly Gly Cys Tyr 100 105 110 Val Asp Leu Phe Ala Gly Asp Leu Gln Gly Leu Lys Ala Lys Ile Pro 115 120 125 Tyr Phe Gln Glu Leu Gly Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Phe 130 135 140 Lys Cys Pro Glu Gly Lys Ser Asp Gly Gly Tyr Ala Val Ser Ser Tyr 145 150 155 160 Arg Asp Val Asn Pro Ala Leu Gly Thr Ile Asp Asp Leu Arg Asp Val 165 170 175 Ile Ala Ala Leu His Glu Ala Gly Ile Ser Ala Val Val Asp Phe Ile 180 185 190 Phe Asn His Thr Ser Asn Glu His Glu Trp Ala Lys Arg Cys Ala Ala 195 200 205 Gly Asp Pro Leu Tyr Asp Asn Phe Tyr Tyr Ile Phe Pro Asp Arg Trp 210 215 220 Met Pro Asp Gln Tyr Asp Arg Thr Leu Arg Glu Ile Phe Pro Asp Gln 225 230 235 240 His Pro Gly Gly Phe Ser Gln Leu Glu Asp Gly Arg Trp Val Trp Thr 245 250 255 Thr Phe Asn Ser Phe Gln Trp Asp Leu Asn Tyr Ser Asn Pro Trp Val 260 265 270 Phe Arg Ala Met Ala Gly Glu Met Met Phe Leu Ala Asn Leu Gly Val 275 280 285 Asp Ile Leu Arg Met Asp Ala Val Ala Phe Ile Trp Lys Gln Met Gly 290 295 300 Thr Ser Cys Glu Asn Leu Pro Gln Ala His Ala Leu Ile Arg Ala Phe 305 310 315 320 Asn Ser Val Met Arg Ile Ala Ala Pro Ala Val Phe Phe Lys Ser Glu 325 330 335 Ala Ile Val His Pro Asp Gln Val Val Gln Tyr Ile Ser Gln Asp Glu 340 345 350 Cys Gln Ile Gly Tyr Asn Pro Leu Gln Met Ala Leu Leu Trp Asn Thr 355 360 365 Leu Ala Thr Arg Glu Val Asn Leu Leu His Gln Ala Leu Thr Tyr Arg 370 375 380 His Asn Leu Pro Asp His Thr Ala Trp Val Asn Tyr Val Arg Ser His 385 390 395 400 Asp Asp Ile Gly Trp Thr Phe Ala Asp Glu Asp Ala Ser Gln Phe Gly 405 410 415 Ile His Gly Tyr Asp His Arg Gln Phe Leu Asn Arg Phe Phe Val Asn 420 425 430 His Phe Asp Gly Ser Phe Ala Arg Gly Val Pro Phe Gln Tyr Asn Pro 435 440 445 Ser Thr Gly Asp Cys Arg Val Ser Gly Thr Ala Ala Ala Leu Val Gly 450 455 460 Leu Ala Gln Asn Asp Pro His Ala Val Asp Arg Ile Lys Leu Leu Tyr 465 470 475 480 Ser Ile Ala Leu Ser Thr Gly Gly Leu Pro Leu Ile Tyr Leu Gly Asp 485 490 495 Glu Val Gly Thr Leu Asn Asp Asp Asp Trp Ser Gln Asp Ser Asn Lys 500 505 510 Ser Asp Asp Ser Arg Trp Ala His Arg Pro Arg Tyr Asn Glu Glu Leu 515 520 525 Tyr Asn Gln Arg His Asp Ser Ser Thr Thr Ala Gly Gln Ile Phe Gln 530 535 540 Gly Leu Arg His Met Ile Ser Ile Arg Gln Ser Asn Pro Arg Phe Asn 545 550 555 560 Gly Gly Arg Leu Val Thr Phe Asn Thr Asn Asn Lys His Ile Ile Gly 565 570 575 Tyr Met Arg Asn Asn Ala Leu Leu Val Phe Gly Asn Phe Ser Glu His 580 585 590 Ala Gln Thr Ile Ser Ala His Thr Leu Gln Ala Met Pro Phe Lys Ala 595 600 605 His Asp Leu Ile Ser Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Gln Asp Leu Val 610 615 620 Leu Gln Pro Tyr Gln Val Met Trp Leu Glu Ile Ala 625 630 635 <210> 23 <211> 1911 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence of the enzyme protein of SEQ ID NO: 22 <400> 23 atgttgaccc agactcaaca ggttgatttg accttgcatc accttaaaga acgcacccta 60 tcgatttata cccccgaaca gcgtgcaagt atcgagacat ctgaagactg gaaacagttt 120 gacagacgac ttgaggaaca cttcccaaaa ctgatgcacg agctggacaa tgtttacaac 180 aacaacgaag ccgtcctccc catgctggag caactgattg cccaagcatg gcaaagctat 240 tcccaacgca actcatcctt aaaagatatc gatatcgcgc gcgaaaacga tcctgactgg 300 attttgtcca acaaacaggt tggcggcggg tgctacgtcg atttgttcgc aggcgatctg 360 caagggttga aagccaaaat cccttatttc caagaattgg gcctgaccta tctgcacctg 420 atgcccctgt ttaaatgtcc tgaaggcaaa agcgacggcg gctatgcggt cagcagctac 480 cgcgatgtca atccagcact gggtacaata gacgacttgc gcgatgtcat tgccgccttg 540 cacgaagcag gcatttccgc cgttgtcgat ttcatcttca accacacttc caacgaacac 600 gaatgggcaa aacgctgcgc tgccggcgat ccactctacg acaacttcta ctatattttc 660 cctgaccgct ggatgcccga ccaatacgac cgcaccctgc gtgaaatctt ccctgaccaa 720 catccgggcg gcttctccca actggaagac ggacgctggg tatggacgac gttcaactcc 780 ttccaatggg acttaaatta cagcaacccg tgggtattcc gtgccatggc aggcgaaatg 840 atgttccttg ccaacttggg cgttgatatt ctgcgcatgg atgccgttgc ctttatttgg 900 aagcaaatgg gcacaagctg cgaaaacctg cctcaggcac acgccctgat tcgcgcgttt 960 aactctgtaa tgcgtatcgc agcgccagcc gtgttcttca aatccgaagc catcgtccac 1020 cctgaccaag ttgtccaata catcagccaa gacgaatgtc aaatcggcta caaccctctg 1080 caaatggcat tgttgtggaa caccctcgcc acacgcgaag tcaacctgct ccatcaagca 1140 ctgacctacc gtcacaacct gcccgaccac acagcatggg tcaactacgt ccgcagccat 1200 gacgacatcg gctggacgtt tgccgacgaa gacgcatcgc aattcggcat ccacggctac 1260 gaccaccgcc aattcctcaa ccgcttcttc gtcaaccatt ttgacggcag cttcgcgcgt 1320 ggcgtaccat tccaatacaa cccaagcaca ggtgactgcc gtgtcagtgg tacagcagca 1380 gcattggtcg gcttggctca aaacgatccg catgccgttg accgcatcaa acttttgtac 1440 agcattgctt tgagtaccgg cggcctgccg ctgatttacc taggcgacga agtgggtacg 1500 ctcaatgacg atgactggtc tcaagacagc aacaagagcg atgacagccg ctgggcacac 1560 cgtcctcgtt acaatgagga gttgtacaac caacgccatg acagctcgac cactgccggt 1620 caaatcttcc aaggtttacg ccatatgatt tccatccgcc aaagcaatcc gcgctttaat 1680 ggcggcaggt tggttacctt caacaccaac aacaaacaca tcatcggcta tatgcgcaac 1740 aacgcgcttt tggtattcgg caacttcagc gaacatgcgc aaaccatcag tgcgcacacc 1800 ctgcaggcca tgccgtttaa agcgcacgat ttgatcagcg gtcaaaccgt ttctctgaat 1860 caggacttgg tactgcaacc ctatcaagtc atgtggcttg aaattgcata a 1911 <210> 24 <211> 636 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of amyloscurase from Neisseria sicca <400> 24 Met Leu Thr Gln Thr Gln Gln Val Asp Leu Thr Leu His His Leu Lys 1 5 10 15 Glu Arg Ala Leu Ala Glu Tyr Ser Pro Gln Gln Arg Ala Thr Val Glu 20 25 30 Ala Ser Glu Asp Trp Lys Gln Phe Asp Arg Arg Leu Asn Glu His Phe 35 40 45 Pro Lys Leu Met His Glu Leu Asp Asn Val Tyr Asn Asp Asn Glu Ala 50 55 60 Val Leu Pro Met Leu Glu Gln Leu Ile Ala Gln Ala Trp Gln Ser Tyr 65 70 75 80 Ser Gln Arg Asp Lys Ser Leu Lys Ala Ile Asp Ala Ala Arg Glu Asn 85 90 95 Asp Pro Asp Trp Ile Leu Ser Asn Lys Gln Val Gly Gly Val Cys Tyr 100 105 110 Val Asp Leu Phe Ala Gly Asp Leu Lys Gly Leu Lys Ala Lys Ile Pro 115 120 125 Tyr Phe Gln Glu Leu Gly Leu Thr Tyr Leu His Met Met Pro Leu Phe 130 135 140 Lys Cys Pro Glu Gly Lys Ser Asp Gly Gly Tyr Ala Val Ser Ser Tyr 145 150 155 160 Arg Asp Val Asn Pro Ala Leu Gly Thr Ile Asp Asp Leu Arg Asp Val 165 170 175 Ile Ala Ala Leu His Glu Val Gly Ile Ser Ala Val Val Asp Phe Ile 180 185 190 Phe Asn His Thr Ser Asn Glu His Glu Trp Ala Lys Arg Cys Ala Ser 195 200 205 Gly Asp Pro Leu Tyr Asp Asn Phe Tyr Tyr Ile Phe Pro Asp Arg Trp 210 215 220 Met Pro Asp Gln Tyr Asp Arg Thr Leu Arg Glu Ile Phe Pro Asp Gln 225 230 235 240 His Pro Gly Gly Phe Ser Gln Leu Glu Asp Gly Arg Trp Ile Trp Thr 245 250 255 Thr Phe Asn Ser Phe Gln Trp Asp Leu Asn Tyr Ser Asn Pro Trp Val 260 265 270 Phe Arg Ala Met Ala Gly Glu Met Met Phe Leu Ala Asn Leu Gly Val 275 280 285 Asp Ile Leu Arg Met Asp Ala Val Ala Phe Ile Trp Lys Gln Met Gly 290 295 300 Thr Asp Cys Glu Asn Leu Pro Gln Ala His Ala Leu Ile Arg Ala Phe 305 310 315 320 Asn Ala Val Met Arg Ile Ala Ala Pro Ala Val Phe Phe Lys Ser Glu 325 330 335 Ala Ile Val His Pro Asp Gln Val Val Gln Tyr Ile Ala Gln Asp Glu 340 345 350 Cys Gln Ile Gly Tyr Asn Pro Leu Gln Met Ala Leu Leu Trp Asn Thr 355 360 365 Leu Ala Thr Arg Glu Val Asn Leu Leu His Gln Ala Leu Ser Tyr Arg 370 375 380 His Asn Leu Pro Asp His Thr Ala Trp Val Asn Tyr Val Arg Ser His 385 390 395 400 Asp Asp Ile Gly Trp Thr Phe Ala Asp Glu Asp Ala Trp Gln Phe Gly 405 410 415 Ile His Gly Tyr Asp His Arg Gln Phe Leu Asn Arg Phe Phe Val Asn 420 425 430 His Phe Asp Gly Ser Phe Ala Arg Gly Val Pro Phe Gln Tyr Asn Pro 435 440 445 Asn Thr Gly Asp Cys Arg Val Ser Gly Thr Ala Ala Ala Leu Ala Gly 450 455 460 Leu Ala Gln His Asp Pro His Ala Val Asp Arg Ile Lys Leu Leu Tyr 465 470 475 480 Ser Ile Ala Leu Ser Thr Gly Gly Leu Pro Leu Ile Tyr Leu Gly Asp 485 490 495 Glu Val Gly Thr Leu Asn Asp Asp Asp Trp Ser Asn Asp Ser Asn Lys 500 505 510 Ser Asp Asp Ser Arg Trp Ala His Arg Pro Arg Tyr Asn Ala Glu Leu 515 520 525 Tyr Glu Gln Arg His Asp Pro Ser Thr Ala Ala Gly Gln Ile Tyr Gln 530 535 540 Gly Leu Arg His Met Ile Asp Ile Arg Gln Asn Asn Pro Arg Leu Asn 545 550 555 560 Gly Gly Arg Leu Val Thr Phe Asn Thr Asn Asn Lys His Ile Ile Gly 565 570 575 Tyr Ile Arg Asn Asn Ala Leu Leu Ala Phe Gly Asn Phe Ser Glu His 580 585 590 Pro Gln Thr Ile Ser Ala His Thr Leu Gln Ala Met Pro Ala Arg Ala 595 600 605 Lys Asp Leu Ile Ser Gly Glu Thr Val Ala Leu Asn Gln Asp Leu Val 610 615 620 Leu Arg Pro Tyr Gln Val Met Trp Leu Glu Ile Ala 625 630 635 <210> 25 <211> 1911 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence of the enzyme protein of SEQ ID NO: 24 <400> 25 atgttgaccc agacccaaca ggtcgatttg accctgcatc atctcaaaga gcgcgccttg 60 gcagaatata gcccccaaca gcgtgcgacc gtcgaagctt ccgaagactg gaaacagttt 120 gacagacgtt tgaacgagca tttccccaag ctgatgcacg agctggacaa cgtttacaac 180 gacaacgaag ccgtcctgcc catgctggaa caactgattg cacaagcatg gcaaagctat 240 tcccaacgcg acaagtctct gaaagccatc gatgccgcgc gtgagaatga ccccgattgg 300 attttgtcca ataaacaggt cggcggcgtg tgttatgtcg atttgttcgc aggcgatttg 360 aaaggcttga aagccaaaat cccttatttt caagagctgg ggctaaccta tctgcacatg 420 atgcccctgt ttaaatgccc tgaaggcaaa agcgacggcg gctatgcggt cagcagctac 480 cgcgacgtca atccggcttt gggtacgata gacgacttgc gcgatgtcat tgccgcgctg 540 cacgaagtgg gcatttccgc cgtcgtcgat ttcatcttca accacacgtc caacgaacac 600 gaatgggcga aacgctgcgc ctccggcgac ccgctttacg acaattttta ctatattttc 660 cccgaccgct ggatgcccga ccaatacgac cgcaccctgc gcgaaatctt ccccgaccag 720 catccgggcg gcttctcaca attagaagac ggacgctgga tatggacgac attcaattcc 780 ttccaatggg atttgaatta cagcaatcct tgggtgttcc gcgccatggc gggcgaaatg 840 atgttccttg ccaatttggg cgttgacatc ctgcgtatgg acgccgttgc ctttatttgg 900 aaacaaatgg gtacggattg cgaaaacctg ccgcaagccc atgccttaat ccgcgcattc 960 aacgccgtca tgcgcatcgc cgcacctgcc gtgttcttca aatccgaagc catcgtccac 1020 cccgaccaag tcgtacaata catcgcacaa gacgaatgcc aaatcggtta caacccgctg 1080 caaatggcat tgttgtggaa caccctcgcc acccgcgaag tcaacctgct ccaccaagcc 1140 ctctcctacc gccacaacct gcccgaccat accgcatggg tcaactacgt ccgcagccat 1200 gacgacatcg gctggacgtt tgccgacgaa gacgcatggc agttcggcat ccacggctac 1260 gaccaccgcc aattcctcaa ccgctttttc gtcaaccatt tcgacggcag cttcgcgcgc 1320 ggcgtccctt tccaatacaa ccccaacacc ggcgactgcc gcgtcagcgg tactgccgcc 1380 gccctggcag gtttggcgca acatgacccc cacgccgttg accgcatcaa acttttgtac 1440 agcatcgccc tgagtaccgg cggcctgccc ctgatttatc tcggcgacga agtcggcacg 1500 ctcaacgacg acgactggtc gaacgacagc aacaagagcg acgacagccg ctgggcgcac 1560 cgtccgcgtt acaacgccga gttgtacgaa cagcgccacg acccgtcaac cgcggcagga 1620 caaatctatc aaggcctgcg ccacatgata gatatccgcc aaaacaaccc gcgcttgaac 1680 ggcggccgtc tggttacctt caacaccaac aacaaacaca tcatcggcta catccgaaac 1740 aatgcgctgt tggcgttcgg caacttcagc gaacacccgc aaaccatcag cgcgcatacc 1800 ctgcaagcca tgcccgcccg cgccaaagac ctcatcagcg gcgaaaccgt ggcactgaat 1860 caggatttgg tgctgcgccc ctaccaagtg atgtggctcg aaatcgcctg a 1911

Claims (17)

1. 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열과, 그 상류(upstream)에 작동 가능하도록 연결되며 코리네박테리움속 균주에서 상기 아밀로수크라제 효소의 발현을 조절하는 조절서열을 포함하며,
   상기 조절서열은 서열번호 1의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 서열번호 8 의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 서열번호 12의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 및 서열번호 16의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 전사 프로모터(transcription promoter)를 포함하는, 코리네박테리움속 균주에서 아밀로수크라제 효소를 발현하는 유전자 발현 카세트(gene expression cassette).
2. 제1항에 있어서, 상기 조절서열은 서열번호 20의 핵산서열을 포함하는 리보좀 결합 영역(ribosome binding site)을 추가로 포함하는 것인 유전자 발현 카세트.
3. 제2항에 있어서, 상기 조절서열은, 5'에서 3'방향으로 순차적으로 연결된 서열번호 20의 핵산서열을 갖는 리보좀 결합 영역과 서열번호 21의 핵산서열을 갖는 스페이서 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 것인 유전자 발현 카세트.
4. 제2항에 있어서, 상기 조절서열은 전사 프로모터와 리보좀 결합 영역 사이에 위치하는 1개 내지 100개 염기크기의 제1 링커 서열을 추가로 포함하는 것인 유전자 발현 카세트.
5. 제2항에 있어서, 상기 조절서열은 5'에서 3'방향으로 순차적으로 위치하는, 전사 프로모터 및 리보좀 결합 영역을 포함하며, 상기 리보좀 결합영역의 3'말단에 연결되며 1개 내지 100개 염기크기의 제1 링커 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 유전자 발현 카세트.
6. 제2항에 있어서, 상기 조절서열은 서열번호 2 내지 서열번호 7의 핵산서열을포함하는 핵산분자, 서열번호 9 내지 서열번호 11의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 서열번호 13 내지 서열번호 15의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 및 서열번호 17 내지 서열번호 19의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 것인 유전자 발현 카세트.
7. 제3항에 있어서, 상기 조절서열은 서열번호 6 내지 서열번호 7의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 서열번호 11의 핵산서열을 포함하는 핵산분자 및 서열번호 15을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 것인 유전자 발현 카세트.
8. 제4항에 있어서, 상기 조절서열은 서열번호 10 내지 서열번호 11의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 서열번호 14 내지 서열번호 15의 핵산서열을 포함하는 핵산분자 및 서열번호 18 내지 서열번호 19의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택되는 젓인 유전자 발현 카세트.
9. 제1항에 있어서, 상기 아밀로수크라제 효소는 Neisseria subflava 또는 Neisseria sicca에서 유래된 것인 유전자 발현 카세트.
10. 제9항에 있어서, 상기 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열은, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 핵산서열, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 핵산서열인 유전자 발현 카세트.
11. 제10항에 있어서, 상기 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열은 서열번호 23 및 서열번호 25로 이루어지는 군에서 선택된 핵산서열을 포함하는 핵산분자인 유전자 발현 카세트.
12. 제1항에 있어서, 상기 조절서열은 서열번호 1 내지 서열번호 19의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드이고, 상기 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열은 서열번호 22 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 핵산서열인 유전자 발현 카세트.
13. 제12항에 있어서, 상기 조절서열은 서열번호 1 내지 서열번호 7의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드이고, 상기 아밀로수크라제 효소를 암호화하는 핵산서열은 서열번호 22 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 핵산서열인 유전자 발현 카세트.
14. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스 (thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라쎄콜라 (melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스 (efficiens)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 유전자 발현 카세트.
15. 제 1 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 복제 기점, 리더(leader), 선택 가능한 마커, 클로닝 부위 및 제한효소 인식부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 추가로 포함하는 것인 유전자 발현 카세트.
16. 서열번호 1 내지 서열번호 19의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 코리네박테리움속 균주에서 아밀로수크라제 효소를 발현하는 전사 프로모터(transcription promoter).
17. 제1항 내지 제15항중 어느 한 항에 따른 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터.

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