KR101476399B1 - A composition containing Arazyme for the prevention and treatment of Atopic Dermatitis - Google Patents

Abstract

본 발명은 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)가 생산하는 아라자임이 아토피 피부염에 관여하는 다양한 세포주에서 염증성 사이토카인 및 케모카인 분비, 세포고사, ROS 생성 및 부착분자 생성에 대해 억제 효과가 있어 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 화장품으로서 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of atopic dermatitis comprising arazyme as an active ingredient. More specifically, the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing and treating atopic dermatitis, which comprises arazic acid , which is produced by Aranicola proteolyticus , It has an inhibitory effect on inflammatory cytokine and chemokine secretion, cell apoptosis, ROS generation and adhesion molecule production in cell lines and can be usefully used as a pharmaceutical composition or cosmetic for the prevention and treatment of atopic dermatitis.

Description

아라자임을 유효성분으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물 {A composition containing Arazyme for the prevention and treatment of Atopic Dermatitis} TECHNICAL FIELD The present invention relates to a composition for preventing and treating atopic dermatitis comprising arazyme as an active ingredient,

본 발명은 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)로부터 유래된 아라자임을 함유하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for preventing and treating atopic dermatitis comprising arazyme as an active ingredient, and more particularly to a composition for preventing and treating atopic dermatitis containing arazyme from Aranicola proteolyticus , ≪ / RTI >

아토피(atopy)는 '괴상한'의 의미의 라틴어 아토피아(atopia)에서 유래된 말로 1925년 코카(Coca)가 선천적으로 음식물과 흡입성 물질에 대한 알레르기 반응의 결과로 피부염이나 천식, 고초열이 나타나는 경향을 아토피라고 기술한 이후부터 쓰이게 된 피부질환으로서 아토피성 질환에는 아토피 피부염 이외에 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염 등이 있다. 아토피 피부염(Atopic dermatitis)은 전세계적으로 퍼져있는 일반적이고, 건조증, 강화 및 가려움증을 수반하는 만성적인 염증성의 피부 질환이다.
Atopy is a term derived from the Latin atopia of the meaning of 'eccentric'. It is a tendency that in 1925 Coca was innately born with dermatitis, asthma and fever as a result of allergic reactions to food and inhalants Atopic dermatitis, atopic dermatitis, asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis and the like. Atopic dermatitis is a chronic, inflammatory skin disease that is common worldwide and involves dryness, strengthening, and itching.

아토피 피부염의 정확한 병태생리는 아직까지 완전히 이해되고 있지 않으나 유전적 소인과 함께 면역학적, 환경학적 요인이 관여하리라고 생각되고 있으며, 특히 면역학적 관점에서 많은 연구가 진행되고 있다. 아토피 피부염을 앓고 있는 사람이 집 먼지, 진드기, 동물의 털, 음식물, 꽃가루 또는 곰팡이 등과 같이 외부환경의 이물질에 대해 알러지 반응을 나타내는 점과 또한 알러지성 비염, 천식 및 결막염 등을 동반한다는 점에서 면역 체계의 교란에 의해 발생하는 것으로 추정하고 있다.
Although the exact pathophysiology of atopic dermatitis has not yet been fully understood, immunological and environmental factors are thought to be involved with genetic predisposition. A person suffering from atopic dermatitis is immunized in that it exhibits an allergic reaction to foreign substances such as house dust, ticks, animal hair, food, pollen or mold and also accompanies allergic rhinitis, asthma and conjunctivitis. It is presumed that this is caused by disturbance of the system.

아토피피부염은 특이적 알러지원(allergen)에 노출되는 경우 즉각 과민반응을 일으키는 IgE 항체를 형성할 수 있는 특징을 가지고 있다. 이러한 표현형의 발현은 복수 개의 유전적 인자가 관여하는 것으로 알려져 있다. 아토피 민감성 유전자에는 여러 HLA 클라스 II 분자들, IL-4 수용체 단백질 및 IgG 고친화성 수용체 단백질이 포함된다.
Atopic dermatitis is characterized by the formation of IgE antibodies that cause immediate hypersensitivity when exposed to specific allergens. Expression of these phenotypes is known to involve multiple genetic factors. Atopy sensitive genes include several HLA class II molecules, IL-4 receptor proteins and IgG highly reactive receptor proteins.

면역반응성 관점으로 각종 면역세포와 사이토카인이 관여한다. 아토피 피부염 환부에 침투한 알러지 유발물질을 섭취한 수지상 세포가 CD4+T 세포를 Th1 세포 또는 Th2 세포로 분화시킨다. 일반적으로 Th1 세포는 INF-γ를 분비하여 지연성 면역반응을 일으키며, Th2 세포는 IL-4를 분비하여 급성 면역반응을 일으킨다. Th2 세포에서 분비된 IL-4는 B 세포에 작용해 Ig 동종전환을 유도하여 IgE 생산을 촉진하여 IgE 세포는 비만세포를 자극하여 히스타민 분비를 증가시킨다. 아토피 피부염이 발생한 환부에는 대식세포, 비만세포 및 Th 림프구 등 면역관련 세포의 침윤이 크게 증가한다. 아토피 피부염 환자 중에서는 혈중 IgE 농도가 크게 상승하는데 그 이유는 Th2 세포의 수가 증가하며 이 세포가 분비한 IL-4가 B 림프구를 자극해 IgE 분비를 촉진하기 때문이다.
From the viewpoint of immunoreactivity, various immune cells and cytokines are involved. Dendritic cells that ingest an allergen that infiltrates the lesion of atopic dermatitis differentiate CD4 + T cells into Th1 cells or Th2 cells. Generally, Th1 cells secrete INF-γ to induce a delayed immune response, and Th2 cells secrete IL-4 to produce an acute immune response. IL-4 secreted from Th2 cells acts on B cells to induce Ig allograft, thereby promoting IgE production, and IgE cells stimulate mast cells to increase histamine release. Inflammatory cell infiltration such as macrophages, mast cells, and Th lymphocytes is greatly increased in the lesion where atopic dermatitis occurs. In patients with atopic dermatitis, the serum IgE level increases significantly because the number of Th2 cells increases and IL-4 secreted by these cells stimulates B-lymphocytes to promote IgE secretion.

유전적인 소인은 약 70%의 아토피 피부염 환자는 아토피의 가족이 병력을 가지고 있다. 아기의 부모 중 한 사람이 알레르기를 앓으면 아기의 50%는 알레르기를 앓고 만일 부모 두 사람 모두 알레르기를 앓으면 아기는 75%로 증가한다.
Genetic predisposition is about 70% of atopic dermatitis patients have a history of atopy family. If one of the parents of the baby suffers allergies, 50% of the babies will suffer allergies. If both parents are allergic, the baby will increase to 75%.

아토피 피부염과 관련 증상으로는 얼굴이 창백해지는 것(facial pallor), 백색피부묘기증(white dermatographism), 각화증(keratosis), hyperlinear palm, 비늘버즘(ichthyosis) 및 눈과 눈 주위의 변화(ocular/periobital change) 등이 나타나며 그 외에도 입과 귀주위에 병변(perioral, periauricular lesion), 모낭주위가 두드러짐(perifollicular accentuation), 태선화(lichenification) 및 양진 병변(prurigo lesion)을 들 수 있다.
The symptoms associated with atopic dermatitis include facial pallor, white dermatographism, keratosis, hyperlinear palm, ichthyosis and changes around the eyes (ocular / periobital In addition, there are lesions (perioral, periauricular lesion), perifollicular accentuation, lichenification, and prurigo lesion on the mouth and nail.

1995년 대한 소아과 알레르기 및 호흡기학회에서 시행한 전국적 역학 조사에 의하면 초등학생의 경우 12 ~ 24%, 중학생의 경우 6 ~ 8%에서 아토피 피부염으로 진단받은 적이 있으며, 2000년도에는 초등생의 24.9%, 중학생의 경우 6 ~ 8%에서 아토피 피부염을 진단받은 것을 비롯하여 성인 아토피 피부염도 국내에서 그 빈도가 점증하고 있다.
According to the National Epidemiologic Survey conducted by the Korean Pediatric Allergy and Respiratory Society in 1995, 12 ~ 24% of elementary school children and 6 ~ 8% of middle school students were diagnosed with atopic dermatitis. In 2000, 24.9% of elementary school students, The incidence of atopic dermatitis is increasing in Korea as well as the diagnosis of atopic dermatitis in 6 ~ 8%.

국내의 경우 아토피 피부염은 전체 인구의 0.5 ~ 1% 수준이며 특히 어린이의 경우 5 ~ 10%에게 고통을 주며 요즘은 아토피 피부염 관련 환자의 수는 더욱 증가하는 추세이다. 증상은 대체로 생후 2 ~ 6개월이며, 1세 미만에서 많이 나타나고 다섯 살 안에 85%가 나타난다. 보통 어릴 때 잠시 앓는 병이라고 알려져 있으며 50%는 두돌 이내에 없어지나 25%는 청소년까지 가며 나머지 25%는 성인이 되어도 나타난다. 최근 어린이는 물론 성인 아토피 피부염의 증가도 심각해지고 있으며, 심한 경우에는 취업 및 결혼 등 사회생활에 지장을 초래하기까지 하여 심각한 사회문제가 되고 있다. 이러한 경우 심하면 심각한 정신적 스트레스로 대인기피 및 우울증을 유발하기도 한다.
In Korea, atopic dermatitis accounts for 0.5 ~ 1% of the total population, and especially for children, it affects 5 ~ 10%. Nowadays, the number of patients with atopic dermatitis is increasing. Symptoms are generally 2 to 6 months of age, occurring more often in children under 1 year of age and 85% in 5 years of age. It is usually known as a sickness in a childhood, and 50% disappear within the stomach, 25% go to adolescents, and 25% become adults. In recent years, the increase of adult atopic dermatitis as well as children has become serious. In severe cases, it has become a serious social problem even if it causes disruption to social life such as employment and marriage. In these cases, serious mental stress can lead to avoidance of coping and depression.

상기 아토피 피부염은 환자에게 육체적 및 정신적 고통과 함께 많은 경제적 피해를 끼치지만 아직까지 상기 질환을 치료하기 위한 특효약이 발견되어 있지 않으며 현재는 아토피 피부염 치료제로서는 스테로이드제 및 항히스타민제 등이 사용되나 이러한 약물을 장기간 사용하는 경우 심각한 부작용이 유발되므로 이들에 대체할 만한 천연물이 필요한 실정이다.
Although atopic dermatitis causes physical and psychological damage to the patient and causes economic damage, no specific drug for treating the disease has been found yet. Currently, steroids and antihistamines are used for treating atopic dermatitis. However, When used for a long period of time, serious side effects are caused, and natural materials that can replace them are needed.

국내에서 알러지 질환 치료를 위해 소요된 비용이 2001년 1억 1천 6백만 달러이고, 상기에서 의료 보험으로 지급된 금액은 7천 3백만 달러에 달한다. 결과적으로 향후 아토피 피부염과 관련된 산업은 지속적으로 성장할 수 있다고 볼 수 있다.
The cost of treatment for allergic diseases in Korea was $ 1016 million in 2001, and the amount paid by medical insurance was $ 73 million. As a result, the industry associated with atopic dermatitis can continue to grow.

아토피 때문에 생기는 다른 영향을 생각해서 여러 가지 새로운 치료방법이 연구되고 있는데, 국부적인 면역조절제로 타크리로무스(tacrolimus, Protopic) 또는 피메크로리무스(pimecrolimus, Elidel) 같은 것이 적용되고 있다. 그리고 카시뉴린 저해제(calcineurin inhibitors, TCIs)는 스테로이드보다 면역 억제 효과가 더 있어 보인다. 그리고 타크리로무스 또는 피메크로리무스도 2세 이상의 아기들에게 적용하여 효과가 있는 것으로 나타나고 있다.
A number of new therapies have been explored in response to other effects caused by atopy, such as tacrolimus (Protopic) or pimecrolimus (Elidel) as local immunomodulators. And calcineurin inhibitors (TCIs) seem to have more immunosuppressive effects than steroids. Tacrimomus or Pimecrolimus has also been shown to be effective for babies over 2 years of age.

기존의 아토피 피부염 치료제는 카시뉴린을 억제하여, 사이토카인(cytokine) 발현을 줄이는 시클로스포린(cyclosporin) 및 FK506 등이 개발되어 사용되고 있으나, 이들은 장기 사용 시 면역체계를 약화시켜 이차 감염증의 저항력이 떨어지고, 피부 가려움 및 소양증을 완화시키는 스체로이드(steroid) 계열의 외용 치료제들도 소아가 장기간 사용할 경우 면역력이 감소되어 성장이 저해되는 문제점이 있다. 현재 일부 학교 및 기업에서 아토피 피무염 치료제의 개발되고 있지만 병리학적 기전에 대응되는 물질 및 제품 개발보다는 막연히 피부의 보습효과를 강화하거나 피부에 저자극성 화장품 관련 아토피 개선 제품으로 개발되고 있는 실정이다.
Cyclosporin and FK506, which inhibit casinilin and reduce cytokine expression, have been developed and used in existing atopic dermatitis treatments. However, they have weakened immune system when used for a long time, Steroid-based external remedies for relieving skin itchiness and pruritus also have a problem in that the immunity is reduced and the growth is inhibited when the child is used for a long period of time. Currently, some schools and corporations are developing atopic dermatitis treatment drugs, but they are being developed to enhance the moisturizing effect of the skin vaguely, rather than developing the substances and products corresponding to the pathological mechanism, or to improve atopic dermatitis related to hypoallergenic skin.

한편, 본 발명자들은 새로운 단백질 분해효소를 개발하고자 노력한 결과, 한국산 무당거미(Nephila clavata)로부터 신규 미생물인 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3 균주(수탁번호: KCTC 0268BP; WO 01/57222호)를 분리하였으며, 본 균주로부터 신규한 단백질 분해효소인 아라자임을 분리하였다.　 아라자임은 저온과 높은 염 농도에서 안정된 단백질 분해 활성을 나타낼 뿐만 아니라 사람의 체온인 37 ℃에서 가장 높은 활성을 보였으며 넓은 pH 범위에서도 안정된 활성을 나타내는 것을 발견하고 본 단백질 분해효소의 유전자를 확인하였다(WO 01/57222호).
On the other hand, as a result of efforts to develop a new protease, the present inventors have found that a Korean spider ( Nephila clavata ) from a new microorganism, Aranicola proteolyticus proteolyticus HY-3 (Accession No .: KCTC 0268BP; WO 01/57222) was isolated, and a novel protease, arazyme, was isolated from this strain. Arazyme exhibited stable proteolytic activity at low temperature and high salt concentration as well as the highest activity at 37 ° C, which is the human body temperature. (WO 01/57222).

이에, 본 발명자들은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 균주에서 유래한 아라자임의 효과를 조사한 결과, 아라자임이 아토피 피부염에 관여하는 다양한 세포주에서 염증성 사이토카인 및 케모카인 분비, 세포고사, ROS 생성 및 부착분자 생성에 대해 억제 효과가 있음을 확인하여, 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 화장품으로서 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로서 본 발명을 완성하였다.
Thus, the present inventors have investigated the effect of arazyme from Aranicola proteolyticus strain. As a result, it has been found that arazyme inhibits inflammatory cytokine and chemokine secretion, apoptosis, ROS production in various cell lines involved in atopic dermatitis And adhesion molecule production, and thus it can be effectively used as a pharmaceutical composition or cosmetic for the prevention and treatment of atopic dermatitis. Thus, the present invention has been completed.

본 발명의 목적은 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물, 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물 또는 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of atopic dermatitis comprising Arazyme as an active ingredient, a cosmetic composition for preventing or improving atopy or a health food composition.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating atopic dermatitis containing arazyme as an active ingredient.

또한, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.Further, the present invention provides a cosmetic composition for prevention and improvement of atopy comprising arazyme as an active ingredient.

아울러, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
In addition, the present invention provides a health food for preventing and improving atopy containing arazyme as an active ingredient.

본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 (Aranicola proteolyticus)가 생산하는 아라자임(Arazyme)은 THP-1, EoL-1 및 HaCaT 세포의 사이토카인 분비에 대한 탁월한 억제 효과와 HUVEC 세포에 대한 염증반응을 억제하므로 아토피 피부염의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
The inventive Aranicola proteolyticus Arazyme produced by proteolyticus suppresses the inflammatory response to HUVEC cells and the excellent inhibitory effect on cytokine secretion of THP-1, EoL-1 and HaCaT cells, and thus is useful as a composition for prevention and treatment of atopic dermatitis Lt; / RTI >

도 1은 사람의 단핵구(monocyte)인 THP-1(human acute monocytic leukemia cell)에서 아라자임(Arazyme)에 대한 세포독성을 측정한 결과 아라자임을 처리하였을 때 80% 이상의 생존율을 보임을 확인한 그림이다.
도 2는 THP-1 세포에 아라자임을 처리하여 MCP-1을 확인한 결과 농도의존적으로 MCP-1의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 3은 THP-1 세포에 아라자임을 처리하여 IL-8을 확인한 결과 농도의존적으로 IL-8의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 4는 사람의 호산구(eosinophil)인 EoL-1(human eosinophilic leukemia cell)에서 아라자임에 대한 세포독성을 측정한 결과 아라자임을 처리하였을 때 80% 이상의 생존율을 보임을 확인한 그림이다.
도 5는 EoL-1 세포에 아라자임을 처리하여 MCP-1을 확인한 결과 농도의존적으로 MCP-1의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 6은 EoL-1 세포에 아라자임을 처리하여 IL-8을 확인한 결과 농도의존적으로 IL-8의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 7은 사람의 각질형성세포인 HaCaT 세포에서 아라자임에 대한 세포독성을 측정한 결과 아라자임을 처리하였을 때 80% 이상의 생존율을 보임을 확인한 그림이다.
도 8은 HaCaT 세포에 아라자임을 처리하여 TARC을 확인한 결과 농도의존적으로 TARC의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 9는 HaCaT 세포에 아라자임을 처리하여 MCP-1을 확인한 결과 농도의존적으로 MCP-1의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 10은 HaCaT 세포에 아라자임을 처리하여 IL-8을 확인한 결과 농도의존적으로 IL-8의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 11은 HaCaT 세포에 아라자임을 처리하여 IL-6을 확인한 결과 농도의존적으로 IL-6의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 12는 사람의 제대정맥내피세포인 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)에서 아라자임에 대한 세포독성을 측정한 결과 아라자임을 처리하였을 때 세포독성효과가 나타나지 않았음을 확인한 그림이다.
도 13은 HUVEC 세포에 아라자임을 처리하여 ROS를 확인한 결과 농도의존적으로 ROS의 생산이 억제됨을 확인한 그림이다.
도 14는 HUVEC 세포에 아라자임을 처리하여 세포고사를 확인한 결과 농도의존적으로 세포고사가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 15는 HUVEC 세포에 아라자임을 처리하여 부착분자를 측정한 결과 아라자임에 의하여 VCAM01(A) 및 ICAM-1(B)의 발현이 억제됨을 확인한 그림이다.
도 16은 HUVEC 세포에 아라자임을 처리하여 NF-κB를 측정한 결과 아라자임에 의하여 활성화된 NF-κB가 VCAM01(A) 및 ICAM-1(B)에 의해 발현이 억제됨을 확인한 그림이다.
도 17은 HUVEC 세포에 아라자임을 처리하여 사이토카이닌 분비를 측정한 결과 아라자임에 의하여 VCAM01(A) 및 ICAM-1(B)의 분비량이 감소함을 확인한 그림이다.FIG. 1 is a graph showing cytotoxicity against arazyme in human monocytic leukemia cell (THP-1), a human monocyte, showing a survival rate of 80% or more when treated with arazyme .
FIG. 2 shows that MCP-1 was inhibited by concentration-dependent inhibition of MCP-1 by treatment with THP-1 cells.
FIG. 3 is a graph showing that IL-8 secretion is inhibited by THP-1 cells in a concentration-dependent manner by treating arazyme with IL-8.
FIG. 4 is a graph showing cytotoxicity against arazyme in human eosinophilic leukemia cell (EoL-1), which is a human eosinophil, showing a survival rate of 80% or more when treated with arazyme.
FIG. 5 shows that MCP-1 was inhibited by concentration-dependent inhibition of MCP-1 by treating arazyme with EoL-1 cells.
FIG. 6 is a graph showing that IL-8 secretion is inhibited by EoL-1 cells in a concentration-dependent manner by treating arazyme with IL-8.
FIG. 7 is a graph showing cytotoxicity against arazyme in HaCaT cells, which is a keratinocyte of a human, showing survival rate of 80% or more when treated with arazyme.
FIG. 8 is a graph showing that TARC was inhibited by concentration-dependent inhibition of arachidonic acid treatment of HaCaT cells.
FIG. 9 is a graph showing that MCP-1 secretion is inhibited in a concentration-dependent manner by treating Arazyme with HaCaT cells and confirming MCP-1.
FIG. 10 is a graph showing that IL-8 secretion is inhibited in a concentration-dependent manner by treating arazyme with HaCaT cells and confirming IL-8.
FIG. 11 is a graph showing that IL-6 secretion is inhibited in a concentration-dependent manner by treating arazyme with HaCaT cells and confirming IL-6.
FIG. 12 is a graph showing cytotoxicity against arazyme in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC), which is a human umbilical vein endothelial cell, showing no cytotoxic effect when treated with arazyme.
FIG. 13 is a graph showing that ROS production was inhibited in a concentration-dependent manner when HUVEC cells were treated with arazyme to confirm ROS.
FIG. 14 shows that HUVEC cells were treated with arazyme and their apoptosis was examined, and the cell apoptosis was inhibited in a concentration-dependent manner.
FIG. 15 is a graph showing that the expression of VCAM01 (A) and ICAM-1 (B) is inhibited by arazyme upon measurement of adherence molecules by treating arabinoma with HUVEC cells.
FIG. 16 is a graph showing that NF-κB activated by arazyme is inhibited by VCAM01 (A) and ICAM-1 (B) when Arazyme is treated with HLAM and HUVEC cells.
FIG. 17 is a graph showing that secretion of VCAM01 (A) and ICAM-1 (B) decreases by arazyme upon measurement of cytokinin secretion by treatment with arazyme to HUVEC cells.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating atopic dermatitis containing arazyme as an active ingredient.

본 발명의 아라자임은 The arazyme of the present invention

(a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; (a) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;

(b) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질; (b) a protein encoded by DNA comprising the coding region of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;

(c) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질; 및 (c) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and which is functionally identical to a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And

(d) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코딩되는 단백질이며, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 어느하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.(d) a protein encoded by DNA hybridized under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and which is selected from the group consisting of a protein functionally equivalent to a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 But it is not limited thereto.

상기 혼성화를 엄격한 조건하에서 실시하면 상동성이 높은 염기 서열을 가진 DNA가 선별되어 결과적으로 분리되는 단백질에는 아라자임과 기능적으로 동일한 단백질이 포함될 가능성이 높아진다. 상동성이 높은 염기 서열이란 예를 들면, 서열번호 2에 기재된 염기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가진 서열을 의미한다. 또한 아미노산 서열은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 높은 상동성의 서열이라면 가능하다. 상기의 상동성 비율은 당업계의 당업자에 의해 선택된 보통의 알고리즘으로 결정될 수 있다. 상기 혼성화는 당해업계에 잘 알려진 엄격한 조건(Hames and Higgins, Eds . Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, U.K. , 1985)의 DNA-DNA 혼성화로 제공되며, 혼성화에서 엄격한 조건은 상기에서 언급하였듯이 혼성화 후 세정 시에 결정되나 이에 한정되지 않는다.When the hybridization is carried out under stringent conditions, DNA having a base sequence having high homology is selected, and as a result, a protein to be separated is likely to include a functionally identical protein to arazyme. The nucleotide sequence having a high homology means, for example, a sequence having 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: do. Also, the amino acid sequence may be a homologous sequence having a homology of at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The above homology ratios can be determined by conventional algorithms selected by those skilled in the art. The hybridization may be carried out under stringent conditions well known in the art (Hames and Higgins, Eds . Nucleic Acid Hybridisation , IRL Press, UK, 1985), and the stringent conditions in hybridization are determined at the time of cleaning after hybridization, but not limited thereto.

또한, 상기 아라자임은 다음과 같은 제조방법으로 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The above-mentioned arazyme is preferably produced by the following production method, but is not limited thereto.

1) 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 균주를 배양하여 배양액을 얻는 단계; 1) Aranicola proteolyticus ( Aranicola proteolyticus ) to obtain a culture;

2) 상기 배양액을 여과하여 상등액을 얻는 단계; 및 2) filtering the culture solution to obtain a supernatant; And

3) 상등액 내에 포함된 상기 아라자임을 수지를 이용하여 정제하는 단계,3) purifying the arazyme contained in the supernatant using a resin,

상기 제조방법에 있어서, 아라자임을 생산하는 미생물로서 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주를 이용하는 것이 바람직하며, 한국생명공학연구원 유전자은행에 1996년 7월 29일자로 기탁된 수탁번호 KCTC 0268BP호의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3를 이용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주는 거미 장내에서 분리한 호기성의 그람 음성 세균으로서, 0.5 ~ 0.8 ㎜ 크기의 구형이고 운동성을 가지고 있으며 카탈라아제(catalase)에는 양성 반응을, 옥시다아제(oxidase)에는 음성반응을 나타낸다(WO 01/57222호). In the above production method, Aranicola proteolyticus strain is preferably used as a microorganism producing arazyme, and Aranicola proteus KCTC 0268BP deposited on Jul. 29, 1996, KCTC 0268BP, It is more preferable to use the theoriticus HY-3, but it is not limited thereto. Arachnicola proteolyticus HY-3 is an aerobic gram-negative bacterium isolated from the spider intestine. It has a spherical shape and mobility of 0.5 ~ 0.8 ㎜, positive for catalase, negative for oxydase (WO 01/57222).

본 발명에서는 상기와 같은 방법으로 수득된 아라자임을 이용하는 것이 바람직하며, 하기와 같은 방법으로 생산된 아라자임을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주의 배양을 위해서 사용하는 원료는 순수 정제시 보다 편하고 고순도의 결과물이 나올 수 있는 의약품 수준의 것이 바람직하며, 배양 후, 암모늄설페이트 침전(또는 아세톤 침전)을 수행한다. 이러한 암모늄설페이트 또는 아세톤 침전 후, 원심분리 및 여과를 통하여 아라자임만을 회수한다. 이는 미생물에서 생산이 되는 다른 대부분의 단백질은 아라자임과 침전 농도가 다른 것을 이용한 것이다. 아라자임을 회수한 후, 막여과를 이용한 1차 불순물의 정제 및 한외 여과기를 이용하여 마지막으로 순수 분리 정제하고 이렇게하여 수득된 용액 상태의 고농도 아라자임을 동결 건조기를 통해 파우더 타입으로 제조한 것을 이용한다. In the present invention, it is preferable to use arazyme obtained by the above-mentioned method. It is more preferable to use arazyme produced by the following method, but it is not limited thereto. The raw material used for culture of Aranicola proteolyticus strain is preferably a drug level that is more comfortable than purified pure water and can produce high purity products, and after the culture, ammonium sulfate precipitation (or acetone precipitation) is performed. After such ammonium sulfate or acetone precipitation, only arazyme is recovered by centrifugation and filtration. Most of the other proteins that are produced in microorganisms use different concentrations of arazyme and sediment. The arazyme is recovered, purified by primary filtration using membrane filtration, purified and purified by ultrafiltration using an ultrafilter, and the solution-obtained high-concentration arazyme prepared in powder form through a freeze dryer is used .

또한, 본 발명은 하기와 같은 방법으로 제조된 아라자임을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. Also, the present invention is not limited to the use of arazyme prepared by the following method.

1) 아라자임의 코딩 영역을 포함하는 염기 서열의 DNA를 발현 벡터에 클로닝하는 단계; 1) cloning the DNA of the base sequence comprising the coding region of arazyme into an expression vector;

2) 상기 단계 1)에서 클로닝된 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 2) introducing the cloned expression vector into the host cell in step 1);

3) 상기 단계 2)에서 형질전환된 숙주 세포를 선별하는 단계; 및 3) selecting the transformed host cells in step 2); And

4) 상기 단계 3)에서 선별된 숙주 세포에서 발현된 아라자임을 수득하는 단계,4) obtaining arazyme, expressed in the host cell selected in step 3) above,

상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 아라자임의 코딩 영역을 포함하는 염기 서열은 서열번호 2에 기재된 것, 서열 번호 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA라면 바람직하다. 엄격한 조건은 혼성화 후 세정 시에 결정된다. 엄격한 조건 중의 하나는 상온에서 6 × SSC, 0.5% SDS로 15분 세정한 뒤 45℃에서 2 × SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정하고, 50 ℃에서 0.2 × SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정을 두 번 반복한다. 더 바람직한 엄격한 조건은 더 높은 온도를 이용하는 것이다. 상기 엄격한 조건의 다른 부분은 동일하게 수행하되 마지막의 두 번의 30분은 60℃에서 0.2 × SSC, 0.5% SDS로 세정한다. 또 다른 엄격한 조건은 상기 엄격한 조건에서 마지막 두 번을 65 ℃에서 0.1 × SSC, 0.1% SDS로 세정하는 것이다. 당업자라면 필요한 엄격한 조건을 얻기 위하여 이러한 조건을 명백히 설정할 수 있다. 또한, 발현 벡터로는 당업계에 널리 알려진 그람 음성세균 또는 그람 양성세균 등, 상업적으로 이용가능한 벡터를 이용할 수 있으며 스크리닝을 위한 약제 내성 유전자가 도입되면 바람직하다. 아라자임 유전자에 어떤 영향을 주지 않는다면, 어떠한 벡터라도 무방하다.In the above production method, the base sequence comprising the coding region of arazyme of step 1) is preferably DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. Strict conditions are determined at the time of cleaning after hybridization. One of the stringent conditions was washing at 6 × SSC and 0.5% SDS at room temperature for 15 minutes, followed by washing with 2 × SSC and 0.5% SDS at 45 ° C. for 30 minutes and then washing with 0.2 × SSC and 0.5% SDS at 50 ° C. for 30 minutes Repeat the cleaning twice. A more desirable stringent condition is to use a higher temperature. The other portions of the above stringent conditions are performed in the same manner, but the last two 30 minutes are rinsed with 0.2 x SSC, 0.5% SDS at 60 ° C. Another stringent condition is to rinse the last two times with 0.1 x SSC, 0.1% SDS at 65 [deg.] C under the above stringent conditions. Those skilled in the art will be able to explicitly set these conditions to obtain the necessary stringent conditions. In addition, commercially available vectors, such as Gram-negative bacteria or Gram-positive bacteria, which are well-known in the art, can be used as expression vectors, and drug-resistant genes for screening are preferably introduced. Any vector can be used as long as it does not affect the arazyme gene.

상기 제조방법에 있어서, 단계 2)의 숙주 세포로는 세균인 E. coli 및 Bacillus subtilis 등이 있으며, 효모인 Saccharomyces cerevisiae , Candia 및 Phicia로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. In the above production method, the host cell of step 2) was E. coli And Bacillus subtilis , and yeast Saccharomyces cerevisiae , Candia And Phicia , but are not limited thereto.

상기 제조방법에 있어서, 단계 3)의 형질전환된 숙주 세포의 선별은 벡터로 도입한 약제 내성 유전자를 이용한 스크리닝과 서던 블랏팅(Southern blotting) 또는 PCR을 이용한 스크리닝을 병용하여 선별하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the above method, the selection of the transformed host cell in step 3) is preferably performed by screening using the drug resistance gene introduced into the vector and screening using Southern blotting or PCR. However, It is not limited.

상기 제조방법에 있어서, 단계 4)에서 수득된 아라자임은 단백질의 어떠한 정제 방법에 따라서 정제된 것이더라도 실질적으로 정제된 단백질이라면 모두 포함될 수 있다. 상기 정제된 단백질은 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴 아마이드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석 또는 재결정 등을 적절히 선택 또는 조합하여 실질적으로 정제된 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 DNA로부터 코딩되는 아라자임은 당업자에게 널리 알려진 단백질 발현계를 이용하여 얻을 수 있다. 또한, 아라자임을 발현하는 세포의 배양물로부터 회수·정제될 수 있다.
In the above production method, the arazyme obtained in step 4) may be purified in accordance with any purification method of the protein, and may be any substantially purified protein. The purified protein is suitably selected or combined by a chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric point electrophoresis, dialysis or recrystallization But it is not limited thereto. Arazyme encoded from the DNA can be obtained using a protein expression system well known to those skilled in the art. It can also be recovered and purified from a culture of cells expressing arazyme.

본 발명자들은 아라자임이 세포독성이 있는지 알아보기 위하여 아토피 피부염에 관여하는 세포주인 THP-1, EoL-1, HeCaT 및 HUVEC에 아라자임을 처리하여 THP-1, EoL-1, HeCaT 및 HUVEC에 처리하여 배지에 배양한 후 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 80% 이상의 세포생존율을 나타냄으로써 세포독성이 거의 없는 안전한 물질임을 확인하였다(도 1, 도 4, 도 7 및 도 12 참조).To investigate the cytotoxicity of arazyme, the present inventors treated THP-1, EoL-1, HeCaT and HUVEC, which are cell lines involved in atopic dermatitis, with arazyme to treat THP-1, EoL-1, HeCaT and HUVEC And the cell viability was measured. As a result, it was confirmed that it is a safe substance having almost no cytotoxicity by showing cell viability of 80% or more of the present invention (see FIGS. 1, 4, 7 and 12).

또한, 본 발명자들은 아토피 피부염에 관여하는 세포주인 THP-1, EoL-1 및 HeCaT에 아라자임을 처리하여 염증성 사이토카인 및 케모카인 분비를 확인하였다. 그 결과, 농도 의존적으로 MCP-1 및 IL-8의 분비가 억제되어 염증성 사이토카인 및 케모카인의 억제 효과를 확인하였다(도 2, 도 3, 도 5, 도 6, 도 9 및 도 10 참조). 추가적으로 HeCaT에서 농도 의존적으로 TARC 및 IL-6의 분비가 억제되어 염증성 사이토카인 및 케모카인의 억제 효과도 확인하였다(도 8 및 도 11 참조).In addition, the present inventors confirmed the secretion of inflammatory cytokines and chemokines by treating arazyme with THP-1, EoL-1 and HeCaT, which are involved in atopic dermatitis. As a result, the secretion of MCP-1 and IL-8 was inhibited in a concentration-dependent manner, confirming the inhibitory effect of inflammatory cytokines and chemokines (see FIGS. 2, 3, 5, 6, 9 and 10). In addition, inhibition of the secretion of TARC and IL-6 by concentration-dependent inhibition of inflammatory cytokines and chemokines was also observed in HeCaT (see FIGS. 8 and 11).

또한, 본 발명자들은 아토피 피부염에 관여하는 세포주인 HUVEC에 아라자임을 처리하여 효과 분석하기 위하여 ROS, 세포고사, 부착분자 및 NF-kB 측정을 하였다. 그 결과, ROS 및 세포고사가 억제되었고, 부착분자의 발현을 측정한 결과 VCAM-1(A)와 ICAM-1(B)의 발현이 억제되었으며, 활성화된 NF-kB가 VCAM-1(A)와 ICAM-1(B)에 의해 발현이 감소하였고, 사이토카이닌 분비을 측정한 결과 VCAM-1(A)와 ICAM-1(B)의 분비량이 감소함을 확인하여 염증성 사이토카인, 케모카인 분비, 세포고사, ROS 생성 및 부착분자 생성에 있어 억제 효과를 확인하였다(도 13, 도 14, 도 15, 도 16 및 도 17 참조).In addition, the present inventors measured ROS, apoptosis, adhesion molecule and NF-kB in order to analyze the effect of arazyme on HUVEC, a cell line involved in atopic dermatitis. As a result, the expression of VCAM-1 (A) and ICAM-1 (B) was inhibited and the expression of activated NF-kB was inhibited by VCAM-1 (A) (A) and ICAM-1 (B), respectively. The secretion of cytokines, ICAM-1 (B) (Fig. 13, Fig. 14, Fig. 15, Fig. 16 and Fig. 17).

따라서, 본 발명의 아라자임은 아토피 피부염에 관여하는 세포주에서 사이토카이닌 분비에 대한 탁월한 억제 효과 및 염증반응을 억제하므로 아토피 피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Accordingly, the present invention can be effectively used as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of atopic dermatitis, because it suppresses the excellent inhibitory effect on cytokine secretion and the inflammatory reaction in cell lines involved in atopic dermatitis.

본 발명의 아라자임에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 산제, 정제, 캡슐제, 환, 과립 또는 주사액제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.In addition to the arazyme of the present invention, one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions may be contained. For administration, one or more additional pharmaceutically acceptable carriers may be prepared. The pharmaceutically acceptable carrier may be a mixture of saline, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components. If necessary, an antioxidant, Other conventional additives such as a bacteriostatic agent may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into main dosage forms such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, powders, tablets, capsules, rings, granules or injection solutions. Further, it can be suitably formulated according to each disease or ingredient, using the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990) in a suitable manner in the art.

본 발명의 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 아라자임의 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏ 이며, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
The pharmaceutical composition for the prevention and treatment of atopic dermatitis according to the present invention can be administered parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally administered in accordance with a desired method, , Age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate, and severity of the disease. The daily dose of arazyme according to the present invention is 0.01 to 5000 mg / kg, preferably 0.01 to 10 mg / kg, and it is more preferable to administer the arazyme in one dose or in several times a day.

본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물 건강식품을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition health food for preventing and treating atopic dermatitis containing arazyme as an active ingredient.

본 발명의 아라자임을 식품 첨가물로 이용할 경우, 상기의 아라자임을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 이용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 이용될 수 있다. 아라자임은 상기와 같은 동일한 방법으로 수득하여 이용한다. 유효성분의 혼합양은 이용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 아라자임은 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량부, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량부의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 이용될 수 있다.When the arazyme of the present invention is used as a food additive, the arazyme may be added as it is, or may be used together with other food or food ingredients, and suitably used according to a conventional method. Arazyme is obtained and used in the same manner as described above. The amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment). Generally, in the production of foods or beverages, arazyme of the present invention is added in an amount of 0.01 to 10 parts by weight, preferably 0.05 to 1 part by weight based on the raw material. However, in the case of long-term consumption intended for health and hygiene purposes or for health control purposes, the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount exceeding the above range .

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.There is no particular limitation on the kind of the food. Examples of the food to which the above substances can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snack, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, Alcoholic beverages, and vitamin complexes, all of which include health foods in a conventional sense.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 이용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 음료 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.The health beverage composition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates as an additional ingredient such as ordinary beverages. The above-mentioned natural carbohydrates are sugar alcohols such as monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and xylitol, sorbitol and erythritol. As the sweetening agent, natural sweetening agents such as tau Martin and stevia extract, synthetic sweetening agents such as saccharin and aspartame, and the like can be used. The ratio of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 ml of the beverage composition of the present invention.

상기 외에 아라자임은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 이용되는 탄산화제 등에 첨가할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육에도 아라자임을 첨가할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 이용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 아라자임 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
In addition to the above, arazymes can be used for various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickening agents, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, And the like. In addition, arazyme can be added to the pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice drink and vegetable drink. These components may be used independently or in combination. The ratio of such additives is not critical but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the aramid of the present invention.

또한, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 피부외용제를 제공한다.The present invention also provides an external preparation for skin for the prevention and treatment of atopic dermatitis comprising arazyme as an active ingredient.

상기 피부외용제로 사용되는 적합한 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고 또는 스프레이의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.Suitable formulations for use as the external preparation for skin include, for example, solutions, gels, solid or paste anhydrous products, emulsions obtained by dispersing an oil phase in water, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionic forms (liposomes) In the form of a non-ionic follicular dispersion, in the form of creams, skins, lotions, powders, ointments or sprays. It can also be prepared in the form of a foam or an aerosol composition further containing a compressed propellant.

상기 피부외용제는 아라자임에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
The external preparation for skin may further contain, in addition to arazyme, a lipid, an organic solvent, a solubilizing agent, a thickening agent and a gelling agent, a softening agent, an antioxidant, a suspending agent, a stabilizer, a foaming agent, a perfume, a surfactant, Any of the other commonly used agents commonly used in nonionic emulsifiers, fillers, sequestering and chelating agents, preservatives, vitamins, barrier agents, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic active agents, lipid vesicles, ≪ RTI ID = 0.0 > and / or < / RTI > In addition, the components can be introduced in amounts commonly used in the dermatology field.

아울러, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic composition for prevention and improvement of atopy comprising arazyme as an active ingredient.

본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.The cosmetic composition of the present invention includes, but is not limited to, a composition selected from the group consisting of water-soluble vitamins, oil-soluble vitamins, polymer peptides, polymer polysaccharides, sphingolipids and seaweed extracts.

상기 수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C 또는 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염(티아민염산염 또는 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염 또는 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.As the water-soluble vitamin, any of vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, pyridoxine, pyridoxine hydrochloride, vitamin B12, pantothenic acid, nicotinic acid, nicotinic acid amide, folic acid, vitamin C or vitamin H can be used, And include salts thereof (such as thiamine hydrochloride or sodium ascorbate) or derivatives thereof (such as ascorbic acid-2-phosphate sodium salt or ascorbic acid-2-phosphate magnesium salt).

상기 유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 및, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파 토코페롤, 니코틴산 dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올 또는 판토테닐에틸에테르 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.Vitamin A, carotene, vitamin D2, vitamin D3, vitamin E (d1-alpha tocopherol, d-alpha tocopherol, d-alpha tocopherol) and derivatives thereof Alpha-tocopherol vitamin E, DL-pantothenyl alcohol, D-pantothenyl alcohol or pantothenyl ethyl ether, etc.), or the like (such as ascorbyl palmitate, ascorbic acid stearate, ascorbic dipalmitate, dl-alpha tocopherol acetate, dl- But is not limited thereto.

상기 고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴 또는 케라틴이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The polymeric peptide may be any compound as long as it can be compounded in cosmetics, but collagen, hydrolyzed collagen, gelatin, elastin, hydrolyzed elastin or keratin are preferable, but not limited thereto.

상기 고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등)이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The polymeric polysaccharide may be any compound as long as it can be compounded in cosmetics, but it is preferably, but not limited to, hydroxyethyl cellulose, xanthan gum, sodium hyaluronate, chondroitin sulfate or a salt thereof (sodium salt, etc.).

상기 스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The sphingogly lipid may be any one as long as it can be incorporated in cosmetics, but ceramides, phytosphingosine and sphingoglycolipids are preferable, but not limited thereto.

상기 해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 갈조 엑기스, 홍조 엑기스 또는 녹조 엑기스이 바람직하고, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨 또는 아르긴산칼륨이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The seaweed extract may be any one as long as it can be compounded in cosmetics. Preferably, the extract is a brown algae extract, a red algae extract or a green algae extract, and the color guanine, arginic acid, sodium alginate or potassium alginate purified from the seaweed extract is preferable. It is not limited.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있다. 상기 다른 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제 또는 정제수가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the cosmetic composition of the present invention, in addition to the above essential ingredients, other ingredients usually added to cosmetics may be blended if necessary. The other components may be selected from the group consisting of a preservative component, a moisturizer, an emollient, a surfactant, an organic and inorganic pigment, an organic powder, an ultraviolet absorbent, an antiseptic, a bactericide, an antioxidant, a plant extract, a pH adjuster, Cold agents, antiperspirants or purified water are preferred, but not always limited thereto.

상기 유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지 또는 식물 유지가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴 또는 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.Examples of the above-mentioned sustaining component include ester-based fats, hydrocarbon-based fats, silicone-based fats, fluorine-based fats, animal fats or plant fats. Examples of ester-based fats include glyceryl tri-2-ethylhexanoate, cetyl 2-ethylhexanoate, isopropyl myristate, butyl myristate, isopropyl palmitate, ethyl stearate, octyl palmitate, isostearyl isostearate, Butyl isopropyl myristate, isopropyl myristate, isopropyl myristate, isopropyl myristate, isopropyl myristate, isopropyl myristate, butyl, ethyl linoleate, isopropyl linoleate, ethyl oleate, isosilyl myristate, isostearic acid isostearyl, isostearyl palmitate, octyldodecyl myristate, Trimethylol propane, triisostearic acid trimethylol propane, tetra 2-ethylhexanoic acid pentaerythritol tetra (2-ethylhexanoate) , Decyl caprylate, decyl laurate, hexyl laurate, myristate decyl, myristyl myristate, myristine monoethyl stearate, stearyl stearate, decyl oleate, ricinoleic acid tri , Isostearyl stearate, isostearyl stearate, isodecyl stearate, octyldodecyl oleate, octyldodecyl linoleate, isopropyl isostearate, isopropyl stearate, isopropyl stearate, isopropyl stearate, -Hexyl stearate, stearyl ethylhexanoate, stearyl 2-ethylhexanoate, hexyl isostearate, ethylene glycol dioctanoate, ethylene glycol dioleate, propylene glycol dicaprate, di (capryl, capric acid) propylene glycol, Propyleneglycol propionate, propyleneglycol propionate, dicaproic acid neopentyl glycol, dioctanoic acid neopentyl glycol, tricarboxylic acid glyceryl, triunsaturated glyceryl, triisopalmitic acid glyceryl, triisostearic acid glyceryl, neopentanoic acid octyldodecyl Octanoic acid octanoate, octanoic acid octanoate, octanoic acid octanoate, octanoic acid octanoate, octanoic acid octanoate, octanoic acid octanoate, Octyldecyl lactate, octyldecyl lactate, octyldecyl lactate, polyglycerin oleic acid ester, polyglycerin isostearic acid ester, triisocetyl citrate, triisobutyl citrate, triisooctyl citrate, lauryl lactate, myristyl lactate, But are not limited to, ethyl, acetyltriethyl citrate, acetyltributyl citrate, trioctyl citrate, diisostearyl malate, 2-ethylhexyl hydroxystearate, di-2-ethylhexyl succinate, diisobutyl adipate, diisopropyl sebacate, But are not limited to, dioctyl sebacate, stearic acid cholesteryl, isostearic acid cholesteryl, hydroxystearic acid cholesteryl, oleic acid cholesteryl, oleic acid dihydrocholesteryl, isostearic acid pitostearyl, 12-stearoylhydroxystearic acid isostearyl, 12-stearoyl stearyl hydroxystearate, or 12-stearoyl stearoyl stearate. The aloylhydroxystearic acid is preferably an ester-based ester such as a sostearyl, but is not limited thereto.

상기 탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스 또는 와셀린 등의 탄화 수소계 유지가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The hydrocarbonaceous oil-retaining agent is preferably a hydrocarbonaceous oil-based oil such as squalene, liquid paraffin, alpha-olefin oligomer, isoparaffin, ceresin, paraffin, floating isoparaffin, polybutene, microcrystalline wax or vaseline.

상기 실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유 또는 아미노 변성 실리콘유가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.Examples of the silicone-based oil include polymethyl silicone, methylphenyl silicone, methyl cyclopolysiloxane, octamethyl polysiloxane, decamethyl polysiloxane, dodecamethyl cyclosiloxane, dimethylsiloxane methyl cetyloxysiloxane copolymer, dimethylsiloxane methyl stearoxysiloxane copolymer, A silicone oil or an amino-modified silicone oil is preferable, but not limited thereto.

상기 불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The fluorine-based oil is preferably a perfluoropolyether, but is not limited thereto.

상기 동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린 또는 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.Examples of the animal or plant oil include avocado oil, almond oil, olive oil, sesame oil, rice bran oil, new flower oil, soybean oil, corn oil, rape oil, apricot kernel oil, palm kernel oil, palm oil, castor oil, The present invention relates to a process for producing a starch-containing starch, which is selected from the group consisting of seed oil, cottonseed oil, palm oil, palm oil, cucumber nut oil, wheat germ oil, rice germ oil, Animal or vegetable oils such as oil, can-pick wax, carnauba wax, liquid lanolin or hardened castor oil are preferable, but not limited thereto.

상기 보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자 또는 지용성 고분자가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n=2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n=2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n=2 이상), 락트산 또는 락트산염이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤 또는 콜레스테롤에스테르가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산 또는 덱스트린 이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르 또는 고분자 실리콘이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산 또는 라놀린지방산콜레스테릴에스테르가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The moisturizing agent is preferably a water-soluble low molecular weight moisturizer, a liposoluble molecular moisturizer, a water-soluble polymer, or a liposoluble polymer, but is not limited thereto. Examples of the water-soluble low-molecular moisturizing agent include serine, glutamine, sorbitol, mannitol, sodium pyrrolidone-carboxylate, glycerin, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, ethylene glycol, polyethylene glycol B Glycol (degree of polymerization n = 2 or more), polyglycerin B (degree of polymerization n = 2 or more), lactic acid or lactic acid salt, but not limited thereto. As the lipid-soluble low molecular weight moisturizing agent, cholesterol or cholesterol ester is preferable, but not limited thereto. The water-soluble polymer is preferably a carboxyvinyl polymer, polyaspartic acid, tragacanth, xanthan gum, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose, water-soluble chitin, chitosan or dextrin But is not limited thereto. The oil-soluble polymer is preferably a polyvinylpyrrolidone eicosene copolymer, a polyvinylpyrrolidone hexadecene copolymer, a nitrocellulose, a dextrin fatty acid ester, or a polymeric silicone, but is not limited thereto. As the emollients, long chain acyl glutamic acid cholesteryl ester, hydroxystearic acid cholesteryl, 12-hydroxystearic acid, stearic acid, rosin acid or lanolin fatty acid cholesteryl ester are preferable, but not limited thereto.

상기 계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제 또는 양성 계면 활성제가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEPOP (폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드 또는 수소첨가대두인지질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염 또는 퍼플루오로알킬인산에스테르가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드 또는 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형 또는 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The surfactant is preferably, but not limited to, a nonionic surfactant, an anionic surfactant, a cationic surfactant or a positive surfactant. Examples of the nonionic surfactant include self emulsifying monostearate glycerin, propylene glycol fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, POE (polyoxyethylene) sorbitan fatty acid ester, POE sorbit fatty acid ester, POE Polyoxyethylene polyoxypropylene) copolymers, POEPOP alkyl ethers, polyether-modified silicones, lauric acid alkanolamides, alkylpolyester esters, polyoxyethylene fatty acid esters, polyoxyethylene fatty acid esters, POE alkyl ethers, POE fatty acid esters, POE hardened castor oil, POE castor oil, POEPOP Amine oxides or hydrogenated soybean phospholipids are preferred, but not limited thereto. Examples of the anionic surfactant include fatty acid soap, alpha-acylsulfonate, alkylsulfonate, alkylarylsulfonate, alkylnaphthalenesulfonate, alkylsulfate, POE alkyl ether sulfate, alkylamide sulfate, alkyl phosphate, POE alkyl ginseng salt, A salt of alkylsulfosuccinate, an acylated hydrolyzed collagen peptide salt, or a perfluoroalkyl phosphoric acid ester is preferable, but it is preferable to use an alkylsulfosuccinic acid salt, It is not limited. Examples of the cationic surfactant include alkyl trimethyl ammonium chloride, stearyl trimethyl ammonium chloride, stearyl trimethyl ammonium bromide, cetostearyl trimethyl ammonium chloride, distearyl dimethyl ammonium chloride, stearyl dimethyl benzyl ammonium chloride, behenyl trimethyl ammonium chloride, Benzalkonium, diethylaminoethylamide stearate, dimethylaminopropylamide stearate or a quaternary ammonium salt of lanolin derivative are preferable, but not limited thereto. Examples of the amphoteric surfactant include carboxybetaine, amidebetaine, sulfobetaine, hydroxysulfobetaine, amidosulfobetaine, phosphobetaine, aminocarboxylate, imidazoline derivative or amideamine Amphoteric surfactants are preferred, but are not limited thereto.

상기 유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우 또는 CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.Examples of the organic and inorganic pigments include silicic acid, anhydrous silicic acid, magnesium silicate, talc, sericite, mica, kaolin, spinach, clay, bentonite, titanium coated mica, bismuth oxychloride, zirconium oxide, magnesium oxide, Inorganic pigments such as aluminum, calcium sulfate, barium sulfate, magnesium sulfate, calcium carbonate, magnesium carbonate, iron oxide, chromium oxide, chromium oxide, chromium oxide, Polyamide, polyester, polypropylene, polystyrene, polyurethane, vinyl resin, urea resin, phenol resin, fluorine resin, silicon resin, acrylic resin, melamine resin, epoxy resin, polycarbonate resin, divinylbenzene styrene copolymer, silk Organic pigments such as powder, cellulose, CI Pigment Yellow or CI Pigment Orange, and composite pigments of inorganic pigments and organic pigments thereof, but are not limited thereto.

상기 유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산; 또는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠스티렌 공중합체 또는 사불화에틸렌가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.Examples of the organic powder include metal soaps such as calcium stearate; Metal salts of alkyl phosphates such as sodium zinc cetylate, zinc laurylate and calcium lauryl laurate; Acylamino acid polyvalent metal salts such as N-lauroyl-beta-alanine calcium, N-lauroyl-beta-alanine zinc and N-lauroylglycine calcium; Amidosulfonic acid multivalent metal salts such as N-lauroyl-taurine calcium and N-palmitoyl-taurine calcium; Such as N-epsilon-lauroyl-L-lysine, N-epsilon-palmitoylidene, N-alpha-paratyylnitin, N-alpha-lauroyl arginine, N- Acyl basic amino acids; N-acylpolypeptides such as N-lauroylglycylglycine; Alpha-amino fatty acids such as alpha-aminocaprylic acid, alpha-aminoaurauric acid, and the like; Or polyethylene, polypropylene, nylon, polymethyl methacrylate, polystyrene, divinylbenzene styrene copolymer, or tetrafluoroethylene, but is not limited thereto.

상기 자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-3차-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진 또는 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.Examples of the ultraviolet absorber include ultraviolet absorbers such as p-aminobenzoic acid, ethyl p-aminobenzoate, amyl paranobenzoate, octyl p-aminobenzoate, ethylene glycol salicylate, phenyl salicylate, benzyl salicylate, benzyl salicylate, butylphenyl salicylate, homomenthyl salicylate, Benzyl, 2-ethoxyethyl methoxycinnamate, octyl methoxycinnamate, dipyrromethoxycinnamic acid mono-2-ethylhexane glyceryl, paramethoxy isoamyl isopropyl, diisopropyl diisopropyl cinnamate ester mixture, Carninoic acid, ethyl urocanoate, hydroxymethoxybenzophenone, hydroxymethoxybenzophenone sulfonic acid and salts thereof, dihydroxymethoxybenzophenone, sodium dihydroxymethoxybenzophenone disulfonate, dihydroxybenzophenone , Tetrahydroxybenzophenone, 4- tert -butyl-4'-methoxydibenzoylmethane, 2,4,6-trianylino-p- (carbo-2'-ethylhexyl- 1,3,5-triazine or 2- (2 -Hydroxy-5-methylphenyl) benzotriazole is preferred, but not limited thereto.

상기 살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301호, 모노니트로과이어콜나트륨 또는 운데시렌산이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.Examples of the bactericide include antibiotics such as hinokitiol, trichloroacid, trichlorohydroxydiphenyl ether, crohexidine gluconate, phenoxyethanol, resorcin, isopropylmethylphenol, azulene, salicylic acid, Photosensitive monomer No. 301, mononitro and eicorne sodium or undecylenic acid, but are not limited thereto.

상기 산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필 또는 엘리소르빈산이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.As the antioxidant, butylhydroxy anisole, gallic acid propyl or erosorbic acid is preferable, but not limited thereto.

상기 pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨 또는 인산일수소나트륨이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The pH adjusting agent is preferably, but not limited to, citric acid, sodium citrate, malic acid, sodium malate, fumaric acid, sodium fumarate, succinic acid, sodium succinate, sodium hydroxide or sodium monohydrogenphosphate.

상기 알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The alcohol is preferably a higher alcohol such as cetyl alcohol, but is not limited thereto.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 0.01 ~ 5% 중량 백분율로 배합되는 것이 바람직하고, 0.01 ~ 3% 중량 백분율로 배합되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.Any of the above components may be blended to the extent that the object and effect of the present invention are not impaired, but it is preferable that the blend is blended at 0.01 to 5% by weight with respect to the total weight , More preferably 0.01 to 3% by weight, but is not limited thereto.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 유화물 또는 점성형 혼합물의 형상을 취할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 본 발명의 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.The cosmetic composition of the present invention may take the form of a solution, an emulsion or a viscous mixture, but is not limited thereto. The ingredients contained in the cosmetic composition of the present invention may contain, as an active ingredient, the ingredients commonly used in cosmetic compositions in addition to the compound of the present invention, and may contain conventional auxiliary agents such as stabilizers, solubilizers, vitamins, But is not limited thereto.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액 또는 모발화장료로 제조될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 또는 바디클린저의 제형을 포함하나 이에 한정되지 않는다.The cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulations conventionally produced in the art and may be formulated into emulsion, cream, lotion, pack, foundation, lotion, essence or hair cosmetic, but not limited thereto. Specifically, the cosmetic composition of the present invention can be used as a skin lotion, a skin softener, a skin toner, an astringent, a lotion, a milk lotion, a moisturizing lotion, a nutrition lotion, a massage cream, a nutrition cream, a moisturizing cream, a hand cream, Packs, soaps, cleansing foams, cleansing lotions, cleansing creams, body lotions or body cleansers.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연이 이용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.When the formulation of the present invention is a paste, a cream or a gel, animal fibers, plant fibers, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as the carrier component But are not limited thereto.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component. In the case of a spray, in particular, / Propane or dimethyl ether, but is not limited thereto.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.When the formulation of the present invention is a solution or an emulsion, a solvent, a solvent or an emulsifier is used as a carrier component, and water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or fatty acid esters of sorbitan can be used, but are not limited thereto.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트가 이용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.When the formulation of the present invention is a suspension, a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, But are not limited to, cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유도체, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
When the formulation of the present invention is an interfacial active agent-containing cleansing, the carrier component may include aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide But are not limited to, ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable derivatives, linolenic derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, Experimental Examples and Preparation Examples.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following Examples, Experimental Examples and Preparation Examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following Examples, Experimental Examples and Production Examples.

<< 실시예Example 1>  1> 아라자임Arazyme (( ArazymeArazyme )의 제조)

본 발명의 유효성분인 아라자임(Arazyme)을 제조하기 위하여, 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주(KCTC 0268BP)를 배양배지(박토 트립톤 0.5%, 효모 추출물 0.5%, 염화 나트륨 0.1%, 염화 칼륨 0.05%, 염화 칼슘 0.02% 및 황산 마그네슘 0.02%에서 22℃로 18 시간 동안 배양하였다. 배양액을 2 ㎛ 막여과를 이용해서 균체와 상등액을 분리한 다음 분리된 상등액을 10 kDa의 막 여과를 이용하여 농축하였다.　 본 발명의 아라자임은 기본적으로 음이온의 특성을 가지므로 농축액을 50 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 전처리한 DEAE-셀룰로오즈(DEAE-cellulose)를 이용한 이온 교환 수지(ion exchange resin)와 20 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 전처리한 세파덱스 G-75(Sephadex G-75)를 이용한 젤 여과 교환수지(gel filtration exchange resin)를 이용해 정제를 했다.　 정제된 효소액은 10% SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)로 전기영동(electrophoresis)을 하여 밴드 경향을 확인하였는데 그 결과 본 발명의 아라자임은 소단위를 갖지 않는 단일체(monomer)로서 약 51.5 kDa의 분자량을 갖는 밴드를 나타냄을 확인하였다.　 단, 아라자임 생산을 위한 아라니콜라 프로테오리티쿠수 HY-3 균주(KCTC 0268BP)는 다양한 산업용 배지에서 생산을 할 수 있으며 생산된 배양액 또한 다양한 방법으로 분리 및 정제하여 이용할 수 있다. 본 발명의 아라자임은 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드 서열을 가지며, 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 가진다.
(KCTC 0268BP) was cultured in a culture medium (0.5% bacto-tryptone, 0.5% yeast extract, 0.1% sodium chloride, and 0.1% yeast extract) in order to produce Arazyme, an active ingredient of the present invention. The cells were incubated for 18 hours at 22 ° C in 0.05% potassium chloride, 0.02% calcium chloride, and 0.02% magnesium sulfate. The cells were separated by filtration through a 2 ㎛ membrane filter, and the separated supernatant was subjected to 10 kDa membrane filtration Since the arazyme of the present invention has basically the characteristics of anion, the concentrate is subjected to ion exchange with DEAE-cellulose (DEAE-cellulose) pretreated with 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.6) and purified by gel filtration exchange resin using Sephadex G-75 (Sephadex G-75) pre-treated with 20 mM tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.6) % SDS-PAGE (Sodium dode cyl sulfate-polyacrylamide gel). As a result, it was confirmed that the arazyme of the present invention exhibited a band having a molecular weight of about 51.5 kDa as a monomer having no subunits. However, the ARANICOLA proteolyticus KYUSHY strain HY-3 (KCTC 0268BP) for the production of arazyme can be produced in various industrial mediums and the produced culture fluid can also be separated and purified by various methods and used. 1 has the polypeptide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and has the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.

<< 실험예Experimental Example 1>  1> 아라자임의Arazic 세포주  Cell line THPTHP -1에 대한 효과 분석-1

<1-1> <1-1> THPTHP -1 세포 배양 및 세포 독성 측정-1 Cell culture and cytotoxicity measurement

사람의 단핵구(monocyte)인 THP-1(human acute monocytic leukemia cell; 미국세포주은행)를 2.0 x 10⁵/ml로 RPMI 1640 배지, 항생물질[페니실린(penicillinm) 104 U/㎖, 스트렙토마이신(streptomycin) 10 mg/㎖, 암포테리신(amphotericin) B 25 ㎍/㎖]과 10% FBS를 넣고, 배양기에서 3일간 배양하였다. THP-1 세포에 아라자임을 1, 10, 20 및 50 μg/ml 로 각각 처리한 후, 24시간 뒤 MTT assay를 이용하여 세포 독성을 측정하였다. Human monocyte, human acute monocytic leukemia cell (THP-1), was cultured in RPMI 1640 medium at 2.0 x 10 ⁵ / ml, antibiotics (penicillin, 104 U / ml, streptomycin) 10 mg / ml, amphotericin B 25 μg / ml] and 10% FBS were added to each well and cultured in an incubator for 3 days. THP-1 cells were treated with arazyme at 1, 10, 20, and 50 μg / ml, respectively, and cytotoxicity was measured by MTT assay after 24 hours.

THP-1, EoL-1, HaCaT 및 HUVEC 세포에서 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(Arazyme)이 세포 독성 및 증식에 관여하는지 확인하기 위해 MTT 측정법(Roche, Penzberg, Germany)을 이용하였다. 세포는 5×10⁴ cells/100 ㎕의 농도로 배양액에 부유하여 96 웰 플레이트에 분주한 다음 다양한 농도의 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(Arazyme)(1 μM ~ 50 μM)을 24시간 동안 처리하였다. 이후 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 10 ㎕ 첨가하여 37℃ 및 5% CO₂ 배양기에서 4시간을 배양한 다음 100 ㎕의 MTT 용해액을 추가로 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO₂ 배양기에서 하루 동안 방치한 다음 550 nm에서 흡광도를 측정하였다MTT assay (Roche, Penzberg, Germany) was used to determine whether Arazyme produced by <Example 1> was involved in cytotoxicity and proliferation in THP-1, EoL-1, HaCaT and HUVEC cells Respectively. Cells were suspended in a culture solution at a concentration of 5 x 10 ⁴ cells / 100 μl, and the cells were divided into 96-well plates and then Arazyme (1 μM to 50 μM) prepared using various concentrations of <Example 1> And treated for 24 hours. Then, 10 μl of MTT (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -25-diphenyltetrazolium bromide) solution was added and incubated at 37 ° C and 5% CO ₂ for 4 hours. 100 μl of MTT solution Lt; / RTI &gt; After standing for one day at 37 ° C and 5% CO ₂ incubator, the absorbance was measured at 550 nm

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 약 80% 이상의 생존률을 보임을 확인하였다(도 1).
As a result, it was confirmed that the survival rate was about 80% or more as shown in Fig. 1 (Fig. 1).

<1-2> <1-2> THPTHP -1 세포에서의 -1 cells MCPMCP -1 및 -1 and ILIL -8 측정 -8 measurement

아토피 피부염에 관여하는 THP-1 세포주에 사이토카인 및 염증성 마커(maker)인 MCP-1 및 IL-8을 처리하여 효과를 분석하였다.The effects of cytokines and inflammatory markers, MCP-1 and IL-8, on the THP-1 cell line involved in atopic dermatitis were analyzed.

THP-1 세포를　0. 5% FBS가 든 RPMI에 2.0 x 10⁶/m로 24 웰 플레이트에 분주한 후 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 16시간 배양하였다. 배양 후 아라자임의 최종 농도 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖을 1시간 동안 처리한 후 HDE(1 ㎍/㎖)를 각각 24시간 동안 처리한 다음, ELISA를 이용하여 상층액에서 MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1) 및 IL-8의 양을 측정하였다. THP-1 cells were seeded in a 24 well plate at 2.0 x 10 ⁶ / m in RPMI supplemented with 0.5% FBS and cultured in an incubator (37 ° C and 5% CO ₂ ) for 16 hours. After culturing, final concentrations of arazyme (1 ㎍ / ㎖, 10 ㎍ / ㎖, 20 ㎍ / ㎖ and 50 ㎍ / ㎖) were treated for 1 hour and HDE (1 ㎍ / Were used to measure the amounts of MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) and IL-8 in the supernatant.

그 결과, THP-1에 마이트(Mite) 20 μg/ml를 처리하면 MCP-1이 분비되었고, THP-1에 아라자임을 1, 10, 20 및 50 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 마이트로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 MCP-1을 측정한 결과 농도의존적으로 MCP-1의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 2).As a result, MCP-1 was secreted when THP-1 was treated with 20 μg / ml of mite, and arazyme was treated with THP-1 at 1, 10, 20 and 50 μg / ml, After 24 hours of activation by diphtheria, MCP-1 was measured in the supernatant using ELISA, and MCP-1 secretion was inhibited in a concentration-dependent manner (FIG. 2).

또한, THP-1 세포에서의 아라자임에 대한 IL-8 분비 측정한 결과 THP-1(사람의 단핵구세포)에 마이트 20 μg/ml를 처리하면 MCP-1이 분비되었다. THP-1에 아라자임을 1, 10, 20 및 50 μg/ml 로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 마이트로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 IL-8를 측정한 결과 농도의존적으로 IL-8의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 3).
In addition, IL-8 secretion of arazyme in THP-1 cells resulted in the secretion of MCP-1 by treatment with THP-1 (human monocyte) at a concentration of 20 μg / ml. IL-8 was measured in the supernatant using ELISA for 24 hours after 1 hour treatment of arazyme with THP-1 at 1, 10, 20, and 50 μg / ml, respectively. IL-8 secretion was inhibited (Fig. 3).

<< 실험예Experimental Example 2>  2> 아라자임의Arazic 세포주  Cell line EoLEoL -1에 대한 효과 분석-1

<2-1> <2-1> EoLEoL -1 세포배양 및 독성 측정-1 Cell culture and toxicity measurement

사람의 호산구(eosinophil)인 EoL-1(human eosinophilic leukemia cell; Riken Cell Bank, Japan)를 2.0 x 10⁵/ml로 RPMI 1640 배지, 항생물질[페니실린(penicillinm) 104 U/㎖, 스트렙토마이신(streptomycin) 10 mg/㎖, 암포테리신(amphotericin) B 25 ㎍/㎖]과 10% FBS를 넣고, 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 3일간 배양하였다. EoL-1 (사람의 호산구 세포) 세포에 아라자임을 1, 10, 20 및 50 μg/ml로 각각 처리한 후, 24시간 뒤 MTT assay를 이용하여 세포 독성을 측정하였다.Human eosinophilic leukemia cells (EoL-1, eicosanophilic leukemia cell; Riken Cell Bank, Japan) were infected with RPMI 1640 medium at 2.0 x 10 ⁵ / ml, antibiotics [penicillin 104 U / ml, streptomycin ) And 10% FBS were added to the cells and cultured in an incubator (37 ° C and 5% CO ₂ ) for 3 days. EoL-1 (human eosinophil cell) cells were treated with arazyme at 1, 10, 20, and 50 μg / ml, respectively, and cytotoxicity was measured by MTT assay 24 hours later.

그 결과 도 4에 나타난 바와 같이 약 80% 이상의 생존률을 보임을 확인하였다(도 4).
As a result, it was confirmed that the survival rate was about 80% or more as shown in FIG. 4 (FIG. 4).

<2-2> <2-2> EoLEoL -1 세포에서의 -1 cells MCPMCP -1 및 -1 and ILIL -8 측정 -8 measurement

EoL-1세포를　10% FBS가 든 RPMI에 7.0 x 10⁵/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 후 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 16시간 배양하였다. 배양 후 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(최종 농도 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖)를 1시간 동안 처리한 후 마이트(20 ㎍/㎖)를 각각 24시간 동안 처리한 다음, ELISA를 이용하여 상층액에서, MCP-1, IL-6 및 IL-8의 양을 측정하였다.EoL-1 cells were plated in 24-well plates at 7.0 x 10 < ⁵ > / ml in RPMI supplemented with 10% FBS and cultured for 16 hours in an incubator (37 ° C and 5% CO ₂ ). After culturing, arazyme (final concentration of 1 / / ml, 10 / / ㎖, 20 / / ㎖ and 50 / / ㎖) prepared using <Example 1> was treated for 1 hour, ) Were each treated for 24 hours and then the amounts of MCP-1, IL-6 and IL-8 were measured in the supernatant using ELISA.

그 결과, EoL-1에 마이트 20 μg/ml를 처리하면 MCP-1이 분비되었다. EoL-1에 아라자임을 1, 10, 20 및 50 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 마이트로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 MCP-1을 측정한 결과 농도의존적으로 MCP-1의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 5).As a result, when 20 μg / ml of EoL-1 was treated with mite, MCP-1 was secreted. 1, 10, 20, and 50 μg / ml of EoL-1, respectively. After 1 hour, the cells were activated with mito- log, and MCP-1 was measured in the supernatant using ELISA for 24 hours. It was confirmed that secretion of MCP-1 was suppressed (Fig. 5).

또한, EoL-1(사람의 호산구세포)에 마이트 20 μg/ml를 처리하면 IL-8이 분비되었다. EoL-1에 배양 후 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(Arazyme)을 1, 10, 20 및 50 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 마이트로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 IL-8을 측정한 결과 농도의존적으로 IL-8의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 6).
In addition, IL-8 was secreted when EoL-1 (human eosinophil cell) was treated with 20 μg / ml of mite. After incubation in EoL-1, arazyme prepared using <Example 1> was treated with 1, 10, 20 and 50 μg / ml, respectively, and activated with mite 1 hour later. After 24 hours, ELISA As a result of measuring IL-8 in the supernatant, it was confirmed that IL-8 secretion was inhibited in a concentration-dependent manner (FIG. 6).

<< 실험예Experimental Example 3>  3> 아라자임의Arazic 세포주  Cell line HaCaTHaCaT 에 대한 효과 분석Effect analysis on

<3-1> <3-1> HaCaTHaCaT 세포배양 및 세포독성 테스트 Cell culture and cytotoxicity test

사람의 각질형성세포인 HaCaT(오비엠랩)를 2.0 x 10⁵/ml로 DMEM 배지, 항생물질[페니실린(penicillinm) 104 U/㎖, 스트렙토마이신(streptomycin) 10 mg/㎖, 암포테리신(amphotericin) B 25 ㎍/㎖]과 10% FBS를 넣고, 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 3일간 배양하였다. HaCaT (사람의 각질형성세포)세포에 배양 후 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(Arazyme)을 1, 5, 10 및 20 μg/ml로 각각 처리한 후, 24시간 뒤 MTT assay를 이용하여 세포 독성을 측정하였다.Human keratinocyte HaCaT (Obie Lab) was cultured in DMEM medium at 2.0 x 10 ⁵ / ml, antibiotics (penicillin 104 U / ml, streptomycin 10 mg / ml, amphotericin ) B 25 μg / ml] and 10% FBS were added to the cells and cultured in an incubator (37 ° C. and 5% CO ₂ ) for 3 days. After culturing in HaCaT (human keratinocyte) cells, Arazyme prepared using <Example 1> was treated with 1, 5, 10 and 20 μg / ml, respectively, and MTT assay was performed 24 hours later To measure cytotoxicity.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 아라자임은 5 μg/ml 이하의 농도에서 약 80% 이상의 생존하였다(도 7).
As a result, as shown in Fig. 7, arazyme survived at about 80% or more at a concentration of 5 μg / ml or less (FIG. 7).

<3-2> <3-2> HaCaTHaCaT 세포에서의  In the cell MCPMCP -1, -One, ILIL -6, -6, ILIL -8 및 -8 and TARCTARC 측정  Measure

HaCaT 세포를　10% FBS가 든 DMEM에 1.5 x 10⁵/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 후 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 16시간 배양하였다. 배양 후 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(Arazyme)(최종 농도 1 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖)를 1시간 동안 처리한 후 IFN-γ(10 ng/ ㎖)과 TNF-α(10 ng/ ㎖)를 각각 24시간 동안 처리한 다음, ELISA를 이용하여 상층액에서, MCP-1, IL-6, IL-8 및 TARC의 양을 측정하였다. HaCaT cells were plated in DMEM containing 10% FBS at a density of 1.5 x 10 < ⁵ > / ml in a 24-well plate and cultured in an incubator (37 ° C and 5% CO ₂ ) for 16 hours. Arazyme (final concentrations of 1 占 퐂 / ml, 2 占 퐂 / ml and 5 占 퐂 / ml) prepared using <Example 1> was incubated for 1 hour and IFN-? (10 ng / ml ) And TNF-α (10 ng / ml) for 24 h, respectively, and the amounts of MCP-1, IL-6, IL-8 and TARC were measured in the supernatant using ELISA.

그 결과, HaCaT cells에 IFN-γ와 TNF-α를 처리하면 TARC가 분비되었다. HaCaT 세포에 아라자임을 1, 2 및 5 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 IFN-γ와 TNF-α 로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 TARC를 측정하였다.As a result, when HaCaT cells were treated with IFN-γ and TNF-α, TARC was secreted. HaCaT cells were treated with arazyme at 1, 2, and 5 μg / ml, respectively, and then activated with IFN-γ and TNF-α 1 hour later. TARC was measured in the supernatant using ELISA 24 hours later.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 TARC의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 8). As a result, it was confirmed that the secretion of TARC was suppressed as shown in Fig. 8 (Fig. 8).

또한, HaCaT 세포에 IFN-γ와 TNF-α를 처리하면 MCP-1이 분비되었다. HaCaT 세포에 아라자임을 1, 2 및 5 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 IFN-γ와 TNF-α로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 MCP-1을 측정한 결과 농도의존적으로 MCP-1의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 9). In addition, IFN-γ and TNF-α treatment of HaCaT cells secreted MCP-1. HaCaT cells were treated with arazyme at 1, 2 and 5 μg / ml, respectively, and activated with IFN-γ and TNF-α 1 hour later. After 24 hours, MCP-1 was measured in the supernatant using ELISA It was confirmed that the secretion of MCP-1 was inhibited in a concentration-dependent manner (FIG. 9).

또한, HaCaT 세포에 IFN-γ와 TNF-α를 처리하면 IL-8이 분비되었다. HaCaT 세포에 아라자임을 1, 2 및 5 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 IFN-γ와 TNF-α로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 IL-8을 측정한 결과 농도의존적으로 IL-8의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 10).Treatment of HaCaT cells with IFN-γ and TNF-α secreted IL-8. IL-8 was measured in the supernatant by ELISA after 24 hours of activation with IFN-γ and TNF-α 1 hour after treatment with arazyme in 1, 2 and 5 μg / ml, respectively, in HaCaT cells It was confirmed that secretion of IL-8 was inhibited in a concentration-dependent manner (Fig. 10).

아울러, HaCaT 세포에 IFN-γ와 TNF-α를 처리하면 IL-6가 분비되었다. HaCaT 세포에 아라자임을 1, 2 및 5 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 IFN-γ와 TNF-α로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 IL-6를 측정한 결과 농도의존적으로 IL-6의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 11).
In addition, treatment of IFN-γ and TNF-α with HaCaT cells secreted IL-6. After 1 hour of treatment with arazyme, arazyme was activated with IFN-γ and TNF-α, and IL-6 was measured in the supernatant by ELISA at 24 hours after HaCaT cells were treated with 1, 2 and 5 μg / It was confirmed that secretion of IL-6 was inhibited in a concentration-dependent manner (FIG. 11).

<< 실험예Experimental Example 4>  4> 아라자임의Arazic 세포주  Cell line HUVECHUVEC 에 대한 효과 분석Effect analysis on

<4-1> <4-1> HUVECHUVEC 세포배양 및 세포독성 결과 Cell culture and cytotoxicity results

사람의 제대정맥내피세포인 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell, ATCC)를 5 x 10⁴ cells/ml로 EGM-2 배지에 2% FBS를 넣고, 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 배양하였다. HUVEC에 아라자임을 1, 5, 10 및 20 μg/ml로 각각 처리한 후, 24시간 뒤 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 측정하였다. Human umbilical vein endothelial cells (ATCC), a human umbilical vein endothelial cell, were inoculated into EGM-2 medium at 5 × 10 ⁴ cells / ml and cultured in an incubator (37 ° C. and 5% CO ₂ ) . HUVEC was treated with arazyme at 1, 5, 10, and 20 μg / ml, respectively, and cell viability was measured by MTT assay after 24 hours.

그 결과 도 12에 나타낸 바와 같이 세포독성효과가 나타나지 않았음을 확인하였다(도 12).
As a result, it was confirmed that no cytotoxic effect was shown as shown in Fig. 12 (Fig. 12).

<4-2> <4-2> HUVECHUVEC 의 of ROSROS 측정  Measure

HUVEC 세포를 2% FBS가 든 EGM-2 배지에 4 x 10⁴/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 다음 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 24시간 배양하였다. 배양 후 아라자임의 최종 농도 20 ㎍/㎖을 1시간 동안 처리한 후 LPS (10 ㎍/㎖)를 각각 1 시간 동안 처리한 다음 10 μM 2’,7'-dichlorofluorescein diacetate(DCFCA)를 첨가하였다. 실온에서 5분 방치한 다음 525 nm의 파장에서 형광세기를 측정하였다. HUVEC에 LPS을 10 μg/ml로 처리하면 ROS가 생산되었다. HUVEC에 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(Arazyme)을 20 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤에 LPS를 첨가하여 다시 1시간 배양한 다음 유세포분석기를 이용하여 생산된 ROS의 양을 측정하였다.HUVEC cells were plated on 24-well plates at 4 x 10 &lt; ⁴ &gt; / ml in EGM-2 medium supplemented with 2% FBS and cultured in an incubator (37 ° C and 5% CO ₂ ) for 24 hours. After culturing, the final concentration of arazyme was 20 μg / ml for 1 hour, and then treated with LPS (10 μg / ml) for 1 hour, followed by addition of 10 μM 2 ', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFCA). After leaving at room temperature for 5 minutes, fluorescence intensity was measured at a wavelength of 525 nm. Treatment of HUVEC with 10 μg / ml of LPS produced ROS. Arazyme prepared using <Example 1> was treated with 20 μg / ml of HUVEC, followed by addition of LPS for 1 hour, followed by incubation for 1 hour. Then, ROS produced using a flow cytometer The amount was measured.

그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 아라자임에 의하여 ROS 생산이 억제됨을 확인하였다(도 13).
As a result, it was confirmed that ROS production was inhibited by arazyme as shown in Fig. 13 (Fig. 13).

<4-3> <4-3> HUVECHUVEC 의 세포고사 측정 Of cell death

HUVEC 세포를 2% FBS가 든 EGM-2 배지에 4x 10⁴/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 다음 배양기(37 ℃ 및5% CO₂)에서 24시간 배양하였다. 배양 후 A, B (최종 농도 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 및 20 ㎍/㎖)을 1시간 동안 처리한 후 LPS (10 ㎍/㎖)를 각각 24 시간 동안 처리한 다음 아넥신(annexin)-V-FITC와 요오드화 프리미디엄(propidium iodide, PI) 염색하였다. 세포고사는 유세포분석기(FACS)를 통해 아넥신-V-FITC가 염색된 세포의 비율로 확인하였다. HUVEC에 LPS (10 μg/ml)를 처리하면 세포고사가 유도된다. HUVEC에 아라자임을 20 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤에 LPS를 첨가하여 다시 24시간 배양한 다음 유세포분석기를 이용하여 세포고사를 측정하였다.HUVEC cells were plated on 24-well plates at ⁴ × 10 ⁴ / ml in EGM-2 medium supplemented with 2% FBS and cultured in an incubator (37 ° C. and 5% CO ₂ ) for 24 hours. After culturing, LPS (10 μg / ml) was treated for 24 hrs after treatment with A, B (final concentrations of 1 ㎍ / ㎖, 5 ㎍ / ㎖, 10 ㎍ / ㎖ and 20 ㎍ / Annexin-V-FITC and propidium iodide (PI) were stained. The apoptosis was confirmed by the percentage of cells stained with annexin-V-FITC via flow cytometry (FACS). Treatment of HUVEC with LPS (10 μg / ml) induces apoptosis. HUVEC was treated with arazyme at 20 μg / ml, followed by addition of LPS for 1 hour, followed by incubation for 24 hours, and cell apoptosis was measured using a flow cytometer.

그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이 세포고사가 억제됨을 확인하였다(도 14).  As a result, it was confirmed that apoptosis was suppressed as shown in Fig. 14 (Fig. 14).

<4-4> <4-4> HUVECHUVEC 의 부착분자 측정 Attachment Molecule Measurement

HUVEC 세포를 2% FBS가 든 EGM-2 배지에 4 x 10⁴/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 다음 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 24시간 배양하였다. 배양 후 아라자임의 최종 농도 20 ㎍/㎖를 1시간 동안 처리한 후 LPS(10 ㎍/㎖)를 각각 24 시간 동안 처리한 다음 부착분자인 VCAM-1과 ICAM-1의 항체를 첨가하여 반응시키고 유세포 분석기를 통해 각각의 항체가 결합된 세포를 측정하였다. HUVEC에 LPS(10 μg/ml)를 처리하면 부착분자인 VCAM-1과 ICAM-1의 발현이 증가하였다. HUVEC에 아라자임 20 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤에 LPS를 첨가하여 다시 24 시간 배양한 다음 유세포분석기를 이용하여 부착분자의 발현을 측정하였다.HUVEC cells were plated on 24-well plates at 4 x 10 &lt; ⁴ &gt; / ml in EGM-2 medium supplemented with 2% FBS and cultured in an incubator (37 ° C and 5% CO ₂ ) for 24 hours. After incubation, final concentration of arazyme (20 ㎍ / ㎖) was treated for 1 hour, LPS (10 ㎍ / ㎖) was treated for 24 hours, and VCAM-1 and ICAM-1 antibody Cells bound with each antibody were measured using a flow cytometer. When HUVEC was treated with LPS (10 μg / ml), expression of adhesion molecules VCAM-1 and ICAM-1 was increased. HUVEC was treated with arazyme (20 μg / ml), followed by addition of LPS for 1 hour, followed by incubation for 24 hours, and expression of adherent molecules was measured using a flow cytometer.

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 아라자임에 의해 VCAM-1(A)와 ICAM-1(B)의 발현이 억제됨을 확인하였다(도 15).
As a result, it was confirmed that expression of VCAM-1 (A) and ICAM-1 (B) was inhibited by arazyme as shown in Fig. 15 (Fig. 15).

<4-5> <4-5> HUVECHUVEC 의 of NFNF -- kBkB 활성화 측정  Activation measurement

HUVEC 세포를 2% FBS가 든 EGM-2 배지에 4 x 10⁴/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 다음 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 24시간 배양하였다. 배양 후 아라자임의 최종 농도 20 ㎍/㎖을 1시간 동안 처리한 후 LPS (10 ㎍/㎖)를 각각 24 시간 동안 처리한 다음 세포 핵막 내에서 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질에서 NF-kB 효소 활성도를 측정하기 위해 형광물질이 표지된 기질을 이용하여 형광분석기를 통해 측정하였다. HUVEC에 LPS (10 μg/ml)를 처리하면 NF-kB가 활성화가 증가하였다. HUVEC에 아라자임을 20 μg/ml로 처리한 후, 1시간 뒤에 LPS를 첨가하여 다시 24시간 배양한 다음 형광분석기를 이용하여 NF-kB의 활성을 측정하였다.HUVEC cells were plated on 24-well plates at 4 x 10 &lt; ⁴ &gt; / ml in EGM-2 medium supplemented with 2% FBS and cultured in an incubator (37 ° C and 5% CO ₂ ) for 24 hours. After culturing, final concentration of arazyme was 20 ㎍ / ㎖ for 1 hour, and LPS (10 ㎍ / ㎖) was treated for 24 hours, and proteins were extracted from the cell nuclear membrane. In order to measure the activity of NF-kB enzymes in the extracted proteins, fluorescence-labeled substrates were used to measure the activity of the NF-kB enzymes. Treatment of HUVEC with LPS (10 μg / ml) increased NF-kB activation. HUVEC was treated with 20 μg / ml of arazyme, 1 hour later, LPS was added and incubated for another 24 hours, and the activity of NF-kB was measured using a fluorescence analyzer.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이 활성화된 NF-kB가 VCAM-1(A)와 ICAM-1(B)에 의해 감소함을 확인하였다(도 16).
As a result, it was confirmed that the activated NF-kB was decreased by VCAM-1 (A) and ICAM-1 (B) as shown in Fig. 16 (Fig. 16).

<4-6> <4-6> HUVECHUVEC 의 사이토카인 분비 측정Cytokine secretion measurement

HUVEC 세포를 2% FBS가 든 EGM-2 배지에 4 x 10⁴/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 다음 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 24시간 배양하였다. 배양 후 아라자임의 최종 농도 20 ㎍/㎖을 1시간 동안 처리한 후 LPS (10 ㎍/㎖)를 각각 24 시간 동안 처리한 다음 사이토카인 양을 측정하였다. HUVEC에 LPS(10 μg/ml)를 처리하면 MCP-1과 IL-6의 분비가 증가하였다. HUVEC에 아라자임을 20 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤에 LPS를 첨가하여 다시 24시간 배양한 다음 ELISA를 실시하여 MCP-1과 IL-6의 분비량을 측정하였다. HUVEC cells were plated on 24-well plates at 4 x 10 &lt; ⁴ &gt; / ml in EGM-2 medium supplemented with 2% FBS and cultured in an incubator (37 ° C and 5% CO ₂ ) for 24 hours. After culturing, the final concentration of arazyme was 20 ㎍ / ㎖ for 1 hour, and LPS (10 ㎍ / ㎖) was treated for 24 hours, and the amount of cytokine was measured. When HUVEC was treated with LPS (10 μg / ml), secretion of MCP-1 and IL-6 increased. HUVEC was treated with arazyme at 20 μg / ml, followed by addition of LPS for 1 hour, followed by incubation for 24 hours. ELISA was performed to determine the secretion of MCP-1 and IL-6.

그 결과 도 17에 나타낸 바와 같이 MCP-1(A)과 IL-6(B)에서 모두 감소함을 확인하였다(도 17).
As a result, it was confirmed that both MCP-1 (A) and IL-6 (B) decreased as shown in Fig. 17 (Fig. 17).

<< 제제예Formulation example 1> 약학적 제제의 제조 1> Preparation of pharmaceutical preparations

<1-1> <1-1> 산제의Sanje 제조 Produce

아라자임 2 gArazyme 2 g

유당 1 gLactose 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
After mixing the above components, the mixture was packed in an airtight container to prepare a powder.

<1-2> 정제의 제조<1-2> Preparation of tablets

아라자임 100 ㎎Arazyme 100 mg

옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg

유 당 100 ㎎100 mg of milk

스테아린산 마그네슘 2 ㎎2 mg of magnesium stearate

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
After mixing the above components, tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.

<1-3> 캡슐제의 제조 &Lt; 1-3 > Preparation of capsules

아라자임 100 ㎎Arazyme 100 mg

옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg

유 당 100 ㎎100 mg of milk

스테아린산 마그네슘 2 ㎎2 mg of magnesium stearate

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
After mixing the above components, the capsules were filled in gelatin capsules according to the conventional preparation method of capsules.

<1-4> 환의 제조&Lt; 1-4 >

아라자임 1 gArazyme 1 g

유당 1.5 gLactose 1.5 g

글리세린 1 gGlycerin 1 g

자일리톨 0.5 g0.5 g of xylitol

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
After mixing the above components, they were prepared so as to be 4 g per one ring according to a conventional method.

<1-5> 과립의 제조<1-5> Preparation of granules

아라자임 150 ㎎Arazyme 150 mg

대두추출물 50 ㎎Soybean extract 50 mg

포도당 200 ㎎200 mg of glucose

전분 600 ㎎600 mg of starch

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
After mixing the above components, 100 mg of 30% ethanol was added and the mixture was dried at 60 캜 to form granules, which were then filled in a capsule.

<1-6> 주사액제의 제조<1-6> Preparation of Injection Solution

아라자임 10 ㎍/㎖Arazyme 10 μg / ml

묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지Diluted hydrochloric acid BP until pH 7.6

주이용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖Sodium chloride up to 1 ml for injection

적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 아라자임을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
Arazyme was dissolved in the appropriate volume of sodium chloride BP, and the pH of the resulting solution was adjusted to pH 7.6 using dilute hydrochloric acid BP. The volume was adjusted using sodium chloride BP for injection and mixed thoroughly. The solution was filled in a 5 ml type I ampoule made of transparent glass, sealed in an upper lattice of air by dissolving the glass, sterilized by autoclaving at 120 DEG C for 15 minutes or longer, and an injection solution was prepared.

<< 제제예Formulation example 2> 식품의 제조 2> Manufacturing of food

상기 제제예 1의 산제, 정제, 캡슐제, 환 및 과립을 식품에 응용하여도 무방하며, 상기의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.
The foods, tablets, capsules, rings and granules of Formulation Example 1 may be applied to foods, and foods containing the culture of Arachnicola proteolithicus or arazyme isolated therefrom may be prepared as follows Respectively.

<2-1> 밀가루 식품의 제조<2-1> Production of flour food

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 10.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 통상의 방법으로 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
0.1 to 10.0 parts by weight of arabinic acid isolated from Arachnicola proteolyticus or Arazyme from arachnid was added to wheat flour, and bread, cake, cookies, crackers and noodles were prepared by using the mixture, .

<2-2> <2-2> 스프soup 및 육즙( And juicy ( graviesgravies )의 제조)

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 1.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
Arachnicola proteolyticus or 0.1 ~ 1.0 part by weight of arazyme isolated therefrom was added to the soup and the juice, and the health improvement meat product, soup soup and juice were prepared by a conventional method.

<2-3> 그라운드 <2-3> Ground 비프(ground beef)의Beef 제조 Produce

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 10 중량부를 그라운 비프에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
Arabinic acid proteolyticus or 10 parts by weight of arazyme isolated therefrom was added to the ground beef to prepare ground beef for health promotion by a conventional method.

<2-4> 유제품(<2-4> Dairy products ( dairydairy productsproducts )의 제조)

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 1.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 통상의 방법으로 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
A culture solution of Aranicola proteolyticus or 0.1 to 1.0 part by weight of arazyme isolated therefrom was added to milk, and various dairy products such as butter and ice cream were prepared by using the milk in a usual manner.

<2-5> <2-5> 선식의Solar 제조 Produce

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.Brown rice, barley, glutinous rice, and yulmu were dried by a known method and dried, and the mixture was granulated to a powder having a particle size of 60 mesh.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.Black soybeans, black sesame seeds, and perilla seeds were steamed and dried by a conventional method, and then they were prepared into powder having a particle size of 60 mesh by a pulverizer.

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 진공 농축기에서 감압, 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.The culture solution of Aranicola proteolyticus or Arazyme isolated therefrom was reduced under reduced pressure in a vacuum concentrator, and dried by spraying and drying with a hot-air drier. The resulting dried product was pulverized to a size of 60 mesh with a pulverizer to obtain a dry powder.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 통상의 방법으로 제조하였다.
The above-prepared cereals, seeds and culture of Aranicola proteolyticus or dried powder of arazyme isolated therefrom were compounded in the following proportions and prepared in a conventional manner.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),(30 parts by weight of brown rice, 15 parts by weight of yulmu, 20 parts by weight of barley)

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),Seeds (7 parts by weight of perilla, 8 parts by weight of black beans, 7 parts by weight of black sesame seeds)

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임의 건조분말(1 중량부),Arabinic acid proteolyticus or dried powder of arazyme isolated therefrom (1 part by weight),

영지(0.5 중량부),(0.5 part by weight),

지황(0.5 중량부)
(0.5 parts by weight)

<< 제제예Formulation example 3> 음료의 제조 3> Manufacturing of beverage

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 포함하는 음료를 다음과 같이 제조하였다.
A drink containing the culture solution of Aranicola proteolyticus or arazyme isolated therefrom was prepared as follows.

<3-1> <3-1> 건강음료의Health drink 제조 Produce

액상과당(0.5 중량부), 올리고당(2 중량부), 설탕(2 중량부), 식염(0.5 중량부), 물(75 중량부)과 같은 부재료와 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임(0.5 중량부)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후, 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.
(0.5 parts by weight), oligosaccharide (2 parts by weight), sugar (2 parts by weight), salt (0.5 part by weight) and water (75 parts by weight) and a culture solution of Aranicola proteolyticus Separated arazyme (0.5 parts by weight) was uniformly blended and sterilized instantaneously, and then packaged in a glass bottle, plastic bottles, etc. to prepare a health drink.

<3-2> <3-2> 야채쥬스의Vegetable juice 제조 Produce

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.5 g을 토마토 또는 당근 등의 야채의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.
The culture solution of Aranicola proteolyticus or 0.5 g of arazyme isolated therefrom was added to 1,000 ml of vegetable juice such as tomato or carrot to prepare a vegetable juice for health promotion by a conventional method.

<3-3> <3-3> 과일쥬스의Of fruit juice 제조 Produce

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 g을 사과 또는 포도 등의 과일의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.
0.1 g of Arazyme dissolved in Aranicola proteolyticus was added to 1,000 ml of fruit juice such as apple or grape, and fruit juice for health promotion was prepared by a conventional method.

<< 제조예Manufacturing example 4> 화장품의 제조 4> Manufacture of cosmetics

<4-1> 유화 제형의 화장품 제조<4-1> Cosmetics manufacturing of emulsified formulations

하기 [표 1]에 기재된 조성으로 유화제형의 화장품을 제조하였다. 제조 방법은 하기와 같다.An emulsifier-type cosmetic was produced in the composition shown in the following [Table 1]. The production method is as follows.

1) 1 내지 9의 원료를 혼합한 혼합물을 65∼70℃로 가열하였다.1) A mixture of raw materials 1 to 9 was heated to 65 to 70 占 폚.

2) 10의 원료를 상기 단계 1)의 혼합물에 투입하였다.2) The starting material of 10 was added to the mixture of step 1).

3) 11 내지 13의 원료의 혼합물을 65∼70℃로 가열하여 완전히 용해시켰다.3) The mixture of raw materials 11 to 13 was completely dissolved by heating to 65 to 70 캜.

4) 상기 단계 3)을 거치면서, 상기 2)의 혼합물을 서서히 첨가하여 8,000 rpm에서 2∼3분간 유화시켰다.4) While the above step 3) was carried out, the mixture of step 2) was gradually added and emulsified at 8,000 rpm for 2 to 3 minutes.

5) 14의 원료를 소량의 물에 용해시킨 후 상기 단계 4)의 혼합물에 첨가하고 2분간 더 유화시켰다.5) The raw material of 14 was dissolved in a small amount of water and then added to the mixture of step 4) and further emulsified for 2 minutes.

6) 15 내지 17의 원료를 각각 평량한 후 상기 단계 5)의 혼합물에 넣고 30초간 더 유화시켰다.6) The raw materials of 15 to 17 were each weighed, and then put into the mixture of step 5) and further emulsified for 30 seconds.

7) 상기 단계 6)의 혼합물을 유화 후 탈기과정을 거쳐 25∼35℃로 냉각시킴으로써 유화제형의 화장품을 제조하였다.
7) The mixture of step 6) was degassed after emulsification and cooled to 25 to 35 ° C to prepare an emulsifier-type cosmetic product.

유화 제형 1, 2, 3의 조성Composition of Emulsification Formulations 1, 2 and 3 조성Furtherance 유화제형 1Emulsifier type 1 유화제형 2Emulsifier type 2 유화제형 3Emulsifier type 3 1One 스테아린 산Stearic acid 0.30.3 0.30.3 0.30.3 22 스테알리 알콜Stearyl alcohol 0.20.2 0.20.2 0.20.2 33 글리세릴 모노스테아레이트Glyceryl monostearate 1.21.2 1.21.2 1.21.2 44 밀납Wax 0.40.4 0.40.4 0.40.4 55 폴리옥시에틸렌솔비탄
모노라우린산 에스테르Polyoxyethylene sorbitan
Monolauric acid ester 2.22.2 2.22.2 2.22.2 66 파라옥시안식향산 메틸Methyl paraoxybenzoate 0.10.1 0.10.1 0.10.1 77 파라옥시안식향산 프로필P-hydroxybenzoic acid profile 0.050.05 0.050.05 0.050.05 88 세틸에틸헥사노에이트Cetyl ethyl hexanoate 55 55 55 99 트리글리세라이드Triglyceride 22 22 22 1010 사이클로메티콘Cyclomethicone 33 33 33 1111 증류수Distilled water ~ 100~ 100 ~ 100~ 100 ~ 100~ 100 1212 농글리세린Concentrated glycerin 55 55 55 1313 트리에탄올아민Triethanolamine 0.150.15 0.150.15 0.150.15 1414 폴리아크릴산 중합체Polyacrylic acid polymer 0.120.12 0.120.12 0.120.12 1515 색소Pigment 0.00010.0001 0.00010.0001 0.00010.0001 1616 향incense 0.100.10 0.100.10 0.100.10 1717 아라자임Arazyme 0.00010.0001 1One 1010

<4-2> <4-2> 가용화Solubilization 제형의 화장품 제조 Cosmetic manufacturing of formulations

하기 [표 2]에 기재된 조성으로 가용화 제형의 화장품을 제조하였다. 제조 방법은 하기와 같다.Cosmetic products of the solubilized formulations were prepared with the compositions shown in the following [Table 2]. The production method is as follows.

1) 2 내지 6의 원료를 1의 원료(정제수)에 넣고 아직믹서를 이용하여 용해시켰다.1) 2 to 6 raw materials were put into 1 raw material (purified water) and dissolved using a mixer.

2) 8 내지 11의 원료를 7의 원료(알코올)에 넣고 완전용해시켰다.2) Raw materials 8 to 11 were completely dissolved in 7 raw materials (alcohol).

3) 상기 단계 2)의 혼합물을 상기 단계 1)의 혼합물에 서서히 첨가하면서 가용화시켰다.
3) The mixture of step 2) was slowly solubilized by adding it to the mixture of step 1).

가용화Solubilization 제형 1, 2, 3의 조성 Composition of formulations 1, 2 and 3 조성Furtherance 가용화 제형 1 Solubilization Formulation 1 가용화 제형 2Solubilization Formulation 2 가용화 제형 3 Solubilization Formulation 3 1One 정제수Purified water ~ 100 ~ 100 ~ 100 ~ 100 ~ 100 ~ 100 22 농글리세린Concentrated glycerin 3 3 3 3 3 3 33 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 2 2 2 2 2 2 44 EDTA-2NaEDTA-2Na 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 55 색소Pigment 0.0001 0.0001 0.0002 0.0002 0.0002 0.0002 66 아라자임Arazyme 0.1 0.1 55 55 77 알코올(95%)Alcohol (95%) 8 8 88 88 88 파라옥시안식향산 메틸Methyl paraoxybenzoate 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 99 폴리옥시에틸렌
하이드로제네이디트에스테르Polyoxyethylene
Hydro genide ester 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 1010 향incense 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 1111 사이클로메티콘Cyclomethicone -  - -  - 0.2 0.2

<110> Insect Biotech Co., Ltd. <120> A composition containing Arazyme for the prevention and treatment of Atopic Dermatitis <130> 12p-05-54 <160> 2 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 487 <212> PRT <213> Aranicola proteolyticus <220> <221> BINDING <222> (192) <223> Zn binding site <220> <221> BINDING <222> (196) <223> Zn binding site <220> <221> BINDING <222> (323) <223> Zn binding site <400> 1 Met Gln Ser Thr Lys Lys Ala Ile Glu Ile Thr Glu Ser Ser Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ser Ala Tyr Asn Ala Val Asp Asp Leu Leu His Tyr His 20 25 30 Glu Arg Gly Asn Gly Ile Gln Val Asn Gly Lys Asp Ser Phe Ser Thr 35 40 45 Glu Gln Ala Gly Leu Phe Ile Thr Arg Glu Asn Gln Thr Trp Asn Gly 50 55 60 Tyr Lys Val Phe Gly Gln Pro Val Lys Leu Thr Phe Ser Phe Pro Asp 65 70 75 80 Tyr Lys Phe Ser Ser Thr Asn Val Ala Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys 85 90 95 Phe Ser Ala Glu Gln Gln Gln Gln Ala Lys Leu Ser Leu Gln Ser Trp 100 105 110 Ser Asp Val Ala Asn Ile Thr Phe Thr Glu Val Gly Ala Gly Gln Lys 115 120 125 Ala Asn Ile Thr Phe Gly Asn Tyr Ser Gln Asp Arg Pro Gly His Tyr 130 135 140 Asp Tyr Asp Thr Gln Ala Tyr Ala Phe Leu Pro Asn Thr Ile Tyr Gln 145 150 155 160 Gly Gln Asn Leu Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Asn Val Asn Gln Ser Asn 165 170 175 Val Lys His Pro Ala Ser Glu Asp Tyr Gly Arg Gln Thr Phe Thr His 180 185 190 Glu Ile Gly His Ala Leu Gly Leu Ser His Pro Gly Asp Tyr Asn Ala 195 200 205 Gly Glu Gly Asn Pro Thr Tyr Arg Asp Ala Ser Tyr Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Arg Glu Phe Ser Leu Met Ser Tyr Trp Ser Glu Thr Asn Thr Gly Gly 225 230 235 240 Asp Asn Gly Gly His Tyr Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp Asp Ile Ser 245 250 255 Ala Ile Gln His Leu Tyr Gly Ala Asn Gln Thr Thr Arg Thr Gly Asp 260 265 270 Thr Val Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Ser Thr 275 280 285 Thr Ser Asn Pro Gln Lys Val Ile Phe Ala Ala Trp Asp Ala Gly Gly 290 295 300 Asn Asp Thr Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Thr Ala Asn Gln Arg Ile Asn 305 310 315 320 Leu Asn Glu Lys Ser Phe Ser Asp Val Gly Gly Leu Lys Gly Asn Val 325 330 335 Ser Ile Ala Ala Gly Val Thr Ile Glu Asn Ala Ile Gly Gly Ser Gly 340 345 350 Asn Asp Val Ile Val Gly Asn Ala Ala Asn Asn Val Leu Lys Gly Gly 355 360 365 Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Glu Leu Trp 370 375 380 Gly Gly Ala Gly Lys Asp Thr Phe Val Phe Ser Ala Val Ser Asp Ser 385 390 395 400 Ala Pro Gly Ala Ser Asp Trp Ile Lys Asp Phe Gln Lys Gly Ile Asp 405 410 415 Lys Ile Asp Leu Ser Phe Phe Asn Gln Gly Ala Gln Gly Gly Asp Gln 420 425 430 Ile His Phe Val Asp His Phe Ser Gly Ala Ala Gly Glu Ala Leu Leu 435 440 445 Ser Tyr Asn Ala Ser Asn Asn Val Ser Asp Leu Ala Leu Asn Ile Gly 450 455 460 Gly His Gln Ala Pro Asp Ile Leu Val Lys Ile Val Gly Gln Val Asp 465 470 475 480 Val Ala Thr Asp Phe Ile Val 485 <210> 2 <211> 2481 <212> DNA <213> Aranicola proteolyticus <400> 2 cgagcgcgaa agacccggaa ggcacgaggt gattagtcaa aaaaagaaaa tgttattcct 60 gcgggaacta aaaagtaccg gcggctaata ataaagagtt attaatctat aacgctttag 120 ccaaatttaa cttttagccg tctaaatccc agcacgattc gcttggctct gcaggccgca 180 tttttgttgg agtttgttac caactcatgg catttaagtt tcattaatat tgtaaataat 240 gcaaaaaacc agcataaatc cccttcgtaa cgataataaa tggctgatta ttttatgtgc 300 agttttacac cgctgcctat aattggaatc gattaccatt tatggtggta atcttatttg 360 ctgatatata tgcattaatt ctctctaaca cactgccggt ancggcgcat aaactccttc 420 ccgtaagcgt gcggttcgtt ctccgtggct tcctggcagg ttatgtctat ctgtctgatt 480 gaaaccaatc agctaatgag tggaatcgaa ccaatgcaat ctactaaaaa ggcaattgaa 540 attactgaat ccagccttgc ggctgcgagc tccgcttaca atgcagtaga tgatttgctg 600 cattatcatg agcgaggcaa cgggattcag gttaatggca aggactcatt ttctaccgaa 660 caagccgggc tgtttattac ccgcgagaac caaacctgga acggttataa agtttttggc 720 caaccggtta aattaacgtt ctctttcccg gattataaat tctcttccac caacgtcgcc 780 ggcgataccg gactgagcaa attcagcgcg gaacagcagc agcaggctaa gctgtcgctg 840 cagtcctggt ctgacgtggc caatatcacc tttaccgaag ttggtgccgg ccagaaggcc 900 aatatcacct tcggtaacta cagccaggat cgtcccggcc attatgacta cgatacccag 960 gcttacgcct tcctgccgaa caccatttat cagggccaaa acctgggcgg gcagacttgg 1020 tacaacgtca accagtccaa cgtgaaacat ccggccagcg aagactacgg ccgccagacc 1080 tttacccacg agattggcca tgcgttgggc ttgagccatc cgggcgatta caacgccggc 1140 gaaggcaacc cgacttacag agatgccagc tacgccgaag atactcgtga gttcagcctg 1200 atgagttact ggagcgaaac caacaccggt ggcgacaacg gcgggcacta cgctgcggcg 1260 ccactgctgg atgacatttc cgctattcag catctgtatg gtgccaacca gaccacccgt 1320 accggcgata ccgtgtatgg cttcaactca aataccggac gtgacttcct cagtaccacc 1380 agcaatccgc aaaaagtgat ctttgcggcc tgggatgcgg gtggtaatga caccttcgat 1440 ttctccggtt acaccgctaa ccagcgtatt aatctgaacg agaaatcttt ctccgacgtg 1500 ggtgggctga aaggcaacgt gtccattgcc gcaggtgtga ccatcgagaa cgcgattggc 1560 ggttcaggca atgacgtgat cgtcggcaat gcggccaaca acgtgctgaa aggtggcgcg 1620 ggcaacgacg tgctgttcgg cggtggtggg gctgatgagc tgtggggcgg tgcgggcaaa 1680 gacacctttg tcttctctgc ggtcagcgat tctgcgccgg gtgcctccga ctggatcaag 1740 gatttccaga aaggcatcga taaaatcgac ctgtcattct tcaatcaggg cgcgcagggt 1800 ggcgatcaga tccacttcgt cgatcatttc agtggcgcag cgggcgaagc cttgctgtct 1860 tacaatgcgt cgaataacgt cagcgatctg gccctgaata tcggcggcca tcaggccccg 1920 gacatcctgg tgaagatcgt cggccaggtt gatgtcgcca ctgactttat cgtttaacag 1980 tgcaggtgct aacgcccggc gccggttggc cgggcgttat acaggagacg atatgaaggg 2040 cagcttagcg cacgccgcct tagtggcagg cggcatgatg gttacggggg cagttatggc 2100 cagcagtttg gttcttccca gcgcgcaatc attggcgggg caatggctgg tcgccaatgc 2160 cgaacaacaa tgtcagattg agtttttggc cggtgaacag agtgaaatca acggctactc 2220 attggttgat cggcagcact gtttggaaaa ggtgttaacc gccgaggtgg tcggttggcg 2280 ccctgcaccg gacggcatcg ctttgctgcg ggcggatggc agtacgctgg cgttcttctc 2340 gcgcgatggc gatatttacc gcaaccagct tggcgcggat gacggactga cgctgaaagc 2400 gctggtataa caacagcggg ttcggcagtc gaacccgccc tgagcagcct tacagataca 2460 gcgaacgtac gatcaggaaa t 2481 <110> Insect Biotech Co., Ltd. <120> A composition containing an enzyme for the prevention and treatment          of Atopic Dermatitis <130> 12p-05-54 <160> 2 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 487 <212> PRT <213> Aranicola proteolyticus <220> <221> BINDING <222> <223> Zn binding site <220> <221> BINDING <222> (196) <223> Zn binding site <220> <221> BINDING <222> <223> Zn binding site <400> 1 Met Gln Ser Thr Lys Lys Ala Ile Glu Ile Thr Glu Ser Ser Leu Ala   1 5 10 15 Ala Ala Ser Ala Tyr Asn Ala Val Asp Asp Leu Leu His Tyr His              20 25 30 Glu Arg Gly Asn Gly Ile Gln Val Asn Gly Lys Asp Ser Phe Ser Thr          35 40 45 Glu Gln Ala Gly Leu Phe Ile Thr Arg Glu Asn Gln Thr Trp Asn Gly      50 55 60 Tyr Lys Val Phe Gly Gln Pro Val Lys Leu Thr Phe Ser Phe Pro Asp  65 70 75 80 Tyr Lys Phe Ser Ser Thr Asn Val Ala Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys                  85 90 95 Phe Ser Ala Glu Gln Gln Gln Gln Ala Lys Leu Ser Leu Gln Ser Trp             100 105 110 Ser Asp Val Ala Asn Ile Thr Phe Thr Glu Val Gly Ala Gly Gln Lys         115 120 125 Ala Asn Ile Thr Phe Gly Asn Tyr Ser Gln Asp Arg Pro Gly His Tyr     130 135 140 Asp Tyr Asp Thr Gln Ala Tyr Ala Phe Leu Pro Asn Thr Ile Tyr Gln 145 150 155 160 Gly Gln Asn Leu Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Asn Val Asn Gln Ser Asn                 165 170 175 Val Lys His Pro Ala Ser Glu Asp Tyr Gly Arg Gln Thr Phe Thr His             180 185 190 Glu Ile Gly His Ala Leu Gly Leu Ser His Pro Gly Asp Tyr Asn Ala         195 200 205 Gly Glu Gly Asn Pro Thr Tyr Arg Asp Ala Ser Tyr Ala Glu Asp Thr     210 215 220 Arg Glu Phe Ser Leu Met Ser Tyr Trp Ser Glu Thr Asn Thr Gly Gly 225 230 235 240 Asp Asn Gly Gly His Tyr Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp Asp Ile Ser                 245 250 255 Ala Ile Gln His Leu Tyr Gly Ala Asn Gln Thr Thr Arg Thr Gly Asp             260 265 270 Thr Val Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Ser Thr         275 280 285 Thr Ser Asn Pro Gln Lys Val Ile Phe Ala Ala Trp Asp Ala Gly Gly     290 295 300 Asn Asp Thr Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Thr Ala Asn Gln Arg Ile Asn 305 310 315 320 Leu Asn Glu Lys Ser Phe Ser Asp Val Gly Gly Leu Lys Gly Asn Val                 325 330 335 Ser Ile Ala Gly Val Thr Ile Gly Asn Ale Ile Gly Gly Ser Gly             340 345 350 Asn Asp Val Ile Val Gly Asn Ala Asn Asn Val Leu Lys Gly Gly         355 360 365 Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Glu Leu Trp     370 375 380 Gly Gly Ala Gly Lys Asp Thr Phe Val Phe Ser Ala Val Ser Asp Ser 385 390 395 400 Ala Pro Gly Ala Ser Asp Trp Ile Lys Asp Phe Gln Lys Gly Ile Asp                 405 410 415 Lys Ile Asp Leu Ser Phe Phe Asn Gln Gly Ala Gln Gly Gly Asp Gln             420 425 430 Ile His Phe Val Asp His Phe Ser Gly Ala Ala Gly Glu Ala Leu Leu         435 440 445 Ser Tyr Asn Ala Ser Asn As Val Ser Asp Leu Ala Leu Asn Ile Gly     450 455 460 Gly His Gln Ala Pro Asp Ile Leu Val Lys Ile Val Gly Gln Val Asp 465 470 475 480 Val Ala Thr Asp Phe Ile Val                 485 <210> 2 <211> 2481 <212> DNA <213> Aranicola proteolyticus <400> 2 cgagcgcgaa agacccggaa ggcacgaggt gattagtcaa aaaaagaaaa tgttattcct 60 gcgggaacta aaaagtaccg gcggctaata ataaagagtt attaatctat aacgctttag 120 ccaaatttaa cttttagccg tctaaatccc agcacgattc gcttggctct gcaggccgca 180 tttttgttgg agtttgttac caactcatgg catttaagtt tcattaatat tgtaaataat 240 gcaaaaaacc agcataaatc cccttcgtaa cgataataaa tggctgatta ttttatgtgc 300 agttttacac cgctgcctat aattggaatc gattaccatt tatggtggta atcttatttg 360 ctgatatata tgcattaatt ctctctaaca cactgccggt ancggcgcat aaactccttc 420 ccgtaagcgt gcggttcgtt ctccgtggct tcctggcagg ttatgtctat ctgtctgatt 480 gaaaccaatc agctaatgag tggaatcgaa ccaatgcaat ctactaaaaa ggcaattgaa 540 attactgaat ccagccttgc ggctgcgagc tccgcttaca atgcagtaga tgatttgctg 600 cattatcatg agcgaggcaa cgggattcag gttaatggca aggactcatt ttctaccgaa 660 caagccgggc tgtttattac ccgcgagaac caaacctgga acggttataa agtttttggc 720 caaccggtta aattaacgtt ctctttcccg gattataaat tctcttccac caacgtcgcc 780 ggcgataccg gactgagcaa attcagcgcg gaacagcagc agcaggctaa gctgtcgctg 840 cagtcctggt ctgacgtggc caatatcacc tttaccgaag ttggtgccgg ccagaaggcc 900 aatatcacct tcggtaacta cagccaggat cgtcccggcc attatgacta cgatacccag 960 gcttacgcct tcctgccgaa caccatttat cagggccaaa acctgggcgg gcagacttgg 1020 tacaacgtca accagtccaa cgtgaaacat ccggccagcg aagactacgg ccgccagacc 1080 tttacccacg agattggcca tgcgttgggc ttgagccatc cgggcgatta caacgccggc 1140 gaaggcaacc cgacttacag agatgccagc tacgccgaag atactcgtga gttcagcctg 1200 atgagttact ggagcgaaac caacaccggt ggcgacaacg gcgggcacta cgctgcggcg 1260 ccactgctgg atgacatttc cgctattcag catctgtatg gtgccaacca gaccacccgt 1320 accggcgata ccgtgtatgg cttcaactca aataccggac gtgacttcct cagtaccacc 1380 agcaatccgc aaaaagtgat ctttgcggcc tgggatgcgg gtggtaatga caccttcgat 1440 ttctccggtt acaccgctaa ccagcgtatt aatctgaacg agaaatcttt ctccgacgtg 1500 ggtgggctga aaggcaacgt gtccattgcc gcaggtgtga ccatcgagaa cgcgattggc 1560 ggttcaggca atgacgtgat cgtcggcaat gcggccaaca acgtgctgaa aggtggcgcg 1620 ggcaacgacg tgctgttcgg cggtggtggg gctgatgagc tgtggggcgg tgcgggcaaa 1680 gacacctttg tcttctctgc ggtcagcgat tctgcgccgg gtgcctccga ctggatcaag 1740 gatttccaga aaggcatcga taaaatcgac ctgtcattct tcaatcaggg cgcgcagggt 1800 ggcgatcaga tccacttcgt cgatcatttc agtggcgcag cgggcgaagc cttgctgtct 1860 tacaatgcgt cgaataacgt cagcgatctg gccctgaata tcggcggcca tcaggccccg 1920 gacatcctgg tgaagatcgt cggccaggtt gatgtcgcca ctgactttat cgtttaacag 1980 tgcaggtgct aacgcccggc gccggttggc cgggcgttat acaggagacg atatgaaggg 2040 cagcttagcg cacgccgcct tagtggcagg cggcatgatg gttacggggg cagttatggc 2100 cagcagtttg gttcttccca gcgcgcaatc attggcgggg caatggctgg tcgccaatgc 2160 cgaacaacaa tgtcagattg agtttttggc cggtgaacag agtgaaatca acggctactc 2220 attggttgat cggcagcact gtttggaaaa ggtgttaacc gccgaggtgg tcggttggcg 2280 ccctgcaccg gacggcatcg ctttgctgcg ggcggatggc agtacgctgg cgttcttctc 2340 gcgcgatggc gatatttacc gcaaccagct tggcgcggat gacggactga cgctgaaagc 2400 gctggtataa caacagcggg ttcggcagtc gaacccgccc tgagcagcct tacagataca 2460 gcgaacgtac gatcaggaaa t 2481

Claims (12)

하기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물:
(a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
(b) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질.
A pharmaceutical composition for the prevention and treatment of atopic dermatitis comprising as an active ingredient arazyme of any one of the following (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And
(b) a protein encoded by DNA comprising the coding region of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
삭제delete 제 1항에 있어서, 상기 아라자임은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 배양액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the arazyme is isolated from a culture solution of Aranicola proteolyticus .
제 3항에 있어서, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3(수탁번호: KCTC 0268BP)인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 3, wherein the ARA Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolyticus) is Ara Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolyticus HY-3 (Accession No .: KCTC 0268BP).
하기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물:
(a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
(b) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질.
A cosmetic composition for prevention and improvement of atopy comprising arazyme as an active ingredient of any one of the following (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And
(b) a protein encoded by DNA comprising the coding region of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
삭제delete 제 5항에 있어서, 상기 아라자임은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 배양액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물.
6. The cosmetic composition according to claim 5, wherein the arazyme is isolated from a culture solution of Aranicola proteolyticus .
제 7항에 있어서, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3(수탁번호: KCTC 0268BP)인 것을 특징으로 하는 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물.
8. The method of claim 7 wherein the ARA Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolyticus) is Ara Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolyticus HY-3 (Accession No .: KCTC 0268BP).
하기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 건강식품:
(a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
(b) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질.
A health food for prevention and improvement of atopy comprising Arazyme as an active ingredient of any one of the following (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And
(b) a protein encoded by DNA comprising the coding region of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
삭제delete 제 9항에 있어서, 상기 아라자임은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 배양액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 아토피 예방 및 개선용 건강식품.
10. The health food for prevention and improvement of atopy according to claim 9, wherein the arazyme is isolated from a culture solution of Aranicola proteolyticus .
제 11항에 있어서, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3(수탁번호: KCTC 0268BP)인 것을 특징으로 하는 아토피 예방 및 개선용 건강식품.


12. The method of claim 11, wherein the ARA Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolyticus) is Ara Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolyticus HY-3 (Accession No .: KCTC 0268BP).

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