KR101653471B1 - 다단계 최종 여과 - Google Patents

다단계 최종 여과 Download PDF

Info

Publication number
KR101653471B1
KR101653471B1 KR1020147016901A KR20147016901A KR101653471B1 KR 101653471 B1 KR101653471 B1 KR 101653471B1 KR 1020147016901 A KR1020147016901 A KR 1020147016901A KR 20147016901 A KR20147016901 A KR 20147016901A KR 101653471 B1 KR101653471 B1 KR 101653471B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
filter
immunoglobulin
pore size
solution
combination
Prior art date
Application number
KR1020147016901A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140091763A (ko
Inventor
로베르토 팔켄슈타인
클라우스 슈벤드너
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에프. 호프만-라 로슈 아게 filed Critical 에프. 호프만-라 로슈 아게
Publication of KR20140091763A publication Critical patent/KR20140091763A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101653471B1 publication Critical patent/KR101653471B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)

Abstract

본원에서는, 기공 크기 3.0 ㎛ 및 0.8 ㎛ 의 1 차 필터, 및 기공 크기 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 의 2 차 필터로의 2 가지의 즉각적인 연속 여과 단계의 조합을 포함하는, 농축 폴리펩티드 용액의 최종 여과를 위한 방법을 보고하고 있다.

Description

다단계 최종 여과 {MULTISTEP FINAL FILTRATION}
본원에서는, 기공 크기 3.0 ㎛ 의 필터로의 예비-여과 및 기공 크기 0.8 ㎛ 의 필터로의 주요-여과를 갖는 1 차 여과 단계, 및 기공 크기 0.45 ㎛ 의 필터로의 예비-여과 및 기공 크기 0.22 ㎛ 의 필터로의 주요-여과를 갖는 2 차 여과 단계의 2 가지의 즉각적인 연속 여과 단계의 조합을 포함하는, 농축 폴리펩티드 용액의 최종 여과를 위한 방법을 보고하고 있다.
100 g/ℓ 초과 농도의 단백질 용액은, 예를 들어 단지 낮은 막통과 흐름을 가지거나, 제형화 또는 농축 과정 동안 형성된 응집물 또는 입자에 의한, 또는 추가된 부형제로 인한 사용 필터의 폐색에 의해, 농축 용액의 점도 증가를 일으키는 최종 여과 단계 동안의 어려움을 갖는 경향이 있다.
고점도 및 입자 또는 응집물 함량 증가의 조합은 사용한 0.22 ㎛ 최종 여과 필터의 기공 폐색을 종종 일으킨다. 그 결과로서, 필터가 여과 단계 동안, 즉 배치가 완전히 진행되기 전에 교체되어야 하거나, 증가된 필터 표면이 사용되어야 한다.
추가로, 기공 크기 0.45 ㎛ 의 필터와 기공 크기 0.22 ㎛ 의 필터의 조합이 이득을 갖지 않는다는 것이 관찰된 바 있다 (예를 들어, Sartobran P 0.45/0.22 ㎛ 필터로서 제공됨). 전에 기재된 문제점을 회피할 수 있는 증가된 기공 크기를 갖는 필터는 뎁스 (depth)-필터 또는 예비-필터로서 (최종 필터로서는 아님) 사용된다.
DE 4 204 444 에서, 0.2 ㎛ 멸균-여과 전에 기체 스트림으로부터 물방울을 제거하기 위한 1.2 ㎛ 예비-필터의 조합이 보고되어 있다. 필터 유닛의 저항성이 감소되도록 구부리기 위해 필터의 유동 방향을 바꿈으로써 작은 기공 크기의 필터가 유연성 있게 되는, 상이한 기공 크기의 2 개 필터를 포함하는 필터 유닛이 US 4,488,961 에 보고되어 있다. US 5,643,566 에서, 기공 크기 0.45 ㎛ 의 필터로의 예비-여과와 기공 크기 0.22 ㎛ 의 필터로의 멸균-여과의 조합이 보고되어 있다. 융기된 팽창자 튜브를 갖는 강성 스크린 지지체에 의해 지지된 얇은, 유연한 기공성 멤브레인 아래에 놓인 평활한 내부를 갖는 멤브레인을 사용하여 구축된 2 단계 필터가 EP 0 204 836 에 보고되어 있다. 상이한 멤브레인 물질 및 상이한 필터 기공 크기 및 필터 기공 구조의 2 개 이상의 멤브레인 필터 유닛의 조합이 DE 3 818 860 에 보고되어 있다.
[Aldington et al. (J. Chrom. B 848 (2007) 64-78)] 은 단일클론 항체 정제 공정의 스케일 업 (scale-up) 을 보고하고 있다. CS 247484 에서 인간 림프구에 대한 면역글로불린의 제조 방법이 보고되어 있다.
발명의 개요
각각 예비-필터 및 주요-필터를 포함하며, 각각 특이적으로 선택된 기공 크기를 갖는 2 개 필터의 조합이, 기공 폐색의 위험성 및 여과 과정 동안 필터를 교체할 필요 없이 최종 패키징 단계 동안 고도로 농축된 면역글로불린 용액을 여과하는데 사용될 수 있다는 것이 발견되었다.
본원에서 보고된 바와 같은 한 양상은, 하기 단계를 포함하는 면역글로불린 용액의 제조 방법이다:
a) 100 g/ℓ 이상의 단백질 농도를 갖는 면역글로불린 용액을 제공하는 단계,
b) 면역글로불린 용액을 1 차 및 2 차 필터의 조합 (1 차 필터는 기공 크기 3.0 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.8 ㎛ 의 주요-필터를 포함하며, 2 차 필터는 기공 크기 0.45 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.22 ㎛ 의 주요-필터를 포함함) 을 통해 여과하여, 면역글로불린 용액을 제조하는 단계.
본원에서 보고된 바와 같은 또다른 양상은, 활성 약학 성분 제조 전에 면역글로불린 용액의 최종 여과를 위한, 1 차 및 2 차 필터의 조합 (1 차 필터는 기공 크기 3.0 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.8 ㎛ 의 주요-필터를 포함하며, 2 차 필터는 기공 크기 0.45 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.22 ㎛ 의 주요-필터를 포함함) 의 본원에서 보고된 바와 같은 필터 조합의 용도이다.
본원에서 보고된 바와 같은 또다른 양상은, 하기 단계를 포함하는 면역글로불린 제조 방법이다:
a) 면역글로불린을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계,
b) 세포를 배양하는 단계,
c) 세포 또는 배양 배지로부터 면역글로불린을 회수하는 단계,
d) 하나 이상의 크로마토그래피 단계로 면역글로불린을 정제하고, 면역글로불린 용액을 제공하는 단계, 및
e) 단계 d) 의 면역글로불린 용액을 1 차 및 2 차 필터의 조합 (1 차 필터는 기공 크기 3.0 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.8 ㎛ 의 주요-필터를 포함하며, 2 차 필터는 기공 크기 0.45 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.22 ㎛ 의 주요-필터를 포함함) 을 통해 여과하여, 면역글로불린을 제조하는 단계.
본원에 보고된 바와 같은 추가적인 양상은, 기공 크기 3.0 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.8 ㎛ 의 주요-필터를 포함하는 1 차 필터, 및 기공 크기 0.45 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.22 ㎛ 의 주요-필터를 포함하는 2 차 필터를 포함하는 키트이다.
한 구현예에서 1 차 필터는 2 차 필터 면적의 최대 2 배인 면적을 갖는다. 또다른 구현예에서 1 차 및 2 차 필터는 대략 동일한 총 필터 면적을 갖는다. 구현예에서 면역글로불린 용액은 당 및/또는 아미노산 및/또는 계면활성제 및/또는 염을 포함한다. 추가적인 구현예에서 면역글로불린 용액은 100 g/ℓ 내지 300 g/ℓ 의 농도를 갖는다. 또다른 구현예에서 면역글로불린 용액은 3 ℓ 내지 100 ℓ 의 부피를 갖는다. 추가적인 구현예에서 여과는 0.1 bar 내지 4.0 bar 의 가압으로 수행된다. 한 구현예에서 면역글로불린 용액은 160 g/ℓ 이상의 농도를 가지며 여과는 1.45 bar 이상의 가압으로 수행된다. 추가적인 구현예에서는 1.50 bar 이상이다. 또다른 구현예에서 면역글로불린 용액은 당 및 계면활성제를 포함하며 125 mg/㎖ 이상의 농도를 가지고, 여과는 0.75 bar 이하의 가압으로 수행된다. 추가적인 구현예에서는 0.7 bar 이하이다.
한 구현예에서 면역글로불린은 항-IL13 수용체 알파 항체 또는 항-HER2 항체이다. 추가적인 구현예에서 정제는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계, 및 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되는 하나 이상의 단계로 수행된다.
도 1: 항체 농도 222 mg/㎖ 의 항-HER2 항체 용액 및 2.0 bar 가압으로 획득한 투과 유량의 시간 추이 (다이아몬드형 = 조합을 포함하는 1.2 ㎛ 기공 크기 필터; 사각형 = 조합을 포함하는 3.0 ㎛ 기공 크기 필터).
도 2: 약 200　mM 트레할로오스 및 약 0.05% (w/v) Tween 20 이 보충된 항체 농도 125 mg/㎖ 의 항-HER2 항체 용액 및 2.0 bar 가압으로 획득한 투과 유량의 시간 추이 (다이아몬드형 = 조합을 포함하는 1.2 ㎛ 기공 크기 필터; 사각형 = 조합을 포함하는 3.0 ㎛ 기공 크기 필터).
도 3: 항체 농도 162 mg/㎖ 의 항-HER2 항체 용액 및 1.8 bar 가압으로 획득한 투과 유량의 시간 추이 (다이아몬드형 = 조합을 포함하는 1.2 ㎛ 기공 크기 필터; 사각형 = 조합을 포함하는 3.0 ㎛ 기공 크기 필터).
도 4: 약 200　mM 트레할로오스 및 약 0.2% (w/v) Poloxamer 가 보충된 항체 농도 141 mg/㎖ 의 항-IL13Rα 항체 용액 및 1.6 bar 가압으로 획득한 투과 유량의 시간 추이 (다이아몬드형 = 조합을 포함하는 1.2 ㎛ 기공 크기 필터; 사각형 = 조합을 포함하는 3.0 ㎛ 기공 크기 필터).
도 5: 항체 농도 162 mg/㎖ 의 항-HER2 항체 용액 및 1.1 bar 가압으로 획득한 투과 유량의 시간 추이 (다이아몬드형 = 조합을 포함하는 1.2 ㎛ 기공 크기 필터; 사각형 = 조합을 포함하는 3.0 ㎛ 기공 크기 필터).
도 6: 트레할로오스 및 Poloxamer 가 보충된 항체 농도 141 mg/㎖ 의 항-IL13Rα 항체 용액 및 0.8 bar 가압으로 획득한 투과 유량의 시간 추이 (다이아몬드형 = 조합을 포함하는 1.2 ㎛ 기공 크기 필터; 사각형 = 조합을 포함하는 3.0 ㎛ 기공 크기 필터).
도 7: 트레할로오스 및 Tween 20 이 보충된 항체 농도 125 mg/㎖ 의 항-HER2 항체 용액 및 0.8 bar 가압으로 획득한 투과 유량의 시간 추이 (다이아몬드형 = 조합을 포함하는 1.2 ㎛ 기공 크기 필터; 사각형 = 조합을 포함하는 3.0 ㎛ 기공 크기 필터).
도 8: 트레할로오스 및 Tween 20 이 보충된 항체 농도 125 mg/㎖ 의 항-HER2 항체 용액 및 0.3 bar 가압으로 획득한 투과 유량의 시간 추이 (다이아몬드형 = 조합을 포함하는 1.2 ㎛ 기공 크기 필터; 사각형 = 조합을 포함하는 3.0 ㎛ 기공 크기 필터).
발명의 상세한 설명
각각 예비-필터 및 주요-필터를 포함하며 각각 특이적으로 선택된 기공 크기를 갖는 2 개 필터 또는 필터 유닛의 조합이, 고도로 농축되고 점성일 뿐 아니라 제형화된 면역글로불린 용액 (즉, 당 및 계면활성제를 포함함) 을 최종 패키징 단계 동안 여과하는데 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 특히, 각각 기공 크기 3.0 ㎛ 및 0.8 ㎛ 의 예비-필터 및 주요-필터를 포함하는 1 차 필터, 및 각각 기공 크기 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 의 예비-필터 및 주요-필터를 포함하는 2 차 필터의 조합이 매우 유리하다. 이러한 조합의 단일 필터 유닛으로, 예를 들어 총 1 kg 의 항-IL-13Ra1 항체 또는 6 kg 의 항-HER2 항체를 함유하는 고도로 농축된 용액을 여과하고, 상기 양을 단지 소량의 물질만을 손실하면서 패키징할 수 있다. 한 구현예에서 용액 부피에 대한 필터 표면 면적의 비를 측정하였다.
한 구현예에서 면역글로불린 용액은 면역글로불린 및 부형제를 포함한다. 또다른 구현예에서 부형제는 글루코오스, 갈락토오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스 및 라피노오스와 같은 당, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴, 이소류신, 류신, 알라닌, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신 및 메티오닌과 같은 아미노산, 염화나트륨, 염화칼륨, 구연산나트륨, 구연산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨과 같은 염, 및 폴리소르베이트 및 폴리 (옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌) 중합체와 같은 계면활성제에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함한다.
본원에서 보고된 바와 같은 여과는 치료 항체의 제조에서 최종 여과 단계로서 사용된다. 이는 필요한 부형제, 안정화제 및/또는 항산화제가 고도로 농축된 항체 용액에 추가된 후 실행될 수 있다. 한 구현예에서 필터의 총 면적에 대한 항체량 (kg) 의 비는 1000 g/㎡ 내지 10,000 g/㎡ 이다. 또다른 구현예에서 상기 비는 1000 g/㎡ 내지 6000 g/㎡ 이다. 또다른 구현예에서 상기 비는 4000 g/㎡ 내지 6000 g/㎡ 이다.
"폴리펩티드" 는 자연적으로 생성되거나 합성적으로 생성된, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 이루어지는 중합체이다. 약 20 개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩티드는 "펩티드" 로서 지칭될 수 있는 한편, 둘 이상의 폴리펩티드로 이루어지거나 100 개 초과의 아미노산 잔기의 하나의 폴리펩티드를 포함하는 분자는 "단백질" 로서 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 탄수화물군, 금속 이온 또는 카르복실산 에스테르와 같은 비-아미노산 성분을 포함할 수 있다. 상기 비-아미노산 성분은 폴리펩티드가 발현되는 세포에 의해 부가될 수 있으며, 세포 유형에 따라 가변적일 수 있다. 폴리펩티드는 본원에서 이의 아미노산 골격 구조 또는 이를 인코딩하는 핵산의 측면에 있어서 정의된다. 탄수화물군과 같은 부가물은 일반적으로 명기되지 않으나, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
용어 "면역글로불린" 은 면역글로불린 유전자에 의해 실제적으로 인코딩된 하나 이상의 폴리펩티드(들) 로 이루어지는 단백질을 지칭한다. 인지된 면역글로불린 유전자는 상이한 불변부 유전자 뿐 아니라 무수한 면역글로불린 가변부 유전자를 포함한다. 면역글로불린은 예를 들어, Fv, Fab 및 F(ab)2 뿐 아니라 단일 사슬 (scFv) 또는 디아바디 (diabodies) 를 포함하는 다양한 포맷으로 존재할 수 있다.
용어 "완전 면역글로불린" 은 2 개의 소위 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 (경쇄) 및 2 개의 소위 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 (중쇄) 를 포함하는 면역글로불린을 나타낸다. 완전 면역글로불린의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 각각은, 항원과 상호작용할 수 있는 결합부를 포함하는 가변 도메인 (가변부) (일반적으로 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단 부위) 을 포함한다. 완전 면역글로불린의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 각각은 또한 불변부 (일반적으로 카르복실 말단 부위) 를 포함한다. 중쇄의 불변부는 항체가 i) 식세포와 같은 Fc 감마 수용체 (FcγR) 를 갖는 세포, 또는 ii) 브람벨 (Brambell) 수용체로도 알려져 있는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 를 갖는 세포에 결합하는 것을 매개한다. 이는 또한 성분 (C1q) 과 같은 전통적인 보체 시스템의 인자를 포함하는 일부 인자에 대한 결합을 매개한다. 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인은 결과적으로, 상이한 분절, 즉 4 개의 골격부 (FR) 및 3 개의 과가변부 (CDR) 를 포함한다.
용어 "면역글로불린 단편" 은 중쇄의 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지 부위, 중쇄의 CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인, 경쇄의 가변 도메인 및/또는 경쇄의 CL 도메인 중 하나 이상의 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 또한, 이의 유도체 및 변이체가 포함된다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 또는 아미노산 부위가 결실된 가변 도메인이 존재할 수 있다.
용어 "면역글로불린 컨쥬게이트" 는 펩티드 결합을 통해 추가의 폴리펩티드에 컨쥬게이션된 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 하나 이상의 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 상기 추가의 폴리펩티드는 비-면역글로불린 펩티드, 예컨대 호르몬, 또는 성장 수용체, 또는 항융합형성 (antifusogenic) 펩티드, 또는 보체 인자 등이다.
용어 "필터" 는 미세공성 또는 거대공성 필터 모두를 나타낸다. 필터는 자체적으로 중합성 물질 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리카르보네이트, 폴리 비닐 클로라이드, 폴리아미드 (나일론, 예를 들어 ZetaporeTM, N66 PosidyneTM), 폴리에스테르, 셀룰로오스 아세테이트, 재생 셀룰로오스, 셀룰로오스 혼성물, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리아릴술폰, 폴리페닐술폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 비-직물 및 직물 (예를 들어 Tyvek
Figure 112014057480610-pat00001
), 섬유성 물질, 또는 무기 물질 예컨대 비석 (zeolithe), SiO2, Al2O3, TiO2 또는 히드록시아파타이트로 이루어지는 필터 멤브레인을 포함한다. 한 구현예에서 1 차 및 2 차 필터의 필터 멤브레인은 셀룰로오스 아세테이트로 만들어진다.
재조합적으로 생성된 면역글로불린의 정제를 위해서, 상이한 컬럼 크로마토그래피 단계의 조합이 종종 사용된다. 일반적으로 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어 하나 또는 둘의 추가적인 분리 단계가 뒤따른다. 최종 정제 단계는, 미량의 불순물 및 오염물 (응집된 면역글로불린과 같은), 잔존 HCP (숙주 세포 단백질), DNA (숙주 세포 핵산), 바이러스 또는 엔도톡신의 제거를 위한 소위 "연마 (polishing) 단계" 이다. 이러한 연마 단계에 대해서, 유동 (flow-through) 방식으로의 음이온 교환 물질이 종종 사용된다.
단백질 회수 및 정제를 위한 상이한 방법이 잘 확립되어 있으며 널리 사용되고 있는데, 예를 들어 미생물 단백질로의 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합 방식 교환), 친황성 흡착 (예를 들어 베타-머캅토에탄올 및 기타 SH 리간드로의), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어 페닐-세파로오스, 아자-아레노필릭 (aza-arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산으로의), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질로의), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동법 (예컨대 겔 전기영동, 모세관 전기영동) 이 있다 (Vijayalakshmi, M.　A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).
본원에서 보고된 바와 같은 제 1 양상은 하기 단계를 포함하는 면역글로불린 용액의 제조 방법이다:
- 100 g/ℓ 이상의 단백질 농도를 갖는 면역글로불린 용액을 제공하는 단계,
- 필터 조합에 용액을 적용하고 압력을 가함으로써, 면역글로불린 용액을 1 차 및 2 차 필터 유닛의 조합 (1 차 필터 유닛은 각각 기공 크기 3.0 ㎛ 및 0.8 ㎛ 의 예비-필터 및 주요-필터를 포함하며, 2 차 필터 유닛은 각각 기공 크기 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 의 예비-필터 및 주요-필터를 포함함) 을 통해 여과하여, 면역글로불린 용액을 제조하는 단계.
한 구현예에서 단백질 농도는 100 g/ℓ 내지 300 g/ℓ 이다. 또다른 구현예에서 단백질 농도는 100 g/ℓ 에서 200 g/ℓ 까지이다. 추가적인 구현예에서 단백질 농도는 120 g/ℓ 내지 165 g/ℓ 이다. 또다른 구현예에서 면역글로불린 용액은 3 ℓ 내지 100 ℓ 의 부피를 갖는다. 상기 용액 부피는 300 g 내지 50,000 g 의 면역글로불린 총 질량과 동등하다. 한 구현예에서 부피는 3.1 ℓ 내지 80 ℓ 이다. 120 g/ℓ 내지 165 g/ℓ 의 단백질 농도에서, 상기 용액 부피는 370 g 내지 13,200 g 의 면역글로불린 총 질량과 동등하다. 한 구현예에서 면역글로불린은 항-IL13 수용체 알파 항체이다. 또다른 구현예에서 면역글로불린은 항-HER2 항체이다.
본원에서 보고된 바와 같은 또다른 양상은 하기 단계를 포함하는 면역글로불린 제조 방법이다:
- 면역글로불린을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,
- 세포 또는 배양 배지로부터 면역글로불린을 회수하는 단계,
- 하나 이상의 크로마토그래피 단계로 면역글로불린을 정제하고, 정제된 면역글로불린 용액을 제공하는 단계, 및
- 용액을 필터 조합에 적용하고 압력을 가함으로써, 상기 정제된 면역글로불린 용액을 본원에서 보고된 바와 같은 필터의 조합, 즉 1 차 및 2 차 필터 유닛의 조합 (1 차 필터 유닛은 각각 기공 크기 3.0 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.8 ㎛ 의 주요-필터를 포함하며, 2 차 필터 유닛은 각각 기공 크기 0.45 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.22 ㎛ 의 주요-필터를 포함함) 을 통해 여과하는 단계.
*한 구현예에서 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포이다. 세포가 원핵생물 세포인 한 구현예에서, 세포는 대장균 (E.coli) 세포 또는 바실러스 (bacillus) 세포에서 선택된다. 세포가 진행생물 세포인 한 구현예에서, 세포는 포유류 세포에서 선택되며, 구체적인 구현예에서는 CHO 세포, BHK 세포, HEK 세포, Per.C6
Figure 112014057480610-pat00002
세포 및 하이브리도마 세포에서 선택된다. 한 구현예에서 세포는 CHO-K1 및 CHO DG44 에서 선택되는 포유류 세포이다. 한 구현예에서 배양은 20℃ 내지 40℃ 의 온도에서, 4 내지 28 일의 기간 동안 이루어진다. 한 구현예에서 정제는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계, 및 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되는 하나 이상의 단계로 이루어진다.
각각 기공 크기 3.0 ㎛ 및 0.8 ㎛ 의 예비-필터 및 주요-필터를 포함하는 1 차 필터 유닛과, 각각 기공 크기 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 의 예비-필터 및 주요-필터를 포함하는 2 차 필터 유닛의 조합이, 필터를 교체할 필요 없이 농축된 면역글로불린 용액의 전체 배치가 여과되게 함으로써 고도로 농축된 면역글로불린 용액을 가공 (여과) 하는데 유리하다는 것이 발견되었다.
2 개의 필터 각각이 유닛에서 사용된 필터 조합이 유리할 뿐 아니라, 상기 필터 조합이 대략적으로 동일한 필터 면적 (즉, 최소 필터 면적의 2 배 내) 을 갖는다는 것이 추가로 발견되었다.
면역글로불린 외의 용액 성분에 따라, 상이한 압력 및 농도 범위가 유리한 방법을 위해 제공된다는 것이 추가로 발견되었다.
용액이 160 g/ℓ 이상의 농도, 즉 165 g/ℓ 또는 170 g/ℓ 의 농도를 가지며 이에 당 또는 계면활성제가 추가되지 않은 농축 면역글로불린 용액인 경우, 상기 방법은 한 구현예에서 1.45 bar 이상의 가압으로, 또다른 구현예에서는 1.5 bar 이상의 가압으로 실행된다. 용액이 125 g/ℓ 이상의 농도, 즉 130 g/ℓ 또는 135 g/ℓ 의 농도를 가지며 이에 당 및 계면활성제가 추가된 농축 면역글로불린 용액인 경우, 상기 방법은 한 구현에에서 0.75 bar 이하의 가압으로, 또다른 구현예에서는 0.7 bar 이하의 가압으로 실행된다.
본원에 보고된 바와 같은 또다른 양상은 각각 기공 크기 3.0 ㎛ 및 0.8 ㎛ 의 예비-필터 및 주요-필터를 포함하는 1 차 필터 유닛, 및 각각 기공 크기 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 의 예비-필터 및 주요-필터를 포함하는 2 차 필터 유닛을 포함하는 키트이다. 본원에서 보고된 바와 같은 또다른 양상은, 100 g/ℓ 이상의 단백질 농도를 갖는 농축 면역글로불린 용액의 여과를 위한, 각각 기공 크기 3.0 ㎛ 및 0.8 ㎛ 의 예비-필터 및 주요-필터를 포함하는 1 차 필터 유닛, 및 각각 기공 크기 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 의 예비-필터 및 주요-필터를 포함하는 2 차 필터 유닛을 포함하는 필터의 용도이다.
본 발명의 이해를 돕기 위해 하기의 실시예 및 도면을 제공하였으며, 이의 진정한 범주는 첨부된 청구항에서 설명된다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 설명한 절차에 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해된다.
[ 실시예 ]
물질 및 방법
항체
예시적인 항체는, 예를 들어 WO　2006/072564 (본원에 참조로 포함됨) 의 SEQ ID NO: 01 내지 12 에서 보고하는 바와 같은 IL13 수용체 α1 단백질 (항-IL13Rα1 항체) 에 대한 면역글로불린이다.
또다른 예시적인 면역글로불린은, WO　92/022653, WO 99/057134, WO　97/04801, US 5,677,171 및 US 5,821,337 (본원에 참조로 포함됨) 에서 보고된 항-HER2 항체이다.
필터
여기서는, 다른 것들 중 Sartobran P 0.45 ㎛ + 0.2 ㎛ 필터 카트리지 및 Sartoclean CA 3.0 ㎛ + 0.8 ㎛ 필터 카트리지를 예시적으로 사용하였다. 두 필터 카트리지 모두 Sartorius AG, Goettingen, Germany 로부터 이용가능하였다.
분석법
크기 배제 크로마토그래피:
- 수지: TSK 3000 (Tosohaas)
- 컬럼: 300 x 7.8 mm
- 유량: 0.5 ㎖/분
- 완충액: 250 mM 염화칼륨을 함유하는 200 mM 인산칼륨, pH 7.0 으로 조정
- 파장: 280 nm
DNA-역치-시스템: 예를 들어 [Merrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403] 를 참조
단백질 A ELISA: 마이크로타이터 플레이트의 웰을 닭 유래 다클론 항-단백질 A-IgG 로 코팅하였다. 결합 후 미-반응 항체를 샘플 완충액으로 세척하여 제거하였다. 단백질　A 결합을 위해서, 정의된 샘플 부피를 웰에 추가하였다. 샘플 내에 존재하는 단백질 A 는 닭 항체에 의해 결합되고, 플레이트의 웰 내에 보유된다. 인큐베이션 후, 샘플 용액을 제거하고 웰을 세척하였다. 검출을 위해 이후 닭 유래 다클론 항-단백질 A-IgG-비오틴 컨쥬게이트 및 스트렙타비딘 퍼옥시다아제 컨쥬게이트를 추가하였다. 추가적인 세척 단계 후 기질 용액을 추가하였는데, 이는 착색된 반응 산물의 형성을 야기하였다. 색의 세기는 샘플의 단백질 A 함량에 비례하였다. 정의된 시간 후에 반응을 중지시키고 흡광도를 측정하였다.
숙주 세포 단백질 (HCP) ELISA: 마이크로타이터 플레이트의 웰 벽을 혈청 알부민 및 스트렙타비딘의 혼합물로 코팅하였다. HCP 에 대한 염소 유래 다클론 항체를 마이크로타이터 플레이트의 웰 벽에 결합시켰다. 세척 단계 후, 마이크로타이터 플레이트의 상이한 웰을 상이한 농도 및 샘플 용액의 HCP 교정 순서로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 결합하지 않은 샘플 물질을 완충 용액으로 세척하여 제거하였다. 검출을 위해 웰을 항체 퍼옥시다아제 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션하여, 결합한 숙주 세포 단백질을 검출하였다. 고정된 퍼옥시다아제 활성을, ABTS 와 함께 인큐베이션하고 405 nm 에서 검출함으로써 검출하였다.
0.45 ㎛ 및 0.22　㎛ 기공 크기의 단일 필터로의 항- HER2 항체의 여과
이 실시예에서는, 고도로 농축된 면역글로불린 용액이, 필터 면적 1 ㎡ 당 2,460 g 초과의 단백질 로딩으로 필터 기공이 폐색되는 일 없이 기공 크기 0.45 ㎛ (예비-필터) 및 0.22 ㎛ (주요-필터) 의 단일 멸균 필터로 여과될 수 없다는 것을 나타낸다.
이 실시예에서는, 기공 크기 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛, 및 총 필터 면적 0.2 ㎡ 의 단일 필터를 사용하였다.
단일 필터 여과에서 사용한 용액
용액 번호 1 2 3 4 5
단백질 질량 [g] 473 491 496 501 542
부피 [ℓ] 3.940 4.200 4.134 4.139 4.516
로딩 [g/㎡] 2,365 2,455 2,480 2,505 2,710
농축 면역글로불린 용액을 하기 표 2 에 나타낸 바와 같은 매개변수로 단일 필터를 통해 여과하였다.
공정 매개변수
용액 번호 1 2 3 4 5
부피 유동
[ℓ/시간]		 1.97 2.1 기공 폐색으로 인해 0 으로 하락 기공 폐색으로 인해 0 으로 하락 기공 폐색으로 인해 0 으로 하락
질량 유동
[g/시간]		 237 246 기공 폐색으로 인해 0 으로 하락 기공 폐색으로 인해 0 으로 하락 기공 폐색으로 인해 0 으로 하락
용액 번호 3 내지 5 에 대해서, 단일 필터의 기공은 배치 부피의 완전 여과 전에 폐색되었다. 여과를 완료하기 위해서는 폐색된 필터를 바꾸어야 했는데, 이는 추가 시간 필요 및 산물 손실을 야기하였다.
여과 결과
용액 번호 1 2 3 4 5
필터를 통과하는 단백질 질량
[g/㎡]		 2,365 2,455 960 968 1,440
필터를 통과하는 부피
[ℓ]		 3.940 4.200 1.600 1.600 2.400
필터의 기공 폐색 무 무 유 유 유
기공 크기 3.0 ㎛ 및 0.8 ㎛ 의 1 차 필터와, 기공 크기 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 의 2 차 필터의 조합으로의 항-HER2 항체의 여과
이 실시예에서는, 고도로 농축된 면역글로불린 용액이, 총 필터 면적 1 ㎡ 당 단백질 로딩과는 독립적으로 필터의 기공이 폐색되는 일 없이 기공 크기 3.0 ㎛ (예비-필터) 및 0.8 ㎛ (주요-필터), 및 0.45 ㎛ (예비-필터) 및 0.22 ㎛ (주요-필터) 의 2 개 필터 조합으로 여과될 수 있다는 것을 나타낸다.
이 실시예에서는, 각각 기공 크기 3.0 ㎛ 및 0.8 ㎛ 의 1 차 필터 유닛, 및 각각 기공 크기 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 의 2 차 필터 유닛을 가지며, 필터 면적이 각각 0.6 ㎡ 인 조합된 필터를 사용하였다.
조합된 필터 여과에서 사용한 용액
용액 번호 6 7 8 9 10
단백질 질량 [g] 5,217 5,191 5,356 6,151 5,580
부피 [ℓ] 42.070 42.201 43.542 48.055 44.998
로딩 [g/㎡] 4,347.5 4,325.8 4,463.3 5,125.8 4,650.0
농축 면역글로불린 용액을 하기 표 5 에서 나타낸 바와 같은 매개변수로 2 개 필터의 조합을 통해 여과하였다.
공정 매개변수
용액 번호 6 7 8 9 10
부피 유동 [ℓ/시간] 38.95 42.20 43.54 33.02 45.00
질량 유동 [g/시간] 4830 5191 5356 4226 5580
용액 번호 6 내지 10 중 어떤 것에 대해서도, 조합된 필터의 기공이 배치 부피의 완전 여과 전에 폐색되지 않았다.
여과 결과
용액 번호 6 7 8 9 10
필터를 통과하는 단백질 질량
[g/㎡]		 4,347.5 4,325.8 4,463.3 5,125.8 4,650.0
필터를 통과하는 부피
[ℓ]		 42.070 42.201 43.542 48.055 44.998
필터의 기공 폐색 무 무 무 무 무
기공 크기 3.0 ㎛ 및 0.8 ㎛ 의 필터와, 기공 크기 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 의 필터 (두 필터 모두 상이한 필터 면적을 가짐) 의 필터 조합으로의 항-IL13Rα 항체의 여과
이 실시예에서는, 조건화된 단백질 A 용리물이 두 필터의 조합으로 여과될 수 있으나, 필터 면적이 두 필터 사이에 매치되지 않는 경우 유량이 감소되어야 한다는 것을 나타낸다.
이 실시예에서는, 기공 크기 3.0 ㎛ (예비-필터) 및 0.8 ㎛ (주요-필터) 이며 필터 면적 1.8 ㎡ 인 필터 유닛, 및 기공 크기 0.45 ㎛ (예비-필터) 및 0.22 ㎛ (주요-필터) 이며 필터 면적 0.6 ㎡ 인 필터 유닛을 사용하였다.
조합된 필터 여과에서 사용한 용액
용액 번호 11 12 13 14 15
단백질 질량 [g] 1,169.0 1,299.6 1,154.4 1,220.4 1,284.7
부피 [ℓ] 71.4 76.0 74.0 67.8 70.2
로딩 [g/㎡] 487.1 541.5 481.0 508.5 535.3
농축 면역글로불린 용액을 하기 표 8 에 나타낸 바와 같은 매개변수로 조합된 필터를 통해 여과하였다.
공정 매개변수
용액 번호 11 12 13 14 15
부피 유동
[ℓ/시간]		 기공 폐색으로 인해 0 으로 하락 22 13 12 98
질량 유동
[g/시간]		 기공 폐색으로 인해 0 으로 하락 376 203 216 1793
용액 번호 11 에 대해서, 조합된 필터의 기공은 배치 부피의 완전 여과 전에 폐색되었다. 여과를 완료하기 위해서는 폐색된 필터를 바꾸어야 했는데, 이는 추가 시간 필요 및 산물 손실을 야기하였다.
여과 결과
용액 번호 1 2 3 4 5
필터를 통과하는 단백질 질량
[g/㎡]		 347.9 541.5 481.0 508.5 535.3
필터를 통과하는 부피
[ℓ]		 51.0 76.0 74.0 67.8 70.2
필터의 기공 폐색 유 무 무 무 무
용액 번호 11 로의 실험에서와 같이 필터 폐색을 방지하기 위해서, 멤브레인을 통한 유량은 용액 번호 12 내지 14 로의 실험에서 감소되어야만 한다. 용액 번호 15 로의 실험에서 단백질 A 용리액을 디켄팅하였는데, 이는 단백질 손실을 야기하였다.
기공 크기 3.0 ㎛ 및 0.8 ㎛ 의 필터, 및 기공 크기 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 의 필터 (두 필터 모두 각각 동일한 필터 면적을 가짐) 의 필터 조합으로의 항-IL13Rα 항체의 여과
이 실시예에서는, 필터 면적이 두 필터 사이에 매치되는 경우, 조건화된 단백질 A 용리액이 유량의 감소 없이 두 필터의 조합으로 여과될 수 있다는 것을 나타낸다.
이 실시예에서는, 기공 크기 3.0 ㎛ 및 0.8 ㎛ 의 필터 유닛은 0.2 ㎡ 의 필터 면적을 가지며, 기공 크기 0.45 ㎛ 및 0.22　㎛ 의 필터 유닛은 0.2 ㎡ 의 필터 면적을 갖는다.
조합된 필터 여과에서 사용한 용액
용액 번호 16 17 18 19 20
단백질 질량 [g] 495 634 825 861 956
부피 [ℓ] 3.5 4.14 5.5 5.6 6.3
로딩 [g/㎡] 1,237.5 1,585.0 2,062.5 2,152.5 2,390
용액 번호 16 내지 20 중 어떤 것에 대해서도, 조합된 필터의 기공이 배치 부피의 완전 여과 전에 폐색되지 않았다.
여과 결과
용액 번호 16 17 18 19 20
필터를 통과하는 단백질 질량
[g/㎡]		 1,237.5 1,585.0 2,062.5 2,152.5 2,390
필터를 통과하는 부피
[ℓ]		 3.5 4.14 5.5 5.6 6.3
필터의 기공 폐색 무 무 무 무 무
상이한 단백질 농도, 상이한 용액 중의 화합물 및 상이한 가압의 상이한 필터 조합으로의 상이한 항체 용액 여과
항-IL13Rα 항체 또는 항-HER2 항체를 포함하는 용액을, 상이한 필터 면적 및 필터 기공 크기 뿐 아니라 상이한 부형제 및 가압을 사용하는 필터 조합으로 여과하였다.
사용한 필터 조합을 하기 표 12 에 열거하였다. 하기에서 표시 'A1', 'A2', 'B1' 및 'B2' 를 이에 따라 사용한다.
필터 조합
조합 필터 1
기공 크기 / 직경 		필터 2
기공 크기 / 직경 		필터 3
기공 크기 / 직경 		필터 4
기공 크기 / 직경
A1 1.2 ㎛ / 26 mm 0.8 ㎛ / 26 mm 0.45 ㎛ / 26 mm 0.2 ㎛ / 26 mm
A2 1.2 ㎛ / 47 mm 0.8 ㎛ / 26 mm 0.45 ㎛ / 26 mm 0.2 ㎛ / 26 mm
B1 3.0 ㎛ / 26 mm 0.8 ㎛ / 26 mm 0.45 ㎛ / 26 mm 0.2 ㎛ / 26 mm
B2 3.0 ㎛ / 47 mm 0.8 ㎛ / 26 mm 0.45 ㎛ / 26 mm 0.2 ㎛ / 26 mm
하기 표 13 내지 20, 및 상응하는 도 1 내지 8 에서, 상이한 필터 조합, 상이한 항체 용액 및 상이한 여과 조건으로 획득한 결과를 나타낸다.
항체 농도 222 mg /㎖ 의 항- HER2 항체 용액 및 2.0 bar 가압으로 획득한 결과
조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분] 		조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분]
A1 1 3.7 B1 1 3.4
2 3.5 2 3.2
3 3.2 3 3.1
4 3.0 4 3.0
5 2.9 5 2.8
6 2.6 6 2.9
7 2.5 7 2.8
8 2.3 8 2.7
9 2.0 9 2.7
10 2.0 10 2.7
11 1.7 11 2.7
12 1.6 12 2.5
13 1.5 13 2.6
14 1.3 14 2.5
15 1.2 15 2.5
약 200　 mM 트레할로오스 및 약 0.05% (w/v) Tween 20 이 보충된 항체 농도 125 mg /㎖ 의 항- HER2 항체 용액 및 2.0 bar 가압으로 획득한 결과
조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분] 		조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분]
A1 1 22.4 B1 1 20.1
2 20.2 2 17.7
3 18.3 3 15.5
4 16.8 4 13.8
5 15.9 5 12.2
6 14.3 6 11.1
7 13.1 7 10.0
8 12.3 8 8.7
9 11.3 9 8.1
10 10.3 10 7.0
11 9.7 11 6.6
12 9.2 12 5.8
13 8.4 13 5.2
14 8.1 14 4.8
15 7.4 15 4.3
항체 농도 162 mg /㎖ 의 항- HER2 항체 용액 및 1.8 bar 가압으로 획득한 결과
조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분] 		조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분]
A2 1 7.6 B2 1 8.1
2 6.5 2 6.9
3 6.1 3 6.4
4 5.7 4 6.2
5 5.4 5 5.9
6 5.1 6 5.6
7 5.2 7 5.5
8 5.0 8 5.3
9 4.9 9 5.2
10 4.7 10 5.1
11 4.8 11 5.0
12 4.8 12 4.8
13 4.6 13 4.9
14 4.7 14 4.6
15 4.6 15 4.6
약 200　 mM 트레할로오스 및 약 0.2% (w/v) Poloxamer 가 보충된 항체 농도 141 mg /㎖ 의 항- IL13R α 항체 용액 및 1.6 bar 가압으로 획득한 결과
조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분] 		조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분]
A2 1 15.6 B2 1 13.2
2 9.4 2 8.1
3 7.0 3 5.5
4 5.5 4 4.1
5 4.6 5 3.3
6 3.8 6 2.6
7 3.3 7 2.3
8 2.9 8 1.9
9 2.5 9 1.6
10 2.2 10 1.5
11 1.5 11 1.2
12 0.5 12 1.2
13 0.3 13 1.0
14 0.3 14 0.9
15 0.3 15 0.8
항체 농도 162 mg /㎖ 의 항- HER2 항체 용액 및 1.1 bar 가압으로 획득한 결과
조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분] 		조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분]
A1 1 4.4 B1 1 4.3
2 4.0 2 4.0
3 3.6 3 3.5
4 3.5 4 3.0
5 3.3 5 3.0
6 3.2 6 3.0
7 3.2 7 2.9
8 3.1 8 2.8
9 3.1 9 2.8
10 2.9 10 2.7
11 3.0 11 2.6
12 2.9 12 2.8
13 2.8 13 2.5
14 2.8 14 2.6
15 2.8 15 2.5
트레할로오스 및 Poloxamer 가 보충된 항체 농도 141 mg /㎖ 의 항- IL13R α 항체 용액 및 0.8 bar 가압으로 획득한 결과
조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분] 		조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분]
A2 1 7.6 B2 1 8.1
2 5.0 2 5.5
3 3.7 3 4.2
4 2.9 4 3.1
5 2.5 5 2.6
6 2.1 6 2.2
7 1.8 7 1.8
8 1.5 8 1.5
9 1.4 9 1.4
10 1.2 10 1.2
11 1.1 11 1.1
12 1.0 12 1.0
13 0.9 13 0.8
14 0.8 14 0.8
15 0.8 15 0.8
트레할로오스 및 Tween 20 이 보충된 항체 농도 125 mg /㎖ 의 항- HER2 항체 용액 및 0.8 bar 가압으로 획득한 결과
조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분] 		조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분]
A1 1 9.3 B1 1 9.7
2 8.7 2 8.8
3 8.1 3 8.4
4 7.9 4 8.0
5 7.7 5 7.4
6 7.2 6 7.0
7 7.1 7 6.4
8 6.6 8 6.1
9 6.2 9 5.7
10 6.0 10 5.4
11 5.6 11 5.0
12 5.3 12 4.6
13 5.0 13 4.5
14 4.8 14 4.1
15 4.5 15 3.3
트레할로오스 및 Tween 20 이 보충된 항체 농도 125 mg /㎖ 의 항- HER2 항체 용액 및 0.3 bar 가압으로 획득한 결과
조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분] 		조합 여과 지속 기간
[분] 		유량
[㎖/분]
A1 1 3.9 B1 1 3.7
2 3.2 2 4.8
3 3.0 3 4.6
4 2.7 4 3.8
5 2.6 5 4.0
6 2.3 6 3.8
7 2.1 7 3.8
8 2.0 8 3.7
9 1.8 9 3.6
10 1.5 10 3.6
11 1.4 11 3.5
12 1.3 12 3.5
13 1.2 13 3.3
14 1.1 14 3.3
15 1.1 15 3.2

Claims (10)

  1. 하기 단계를 포함하는 면역글로불린 용액의 제조 방법:
    a) 100 g/ℓ 이상의 농도를 갖는 면역글로불린 용액을 제공하는 단계,
    b) 면역글로불린 용액을 0.1 내지 4.0 bar 의 압력으로 1 차 및 2 차 필터 유닛의 조합에 적용하여, 면역글로불린 용액을 제조하는 단계로서, 상기 1 차 필터 유닛은 기공 크기 3.0 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.8 ㎛ 의 주요-필터를 포함하며, 2 차 필터 유닛은 기공 크기 0.45 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.22 ㎛ 의 주요-필터를 포함하는 것인, 단계.
  2. 하기 단계를 포함하는 면역글로불린 제조 방법:
    a) 면역글로불린을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,
    b) 세포 또는 배양 배지로부터 면역글로불린을 회수하는 단계,
    c) 하나 이상의 크로마토그래피 단계로 면역글로불린을 정제하고, 면역글로불린 용액을 제공하는 단계,
    d) 임의로는 당, 아미노산 및/또는 세제를 용액에 추가하는 단계,
    e) 임의로는 정용여과 (diafiltration) 또는 접선 유동 여과 (tangential-flow filtration) 에서 선택되는 방법으로 면역글로불린 용액을 100 g/ℓ 이상의 농도로 농축하는 단계, 및
    f) 전단계의 면역글로불린 용액을 0.1 내지 4.0 bar 의 압력으로 1 차 및 2 차 필터 유닛의 조합에 적용하여, 면역글로불린을 제조하는 단계로서, 상기 1 차 필터 유닛은 기공 크기 3.0 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.8 ㎛ 의 주요-필터를 포함하며, 2 차 필터 유닛은 기공 크기 0.45 ㎛ 의 예비-필터 및 기공 크기 0.22 ㎛ 의 주요-필터를 포함하는 것인, 단계.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 1 차 및 2 차 필터 유닛에서의 필터가 최소 필터 면적의 2 배 내의 면적을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 면역글로불린 용액이 100 g/ℓ 내지 300 g/ℓ 의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 면역글로불린 용액이 3 ℓ 내지 100 ℓ 의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 면역글로불린이 항-IL13 수용체 알파 항체 또는 항-HER2 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 2 항에 있어서, 정제를 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계, 및 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 선택되는 하나 이상의 단계로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 면역글로불린 용액이 160 g/ℓ 이상의 농도를 가지며, 1.45 bar 이상의 압력을 가해 필터의 조합에 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 면역글로불린 용액이 당 및 계면활성제를 포함하고 125 mg/㎖ 이상의 농도를 가지며, 0.75 bar 이하의 압력을 가해 필터의 조합에 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 기공 크기 3.0 ㎛ 내지 0.8 ㎛ 의 1 차 필터, 및 기공 크기 0.45 ㎛ 내지 0.22 ㎛ 의 2 차 필터를 포함하는, 100 g/ℓ 이상의 단백질 농도를 갖는 농축 면역글로불린 용액의 여과용 키트.
KR1020147016901A 2009-10-01 2010-09-29 다단계 최종 여과 KR101653471B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09012460 2009-10-01
EP09012460.3 2009-10-01
PCT/EP2010/064487 WO2011039274A1 (en) 2009-10-01 2010-09-29 Multistep final filtration

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127008385A Division KR101508044B1 (ko) 2009-10-01 2010-09-29 다단계 최종 여과

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167023445A Division KR101718301B1 (ko) 2009-10-01 2010-09-29 다단계 최종 여과

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140091763A KR20140091763A (ko) 2014-07-22
KR101653471B1 true KR101653471B1 (ko) 2016-09-01

Family

ID=41466840

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127008385A KR101508044B1 (ko) 2009-10-01 2010-09-29 다단계 최종 여과
KR1020147016901A KR101653471B1 (ko) 2009-10-01 2010-09-29 다단계 최종 여과
KR1020167023445A KR101718301B1 (ko) 2009-10-01 2010-09-29 다단계 최종 여과

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127008385A KR101508044B1 (ko) 2009-10-01 2010-09-29 다단계 최종 여과

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167023445A KR101718301B1 (ko) 2009-10-01 2010-09-29 다단계 최종 여과

Country Status (21)

Country Link
US (4) US20120231506A1 (ko)
EP (3) EP3133083B1 (ko)
JP (1) JP5458183B2 (ko)
KR (3) KR101508044B1 (ko)
CN (3) CN104610447A (ko)
AU (1) AU2010302662B2 (ko)
BR (1) BR112012004054B1 (ko)
CA (1) CA2773674C (ko)
CY (1) CY1118577T1 (ko)
DK (1) DK2483305T3 (ko)
ES (2) ES2787403T3 (ko)
HK (2) HK1200178A1 (ko)
HR (2) HRP20161693T1 (ko)
HU (1) HUE030186T2 (ko)
IL (2) IL217626A (ko)
LT (1) LT2483305T (ko)
MX (1) MX342442B (ko)
PL (2) PL2483305T3 (ko)
PT (1) PT2483305T (ko)
SI (2) SI3133083T1 (ko)
WO (1) WO2011039274A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3769083A1 (en) 2018-03-21 2021-01-27 Waters Technologies Corporation Non-antibody high-affinity-based sample preparation, sorbents, devices and methods
CN111007242A (zh) * 2019-12-20 2020-04-14 苏州和迈精密仪器有限公司 基于多层高分子多孔膜的荧光免疫检测方法、装置及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009010269A1 (en) * 2007-07-17 2009-01-22 F.Hoffmann-La Roche Ag Variable tangential flow filtration

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5643566A (en) 1982-09-23 1997-07-01 Cetus Corporation Formulation processes for lipophilic proteins
US4488961A (en) 1982-09-29 1984-12-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company One-way filter unit
US4592848A (en) 1984-12-11 1986-06-03 Pabst Richard E Flow through filter with backflush clearing capability
CS247484B1 (cs) 1985-04-12 1987-01-15 Eva Hamsikova Způsob přípravy imunoglobulinu proti lidským Iymfocytům
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
DE3818860A1 (de) 1988-06-03 1989-12-07 Seitz Filter Werke Filterelement
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
DE4204444C1 (ko) 1992-02-14 1993-05-19 Krankenhausentsorgungs Gmbh, 1000 Berlin, De
DK1516628T3 (da) 1995-07-27 2013-09-08 Genentech Inc Stabil, isotonisk lyofiliseret proteinformulering
ES2335365T3 (es) 1996-11-27 2010-03-25 Genentech, Inc. Purificacion por afinidad de polipeptido en una matriz de proteina a.
DE69907439T3 (de) 1998-05-06 2014-01-02 Genentech, Inc. Reinigung von proteinen durch ionenaustauschchromatographie
US6984494B2 (en) * 2000-08-15 2006-01-10 Genentech, Inc. Analytical method
DE60325334D1 (de) 2002-02-05 2009-01-29 Genentech Inc Proteinaufreinigung
AU2003251592A1 (en) * 2002-06-21 2004-01-06 Biogen Idec Inc. Buffered formulations for concentrating antibodies and methods of use thereof
KR20050048666A (ko) * 2002-10-04 2005-05-24 기린 비루 가부시키가이샤 인간 인공 염색체(ｈａｃ) 벡터
JPWO2004087761A1 (ja) 2003-03-31 2006-07-27 麒麟麦酒株式会社 ヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の精製
GB0316560D0 (en) * 2003-07-15 2003-08-20 Chiron Srl Vesicle filtration
CA2567814C (en) * 2004-05-27 2013-07-23 Jon A. Weidanz Antibodies as t cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
PT1786273T (pt) * 2004-08-20 2019-02-19 The American Nat Red Cross Esquemas de isolamento e purificação de proteínas sequenciais por cromatografia de afinidade
US20060051347A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-09 Winter Charles M Process for concentration of antibodies and therapeutic products thereof
US20080247949A1 (en) * 2004-11-22 2008-10-09 Oxygenix Co., Ltd. Biological Tissue Examination Agent Comprising Hemoglobin Labeled With Oxygen Isotope And Method For Producing The Same
TW200902555A (en) 2005-01-03 2009-01-16 Hoffmann La Roche Antibodies against IL-13 receptor alpha 1 and uses thereof
NZ560844A (en) * 2005-03-08 2008-08-29 Pharmacia & Upjohn Co Llc Anti-MAdCAM antibody compositions
WO2007018316A1 (ja) 2005-08-09 2007-02-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited 癌の予防・治療剤
EP2078039B1 (en) * 2006-11-01 2017-09-13 Biogen MA Inc. Method of isolating biomacromolecules using low ph and divalent cations
AR067536A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
WO2009058769A1 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Schering Corporation Purification of antibodies containing hydrophobic variants
EP2346900A1 (en) 2008-10-29 2011-07-27 Wyeth LLC Methods for purification of single domain antigen binding molecules
SI2914612T1 (sl) * 2012-10-30 2019-03-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Čiščenje polipeptidov z uporabo dvostopenjske tangencialne ultrafiltracije

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009010269A1 (en) * 2007-07-17 2009-01-22 F.Hoffmann-La Roche Ag Variable tangential flow filtration

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Chromatography B, Vol. 848, Pages 64-78(공개일: 2007. 1. 16.).*

Also Published As

Publication number Publication date
LT2483305T (lt) 2016-11-25
CA2773674C (en) 2017-08-29
CY1118577T1 (el) 2017-07-12
KR20160104739A (ko) 2016-09-05
IL217626A (en) 2017-12-31
PL2483305T3 (pl) 2017-03-31
HK1200178A1 (en) 2015-07-31
ES2787403T3 (es) 2020-10-16
ES2604103T3 (es) 2017-03-03
CN103980346A (zh) 2014-08-13
DK2483305T3 (en) 2016-10-24
HK1210183A1 (en) 2016-04-15
CA2773674A1 (en) 2011-04-07
IL255658A (en) 2018-01-31
AU2010302662B2 (en) 2015-11-26
BR112012004054A2 (pt) 2020-08-11
CN104610447A (zh) 2015-05-13
JP2013505733A (ja) 2013-02-21
US20120231506A1 (en) 2012-09-13
US20200291097A1 (en) 2020-09-17
KR20140091763A (ko) 2014-07-22
EP2483305B1 (en) 2016-09-21
BR112012004054B1 (pt) 2021-09-08
KR101718301B1 (ko) 2017-03-20
HUE030186T2 (en) 2017-04-28
JP5458183B2 (ja) 2014-04-02
EP3133083B1 (en) 2020-02-19
CN102574913A (zh) 2012-07-11
KR20120053522A (ko) 2012-05-25
SI2483305T1 (sl) 2017-01-31
MX342442B (es) 2016-09-29
US11891430B2 (en) 2024-02-06
KR101508044B1 (ko) 2015-04-07
US20180009878A1 (en) 2018-01-11
MX2012003727A (es) 2012-04-30
PL3133083T3 (pl) 2020-09-07
SI3133083T1 (sl) 2020-07-31
AU2010302662A1 (en) 2012-02-09
EP2483305A1 (en) 2012-08-08
PT2483305T (pt) 2016-11-04
HRP20200588T1 (hr) 2020-07-10
EP3715369A1 (en) 2020-09-30
US20240132574A1 (en) 2024-04-25
HRP20161693T1 (hr) 2017-02-24
WO2011039274A1 (en) 2011-04-07
EP3133083A1 (en) 2017-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6471183B2 (ja) 生体分子の精製
US20240132574A1 (en) Multistep final filtration
EP2152745B1 (en) Immunoglobulin purification
AU2012282960A1 (en) Method for purifying Fc-fusion protein
WO2020159838A1 (en) A continuous manufacturing process for biologics manufacturing by integration of drug substance and drug product processes
WO2011038894A1 (en) Protein a chromatography
JP2010051927A (ja) 限外濾過膜を用いた生体成分の分離方法およびモジュール、装置
KR20220025873A (ko) 당형태 정제
WO2021144422A1 (en) Methods to decrease impurities from recombinant protein manufacturing processes
CN113646066A (zh) 蛋白质的纯化方法

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
A107 Divisional application of patent
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190624

Year of fee payment: 4