KR20140049218A - 갈근 추출물을 함유하는 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 함유하는 암질환 치료 및 예방을 위한 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명의 추출물은 CT-26 세포와 같은 결장암에서 강력한 항암활성을 나타낼뿐만 아니라, 암이종 이식 동물모델실험에서 5-FU 및 LV 등과 같은 기존 항암제와 공동 투여시에 암조직 성장억제 및 면역 조절물질들인 MHC II, CD80, CD86, IL-12, CD4 및 CD8의 생성을 증가시킴을 확인하여, 암질환의 예방, 억제 및 치료에 우수한 항암제 또는 항암보조제 효능을 갖는 의약품 및 건강기능식품으로서 유용하다.

Description

갈근 추출물을 함유하는 약학 조성물{Composition comprising the extract of Puerariae Radix for anti-cancer activity}

본 발명은 갈근 추출물을 함유하는 항암 활성을 위한 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Dawson T.M., et al., Annu . Rev . Med , 47, pp.219-227, 1996

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[문헌 3] Kim NH, Kim SN, Oh JS, Lee S, Kim YK. Anti-mitotic potential of 7-diethylamino-3(2′-benzoxazolyl)-coumarin in 5-fluorouracil-resistant human gastric cancer cell line SNU620/5-FU. Biochem Biophys Res Commun 2012; 418:616-21; PMID: 22301191; DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.01.049.

[문헌 4] Kanetaka K, Enjoji A, Furui J, Nagata Y, Fujioka H, Shiogama T, et al. Effects of Intermittent 5-Fluorouracil and Low-dose Cisplatin Therapy on Advanced and Recurrent Gastric Cancer. Anticancer Res 2012; 32:3495-9; PMID: 22843936.

[문헌 5] Wettergren Y, Carlsson G, Odin E, Gustavsson B. Pretherapeutic uracil and dihydrouracil levels of colorectal cancer patients are associated with sex and toxic side effects during adjuvant 5-fluorouracil-based chemotherapy. Cancer 2012; 118:2935-43; PMID: 22020693; DOI: 10.1002/cncr.26595.

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암은 혈액암과 고형암으로 크게 분류되며, 폐암, 위암, 유방암, 구강암, 간암, 자궁암, 식도암, 피부암 등 신체의 거의 모든 부위에서 발생한다.

백혈구는 2차 또는 3차 방어선을 구성하여 1차 방어선을 돌파하여 체내에 들어온 이물을 담당하게 되며, 세균, 바이러스 감염 또는 염증 반응 시, 대식세포 및 림프구 활성의 조절은 의약품의 치료 효과의 결정에 있어서 중추적인 역할을 한다. 대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로 산화적 스트레스 상황에서 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 일산화산소(NO)를 생성하여 면역체계에서 중요한 역할을 한다. 특히 대식세포에서 지질다당류(Lipopolysaccharide; LPS), 사이토카인, TNF-α와 같은 자극에 의해 발현되는 iNOS는 장시간 동안 다량의 NO를 생산하여, NFκB 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 활성화된 대식세포에 의한 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion, O₂-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)와 같은 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 및 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생산은 비특이적 면역에 있어서 중요한 세포독성 및 세포활성억제기작이다. 대식세포에 의한 ROS 및 NO의 생성에 어떤 천연화합물이 영향을 미치는지 많은 연구들이 수행되어 왔다. 대식세포는 항원을 제시하거나(antigen-presenting), 종양을 없애거나(tumoricidal) 미생물세포를 죽이는(microbicidal) 세포로서, 세포매개 (cell-mediated) 또는 체액성 면역(humoral immunity)에 중심적인 역할을 하는 조절세포로, 활성화된 대식세포에서 생산되는 NO는 비특이적 숙주방어기작인 대식작용, 그리고 세균 및 암세포의 증식억제활성을 보인다(Dawson T.M., et al., Annu . Rev . Med , 47, pp.219-227, 1996).

대식세포는 많은 라이소솜을 가지고 있고 이들은 산성가수분해효소와 과산화 효소를 함유하고 있다. 또한 유리면과 플라스틱 표면에 강하게 부착하는 성질이 있으며 미생물이나 종양세포 등을 활발하게 탐식한다. 상기 세포는 IFN-γ등의 사이토카인 수용체를 가지고 있다. 이들은 보체성분, 인터페론, 인터루킨-1 및 종양괴사인자 같은 사이토카인을 생산하며 T-세포로부터 생산되는 여러 가지 사이토카인에 의해 기능이 증강될 수 있다. 백혈구의 일종인 T-세포는 혈중 소림프구의 약 70%를 차지한다. T-세포는 흉선에서 분화되며 T-세포항원수용체(TCR)를 갖는다. 말초혈액 T-세포는 CD4 양성인 T_H 세포(helper T-cell)와 CD8 양성인 T_C 세포(cytotoxic T-cell)로 나뉘며, CD4+ T_H 세포는 MHC II 급(class) 분자에 결합된 항원을 인식하여 활성화되며, B세포를 도와서 항체생성을 가능하게 하거나 다른 T 세포의 기능을 돕는다. CD4+ T_H 세포는 다시 그들이 생산하는 사이토카인을 근거로 T_H1 및 T_H2로 분류할 수 있다. 실험용 생쥐(mouse)의 T_H1세포는 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-감마(IFN-γ) 등을 분비하는 반면에 T_H2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 등을 분비한다. 그러나 사람에 있어서는 IL-2, IL-6, IL-10, IL-13의 생성이 엄격히 구분되지 않는다. T_H1세포는 세포면역반응에 관여하며 세포독성 및 염증성 반응을 활성화한다. T_H2 세포에서 생성된 사이토카인은 항체형성을 촉진시키는데, 특히 IgE의 생성을 도우며 호산구의 증식과 기능을 증강시키므로 T_H2 사이토카인은 항체생성 및 알레르기 반응에서 흔히 발견된다. T_H1 과 T_H2 사이토카인은 서로간 억제기능을 가지고 있고, 동물의 감염증에서 항 IL-4 항체와 항 IFN-γ항체로 질환의 경과를 변화시킬 수 있음이 밝혀졌으며, 류마티스 관절염의 환자에 IFN-γ를 주사하여 증상의 호전이 관찰된 예도 있다 (Richard A. Goldsby, et al., KUBY Immunology. 2000).

악성종양을 치료하기 위해 사용하는 방법들 중 수술이나 방사선 요법을 제외한 화학요법제를 총칭하여 항암제라고 하며, 주로 핵산의 합성을 저해하여 항암활성을 나타내는 물질이 대부분이다.

지금까지 수술법, 화학요법제 및 방사선조사법 등과 같은 암치료법들이 연구되어 왔으며, 5-풀루오로우라실(fluorouracil; 5-FU)는 수용성 불소치환 피리딘 유도체(water-soluble fluorinated pyrimidine analog)으로서 항종양제로서 널리 사용되고 있는 약물이다((Kim NH, Kim SN, Oh JS, Lee S, Kim YK. Anti-mitotic potential of 7-diethylamino-3(2′-benzoxazolyl)-coumarin in 5-fluorouracil-resistant human gastric cancer cell line SNU620/5-FU. Biochem Biophys Res Commun 2012; 418:616-21; PMID: 22301191; DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.01.049. ). 이는 간암, 위암, 대장암, 췌장암, 유방암 등과 같은 고형암에 단독 또는 류코보린(leucovorin; LV)와의 조합으로 암치료에 사용되고 전신순환으로 혈장 반감기가 10 내지 20분인 약물로서(Kanetaka K, Enjoji A, Furui J, Nagata Y, Fujioka H, Shiogama T, et al. Effects of Intermittent 5-Fluorouracil and Low-dose Cisplatin Therapy on Advanced and Recurrent Gastric Cancer. Anticancer Res 2012; 32:3495-9; PMID: 22843936. ). 골수 쇠약, 위장관 반응, 백혈구감소증 및 혈소판감소증등과 같은 부작용을 유발할 수 있다 (Wettergren Y, Carlsson G, Odin E, Gustavsson B. Pretherapeutic uracil and dihydrouracil levels of colorectal cancer patients are associated with sex and toxic side effects during adjuvant 5-fluorouracil-based chemotherapy. Cancer 2012; 118:2935-43; PMID: 22020693; DOI: 10.1002/cncr.26595.).

동의보감 등 과거 한의학 서적에 한약재들에 대한 효능은 언급되어 있지만, 문헌에 의한 정보가 현재의 특정 질병이나 증상과 접목돼 있는 것은 아니다. 또한 한약재의 성분 중 어느 성분이 직접적인 효과를 내는지는 밝혀지지 않았다. 동의보감이나 중의학 대사전에 수록된 한약재들 중 면역증강효과가 있는 것으로 알려져 있는 한약재들은 현대의 과학적인 연구에 의하여 면역증강효능에 대한 검증이 요구된다.

갈근(葛根; Puerariae Radix)은 콩과(Leguminosae)의 덩굴나무인 칡(Pueraria lobata (Willd.) Ohwi.)의 뿌리로 우리나라 전역의 산기슭 양지에서 자라며, 일본, 중국에 분포한다(배기환, 한국의 약용식물, 교학사, p.260, 2000). 갈근의 성분은 푸에라린(puerarin), 다이드제인(daizein), 다이드진(daidzin) 등의 플라보노이드(flavonoid)계 화합물과 소야사포닌(soyasaponin) 등의 사포닌(saponin) 및 전분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다(생약학교재편찬위원회, 생약학, 동명사, p.100-102, 2006).

한방에서 이 약물의 성미는 감(甘), 신(辛), 량(凉)하고, 비(脾)와 위(胃)에 귀경하고, 해기퇴열(解肌退熱), 투발마진(透發痲疹), 생진지갈(生津止渴), 승양지사(升陽止瀉)의 효능이 있어 외감표증(外感表證), 마진불투(痲疹不透), 열병구갈(熱病口渴), 열사열리(熱瀉熱痢), 비허설사(脾虛泄瀉) 등의 치료에 이용되고 있으나(한국생약학교수협의회, 본초학, 사단법인 대한약사회, pp.107-110, 1995), 상기 문헌 어디에도 갈근추출물이 항암효과에 효과적이라는 어떠한 개시도 된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 본 발명의 본 발명의 추출물은 CT-26 세포와 같은 결장암에서 강력한 항암활성을 나타낼뿐만 아니라, 암이종 이식 동물모델실험에서 5-FU 및 LV 등과 같은 기존 항암제와 공동 투여시에 암조직 성장억제 및 면역 조절물질들인 MHC II, CD80, CD86, IL-12, CD4 및 CD8의 생성을 증가시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암질환의 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 질환 치료 및 예방을 위한 항암제 보조용 조성물을 제공한다.

본 발명은 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암질환의 개선 및 예방용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 “암질환”은 결장암, 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 백혈병, 소장암, 직장암, 항문암, 식도암, 췌장암, 위암, 신장암, 자궁암, 폐암, 임파선암, 갑상선암, 피부암, 뇌종양, 방광암, 난소암, 또는 담낭암, 바람직하게는 결장암, 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 가장 바람직하게는 결장암을 포함한다.

본원에서 정의되는 “추출물”은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 포함하는, 암질환을 예방, 치료하기 위한 약제학적 조성물과 상기 추출물을 사용하여 상기 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 갈근(Puerariae Radix) 추출물 및 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 함유하는 암질환의 치료 및 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타약학적 활성 화합물, 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 기존 항암제들, 즉, 5-FU (Fluorouracil), LV(leucovorin), 아드리아마이신(adriamycin), 사이클로포스파마이드 (cyclophosphamide), 암사크린(amsacrine), 도노마이신(daunomycin), 탁솔(taxol) 등, 바람직하게는 5-FU (Fluorouracil), LV(leucovorin) 등의 기존 항암제들과의 결합뿐만 아니라 적당한 조합으로 기존 항암제에 대한 다제내성 (Multi-drug resistance; MDR)을 갖는 암세포의 성장을 억제하기 위한 항암 보조제로 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 추출물 및 기존 항암요법에 사용되는 타항암제, 바람직하게는 엽산유도체(methotrexate), 퓨린유도체 (6-mercaptopurine, 6-thioguanine), 피리미딘유도체(5-fluorouracil, Cytarabine) 등의 대사길항제 (antimetabolites); 니트로겐 머스타드계 화합물(chlorambucil, cyclophosphamide), 에틸렌이민계 화합물(thiotepa), 알킬설포네이트계 화합물 (busulfan), 니트로소우레아계 화합물(carmustine), 트리아젠계 화합물(dacarbazine) 등의 알킬화제(alkylating agents); 악티노마이신 D(actinomycin D), 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신과 같은 항암성항암제, 빈크리스틴, 빈블라스틴과 같은 식물알칼로이드, 탁산환을 포함하는 유사분열 저해제인 탁소이드 등의 유사분열억제제(antimitotic drugs); 부신피질호르몬이나 프로게스테론과 같은 호르몬제; 시스플라틴 같은 백금 함유 항암제;, 보다 바람직하게는 아드리아마이신(adriamycin), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 5-FU, 암사크린 (amsacrine), 탁솔(taxol)로부터 선택된 적어도 1 종 이상의 항암제, 바람직하게는 엽산유도체(methotrexate), 퓨린유도체 (6-mercaptopurine, 6-thioguanine), 피리미딘유도체(5-fluorouracil, Cytarabine) 등의 대사길항제 (antimetabolites); 보다 바람직하게는 피리미딘유도체(5-fluorouracil, Cytarabine)와 항암활성을 극대화 할 수 있는 조합비, 예를 들어, 바람직하게는 기존 항암제 및 갈근 추출물의 중량배합비가 1:0.1 내지 10(w/w)의 조합비로 조합된 약학 조성물을 제공한다.

따라서 본 발명은 상기 갈근 추출물 및 엽산유도체(methotrexate), 퓨린유도체 (6-mercaptopurine, 6-thioguanine), 피리미딘유도체(5-fluorouracil, Cytarabine) 등의 대사길항제 (antimetabolites); 니트로겐 머스타드계 화합물(chlorambucil, cyclophosphamide), 에틸렌이민계 화합물(thiotepa), 알킬설포네이트계 화합물 (busulfan), 니트로소우레아계 화합물(carmustine), 트리아젠계 화합물(dacarbazine) 등의 알킬화제(alkylating agents); 악티노마이신 D(actinomycin D), 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신과 같은 항암성 항암제, 빈크리스틴, 빈블라스틴과 같은 식물알칼로이드, 탁산환을 포함하는 유사분열 저해제인 탁소이드 등의 유사분열억제제(antimitotic drugs); 부신피질호르몬이나 프로게스테론과 같은 호르몬제; 시스플라틴 같은 백금 함유 항암제;, 보다 바람직하게는 아드리아마이신(adriamycin), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 5-FU, 암사크린 (amsacrine), 탁솔(taxol)로부터 선택된 적어도 1 종 이상의 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 암세포의 성장을 억제하기 위한 항암제를 제공한다.

본 발명의 갈근 추출물은 하기와 같은 제조공정으로 제조될 수 있다.

건조시킨 갈근을 통상적인 추출방법에 따라 제조할 수 있으며, 건조된 갈근 건조 중량의 1 내지 20배, 바람직하게는 5 내지 15배 부피의 물, 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물을 가하여 0.5 내지 10시간, 바람직하게는 2 내지 5시간씩, 70℃ 내지 100℃로, 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 5회 반복하여 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출 및 환류냉각 추출 등의 추출방법으로, 바람직하게는 열수 추출한 후, 추출액을 여지로 감압 여과한 다음, 여과액을 농축하여 동결건조한 후 본 발명의 갈근 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암질환의 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 및 치료를 위한 항암제 보조용 조성물 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 약학조성물은 CT-26 세포와 같은 결장암에서 강력한 항암활성을 나타낼뿐만 아니라, 암이종 이식 동물모델실험에서 5-FU 및 LV 등과 같은 기존 항암제와 공동 투여시에 암조직 성장억제 및 면역 조절물질들인 MHC II, CD80, CD86, IL-12, CD4 및 CD8의 생성을 증가시킴을 확인함으로써 암질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 상기 갈근 추출물을 함유하는 암 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 항암 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한점이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 갈근(Puerariae Radix) 추출물은 CT-26 세포와 같은 결장암에서 강력한 항암활성을 나타낼뿐만 아니라, 암이종 이식 동물모델실험에서 5-FU 및 LV 등과 같은 기존 항암제와 공동 투여시에 암조직 성장억제 및 면역 조절물질들인 MHC II, CD80, CD86, IL-12, CD4 및 CD8의 생성을 증가시킴을 확인함으로써, 암질환의 예방, 억제 및 치료에 우수한 항암제 또는 항암보조제 및 건강기능식품으로 사용될 수 있다.

도 1은 갈근추출물의 CT-26 종양-이종이식 마우스(xenograft mice)에서의 종양 부피, 체중 및 비장 무게에 미치는 영향을 나타낸 도이며(시험 기간 중 체중 (A), 종양 부피 (B), 및 시험 종료후 비장 무게 (C)를 나타내며, Fluoruuracil, 5-FU; leucovorin, LV을 나타냄),
도 2은 갈근추출물의 면역조절물질들의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다(시험 기간 중 체중 (A), 종양 부피 (B), 및 시험 종료후 비장 무게 (C)를 나타내며, Fluoruuracil, 5-FU; leucovorin, LV을 나타냄).

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 갈근 추출물의 제조

갈근(USE TECHNO CORPORATION, Korea)을 자연 건조시킨 후, 잘게 세절하여, 건조된 갈근 1kg에 증류수 3ℓ를 가하여 100℃에서 3시간 동안 가열추출을 3회 반복한 후, 진공 여과하여 여액을 얻고, 여과액을 감압농축 (EYELA사, N-1000, 일본) 및 동결건조하여 갈근 추출물 15.8g을 수득하였다. (이하, WK6-2S이라 함).

참조예 1. 세포배양, 시약 및 시약

본 실험에 사용된 사용된시료 마우스 암세포주(Mouse colon carcinoma cell line, CT-26 cells)는 회사(Korean Cell Line Bank, KCLB; Seoul, Korea)에서 구입하여 10% FBS 및 1% penicillin/streptomycin을 참가한 DMEM에서 5% CO_{2 ,} 37˚C 조건하에서 배양하였다. 세포배양 배지 및 시약은 회사(Thermo Scientific Hyclone, Waltham, MA, USA)에서 구입하고, DMEM 및 FBS는 회사(GibcoBRL, Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. LPS(Lipopolysaccharide), DMSO(dimethylsulfoxide) 및 PMB (polymyxin B sulfate)는 회사(Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 키트(enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA) kit for TNF-α )는 회사(R&D Systems, Minneapolis, MN, U.S.A.)에서 추출키트( Easy BlueTotal RNA Extraction kit)는 회사(iNtRON Biotechnology, Inc, Seoul, Korea)에서 구입하였으며, PD98059, SB202190, SP600125 및 PDTC (Pyrrolidine dithiocarbamate) 은 회사(Calbiochem, La Jolla, CA, USA)에서 구입하였다. 효소 (Polyclonal antibodies against phospho-JNK MAP kinase, JNK MAP kinase, phospho-ERK MAP kinase 및 ERK MAP kinase)는 회사(Cell Signaling, Beverly, MA, USA)에서 구입하고, 항체(Polyclonal antibodies against phospho-p38 MAP kinase, p-38 MAP kinase, NF-κB, IκBα 및 HRP-conjugated anti-rabbit 및 anti-mouse IgGs)은 회사(Santa Cruz Biotechnology Inc, California, USA)에서 구입하였다. 유세포 분석을 위한 항체(Antibodies, APC Rat anti mouse CD86, PE Hamster Anti-mouse CD80, PE Rat Anti-mouse IL-12(p40/p70), PE Rat Anti mouse IFN-γ, APC Rat Anti-mouse CD4 및 PE-CyTm7 Rat Anti - mouse CD8a)는 회사(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에서 항체(Anti-mouse F4/80 PECy7 및 Fitc-Conjugated, Anti mouse MHC Class II)는 회사(eBioscience, San Diego, CA,USA)에서, 시약(Fluoruuracil, 5-FU)은 회사(Ildong Pharmaceutical Co., Ltd., Seocho-Gu, Seoul, Korea) 및 시약(leucovorin, LV)은 회사(Samhinpharm Co.Ltd., Mapo-Gu, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다.

참고예 2. 통계처리

실험결과는 3개의 개별적 실험의 3개의 결과 평균치(mean ± S.D.)로 표시하고 통계적 유의성은 일원변량분석 (one way analysis of variance, ANOVA) 및 스튜던트 검정법(Student’s t test)로 검정하여 p값이 0.05이하인 경우에 유의한 것으로 인정하였다.

실험예 1. 암이종 이식 동물모델실험에서의 항암 실험

상기 실시예의 시료의 암이종 이식 동물모델실험에서의 항암효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험하였다(Holland EC (2004) Mouse models of human cancer. Wiley-Liss, New York; Loganayaki N, Manian S. Antitumor activity of the methanolic extract of Ammannia baccifera L. against Dalton’s ascites lymphoma induced ascitic and solid tumors in mice. J Ethnopharmacol. 2012 Jun 26;142(1):305-9; Lee B, Lee DY, Yoo KH, Baek NI, Park JH, Chung IS. Calenduloside E 6'-methyl ester induces apoptosis in CT-26 mouse colon carcinoma cells and inhibits tumor growth in a CT-26 xenograft animal model. Oncol Lett. 2012 Jul;4(1):22-28)

CT-26 암이종 이식 마우스에서의 동양성장, 체중 및 임파구 수에 대한 효과를 하기와 같이 실험하였다.

마우스(Female Balb/c mice, 6 주, Central Laboratory Animal Inc., Seoul, Korea)를 실험 전에 2주 이상 온도 (22 ± 1°C), 상대습도 (55 ± 1%) 및 12시간 주-야 조절주기를 갖는 조건하에서 표준 사료(standard pellet)로 키우고 동물보호 규정 및 기준(institutional, (Wonkwang University) Animal Care and Use Committee)에 따랐다.

이종이식 결장암(allograft colon carcinoma) 동물모델을 확립하기 위하여 200μL PBS 중 세포(5 × 10⁵CT-26cell)를 마우스(BALB/cmice) 우측 엽구리에 주입하였다. 종양이 보일때까지 7일간 배양하고 각 10마리의 5개 그룹으로 구분하였다. 개개 그룹은 하기와 같이 처리하였다: (a) 정상군(Normal; 비처치 및 암이 없음), (b) WK6-2S 단독투여군 (50 mg/kg/dose), (c) 5-FU 및 LV 혼합투여군(36 mg/kg/dose; 18 mg/kg/dose 5-FU 및 18 mg/kg/dose LV), (d) 5-FU 및 WK6-2S 혼합투여군 (68 mg/kg/dose; 18 mg/kg/dose 5-FU 및 50 mg/kg/dose WK6-2S) 및 (e) 5-FU, LV 및 WK6-2S 혼합투여군 (86 mg/kg/dose; 18 mg/kg/dose 5-FU, 18 mg/kg/dose 5-FU 및 50 mg/kg/dose for WK6-2S) 들을 증류에서 녹여 3시간 전에 가비지(gavage)를 이용하여 경구투여하였다. 5-FU 및 LV 또는 5-FU 는 3주 동안 주당 1회 처치하고 WK6-2S는 3주간 주당 3회 처치하였다. 종양크기(tumor volume)는 캘리퍼(caliper)로 주당 1회 측정하고 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

여기에서 길이는 최대 종양의 직경 및 폭은 최소종양의 직경을 문헌(Alessandria G, Filippeschi S, Sinibaldi P, Mornet F, Passera P, Spreafico F, Cappa PM and Gullino PM: Influence of gangliosides on primary and metastatic neoplastic growth in human and murine cells. Cancer Res 47: 4243-4247, 1987.)에 따라 계산하였다. 체중은 주당 2회 측정하였다.

실험 종료시에 하룻밤 절식한 다음날에 혈액을 채취(배부위 정맥)하여 임파구 측정에 사용하였고 혈액은 판독기(Fully Automated Blood Cell Counter LC-660 (HORIBA, Ltd.; Minami-ku, Kyoto, Japan)로 분석하였다.

본 실험 결과, 모든 그룹에서 유의적인 체중변화는 나타내지 않았으며 (도 1A), 혈액 분석상, 대조군의 임파구 수는 정상군보다 감소되었으며(도 1B), CT-26 종양-이종이식 마우스에서 5-FU 및 LV 혼합물 투여군은 임파구의 급격한 감소를 나타냈다(도 1B). 5-FU 또는 5-FU 및 LV 혼합물중 WK6-2S과의 혼합투여군은 5-FU 단독 투여군 또는 5-FU 및 LV 혼합물 투여군보다 높은 임파수 수를 나타냈다 (도 1B). CT-26 종양-이종이식 마우스는 시험기간중 증가된 종양크기를 나타냈고(도 1C) 5-FU 및 LV 처치군은 비처치 CT-26 종양-이종이식 마우스보다 작은 종양 크기를 나타냈다 (도 1C). 또한 WK6-2S이 처치는 종양 대조군(tumor control group) 또는 5-FU 및 LV 투여과 비교시에 유의적으로 감소된 종양 크기를 나타냈다 (도 1C). 특히, 5-FU 및 WK6-2S의 혼합투여군은 가장 감소된 암 크기를 나타냈다 (도 1C).

실험예 2. 면역조절물질들의 유세포분석 실험

상기 실시예의 시료의 면역조절물질들에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 유세포 분석 방법을 응용하여 실험하였다 (Chirasani SR, Leukel P, Gottfried E, Hochrein J, Stadler K, Neumann B, Oefner PJ, Gronwald W, Bogdahn U, Hau P, Kreutz M, Grauer OM. Diclofenac inhibits lactate formation and efficiently counteracts local immune suppression in a murine glioma model. Int J Cancer. 2012. doi: 10.1002/ijc.27712)

비장을 마쇄하고 여과한 후에 세포들을 분석기(FACS Calibur, BD Biosciences; San Jose, CA, USA) 상에서 측정시에 95% 순수 세포 군(pure the cell population)에 도달하도록 키트 (cell isolation kit, MACS, Miltenyi Biotec, Germany)를 이용하여 정제하였다. 정제된 세포들을 (2 × 10⁵) 2시간 동안 37°C에서 PMA (20ng/mL), ionomycin(500ng/mL) 및 brefeldin (1mg/mL)와 같이 배양하였다. 아이스(ice) 상에서 세포들을 회수한 후에, 세포를 5분간 1,200 rpm 속도로 원심분리하고 빙-냉 PBS을 가하고 다시 5분간 1200 rpm으로 원심분리하였다. 0.1 mL PBS로 현탁한 후에, 세포를 4 °C에서 20분간 0.25 μL 개개 시토크롬 (cytocromes), 30 μL FACS 와충액 및 0.5 μL 개개 항체들 (MHC II, CD80, CD86, IL - 12, F4/80, IFN-γ, CD4 및 CD8)로 염색하였다. PBS로 세척한 후에, 세포를 1 mL PBS로 현탁하고 2 × 10⁶ 세포로 빙냉하에 제조하였다. 세포에 동일한 부피의 1% 포름알데히드(formaldehyde in PBS)를 첨가하고 20분간 4°C에서 방치하였다. 세포를 유세포분석법으로 분석하였다. 3주 후에, 비장세포를 종양-유발 마우스로부터 제조하고 정제된 세포들을 유세포 분석법으로 분석하였다.

생체내 시험법으로(in vivo) 면역조절물질(MHC II, CD80, CD86, IL-12, CD4 and CD8) 생성능에 대한 WK6-2S의 역할을 확인하기 위하여, CT-26 종양-이종이식 마우스 비장으로부터 얻은 세포를 유세포 분석법으로 분석하였다. 비장세포를 WK6-2S 처치 및 비처치 마우스로부터 제조하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 정상군(normal group)의 MHCII 빈도(frequency)는 비처치된(untreated) CT-26 종양-이종이식 마우스와 비교시에 감소하였다. 5-FU 및 LV 처치군에서의 MHCII 빈도는 암발생군(cancer groups)과 유사하였다. 5-FU 단독 또는 5-FU 및 LV 혼합투여군으로의 WK6-2S 첨가는 비처치된(untreated) CT-26 종양-이종이식 마우스와 비교시에 증가된 MHCII 빈도를 나타냈다.

CD80 빈도 면에서 암발생군(cancer groups) 보다 5-FU 및 LV 처치군이 보다 낮은 감소정도를 나타냈고 5-FU중 WK6-2S 처치군은 암발생군(cancer groups) 보다 매우 높은 빈도를 나타냈다.

CD86 빈도면에서 암발생군(cancer groups) 보다 5-FU 및 LV 처치군이 보다 낮은 감소정도를 나타냈고 5-FU중 WK6-2S 처치군은 암발생군(cancer groups) 보다 매우 높은 빈도를 나타냈다.

IL-12 빈도면에서 5-FU중 WK6-2S 처치군은 보다 매우 높은 빈도를 나타냈다.

CD4 빈도면에서 암발생군(cancer groups)에서 약간 감소하였으나 5-FU중 WK6-2S 처치군은 보다 매우 높은 빈도를 나타냈다.

실험예 3. 경구투여 독성실험

본 실험에서는 7주령의 ICR 마우스 (오리엔트바이오, Japan)를 사용하여 갈근 추출물 투여 전 4시간 동안 마우스를 절식하고, 체중을 측정하한 후, 식품의약품안전청의 독성시험기준(식품의약품안전청, 의약품등의 독성시험기준, 식품의약품안전청고시 2005-60호, 2005)에 따라 2,000 mg/kg을 최고 용량으로 정하고, 정제 증류수로 희석하여 5 mg/kg, 50 mg/kg 및 500 mg/kg의 시험물질을 제조하였다. 투여는 임상에서의 주요 적용경로인 경구투여로 하였으며, 투여방법은 동물을 경배부 피부 고정법으로 고정한 후 금속제 경구투여용 존대를 이용하여 위내에 직접주입 하였다. 1일 1회 당일 체중을 기준으로 체중 kg당 10 ml을 투여액량으로 하여 투여하였고, 시험동물에 시험물질투여 후 2시간동안은 사료를 제한하였으며, 이후 시험기간 동안 사료와 물은 계속 공급하였다.

식품의약품안전청의 독성시험기준 및 국제경제협력기구의 급성독성시험 가이드라인 (OECD Guideline for the Testing Chemicals revised draft guideline 420, Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), 2001)에 독성시험기준에 따라 투여 후 처음 6시간 동안을 특별한 주의를 가지고 시험동물의 피부, 털, 눈, 점막, 호흡기, 순환기, 자율신경계, 중추신경계, 신체 운동 활동성, 행동형태 및 시험동물의 진전(tremors), 경련(convulsions), 유연(salivation), 설사(diarrhoea), 기면(lethargy), 수면(sleep), 혼수(coma) 등의 유무를 관찰하였다. 투여 후 14 일 동안 1일 1회씩 일반 임상증상을 관찰하고 시험동물의 개별 체중은 시험물질을 투여하기 전과 후, 시험기간 동안 1일 1회씩 측정하였다.

투여 후 14일째에 ICR 마우스를 에틸 에테르(ethyl ether)로 마취하고, 방혈 치사시킨 후 모든 장기를 적출하여, 개체 시험동물의 육안적 병변 관찰하고 장기의 무게를 측정하였다.

항암 효과를 나타내는 갈근 추출물의 단회 경구투여에 의한 급성독성시험결과, 본 연구에 사용된 시험동물 및 조건에서 투여된 최고 용량인 2,000 mg/kg에서 사망하는 개체가 관찰되지 않았으며, 사용한 어떠한 용량에서도 식품의약품안전청의 독성시험기준에 따라 관찰된 모든 지표에서 갈근 추출물의 투여에 의한 독성은 유발되지 않았다. 결론적으로 갈근 추출물은 급성독성시험 권고 최대용량인 2,000 mg/kg에서도 독성이 없이 안전함을 확인하였다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

갈근 추출물 --------------------------- 20 ㎎

유당 --------------------------------- 100 ㎎

탈크 ---------------------------------- 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

갈근 추출물 --------------------------- 10 ㎎

옥수수전분 --------------------------- 100 ㎎

유당 --------------------------------- 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 -------------------- 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

갈근 추출물 --------------------------- 10 ㎎

결정성 셀룰로오스 ---------------------- 3 ㎎

락토오스 ---------------------------- 14.8 ㎎

마그네슘 스테아레이트 ---------------- 0.2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

갈근 추출물 --------------------------- 10 ㎎

만니톨 ------------------------------- 180 ㎎

주사용 멸균 증류수 ------------------ 2974 ㎎

Na₂HPO₄·12H₂O ------------------------- 26 ㎎

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

갈근 추출물 --------------------------- 20 ㎎

이성화당 ------------------------------- 10 g

만니톨 ---------------------------------- 5 g

정제수 --------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

갈근 추출물 --------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 ---------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 --------------------- 70 ㎍

비타민 E ------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B₁ ------------------------------ 0.13 ㎎

비타민 B₂ ------------------------------ 0.15 ㎎

비타민 B₆ ------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B₁₂ ------------------------------ 0.2 ㎍

비타민 C -------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ---------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 ------------------------- 1.7 ㎎

엽산 ------------------------------------ 50 ㎍

판토텐산 칼슘 -------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 ---------------------------- 적량

황산제1철 ----------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 ------------------------------ 0.82 ㎎

탄산마그네슘 -------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 ----------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 ----------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 ------------------------------ 90 ㎎

탄산칼슘 ------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 -------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

갈근 추출물 --------------------------- 100 ㎎

비타민 C -------------------------------- 15 g

비타민 E(분말) ------------------------- 100 g

젖산철 ------------------------------- 19.75 g

산화아연 ------------------------------- 3.5 g

니코틴산아미드 ------------------------- 3.5 g

비타민 A ------------------------------- 0.2 g

비타민 B₁ ------------------------------ 0.25 g

비타민 B₂ ------------------------------- 0.3 g

물 -------------------------------------- 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (8)

1. 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암질환의 치료 및 예방용 약학조성물.
2. 갈근(Puerariae Radix) 추출물 및 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 함유하는 암질환의 치료 및 예방용 약학 조성물.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 기존 항암제는 아드리아마이신(adriamycin), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 5-FU, 암사크린 (amsacrine), 또는 탁솔(taxol)로부터 선택된 적어도 1 종 이상의 항암제인 약학조성물.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출물인 약학조성물.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 암질환은 결장암, 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 백혈병, 소장암, 직장암, 항문암, 식도암, 췌장암, 위암, 신장암, 자궁암, 폐암, 임파선암, 갑상선암, 피부암, 뇌종양, 방광암, 난소암, 또는 담낭암인 약학조성물.
6. 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 및 치료를 위한 항암제 보조용 조성물.
7. 갈근(Puerariae Radix) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
8. 제 7항에 있어서, 상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태인 건강기능식품.

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