KR101693133B1

KR101693133B1 - Tarp-감마 8 의존성 ampa 수용체 길항제로서의 6-((s)-1-｛1-[5-(2-히드록시-에톡시)-피리딘-2-일]-1h-피라졸-3-일｝-에틸)-3h-1,3-벤조티아졸-2-온

Info

Publication number: KR101693133B1
Application number: KR1020157013470A
Authority: KR
Inventors: 존 케빈 릴; 워렌 제이 포터; 제프리 마이클 위드킨
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2013-11-20
Publication date: 2017-01-04
Also published as: BR112015011200A2; TW201825484A; MX2015006697A; TN2015000200A1; TW201434834A; MA38126A1; CA2889243C; MA38126B1; MX356478B; ZA201503733B; UA114345C2; CL2015001419A1; ES2618260T3; JP2016501219A; SG11201504164VA; JP6246227B2; WO2014085153A1; IL238831B; TWI618705B; EP2925754B1

Abstract

하기 화학식 I의 TARP γ8 의존성 AMPA 수용체 길항제, 그의 제약상 허용되는 염, 용도, 및 그의 제조 방법이 기술된다.
[화학식 I]

Description

TARP-감마 8 의존성 AMPA 수용체 길항제로서의 6-((S)-1-｛1-[5-(2-히드록시-에톡시)-피리딘-2-일]-1H-피라졸-3-일｝-에틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 {6-((S)-1-｛1-[5-(2-HYDROXY-ETHOXY)-PYRIDIN-2-YL]-1H-PYRAZOL-3-YL｝-ETHYL)-3H-1,3-BENZOTHIAZOL-2-ONE AS A TARP-GAMMA 8 DEPENDENT AMPA RECEPTOR ANTAGONIST}

간질은 세계적으로 5천만명을 넘는 사람에게 영향을 미치고, 치료된 환자의 30-40%가 현재의 약물요법에 저항성이며, 치료된 환자의 약 8%만이 무발작 상태로 유지된다. 간질은 사람에게 2회 이상의 자극되지 않은 간질성 발작이 있을 때로서 종종 정의된다. 국제 간질 연맹(International League Against Epilepsy) (ILAE)은 간질성 발작을 "뇌에서의 비정상적인 과도한 뉴런 활성 또는 동시성 뉴런 활성에 기인하는 징후 및/또는 증상의 일시적인 발생"으로서 정의한다. 발작은 간질 치료에 어려움을 부가하는 다수의 기저 인과관계가 있는 것으로 생각된다. 간질은 전신 발작 (소발작, 무긴장성, 긴장성-간대성 (대발작), 및 근간대성), 단순 및 복합 부분 개시 발작, 웃음 발작, 울음 발작, 및 간질지속증을 포함하여 그의 임상 표현에 따라 분류되었다. 현재의 요법들은 GABA (γ-아미노부티르산) 수용체 작동작용, T-유형 칼슘 채널 차단제, 나트륨 채널 조정제, 시냅스 소포 단백질 SV2A 조정, 및 GABA 트랜스아미나제 억제를 포함하는 다양한 메카니즘을 표적으로 한다. AMPA 수용체 길항제 또한 발작 치료를 위해 연구되었다.

AMPA (α-아미노-3-히드록실-5-메틸-4-이속사졸-프로피온산) 수용체는 중추신경계 내의 흥분 시냅스의 시냅스후막 상의 글루타메이트 민감성 이온 채널이고, 시냅스 간격을 가로지르는 신속한 신경전달을 매개하는 것을 주로 담당한다. AMPA 수용체 길항제는 공지된 항경련제이고, 흥분성 신경전달을 하향 조정하는 그의 능력이 그의 항-간질 치료 잠재력의 비결이다. 그러나, AMPA 수용체 활성이 CNS에서 매우 편재성이기 때문에, 일반적인 길항작용은 CNS의 대부분의 영역에 영향을 미쳐서 원치 않는 효과, 예컨대 운동실조, 진정, 및/또는 어지럼증을 초래하며, 모든 공지된 일반적인 AMPA 수용체 길항제가 이를 공유한다. 전형적으로, 이러한 일반적인 길항제들은 치료 용량 창이 매우 좁고, 이는 전형적으로 항경련 활성을 수득하기 위해 필요한 용량이 원치 않는 효과가 관찰되는 용량과 매우 가깝거나 또는 중첩된다는 것을 의미한다. (Michael A. Rogawski. "Revisiting AMPA Receptors as an Antiepileptic Drug Target" Epilepsy Currents 11.2 (2011).)

막횡단 AMPA 수용체 조절 단백질 (TARP)은 꽤 최근에 발견된, AMPA 수용체의 활성과 연관되고 이를 조정하는 것으로 확인된 단백질들의 패밀리이다. 몇몇 TARP들은 뇌에서 꽤 부위-특이적이어서, AMPA 수용체 활성의 생리학적 구별에 이른다. 예를 들어, TARP γ2 (스타가진(stargazin)) 의존성 AMPA 수용체는 주로 소뇌 및 대뇌 피질에 국소화되고, TARP γ8 의존성 AMPA 수용체는 발작 기원 및/또는 전파에 특히 관련되는 영역인 해마에 주로 국소화된다. 개별적인 TARP를 표적화하는 것이 시냅스 전달에 전체적으로 영향을 미치지 않으면서 특정 뇌 회로의 선택적인 조정을 가능하게 할 수 있다는 이론이 세워졌다. (Gill, Martin B. and Bredt, David S., Neuropsychopharmacology 36(1): 362-363 (2011).)

레베티라세탐(levetiracetam) ((S)-2-(2-옥소피롤리딘-1-일)부탄아미드), 가바펜틴(gabapentin) (2-[1-(아미노메틸)시클로헥실]아세트산), 토피라메이트(topiramate) (2,3:4,5-비스-O-(1-메틸에틸리덴)-베타-D-프룩토피라노스 술파메이트), 및 카르바마제핀(carbamazepine) (5H-디벤조[b,f]아제핀-5-카르복스아미드)은 간질성 발작에 대한 현재의 선도적 치료 약물이다. 이러한 현재 승인된 약물 중 어느 것도 전적으로 AMPA 수용체의 조정을 통해 작용하는 것으로 보이지는 않는다.

탈람파넬(talampanel) ((8R)-7-아세틸-5-(4-아미노페닐)-8,9-디히드로-8-메틸-7H-1,3-디옥솔로[4,5-h] [2,3]벤조디아제핀), 셀루람파넬(selurampanel) (BGG492) (N-[7-이소프로필-6-(2-메틸-2H-피라졸-3-일)-2,4-디옥소-1,4-디히드로-2H-퀴나졸린-3-일]메탄술폰아미드), 및 파람파넬(parampanel) (5'-(2-시아노페닐)-1'-페닐-2,3'-비피리디닐-6'(1'H)-온)은 항간질제로서 시험되고 있는 일반적인 (비-TARP 의존성/비-선택적) AMPA 수용체 길항제이다.

선택적, 비-경쟁적 TARP γ8 의존성 AMPA 수용체 길항제가 소뇌에서의 AMPA 수용체 길항작용과 더욱 연관되는 일반적인 (비-TARP 의존성/비-선택적) AMPA 길항제 또는 TARP γ2 의존성 AMPA 길항제의 부작용 (예를 들어 진정, 운동실조, 및/또는 어지럼증)이 없는 효과적인 항발작/항간질 치료제일 수 있다는 것이 본원에서 제안된다.

본 발명은 시험관 내에서의 강력하고 선택적인 TARP γ8-의존성 AMPA 수용체 길항제 활성, 뿐만 아니라 발작 및 통증의 동물 모델에서의 효능을 나타내는 화합물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 간질 환자에서의 발작, 예를 들어, 단순 및/또는 복합 부분 개시 발작, 및/또는 원발성 및/또는 속발성 전신 발작의 치료에 유용한 것으로 여겨지는 화합물을 제공한다. 추가로, 본 발명의 화합물은 통증 치료에 또한 유용할 수 있다. 더욱 특히, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물

[화학식 I]

(즉, 6-((S)-1-{1-[5-(2-히드록시-에톡시)-피리딘-2-일]-1H-피라졸-3-일}-에틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온), 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명의 이러한 측면은 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는, 간질 환자에서의 발작, 예를 들어 단순 및/또는 복합 부분 개시 발작, 및/또는 원발성 및/또는 속발성 전신 발작을 치료하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 이러한 측면은 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 항간질 약물인 제2 치료제, 예를 들어 레베티라세탐, 가바펜틴, 토피라메이트, 또는 카르바마제핀, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 발작, 예를 들어 단순 및/또는 복합 부분 개시 발작, 및/또는 원발성 및/또는 속발성 전신 발작의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 간질에 걸린 포유동물에서 발작, 예를 들어 단순 및/또는 복합 부분 개시 발작, 및/또는 원발성 및/또는 속발성 전신 발작을 치료하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태에서, 이러한 방법은 항간질 약물인 제2 치료제, 예를 들어 레베티라세탐, 가바펜틴, 토피라메이트, 또는 카르바마제핀을 동시에, 별도로 또는 순차적으로 조합하여 투여하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 치료 방법의 한 특정한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

본 발명은 요법에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 또한 제공한다. 이러한 측면에서, 본 발명은 간질에 걸린 포유동물, 특히 인간에서의 발작, 예를 들어 단순 및/또는 복합 부분 개시 발작, 및/또는 원발성 및/또는 속발성 전신 발작의 치료에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 또한, 본 발명의 이러한 측면은 간질에 걸린 포유동물, 특히 인간에서의 발작의 치료에서 항간질 약물, 예를 들어 레베티라세탐, 가바펜틴, 토피라메이트, 또는 카르바마제핀과 동시에, 별도로 또는 순차적으로 조합하여 사용하기 위한 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 간질에 걸린 포유동물, 특히 인간에서의 발작, 예를 들어 단순 및/또는 복합 부분 개시 발작, 및/또는 원발성 및/또는 속발성 전신 발작의 치료를 위한 의약의 제조에서의 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 간질에 걸린 포유동물, 특히 인간에서의 발작, 예를 들어 단순 및/또는 복합 부분 개시 발작, 및/또는 원발성 및/또는 속발성 전신 발작의 치료의 치료를 위한 의약의 제조에서의 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공하며, 이때 상기 의약은 항간질 약물인 제2 치료제, 예를 들어 레베티라세탐, 가바펜틴, 토피라메이트, 또는 카르바마제핀과 동시에, 별도로 또는 순차적으로 조합되어 투여된다.

본 발명의 또 다른 측면은 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는, 통증 치료를 위한 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 통증 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 통증을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 치료 방법의 한 특정한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

본 발명의 또 다른 측면은 특히 인간에서의 통증 치료에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 통증 치료용 의약의 제조에서의 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 화합물은 염기성 및 산성 모이어티가 있고, 따라서 다수의 유기 및 무기 산 및 염기와 반응하여 제약상 허용되는 염을 형성한다. 본 발명의 화합물의 제약상 허용되는 염은 본 출원의 범주 내인 것으로 고려된다. 본원에서 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는 염"이라는 용어는 살아 있는 생물에게 실질적으로 독성이지 않은 본 발명의 화합물의 임의의 염을 지칭한다. 이같은 제약상 허용되는 염 및 그의 제조를 위한 통상적인 방법이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008)]; 및 [S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, January 1977]을 참조한다.

본원에서 사용된 약어는 하기와 같이 정의된다:

"AMPA"는 α-아미노-3-히드록실-5-메틸-4-이속사졸-프로피온산을 의미한다.

"염수"는 포화 NaCl을 의미한다.

"CHO"는 차이니즈 햄스터 난소를 의미한다.

"CTZ"는 시클로티아지드를 의미한다.

"DCM"은 디클로로메탄을 의미한다.

"DMEM"은 둘베코 최소 이글 배지(Dulbecco's Minimum Eagle's Medium)를 의미한다.

"DMSO"는 디메틸 술폭시드를 의미한다 (NMR용인 경우 과중수소화됨 [d6]).

"ED₅₀"은 관찰된 최대 효과의 50%를 일으키는 용량을 의미한다.

"Eq"는 몰 당량을 의미한다.

"EtOAc"는 에틸 아세테이트를 의미한다.

"EtOH"는 에탄올을 의미한다.

"FLIPR"은 형광 영상화 플레이트 판독기를 의미한다.

"HBSS"는 행크 완충 염 용액(Hank's Buffered Salt Solution)을 의미한다.

"HEPES"는 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산을 의미한다.

"HPLC"는 고압 액체 크로마토그래피를 의미한다.

"hr." 또는 "h"는 시간을 의미한다.

"IC₅₀"은 최대 억제의 50%가 달성되는 농도를 의미한다.

"LCMS"는 액체 크로마토그래피 질량 분광측정법을 의미한다.

"MeOH"는 메탄올을 의미한다.

"min." 또는 "m"은 분을 의미한다.

"MS"는 질량 분광법 또는 질량 스펙트럼을 의미한다.

"p.o."는 입에 의한 경구를 의미한다.

"PTZ"는 펜틸렌테트라졸을 의미한다.

"RT"는 체류 시간을 의히만다.

"S.C."는 피하를 의미한다.

"SEM"은 평균의 표준 오차를 의미한다.

"TARP"는 막횡단 AMPA 수용체 조절 단백질을 의미한다.

"THF"는 테트라히드로푸란을 의미한다.

"VCD"는 진동 선회 이색성을 의미한다.

"XRPD"는 X선 분말 회절을 의미한다.

일반 화학

본 발명의 화합물을 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 인정되어 있는 일반적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 이러한 체계들의 단계에 대한 적절한 반응 조건이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 용매 및 공동-시약의 적합한 대용물이 관련 기술분야의 기술 내에 속한다. 마찬가지로, 필요하다면 또는 원한다면 다양한 주지된 기술에 의해 합성 중간체를 단리 및/또는 정제할 수 있고, 빈번하게는, 다양한 중간체를 거의 정제하지 않고 또는 정제하지 않고 후속 합성 단계에서 직접적으로 사용하는 것이 가능할 것임을 통상의 기술자는 이해할 것이다. 또한, 숙련된 기술자는 일부 상황에서 모이어티들이 도입되는 순서가 결정적이지 않다는 것을 이해할 것이다.

하기의 설명적인 제조 및 실시예에서, 일반적으로 감압 하에 용매가 제거된다 (증발된다). 일부 절차에서, 지시된 수율은 증발 또는 여과에 의해 단리되고 추가적인 정제 없이 직접적으로 사용되는 생성물에 대한 대표적인 조 수율이다.

제조예 1: 6-아세틸-3-(메톡시메틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온

탄산세슘 (1.5 Eq; 310.5 mmoles; 101.1 g)을 디메틸포름아미드 (690 ㎖) 내의 6-아세틸-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (40.0 g, 207 mmoles)의 용액에 첨가한다. 클로로메틸 메틸 에테르 (1.3 Eq, 269 mmoles, 20.4 ㎖)를 적가하고, 실온에서 18 시간 동안 교반한다. 분리 깔때기로 옮기고, EtOAc (1 ℓ)를 첨가하고, 물 (2×200 ㎖)로 세척한 후, 염수 (200 ㎖)로 세척한다. DCM (300 ㎖)으로 역추출한다. 합쳐진 유기 층들을 Na₂SO₄에서 건조시키고, 여과하고, 농축한다. 농축물을 200 ㎖ 헥산/EtOAc (75:25)에서 슬러리화시키고, 여과하여, 6-아세틸-3-(메톡시메틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온을 백색 고체로 수득한다 (37.0 g, 156 mmoles, 75% 수율). LCMS (저분해능) rt=1.68 min., M+1=238.

제조예 2: 6-[1-히드록시-1-(1-테트라히드로피란-2-일-1H-피라졸-5-일)에틸]-3-(메톡시메틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (부분입체이성질체의 라세미 혼합물)

1-테트라히드로피란-2-일-피라졸 (1.5 Eq, 202 mmoles, 30.8 g) (알드리치(Aldrich)) 및 THF (900 ㎖)를 화염으로 건조된 2 ℓ 3목 둥근바닥 플라스크에 첨가하고, -78℃로 냉각한다 (드라이 아이스/아세톤 배스(bath)). 적어도 -68℃를 유지하면서 t-부틸 리튬 (THF 내 2.5 M) (1.5 Eq, 202 mmoles; 81.0 ㎖)을 적가하고, 60분 동안 -78℃에서 교반한다. THF (450 ㎖) 내의 6-아세틸-3-(메톡시메틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (32.0 g, 134 mmoles)의 용액을 45분에 걸쳐 적가하고, -78℃에서 30분 동안 교반한다. 드라이 아이스 배스를 제거하고, -50℃로 가온되게 하고, 1시간 동안 교반한다. (온도가 -45℃ 초과로 상승되게 하지 않는다). MeOH (80 ㎖)로 반응을 켄칭시킨다. 분리 깔때기로 옮기고, EtOAc (2000 ㎖)를 첨가하고, 물 (500 ㎖)로 세척한 후, 염수 (500 ㎖)로 세척한다. 유기 층을 Na₂SO₄에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여, 조 황색 오일을 수득한다. 이러한 물질을 HPLC로 정제하고, 헥산/EtOAc (6:4)로 용리하여, 6-[1-히드록시-1-(1-테트라히드로피란-2-일-1H-피라졸-5-일)에틸]-3-(메톡시메틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온을 백색 발포체로서 수득한다 (44 g, 113 mmoles, 84% 수율) (부분입체이성질체의 라세미 혼합물). LCMS (저분해능) rt=1.76 min., M+1= 288, 및 rt=1.86 min., M+1= 288

제조예 3: 3-(메톡시메틸)-6-[1-(1H-피라졸-5-일)에테닐]-3H-1,3-벤조티아졸-2-온

트리플루오로아세트산 (20 Eq (몰), 2.26 moles, 170 ㎖)을 DCM (0.2 M, 8.81 moles, 565 ㎖) 내의 6-[1-히드록시-1-(1-테트라히드로피란-2-일-1H-피라졸-5-일)에틸]-3-(메톡시메틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (44 g, 113 mmoles)의 용액에 첨가하고, 실온에서 밤새 교반한다 (~16 시간). 생성된 어두운 자주색의 반응 혼합물을 농축하고, 이를 EtOAc (2 ℓ)에 용해시키고, 포화 수성 중탄산나트륨을 천천히 첨가하여 용액을 중화시킨다. 분리 깔때기로 옮기고, EtOAc 내로 추출하고, 물 (300 ㎖)로 세척한 후, 염수 (300 ㎖)로 세척한다. Na₂SO₄에서 건조시키고, 여과하고, 농축한다. 이러한 물질을 HPLC로 정제하고, EtOAc/헥산 (1:1)으로 용리하여, 3-(메톡시메틸)-6-[1-(1H-피라졸-5-일)에테닐]-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (30 g, 104 mmoles, 92% 수율)을 진황색 오일로 수득한다. LCMS (저분해능): rt=1.82 min.에서의 원하는 생성물의 피크, M+1= 288.

제조예 4: 3-(메톡시메틸)-6-[1-(1H-피라졸-5-일)에틸]-3H-1,3-벤조티아졸-2-온

5% 팔라듐/탄소 (15 g; 7.0 mmoles)를 N₂로 퍼징된 플라스크에 첨가하고, EtOAc (250 ㎖)를 첨가한다. EtOAc (250 ㎖) 내의 용액으로서의 3-(메톡시메틸)-6-[1-(1H-피라졸-5-일)에테닐]-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (29 g, 101 mmoles)을 첨가한다. 진공 하에 탈기시키고, 풍선을 통해 수소를 충전한다. 밤새 교반하고, 과량의 수소를 가압 하에 배기시키고, N₂로 플러싱한다. 규조토로 여과하고, 농축하여, 3-(메톡시메틸)-6-[1-(1H-피라졸-5-일)에틸]-3H-1,3-벤조티아졸-2-온을 진황색 오일로 수득한다 (27 g, 93 mmoles; 92% 수율). 이러한 물질을 추가로 정제하지 않고 다음 단계로 보낼 수 있다. LCMS (저분해능) rt=1.73 min., M+1=290.

제조예 5: 2-플루오로-5-[2-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)에톡시]피리딘

탄산세슘 (3 Eq, 53.05 mmoles; 17.2 g)을 디메틸포름아미드 (0.3 M; 762.37 mmoles; 59.0 ㎖) 내의 2-플루오로-5-히드록시피리딘 (2.0 g, 1.00 Eq, 17.68 mmoles)의 용액에 첨가하고, 이어서 2-(2-브로모에톡시)테트라히드로-2H-피란 (17.7 mmoles, 3.7 g)을 첨가하고, 실온에서 밤새 교반한다. 분리 깔때기로 옮기고, EtOAc (500 ㎖)를 첨가한다. 유기 층을 세척하고, 물 (300 ㎖)로 세척한 후, 염수 (200 ㎖)로 세척한다. Na₂SO₄에서 건조시키고, 여과하고, 농축한다. 조 혼합물을 HPLC로 정제하고, 헥산/EtOAc 7/3으로 용리하여, 2-플루오로-5-[2-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)에톡시]피리딘을 담황색 오일로 수득한다 (3.9 g, 16.2 mmoles; 91% 수율). LCMS (저분해능) rt= 1.8 min., M+1=242.

제조예 6: 3-(메톡시메틸)-6-{1-[1-(5-{2-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)에톡시}피리딘-2-일)-1H-피라졸-3-일]에틸}-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (부분입체이성질체의 라세미 혼합물)

3-(메톡시메틸)-6-[1-(1H-피라졸-5-일)에틸]-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (7.7 g, 26.6 mmoles)을 디메틸포름아미드 (0.2 M; 133 ㎖)에 용해시킨다. 리튬 t-부톡시드 ((THF 내의 1.00 몰 용액 1.5 Eq), 39.9 mmoles; 39.9 ㎖))를 첨가하고, 15분 동안 교반한다. 2-플루오로-5-[2-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)에톡시]피리딘 (2.00 Eq; 53.2 mmoles; 12.8 g)을 첨가한다. 반응물을 오일 배스에서 140℃로 가열하고, N₂로 퍼징하여, THF를 제거한다. 혼합물을 5 시간 동안 환류시키면서 가열한다. 혼합물을 실온으로 냉각하고, 포화 염화암모늄으로 켄칭시킨다. EtOAc (2×200 ㎖) 내로 추출하고, 물 (2×100 ㎖)로 세척하고, 이어서 염수 (200 ㎖)로 세척한다. 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 농축한다. HPLC (실리카)로 정제하고, 40% EtOAc/헥산으로 용리하여, 3-(메톡시메틸)-6-{1-[1-(5-{2-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)에톡시}피리딘-2-일)-1H-피라졸-3-일]에틸}-3H-1,3-벤조티아졸-2-온을 담황색 오일로 수득한다 (10 g; 19.6 mmoles, 74% 수율). LCMS (저분해능) rt= 2.6, M+1= 511.

실시예 1: 6-(1-{1-[5-(2-히드록시-에톡시)-피리딘-2-일]-1H-피라졸-3-일}-에틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온, 라세미체

3-(메톡시메틸)-6-{1-[1-(5-{2-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)에톡시}피리딘-2-일)-1H-피라졸-3-일]에틸}-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (140 ㎎, 274.18 μmoles)을 트리플루오로아세트산 (0.05 M; 73 mmoles; 5.5 ㎖)에 용해시키고, 2시간 동안 N₂ 하에 환류 (~72℃)하면서 가열하였다. (오렌지색이 약 10분 후에, 그리고 70℃에서 관찰됨). 반응물을 실온으로 냉각하고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 THF (0.05 M; 67 mmoles, 5.5 ㎖)에 용해시키고, 28% 수산화암모늄 (0.2 M; 9.9 mmoles; 1.4 ㎖)을 첨가하고, 실온에서 ~1 시간 동안 교반하였다. EtOAc (100 ㎖)로 희석하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 25 g 실리카 겔 칼럼 상에서의 액체 크로마토그래피로 정제하고, 헥산 내의 60 - 80% EtOAc의 구배로 용리하여, 6-(1-{1-[5-(2-히드록시-에톡시)-피리딘-2-일]-1H-피라졸-3-일}-에틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온을 백색 발포체로 수득하였다 (80 ㎎; 209 μmoles; 76% 수율). LCMS (저분해능) rt 1.8 min., M+1 =383.

실시예 2: 6-((S)-1-{1-[5-(2-히드록시-에톡시)-피리딘-2-일]-1H-피라졸-3-일}-에틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (이성질체 1)

6-(1-{1-[5-(2-히드록시-에톡시)-피리딘-2-일]-1H-피라졸-3-일}-에틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (330 ㎎)을 MeOH (3.0 ㎖) 및 DCM (2.5 ㎖)에 용해시키고, 40% MeOH/액체 CO₂, 70 ㎖/분으로 용리하고, 225 nm에서 검출하며, 러닝 당 300 ㎕ 분취량을 주입하는 키랄셀(Chiralcel)® OJ-H (2.1 × 15 ㎝, 5 ㎛ 칼럼, 키랄 테크놀러지즈 유럽(Chiral Technologies Europe))를 사용하여 키랄 크로마토그래피에 의해 거울상이성질체들로 분할하였다. 분리된 거울상이성질체들을 함유하는 분획들을 합치고, 진공 하에 농축하여, 이성질체 1 (150 ㎎) 및 이성질체 2 (169 ㎎)를 무정형 백색 고체로 수득하였다. 40% MeOH/액체 CO₂, 5 ㎖/분으로 용리하고 225 nm에서 검출하는 키랄셀® OJ-H (4.6 × 150 ㎜, 5 ㎛ 칼럼, 키랄 테크놀러지즈 유럽)를 사용하는 분석적 키랄 크로마토그래피에서 rt = 2.03 min.의 이성질체 1 및 rt = 2.66 min.의 이성질체 2가 특성화되었다. LCMS (저분해능): 이성질체 1 rt 1.8 min., M+1 = 383; 이성질체 2, rt 1.8 min., M+1 = 383.

결정화: 형태 I:

6-((S)-1-{1-[5-(2-히드록시-에톡시)-피리딘-2-일]-1H-피라졸-3-일}-에틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (이성질체 1) (56.9 ㎎)을 70℃에서 20분 동안 교반하면서 1:1 EtOH:헵탄 (3.0 ㎖)에 용해시켰다. 뜨거울 때 용액을 여과하고, 2개의 동일한 부분으로 나눴다; 그 중 하나를 주위 온도에서 바이알로 옮기고, 마개를 닫고, 5℃에서 밤새 교반하였다. 여과로 고체를 회수하고, 질소 하에 건조시켜, 결정 형태 I이 제공되었다 (23.9 ㎎, 84% 수율).

단일 결정 X선 결정학에 의해 이성질체 I에 대한 절대 입체화학이 6-((S)-1-{1-[5-(2-히드록시-에톡시)-피리딘-2-일]-1H-피라졸-3-일}-에틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온인 것으로 확인되었다.

X선 분말 회절

35 kV 및 50 mA에서 작동된, CuKa 공급원 (λ = 1.54060 Å) 및 반텍(Vantec) 검출기가 장착된 브루커 D4 인데버(Bruker D4 Endeavor) X선 분말 회절분석기 상에서 결정질 고체의 XRPD 패턴을 수득하였다. 2θ에서의 0.0087°의 스텝 크기 및 0.5 초/스텝의 스캔 속도로, 그리고 0.6 ㎜ 디버전스(divergence), 5.28 ㎜ 고정 안티-스캐터(anti-scatter) 및 9.5 ㎜ 검출기 슬릿(slit)으로 샘플을 2θ에서의 4 내지 40°에서 스캐닝하였다. 건조 분말을 석영 샘플 홀더에 채우고, 유리 슬라이드를 사용하여 반반한 표면을 수득하였다. 임의의 소정의 결정 형태에 대해, 결정 형태학 및 습성과 같은 요인들로부터 초래되는 선호되는 배향으로 인해 회절 피크의 상대적인 강도가 변할 수 있다는 것이 결정학 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 선호되는 배향의 효과가 존재하는 경우, 피크 강도가 변경되지만, 다형체의 특징적인 피크 위치는 변하지 않는다. 예를 들어 문헌 [The U. S. Pharmacopeia 33 - National Formulary 28 Chapter <941> Characterization of Crystalline Solids by X-ray Powder Diffraction (XRPD) Official October 1, 2010-February 1, 2011]을 참조한다. 또한, 임의의 소정의 결정 형태에 대해, 각 피크 위치가 약간 변할 수 있다는 것도 결정학 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 샘플이 분석되는 온도 또는 습도의 변동, 샘플 교체, 또는 내부 표준물의 존재 또는 부재로 인해 피크 위치가 이동할 수 있다. 본 경우에, 2θ에서의 ± 0.2의 피크 위치 변동성이 지시된 결정 형태의 명확한 확인을 방해하지 않으면서 이러한 잠재적인 변동을 고려할 것이다. 결정 형태의 확인은 특징적인 피크들 (° 2θ의 단위), 전형적으로는 더욱 우세한 피크들의 임의의 독특한 조합을 기초로 할 수 있다. 주위 온도 및 상대 습도에서 수집된 결정 형태 회절 패턴을 8.85 및 26.77도 2-θ에서의 NIST 675 표준물 피크를 기초로 조정하였다.

6-((S)-1-{1-[5-(2-히드록시-에톡시)-피리딘-2-일]-1H-피라졸-3-일}-에틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (이성질체 1)은 CuKa 방사선조사를 사용하는 XRPD 패턴에 의해 하기 표 1에 기술된 바와 같은 회절 피크 (2-θ 값)가 있는 것으로 특성화되었다. 구체적으로, 이러한 패턴은 0.2도의 회절 각에 대한 공차로, 16.62, 14.39, 14.05, 11.54 및 10.99로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 하나 이상과 조합된 15.81에서의 피크를 함유하였다.

<표 1>

6-((S)-1-{1-[5-(2-히드록시-에톡시)-피리딘-2-일]-1H-피라졸-3-일}-에틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온 (이성질체 1) 형태 1의 X선 분말 회절 피크.

시험관 내에서, 그리고 동물 연구에서 생성된 데이터는 특히 발작 치료에서의 TARP γ8 의존성 AMPA 수용체 길항제 및 본 발명의 화합물에 대한 역할을 지지한다. 구체적으로, 본 발명의 화합물이 높은 효능으로 TARP γ8 의존성 AMPA 수용체를 선택적으로 길항하고 래트 펜틸렌테트라졸 (PTZ)-유도 발작 모델에서 발작에 대해 보호작용을 한다는 것이 발견되었다. 본 발명의 화합물은 마우스에서의 포르말린-유도 통증 모델에서 진통 활성을 또한 실연하였다.

본 발명의 화합물의 특성을 추가로 실연하기 위해, 화합물을 하기의 시험관내 및 생체내 검정법에서 실행시킬 수 있었다:

FLIPR 길항제 기능 검정법

AMPA 수용체 길항제 화합물의 TARP 하위유형-선택성이 해마 강화 TARP (TARP γ-8) 또는 소뇌 강화 TARP (TARP γ-2)와 함께 CHO-S 세포에서 공동-발현된 AMPA GluA1 플롭(flop) 이소형 수용체 서브유닛에서의 화합물의 활성을 비교함으로써 실연되었다. AMPA 수용체 길항제 화합물의 TARP 의존성이 상기 활성을 공동-발현된 TARP의 부재 하에 CHO-S 세포에서 발현된 AMPA GluA1 플립(flip) 이소형 수용체 서브유닛에서의 활성과 비교함으로써 실연되었다.

간략하게, CHO-S (인비트로젠(Invitrogen)) 세포를 50/50 맞춤 배지에서 1×10⁷개의 세포/㎖의 밀도로 현탁 성장시켰다. (50/50 맞춤 배지는 CD CHO 배지 (깁코(Gibco) #10743) 및 맞춤 완전 배지의 1:1 (v/v) 혼합물로서 제조된 저칼슘 배지이다. 맞춤 완전 배지는 0.40 ㎎/ℓ 트로폴론, 5.00 ㎎/ℓ 인슐린, 20 mM HEPES, 및 0.075% 플루로닉(Pluronic)® F68을 하기 제법의 맞춤 기본 배지에 첨가함으로써 제조된다: (달리 특정되지 않는 한 값은 ㎎/ℓ 단위이다) 11.01 무수 염화칼슘, 0.050 질산제2철-9H₂O, 0.420 황산제1철-7H₂O, 28.64 무수 염화마그네슘, 48.84 무수 황산마그네슘, 312.14 KCl, 5505.96 NaCl, 62.57 1염기성 인산나트륨, 71.28 무수 2염기성 인산나트륨, 0.432 황산아연-7H₂O, 10.0 에탄올아민 HCl, 6000 D-글루코스 (덱스트로스), 0.210 DL 리포산 티옥트산, 0.081 푸트레신 2 HCl, 4.78 소듐 하이포잔틴, 220.24 피루브산나트륨, 0.730 티미딘, 8.90 L-알라닌, 211.23 L-아르기닌 HCl, 15.02 L-아스파라긴 H₂O, 13.31 L-아스파르트산, 62.67 시스틴 2 HCl, 7.360 L-글루탐산, 146.16 L-글루타민, 30.0 글리신, 42.04 L-히스티딘 HCl 2 H₂O, 105.11 L-이소류신, 105.11 L-류신, 146.16 L-리신 HCl, 30.03 L-메티오닌, 66.07 L-페닐알라닌, 17.27 L-프롤린, 42.04 L-세린, 95.1 L-트레오닌, 16.02 L-트립토판, 104.11 L-티로신 디소듐 염, 94.1 L-발린, 8.99 염화콜린, 4.00 엽산, 12.61 I 이노시톨, 4.00 니아신아미드, 4.00 피리독살 HCl, 0.031 피리독신 HCl, 0.400 리보플라빈, 4.00 소듐 판토테네이트, 4.00 티아민 HCl, 0.680 비타민 B12, 및 2200 중탄산나트륨.) 세포를 1000×g에서 15분 동안 원심분리하고, 신선한 50/50 맞춤 배지에 2×10⁶개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 배치 형질감염을 위해, 2 ㎎의 전체 DNA(들)를 각각의 세포 ℓ에 대해 사용하였다. CHO-S 세포의 GluA1-γ8 형질감염을 위해, 인간 GluA1Q플롭-Cacng8-pBudCE4.1 DNA (퀴아젠(Qiagen)) 및 인간 EAAT3 pAN104 DNA (퀴아젠, 글루타민 수송체)를 2:3의 비로 혼합하였다. CHO-S 세포의 GluA1-γ2 형질감염을 위해, 인간 GluA1Q플롭-Cacng2-pBudCE4.1 (퀴아젠)을 사용하였다. CHO-S 세포의 GluA1플립 형질감염을 위해, 인간 GluA1플립 pcDNA3.1 DNA (퀴아젠)을 사용하였다. DNA(들) 및 프리스타일™ 맥스(FreeStyle™ MAX) 시약 (인비트로젠 카탈로그#16447-500)을 기본 맞춤 배지 (상기 참조)에 10 ㎍ 전체 DNA:10 ㎕ 프리스타일™ 맥스 시약:1 ㎖ 배지의 비율로 첨가하여, DNA 복합체를 형성시켰다. 15분 후, 적합한 부피 (20% v/v)의 DNA 복합체를 제조된 세포 배양물에 첨가하였다. 일시적으로 형질감염된 CHO-S 세포를 48시간 후에 수확하고, 추후 사용을 위해 분취하여 동결시켰다. 형질감염된 세포에서의 AMPA 수용체의 기능 및 약리학을 신선하게 제조된 세포 분취액 및 해동된 세포 분취액 둘 다에서 확인하였다.

AMPA 수용체를 발현하는 동결된 형질감염된 CHO-S 세포를 해동시키고, 384-웰 폴리-D-리신 코팅 플레이트 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 카탈로그# 354663)에 웰 당 50,000개의 세포로 5% 투석 소 태아 혈청 (깁코, 카탈로그# 26400-036) 및 20 mM HEPES를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM 배지) (깁코, 카탈로그# 11960) 내에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 실험 당일에, 2개의 형광 염료 로딩 완충제를 제조하였다. 플루오(Fluo)-4 AM 염료 로딩 완충제는 20 mM HEPES (pH 7.4), 2.5 mM 프로베네시드 (시그마(Sigma), 카탈로그# P8761, 세포 수송체가 염료를 퍼내는 것을 억제함), 및 5 nM 플루로닉® F-127 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 카탈로그# P3000MP)를 함유하는 행크 밸런스 염 용액 (HBSS) 내의 5 μM 플루오-4 AM 염료 (몰레큘라 프로브스, 카탈로그# F-14202)로 이루어졌다. 플루오-4 NW 염료 로딩 완충제는 20 mM HEPES (pH 7.4) 및 2.5 mM 프로베네시드를 함유하는 HBSS 100 ㎖를 한 병의 플루오-4 NW 염료 (몰레큘라 프로브스, 고처리량 팩, 카탈로그# F36205)에 첨가함으로써 제조되었다. 배양된 GluA1- γ8 및 GluA1- γ2 CHO-S 세포에 플루오-4 AM 염료 로딩 완충제를 로딩하고, 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. GluA1플립 CHO-S 세포에 플루오-4 NW 염료 로딩 완충제를 로딩하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 추가로 90분 동안 22℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 화합물에 노출시키는 것을 시작하기 전에, 세포 플레이트 내의 염료 로딩 완충제를 제거하고, 신선한 검정법 완충제를 첨가하였다. 검정법 완충제는 HBSS + 20 mM HEPES (pH 7.4), 2.5 mM 프로베네시드 및 4 mM CaCl₂로 이루어졌다. 화합물을 첨가한 후 세포를 검정법 완충제 내의 글루타메이트 (최종 농도 = 45 μM) 및 시클로티아지드 (CTZ, 최종 농도 = 20 μM)로 자극함으로써 검정법이 개시되었다. 세포내 [Ca++]의 변화를 형광 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR)로 동역학적으로 기록하였다. 화합물의 부재 하에 나타난 효과에 대한 시험 화합물의 존재 하에 글루타메이트 + CTZ에 의해 자극된 응답의 백분율로서 시험 화합물에 의한 글루타메이트 효과의 억제가 표현되었다. 4-파라미터 비선형 로지스틱 방정식을 사용하여 상대적인 IC₅₀이 계산되었다. GluA1플립 단독 또는 GluA1플롭-γ2를 발현하는 CHO-S 세포를 사용하여 화합물을 유사하게 평가하여, TARP-의존성 및 TARP-선택적 활성을 확증하였다.

실시예 2의 화합물을 본질적으로 상기 기술된 바와 같이 검정하였고, 이는 74.5 ± 17.8 nM (평균 ± SEM, n=9)의 IC₅₀으로, 약 85.6 ± 0.7% (평균 ± SEM, n=9)로 TARP γ8 의존성 GluA1 플롭 수용체의 글루타메이트 + CTZ 활성화를 억제하는 것으로 확인되었지만, TARP가 없는 플립 이소형 또는 TARP γ2 의존성 GluA1 플롭 수용체는 억제하지 않았다 (IC₅₀ > 9260 nM의 검정법 한계).

따라서, 생리학적으로 관련된 용량의 본 발명의 화합물이 다른 생리학적으로 관련된 수용체, 예를 들어 TARP 독립적 수용체 또는 TARP γ2 의존성 수용체와 실질적으로 상호작용하지 않으면서 생체 내에서 TARP γ8 AMPA 수용체의 실질적인 억제를 제공할 것으로 예상되고, 따라서 비-TARP-의존성 AMPA 수용체 길항제와 연관된 원치 않는 효과를 피하면서 발작 치료에 유용할 수 있다.

래트 펜틸렌테트라졸 ( PTZ )-유도 발작 모델:

시험 시점에 체중이 90-110 그램인 수컷 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트 (할랜 스프라그 돌리(Harlan Sprague Dawley), 인디애나주 인디애나폴리스)를 표준 빛 사이클 (오전 6시에 불을 켜고, 오후 6시에 불을 끔)로 대형 사육실에서 음식 및 물에 자유롭게 접근하게 하면서 우리 당 5마리로 수용하였다. 동물을 사육실에서 적어도 3일 동안 유지시킨 후 시험하였다. 시험을 시작하기 1시간 전에 격리실로 동물을 옮겼다. 동물을 1번만 사용하였다.

동물을 이동시키고, 화합물 또는 비히클 (5% DMSO, 10% 아카시아 및 0.05% 다우 코닝(Dow Corning)® 1510-US 소포제)을 p.o., 10 ㎖/㎏으로 투약하고, 이들의 우리로 돌려보냈다. 투약하고 나서 25분 후에, 동물을 스크린 상에 놓고, 스크린을 180도 역전시켜서 운동 손상에 대해 시험하였다. 역전 60초 후에 하기와 같이 동물을 채점하였다: 0점 - 동물이 스크린을 타고 넘는 경우; 1점 - 동물이 스크린의 바닥에 매달린 경우; 2점 - 동물이 스크린에서 떨어진 경우. 스크린 시험을 완료한 후, 동물에게 염수 내의 35 ㎎/㎏ PTZ를 1 ㎖/㎏의 부피로 S.C. 투약하였다. 그 후, 동물을 관찰 우리 내에 놓고, PTZ 후 30분 동안 관찰하였다. 간대성 경련은 앞다리 및/또는 뒷다리의 간대성 발작으로서 정의되고, 이러한 경련 동안 래트는 바로잡기의 상실을 나타낸다. 긴장성 발작은 긴장성 뒷다리 펴기가 있는 바로잡기의 상실로서 정의된다. 관찰 기간 동안의 치사율을 또한 기록하였다. 관찰 기간 동안의 임의 시점의 특정 발작 유형의 존재에 따라 동물을 채점하였다. 소정의 발작 유형이 있는 동물의 수로서 데이터를 기록하였다 (예를 들어, 4/5 간대성 발작은 5마리의 동물 중 4마리가 관찰 기간 동안의 임의의 시간에 임의 기간의 1회 이상의 간대성 발작을 나타냈음을 의미한다).

실시예 2의 화합물을 1-10 ㎎/㎏의 용량 범위로 본질적으로 상기 기술된 바와 같이 시험하였고, 이는 10 ㎎/㎏ 용량에서 1.74 ㎎/㎏의 추정 ED₅₀ 및 100% 보호로 PTZ-유도 발작에 대해 래트를 보호하는 것으로 발견되었고, 이때 역전 스크린 시험에 의해 측정 시 어떠한 운동 손상도 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 실시예 2의 화합물이 래트 발작 모델에서 효과가 있고, 따라서 본 발명의 화합물이 비-TARP-의존성 AMPA 수용체 길항제와 연관된 원치 않는 효과를 피하면서 발작 치료에서 유용할 수 있다는 것을 가리킨다.

수동 포르말린-유도 통증 모델

진통 성질에 대해 화합물을 스크리닝하는 것에 대해 수동 포르말린-유도 통증 모델이 잘 알려져 있다 (Mogil J.S. et al., Heritability of nociception I: Responses of 11 inbred mouse strains on 12 measures of nociception. Pain 80 (1999) 67-82). 이러한 검정법은 약 10 ㎝ × 10 ㎝ × 10 ㎝ 크기의 플렉시글라스(Plexiglas)® 박스에서 수행되었다. 우리 뒤쪽에 놓인 거울이 포르말린이 주사된 발을 방해 없이 관찰하게 하였다. 금식시키지 않은 수컷 마우스 (할란(Harlan) (HSD) CD1-Icr)를 실험 전에 적어도 60분 동안 개별적으로 칸막이방 내에 놓았다. 모든 시험은 08:00시 내지 16:00시 사이에 수행되었고, 시험실의 온도는 21-23 ℃로 유지되었다. 다중 용량의 시험 화합물 (3, 10 및 30 ㎎/㎏), 비히클 (10% 아카시아, 0.05% 소포제 내의 5% DMSO), 및 양성 대조군 (1% HEC, 0.25% 트윈(Tween) 80, 0.05% 소포제 내의 트라마돌 80 ㎎/㎏)을 포르말린 챌린지 이전의 다양한 시점에 말초 투여하였다 (p.o.). 포르말린 (0.9% 염수 내의 5% 용액 20 ㎕)을 27 게이지 바늘로 왼쪽 뒷발의 발바닥 표면 내로 피하 주사하였다. 포르말린 주사 직후에 관찰을 시작하였다. 5분 간격에서 각각의 핥기 사례가 지속되는 초수를 기록함으로써 포르말린-유도 통증을 정량하였다. 포르말린 주사 후 60분 동안 통증 점수를 측정하였다. 기존에 기술된 바와 같이 통증 거동의 2가지 단계가 관찰되었다 (Wheeler-Aceto, H., Porreca, F. and Cowan, A., The rat paw formalin test: comparison of noxious agents, Pain 40 (1990) 229-238.). 초기 단계는 포르말린 주사 직후에 직후에 시작되었고, 약 5분 동안 지속되었으며, 그 후 10-15분 사이에 후기 단계가 시작되었고, 이때 최대 응답은 전형적으로 포르말린 주사 후 25-40분 정도에 관찰되었다. 60분 관찰 기간 후에, 동물을 CO₂에 이어지는 경부 탈구로 희생시켰다. 포르말린 시험에 대해 보고된 여러 채점 파라미터들 중에서, 주사맞은 발을 핥고 깨무는데 소요된 총 시간이 가장 적절한 것으로 고려되었다. (Abbott et al., The formalin test: scoring properties of the first and second phases of the pain response in rats, Pain 60 (1995) 91-102; Coderre et al., The formalin test: a validation of the weighted-scores method of the behavioral pain rating, Pain 54 (1993) 43-50).) 초기 단계 점수는 0 내지 5분의 시간에 핥는데 소요된 시간의 합계 (초)였다. 후기 단계 점수는 15분 내지 55분의 관찰 기간에 핥는데 소요된 전체 초수를 합산함으로써 수득되었다. 데이터는 평균과 평균의 표준 오차 (±SEM)로서 제시되었다. 양측 비교에 대해 던넷(Dunnett) "t" 검정으로 분석된 적합한 대비 및 1원 분산 분석 (ANOVA)에 의해 데이터를 평가하였다. P-값이 0.05 미만이면 차이가 유의한 것으로 간주되었다. (애보트(Abbott)의 상기 문헌; 코데르(Coderre)의 상기 문헌; 및 휠러-아세토(Wheeler-Aceto)의 상기 문헌)

실시예 2의 화합물을 본질적으로 상기 기술된 바와 같이 시험하였고, 이는 하기의 용량 응답으로부터 유래된 2.61 ㎎/㎏의 ED₅₀으로 통증 거동을 유의하게 감소시키는 것으로 확인되었다:

용량 (㎎/㎏ p.o.) 총 핥는 시간의 % 감소 S.E.M.

30 90.0 3.4%

10 80.4 8.6%

3 53.9 7.2%

따라서, 본 발명의 화합물은 통증 치료에서 유용할 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용된 화합물을 어떠한 제제화도 없이 직접적으로 투여하는 것이 가능하지만, 일반적으로 화합물은 활성 성분으로서의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 제약 조성물의 형태로 투여된다. 이러한 조성물은 경구, 설하, 비내, 피하, 정맥내 및 근육내를 포함하는 다양한 경로로 투여될 수 있다. 이같은 제약 조성물 및 그의 제조 방법이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (University of the Sciences in Philadelphia, ed., 21^st ed., Lippincott Williams & Wilkins Co., 2005)]를 참조한다.

바람직하게는 조성물은 단위 투여량 형태로 제제화되고, 이때 각각의 투여량은 약 25 내지 약 1000 ㎎, 더욱 일반적으로는 약 50 내지 약 500 ㎎, 예를 들어 약 100 ㎎의 활성 성분을 함유한다. "단위 투여량 형태"라는 용어는 각각의 단위가 하나 이상의 적절한 제약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 원하는 치료 효과를 일으키도록 계산된 미리 정해진 양의 활성 물질을 함유하는, 인간 대상체 및 기타 포유동물에 대한 단위 투여량으로서 적절한 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다.

화학식 I의 화합물은 일반적으로 광범위한 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 일일 투여량은 일반적으로 약 0.3 ㎎/체중 ㎏ 내지 약 15 ㎎/체중 ㎏, 더욱 일반적으로는 약 0.7 ㎎/체중 ㎏ 내지 약 7.5 ㎎/체중 ㎏, 예를 들어 약 1.5 ㎎/체중 ㎏의 범위에 속할 것이다. 일부 경우에는 상기 언급된 범위의 하한보다 낮은 투여량 수준이 더욱 적합할 수 있는 한편, 다른 경우에는 더 큰 용량이 어떠한 해로운 부작용도 야기하지 않으면서 사용될 수 있고, 따라서 상기 투여량 범위는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 한정하도록 의도되지 않는다. 일일 용량을 각각의 날에 걸쳐 부분적으로 투여하는 것이 또한 유리할 수 있다 (예를 들어, 하루에 2번 ½ 용량 또는 하루에 3번 1/3 용량). 실제 투여되는 화합물의 양은 치료될 병태, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물 또는 화합물들, 개별적인 환자의 연령, 체중 및 응답, 및 환자 증상의 중증도가 포함되는 관련 상황의 견지에서 의사에 의해 결정될 것임이 이해될 것이다.

본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 예를 들어 본 발명의 제약 조성물 내의 것이 발작을 방지하기 위한 만성 투여에 의해 및/또는 진행 중인 발작을 제어하거나 정지시키기 위한 급성 투여에 의해 발작을 치료하는데 사용될 것으로 구상된다.

Claims

하기 화학식의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항에 있어서, 6-((S)-1-{1-[5-(2-히드록시-에톡시)-피리딘-2-일]-1H-피라졸-3-일}-에틸)-3H-1,3-벤조티아졸-2-온인 화합물.
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제1항 또는 제2항에 따른 화합물 또는 염을 포함하는, 간질에 걸린 환자에서의 발작의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
제1항 또는 제2항에 따른 화합물 또는 염을 포함하는, 통증의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
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