KR20220025873A - 당형태 정제 - Google Patents

당형태 정제 Download PDF

Info

Publication number
KR20220025873A
KR20220025873A KR1020227003061A KR20227003061A KR20220025873A KR 20220025873 A KR20220025873 A KR 20220025873A KR 1020227003061 A KR1020227003061 A KR 1020227003061A KR 20227003061 A KR20227003061 A KR 20227003061A KR 20220025873 A KR20220025873 A KR 20220025873A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
separation
protein
glycoform
separation material
sample
Prior art date
Application number
KR1020227003061A
Other languages
English (en)
Inventor
로마스 스쿠다스
아니카 홀츠그레페
알리자 슈트로벨
Original Assignee
메르크 파텐트 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메르크 파텐트 게엠베하 filed Critical 메르크 파텐트 게엠베하
Publication of KR20220025873A publication Critical patent/KR20220025873A/ko

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/362—Cation-exchange
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B01J20/288—Polar phases
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/321—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/327—Polymers obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3276—Copolymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3278—Polymers being grafted on the carrier
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3285—Coating or impregnation layers comprising different type of functional groups or interactions, e.g. different ligands in various parts of the sorbent, mixed mode, dual zone, bimodal, multimodal, ionic or hydrophobic, cationic or anionic, hydrophilic or hydrophobic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J43/00—Amphoteric ion-exchange, i.e. using ion-exchangers having cationic and anionic groups; Use of material as amphoteric ion-exchangers; Treatment of material for improving their amphoteric ion-exchange properties
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 아미노산계 말단기를 갖는 이온 교환 분리 물질을 이용한 당형태의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.

Description

당형태 정제
본 발명은 아미노산계 말단기를 갖는 이온 교환 분리 물질을 이용한 당형태의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.
글리칸은 당단백질 분자의 필수적인 부분으로, 그 구조와 기능을 보장한다.
가장 일반적인 당단백질 중 하나는 Fc 부분의 CH2 도메인 내의 보존된 아스파라긴 297 에서 2 개의 N-연결된 올리고당을 함유하는 면역글로불린이다. 글리칸의 구조는 2 개의 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), 3 개의 만노스 및 2 개의 GlcNAc 잔기로 구성된다. 푸코스 (Fuc), 갈락토스 (Gal), N-아세틸뉴라민산 (NANA) 또는 N-글리콜릴뉴라민산 (NGNA) 잔기를 포함하는 시알산과 같은 추가의 단당류 또한 존재할 수 있다. (도 1. 글리칸 구조). 글리칸 구조는 당단백질 및 수용체 친화성 결합에 중요한 역할을 한다. 글리칸 조성물의 변화는 당단백질의 형태 변형을 야기하여, 그의 특이적 수용체 결합에 영향을 미치고 효과기 기능의 변화를 초래할 수 있다. 또한, 일부 글리칸 조성물은 보호 유기체 반응, 예를 들어 만노스 결합 수용체 (ManR) 운반 이펙터에 대한 말단 만노스 결합을 개시한다.
또한, 효모, 곤충 세포 및 식물로부터 유래된 당단백질에서 흔히 발견되는 당단백질을 함유하는 고말단 만노스 글리칸은 인간에서 매우 면역원성일 수 있다 (Durocher Y, Butler M. 2009. Expression systems for therapeutic glycoprotein production. Curr Opin Biotechnol 20: 700-707). 따라서, 잠재적인 면역원성을 피하기 위해 생물약학적 당단백질 내의 고말단 만노스 글리칸의 수준을 조절하는 것이 매우 중요하다.
또한, 말단 만노스 및 하이브리드 글리칸 구조는 모노클로날 항체 (mAb) CH2 도메인의 입체형태적 안정성을 감소시킨다. 이는 이러한 분자에 대해 더 높은 수준의 효소 분해 또는 짧은 저장 시간을 야기할 수 있다 (Fang, J. Richardson J, Du Z, Zhang Z. Effect of Fc-Glycan Structure on the Conformational Stability of IgG Revealed by Hydrogen/Deuterium Exchange and Limited Proteolysis, Biochemistry 2016, 55, 860-868).
하이브리드 글리코실화 변이체는 종종 골지체에서 형성된다. 하이브리드 글리코실화 변이체는 감소되거나 변경된 글리코실화를 나타내며, 다시 말해 원하는 글리코실화 패턴을 갖지 않는다. 하이브리드 형태의 일부 예는 G0 변이체에서 N-아세틸글루코사민이 결여된 변이체 (예를 들어, G0-N) 또는 G1 변이체에서 갈락토스가 결여된 변이체 (예를 들어, G1-N) 를 포함한다 (Costa AR, Rodrigues ME, Henriques M, Oliveira R, Azeredo J. Glycosylation: impact, control and improvement during therapeutic protein production, Crit Rev Biotechnol. 2013, 1-19). 언급된 하이브리드 변이체 둘 다는 말단 만노스를 가짐으로써, 혈액에서 수명이 더 짧아질 확률을 증가시킨다 (Goetze AM, Liu YD, Zhang Z, Shah B, Lee E, Bondarenko PV, Flynn GC. 2011. High mannose glycans on the Fc region of therapeutic IgG antibodies increase serum clearance in humans. Glycobiology 21: 949-959).
또한, 낮은 수준의 갈락토스는 보체-의존적 세포독성 (CDC) 활성을 감소시켜, 당단백질 활성에 영향을 미친다. 몇몇 연구에서는, G2-글리코형을 함유하는 mAb 와 G0-글리코형을 함유하는 mAb 사이에서 활성이 2 배 감소될 수 있음을 나타내었다 (Raju TS. 2008. Terminal sugars of Fc glycans influence antibody effector functions of IgGs. Curr Opin Immunol 20: 471-478). 따라서, 하이브리드 글리코실화 변이체, 특히 말단 만노스를 갖거나 갈락토스가 결여된 것의 양을 조절하거나 감소시키는 능력은 당단백질의 수명 및 효능을 증가시킬 것이다.
글리칸 구조 변화의 가장 명백한 효과 중 하나는 푸코스의 존재 또는 결여에 의해 관찰된다. 푸코스는 골지체에서 글리칸 구조에 첨가된다. mAb 의 코어 글리칸 구조에서의 푸코스의 존재는 FcγRIIIa 수용체에 대한 그의 결합을 억제하여, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성을 감소시킬 것으로 알려져 있다. FcγRIIIa 수용체에 대한 특이적 결합을 50 배 감소시킬 수 있어 당단백질의 효능에 큰 영향을 미칠 수 있다 (Peipp et al, Antibody fucosylation differentially impacts cytotoxicity mediated by NK and PMN effector cells, BLOOD, 15 September 2008, Volume 112, Number 6, 2390-2399).
또한, 글리코실화의 부재는 당단백질과 수용체 사이의 결합 친화성을 극적으로 감소시킨다는 것은 잘 알려져 있다. 예를 들어, mAb 상의 글리코실화의 결여는 FcγRI 수용체에 대한 결합을 극적으로 감소시키고, FcγRII 및 FcγRIII 수용체에 대한 결합을 제거한다 (Liu L, Antibody Glycosylation and Its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and FC-Fusion Proteins, Journal of Pharmaceutical Sciences 104: 1866-1884, 2015).
미국 식품의약국 (FDA) 은 바이오시밀러 약물에 대한 글리코실화 유사성을 가장 중요한 요구 사항 중 하나로 평가한다 (FDA, 2012. Guidance for industry quality considerations in demonstrating biosimilarity to a reference protein product). 또한, 글리코실화 향상은 바이오베터 (biobetter) 에 대한 주요 경향들 중 하나이다.
모든 이러한 이유로 인해, 다양한 글리칸 종을 통제, 농축 또는 분리하고 최상의 약동학, 효능, 반감기 및 내약성을 가능하게 함으로써 글리코실화된 생물약학적 분자의 효율을 향상시키기 위한 산업에서의 요구가 증가하고 있다.
글리칸 변이체에 기초한 당단백질 분리에 대한 현재의 최신 기술은 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 고 만노스 당형태를 농축하는 분취 크로마토그래피 모드로 수행될 수 있다 (WO 2014/100117). 불행하게도, 주어진 실시예에서 고 만노스 함유 당형태의 농축은 응집체 농축과 중복되어, 당단백질 분리를 함유하는 응집체가 또한 달성되지 않을 경우 인식하기가 어렵다. 또한, 이 기술이 다른 글리칸 변이체 분리 또는 제거에 사용될 수 있다는 표시는 없다.
고 만노스 함유 글리코형에 대한 대안적 기술은 렉틴을 사용하는 친화성 크로마토그래피이다 (US 20020164328). 이 기술은 이온 교환 크로마토그래피에 비하여 보다 특이적이지만, 글리칸을 함유하는 고 만노스에 한정되어 있으며, 특이적인 결합 조건이 요구된다. 또한, 렉틴의 침출, 이 수지의 재생 및 수명은 경제적인 고 만노스 함유 글리칸 변이체 분리에서의 이의 적용을 방해한다.
다른 제조용 글리칸 변이체 분리 방법은 음이온 교환 및 역상 크로마토그래피 기술의 조합 (US 20100151584) 또는 음이온 교환 크로마토그래피만을 사용하는 것 (IN 01066ch2012) 을 포함한다. 불행하게도, 종래 기술 중 어느 것도 당단백질의 당형태를 분리하기 위한 효율적이고 효과적인 기술의 명백한 필요에 대응하여, 하나 이상의 당형태 분리를 달성하지 않는다.
공유적으로 부착된 류신 잔기 또는 유사한 잔기를 보유하는 이온 교환 물질이 10 mg 초과의 당단백질/ml 물질 용량에서 효율적인 글리칸 종 분리를 가능하게 하는 당형태의 분리 및 농축을 위해 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 보다 바람직한 구현예에서, 용량은 10-80 mg/ml 이다. 또한, 이 혁신적인 이온 교환 물질은 10 mS/cm 초과의 높은 전도도에서 사용될 수 있으며, 더욱 바람직한 구현예에서 전도도는 10 내지 60 mS/cm 이다. 놀랍게도, 용매 pH 구배를 사용하여 고 만노스 함유 변이체, 말단 만노스 함유 변이체, 푸코스 함유 변이체 및 무-글리코실화 함유 변이체를 포함하는 글리칸 변이체를 분리 및 농축하는 것이 가능하였다. 더욱이, 이러한 발견은 광범위한 작동 윈도우를 탐색할 수 있게 하였으며, 여기서 이온 및 소수성 상호작용은 글리칸 변이체 분리의 선택성에 기여하였다. 또한, 이러한 혁신적인 이온 교환 물질의 적용은 친화성 크로마토그래피 모드에 비해 현저한 경제적 이점을 보였고, 음이온 교환 모드에 비해 더 넓은 선택성 및 향상된 성능을 가능하게 하였다.
본 발명은 따라서, 하기를 특징으로 하는, 단백질 당형태를 포함하는 샘플을, 표면에 중합체 사슬이 공유 결합에 의해 그래프트된 히드록실기 함유 베이스 매트릭스를 포함하는 분리 물질과 접촉시킴으로써, 단백질 당형태를 크로마토그래피 정제 및/또는 분리하는 것에 관한 것이다:
a) 베이스 매트릭스는 히드록실기를 함유하고,
b) 중합체 사슬은 히드록실기를 통해 베이스 매트릭스에 공유 결합되고,
c) 중합체 사슬은 말단기 -N(Y)-R3 을 포함하고,
Y 는 서로 독립적으로 H 또는 CH3, 바람직하게는 H 이고,
R3 은 -CHCOOMR4 이고,
R4 는 C1 내지 C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 바람직하게는 이소프로필 및 이소부틸, 매우 바람직하게는 이소부틸, 또는 C1 내지 C4 퍼플루오로알킬이고,
M 은 서로 독립적으로 H, Na, K 또는 NH4 + 임.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 단백질 당형태를 포함하는 샘플을, 중합체 사슬이 공유 결합에 의해 표면에 그래프트된 히드록실기 함유 베이스 매트릭스를 포함하는 분리 물질과 접촉시킴으로써, 단백질 당형태 중 하나 이상이 분리 물질에 결합됨
b) 선택적으로 분리 물질을 세척함
c)분리 물질을 용리 완충제와, 결합된 단백질 당형태가 분리 물질로부터 용리되는 조건 하에서 접촉시킴
바람직한 구현예에서, 단계 c) 에서, 용리 완충제는 로딩 완충제보다 높은 pH 를 갖는다. 용리 완충제는 단계 또는 구배로서 적용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 단계 a) 에서, 분리 물질 상에 로딩된 샘플이 5 내지 60 mS/cm, 바람직하게는 15 내지 35 mS/cm 의 전도도를 갖도록, 분리 물질과 샘플의 접촉은 증가된 전도도의 조건 하에서 일어난다. 이는 전형적으로 샘플 용액에 염화나트륨과 같은 염을 첨가함으로써 달성된다.
또다른 바람직한 구현예에서, 방법은 분리 물질을 통해 흐르는 단백질 당형태를 회수하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 샘플은 만노스 풍부 단백질 당형태를 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 샘플은 말단 만노스 단백질 당형태를 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 샘플은 푸코실화 및 비-푸코실화 단백질 당형태를 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 샘플은 글리코실화 및 비-글리코실화 단백질을 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 샘플은 단리된 또는 바이러스 또는 바이러스 캡시드 상의 항체 및/또는 Fc 융합 단백질 및/또는 바이러스 단백질 당형태를 포함한다.
바람직하게는, 중합체의 단량체 단위는 선형 방식으로 연결되고, 각각의 단량체 단위는 말단기 -N(Y)-R3 을 포함한다.
바람직하게는, 분리 물질의 이온 밀도는 10 내지 1200 μeq/g 이다.
바람직한 구현예에서, Y 는 H 이고, R4 는 이소프로필 및/또는 이소부틸이다.
바람직한 구현예에서, 히드록실기 함유 베이스 매트릭스는 지방족 히드록실기를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 베이스 매트릭스는 a) 및 b) 그룹으로부터의 적어도 하나의 화합물의 공중합에 의해 형성된 공중합체이다:
a) 적어도 하나의 화학식 I 의 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르
Figure pct00001
식 중, R1, R2, R3 은 서로 독립적으로, H 또는 C1 내지 C6 알킬, 바람직하게는 H 또는 -CH3 일 수 있고,
R4 는 적어도 하나의 히드록실기를 갖는 라디칼임,
및
b) 화학식 II 및/또는 III 및/또는 IV 에 따르는 적어도 하나의 가교제
Figure pct00002
식 중, X 는 2 내지 5 개의 C 원자, 바람직하게는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 이가 알킬 라디칼이고, 여기서 인접하지 않고 N 의 바로 근처에 위치하지 않는 하나 이상의 메틸렌 기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 치환될 수 있고, 메틸렌 기의 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH-(C1-C8)-알킬, N-(C1-C8)-알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음, 및
Figure pct00003
식 중, 화학식 III 및 IV 의 Y1 및 Y2 는 서로 독립적으로, 하기이고:
C1 내지 C10 알킬 또는 시클로알킬, 여기서 하나 이상의 비-인접 메틸렌 기 또는 N 의 바로 근처에 위치하지 않는 메틸렌 기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 치환될 수 있고, 메틸렌 기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음,
또는 C6 내지 C18 아릴, 여기서, 아릴 시스템 내의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음,
A 는 2 내지 5 개의 C 원자, 바람직하게는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 이가 알킬 라디칼이고, 여기서 하나 이상의 비-인접 메틸렌 기 또는 N 의 바로 근처에 위치하지 않는 메틸렌 기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 치환될 수 있고, 메틸렌 기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음.
화학식 I 에서 R4 는 전형적으로 적어도 하나의 히드록실 기를 갖는 알킬 라디칼, 지환족 라디칼 또는 아릴 라디칼이다.
매우 바람직한 구현예에서, 베이스 매트릭스는 가교제로서 1,4-부탄디올 모노비닐 에테르, 1,5-펜탄디올 모노비닐 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노비닐 에테르 또는 시클로헥산디메탄올 모노비닐 에테르 및 디비닐에틸렌우레아 (1,3-디비닐이미다졸린-2-온) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르의 공중합에 의해 형성된다.
바람직한 구현예에서, 분리 물질은 히드록실기 함유 베이스 매트릭스를 화학식 V 에 따른 단량체의 세륨 (IV) 촉매된 그래프트 중합에 적용함으로써 제조될 수 있다
Figure pct00004
식 중, R1, R2 및 Y 는 서로 독립적으로 H 또는 CH3, 바람직하게는 H 이고,
R3 은 -CHCOOMR4 이고,
R4 는 C1 내지 C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 바람직하게는 이소프로필 및 이소부틸, 매우 바람직하게는 이소부틸, 또는 C1 내지 C4 퍼플루오로알킬이고
M 은 H, Na, K 또는 NH4 + 임.
이 그래프트 중합은 US 5453186, 페이지 9, 실시예 8 에 따라 바람직하게 수행된다.
바람직한 구현예에서, 단백질 당형태는 2 내지 7 의 pH 에서 분리 물질에 결합하고, 선택적으로 pH 값을 알칼리성 pH, 바람직하게는 9 초과, 예를 들어 9 내지 11, 바람직하게는 약 10 값으로 증가시킴으로써 세척 및 용리된다.
바람직한 구현예에서, 샘플은 10 내지 1200 μeq/g 의 이온 밀도로 분리 물질에 적용된다.
바람직한 구현예에서, 분리 물질 ml 당 10 mg 내지 100 mg 의 당형태가 결합된다.
도 1 은 글리칸 구조의 개략도로서, 정사각형은 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), 전체 원 - 만노스, 삼각형 - 푸코스 (Fuc) 및 빈 원 - 갈락토스 (Gal) 를 나타낸다.
도 2 은 아크릴로일류신 단량체의 중합에 의해 형성된 선형 중합체로 관능화된 베이스 물질 (도트) 을 갖는 본 발명에 따른 분리 물질의 개략도를 보여준다.
도 3 는 아크릴로일발린 단량체의 중합에 의해 형성된 선형 중합체로 관능화된 베이스 물질 (도트) 을 갖는 본 발명에 따른 분리 물질의 개략도를 보여준다.
도 4 는 20 mg/ml CV 로딩 및 250 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 당단백질의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 5 은 20 mg 당단백질/ml CV 로딩에서 로딩된 당단백질 (로딩) 및 250 mM NaCl 을 포함하는, 분석된 용리 분획 (1A10 내지 1E3) 의 정량적 면적에서 표시된 LC-MS 분석 방법을 사용하는 샘플 분획 특성화의 분석 결과를 보여준다.
도 6 는 20 mg/ml CV 로딩 및 250 mM NaCl 에서 분리 물질 상의 결합된 당단백질의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 7 은 20 mg 당단백질/ml CV 로딩에서 로딩된 당단백질 (로딩) 및 250 mM NaCl 을 포함하는, 분석된 용리 분획 (1A10 내지 1E3) 의 정량적 면적에서 표시된 LC-MS 분석 방법을 사용하는 샘플 분획 특성화의 분석 결과를 보여준다.
도 8 는 30 mg/ml CV 로딩 및 250 mM NaCl 에서 분리 물질 상의 결합된 당단백질 (예를 들어, mAb05) 의 용리 피크를 보여준다. 파란색 선의 UV 흡착 신호 트레이스.
도 9 는 분석된 용리 분획 (1A4 내지 4B2) 의 정량적 면적에서 표시된 LC-MS 분석 방법을 사용하는 샘플 분획 특성화의 분석 결과를 보여준다.
도 10 는 30 mg/ml CV 로딩 및 200 mM NaCl 에서 분리 물질 상의 결합된 당단백질 (예를 들어, mAb05) 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH.
도 11 은 1 mg/ml CV 로딩 및 150 mM NaCl 에서 분리 물질 상의 결합된 당단백질 (예를 들어, Rituximab®) 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 부분적으로 탈글리코실화된 Rituximab® 트레이스의 UV 흡착 신호, 점으로 된 선의 천연 Rituximab® 의 UV 흡착 신호 및 점선의 pH.
도 12 는 10 mg/ml CV 로딩 및 450 mM NaCl 에서 분리 물질 상의 결합된 당단백질 (예를 들어, mAb05) 의 플로우 스루 및 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH.
도 13 는 1 mg/ml CV 로딩 및 150 mM NaCl 에서 분리 물질 상의 결합된 당단백질 (예를 들어, SARS-CoV-2 의 스파이크 S1 단백질) 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 당단백질 트레이스의 UV 흡착 신호, 및 점선의 pH.
도 14 는 1 mg 당단백질/ml CV 로딩에서 로딩된 당단백질 (로딩) 및 250 mM NaCl 을 포함하는 실선의 UV 신호 트레이스 및 점선의 당단백질 (예를 들어, SARS-CoV-2 의 스파이크 S1 단백질) 의 용리 분획 1C6 으로 표시된 HIC 분석 방법을 이용한 샘플 분획 특성화의 분석 결과를 나타낸다.
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명이 특정 조성물 또는 방법 단계에 한정되지 않으며, 그 자체가 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥 상 다르게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "리간드" 로 언급하는 것은 복수의 리간드를 포함하고, "항체" 로 언급하는 것은 복수의 항체 등을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 관련되어 있는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 용어는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 목적을 위해 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 분자" 는 샘플의 하나 이상의 기타 성분, 예를 들어 불순물로부터 단리, 분리 또는 정제되어야 하는 임의의 분자, 물질 또는 화합물을 지칭한다. 표적 분자의 예는 단백질 당형태 또는 당단백질의 글리칸 종이라고도 불리는 당단백질이다. 표적 분자는 또한 샘플에 또한 존재하는 단백질 당형태로부터 분리될 비-글리코실화된 단백질일 수 있다. 제조 및/또는 정제 방법에서, 표적 분자는 전형적으로 액체 중에 존재한다. 액체는 물, 완충액, 비수성 용매, 예컨대 에탄올 또는 그 임의의 혼합물일 수 있다. 표적 분자 이외에, 상기 액체는 하나 이상의 불순물을 포함할 수 있다. 액체는 샘플이라고도 할 수 있다. 액체의 조성은 수행되는 방법 단계에 따라 제조 및/또는 정제 동안 변화될 수 있다. 크로마토그래피 단계 후에, 크로마토그래피 단계에 사용되는 용리액으로 인해, 액체는 전형적으로 이전과는 다른 용매를 포함한다. 전형적으로, 가장 마지막 정제 단계 후에만, 표적 분자가 최종 투여 형태의 제조를 위해 건조될 수 있다.
당단백질 또는 단백질 당형태는 글리코실화된 단백질이다. 글리코실화는 예를 들어 하나 이상의 푸코스, 만노스, 갈락토스, N-아세틸글루코사민, 시알산 및/또는 뉴라민산을 포함하는, 모노-디- 또는 올리고당 사슬의 형태일 수 있다. 예를 들어, 항체는 전형적으로 복합 N-연결된 올리고당을 갖는다. 자세한 정보는 위의 도입부에서 확인할 수 있다. 통상의 글리칸 구조에 대한 예는 항체에서 발견될 수 있는 바와 같이, N-글리코시드-연결된 당 사슬이다.
"N-글리코시드-연결된 당 사슬" 또는 "N-글리코시드-연결된 글리칸" 은 전형적으로 아스파라긴 297 (Kabat 수에 따라) 에 결합되지만, 복합 N-글리코시드-연결된 당 사슬은 또한 다른 아스파라긴 잔기에 연결될 수 있다. 복합 N-글리코시드-연결된 당 사슬은 전형적으로, 주로 다음 구조를 갖는, 바이안테나 복합 당 사슬을 갖는다:
Figure pct00005
여기서 +/- 는 당 분자가 존재 또는 부재할 수 있음을 나타내고, 숫자는 당 분자 사이의 연결 위치를 나타낸다. 상기 구조에서, 아스파라긴과 결합하는 당 사슬 말단을 환원 말단 (오른쪽) 이라 하고, 반대쪽을 비-환원 말단이라 한다. 푸코스는 일반적으로 환원 말단의 N-아세틸글루코사민 ("GIcNAc") 에, 전형적으로 α 1,6 결합에 의해 결합된다 (GIcNAc 의 6-위치는 푸코스의 1-위치에 연결된다). "Gal" 은 갈락토스를 나타내고, "Man" 은 만노스를 나타낸다.
단백질 당형태의 예는 상이한 수준의 푸코실화, 예를 들어 상이한 수준의 코어 푸코실화, 상이한 수준의 시알릴화, 상이한 수준의 갈락토실화 또는 상이한 수준의 만노실화를 갖는 단백질이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 고 만노스 단백질 당형태를 분리 또는 정제하는데 사용된다.
고 만노스 단백질 당형태는 5 개 이상, 전형적으로 5 개 내지 9 개의 만노스 단위를 갖는 글리칸 잔기를 갖는 당단백질이다. 고 만노스 단백질에 대한 예는 5 내지 9 개의 만노스 단위를 포함하는 N-연결된 올리고당을 갖는 항체이다. 만노스 풍부 단백질의 또다른 예는 HIV 1 의 만노스 풍부 외피 당단백질 또는 2019-nCoV (SARS-CoV-2) 의 스파이크 (S1) 단백질과 같은 바이러스 당단백질이다.
말단 만노스 단백질 당형태는 코어 구조에 3 개의 만노스 단위를 갖는 글리칸 잔기를 갖는 당단백질이며, 여기서 분지 내의 하나 또는 둘 모두의 만노스 단위는 N-아세틸글루코사민 ("GIcNAc") 에 결합되지 않는다. 일부 구현예에서, 이는 G0-N 당단백질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 G1-N 당단백질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 하이브리드 당형태를 지칭할 수 있다.
본 발명에 따른 당단백질 또는 단백질 당형태는 단리된 당단백질 또는 약물, 다른 단백질, 바이러스 또는 바이러스 캡시드와 같은 다른 모이어티에 연결된 당단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 당형태는 포유동물 세포, 진균 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포에서 생성된다.
용어 "항체" 는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 단백질을 지칭한다. "항체" 또는 "IgG" 는 또한 분석물 (항원) 에 특이적으로 결합하여 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 이의 단편에 의해 실질적으로 인코딩된 폴리펩티드를 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자, 뿐만 아니라 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다 중 어느 하나로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되고, 이것은 이번에는 면역글로불린 부류 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 를 정의한다.
예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kD) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kD) 를 가지며, 상기 사슬은 예를 들어, 사슬간 디설파이드 결합에 의해 안정화된다. 각각의 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110 개 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 의미한다.
항체는 단일클론 또는 다클론일 수 있고, 단량체성 또는 중합체성 형태로 존재할 수 있는데, 예를 들어 IgM 항체는 오량체 형태로 존재하고/하거나 IgA 항체는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재한다. 항체는 유지된다면 항체 단편들 및 다특이적 항체 (예, 이중특이적 항체) 를 또한 포함할 수 있거나, 또는 개질되어 리간드-특이적 결합 도메인을 포함한다. 용어 "단편" 은 무결 또는 완전 항체 또는 항체 사슬보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 부분 또는 일부를 지칭한다. 단편은 무결 또는 완전 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리를 통해 수득될 수 있다. 단편은 또한 재조합 방식에 의해 수득될 수 있다. 재조합으로 생산되는 경우, 단편은 단독으로 또는 융합 단백질로 불리는 거대 단백질의 부분으로서 발현될 수 있다. 예시적 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 예시적 융합 단백질은 Fc 융합 단백질을 포함한다. 본 발명에 따라, 융합 단백질은 또한 용어 "항체" 에 포함된다.
일부 구현예에서, 항체는 Fc 영역 포함 단백질, 예를 들어 면역글로불린이다. 일부 구현예에서, Fc 영역 포함 단백질은 또 다른 폴리펩티드 또는 그 단편에 융합된 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 재조합 단백질이다. 예시적 폴리펩티드는, 예를 들어 레닌; 성장 호르몬 (인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬 포함); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; α-1-항트립신; 인슐린 α-사슬; 인슐린 β-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 우로키나아제 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나아제; RANTES (활성화시 조절 정상적 T-세포 발현 및 분비); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1-α); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러리안(Muellerian)-저해 물질; 렐락신 α-사슬; 렐락신 β-사슬; 프로렐락신; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 β-락타마아제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA) (예, CTLA-4); 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자를 위한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류머티즘성 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 골-유래 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β.; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대 αFGF 및 βFGF; 상피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-β (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); 데스(l-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, 및 CD40; 에리스로포이에틴; 골전도성 인자; 항체독소; 골 형태발생 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β, 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-I 내지 IL-IO; 초산화물 디스뮤타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 부식 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어 AIDS 엔벨로프의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CDl Ia, CDl Ib, CDl Ic, CD 18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 나열된 폴리펩티드 중 어느 하나의 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 추가로, 본 발명에 따른 항체는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드, 그 단편 또는 변이체이며, 이는 상기 나열된 폴리펩티드 중 어느 하나에 특이적으로 결합된다.
본원에 사용된 바와 같고 달리 언급되지 않는 한, 용어 "샘플" 은 표적 분자를 포함하는 임의의 조성물 또는 혼합물을 지칭한다. 샘플은 생물학적 또는 기타 공급원 유래일 수 있다. 생물학적 공급원에는 동물 또는 인간과 같은 진핵생물 공급원이 포함된다. 바람직한 샘플은 포유류로부터 유래된 혈액 또는 혈장 샘플이다. 샘플은 또한 표적 분자와 함께 혼합되어 발견되는 희석제, 완충액, 세제, 및 오염 종 등을 포함할 수 있다. 샘플은 "부분 정제" 될 수 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 정제 단계, 예컨대 여과 또는 원심분리 단계에 적용됨), 표적 분자를 생산하는 유기체로부터 직접 수득될 수 있다. 혈장 샘플은 혈장 또는 혈장의 일부를 포함하는 임의의 샘플이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "불순물" 또는 "오염물" 은 생물학적 매크로분자, 예컨대 DNA, RNA, 하나 이상의 숙주 세포 단백질, 핵산, 내독소, 지질, 합성 기원의 불순물, 및 외래 또는 부적당한 분자 중 하나 이상으로부터 분리된 표적 분자를 포함하는 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 첨가제를 포함하여, 임의의 외래 또는 부적당한 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어, "불순물" 또는 "오염물질" 은 면역글로불린 M 뿐만 아니라 환자에서 알레르기 반응을 일으키는 면역글로불린 A 와 같이 표적 분자로부터 분리되어야 하는 특정 면역글로불린에도 적용될 수 있다. 부가적으로, 이러한 불순물은 제조 및/또는 정제 공정의 단계에서 사용되는 임의의 시약을 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환되어 사용되는 바와 같은 용어 "정제하는", "분리하는" 또는 "단리하는" 은 표적 분자 및 하나 이상의 기타 성분, 예를 들어 불순물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 분리에 의해 표적 분자의 순도를 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 표적 분자의 순도는 조성물로부터 하나 이상의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다.
용어 "크로마토그래피" 는 혼합물에 존재하는 기타 분자로부터 관심있는 분석물 (예, 표적 분자) 을 분리시키는 임의 종류의 기법을 지칭한다. 통상적으로, 표적 분자는 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향 하에 고정 매질 또는 분리 물질을 통해 이동하는 속도, 또는 결합 및 용리 과정의 차이의 결과로서 다른 분자로부터 분리된다. 크로마토그래피 분리 방법을 위한 예는 역상 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피이다.
"완충제" 는 그것의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해 pH 변화에 저항하는 용액이다. 예를 들어, 완충액의 원하는 pH 에 따라 사용될 수 있는 다양한 완충액은 Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975) 에 설명된다. 완충제의 비제한적 예는 MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 글리신 및 암모늄 완충제, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.
"분리 물질" 또는 "크로마토그래피 매트릭스" 라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 분리 과정에서 혼합물에 존재하는 다른 분자로부터 표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질, 예컨대 면역글로불린) 를 분리하는 임의의 종류의 과립 흡수제, 수지, 매트릭스 또는 고체 상을 의미한다. 통상적으로, 표적 분자는 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향 하에 분리 물질을 통해 이동하고 분리 물질과 상호작용하는 속도, 또는 결합 및 용리 과정의 차이의 결과로서 다른 분자로부터 분리된다. 예를 들어,수지 입자, 멤브레인 또는 모놀리식 흡수제로 이루어진 분리 물질은 컬럼 또는 카트리지에 넣어질 수 있다. 전형적으로, 분리 물질은 베이스 물질로서 베이스 매트릭스 및 상기 베이스 매트릭스에 부착된 하나 이상의 유형의 리간드를 포함한다.
"리간드" 는 작용기이거나 이를 포함하고, 크로마토그래피 베이스 매트릭스에 부착되고, 매트릭스의 결합 특성을 결정하거나 영향을 미친다. 바람직하게는, 리간드는 하나 이상, 바람직하게는 복수의 작용기를 갖는 중합체 사슬이다. 이들이 형성되는 단량체 단위 당 적어도 하나의 작용기를 갖는 중합체 사슬로 제조된 리간드가 가장 바람직하다. "리간드" 의 예로는 이온 교환기, 소수성 상호작용기, 친수성 상호작용기, 티오친화성 상호작용기, 금속 친화성기, 친화성기, 생체친화성기, 및 혼합 모드기 (전술한 것의 조합) 를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용될 수 있는 바람직한 리간드는 카르복실산과 같은 약한 이온 교환기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"이온-교환" 및 "이온-교환 크로마토그래피" 란 용어는 혼합물 중의 표적 분자 (예를 들어, 표적 단백질을 함유하는 Fc 영역) 가 이온 교환 매트릭스에 연결된 (예컨대, 공유 부착에 의한) 하전 화합물과 상호작용하여, 표적 분자가 혼합물 중의 용질 불순물 또는 오염물질보다 많거나 적은 양의 하전 화합물과 비특이적으로 상호작용하는 크로마토그래피 과정을 말한다. 혼합물 내의 불순물은 표적 분자보다 더 빠르거나 느리게 이온 교환 물질의 컬럼으로부터 용리되거나, 표적 분자에 비해 수지에 결합되거나 수지로부터 배제된다. "이온-교환 크로마토그래피" 는 구체적으로 양이온 교환, 음이온 교환, 및 혼합 모드 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 이온 교환 크로마토그래피는 표적 분자 (예를 들어, 표적 단백질을 함유하는 Fc 영역) 에 결합시킨 후 용리시키거나, 표적 분자가 컬럼을 "통해 흐르는" 동안 주로 불순물에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 결합 및 용리 모드로 수행된다.
구절 "이온 교환 매트릭스" 는 음으로 하전된 (즉, 양이온 교환 수지) 또는 양으로 하전된 (즉, 음이온 교환 수지) 크로마토그래피 매질 또는 분리 물질을 의미한다. 전하는 하나 이상의 하전된 리간드를 매트릭스에 부착함으로써, 예를 들어 공유 결합에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 전하는 매트릭스의 고유 특성일 수 있다.
본원에서 용어 "양이온 교환 매트릭스" 는 음으로 하전된 분리 물질로서, 예를 들어 카르복실산기와 같은 하나 이상의 음전하를 띠는 리간드가 부착된 것을 의미한다.
분리 컬럼을 결합 및 용리 모드로 "로딩" 할 때, 완충액을 사용하여 표적 분자 (예를 들어, 표적 단백질을 함유하는 Fc 영역) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성물을 크로마토그래피 컬럼 (예를 들어, 이온 교환 컬럼) 에 로딩한다. 완충제는 표적 분자가 분리 물질에 결합되지만 이상적으로는 모든 불순물은 결합되지 않고 컬럼을 통해 흐르도록 하는 전도도 및/또는 pH 를 갖는다.
분리 컬럼을 표적 분자를 "통해 흐르게" 하도록 "로딩" 할 때, 완충액을 사용하여 표적 분자 (예를 들어, 표적 단백질을 함유하는 Fc 영역) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성물을 크로마토그래피 컬럼 (예를 들어, 이온 교환 컬럼) 에 로딩한다. 완충제는 표적 분자가 분리 물질에 결합되지 않고 컬럼을 통해 흐르지만 이상적으로는 모든 불순물은 컬럼에 결합되도록 하는 전도도 및/또는 pH 를 갖는다.
분리 컬럼을 표적 분자에 "결합 및 용리" 하도록 "로딩" 할 때, 완충액을 사용하여 표적 분자 (예를 들어, 표적 단백질을 함유하는 Fc 영역) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성물을 크로마토그래피 컬럼 (예를 들어, 이온 교환 컬럼) 에 로딩한다. 완충제는 표적 분자가 분리 물질에 결합되도록 하는 전도도 및/또는 pH 를 갖는다. 하나 이상의 불순물로부터의 분리는 전도도 및/또는 pH 의 변화로 이어져, 표적 분자가 하나 이상의 불순물 전 또는 후에 세척 또는 용리된다.
전형적으로 샘플이 분리 물질에 로딩되는 완충액을 로딩 완충액 또는 샘플 완충액이라고 한다.
용어 "평형화" 는 표적 분자를 로딩하기 전에 분리 물질을 평형화하기 위한 완충제의 사용을 지칭한다. 전형적으로, 로딩 완충액은 평형을 위해 사용된다.
분리 물질을 "세척하다" 또는 "세척하기" 란, 적절한 액체, 예를 들어, 완충액을 분리 물질을 통해 또는 그 위로 통과시키는 것을 의미한다. 전형적으로 세척은 표적 분자를 용리하기 전에 분리 물질로부터 약하게 결합된 오염물을 제거하고/거나 로딩 후에 비결합된 또는 약하게 결합된 표적 분자를 제거하는데 사용된다.
이 경우, 전형적으로, 세척 완충액과 로딩 완충액은 동일하다. 바이러스 불활성화 완충액을 사용하는 경우, 이것은 표적 분자를 용리하기 전에 특정 존재하는 바이러스를 불활성화시키는데 사용된다. 이 경우, 전형적으로 바이러스 불활성화 완충액은 이것이 세제/세제들을 함유하거나 상이한 특성 (pH/전도도/염 및 그 양) 을 가질 수 있기 때문에 로딩 완충액과 상이하다.
세척은 또한 표적 분자의 용리 후에 분리 물질로부터 오염물을 제거하는데 사용될 수 있다. 이는 표적 분자의 용리 후에 적절한 액체, 예를 들어 완충액을 분리 물질을 통해 또는 그 위로 통과시킴으로써 수행된다. 이 경우, 전형적으로, 세척 완충액은 로딩 완충액과 상이하다. 이것은 세제/세제들을 함유하거나, 상이한 특성 (pH/전도도/염 및 그 양) 을 가질 수 있다. 세척 완충액은 예를 들어 산성 완충액이다.
분리 물질로부터 분자 (예를 들어, 면역글로불린 G 또는 불순물과 같은 관심 있는 폴리펩티드) 를 "용리" 하는 것은 그로부터 분자를 제거하는 것을 의미한다. 용리는 표적 분자가 로딩 완충액의 용매 앞쪽으로 용리될 때 플로우 스루 모드에서 직접 일어날 수 있다. 또는 로딩 완충액과 상이한 완충액이 분리 물질 상의 리간드 부위에 대해 관심 분자와 경쟁하도록 용액 조건을 변경함으로써. 비제한적인 예는, 이온 교환 물질을 둘러싸는 완충액의 이온 강도를 변경함으로써 이온 교환 물질로부터 분자를 용리시켜 완충액이 이온 교환 물질 상의 하전된 부위에 대해 분자와 경쟁하도록 하는 것이다.
용어 "평균 입자 크기 직경" 또는 d50 은 누적 입자 크기 분포의 50% 에서의 평균 입자 크기 분포 값을 의미한다. 입자 크기는 레이저-회절에 의해, 바람직하게는 Malvern ‘Master Sizer 에 의해 결정된다.
용어 "평균 공극 크기" 는 누적 공극 크기 분포의 50% 에서의 평균 공극 크기 분포 값을 의미한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "플로우-스루 공정", "플로우-스루 모드" 및 "플로우-스루 작업" 은, 샘플 내에 하나 이상의 불순물과 함께 함유된 적어도 하나의 표적 분자 (예를 들어, Fc-영역 함유 단백질 또는 항체) 가, 통상적으로 하나 이상의 불순물에 결합하는 분리 물질을 통해 흐르도록 의도되고, 여기서 표적 분자는 통상적으로 결합하지 않고 (즉, 통과하여 흐르며) 로딩 완충액을 이용하여 분리 물질로부터 용리되는 분리 기술을 지칭한다.
용어 "결합 및 용리 모드" 및 "결합 및 용리 공정" 은, 샘플 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질) 에 포함된 적어도 하나의 표적 분자가 적합한 분리 물질 (예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피 매질) 에 결합하고, 이어서 로딩 완충액과 상이한 완충액으로 용리되는 분리 기술을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "이온 밀도" 는 주어진 분리 물질의 단위 부피 또는 질량 당 이온의 수, 보다 특히, 분리 물질의 단위 부피 또는 질량 당 주어진 유형의 이온 (예를 들어, 양이온 또는 음이온) 의 수를 지칭한다. 일반적으로, 이온의 수는 주어진 분리 재료를 적정하는 것으로 추정된다. 또한, 이온의 양은 분리 물질의 질량 또는 부피 단위 당 당량 (eq) 으로 주어진다.
본원에서 사용되는 용어 "전도도" 란 대부분의 물질의 고유한 특성을 말하며, 전류가 얼마나 강하게 저항하거나 전도하는지를 정량화한다. 완충액과 같은 수용액에서, 전류는 하전된 이온에 의해 전달된다. 전도도는 하전된 이온의 수, 그들이 운반하는 전하량 및 그들이 얼마나 빨리 이동하는지에 의해 결정된다. 따라서, 대부분의 수용액의 경우, 용해된 염의 농도가 높을수록 전도도가 높다.
온도를 올리면 이온이 더 빠르게 움직이게 되고, 따라서 전도도가 증가하게 된다. 전형적으로, 전도도는 달리 지시되지 않는 한, 실온에서 정의된다. 전도도의 기본 단위는 지멘스 (S) 이다. 이는 1 cm 입방체의 액체의 대향하는 면 사이에서 측정된, 오옴 (Ohm) 의 저항의 역수로서 정의된다. 따라서, 값은 S/cm 로 추정된다.
본 발명은 단백질 당형태를 분리 또는 정제하는 방법을 제공한다. 이는 하나 이상의 단백질 당형태가 하나 이상의 다른 단백질 당형태로부터 및/또는 샘플 내의 다른 불순물로부터 분리될 수 있다는 것을 의미한다. 바람직하게는 적어도 하나의 단백질 당형태는 적어도 하나의 다른 당형태로부터 분리되고, 예를 들어 하나의 고 만노스 당형태는 또다른 단백질 당형태로부터 분리된다. 이것은 중합체 사슬이 공유적으로 부착된 베이스 매트릭스를 포함하는, 또한 수지라고도 불리는, 특정 분리 물질 상의 크로마토그래피 분리에 의해 수행된다. 중합체 사슬은 아미노산 및 중합성 이중 결합을 포함하는 단량체로 제조된다.
본 발명의 방법에 의해, 당형태는 효율적인 글리칸 종 분리를 가능하게 하는 분리, 농축 및/또는 정제될 수 있다. 본 발명의 특정 양상에서, 보다 소수성이고 보다 빠른 소거율을 나타내는 고 만노스 또는 말단 만노스 분자를 함유하는 글리칸 변이체를 분리하는 것이 유리하다. 또한, 이러한 글리칸 변이체는 더 높은 독성 및 더 낮은 당단백질 효능에 기여할 수 있다. 본 발명의 다른 양상에서, 푸코스를 갖는 당단백질을 분리하여, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성의 더 나은 조절을 보장하는 것이 유리하다. 본 발명의 다른 양상에서, 다르게는 표적 당단백질과 동일하지만 글리코실화되지 않은 단백질을 제거하는 것이 유리하다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 정제된 당단백질은 고 만노스 글리칸 변이체를 함유하지 않는다. 본 발명의 또다른 구현예에서, 정제된 당단백질은 말단 만노스를 갖는 낮은 수준의 하이브리드 글리칸 변이체를 함유한다. 본 발명의 또다른 구현예에서, 정제된 당단백질은 낮은 수준의 비-푸코실화 글리칸 변이체를 함유한다. 본 발명의 또다른 구현예에서, 정제된 당단백질은 낮은 수준의 비-글리코실화 단백질을 함유한다.
본 발명의 분리 물질은 촉수-유사 구조가 부착된, 바람직하게는 그래프트된 베이스 물질을 포함한다.
베이스 매트릭스라고도 불리는 베이스 물질은 그래프트-중합 반응에 접근할 수 있는 반응성 기, 특히 OH 기, 바람직하게는 지방족 OH 기를 함유한다. 따라서, 베이스 물질은 또한, 예를 들어, 유기 중합체로부터 제조될 수 있다. 이러한 유형의 유기 중합체는 다당류, 예컨대 아가로오스, 덱스트란, 전분, 셀룰로오스 등, 또는 합성 중합체, 예컨대 폴리(아크릴아미드), 폴리(메타크릴아미드), 폴리(아크릴레이트), 폴리(메타크릴레이트), 친수성 치환된 폴리(알킬 알릴 에테르), 친수성 치환된 폴리(알킬 비닐 에테르), 폴리(비닐 알코올), 폴리(스티렌) 및 상응하는 단량체의 공중합체일 수 있다. 이들 유기 중합체는 바람직하게는 또한 가교결합된 친수성 네트워크의 형태로 사용될 수 있다. 이는 또한 스티렌 및 디비닐벤젠으로부터 제조된 중합체를 포함하며, 이는 바람직하게는 다른 소수성 중합체와 같이, 친수화된 형태로 사용될 수 있다.
대안적으로는, 실리카, 산화지르코늄, 이산화티탄, 산화알루미늄 등의 무기 물질을 베이스 물질로 사용할 수 있다. 복합 재료, 즉, 예를 들어 자성화가능한 입자 또는 자성화가능한 코어의 공중합에 의해 자성화될 수 있는 입자를 사용하는 것도 동등하게 가능하다. 코어 쉘 물질을 사용하는 것도 가능하며, 이에 의해 쉘, 즉 적어도 표면 또는 코팅은 OH 기를 갖는다.
그러나, 가수분해에 안정하거나 또는 단지 어렵게 가수분해될 수 있는 친수성 기재의 사용이 바람직한데, 이는 본 발명에 따른 물질이 바람직하게는 예를 들어 연장된 사용 기간에 걸쳐 염기성 pH 에서 알칼리 세정 또는 재생을 견뎌야 하기 때문이다.
베이스 매트릭스는 입자 크기가 2 내지 1000 ㎛ 일 수 있는 불규칙한 형상의 입자 또는 구형 입자로 이루어질 수 있다. 3 내지 300 ㎛ 의 평균 입자 크기가 바람직하며, 가장 바람직한 구현예에서 평균 입자 크기는 20 내지 63 ㎛ 이다.
베이스 매트릭스는 특히, 비-다공성 또는 바람직하게는 다공성 입자의 형태일 수 있다. 평균 공극 크기는 2 내지 300 nm 일 수 있다. 5 내지 200 nm 의 공극 크기가 바람직하며, 가장 바람직한 평균 공극 크기는 40 내지 110 nm 이다.
베이스 매트릭스는 또한 동일하게 막, 섬유, 중공 섬유, 코팅 또는 모놀리식 몰딩의 형태일 수 있다. 모놀리식 몰딩은 바람직하게는 다공성의, 3 차원 바디, 예를 들어 원통형 형태이다.
바람직한 구현예에서, 베이스 매트릭스는 a) 및 b) 그룹으로부터의 적어도 하나의 화합물의 공중합에 의해 형성된 공중합체이다:
a) 적어도 하나의 화학식 I 의 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르
Figure pct00006
식 중, R1, R2, R3 은 서로 독립적으로, H 또는 C1 내지 C6 알킬, 바람직하게는 H 또는 -CH3 일수 있고,
R4 는 적어도 하나의 히드록실기를 갖는 라디칼임,
및
b) 화학식 II 및/또는 III 및/또는 IV 에 따르는 적어도 하나의 가교제
Figure pct00007
식 중, X 는 2 내지 5 개의 C 원자, 바람직하게는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 이가 알킬 라디칼이고, 여기서 인접하지 않고 N 의 바로 근처에 위치하지 않는 하나 이상의 메틸렌 기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 치환될 수 있고, 메틸렌 기의 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH-(C1-C8)-알킬, N-(C1-C8)-알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음, 및
Figure pct00008
식 중, 화학식 III 및 IV 의 Y1 및 Y2 는 서로 독립적으로, 하기이고:
C1 내지 C10 알킬 또는 시클로알킬, 여기서 하나 이상의 비-인접 메틸렌 기 또는 N 의 바로 근처에 위치하지 않는 메틸렌 기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 치환될 수 있고, 메틸렌 기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음,
또는 C6 내지 C18 아릴, 여기서, 아릴 시스템 내의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음,
A 는 2 내지 5 개의 C 원자, 바람직하게는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 이가 알킬 라디칼이고, 여기서 하나 이상의 비-인접 메틸렌 기 또는 N 의 바로 근처에 위치하지 않는 메틸렌 기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 치환될 수 있고, 메틸렌 기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음,
화학식 I 에서 R4 는 전형적으로 적어도 하나의 히드록실 기를 갖는 알킬 라디칼, 지환족 라디칼 또는 아릴 라디칼이다.
매우 바람직한 구현예에서, 베이스 매트릭스는 가교제로서 1,4-부탄디올 모노비닐 에테르, 1,5-펜탄디올 모노비닐 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노비닐 에테르 또는 시클로헥산디메탄올 모노비닐 에테르 및 디비닐에틸렌우레아 (1,3-디비닐이미다졸린-2-온) 의 군으로부터 선택되는 사용된 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르의 공중합에 의해 형성된다.
적합한 상업적으로 입수가능한 비닐에테르 기재의 베이스 물질의 예는 Eshmuno®, Merck KGaA, Germany 이다.
베이스 물질의 표면에 선형 중합체 사슬이 공유 결합되어 분리 물질이 생성되고, 이에 의해
a) 베이스 물질은 바람직하게는 지방족 히드록실기를 함유한다,
b) 중합체는 지지체에 공유 결합되고,
c) 중합체는 아미노산 잔기를 포함한다,
d) 중합체의 단량체 단위는 선형 방식으로 연결된다.
베이스 물질 및 공유적으로 부착된 선형 중합체 사슬을 포함하는 실제 분리 물질은 다양한 방식으로 제조될 수 있다. "그래프팅 온투 (~ 상의 그래프팅)" 의 경우, 먼저 단량체로부터 중합체 사슬을 형성해야 하고, 2 단계에서 표면에 결합해야 한다. "그래프팅 프롬 (~ 로부터의 그래프팅)" 의 경우, 표면 상에서 중합 반응이 시작되고, 그래프트 중합체가 개별 단량체로부터 직접 쌓아진다. 베이스 물질의 표면에 결합을 허용하는 다른 중합 방법이 또한 사용될 수 있다.
"그래프팅 프롬" 방법이 바람직하고, 분리되어야 하는 비-공유적으로 결합된 중합체와 같은 소수의 부산물만이 형성된 변이체가 특히 바람직하다. 자유 라디칼 중합이 제어된 방법, 예를 들어 원자-전달 자유 라디칼 중합 (ATRP) 의 방법이 특히 관심있는 것으로 보인다. 여기서, 개시제 기는 제 1 단계에서 원하는 밀도로 지지체 표면에 공유 결합된다. 개시제 기는, 예를 들어, 2-브로모-2-메틸프로피온산 에스테르에서와 같이 에스테르 기능을 통해 결합된 할라이드일 수 있다. 그래프트 중합은 구리 (I) 염의 존재 하에 제 2 단계에서 수행된다.
본 발명에서 사용되는 분리 재료의 제조에 적합한 매우 바람직한 일단계 그래프트 중합 반응은 베이스 물질을 활성화시키지 않고, 히드록실-함유 베이스 물질 상의 세륨 (IV) 에 의해 개시될 수 있다.
이러한 세륨 (IV) 개시 그래프팅은 바람직하게는 EP 0 337 144 또는 US 5,453,186 에 따라 수행된다. 생성된 사슬은 단량체 단위를 통해 베이스 물질에 연결된다. 이를 위해, 본 발명에 따른 베이스 물질은 단량체의 용액, 바람직하게는 수용액 중에 현탁된다. 중합체 재료의 그래프팅-온은 산소를 배제하는 종래의 산화환원 중합의 과정에서 수행된다. 사용되는 중합 촉매는 세륨 (IV) 이온인데, 이는 이 촉매가 베이스 물질의 표면에 자유 라디칼 자리를 형성하므로, 이로부터 단량체의 그래프트 중합이 개시된다. 이 반응은 보통 묽은 무기 산에서 수행된다. 이러한 그래프트 중합을 수행하기 위해, 산은 일반적으로 1 내지 0.00001 mol/l, 바람직하게는 0.1 내지 0.001 mol/l 범위의 농도로 수용액에 사용된다. 0.1 내지 0.001 mol/l 범위의 농도로 사용되는 희석 질산의 사용이 매우 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 분리 물질의 제조를 위해, 단량체는 통상적으로 베이스 물질에 과량으로 첨가된다. 전형적으로, 침강된 중합체 재료의 리터 당 0.05 내지 100 mol 의 총 단량체가 사용되며, 바람직하게는 0.05-25 mol/l 가 사용된다.
중합은 세륨 염을 포함하는 종결 반응에 의해 종결된다. 이러한 이유로, (평균) 사슬 길이는 베이스 물질, 개시제 및 단량체의 농도 비에 의해 영향을 받을 수 있다. 또한, 균일한 단량체 또는 또한 상이한 단량체의 혼합물이 사용될 수 있고; 후자의 경우, 그래프팅된 공중합체가 형성된다.
본 발명에 사용되는 분리 재료의 제조에 유리하게 사용될 수 있는 단량체는 화학식 V 에 따른 것이다
Figure pct00009
식 중, R1, R2 및 Y 는 서로 독립적으로 H 또는 CH3, 바람직하게는 H 이고,
R3 은 -CHCOOMR4 이고,
Figure pct00010
R4 는 C1 내지 C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 바람직하게는 이소프로필 및 이소부틸, 매우 바람직하게는 이소부틸, 또는 C1 내지 C4 퍼플루오로알킬이고
M 은 H, Na, K 또는 NH4 + 임.
퍼플루오로알킬은 알킬 잔기의 모든 H 원자가 F 원자로 치환됨을 의미한다.
화학식 V 의 예시적인, 바람직한 구조는 Va:
Figure pct00011
식 중 R1, R2 및 Y 는 H 이고,
R3 은 -CHCOOMR4 이고,
R4 는 이소프로필이고,
M 은 H 임
뿐 아니라 화학식 Vb 이다:
Figure pct00012
식 중 R1, R2 및 Y 는 H 이고,
R3 은 -CHCOOMR4 이고,
R4 는 이소부틸이고,
M 은 H 임.
이러한 단량체는 또한 아크릴로일발린 (화학식 Va), 아크릴로일류신 (화학식 Vb), 아크릴로일알라닌, 아크릴로일노르류신, 메타크릴로일발린, 메타크릴로일류신, 메타크릴로일알라닌, 메타크릴로일노르류신, 디메타크릴로일발린, 디메타크릴로일류신, 디메타크릴로일알라닌, 디메타크릴로일노르류신으로 기재될 수 있으며, 이로써 아크릴로일발린 및 아크릴로일류신이 바람직하고, 아크릴로일류신이 특히 바람직하다.
본 발명의 방법에서 사용되는 분리 물질은 바람직하게는 화학식 V 에 따른 단량체로부터 생성된 베이스 물질 상에 그래프팅된 촉수-유사 선형 중합체 구조만을 함유한다. 바람직하게는, 이들은 화학식 V 에 따른 하나의 유형의 단량체에 의해서만 생성되는 선형 중합체를 함유한다.
그러나, 선형 중합체가 화학식 V 에 따른 2 개 이상의 상이한 단량체의 공중합에 의해 형성되는 것도 가능하다. 선형 중합체가 화학식 V 에 따른 하나 이상의 상이한 단량체 및 예를 들어 이온성, 친수성 또는 소수성 기로 관능화된 다른 아크릴아미드, 메타크릴레이트, 아크릴레이트, 메타크릴레이트 등과 같은 하나 이상의 다른 중합성 단량체의 공중합에 의해 형성되는 것도 가능하다.
본 발명에 따른 분리 재료의 예시적인 구조를 도 2 및 도 3 에 나타내었다. 도 2 은 아크릴로일류신 단량체의 중합에 의해 형성된 선형 중합체로 관능화된 베이스 물질 (도트) 을 보여준다. 또한, 명확성을 위해, 각각의 중합체 단위의 카르복시-알킬 말단기를 나타낸다. 도 3 은 아크릴로일발린 단량체의 중합에 의해 형성된 선형 중합체로 관능화된 베이스 물질 (도트) 을 보여준다. 또한, 명확성을 위해, 각각의 중합체 단위의 카르복시-알킬 말단기를 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 분리 물질은 10-1200 μeq/g 범위의 다양한 양의 이온 밀도 윈도우를 갖는 이온 교환 물질이며, 보다 바람직한 구현예에서 이온 밀도 윈도우는 400-900 μeq/g 이다.
바람직한 구현예에서, 이온 교환 물질은 이온 교환 작용기 및 소수성 작용기를 함유할 수 있고, 보다 바람직한 구현예에서 둘 모두의 작용기는 중합체 사슬 내에 내장된 하나의 단량체 단위로부터 생성된 단일 표면 작용기 단위 상에 있고, 가장 바람직한 구현예에서 작용기는 아미노산 잔기의 일부이다.
전형적으로, 상기 기재된 분리 물질을 포함하는 크로마토그래피 컬럼이 본 발명에 따른 방법에 사용된다. 크로마토그래피 컬럼은 당업자에 공지되어 있다. 이들은 전형적으로 분리 물질로 충전된 원통형 튜브 또는 카트리지 뿐만 아니라 튜브 또는 카트리지에 분리 물질을 고정하기 위한 필터 및/또는 수단 및 튜브로 그리고 튜브로부터 용매 전달을 위한 연결부를 포함한다. 크로마토그래피 컬럼의 크기는 적용, 예를 들어, 분석 또는 분취에 따라 달라진다. 크로마토그래피 컬럼은 또한 멤브레인 함유 카트리지일 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 물질은 또한 분리 이펙터를 구비한 베이스 물질로서 설명될 수 있다. 이들은 샘플 액체로부터 분리하기 위한 목적으로 하나 이상의 표적 성분의 선택적, 부분 선택적 또는 비-선택적 결합 또는 흡착을 위해, 또는 매트릭스로부터 2 차 성분의 분리, 천연 공급원으로부터의 생물중합체의 분리, 농축 및/또는 고갈, 재조합 공급원으로부터의 생물중합체의 분리, 농축 및/또는 고갈, 단백질 및 펩티드의 분리, 농축 및/또는 고갈, 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 분리, 농축 및/또는 고갈, 바이러스의 분리, 농축 및/또는 고갈, 숙주 세포 단백질의 분리, 농축 및/또는 고갈, 또는 당단백질의 분리, 농축 및/또는 고갈을 목적으로 하나 이상의 2 차 성분의 선택적, 부분 선택적 또는 비-선택적 결합 또는 흡착을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 표적 분자는 당단백질이다.
표적 분자는 샘플로부터 적어도 하나 이상의 다른 물질로부터 분리되고, 여기서 표적 분자를 포함하는 샘플은 액체에 용해되고, 이는 본 발명에 따른 물질과 접촉된다. 접촉 시간은 통상적으로 30 초 내지 24 시간의 범위이다. 본 발명에 따른 분리 물질을 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 액체를 통과시킴으로써 액체 크로마토그래피의 원리에 따라 작업하는 것이 유리하다. 액체는 단지 그 중력을 통해 컬럼을 통해 흐를 수 있거나 펌프에 의해 펌핑될 수 있다. 다른 방법은 배치식 크로마토그래피이며, 여기서 표적 분자 또는 생체중합체가 분리 물질에 결합할 수 있는 한, 교반 또는 진탕에 의해 분리 물질을 액체와 혼합한다. 마찬가지로, 예를 들어, 분리 물질을 포함하는 현탁액으로 분리될 액체를 도입함으로써 크로마토그래피 유동층의 원리에 따라 작업하는 것이 가능하며, 여기서 분리 물질은 이의 고밀도 및/또는 자기 코어로 인해 원하는 분리에 적합하도록 선택된다.
크로마토그래피 공정이 결합 및 용리 모드로 수행되는 경우, 표적 분자는 분리 물질에 결합한다. 이어서, 분리 물질을, 바람직하게는 표적 분자가 분리 물질과 접촉하는 액체와 동일한 이온 강도 및 동일한 pH 를 갖는 세척 완충제로 세척할 수 있다. 세척 완충제는 분리 물질에 결합되지 않는 모든 성분을 제거한다. 다른 적합한 완충제를 사용한 추가의 세척 단계는 표적 분자를 탈착시키지 않고 뒤따를 수 있다. 결합된 표적 분자의 탈착은 용리액 내의 이온 강도를 변화시킴으로써 및/또는 용리액 내의 pH 를 변화시킴으로써 및/또는 용매를 변화시킴으로써 수행된다. 따라서, 표적 분자는 용리액 내에서 정제되고 농축된 형태로 수득될 수 있다. 표적 분자는 통상적으로 탈착 후 순도가 70% 내지 99%, 바람직하게는 85% 내지 99%, 특히 바람직하게는 90% 내지 99% 이다.
또한, 하나 이상의 유형의 표적 분자를 분리하거나 정제하기 위해 상기 기술된 결합 및 용리 공정을 사용하는 것이 가능하며, 이에 의해 표적 분자의 그룹은 상기 기술된 바와 같이 분리 물질에 결합되고 하나 이상의 불순물로부터 분리된다.
그러나, 크로마토그래피 공정이 플로우-스루 모드로 진행되면, 표적 분자 또는 상이한 유형의 표적 분자는 액체 내에 유지되지만, 다른 수반되는 성분은 분리 물질에 결합한다. 그 후, 표적 분자는 스루-플로우에서 컬럼 용리액을 수집함으로써 직접 수득된다. 특정 생체중합체를 분리 물질에 결합시키기 위해, 또는 정제 작업이 표적 분자와 결합하지 않는 것이 유리한지 여부를 조건, 특히 pH 및/또는 전도도를 어떻게 적응시켜야 하는지가 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명은 바람직하게는 당단백질의 분리 및 정제를 위한 상기 기재된 분리 물질의 용도 및 분리 물질을 바람직하게는 산성 조건 하에 하나 이상의 당단백질을 포함하는 샘플과 접촉시키는 것을 포함하는 액체 크로마토그래피에 의한 당단백질의 정제 및/또는 분리 방법에 관한 것이다.
예상치않게, 본 발명에 따른 이온 교환 물질이 >10 mg 당단백질/ml 물질 용량에서 효율적인 글리칸 종 분리를 가능하게 하는 당형태의 정제, 분리 또는 농축을 위해 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 여기서 더욱 바람직한 구현예에서 용량은 10 내지 80 mg/ml 이다. 또한, 이 혁신적인 이온 교환 물질은 5 mS/cm 초과의 높은 전도도에서 사용될 수 있으며, 더욱 바람직한 구현예에서 전도도는 5 내지 60 mS/cm 이다.
놀랍게도, 구배 또는 단계 모드에서 4-7 에서 9 초과의 pH, 바람직하게는 9 내지 11, 가장 바람직하게는 pH 10 로의 pH 변화를 사용하여 고 만노스 함유 변이체, 말단 만노스 함유 변이체, 푸코스 함유 변이체 및 무-글리코실화 함유 변이체를 포함하는 글리칸 변이체를 분리 및 농축하는 것이 가능하였다. 또한, 이러한 분리 물질의 적용은 친화성 크로마토그래피 모드에 비해 현저한 경제적 이점을 보였고, 음이온 교환 모드에 비해 더 넓은 선택성 및 향상된 성능을 가능하게 하였다.
또한, 적용은 상이한 글리칸 변이체 종의 분리에 제한되지 않지만, 무-글리코실화 함유 변이체를 글리코실화된 것으로부터 제거하는 데 사용될 수 있다.
또한, 이 물질의 적용은 결합 및 용리 적용에 제한되지 않지만, 플로우-스루 모드에서 사용될 수 있어서, pH < 6 및/또는 높은 전도도 ( > 20 mS/cm) 를 갖는 완충제를 사용하여 이온 교환 물질 상에 더 높은 만노스 함유 종 또는 말단 만노스 함유 글리칸 변이체 흡착을 초래한다. 또한, 놀랍게도 물질에 공유적으로 부착된 아미노산으로 1 차로 구성된 이러한 이온 교환 물질만이 글리칸 종에 대해 필요한 선택성을 가지며, 여기서 더욱 바람직한 구현예에서 이들 아미노산은 발린 또는 류신이고, 이들의 조합 및 유도체를 포함하고, 가장 바람직한 것은 류신이다.
또한, 본 발명은 재생될 수 있고 넓은 작업 윈도우, 예를 들어, pH 3-10; 전도도 5-60 mS/cm 에서 적용가능한 크로마토그래피 기반 당단백질 정제 단계를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, 글리칸 종을 분리하기 위한 결합 및 용리 모드에서 당단백질 정제 공정에 사용된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, 글리칸 종을 분리하는 결합 및 용리 모드에서 당단백질 정제 공정에 사용되며, 여기서 작동 윈도우 스팬은 pH 2 내지 10 이고, 보다 바람직한 구현예에서 pH 는 4 내지 7 이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, 글리칸 종을 분리하는 결합 및 용리 모드에서 당단백질 정제 공정에 사용되며, 여기서 용매 pH 용리는 결합된 성분을 회수하기 위해 사용된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, 글리칸 종을 분리하기 위한 결합 및 용리 모드에서 당단백질 정제 공정에 사용되며, 여기서 결합 윈도우 스팬은 10 mg 당단백질/ml 물질 내지 100 mg 당단백질/ml 물질이고, 보다 바람직한 구현예에서 결합 윈도우 스팬은 20 mg 당단백질/ml 물질 내지 80 mg 당단백질/ml 물질이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, 글리칸 종을 분리하는 결합 및 용리 모드에서 당단백질 정제 공정에 사용되며, 여기서 전도도 윈도우 스팬은 5 내지 60 mS/cm 이고, 보다 바람직한 구현예에서 전도도 범위는 15 내지 35 mS/cm 이다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, 글리칸 종을 분리하는 플로우-스루 모드에서 당단백질 정제 공정에 사용되며, 여기서 낮은 만노스 함유 종은 플로우-스루에 있고 높은 만노스 함유 종은 분리 물질에 결합한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, 글리칸 종을 분리하는 플로우-스루 모드에서 당단백질 정제 공정에 사용되며, 여기서 비-하이브리드 종은 플로우-스루에 있고 하이브리드 (예를 들어, 말단 만노스 함유) 종은 분리 물질에 결합한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, 글리칸 종을 분리하는 플로우-스루 모드에서 당단백질 정제 공정에 사용되며, 여기서 낮은 푸코실화 종은 플로우-스루에 있고 높은 푸코실화 함유 종은 분리 물질에 결합한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 본 발명에서 사용되는 이온 교환 물질을 포함하는 크로마토그래피 컬럼에 당형태 중 적어도 하나가 고 만노스 당형태인 단백질 당형태의 혼합물을 포함하는 샘플을 적용하는 단계
b) 플로우-스루에서 적어도 하나의 고 만노스 당형태를 분리 및 용리하는 단계
c) 분리 물질로부터 결합된 당형태를 용리시킴으로써, 용리된 당형태가 고 만노스 당형태로 환원되는 단계.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 본 발명에서 사용되는 이온 교환 물질을 포함하는 크로마토그래피 컬럼에 당형태 중 적어도 하나가 고 만노스 당형태인 단백질 당형태의 혼합물을 포함하는 샘플을 적용함으로써, 적어도 하나의 고 만노스 당형태, 전형적으로 또는 다른 단백질 당형태가 분리 물질에 결합되는 단계
b) 분리 물질을 용리 완충제와 접촉시킴으로써, 고 만노스 당형태와 상이한 적어도 하나의 당형태가 용리되는 한편, 적어도 하나의 고 만노스 당형태는 분리 물질에 결합된 채로 유지되는 단계
c) 선택적으로 분리 물질을 제 1 용리 완충액과 전형적으로 상이한 제 2 용리 완충액과 접촉시키고, 이에 의해 적어도 하나의 고 만노스 당형태를 용리시키는 단계.
이 구현예에서, 단계 b) 에서 수득된 용리액은 단계 a) 에서 적용된 샘플과 비교하여 고 만노스 당형태에서 감소되고, 단계 c) 에서 수득된 용리액은 풍부하다. 상기 기재된 바와 같이 플로우 스루 또는 결합 용리액에 분리된 만노스 당형태는 바람직하게는 상이한 정도의 만노실화를 갖는 항체 또는 상이한 정도의 만노실화를 갖는 바이러스 및/또는 바이러스 캡시드 보유 단백질이다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 도입되고, 당단백질을 포함하는 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 다른 유형의 당단백질을 포함하거나 당단백질을 포함하지 않는 바이러스 및/또는 바이러스 입자로부터 분리하기 위해 플로우-스루 또는 결합 용리 모드로의 당단백질 정제 공정에 사용된다. 바람직하게는, 분리는 글리칸 구조에 존재하는 만노스의 상이한 양에 기초하여 일어난다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 본 발명에서 사용되는 이온 교환 물질을 포함하는 크로마토그래피 컬럼에 당형태 중 적어도 하나가 말단 만노스 당형태인 단백질 당형태의 혼합물을 포함하는 샘플을 적용함으로써, 적어도 하나의 말단 만노스 당형태, 전형적으로 또한 다른 단백질 당형태가 분리 물질에 결합되는 단계
b) 분리 물질을 용리 완충제와 접촉시킴으로써, 말단 만노스 당형태와 상이한 적어도 하나의 당형태가 용리되는 한편, 적어도 하나의 말단 만노스 당형태는 분리 물질에 결합된 채로 유지되는 단계
c) 선택적으로 분리 물질을 제 1 용리 완충액과 전형적으로 상이한 제 2 용리 완충액과 접촉시키고, 이에 의해 적어도 하나의 말단 만노스 당형태를 용리시키는 단계.
이 구현예에서, 단계 b) 에서 수득된 용리액은 단계 a) 에서 적용된 샘플과 비교하여 말단 만노스 당형태에서 감소되고, 단계 c) 에서 수득된 용리액은 풍부하다. 상기 기재된 바와 같이 플로우 스루 또는 결합 용리액에 분리된 말단 만노스 당형태는 바람직하게는 상이한 정도의 만노실화를 갖는 항체 또는 상이한 정도의 만노실화를 갖는 바이러스 및/또는 바이러스 캡시드 보유 단백질이다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 도입되고, 당단백질을 포함하는 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 다른 유형의 당단백질을 포함하거나 당단백질을 포함하지 않는 바이러스 및/또는 바이러스 입자로부터 분리하기 위해 플로우-스루 또는 결합 용리 모드로의 당단백질 정제 공정에 사용된다. 바람직하게는, 분리는 글리칸 구조에 존재하는 말단 만노스의 상이한 양에 기초하여 일어난다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 본 발명에서 사용되는 분리 물질을 포함하는 크로마토그래피 컬럼에 당형태 중 적어도 하나가 푸코스 보유 당형태인 단백질 당형태의 혼합물을 포함하는 샘플을 적용함으로써, 적어도 하나의 푸코스 보유 당형태, 전형적으로 또한 다른 단백질 당형태가 분리 물질에 결합되는 단계
b) 분리 물질을 용리 완충제와 접촉시킴으로써, 무-푸코스 보유 당형태와 상이한 적어도 하나의 당형태가 용리되는 한편, 적어도 하나의 푸코스 보유 당형태는 분리 물질에 결합된 채로 유지되는 단계
c) 선택적으로 분리 물질을 제 1 용리 완충액과 전형적으로 상이한 제 2 용리 완충액과 접촉시키고, 이에 의해 적어도 하나의 무-푸코스 보유 당형태를 용리시키는 단계.
이 구현예에서, 단계 b) 에서 수득된 용리액은 단계 a) 에서 적용된 샘플과 비교하여 무-푸코스 보유 당형태에서 감소되고, 단계 c) 에서 수득된 용리액은 풍부하다. 상기 기재된 바와 같이 플로우 스루 또는 결합 용리액에 분리된 푸코스 보유 당형태는 바람직하게는 상이한 정도의 푸코실화를 갖는 항체 또는 상이한 정도의 푸코실화를 갖는 바이러스 및/또는 바이러스 캡시드 보유 단백질이다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 도입되고, 당단백질을 포함하는 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 다른 유형의 당단백질을 포함하거나 당단백질을 포함하지 않는 바이러스 및/또는 바이러스 입자로부터 분리하기 위해 플로우-스루 또는 결합 용리 모드로의 당단백질 정제 공정에 사용된다. 바람직하게는, 분리는 글리칸 구조에 존재하는 푸코스의 상이한 양에 기초하여 일어난다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 글리칸을 갖고 글리칸을 갖지 않는 단백질의 혼합물을 포함하는 샘플을 적용함으로써, 글리칸을 갖는 단백질 중 적어도 하나인, 단백질 당형태가 본 발명에서 사용되는 분리 물질을 포함하는 크로마토그래피 컬럼에 결합되는 단계
b) 분리 물질을 용리 완충제와 접촉시킴으로써, 글리칸이 있는 적어도 하나의 단백질이 용리되는 한편, 글리칸이 없는 적어도 하나는 분리 물질에 결합된 채로 유지되는 단계
c) 선택적으로 분리 물질을 제 1 용리 완충액과 전형적으로 상이한 제 2 용리 완충액과 접촉시키고, 이에 의해 글리칸이 없는 적어도 하나를 용리시키는 단계.
이 구현예에서, 단계 b) 에서 수득된 용리액은 단계 a) 에서 적용된 샘플과 비교하여 당형태 보유 단백질에서 풍부하고, 단계 c) 에서 수득된 용리액은 풍부하다. 상기 기재된 바와 같이 플로우 스루 또는 결합 용리액에 분리된 당형태는 바람직하게는 상이한 정도의 글리코실화를 갖는 항체 또는 상이한 정도의 글리코실화를 갖는 바이러스 및/또는 바이러스 캡시드 보유 단백질이다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 도입되고, 당단백질을 포함하는 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 다른 유형의 당단백질을 포함하거나 당단백질을 포함하지 않는 바이러스 및/또는 바이러스 입자로부터 분리하기 위해 플로우-스루 또는 결합 용리 모드로의 당단백질 정제 공정에 사용된다. 바람직하게는, 분리는 글리칸 구조에 존재하는 글리코실화의 상이한 양에 기초하여 일어난다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, 글리칸 종을 분리하는 플로우-스루 모드에서 당단백질 정제 공정에 사용되며, 여기서 글리코실화 함유 단백질은 플로우-스루에 있고 비-글리코실화된 단백질은 분리 물질에 결합한다.
바람직한 구현예에서, 이온 교환 물질은 1 내지 200 ㎛ 범위의 다양한 입자 크기로 크기화될 수 있고, 보다 바람직한 구현예에서 평균 입자 크기는 20 내지 63 ㎛ 이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 이온 교환 물질은 4 nm 내지 1500 nm 범위의 다양한 공극 크기를 가질 수 있고, 더욱 바람직한 구현예에서 평균 공극 크기는 10 내지 120 nm 이고, 가장 바람직한 구현예에서 평균 공극 크기는 40 내지 110 nm 이다.
본 발명의 방법은 매우 융통성이 있다. 크로마토그래피 모드 (결합-용리 또는 플로우-스루) 는 적합하게 적용될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 조건은 상기 언급된 넓은 범위에서 변경될 수 있다. 또한, 표적 분자도 다양할 수 있다. 전술한 바와 같이, 임의의 경우에, 샘플은 적어도 하나의 단백질 당형태를 포함한다. 그러나, 표적 분자는 단백질 당형태, 상이한 단백질 당형태의 그룹 또는 비-글리코실화된 단백질일 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 방법에서, 적어도 하나의 단백질 당형태는 분리 물질에 결합하지만, 이러한 단백질 당형태는 반드시 표적 분자일 필요는 없다. 이는 표적 분자일 수 있지만, 표적 분자는 또한 분리 물질에 결합하거나 또는 플로우 스루에 있는 또다른 단백질 당형태 또는 비-글리코실화된 단백질일 수 있다. 본 발명의 방법이 상이한 단백질 당형태뿐만 아니라 글리코실화된 및 비-글리코실화된 단백질의 분리를 가능하게 하기 때문에, 표적 분자는 필요에 따라 정의될 수 있다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 및 하기에 인용된 모든 특허출원, 특허 및 공보 뿐 아니라, 2019 년 7 월 7 일자 출원된 대응 EP 특허 출원 19184130.3 은, 본원에 참조로서 인용된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 실제 적용을 나타낸다.
1. 분리 물질의 합성
공정으로부터의 그래프팅에 사용되는 단량체의 제조를 위해, 아미노산, 예를 들어 발린, 류신 또는 알라닌을 VE 물에 용해시키고, NaOH (32%) 를 첨가함으로써 pH 를 13 초과의 pH 로 조정하였다. 0 내지 5 ℃ 의 온도에서, 아크릴산 클로라이드 또는 아크릴산과 같은 아크릴 화합물을 첨가하고, 혼합물을 한 시간 동안 교반한다.
발린 및 류신과의 아크릴산 클로라이드에 대한 반응식은 도 2 및 도 3 에 제시된다.
이어서, 질산을 첨가하여 pH 를 약 pH 2.2 로 조정한다. 그 후, OH 함유 베이스 물질, 예를 들어 Eshmuno® 입자를 첨가한다.
중합은 세륨 (IV) 니트레이트를 첨가하여 시작한다. 반응은 30 내지 50 ℃ 에서 4 시간 동안 일어난다.
중합 반응 후, 실온 또는 승온에서 산성, 염기성 및 용매 혼합물을 사용하는 광범위한 세척에 의해 미반응 성분 및 출발물질이 제거된다.
2. 고 만노스 글리칸 형태 분리를 갖는 Rituximab®
실시예 1 에 따라 제조된 이온 교환 물질 (예를 들어, 20 내지 63 ㎛ 의 평균 입자 크기, 40 내지 110 nm 의 평균 공극 크기 및 400 내지 900 μeq/g 의 이온 밀도를 가짐) 은 상업적으로 입수가능한 약물 Rituximab® 의 고 만노스 함유 종을 분리하는 능력에 대해 평가하였다. 이온 교환 물질을 0,8-1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5 x 100 mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 이온 교환 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 4.75 및 250 mM NaCl 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 4.5 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 동일한 용액을 사용하여 Rituximab® 샘플을 4,8　mg/ml 농도까지 희석시켰다. 20 mg Rituximab® 로딩이 1　ml 수지에 도달될 때까지, 이 용액을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 20 mg/ml Rituximab® 를 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 4.75 완충액으로 세척한 후, pH 8.5 및 250 mM NaCl 을 갖는 완충제로 구배 용리를 사용하여 용리하였다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 Rituximab® 용리가 달성되었음을 보여준다. 샘플 용리를 분별하고, 얻어진 분획을 글리칸 종 확인을 위한 LC-MS 방법을 사용하여 라인으로 평가하였다 (도 4).
수집된 분획의 LC-MS 분석 방법을 이용한 분석 평가는 도 5 에 나타나 있으며, 이는 대표적인 1B9 및 1C7 분획으로 추가로 특징화된 주요 당단백질 용리 피크가 어떠한 고 만노스 글리칸 변이체도 함유하지 않았음을 보여준다. 대부분의 고 만노스 글리칸 변이체는 더 높은 pH 에서 용리되었고, 대표적인 1D10 및 1E3 분획으로 추가로 특징지어진다 (도 5).
도 4 에 도시된 바와 같이, 선형 pH 구배 용리를 사용하면서 고 만노스 함유 글리칸 종의 분리/농축이 가능하다. 주요 당단백질 함유 분획 (예를 들어, 1B9 및 1C7) 에서는 고 만노스 변이체가 검출되지 않았다. 모든 고 만노스 함유 변이체는 별도의 분획 (예를 들어, 1D10) 에서 용리되었다.
3. 200 mM 내지 600 mM 황산나트륨 내의 넓은 적용 윈도우에서 고 만노스 글리칸 형태 분리를 갖는 Erbitux®
실시예 1 에 따라 제조된 이온 교환 물질 (예를 들어, 20 내지 63 ㎛ 의 평균 입자 크기, 40 내지 110 nm 의 평균 공극 크기 및 400 내지 900 μeq/g 의 이온 밀도를 가짐) 은 상업적으로 입수가능한 약물 Erbitux® 의 고 만노스 함유 종을 분리하는 능력에 대해 평가하였다. 이온 교환 물질을 0,8-1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5 x 100 mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 이온 교환 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 4.5 및 250 mM NaCl 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 4.5 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 5 mg 미리-정제된 Erbitux® 로딩이 1 ml 수지에 도달될 때까지, 미리-정제된 Erbitux® 샘플을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 5 mg/ml 미리-정제된 Erbitux® 를 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 4.5 완충액 및 다양한 양의 Na2SO4 로 세척하였다. Na2SO4 의 양은 200 내지 600 mM 로 다양하였다. 그 후, pH 8.5 및 상응하는 Na2SO4 양을 갖는 완충액을 이용한 구배 용리를 사용하여 컬럼을 용리시켰다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 Erbitux® 용리가 달성되었음을 보여준다. 표 1 에는 상응하는 pH 에서 주요 피크 및 고 만노스 함유 피크 용리 최대값이 표시되어 있다.
Figure pct00013
표 1 은 상응하는 pH 에서 주요 피크 및 고 만노스 함유 피크 용리 최대값을 보여준다.
표 1 에 제시된 바와 같이, 선형 pH 구배 용리를 사용하면서 고 만노스 함유 글리칸 종의 분리/농축이 광범위한 전도도에서 가능하였다. 고 만노스 함유 변이체를 갖는 분획은 무-고 만노스 함유 글리칸 종과 비교하여 더 높은 pH 값에서 전체 조사된 범위에 걸쳐 용리되었다.
4. 하이브리드 글리칸 형태 분리를 갖는 Rituximab®
실시예 1 에 따라 제조된 이온 교환 물질 (예를 들어, 20 내지 63 ㎛ 의 평균 입자 크기, 40 내지 110 nm 의 평균 공극 크기 및 400 내지 900 μeq/g 의 이온 밀도를 가짐) 은 상업적으로 입수가능한 약물 Rituximab® 의 하이브리드 글리칸 종을 분리하는 능력에 대해 평가하였다. 이온 교환 물질을 0,8 - 1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5 x 100 mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 이온 교환 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 4.75 및 250 mM NaCl 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 4.5 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 동일한 용액을 사용하여 Rituximab® 샘플을 4,8　mg/ml 농도까지 희석시켰다. 20 mg Rituximab® 로딩이 1　ml 수지에 도달될 때까지, 이 용액을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 20 mg/ml Rituximab® 를 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 4.75 완충액으로 세척한 후, pH 8.5 및 250 mM NaCl 을 갖는 완충제로 구배 용리를 사용하여 용리하였다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 Rituximab® 용리가 달성되었음을 보여준다. 샘플 용리를 분별하고, 얻어진 분획을 글리칸 종 확인을 위한 LC-MS 방법을 사용하여 라인으로 평가하였다 (도 7).
수집된 분획의 LC-MS 분석 방법을 이용한 분석 평가는 도 7 에 나타나 있으며, 이는 대표적인 1B9 및 1C7 분획으로 추가로 특징화된 주요 당단백질 용리 피크가 어떠한 하이브리드 글리칸 변이체 (예를 들어, 말단 만노스 함유) 도 함유하지 않았음을 보여준다. 대부분의 하이브리드 글리칸 변이체는 더 높은 pH 에서 용리되었고, 대표적인 1D10 및 1E3 분획으로 추가로 특징지어진다 (도 7).
도 6 및 도 7 에 도시된 바와 같이, 선형 pH 구배 용리를 사용하면서 하이브리드 글리칸 종의 분리/농축이 가능하다. 주요 당단백질 함유 분획 (예를 들어, 1B9 및 1C7) 에서는 하이브리드 글리칸 변이체가 검출되지 않았다. 모든 하이브리드 글리칸 변이체는 별개의 분획 (예를 들어, 1D10 및 1E3) 으로 용리되었다.
5. 하이브리드 글리칸 형태 분리를 갖는 mAb05
실시예 1 에 따라 제조된 이온 교환 물질 (예를 들어, 20 내지 63 ㎛ 의 평균 입자 크기, 40 내지 110 nm 의 평균 공극 크기 및 400 내지 900 μeq/g 의 이온 밀도를 가짐) 은 mAb05 의 하이브리드 글리칸 종을 분리하는 능력에 대해 평가하였다. 이온 교환 물질을 0,8-1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5 x 100 mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 이온 교환 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 4.75 및 250 mM NaCl 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 4.75 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 동일한 용액을 사용하여 mAb05 샘플을 5 mg/ml 농도까지 희석시켰다. 30 mg mAb05 로딩이 1 ml 수지에 도달될 때까지, 이 용액을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 30　mg/ml mAb05 를 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 4.75 완충액으로 세척한 후, pH 8.5 및 250 mM NaCl 을 갖는 완충제로 구배 용리를 사용하여 용리하였다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 mAb05 용리가 달성되었음을 보여준다. 샘플 용리를 분별하고, 얻어진 분획을 글리칸 종 확인을 위한 LC-MS 방법을 사용하여 라인으로 평가하였다 (도 9).
수집된 분획의 LC-MS 분석 방법을 이용한 분석 평가는 도 9 에 나타나 있으며, 이는 제 1 용리 분획 1A4-2A4 이 어떠한 하이브리드 글리칸 변이체 (예를 들어, 말단 만노스 함유 G0F-N 및 G1F-N) 도 함유하지 않았음을 보여준다. 대부분의 하이브리드 글리칸 변이체는 더 높은 pH 에서 용리되었고, 대표적인 3B5 내지 4B2 분획으로 추가로 특징지어진다 (도 9). 하이브리드 형태에 더하여, 만노스 5 개 함유 글리칸 변이체를 또한 더 높은 pH 에서 용리시켰다.
도 8 에 도시된 바와 같이, 선형 pH 구배 용리를 사용하면서 하이브리드 글리칸 종의 분리/농축이 가능하다. 주요 당단백질 함유 분획 (예를 들어, 1A4 및 2A4) 에서는 하이브리드 글리칸 변이체가 검출되지 않았다. 모든 하이브리드 글리칸 변이체는 더 높은 pH 값에서 (예를 들어, 3B5 내지 4B2) 용리되었다.
또한, 얻어진 분획을 특징화하고 단편화 또는 응집의 수준을 모니터링하기 위해 분석 크기 배제 크로마토그래피를 사용하였다. 결과는 사용된 샘플 또는 수득된 분획에서 1% 미만의 응집체 존재를 나타낸다 (표 2).
Figure pct00014
표 2 는 얻어진 분획에 대해 단편화된 또는 응집된 종에 대해 면적 및 % 로 나타낸 분석 크기 배제 크로마토그래피 결과를 나타낸다. 모든 분획은 99% 이상 순수하였다.
6. 푸코실화, 비-푸코실화 형태 분리를 갖는 mAb05
실시예 1 에 따라 제조된 이온 교환 물질 (예를 들어, 20 내지 63 ㎛ 의 평균 입자 크기, 40 내지 110 nm 의 평균 공극 크기 및 400 내지 900 μeq/g 의 이온 밀도를 가짐) 은 mAb05 의 푸코실화 및 비-푸코실화 글리칸 종을 분리하는 능력에 대해 평가하였다. 이온 교환 물질을 0,8-1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5x100 mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 이온 교환 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 4.75 및 200 mM NaCl 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 4.75 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 동일한 용액을 사용하여 mAb05 샘플을 5 mg/ml 농도까지 희석시켰다. 30 mg mAb05 로딩이 1 ml 수지에 도달될 때까지, 이 용액을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 30 mg/ml mAb05 를 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 4.75 완충액으로 세척한 후, pH 8.5 및 200 mM NaCl 을 갖는 완충제로 구배 용리를 사용하여 용리하였다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 mAb05 용리가 달성되었음을 보여준다 (도 10). 샘플 용리를 분별하고, 얻어진 분획을 글리칸 종 확인을 위한 LC-MS 방법을 사용하여 라인으로 평가하였다 (표 3).
수집된 분획의 LC-MS 분석 방법을 이용한 분석 평가는 표 3 에 나타나 있으며, 이는 제 1 용리 분획 1B4-1D5 이 로딩된 당단백질보다 (G0F 및 G1F) 에 비해 덜 비-푸코실화된 형태 (G0 및 G1) 를 함유하지 않았음을 보여준다. 더 많은 양의 푸코실화 글리칸 변이체 (G0F 및 G1F) 는 더 높은 pH 에서 용리되었고, 대표적인 1E4 및 1F12 분획으로 추가로 특징지어진다 (표 3). 부가적으로, 만노스 5 개 함유 글리칸 변이체를 또한 더 높은 pH 에서 용리시켰다.
표 3 는 분석된 용리 분획 (1B4 내지 1F12) 의 정량적 면적에서 표시된 LC-MS 분석 방법을 사용하는 샘플 분획 특성화의 분석 결과를 보여준다.
Figure pct00015
도 10 및 표 3 에 도시된 바와 같이, 선형 pH 구배 용리를 사용하면서 비-푸코실화 글리칸 종의 분리/농축이 가능하다. 주요 당단백질 함유 분획 (예를 들어, 1B4 내지 1D5) 에서는 덜 푸코실화된 글리칸 변이체가 검출되었다. 좀더 푸코실화된 글리칸 변이체는 더 높은 pH 값에서 (예를 들어, 1E4 내지 1F12) 용리되었다.
7. 천연 및 탈글리코실화 Rituximab® 의 분리
실시예 1 에 따라 제조된 이온 교환 물질 (예를 들어, 20 내지 63 ㎛ 의 평균 입자 크기, 40 내지 110 nm 의 평균 공극 크기 및 400 내지 900 μeq/g 의 이온 밀도를 가짐) 은 글리코실화 및 비-글리코실화 Rituximab® 을 분리하는 능력에 대해 평가하였다. 이온 교환 물질을 0,8-1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5 x 100　mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 이온 교환 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 4.75 및 150 mM NaCl 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 4.75 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 동일한 용액을 사용하여 천연 및 탈글리코실화 Rituximab® 샘플을 4 mg/ml 농도까지 희석시켰다. 1 mg Rituximab® 로딩이 1 ml 수지에 도달될 때까지, 이 용액을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 1 mg/ml Rituximab® 를 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 4.75 완충액으로 세척한 후, pH 8.5 및 150 mM NaCl 을 갖는 완충제로 구배 용리를 사용하여 용리하였다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 Rituximab® 용리가 달성되었음을 보여준다.
샘플을 제조하기 위해, Rituximab® 는 엔도글리코시다제 소화를 사용하여 부분적으로 탈글리코실화되었다.
부분적 탈글리코실화 및 천연 Rituximab® 은, 둘 다 2 개의 상이한 적용에 로딩되고 체류 시간을 비교한다 (도 11).
선형 pH 구배에서의 천연 당단백질 (예를 들어, Rituximab®) 의 용리 프로파일은 천연 글리코실화 단백질에 대해 더 낮은 용리 pH 를 나타낸다. 당단백질의 탈글리코실화 부분은 구배의 더 높은 pH 에서 용리된다.
도 11 에 도시된 바와 같이, 선형 pH 구배 용리를 사용하면서 탈글리코실화 및 천연 당단백질의 분리/농축이 가능하다.
8. 플로우 스루 모드에서 고 만노스 글리칸 형태 분리를 갖는 mAb05
실시예 1 에 따라 제조된 이온 교환 물질 (예를 들어, 20 내지 63 ㎛ 의 평균 입자 크기, 40 내지 110 nm 의 평균 공극 크기 및 400 내지 900 μeq/g 의 이온 밀도를 가짐) 은 플로우 스루 모드에서 mAb05 의 고 만노스 글리칸 종을 분리하는 능력에 대해 평가하였다. 이온 교환 물질을 0,8-1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5 x 100 mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 이온 교환 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 4.75 및 400 mM NaCl 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 4.75 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 동일한 용액을 사용하여 mAb05 샘플을 4,8 mg/ml 농도까지 희석시켰다. 10 mg mAb05 로딩이 1 ml 수지에 도달될 때까지, 이 용액을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 10 mg/ml mAb05 를 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 4.75 완충액으로 세척한 후, pH 8.5 및 400 mM NaCl 을 갖는 완충제로 구배 용리를 사용하여 용리하였다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 고 만노스 mAb05 당변이체 용리가 달성되었음을 보여준다. 반면 만노스가 없는 당변이체는 컬럼 상에서 결합하지 않고 플로우 스루에 있다. 플로우 스루 및 샘플 용리를 분별하고, 얻어진 분획을 글리칸 종 확인을 위한 LC-MS 방법을 사용하여 평가하였다 (표 4).
Figure pct00016
표 4 는 수집된 분획의 LC-MS 분석 방법을 이용한 분석 평가를 나타낸다. 플로우 스루 분획 1F8 이 만노스 함유 당변이체를 1% 미만으로 함유하였음을 보여준다. 대부분의 만노스 함유 당변이체는 더 높은 pH 에서 용리되었고, 대표적인 분획 1H9 로 추가로 특징지어진다 (표 4).
도 12 에 도시된 바와 같이, 선형 pH 구배 용리를 사용하면서 플로우 스루에서 고 만노스 함유 글리칸 종의 분리/농축이 가능하다. 결합된 분획 (예를 들어, 1H9) 에서 고 만노스 글리칸 변이체가 검출되었다. 고 만노스 글리칸 변이체는 더 높은 pH 값에서 (예를 들어, 1H9) 용리되었다.
9. 결합-용리 모드에서 SARS-CoV-2 분리의 스파이크 S1 단백질
실시예 1 에 따라 제조된 이온 교환 물질 (예를 들어, 20 내지 63 ㎛ 의 평균 입자 크기, 40 내지 110 nm 의 평균 공극 크기 및 400 내지 900 μeq/g 의 이온 밀도를 가짐) 은 SARS-CoV-2 의 스파이크 S1 단백질에 결합하는 능력에 대해 평가하였다. 이온 교환 물질을 0,8-1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5 x 100 mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 이온 교환 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 4.75 및 250 mM NaCl 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 4.75 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 동일한 용액을 사용하여 S1 단백질 샘플을 0.6 mg/ml 농도까지 재구성하였다. 1 mg S1 단백질 로딩이 1 ml 수지에 도달될 때까지, 이 용액을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 1 mg/ml S1 단백질을 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 4.75 완충액으로 세척한 후, pH 10.5 및 250 mM NaCl 을 갖는 완충제로 구배 용리를 사용하여 용리하였다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 S1 단백질 용리가 달성되었음을 보여준다. 샘플 용리를 분별하고, 얻어진 분획을 단백질 확인을 위한 분석 HIC 방법을 사용하여 라인으로 평가하였다 (도 13).
수집된 분획의 분석 HIC 방법을 이용한 분석 평가는 도 14 에 나타나 있으며, 이는 대표적인 1C6 분획으로 추가로 특징화된 주요 용리 피크 (점선) 가 오직 S1 단백질만 (실선) 함유하였음을 보여준다. (도 14).
도 13 에 도시된 바와 같이, 선형 pH 구배 용리를 사용하면서 SARS-CoV-2 스파이크 S1 단백질의 결합/용리가 가능하다. 용리 피크는 S1 단백질만을 함유한다.
10. 플로우 스루 모드에서 고 만노스 글리칸 형태 분리를 갖는 mAb03
실시예 1 에 따라 제조된 이온 교환 물질 (예를 들어, 20 내지 63 ㎛ 의 평균 입자 크기, 40 내지 110 nm 의 평균 공극 크기 및 400 내지 900 μeq/g 의 이온 밀도를 가짐) 은 플로우 스루 모드에서 mAb03 의 고 만노스 글리칸 종을 분리하는 능력에 대해 평가하였다. 이온 교환 물질을 0,8-1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5 x 100 mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 이온 교환 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 5.12 및 250 mM NaCl 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 5.12 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 동일한 용액을 사용하여 mAb03 샘플을 5,0 mg/ml 농도까지 희석시켰다. 100 mg mAb03 로딩이 1 ml 수지에 도달될 때까지, 이 용액을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 100 mg/ml mAb03 를 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 5.12 완충액으로 세척한 후, pH 8.5 및 250 mM NaCl 을 갖는 완충제로 구배 용리를 사용하여 용리하였다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 및 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 고 만노스 mAb03 당변이체 용리가 달성되었음을 보여준다. 반면 만노스가 없는 당변이체는 컬럼 상에서 결합하지 않고 플로우 스루에 있다. 플로우 스루를 분별하고 얻어진 분획을 고 만노스 종 양에 대해 평가하였다 (표 5).
Figure pct00017
표 5 는 특정 mAb03 브레이크 스루 후 수집된 분획의 정류 고 만노스 종 양의 분석 평가를 나타낸다. 고 만노스 종의 출발 농도는 7,68% 였다. 이로써, 66,2 mg 의 플로우 스루 mAb03 샘플은 1% 미만의 고 만노스 함유 당변이체를 함유한 것으로 나타났다.
11. Gammanorm® 정적 결합 용량
그래프팅에 사용된 헥사플루오로-발린으로 제조된 물질을 이용하여 Gammanorm® 의 정적 결합 용량을 측정하였다. 헥사플루오로-발린을 VE 물에 용해시키고, NaOH (32%) 를 첨가하여 pH 를 13 초과의 pH 로 조정하였다. 0 내지 5 ℃ 의 온도에서, 아크릴산 클로라이드 또는 아크릴산과 같은 아크릴 화합물을 첨가하였고, 혼합물을 한 시간 동안 교반하였다. 이어서, 질산을 첨가하여 pH 를 약 pH 2.2 로 조정하였다. 그 후, OH 함유 베이스 물질, 예를 들어 Eshmuno® 입자를 첨가하였다.중합은 세륨 (IV) 니트레이트를 첨가하여 시작하였다. 반응은 30 내지 50 ℃ 에서 4 시간 동안 일어났다.
pH 5.0 의 5 mg/ml Gammanorm 및 다양한 양의 NaCl 을 함유하는 용액에 정확한 양의 이러한 물질을 침지하였다. 4 시간 동안 인큐베이션한 후, 물질을 제거하고, 용액 중 남아있는 Gammanorm® 양을 측정하여 결합된 Gammanorm® 의 양을 추정하였다. 측정된 정적 결합 용량은 다음과 같았다:
0 mM NaCl - 64,5 mg Gammanorm®/ml 헥사플루오로-발린 그래프트된 물질; 30 mM NaCl - 50,9 mg Gammanorm®/ml 헥사플루오로-발린 그래프트된 물질; 75 mM NaCl - 50 mg Gammanorm®/ml 헥사플루오로-발린 그래프트된 물질을 결합시켰다.

Claims (14)

  1. 단백질 당형태를 포함하는 샘플을, 표면에 중합체 사슬이 공유 결합된 베이스 매트릭스를 포함하는 분리 물질과 접촉시킴으로써, 단백질 당형태를 크로마토그래피 정제 및/또는 분리하는 방법으로서,
    중합체 사슬이 말단기 -N(Y)-R3:
    식 중,
    Y 는 서로 독립적으로 H 또는 CH3 이고,
    R3 은 -CHCOOMR4 이고,
    R4 는 C1 내지 C4 알킬 또는 C1 내지 C4 퍼플루오로알킬이고,
    M 은 H, Na, K 또는 NH4 임
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    a) 단백질 당형태를 포함하는 샘플을 상기 분리 물질과 접촉시켜, 단백질 당형태 중 하나 이상이 분리 물질에 결합되는 단계,
    b) 선택적으로 분리 물질을 세척하는 단계,
    c) 분리 물질을 용리 완충액과, 결합된 단백질 당형태가 분리 물질로부터 용리되는 조건 하에서 접촉시키는 단계
    를 포함하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 a) 에서 분리 물질을 통해 유동하는 단백질 당형태를 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액의 pH 는 단계 a) 에서 샘플을 분리 물질과 접촉시키기 위해 사용된 로딩 완충액의 pH 보다 높은 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 에서, 단계 a) 에서의 분리 물질과 접촉된 샘플의 전도도가 5 내지 60 mS/cm 인 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 하기:
    - 만노스 풍부 단백질 당형태
    - 말단 만노스 단백질 당형태
    - 푸코실화 및 비-푸코실화 단백질 당형태
    - 글리코실화 및 비-글리코실화 단백질
    중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 글리코실화 항체 및/또는 바이러스 단백질 당형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 사슬은 단량체 단위에 의해 형성되고, 중합체 사슬의 단량체 단위는 선형 방식으로 연결되어 있으며, 각 단량체 단위는 말단기 -N(Y)-R3 을 포함하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, Y 가 H 이고, R4 가 이소프로필 및/또는 이소부틸인 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 물질의 이온 밀도가 10 내지 1200 μeq/g 인 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 당형태가 2 내지 7 의 pH 에서 분리 물질에 결합되고, 선택적으로 pH 값을 9 내지 11 의 값으로 증가시킴으로써 세척 및 용리되는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 분리 물질에 10 내지 1200 μeq/g 의 이온 밀도로 적용하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 물질 ml 당 10 mg 내지 100 mg 의 단백질 당형태가 결합되는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 SARS-CoV-2 단백질 당형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
KR1020227003061A 2019-07-03 2020-07-01 당형태 정제 KR20220025873A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19184130.3 2019-07-03
EP19184130 2019-07-03
EP20172272 2020-04-30
EP20172272.5 2020-04-30
PCT/EP2020/068439 WO2021001388A1 (en) 2019-07-03 2020-07-01 Glycoform purification

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220025873A true KR20220025873A (ko) 2022-03-03

Family

ID=71138769

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227003061A KR20220025873A (ko) 2019-07-03 2020-07-01 당형태 정제

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220380406A1 (ko)
EP (1) EP3993887B1 (ko)
JP (1) JP2022539241A (ko)
KR (1) KR20220025873A (ko)
CN (1) CN114096560A (ko)
CA (1) CA3145765A1 (ko)
ES (1) ES2961186T3 (ko)
TW (1) TW202108223A (ko)
WO (1) WO2021001388A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3192925A1 (en) 2020-04-02 2021-03-11 Regeneron Pharamaceuticals, Inc. Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
CA3181026A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Samit GANGULY Methods for treating or preventing sars-cov-2 infections and covid-19 with anti-sars-cov-2 spike glycoprotein antibodies

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3811042A1 (de) 1988-03-31 1989-10-19 Merck Patent Gmbh Ionenaustauscher
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US8304250B2 (en) 2007-04-16 2012-11-06 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Multi-dimensional chromatographic methods for separating N-glycans
CA2687930C (en) * 2007-05-25 2016-05-17 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Graft copolymers for cation exchange chromatography
EP2734537B1 (en) * 2011-07-20 2022-12-21 Zepteon, Incorporated Polypeptide separation methods
MX355048B (es) * 2011-10-19 2018-04-03 Roche Glycart Ag Metodo de separacion para anticuerpos fucosilados.
WO2014100117A2 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Medimmune, Llc Methods of using ion exchange chromatograpy to control levels of high mannose glycoforms

Also Published As

Publication number Publication date
EP3993887B1 (en) 2023-07-26
EP3993887A1 (en) 2022-05-11
TW202108223A (zh) 2021-03-01
JP2022539241A (ja) 2022-09-07
WO2021001388A1 (en) 2021-01-07
CN114096560A (zh) 2022-02-25
ES2961186T3 (es) 2024-03-08
CA3145765A1 (en) 2021-01-07
US20220380406A1 (en) 2022-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6743074B2 (ja) タンパク質精製中に試料中の１または複数の不純物のレベルを低下させる方法
EP2462157B1 (en) Methods for purifying a target protein from one or more impurities in a sample
CN103842045B (zh) 色谱纯化方法和设备
CN105073769B (zh) 利用基于a蛋白的色谱增加蛋白纯度的方法
WO2016009077A1 (en) Improved method of mapping glycans of glycoproteins in serum samples
EP3993887B1 (en) Glycoform purification
KR102446468B1 (ko) 혈장으로부터의 면역글로불린의 정제
CN104710527B (zh) 一种生物制品的内毒素去除方法
CN114014906A (zh) 一种利用阳离子交换层析纯化疏水性蛋白的方法
AU2012269240A1 (en) Single unit chromatography antibody purification
KR20220028029A (ko) 항체 약물 접합체 정제

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination