KR101484709B1 - 벌사상자 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강 및 암질환 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벌사상자 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 벌사상자 추출물은 대식세포 Raw 264.7 세포내에서 면역증강인자인 NO, TNF-α의 분비능 생성 증가 효과 및 탐식능 증가효과를 나타내며, 면역세포에 매개한 CT-26세포와 같은 결장암에서 항암활성을 나타낼뿐만 아니라, 암이종 이식 동물모델실험에서 5-FU 와 같은 기존 항암제와 공동 투여시에 암조직 성장억제 및 면역 조절물질들인 TNF-a의 생성을 증가시킴을 확인하여, 우수한 면역증강 및 항암 효능을 갖는 식품, 의약품 그리고 사료의 성분으로 유용하다.

Description

벌사상자 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강 및 암질환 치료 또는 예방용 조성물 {A composition comprising the extract of Cnidium monieri (L) having potent immuo-stimulating activity and treating or preventing cancer disease}

본 발명은 벌사상자 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강 및 암질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

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면역계는 자연저항, 비특이성 면역체계 및 특이성 면역체계로 구분할 수 있다. 자연저항(1차 방어선)이란 미생물을 위시한 모든 침입자들을 그들의 종류에 관계없이 막아내는 해부생리학적 요소들을 말하며, 비특이적 면역(2차 방어선)은 자연저항을 돌파하여 체내로 들어온 침입자들을 제거하는 식세포로 구성된 방어체계를, 그리고 특이성 면역계(3차 방어선)는 림프구들로 구성된 면역체계를 말하는데, 이중 특이성 면역계는 기억능 그리고 자기와 비자기를 구분할 수 있는 능력을 지닌 고도로 발달한 면역체계이다(Kim et al., 2004; Kim et al., 2008; Leiro et al., 2007; Han et al., 2009).

백혈구는 2차 또는 3차 방어선을 구성하여 1차 방어선을 돌파하여 체내에 들어온 이물을 담당하게 되며, 세균,바이러스 감염 또는 염증 반응 시, 대식세포 및 림프구 활성의 조절은 의약품의 치료 효과의 결정에 있어서 중추적인 역할을 한다. 대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로 산화적 스트레스 상황에서 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 일산화산소(NO)를 생성하여 면역체계에서 중요한 역할을 한다. 특히 대식세포에서 리포 다당류(Lipopolysaccharide; LPS), 사이토카인, TNF-α와 같은 자극에 의해 발현되는 iNOS는 장시간 동안 다량의 NO를 생산하여, NFκB 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 활성화된 대식세포에 의한 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion, O2^-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)와 같은 활성산소종(reactive oxygenspecies; ROS) 및 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생산은 비특이적 면역에 있어서 중요한 세포독성 및 세포활성억제기작이다. 대식세포에 의한 ROS 및 NO의 생성에 어떤 천연화합물이 영향을 미치는지 많은 연구들이 수행되어 왔다. 대식세포는 항원을 제시하거나(antigen-presenting), 종양을 없애거나(tumoricidal) 미생물세포를 죽이는(microbicidal) 세포로서, 세포매개(cell-mediated) 또는 체액성 면역(humoral immunity)에 중심적인 역할을 하는 조절세포로, 활성화된 대식세포에서 생산되는 NO는 비특이적 숙주방어기작인 대식작용, 그리고 세균 및 암세포의 증식억제활성을 보인다(Dawson TM, et al., 1996).

대식세포는 많은 라이소솜을 가지고 있고 이들은 산성가수분해효소와 과산화효소를 함유하고 있다. 또한 유리면과 플라스틱 표면에 강하게 부착하는 성질이 있으며 미생물이나 종양세포 등을 활발하게 탐식한다. 상기 세포는 IFN-γ등의 사이토카인 수용체를 가지고 있다. 이들은 보체성분, 인터페론, 인터루킨-1 및 종양괴사인자 같은 사이토카인을 생산하며 T-세포로부터 생산되는 여러 가지 사이토카인에 의해 기능이 증강될 수 있다(Kim et al., 2004; Kim et al., 2008; Leiro et al., 2007; Han et al., 2009).

암은 혈액암과 고형암으로 크게 분류되며, 폐암, 위암, 유방암, 구강암, 간암, 자궁암, 식도암, 피부암 등 신체의 거의 모든 부위에서 발생한다. 악성종양을 치료하기 위해 사용하는 방법들 중 수술이나 방사선 요법을 제외한 화학요법제를 총칭하여 항암제라고 하며, 주로 핵산의 합성을 저해하여 항암활성을 나타내는 물질이 대부분이다. 지금까지 수술법, 화학요법제 및 방사선조사법 등과 같은 암치료법들이 연구되어 왔으며, 5-풀루오로우라실(fluorouracil; 5-FU)는 수용성 불소치환 피리딘 유도체(water-soluble fluorinated pyrimidine analog)으로서 항종양제로서 널리 사용되고 있는 약물이다(Kim et al., 2012). 이는 간암, 위암, 대장암, 췌장암, 유방암 등과 같은 고형암에 단독 또는 류코보린(leucovorin; LV)와의 조합으로 암치료에 사용되고 전신순환으로 혈장 반감기가 10 내지 20분인 약물로서(Kanetaka et al., 2012) . 골수 쇠약, 위장관 반응, 백혈구감소증 및 혈소판감소증 등과 같은 부작용을 유발할 수 있다(Wettergren et al., 2012).

현재 전 세계적으로 면역력 증강을 통해 건강을 증진시키고자 많은 천연물이 사용되고 있다. 미국에서 천연물들은 의약품뿐만 아니라 건강기능성 식품으로도 인정받고 있다. 아시아에서뿐만 아니라 미국인구의 3분의 1이 적어도 한 번은 대체의약의 형태로 천연물을 복용하고 있음이 알려져 있다(Eisenberg et al., 1993). 천연물 유래의 약품은 질병의 예방과 치료를 위한 활성성분의 동정에 초점이 맞추어져 왔다. 동의보감 등 과거 한의학 서적에 천연물들에 대한 효능은 언급되어 있지만, 문헌에 의한 정보가 현재의 특정 질병이나 증상과 접목돼 있는 것은 아니다. 또한 천연물의 성분 중 어느 성분이 직접적인 효과를 내는지는 밝혀지지 않았다. 동의보감이나 중의학 대사전에 수록된 천연물들 중 면역증강효과가 있는 것으로 알려져있는 천연물들은 현대의 과학적인 연구에 의하여 면역증강효능에 대한 검증이 요구된다.

벌사상자는 미나리과(Unbelliferae)에 속한 일년생 초본인 벌사상자 (Cnidium monieri (L). Cuss)의 성숙한 과실을 건조한 것이다. 벌사상자는 흰색에 가까운 색을 띠고 약재표면을 유심히 관찰하면 약재에 3개의 능선이 있어 각이 진 모양이고 과피에 털이 많이 나있다. 벌사상자의 맛은 맵고 쓰며 성질은 따뜻하고 무독하며 (한국생약학교수협의회, 본초학, 1995) 신, 폐, 비경에 작용한다, 한방에서 이 약물은 신장을 따뜻하게 하고 양기는 돋구어 남성들의 신허 음위증과 여자 불임들의 병증에 응용된다. 남자들의 발기부전증인 양위증, 한습으로 인한 대하증, 피부에 생긴 습진, 소양, 개선 등에 이용되어지고 있으며 콩팥을 덥히고 성기능을 도우며 풍을 제거하고 습한 것을 건조하게 하며 살충하는 효능이 있다. 남자 음위, 음낭 습양, 여자의 대하와 음부 소양증, 자궁 한냉으로 인한 불임증, 풍습비통, 개선습창 등의 치료에 이용되고 있다고 알려져 있다. 그러나, 상기 문헌의 어디에도 벌사상자 추출물이 면역 증강, 항균 및 항암제로서의 효능에 대한 어떠한 기술 내용도 개시 또는 교시된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 천연물 유래 추출물로부터 면역 증강 효과를 갖는 물질을 확인하던 중 본 발명의 벌사상자 추출물이 대식세포 Raw 264.7 세포내에서 면역증강인자인 NO, TNF-α의 분비능 생성 증가 효과 및 탐식능 증가효과를 나타낼 뿐만 아니라, 면역세포에 매개한 CT-26세포와 같은 결장암에서 항암활성을 나타낼뿐만 아니라, 암이종 이식 동물모델실험에서 5-FU 와 같은 기존 항암제와 공동 투여시에 암조직 성장억제 및 종양괴사인자인, TNF-α의 생성을 증가시킴을 확인하여, 우수한 면역증강 및 항암 효능을 갖는 식품, 의약품 그리고 사료의 성분으로 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벌사상자 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강 및 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 벌사상자 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강 및 암질환 치료 또는 예방용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 벌사상자 추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 또는 60~100% 에탄올에 가용한 추출물임을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 벌사상자 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강제를 제공한다.

본원에서 정의되는 ‘암질환’은 결장암, 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 백혈병, 소장암, 직장암, 항문암, 식도암, 췌장암, 위암, 신장암, 자궁암, 폐암, 임파선암, 갑상선암, 피부암, 뇌종양, 방광암, 난소암, 또는 담낭암, 바람직하게는 결장암, 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 가장 바람직하게는 결장암을 포함한다.

또한 본 발명은 벌사상자 추출물과 기존 항암 치료제와의 조합을 유효성분으로 함유하는 암질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 벌사상자 추출물과 기존 항암 치료제와의 조합을 유효성분으로 함유하는 암질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 기존 항암 치료제는 5-FU, -FU (Fluorouracil),LV(leucovorin), 아드리아마이신(adriamycin), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 암사크린(amsacrine), 도노마이신(daunomycin), 탁솔(taxol), 바람직하게는 5-FU을 포함한다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타약학적 활성 화합물, 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 기존 항암제들, 즉, 5-FU (Fluorouracil),LV(leucovorin), 아드리아마이신(adriamycin), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 암사크린(amsacrine), 도노마이신(daunomycin), 탁솔(taxol)등, 바람직하게는 5-FU (Fluorouracil) 등의 기존 항암제들과의결합뿐만 아니라 적당한 조합으로 기존 항암제에 대한 다제내성 (Multi-drugresistance; MDR)을 갖는 암세포의 성장을 억제하기 위한 항암 보조제로 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 벌사상자 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.

따라서 본 발명은 상기 추출물 및 기존 항암요법에 사용되는 타항암제, 바람직하게는 엽산유도체(methotrexate), 퓨린유도체 (6-mercaptopurine,6-thioguanine), 피리미딘유도체(5-fluorouracil, Cytarabine) 등의 대사길항제 (antimetabolites); 니트로겐 머스타드계 화합물(chlorambucil,cyclophosphamide), 에틸렌이민계 화합물(thiotepa), 알킬설포네이트계 화합물(busulfan), 니트로소우레아계 화합물(carmustine), 트리아젠계 화합물(dacarbazine) 등의 알킬화제(alkylating agents); 악티노마이신 D(actinomycinD), 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신과 같은 항암성항암제, 빈크리스틴, 빈블라스틴과 같은 식물알칼로이드, 탁산환을 포함하는 유사분열 저해제인 탁소이드 등의 유사분열억제제(antimitotic drugs); 부신피질호르몬이나 프로게스테론과 같은 호르몬제; 시스플라틴 같은 백금 함유 항암제; 보다 바람직하게는 아드리아마이신(adriamycin), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 5-FU, 암사크린 (amsacrine), 탁솔(taxol)로부터 선택된 적어도 1 종 이상의 항암제, 바람직하게는 엽산유도체(methotrexate), 퓨린유도체 (6-mercaptopurine, 6-thioguanine), 피리미딘유도체(5-fluorouracil, Cytarabine) 등의 대사길항제 (antimetabolites); 보다 바람직하게는 피리미딘유도체(5-fluorouracil, Cytarabine)와 항암활성을 극대화 할 수 있는 조합비, 예를 들어, 바람직하게는 기존 항암제 및 벌사상자 추출물의 중량배합비가 1:0.1 내지 10(w/w)의 조합비로 조합된 약학 조성물을 제공한다.

따라서 본 발명은 상기 벌사상자 추출물 및 엽산유도체(methotrexate), 퓨린유도체 (6-mercaptopurine, 6-thioguanine), 피리미딘유도체(5-fluorouracil, Cytarabine) 등의 대사길항제 (antimetabolites); 니트로겐 머스타드계 화합물(chlorambucil, cyclophosphamide), 에틸렌이민계 화합물(thiotepa), 알킬설포네이트계 화합물 (busulfan), 니트로소우레아계 화합물(carmustine), 트리아젠계 화합물(dacarbazine) 등의 알킬화제(alkylating agents); 악티노마이신 D(actinomycinD), 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신과 같은 항암성 항암제, 빈크리스틴, 빈블라스틴과 같은 식물알칼로이드, 탁산환을 포함하는 유사분열 저해제인 탁소이드등의 유사분열억제제(antimitotic drugs); 부신피질호르몬이나 프로게스테론과 같은 호르몬제; 시스플라틴 같은 백금 함유 항암제;, 보다 바람직하게는 아드리아마이신(adriamycin), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 5-FU, 암사크린(amsacrine), 탁솔(taxol)로부터 선택된 적어도 1 종 이상의 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 면역활성에 의해 매개된 항암제를 제공한다.

본 발명의 벌사상자 추출물은 하기와 같은 제조공정으로 제조될 수 있다.

건조시킨 벌사상자을 통상적인 추출방법에 따라 제조할 수 있으며, 건조된 벌사상자 건조 중량의 1 내지 20배, 바람직하게는 5 내지 15배 부피의 물, 메탄올 등과 같은 C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물을 가하여 0.5 내지 10시간, 바람직하게는 2 내지 5시간씩, 70℃ 내지 100℃로, 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 5회 반복하여 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출 및 환류냉각 추출 등 의 추출방법으로, 바람직하게는 열수 추출한 후, 추출액을 여지로 감압 여과한 다음, 여과액을 농축하여 동결건조한 후 본 발명의 벌사상자 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 벌사상자 추출물은 대식세포 Raw 264.7 세포내에서 면역증강인자인 NO, TNF-α의 분비능 생성 증가 효과 및 탐식능 증가효과를 나타내며, 면역세포에 대개한 CT-26세포와 같은 결장암에서 항암활성을 나타낼뿐만 아니라, 암이종 이식 동물모델실험에서 5-FU 와 같은 기존 항암제와 공동 투여시에 암조직 성장억제 및 면역 조절물질들인 TNF-a의 생성을 증가시킴을 확인하여, 우수한 면역증강 및 항암 효능을 갖는 식품, 의약품 그리고 사료의 성분으로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 벌사상자 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강 및 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.

또한, 벌사상자는 오랫동안 식용되거나 생약으로 사용되어 오던 약재로서 본 발명의 벌사상자 추출물은 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

본 발명의 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.

또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 및 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지 및 글리 세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 0.0001 ~ 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 50 중량%의 함량으로 배합될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 및 뇌혈관내 (intracere broventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 벌사상자 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강 및 암질환 치료 또는 예방용 건강기능 식품을 제공한다.

본 발명의 추출물은 목적 질환의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 및 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제 및 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은 목적 질환의 예방 및 치료를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 30 g, 바람직하게는 0.3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리 사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량 부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 상기 벌사상자 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 및 항암 효능을 갖는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.

상기의 동물사료 첨가제용 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립형태일 수 있다.

본 발명의 동물사료 첨가제용 조성물은 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 조성물은 동물에게 단독으로, 또는 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.

또한, 상기 동물사료 첨가제용 조성물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다.

통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 조성물은 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 조성물의 투여 형태는 이들의 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 추출물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 동물사료 첨가제를 포함하는 사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

상기의 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물(예, 랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스 쥐), 모피 소유 동물(예, 밍크 및 여우), 및 동물원 동물(예, 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이), 뿐만 아니라 가축 (예, 고양이 및 개)에 사용할 수 있다. 통상적으로 상업상 중요한 가금에는 닭, 터키, 오리, 거위, 꿩 및 메추라기가 포함된다. 송어와 같은 상업적으로 사육되는 어류도 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 동물사료 첨가제를 포함한 동물사료 배합 방법은, 상기 동물사료 첨가제를 동물사료에 건조 중량 기준으로 사료 1kg당 약 1g 내지 100g의 양으로 혼입한다.

또한, 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 매시로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성한다. 이 때, 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해, 동물사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 벌사상자 추출물은 대식세포 Raw 264.7 세포내에서 면역증강인자인 NO, TNF-α의 분비능 생성 증가 효과 및 탐식능 증가효과를 나타내며, 면역세포에 대개한 CT-26세포와 같은 결장암에서 항암활성을 나타낼뿐만 아니라, 암이종 이식 동물모델실험에서 5-FU 와 같은 기존 항암제와 공동 투여시에 암조직 성장억제 및 종양괴사인자, TNF-a의 생성을 증가시킴을 확인하여, 우수한 면역증강 및 항암 효능을 갖는 식품, 의약품 그리고 사료의 성분으로 유용하다.

도 1는 RAW 264.7 세포에서 추출용매에 따른 벌사상자 추출물의 종양괴사인자, TNF-α (Tumor necrosis Factor)를 나타낸 도이며;
도 2는 RAW 264.7 세포에서의 시료의 면역증강활성을 나타낸 도이며{ (A) 세포 생존능 실험 결과; (B) NO 생성, (C) TNF-α, (D) 대식세포에서의 식균 활성을 나타냄 };
도 3는 RAW 264.7 세포에서의 시료의 면역 활성을 통해 CT-26세포의 생존능 실험결과임
도 4는 5-FU 및 벌사상자 추출물의의 혼합투여군은 가장 감소된 암 크기를 나타내며;
도 5는 5-FU 및 벌사상자 추출물의의 혼합 투여군에서 종양 컨트롤 및 5FU 처치군의 혈액내 TNF-α (Tumor necrosis Factor) 수준 변화를 나타낸다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 벌사상자 추출물의 제조

1-1. 벌사상자 물 추출물의 제조

전북 익산시 대학한약국에서 구입한 벌사상자(Cnidium monieri (L). Cuss)를 자연 건조시킨 후 잘게 세절하여, 건조된 사상자 1kg에 증류수 10ℓ를 가하여 100℃에서 3시간 동안 가열하는 것을 3회 반복한 후, 진공 여과하여 여액을 얻고, 여과액을 감압농축(EYELA사, N-1000, 일본)하여, 벌사상자추출물 126g(이하, CMW라고 함)을 수득하여 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

1-2. 70% 및 100% 에탄올 추출물의 제조

상기 1-1의 방법과 동일하게, 건조된 사상자 50g에 70% 에탄올 및 100% 에탄올을 500㎖씩 각각 가하여 100℃에서 2시간 동안 가열하는 것을 3회 반복한 후, 진공 여과하여 여액을 얻고, 여과액을 감압농축(EYELA사, N-1000, 일본)하여 벌사상자 70% 에탄올 추출물 및 벌사상자 100% 에탄올 추출물을 각각 6.34g (이하, CM70E라고 함) 및 7.23g (이하, CM100E라고 함)을 각각 수득하였다.

참조예 1. 세포배양, 시약 및 시약

본 실험에 사용된 시료 마우스 대식세포주 및 대장암세포주 (Mouse macrophage cell line, 세포: ATCC The Global Bioresource Center, USA)를 구입하여 10% FBS 및 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM에서 5% CO₂, 37˚C 조건하에서 배양하였다. 세포배양 배지 및 시약은 회사(Thermo Scientific Hyclone, Waltham, MA, USA)에서 구입하고, DMEM 및 FBS는 회사(GibcoBRL, Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. LPS(Lipopolysaccharide), DMSO(dimethylsulfoxide) 는 회사(Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 키트(enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA) kit for NO, TNF-α, IL-12 )는 회사(R&D Systems, Minneapolis, MN, U.S.A.)에서 시약(Fluoruuracil, 5-FU)은 회사 (Ildong Pharmaceutical Co., Ltd., Seocho-Gu, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다

참조예 2. 통계처리

실험결과는 평균치(Mean ± S.D.)로 표시하고 통계적 유의성은 스튜던트 검정법(Students t-test)로 검정하여 p값이 0.05이하인 경우에 유의한 것으로 인정하였다.

실험예 1. 추출용매에 따른 종양괴사인자 활성

상기 실시예 시료의 면역증강활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Ledur et al., 1995)

RAW 264.7 세포를 96웰 마이크로플레이트에 웰 당 1×10⁵ 씩 분주하고, 10, 30 및 100 μM의 농도로 본 발명 화합물을 처리한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양한 후, 50㎕의 세포 배양 상층액을 취하여 종양괴사인자인 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 ELISA 검사를 실시하였다 (R&D Systems Quantikine Mouse TNF-α kit).그 후 인피니트 200 스펙트로포토메터 (Tecan사, Switzerland)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 리포폴리사카리드 (Lipopolysaccharide; LPS, 100 ng/ml)를 양성 대조군으로 사용하였다.

본 실험결과, 표 1 및 도 1에서 나타난 바와 같이 본 발명 화합물들은 모든 추출물 분획에서 종양괴사인자의 활성을 노말대조군 대비 유의적으로 증가시키는 것을 확인하였으며, 그중 CMW의 종양괴사인자의 활성이 가장 높은 수준임을 확인하였다.

TNF-a (ng/ml)	10 μg/ml	30 μg/ml	100 μg/ml
UN	0.03 ± 0.03
LPS	2.26 ± 0.42
CMW	0.59 ± 0.12	1.02 ± 0.46	1.62 ± 0.18
CM70E	0.29 ± 0.02	0.80 ± 0.02	0.93 ± 0.10
CM100E	0.03 ± 0.03	0.45 ± 0.07	0.98 ± 0.10

실험예 2. 세포 생존능에 대한 효과

상기 실시예 시료의 세포 생존능에 대한 효과를 확인하기 위하여 문헌에 기재된 MTT 어세이법(assay)방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Carmichael et al., 1987)

RAW 264.7 세포들을 3, 10, 30 및 100 mM 농도의 시료들로 24시간 동안 처리하고 배양하였다. 배양종료후 상층액을 버리고, MTT 어세이 시약을 200ul 첨가하고 37℃에 3시간 배양하고 dmso를 첨가하고 그 후 인피니트 200 스펙트로포토메터 (Tecan사, Switzerland)를 사용하여 590nm에서 흡광도를 측정하였다.

본 실험결과, 표 2 및 도 2A에서 나타난 바와 같이 본 발명 화합물들은 음성대조군(화합물을 처리하지 않은 군)과 비교하여 유의적인 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

Group	면역세포의 세포생존률(%)
대조군	100.2 ± 7.94
양성대조군 (LPS)	109.0 ± 6.85
벌사상자 추출물 3μg/ml	100.1 ± 6.10
벌사상자 추출물 10μg/ml	99.4 ± 5.11
벌사상자 추출물 30μg/ml	104.7 ± 2.44
벌사상자 추출물 100μg/ml	100.8 ± 5.29

실험예 3. 면역증강 활성

상기 실시예 시료의 면역증강활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Ledur et al., 1995; Azizah et al., 2004; Mills 2001)

RAW 264.7 세포 (ATCC, USA)를 96웰 마이크로플레이트에 웰 당 1×10⁵ 씩 분주하고, 10, 30 및 100 mM의 농도로 본 발명 화합물을 처리한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양한 후, 상층액을 취하여, 50㎕의 세포 배양 상층액에 동량의 그리스 시약 (Griess reagent, 0.1% (w/v)N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride + 1% (w/v) sulfanilamide in 5%(v/v)phosphoric acid)을 넣고 혼합한 다음, 상온에서 10분 두었으며, 그 후 인피니트 200 스펙트로포토메터 (Tecan사, Switzerland)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 리포폴리사카리드 (Lipopolysaccharide; LPS, 100 ng/ml)를 양성 대조군으로 사용하였다.

또한, 같은 조건에서 50㎕의 세포 배양 상층액을 취하여 종양괴사인자, TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 ELISA 검사를 실시하였다 (R&D Systems Quantikine Mouse TNF-α kit).

본 실험결과, 표 3 내지 표 4, 도 2-B에 나타난 바와 같이 RAW 264.7세포에서 벌사상자 추출물의 30, 100 mg/ml처리군에서 아질산 이온(NO2-)의 농도가 대조군 대비 2.54, 5.26배 증가하였고, 양성대조군으로 사용한 LPS 단독 처리군과 유사한 증가를 나타내어, 이를 통해 벌사상자 추출물이 NO 분비를 증가시킴을 확인할 수 있었으며, RAW 264.7세포에서 종양괴사인자인자 TNF-α가 대조군 대비 모든 처리농도에서 19.6, 34, 54배 증가, 양성대조군으로 사용한 LPS 단독 처리군과 유사한 증가효과를 나타내었고, 벌사상자 추출물이 TNF-α 와 NO 분비를 모두 증가시킴을 확인할 수 있었다(도 2C 참조).

Group	NO (μM)생성
대조군	4.50 ± 1.48
양성대조군 (LPS)	37.72 ± 1.89
벌사상자 추출물 10μg/ml	3.91 ± 1.12
벌사상자 추출물 30μg/ml	11.43 ± 2.23
벌사상자 추출물 100μg/ml	23.71 ± 2.51

Group	TNF-α(ng/ml) 분비능
대조군	0.03± 0.02
양성대조군 (LPS)	2.26 ± 0.43
벌사상자 추출물 10μg/ml	0.59 ± 0.12
벌사상자 추출물 30μg/ml	1.02 ± 0.47
벌사상자 추출물 100μg/ml	1.63 ± 0.19

실험예 4. 면역세포의 탐식능 활성

상기 실시예 시료의 RAW 264.7에서의 탐식 활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 Neutral Red Uptake법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Cheng, W.X. et al., 2008).

RAW 264.7 세포 (ATCC, USA)를 96웰 마이크로플레이트에 웰 당 1×10⁵ 씩 분주하고, 3, 10, 30 및 100 μg/ml의 농도로 본 발명 추출물을 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하고, 100㎕의 0.075% Neutral Red를 넣고 37℃ 배양기에서 1시간 배양후, 0.01% acetic acid와 100% 에탄올을 동량으로 혼합한 용액 200㎕를 실온에서 2시간 처리후, 인피니트 200 스펙트로포토메터 (Tecan사, Switzerland)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 리포폴리사카리드(Lipopolysaccharide; LPS, 100 ng/ml)를 양성 대조군으로 사용하였다

실험결과, 표 5 및 도 2D 에 나타난 바와 같이 벌사상자 추출물 처리에 따른 RAW 264.7세포의 탐식능은 대조군 대비 100μM 처리군에서 최대 1.86배 증가시켰다. 이를 통해 벌사상자 추출물은 대식세포의 탐식능을 향상시키는 것을 확인할 수 있었다(도 2D 참조).

Group	탐식능 활성 (%)
대조군	100.0 ± 35.5
양성대조군 (LPS)	136.0 ± 25.2
벌사상자 추출물 10μg/ml	114.2 ± 49.7
벌사상자 추출물 30μg/ml	148.3 ± 51.2
벌사상자 추출물 100μg/ml	186.8 ± 68.3

실험예 5. 면역활성을 통한 항암활성

상기 실시예 시료의 항암활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Jensen et al., 2008)

본 실시예에서는 벌사상자 추출물의 항암면역 활성을 조사하기 위해 마우스 대식세포인 RAW264.7cell 1×10⁵cells/ml과 결장암세포인 CT-26cell을 1x10⁴cells/ml (effector/target세포의 비율 10:1)을 함께 배양한 후에, 벌사상자 추출물을 10, 30, 100μg/ml의 농도로 24시간 처리하고 암세포에 대한 면역세포의 세포면역반응을 MTT 어세이를 통해 평가하고 항암활성을 하기 수학식 1과 같이 계산하였다.

실험결과, 하기 도 3 및 표 6에서 나타낸 바와 같이, 양성대조군인 리포폴리사카라이드(LPS)와 유사하게 대식세포를 자극하여 식작용을 증가시키는 효과가 있으며 이는, 타겟이 되는 항암세포의 성장을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.

Group	면역세포의 항암활성(%)
대조군	214.4 ± 8.07
양성대조군 (LPS)	372.4 ± 23.7
벌사상자 추출물 10μg/ml	408.6 ± 20.8
벌사상자 추출물 30μg/ml	308.8 ± 27.6
벌사상자 추출물 100μg/ml	390.0 ± 10.1

실험예 6. 암이종 이식 동물모델실험에서의 항암 실험

상기 실시예의 시료의 암이종 이식 동물모델실험에서의 항암효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험하였다(Holland EC, 2004; Lee B et al., 2012).

마우스(Female Balb/c mice, 6 주, Central Laboratory Animal Inc., Seoul, Korea)를 실험 전에 2주 이상 온도 (22 ± 1°C), 상대습도 (55 ± 1%) 및 12시간 주야 조절주기를 갖는 조건하에서 표준 사료(standard pellet)로 키우고 동물보호 규정 및 기준 (institutional, Wonkwang University Animal Care and Use Committee)에 따랐다. 이종이식 결장암 (allograft colon carcinoma) 동물모델을 확립하기 위하여 200μL PBS 중 세포(5 × 10⁵CT-26c ell)를 마우스(BALB/cmice) 우측 옆구리에 주입하였다. 종양이 보일때까지 7일간 배양하고 각 9마리의 7개 그룹으로 구분하였다.

개개 그룹은 하기와 같이 처리하였다: (a) 정상군(Normal; 비처치 및 암이 없음), (b) 대조군(control; 생리식염수 및 암 유발) (c) 5-FU 투여군(50 mg/kg), (d) 벌사상자 추출물 투여군 (100 mg/kg/dose) (e) 벌사상자 추출물 투여군 (300 mg/kg/dose) (f) 5-FU 및 벌사상자 추출물 투여군 (50 mg/kg; 5-FU, 100 mg/kg/dose;벌사상자 추출물) (g) 5-FU 및 벌사상자 추출물 투여군 (50 mg/kg; 5-FU, 300 mg/kg/dose;벌사상자 추출물) 5-FU는 종양크기 발생후 5일 동안 처치하고 벌사상자 추출물은 14일동안 매일처치하였다. 종양의 크기(tumor volume)는 캘리퍼(caliper)로 2일 간격으로 7회 측정하고 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.

여기에서 길이는 최대 종양의 직경 및 폭은 최소종양의 직경을 문헌 (Alessandria G. et al., 1987.)에 따라 계산하였다.

실험 종료시에 하룻밤 절식한 다음날에 Ether 마취후 방혈치사하고 하고, 혈액은 원심분리하여 혈액중 면역조절물질 측정하였다.

본 실험 결과 CT-26 종양-이종이식 마우스에서 종양 벌사상자 추출물의 처치는 대조군 또는 5FU 처치군에 비해 유의적으로 감소된 암의 크기를 나타냈다, 특히 5-FU 및 벌사상자 추출물의의 혼합투여군은 가장 감소된 암 크기를 나타냈으며, (도 4) 면역조절물질인 Tumor necrosis Factor (TNF-a) 역시 5-FU 및 벌사상자 추출물의의 혼합 투여군에서 종양 컨트롤 및 5FU 처치군에 비해 유의적으로 증가 되는 것을 확인할 수 있었다. (도 5)

본 발명의 추출물 또는 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

CM70E ----------------------------------------- 300 mg

유당 ------------------------------------------ 100 mg

탈크 ------------------------------------------- 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

CM100E ---------------------------------------- 300 mg

옥수수전분 ------------------------------------ 100 mg

유당 ------------------------------------------ 100 mg

스테아린산 마그네슘 ----------------------------- 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

CMW ------------------------------------------ 300 mg

결정성 셀룰로오스 ------------------------------ 3 mg

락토오스 ------------------------------------ 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 ------------------------ 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

CM70E ---------------------------------------- 300 mg

만니톨 --------------------------------------- 180 mg

주사용 멸균 증류수 -------------------------- 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O ----------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

CM100E --------------------------------------- 300 mg

이성화당 --------------------------------------- 10 g

만니톨 ------------------------------------------ 5 g

정제수 ----------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

CMW ----------------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 ---------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 --------------------------- 70 ㎍

비타민 E ------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B1 ----------------------------------- 0.13 ㎎

비타민 B2 ----------------------------------- 0.15 ㎎

비타민 B6 ------------------------------------ 0.5 ㎎

비타민 B12 ----------------------------------- 0.2 ㎍

비타민 C -------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ---------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 ------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 ------------------------------------------ 50 ㎍

판토텐산 칼슘 -------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 ---------------------------------- 적량

황산제1철 ----------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 ------------------------------------ 0.82 ㎎

탄산마그네슘 -------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 ----------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 ----------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 ------------------------------------ 90 ㎎

탄산칼슘 ------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 -------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

CM70E --------------------------------------- 300 ㎎

비타민 C -------------------------------------- 15 g

비타민 E(분말) ------------------------------- 100 g

젖산철 ------------------------------------- 19.75 g

산화아연 ------------------------------------- 3.5 g

니코틴산아미드 ------------------------------- 3.5 g

비타민 A ------------------------------------- 0.2 g

비타민 B1 ----------------------------------- 0.25 g

비타민 B2 ------------------------------------ 0.3 g

물 -------------------------------------------- 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동 안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (10)

1. 벌사상자(Cnidium monieri (L). Cuss) 열매(사상자)의 60~100% 에탄올(w/w)에 가용한 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 약학조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 벌사상자(Cnidium monieri (L). Cuss) 열매(사상자)의 60~100% 에탄올(w/w)에 가용한 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 건강기능 식품.
8. 삭제
9. 벌사상자(Cnidium monieri (L). Cuss) 열매(사상자)의 60~100% 에탄올(w/w)에 가용한 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 동물사료 첨가제.
10. 제 9항의 동물사료 첨가제를 포함하는 사료.

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